Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль компонентного состава костного мозга в проявлении функциональной активности криоконсервированных кроветворныхклеток

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Роль компонентного состава костного мозга в проявлении функциональной активности криоконсервированных кроветворныхклеток"

^ А^ЦЮНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут проблем кріобіологіі і кріомедииини

на правах рукопису

Луценко Олена Дмитрівна

РОЛЬ КОМПОНЕНТНОГО СКЛАДУ КІСТКОВОГО МОЗКУ У ВИЯВЛЕННІ ФУНКЦИОНАЛЬНО! АКТИВНОСТІ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ КРОВОТВОРНИХ КЛІТИН

(03.00.22 — кріобіологія)

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Харків 1996 р.

Дисертація є рукописом. '

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії Наук України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор А.М.Гольцев Офіційні опоненти:

1. Доктор медичних наук, професор лауреат Державної премії СРСР Т.М. Юрченко

2. Доктор біологічних наук, професор Г.Ф.Жегунов

Провідна установа: Київський НДІ гематології та

переливання крові, м.Київ

Захист відбудеться “ *1-5 ” 1996 р.

на засіданні спеціалізованої вченої-ради Д 50.21.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАД України.

(310015, Харків-15, вул.Переяслівська, 23) 3 дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Автореферат розісланий “________”_____________________ 1996 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доктор медичних наук,

професор А. М. Гольцев.

Загальна характеристика роботи, актуальність та ступінь дослідженості тематики дисертації.

Вивчення механізмів захисної дії пересадженої гемопоетичної тканини є однією з найважливіших умов підвищення ефективності її застосування в клінічній практиці. Актуальність проблеми зростає ще в більшій мірі при використанні кріоконсервованого кісткового мозку, який відрізняється від натшшого по цілому ряду морфофункциональних параметрів [Пушкар Н.С. 1976, Гольцев А.М. 1988, Rowley 1992]. Встановлено, що в процесі кріоконсервувашш в клітинах кісткового мозку розвиваються нелетальні пошкодження, які обумовлюють інги-біцію процесів проліферації і диференціювання стволових клітин [Цуцаєва А.О. 1980, 1983], зниження темпів утворення ними имуно-компетентних клітин у летально опромінених реципієнтів [Гольцев А.М.1988, Попов М.М-. 1990]. .

Сучасні дані в галузі імуногематології дають підстави вважати, що захисний потенціал миєлотрансплантата обумовлен не тільки родоначальними кровотворними елементами, але й рядом акцесорних клітин, які входять до його складу. Разом з тим потрібні аргументовані докази необхідності присутності цих елементів в мієлотрансплантаті, які разом з клітінами кровотворного мікрооточення реципієнта виступають як регулятори гемопоезу. Оцінка ролі різних популяцій міє-лотрансплантата і гуморальних субстанцій, які володіють модифікуючою активністю відносно функціонування кріоконсервованих кровотворних попередників, є невивченою галуззю наукових досліджень.

Особливий інтерес представляють дані про регуляцію гемопоеза клітинами Т-ряду і визначення регуляторної активності адгезивних клітин, які входять до складу гемопоетічної строми кісткового мозку, яка містить моноцити, фібробласти, ендотеліальні клітини та ін., які володіють, як відомо, високою здатністю виробляти регуляторні фактори [Фріденштейн О.Я. 1992, Andreoni,1990]. Якщо відносно взаємодії

. з кріоконсервованйм мієлотраисплантато.м клітин Т-ряду існують дані, хоча часто протиречливі [Апііп, І 992], то відомості про 'потребу при. сутності,в мієлотрансшіантаті і функціональний стан адгезивних еле. ментів кісткового мозку після кріоконсервування практично відсутні.

« Залишається також маловивченим; але важливим для клінічної практики питання про стан гемопоетичних попередників і стан модифікації кооперативних міжклітинних взаємодій в кріоконсерпованому кістковому мозку, попередньо обробленому цитостатиками. .

, Мета досліджень: визначення в кріоконсервованому кістковому , мозку клітинних популяцій, які володіють регуляторною активністю у _ відношенні кровотворних попередників різного ступеня дифферен-ціювання, для лідвишення міри їх цілості і захисного потенцйалу _ мієлотрансплантата в умовах- зміни його компонентного складу після кріоконсервування. ‘

Для виконання поставленої мети потрібно було вирішити наступні _ завдання: ’ •

- вивчити регуляторну (акцесорну) роль і вплив різних режимів кріоконсервування на кооперативні відносини фракції адгезивних клітин

,(АК) трансплантата з кровотворними попередниками різного ступеня зрілості; _ - ’ •

- ідентифікувати в лімфомієлоідному комплексі і визначити роль

ТЬу-1,2+ клітин кісткового мозку у відновленні лімфо- і мієлопоезу опроміненіх реципієнтів після трансплантації кріоконсервованого і нативного кісткового. мозку; _ ■ ' .

