Роль клеток реципиента и нарушения структуры тканевого матрикса в механизме кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца

Фадеева, Ирина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль клеток реципиента и нарушения структуры тканевого матрикса в механизме кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль клеток реципиента и нарушения структуры тканевого матрикса в механизме кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца"

На правах рукописи

ФАДЕЕВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

РОЛЬ КЛЕТОК РЕЦИПИЕНТА И НАРУШЕНИЯ СТРУКТУРЫ ТКАНЕВОГО МАТРИКСА В МЕХАНИЗМЕ КАЛЬЦИФИКАЦИИ ТРАНСПЛАНТАТОВ СОСУДОВ

И КЛАПАНОВ СЕРДЦА

Специальность 03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

10 ОКТ 2013

Пущино - 2013

005534840

Работа выполнена в Лаборатории тканевой инженерии Федерально1 государственного бюджетного учреждения науки Институт теоретической экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Акатов Владимир Семенович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Куликов Александр Владимирович

(рук. Сектора экспериментальной трансплантологии ИТЭБ РАН)

кандидат медицинских наук Деев Роман Вадимович

(в.н.с. Лаборатории №1 ФГБУ ГНЦ Федеральный

медицинский биофизический центр

им. А.И. Бурназяна ФМБА России, г. Москва)

Ведущая организация: ФГБУ Научный центр сердечно-сосудистой

хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН (г. Москва)

Защита диссертации состоится « 02 » октября 2013 г. в 14°° на заседании совет Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, н соискание ученой степени доктора наук, созданном на базе Федерапьног государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, г Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан « Л -Г» августа 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, кандидат физ.-мат. наук ^/сссс^у Ланина Н. Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. На сегодняшний день единственным способом лечения зожденных и приобретенных клапанных пороков сердца и сосудов дегенеративного ¡неза является хирургическая замена поврежденных клапанов и сосудов ютветствующим протезом или графтом (трансплантатом). Клиническое применение эансплантатов сосудов и клапанов сердца (ТСКС) в значительной степени связано с ^достатками механических клапанов и фиксированных биопротезов, такими как зомбоэмболические осложнения, необходимость пожизненного приема тгикоагулянтов, а также протезным эндокардитом, неспособностью к росту, оддержанию и обновлению структуры ткани, токсическим действием знсервирующих агентов и т.д. (Mirensky et al., 2008; Demer et al., 2002; 2008; averich, 2008; Акатов и др., 2006, 2010). Альтернативой имеющимся протезам вляется применение модифицированных нефиксированных трансплантатов, которые е требуют приема антикоагулянтов, иммунодепресантов и потенциально способны к епопуляции и ремоделированию. Однако применение таких трансплантатов граничено развивающейся после имплантации тканевой дегенерацией и альцификацией матрикса (Cebotari et al., 2002; Wilhelmi et al., 2003; Vesely, 2005; ratos-Pérez et al., 2008; de Mel et al., 2008; Haverich, 2008; Muratov et al., 2010; окерия и др. 1997; 2004; Акатов и др. 2010), что требует проведения сложных овторных операций.

Клинические проявления кальцификации клапанного аппарата изучены осконально, однако споры о ее этиологии продолжаются с 1904 года (Monckeberg, 904). Предлагаются различные гипотезы о механизме инициации кальциноза рансплантатов и биопротезов клапанов сердца. В частности, рассматривается редположение о связи инициации кальциноза ТСКС с компонентами погибших теток (Ferrans et al., 1980; Valente et al., 1985; Розанова, Васин, 1999), с омпонентами тканевого матрикса: с коллагеном I типа, фибронектином (Watson et al., 998; Price et al., 2006), эластином (Bailey et al., 2003; Lee et al., 2006; Price et al., 2006; osaka et al., 2009; Ronchetti et al., 2013), кальций-связывающими белками (Gla-ротеины, остеокальцин, остеопонтин, остеонектин, фетуин А), фосфопротеинами Shanahan et al., 1998; Proiidfoot et al., 1998), щелочной фосфатазой (Hui et al., 1998; rice et al., 2008). Предполагается, что при гибели клеток в результате ерментативного лизиса может нарушаться связь гликозаминогликанов с коллагеном тканевом матриксе, что также может способствовать образованию сайтов, ффинных к фосфатам кальция (Loose et al., 1993). Однако, несмотря на интенсивные сследования, ясного представления о комплексном механизме инициации кальциноза рансплантатов сосудов и клапанов сердца в настоящее время нет.