- вивчити вплив різних режимів кріоконсервування на цілість антигенних структур крововтворних попередників кісткового мозку;

- вивчити характер і, міру впливу кріоконсервування на функціональну

-активність мієлотранспланіата із зміненим компонентним, складом, обумовленим Дією цитостатиків; і '

т визначити можливий’ метод підвищення функціональної активності

кровотворних попередників після кріоконсервування з метою симуляції захисного потенціалу кріомієлогрансплантата.

Теоретична і практична цінність роботи.

Теоретичне значення досліджень полягає в встановленні залежності функціональної активності кріоконсерованих кровотворних попередників від присутності в мієлотрансплантаті акцесорно-регуляторних клітин. Відзначено, що кріоконсервування з використанням різних режимів заморожування-відігріву може використовуватися з метою направленої елімінації з кісткового мозку певних реглуяторно-акцесорних клітин і отримання мієлотрансплантата з завданими характеристиками (зміна і мун о р е акт иш і о ст і, певна направленість диференціювання кровотворних попередників та ін.). В зв’язку з цим відкривається можливість додаткової розшифровки механізму регуляції гемопоезу і підвищення ефективності трансплантації кріоконсервованого кісткового мозку.

Практичне значення роботи полягає у визначенні методів кріоконсервування, які забеспечують функціональну цілість після кріоконсервування не тільки кровотворних, але й акцесорних елементів гемопоезу, а також використання невних клітинних популяцій і екзогенних біологічних агентів як стимуляторів захисного потенціалу кріомієлотрансплантата.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше установлено факт залежності функціональної активності кріоконсервованих кровотворних попередників від компонентного складу мієлотрансплантата (наявності акцесорно-регуляторних клітин). Доведена трансплантабельність акцесорно-регуляторних елементів адгезивної фракції мієлотрансплантата, показана різна роль АК у відношенні селезінкового і медулярного кровотворення. Новим є встановлений факт про те, що міра регуляторної активності і як наслідок, його гемопоетична активність залежать від режиму кріоконсервування кісткового мозку. Доведена селективна елімінація регуляторних клітин кісткового мозку в залеж-

пості від обраного режіму кріоконсервування. Показано, що тест колонієутворення in vivo є інтегральним показником функціональної активності як КУОс, так і акцесорних клітин кісткового мозку. Цей тест при оцінці кількості кровотворних попередників в кріоконсер-вованому кістковому мозку може бути об’ єктивним за умовами забес-печення обраними режимами кріоконсервування збалансованого клітинного складу мієлотрансплантата. Вперше визначена роль Thy-1,2+ стволових клітин у відновленні гемопоеза опромінених реципієнтів після трансплантації нативного і кріоконсервованого кісткового мозку.

Рівень реалізації та впровадження результатів дослідженій.

Проведені дослідження доводять роль різних клітинних популяцій в регуляції функціональної активності кріоконсервованих кровотворних клітин кісткового мозку. Отримані дані важливі для кріобіології, так як вперше установлена селективна елімінація регуляторних клітин гемопоезу в залежності від обраного режиму кріоконсервування. Представлені результати можуть бути цінні в клінічній практиці при виборі режимів кріоконсервування в залежності від застосовусмого кісткового мозку.

Апробація роботи. Резуль тати досліджень були докладені і надруковані в матеріалах конференцій “Система мононуклеарних фагоцитів в нормі і при патології”(Новосибірськ, 1990), “Реабілітація имуниої системи”(Цхалтубо, 1990), ’’Успіхи сучасної кріобіології” (Хар ків, 1992),”Кріо-94" (Кіото, Японія 1994), “Фундаментальні і прикладні аспекти сучасної кріобіології” (Харків, 1994), І з’їзді українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків, 1995), 111 з’їзді гематологів і трансфузіологів (Суми, 1995), “Сучасні проблеми клінічної та експериментальної транспланталогії (Запоріжжя, 1995), “Ідеї І.І.Мечникова та розвиток сучасного природознавства” (Харків, 1995).

Публікації. Основні положення дисертації представлені в 18 надрукованих роботах.

Обсяг і структура роботи. Дисертація викладена на 125 стор. машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень і їх обговорення, закінчення і висновків, містить ЗО таблиць і 14 малюнків. Список використаної літератури містить 162 найменування.

Особистий внесок дисертанта в виконання роботи: Наукові результати, які виносяться на захист отримані дисертантом особисто. В роботах, які надруковані в соавторстві, дисертанту належить розробка схем постановки експериментів, загальна частіша обміркування результатів, визначення основних висновків дослідження.

Основні положення, які виносяться на захист:

1. Функціональна активність кріоконсервованих кровотворних попередників в організмі опроміненого реципієнта залежить від компонентного складу мієлотрансплантата.

2. В загальному нулі кровотворних попередників кісткового мозку присутні Т1іу-1,2+ клітини з високим проліферативним потенціалом і здатні відновлювати лімфомієлоідний комплекс опромінених реципієнтів. Різні режими кріоконсервування по різному змінюють стан Thy-1,2+ антигенних структур, але не позбавляють в цілому клітин указаної здібності.

3. Адгсзивні клітини кісткового мозку' володіють “транспла-нтабельністю” і виявляють функціональну активність у відношенні нативних і кріоконсервованих крововтворних попередників в умовах діі' екзогенних регуляторних сигналів. Різні режими кріоконсервування можуть селективно елімінувати з гетерогенного пулу клітин кісткового мозку елементи, які володіють регуляторною активністю у відношенні кровотворних попередників.

4. Методи оцінки функціональної активності кріоконсервованих кровотворних попередників in vivo коректні за умов збереження збалансованого клітинного складу кріоконсервованого мієлотрансплантата,

так як є інтегральним показником, визначаємим схоронністю кровотворних попередників і функцією акцесорних клітин кісткового мозку.

МЕТОДОЛОГІЯ, МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ПРЕДМЕТУ І ОБ'ЄКТУ

Експерименти виконані на лінійних мишах СВА/Н, (СВАхС57В1) Р15 8-12 тиждневого віку. Об'єктом досліджень був кістковий мозок експериментальних тварин, а також клітинні популяції лімфоміслоідних органів мишей-рецииієнтів кісткового мозку.

Кріоконсервування кісткового мозку здійснили по методу [Цуца-єва А.О.,1983] з використанням кріопротекторів ДМСО в 10% концентрації (режим К-1) і ПЕО-400 в концентрації 7,5% (режим К-2). Заморожування здійснили* на програмному заморожувачі УОП-6 виробництва СКТБ з ДВ ІПК і К НАН України, м. Харків. Відігрів зразків проводили на водяній бані при температурі 40,0±0,5°С.

Опромінення мишей-реципієнтів проводити на установці РУМ-17 в летальній дозі 7,5-8 Гр.

Як модель регенеруючого кісткового мозку використовували кістковий мозок мишей, оброблених цитостатиком 5-фторуранилом (5-ФУ) в дозі 150-200 мг/кг маси тварини за 4 і 8 діб до отримання мієлокаріоцитів [ІІосІзоп, 1982].

Для виведення з кісткового мозку АК суспензію двічі по 1 годині витримувати в чашках Петрі при температурі 22°С, АК знімати з чашок гумовим шпателем. Для ідентифікації клітин адгезішної фракції кісткового мозку був використан морфологічній! облік в світловому мікроскопі препаратів, покрашених азур-І І-еозином (по Романовському-Гімза), а також цитохімічний аналіз АК кісткового мозку на присутність кислої фосфатази і неспецифічної естерази [Учитель О.М., 1982].

З метою визначення кількості в кістковому мозку кровотворних попередників, які формирують гемопоетичні колонії в селезінках на 8

і 12 добу (відповідно КУОс8 і КУОс12), кожну з досліджуваних суспензій вводили внутрівенно через 6-8 годин після опромінення реципієнтів.

Оцінку захисного -потенціалу досліджуваного трансплантата проводили по тесту ЗО добової виживаємості опромінених реципієнтів, а також визначення стану лімфомієлоідних органів тварин на різні строки післятрансплантаціиного періоду. •

Для ідентифікації і оцінки стану антигена Thy-1,2 на КУОс в роботі був використан метод імунологічної селекції — прямий пенінг-метод — з використанням моноклональних антитіл (МАТ) до антигена Thy-1,2 [Greenberg, 1987]. В лунки пластикового планшету (Linbro, США) діаметром 16 мм вносили по 300 мкл МАТ до антигену Thy-1,2 в розведенні 1:200 в фосфатному буфері і витримували протягом 10-

12 годин у вологій камері при 4°С. Нативні або кріоконсервовані клітини кісткового мозку доводили до концентрації ядерних клітин 1,5-3х107/мл і вносили по 0,5 мл суспензії в ямки з антитілами.