Основываясь на предположении о том, что основной причиной кальцификации и егенерации ТСКС являются клетки донора, в последние двадцать лет активно азрабатываются способы предварительного обесклеточивания (децеллуларизации) атрикса графтов, либо принудительной контролируемой гибели в них клетки донора до имплантации (девитализация ткани) (O'Brien et al., 1999; Teebken et al., 2000; Schoen, Levy, 2005; Vesely, 2005; Lichtenberg et al., 2006; Tudorache et al., 2007). Предполагается, что в результате лизиса или гибели клеток донора до имплантации будет снижена иммуногенность и элиминированы центры нуклеации кальциноза.

Однако современные методы обесклеточивания матрикса трансплантатов не мо одновременно предотвращать дегенерацию, кальциноз и иммуногенност трансплантатов клапанов сердца и сосудов (Акатов и др., 2010). Таким образор. разработка новых высокоэффективных методов предварительной модификаци трансплантатов остается одной из самых актуальных проблем тканевой инженерии.

Ранее в Лаборатории тканевой инженерии ИТЭБ РАН была сформулирована экспериментально подтверждена гипотеза о том, что инициация кальциноза трансплантатах обусловлена накоплением кальция и фосфатов в митохондрия погибающих клеток (Акатов и др., 2005; Фесенко (Рындина), 2006), на основани которой разработан и внедрен в медицинскую практику способ антикальцинозно девитализации (АКД), позволивший радикально снизить кальцификацш имплантированной ткани. (Акатов с соавт., 2007). С целью дальнейшего повышени биосовместимости ТСКС разработан способ ферментативного разрушения клето донора в стенках аорты после АКД (Акатов и др., 2010) с максимальным сохранение1 нативной структуры тканевого матрикса. Однако такое разрушение спровоцировал восстановление способности трансплантатов к кальцификации и усилило клеточны ответ в организме реципиента. Эти результаты трудно объяснить на основ представлений о митохондриальном механизме кальциноза и указывают н множественный характер механизмов кальцификации ТСКС. Таким образом возникает необходимость дальнейшего выяснения механизмов кальцификаци трансплантатов сосудов и клапанов сердца, в частности необходимо выяснить рол структурных повреждений внеклеточного матрикса трансплантатов и участие клето реципиента в инициации кальциноза имплантированной ткани.

Целью данной работы являлось выяснение механизмов кальцификаци: трансплантатов сосудов и клапанов сердца и разработка на основе полученны: результатов способов ее подавления.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. оценка возможности подавления кальциноза трансплантатов сосудов : клапанов сердца при разрушении в них клеток донора до имплантации;

2. изучение роли клеток реципиента в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца;

3. выяснение роли липидов в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца;

4. изучение роли повреждений внеклеточного матрикса трансплантатов сосудов и клапанов сердца в их в кальцификации;

5. разработка способа предотвращения кальциноза и повышения биосовместимости трансплантатов сосудов и клапанов сердца на основе полученных результатов;

6. разработка способа ускорения репопуляции трансплантатов сосудов и клапанов сердца.

Новизна работы. В работе впервые показано, что известные из научной литературы способы децеллуларизациии трансплантатов клапанов сердца и сосудов повреждают структуру тканевого матрикса, сохраняя и(или) усиливая их способность к кальцификации. Впервые установлено, что кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца осуществляется в значительной степени при участии клеток реципиента, и липидные компоненты ТСКС играют решающую роль в инициации