Для визначення кількості -Thy-1,2+ КУОс в трансплантаті були зроблені розрахунки по запропонованій нами формулі [Гольцев А.М., 1990]:

у = , де У. - % Thy-1,2+ КУОс, п - доба визначення КУОс,

/ХП с

А -% Т1іу-1,2+ клітин в кістковому мозку (результат сорбції на МАТ), В - кількість колоній після введення Thy-1,2+ фракції,

С - кількість колоній, яка утворюється після уведення суцільної суспензії кісткового мозку.

В комплемент-залежному цітотоксичному тесті з використанням МАТ до Thy-1,2, Ly2, L3T4 антигенів була проведена оцінка кількості Thy-1,21, Ly2+, Ly3T4+ клітин в кістковому мозку, тимусі, лімфатичних вузлах тварин [Клаус В.Л., 1990].

Статистичну обробку результатів виконаних експериментів проводили по методу' Стьюдснта-Фішера [АшмаринІ.П.,1972]. Достовірність відмінностей оцінювали за допомогою t-критерію з рівнем значущості 5%.

В експериментах було використано 2800 мишей.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Оцінка ролі різних популяцій мієлотрансплантата і гуморальних субстанцій, володіючих модифікуючою активністю у відношенні функціонування кровотворних попередників є маловивченою. Відомості про необхідність присутності в кріоконсервованому мієлотрансплантаті і функціональний стан регуляторних елементів кісткового мозку після заморожування-відігріву практично відсутні.

В виконаних дослідженнях за допомогою МАТ до Піу-1,2, ЬЗТ4, Ьу2 антигенів встановлена присутність різних субпопуляцій клітин Т-ряду в кістковому мозку. Ідентифікація Т-клітин, які несуть різні антигенні маркери може відбивати гетерогенність Т-нопулянії навіть в одному органі. Різний субпопулянійний склад клітин характеризує присутність елементів різної міри зрілості, які мають неоднакову здібність до продукції регуляторних факторів [Мірошниченко І.О.Д987]. Тому для оцінки участі Т-клітин в контролі гемопоезу були обрані ТЬу-1,2+ елементи мієлотрансплантата. Усунення Т-клітин за допомогою антитіл до Еу2/ЬЗТ4 значно не відбилося на колонієутворюючий активності в селезінці опромінених реципієнтів (контроль 100,0+6,3; після обробки коктейлем антитіл Ьу2/ЬЗТ4 93,3+4,5). Не відмічено зміни колонієутворення в "експериментальній моделі при уведенні зайвої кількості зрілих Т-клітин (тимоцитів). Разом з тим, встановлено, що обробка коктейлем МАТ супроводжується збільшенням гранулоцита-рних колоній і зниженням співвідношення еритроідних колоній до гранулоцитарних. Менша міра зміни перерозподілу відношення Е:Г встановлена на 12 добу колонієутворення. Певно, на диференціювання клітип-тпередників,які формирують “пізні” колонії дефишіт зрілих Т-клітин справляє менш виражений вплив порівняно з їх впливом на диференціювання “ранніх”.

Цитотоксична обробка, пенінг-метод з використанням МАТ до

Thy-1,2 антигену значно знижує колонієутворюючу активність уведених клітин (контроль 16,2±2Д; кількість колоній після обробки МАТ до Thy-1,2 антигену в цитотоксичному тесті на 8 добу складало 12,9±2,4, на 12 добу - 7,2±1,2). Отримані дані можуть відображати здатність використаних антитіл елімінувати різні субпопуляції клітин Т-ряду. Це допущення було підтверджено наступними результатам^ які свідчать про присутність серед Thy-l,2f клітин колонієутворюючих елементів різного рівня диференціювання (КУОс8, КУОс12).

При вивченні впливу кріоконссрвування на функціональну активність Thy-1,2+ фракції кісткового мозку встановлено, що функціонування кріоконсервованого мієлотрансплантата залежить від кількості Піу-1,2+клігші, що збереглися (табл.1). Крім того встановлено, що в залежності від використаного режиму кріоконсервування (з кріопро-тектором ПЕО або ДМСО) змінюється здатність кріоконсервованих Thy-1,2+ клітин сорбируватися на МАТ до Thy-1,2 антигену. Відомо, що Thy-І структура на клітинах відповідна за акцепцію регуляторних факторів [Білокрилов Г.А.,198б]. Можна утверджувати, що зміна фено-типичних характеристик кріоконсервованих Thy-1,2+ клітин відбивається на виявленні функціональних властивостей цих клітин, зокрема, відмічена знижена здатність кріоконсервованих Thy-1,2+ клітин не тільки формирувати КУОс, але й заселяти лімфоідні органи — тимус, лімфовузли, особливо у віддалені строки після трансплантації.