ьциноза. Научная новизна заключается в том, что авторами впервые предложено редставление о том, что механизм кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов :рдца является комплексным и включает механизмы зависимые и не зависимые от теток реципиента. Авторами впервые предложена гипотеза о механизме зависимой г клеток реципиента кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов, знованная на представлениях об атеросклеротическом поражении сосудов и едиальном кальцинозе. Впервые показано, что независимые от клеток реципиента еханизмы кальцификации ТСКС определяются структурными повреждениями шлагеновых и эластиновых волокон матрикса. Показана возможность редотвращения кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца путем их бработки до имплантации натуральным липофильным детергентом дезоксихолатом атрия, препятствующим аккумуляции кальция митохондриями, инактивирующим изосомальные гидролазы и протеазы клеток донора, удаляющим инициаторные ипидные компоненты матрикса и не нарушающим целостности внеклеточного атрикса трансплантатов (минимальные повреждения). Показано, что использование остовых факторов в качестве хемоаттрактантов клеток реципиента может как ровоцировать минерализацию ткани, так и усиливать репопуляцию матрикса графта летками реципиента без развития кальциноза в зависимости от редимплантационной обработки трансплантатов сосудов и клапанов сердца.

Полученные данные расширяют представление о механизмах патологической альцификации биологических тканей, что актуально не только для проблемы онимания механизма кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца, но и для роблемы патологической минерализации тканей в организме, в частности при едиальном кальцинозе и атеросклерозе сосудов.

Практическая значимость исследования заключается в том, что на основе роведенных исследований разработан эффективный способ предотвращения альциноза и повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца и осудов. Предложенный способ запатентован и внедрен в технологический регламент роизводства аллотрансплантатов клапанов сердца в НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева АМН, г. Москва. Полученные в работе результаты могут быть использованы в ачестве фундаментальной основы для разработки новых способов повышения иосовместимости трансплантатов клапанов сердца и сосудов.

Апробация. Основные результаты диссертационной работы были представлены а IV и V Всероссийских съездах трансплантологов (Москва, 2008, 2010), онференции Экспериментальная и теоретическая биофизика '09,'10 (Пущино, 2009, 010), IV и V Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные опросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2010; Уфа, 2012), 1еждународном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальная и рикладная наука» (Пущино, 2010, 2012), Школе-конференции для молодых ученых (Клеточные технологии для регенеративной медицины» (Санкт-Петербург, 2011), ущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2013) и Всероссийском симпозиуме и Школе-конференции для молодых ученых по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из веден обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложен! результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литератур! Работа изложена на страницах, содержит ¿Г/ рисунков и Л- табли

Список цитируемой литературы включает источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. В экспериментах были использованы аортальные клапаны серд1 свиньи, любезно предоставленные НЦ ССХ им. Бакулева РАМН (г. Москва), а такя ООО «Кампродукт» (д. Волохово). Аортальные клапаны с частью восходящей аорт извлекались не позднее, чем через 30 минут после забоя животных. Весь матерш помещался в питательную среду RPMI-1640 с добавлением гентамицина (400 мкг/м. и флуконазола (50 мкг/мл). После доставки в лабораторию (не позднее, чем через часа, при 4°С) ткани подвергались многоступенчатым обработкам с целью и девитализации и(или) децеллуларизации.

Известно, что створки трансплантатов клапанов сердца при имплантации организм реципиента не минерализуются: кроме случаев кальциноза клапанов сердг бактериального генеза, минерализация створок всегда является вторичной происходит за счет пророста кристаллов кальция из комиссур и основания створо т.е. из сосудистой стенки клапана (Barratt-Boyes et al., 1977; Levy et al., 1983; Imamur et al., 1989; Poller D.N. et al., 1989; Giachelli, 1999; Гилинская Л.Г. и др., 2003; Рындин (Фесенко), 2006). Таким образом, во всем цикле работ исследовалась степен кальцификации непосредственно стенок аорты.

Обработка материала. Нативные кондуиты отмывались физически и хранилис в стерильных условиях. В экспериментах использовались фрагменты стенк аортального клапана. Нативная ткань стенки аорты рассекалась на фрагмент размером 8x12 мм и сохранялась до имплантации или обработки в среде RPMI-1640 добавлением гентамицина (400 мкг/мл) и флуконазола (50 мкг/мл) при 4°С.

Девитализация ткани. 1. Часть фрагментов подвергали антикальцинозно девитализации (АКД) (Акатов с соавт., патент №2291675, 2007).