На підставі даних,отриманих при оцінці функціональної активності Thy-1,2* клітин (фракції, позбавленої регуляторних і кровотворних Thy-1,2+ клітин), *можна заключитн, що ця фракція, на відміну від Thy-1,2+ популяції на ранні строки після трансплантації має більш виражену здатність заселяти селезінку (табл.2), що може бути пояснено на основі літературних даних тим, шо відсутність Т-клітин в трансплантаті приводить до посилення еритропоезу в сингенній системі, якому сприяє червона пульпа селезінки.

Таблиця 1

Захисний потенціал трансплантата в залежності. від кількості в ньому ТЬу-1,2+. КУОс

транс- плантат кількість КУОс % сорбиро-ваних Т1іу-1,2+ клітин концентрація 1Ьу-1,2+ КУОс виживаємість протягом ЗО діб

нативний ■ К-1 ’ К-2 16,9+2,1 16 Д ± 1,4 11,2±2,0*# 2,1+.0,2 1,б±.0,2* 0,3+0,04*# 15,9+2,0 10,8+1,0* 1,0+0,1*# 92,3+5,7 68,1 ±6,7* 054,3±4,8*#

Примітка: * - достовірні відмінності (Р,-< 0,05) у порівнянні з нативним контролем; # - достовірні відмінності (Р2 < 0,05) у порівнянні груп з трансплантатом К-1 і К-2; К-1 - транспалантат, ■ кріоконсервований в режимі з 10% ДМСО; К-2 - транс-■ плантат'і, кріоконсервований в режимі з 7,5% ПЕО-400.

Не дивлячись на високий захисний потенціал ТЬу-1,2+ фракції, здатність відновлювати лімфомієлоідні органи опромінених тварин, навіть за умовами збереження після кріоконсервування Т1іу-1,2+ клітин, виживаємість опромінених реципієнтів кріоконссрвованого матеріалу поступає нативному. Для оцінки впливу на функціональну активність кровотворних попередників інших компонентів мієлотрансплантата ми досліджували роль адгезивної популяції кісткового мозку. Встановлено, шо в широкому діапазоні температур з кісткового мозку' мишей адге-зирується 18-22% клітин, які .мають невисокі рівні лізосомальних ферментів. Як свідчать отримані дані, сами АК не мають виражену здатність формувати гемопоетнчні колонії. Вилучення АК з трансплантата не змінює співвідношення Е:Г колоній в селезінці опро-

Таблиця 2

Виживаємість, селезінкове колонієутворення та кількість ядерних клітин в кістковому б 7

мозку (хІО ) I селезінці (хІО ) у летально опромінених мишей після трансплантації кісткового мозку Із зміненим компонентним складом

МІєлотрансплантат : % живих : тварин на | ЗО добу • віднооно колонїєутворвюча активність КУОс Ш : кількість ядерних клітин0 * . . ..... . . .

9 доба ; 12 доба ; кістковий мозок : селезінка

; І групи ;І2 доб 20 доб :І2доб 20доб

І.Нативний Інтактний 100,0+ 7,4 100,0+ 12,0 100,0+ 6,7 9,3 п,о 8,0 14,0

2.КрІоконсервований (К-І) 91,1+ 6,7 95,0+4,0 82,3+ 10,4 8,3 10,0 І2,ІХ 13,5

З.КрІоконсервований (К-П) 42,3+ 4,8х 52,4+ 3,8х 73,6+6,8х 6,0х 10,9 10,2 11,6

4.Нативний без АККМ 75,4+ 5,7* 112,0+7,8 98,5+7,9 4,2* 6,0х 7,4 н 8,0

5.КрІоконсервований (К-І) бег АККМ 50,0+ 3,8 50,0+ 3,4 71,7+ 7,ІХ 4,6К 9,7 8,6 7,4х

б.Нативний Т^у-1,2 94,2+ 6,3 97,8+ 5,5 81,8+ 7,4* 9,0 8,0» 14,5* 11,0

У.К^Іоконсвтаований (К-І) 96,4+ 4,1 85,0+ 5,8 70,0+ 10,5 х 7,0 10,0 13,4х ІЗ,0Х

З.Нативний Тйу-1,2 80,1+ 3,0х 36,7+2,2 78,4+ 3,7 8,5 9,5 з,ок 21,0*

9.КрІоконсервований (К-І) Му-І,2 . . 63,2+ 2,9х 24,3+3,1 91,3+9,1- 8,0 10,0 6,0* 22,0*

Примітка: ^-п/ 0,05 поміж ~по'казниками"контрольноІ групи "(першої)"" І дослідної; ^-довірчий Інтервал в гбупах не перебільшував 2-6% середньої величини

мінених рецішієнтів. Проте зайва кількість АК, яка досягається в моделі з додатковим уведенням АК з кістковим мозком, підвищує загальну кількість колоній за рахунок стимуляції колоній еритроідного ряду. Цей факт може бути пояснено присутністю серед АК кісткового мозку макрофагів, які виробляють, як відомо, фактори росту еритроідних колоній [Дигай А.М.,1989]. Трансплантабельність АК доведена експериментами з сумісним уведенням кісткового мозку з клітинами, які мають регуляторну активність у відношенні КУОс — макрофагами перитонеальної порожнини. Макрофаги не виявляли такої активності при сумісному уведенні з ііативним інтактним кістковим мозком, проте після виведення з кісткового мозку АК відмічен стимулюючий ефект макрофагів на КУОс8 та КУОс12. Тобто серед адгезивних елементів мієлотрансплантата присутні клітиіш, які не мають властивості колоніє-утворюючих одиниць, але грають роль “буферної системи” у відношенні виливу на КУОс регуляторних сигналів, зокрема, виробляємих екзогенними макрофагами, і котрі підтримують розселені в кровотворному мікрооточенні реципієнта КУОс на певному рівні функціональної активності.

Експериментально встановлено, шо міра відповіді КУОс на екзогенні фактори може визначатися режимом кріоконсервуванігя. Вплив макрофагів мінімальний, як і при уведенні з нативними мієло-каріоцитами, у випадку кріоконсервування з ДМСО. При трансплантації з кістковим мозком, кріоконсервованим під захистом ПЕО-400, макрофаги проявляли у відношенні КУОс стимулюючу активність подібно уведенню з натнвним кістковим мозком,позбавленим АК. Можна утверджувати, що режим кріоконсервування з ПЕО-400 схожий з експериментальною моделлю використання кісткового мозку без АК.

Введення АК з кістковим мозком, кріоконсервованим в режимі К-2 хоча не заповнює, але збільшує його колонієутворюючу активність, що доводить учать АК разом з клітинами кровотворного мікрооточення

реципієнта в підтриманні уведенних КУОс на певному функціональному рівні. Ці дослідження доводять, що тест колонієутворення in vivo є інтегральним показником, зумовленим цілістю КУОс і функцією акцесорних клітин кісткового мозку і тому може бути об'єктивним при оцінці кількості КУОс в кріоконсервованому кістковому мозку за умовою забеспечення збалансованого клітинного складу мієлотранс-плантата.

При оцінці 30-добової виживаємості опромінених реципієнтів нативного і кріоконсервованого кісткового мозку відмічена менша ефективність застосування вичерпаного по АК кісткового мозку, що може бути пояснено встановленим фактом недостатності медулярного крововтворення на ранніх етапах післятрансплантаційного періоду. Разом з тим, селезінкове кровотворення у випадку трансплантації нативного матеріалу небагато відрізняється від контроля. Можна припустити, що АК володіють в більшій мірі впливом на гемопоез в кістковому мозку, так як серед них присутні стромальні елементи, регуляторна роль якіх в медулярному кровотворенні обмірковується в літературі [Andreoni, 1990]. .

В проведених дослідженнях виявлено, що виведення АК істотно не відбилося на захисному потенціалі нативної суспензії, отриманої після пенінга, тобто позбавленої основної маси Thy-1,2+ клітин, фракції Thy-1,2“ (табл.2). Як нативна,так і кріоконсервована популяція забес-печила виживаємість тварин, подібну в групі, яка є для них контрольною — тварини з нативним трансплантатом без АК. Аналогічний ефект встановлено при оцінці колонієутворюючої активності цієї фракції. Представлені результати свідчать про те, що Thy-1,2“ фракція для здійснення своєї захисної функції менш вразлива до дії регуляторних сигналів, які здійснюються АК. Крім того, ця популяція позбавлена клітин Т-ряду, які є регуляторними і функція яких після кріоконсер-вування може істотно модифікуватися [Venkataraman, 1986, Попов Н.Н.

1990], ідо у кінцевому підсумку може змінювати низку регуляторних взаємодій в гемопоезі.

Встановлено, що обробка донорів 5-ФУ приводить до істотної зміни клітинного складу кісткового мозку на фоні різкого зниження клітинного складу органа. Абсолютна кількість КУОс8 та КУОс12 превищує приблизно в 2 рази їх початковий рівень в нормальному мієлотрансплантаті. Таке підвищення відбувається мабуть за рахунок швидкого росту популяції кровотворних попередників після елімінації цитостатиком проліферируючого пулу. На фоні підвищення кількості Thy-1,2+ клітин, концентрація Thy-1,2+ КУОс значно знижена, що може бути наслідком “розбавлення” їх формиругочимися Thy-1,2“ КУОс, що підтверджується підвищенням загального числа КУОс. На підставі отриманих результатів важливо відмітити, що кістковий мозок, оброблений 5-ФУ, містить високий процент Thy-1,2+ елементів, серед яких присутні регуляторні Т-клітіши [Мірошніченко І.А., 1987], відомі продуценти ІЛ-3 -фактора стимулюючого проліферацію поліпотентних стволових клітин [Leary, 1988]. Експерименти показали, що обробка цитостатиком донорів не змінює кількість АК в кістковому мозку, але приводить до зміни функціональної актцивності цієї фракції, що виявляється, зокрема, в різній здатності АК з інтактного кісткового мозку і кісткового мозку донорів, оброблених цитостатиком стимулювати колонієутворюючу активність кріоконсервованого кісткового мозку. Цей факт погоджується з літературними данними про стимуляцію продукції КСФ в умовах впливу на організм екстремальних факторів (при стресі, запаленні) [Quessenberry, 1990]. Згідно сучасним уявленням, одним з найважливіших продуцентів КСФ є макрофаги, присутні в адгезивній фракції кісткового мозку.

Після кріоконсервування в режимі з ДМСО колопієутворююча активність трансплантата від донорів, попередньо оброблених цитостатиком, знижується, однак сумісне введення цих клітин з адгезивною

фракцією чи тимоцитами в певній мірі компенсує колонієутворюючу активність, що доводить участь регуляторних елементів в забеспеченні функціональних властивостей кріоконсервованого мієлотрансплантата, попередньо обробленого цитостатиком.

ВИСНОВКИ

1. Функціональна активність кріоконсервованого мієлотрансплантата визначається сукупністю властивостей присутніх в ньому кровотворних попередників і володіючих “трансплантабельністю” регуляторно-акцесорних клітин гемопоезу.

2. Акцесорні елементи присутні во фракції АК мієлотрансплантата і проявляють функціональну активність у відношенні нативних і кріоконсервованих кровотворних попередників різного рівня диференціювання при дії ендо- і екзогенних регуляторних сигналів.

3. При різних режимах кріоконсервування змінюється не тільки кількість і функціональна активність самих кровотворних попередників, але й акцесоних елементів мієлотрансплантата, які мають у відношенні цих клітин регуляторну активність. В залежності від обраного режиму кріоконсервування може проходити селективна елімінація акцесорних елементів. .

4. В гетерогенній популяції кісткового мозку ідентифікована фракція Thy-1,2+ клітин, яка збагатчена поліпотентними КУОс-12 і яка містить регуляторно-акцесорні елементи з фенотипичними маркерами зрілих Т-лімфоцитів. Після кріоконсервування кісткового мозку в різних режимах кількість Thy-1,2+ клітин знижується, шо корелює

із зниженням виживаємості опромінених реципієнтів.

5. Тест колонїєутворення in vivo може буті об'єктивним у відношенні оцінки захисного потенціалу (істинної кількості КУОс) кріоконсервованого кісткового мозку тільки за умовою забеспечення збалансованого клітинного складу мієлотрансплантата, так як він є інтегральним показником цілості пересаджених КУОс і акцесорних клітин

кісткового мозку. .

6. Попереднє уведення донорам кісткового мозку цитостатиків (5-фторурацила) змінює компонентний склад мієлотрансплантата (кількість КУОс, стан регуляторно-акцесорних елементів), що супроводжується додатковими змінами компонентного складу мієлотрансплантата після кріоконсервування і порушенням його функціональної активності.

Список робіт, надрукованій по темі дисертації

1. Функціональна активність кріоконсервованих кровотворних клітин (КУОс) в залежності від компонентного складу мієлотрансплантата / Проблеми кріобіології.-1993, N4.-C.34-40 (соавт. Гольцев А.М., Остан-кова JT.B-, Дубрава Т.Г.)

2. Кріоконсервування як можливий метод оцінки ролі компонентного складу мієлотрансплантата у виявленні функціональної активності кровотворних клітин /Проблеми кріобіології.-1994, Nl.-C.3-14 (соавт. Гольцев А..М.).

3. The importance of myelotransplant component content in manifestation of cryopreservaed hemopoietic precursors functional activity. The assesment of bone marrow adhesive cells role// Cryoletters.- 1994.- N.4.- P.203-208. (with Goltsev A.N., Ostankova L.V., Dubrava T.G.).

4. Кріоконсервоваиий кістковий мозок: потенціал та межи використання в умовах зміненого компонентного складу /Проблеми кріо-6kxToru.-1995.-N2.-C.29-36 (соавт. Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Останкова Л.В., Опанасенко О.В.)

5. Мембранні структури, які визначають стенотипічні характеристики і функціональний статус кровотворних клітин; можлива модифікація під впливом факторів кріоконсервування. 1 Частина /Проблеми кріо-біологїї. -1995.-N3.-C. 11-23 (соавт. Гольцев А.М., Останкова Л.В., Дубрава Т.Г., Опанасенко О.В.)

6. Спосіб оцінки захисного потенціалу кісткового мозку при міело-

трансплантації /Авт. св. N1798310 Заявка 24.04.90 N4818047/14 Надр.*’ 28.02.93. ' ' . ‘ " . • • . ’

7. 'Ідентифікація антигена Т1гу-1,2 на кровотворних попередниках

(КУОс) і оцінка його стану після кріоконсєрвування кісткового мозку /Деп. у ВІНІТІ 18.07.90t N4034-590, 51 с. (соавт.'Гольцев А. М., Дубрава Т.Г., Коваленко Л.О.). ■ ’ .

8. Можливість використати пенінг-методу для ідентифікації на крово-

творних клітинах нормального і регенеруючого кісткового мозку антигена ТЬу-.1,2 і оцінка його стану після кріоконсєрвування мієло-каріошітів/в зб."Фундаментальні і прикладні проблеми кр'іобіології”, Харків.-1993.-С.84-49. (соавт.Гольцев А.М). ’

Луценко Е.Д. Роль компонентного состава костного Мозга, в . проявлении функциональной активности криоконсервироватгых крове- , творных клеток. . • '

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, (рукопись) по специальности 03.00.22 — криобиология. Институт проблем криобиологии и ■ криомедицины Национальной' академии наук Украйны, Харьков, 1996. . ' , .

, Защищается диссертационная работа, которая содержит результата исследования клеточных популяций миелотрансплантата (адгезивной фракции, клеток Т-ряда), которые вместе ■ с гсмопоэтическим микроокружением реципиента обеспечивают функциональную активность криоконсервированных кроветворных предшественников. Установлено, .что костный мозг содержит акцессорно-регуляторные ' популяции, обладающие “трансплантабельностыо”. Функциональное ' состояние криоконсервированного миелотрансплантата опредляется ' сохранностью, не только самих кроветворных предшественников, но и

сбалансированным клеточным составом регуляторных элементов. Экспериментально доказано,что криоконсервирование с использованием различных режимов замораживания-отогрева может служить методом селективной элиминации различных акцессорно-регуляторных популяций клеток из костного мозга.

Lutsenko E.D. ROLE OF BONE MARROW COMPONENT CONTENT IN MANIFESTATION OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF CRYOPRE-SERVED HAEMOPOIETIC CELLS

Thesis for obtaining scientific degree of candidate of biological sciences (manuscript) on the speciality -03.00.22. - cryobiology. Institute for Problems of Cryobiology & Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov, 1996.

Thesis contains the results of studies of myelotransplant cellular populations (adhesive fractions, T-cells) which are together with microenvironment of recipient provide functional activity of cryopreserved haemopoietic precursors. It has been establshed that bone marrow contains accessory regulatory populations having “transplantability”. Functional state of cryopreserved myelotransplant is determined by the integrity of not only haemopoietic precursors themselves but and by balanced cellular content of regulatory elements. It has been experimentally proved that cryopreservation using various regiments of freeze-thawing can serve as the method for selective elimination of different accessory regulatory cell populations from bone marrow.

Key words: cryopreservation, bone marrow, adhesive cells, myelotransplant integrity, Thy-1,2+ cells.

Ключові слова: кріоконсервування, кістковий мозок, адгезивні клітини, ’’повнота” мієлотрансттлантата, Thy-1,2+ клітини

Відповідальний за випуск - ГРИЩЕНКО В.І.

Підпис, до друку 6№,$6 р. Формат 60 х 84 1/16 Папір тип. Друк офсетний. Усл. др. арк. 1,0. Тираж 100 прим. Зам. Безкоштовно.

адреса типографїї Ротаптзінт ФТІКТ НАН України,

ХагжІв-Іб4, пп. Леніна, 47