2. Для разрушения клеток донора часть стенок аорты после доставки лабораторию подвергалась обработке с помощью, так называемого гипотоническог шока (O'Brien et al., 1999).

3. Часть образцов подвергали ферментативной девитализации (Teebken et al. 2000).

4. Часть нативных фрагментов аорты подвергалась обработке натуральны липофильным детергентом - 1%-ным раствором дезоксихолата натрия (далее 1°/ ДОАсп) (Фадеева с соавт., 2012, Патент РФ №2012141322).

5. Для сравнительного исследования липофильного действия дезоксихолат натрия часть нативных фрагментов стенки аорты свиньи обрабатывали ацетоном (QP Panreac Química, Spain) в условиях шейкера-инкубатора (New Brunswick Scientific, USA) при 8°C в течение 24 часов, с последующим 3-кратным отмыванием в физ. р-ре

Р), рН 7.2 при 100-кратном соотношении объема отмывочного раствора к объему кани.

6. Часть фрагментов аорты подвергали 48-часовой обработке 2%-ным р-ром рибутил фосфата (TnBP, Sigma, USA) в трис-буфере, рН 8.0 (Cartmell et al., 2000; )eeken et al., 2011) при комнатной температуре, с последующим 3-кратным тмыванием в ФР, рН 7.2 при 100-кратном соотношении объема отмывочного аствора к объему ткани.

7. Часть нативных и часть девитализированных антикальцинозным способом бразцов подвергали обработке в трис-буфере, рН 8.0, содержащем 0,1% и 1% одецилсульфата натрия (SDS, Amresco, USA), а также лизирующим буфером RIPA, H 8.0, 20°С при слабом перемешивании на шейкере в течение 24 часов (Dohmen et /., 2006; Erdbriigger et al., 2006; Tudorache et al., 2007; Ott et al., 2008). После роцедуры образцы 10-кратно отмывались в течение 6 суток часа в ФР, рН 7.2 при 00-кратном соотношении объема отмывочного раствора к объему ткани.

8. Часть образцов подвергали методу энзиматической децеллуларизации, ключающей длительную инкубацию тканей либо сразу после проведения Ферментативной обработки в ФР, рН 7.2 (ФО/инк), либо после проведения цикла нтикальцинозной девитализации с последующей краткосрочной обработкой зотоническим р-ром, рН 7.2, содержащем 0.25% трипсина и 0.02% ЭДТА (0.5 мМ) в ечение 6 часов при 37°С (АКД/Тр/инк) или воздействия ЗООЕД/мл плазмина Биофарма, Россия) в течение 24 ч (АКД/Пл/инк) в условиях шейкера-инкубатора. Хоследующая длительная инкубация подвергшихся воздействию ферментов тканей существлялась в бескальциевой среде (ФР, рН 7.4). Для достижения ецеллуларизирующего эффекта ткани инкубировали при 37°С в течение 20 суток, что беспечивало полную элиминацию хроматина в матриксе трансплантатов.

9. Часть экспериментальных образцов была обработана до имплантации помимо писанного выше метода энзиматической децеллуларизации (АКД/Тр/инк), 1%-ным -ром дезоксихолата натрия (АКД/Тр/инк/ДОА) по методике (Фадеева с соавт., 2012, 1атент РФ №2012141322) для удаления липидных компонентов матрикса рансплантатов. Данная дополнительная обработка бесклеточных фрагментов аорты

свиньи раствором дезоксихолатом натрия должна была показать, можно ли снизить иммуногенность децеллуларизированных ксенотрансплантатов за счет удаления перед имплантацией аттрактантных липидных компонентов матрикса ТСКС.

Культура клеток. Клетки эмбриональных фибробластов мыши линии NCTC clone 929 (L929) получены из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки линии L929 выращивали в среде DMEM (Биолот, Россия)с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, USA), 40 мкг/мл гентамицина, при 37°С и 5% углекислого газа в условиях СС^-инкубатора (Binder, Germany).

Получение первичной культуры клеток. Культуру гладкомышечных клеток из стенок аорты получали методом культивирования эксплантатов ткани (Акатов и др., 2000; Акатов и др., 2001 ; Mahabeleshwar et al., 2006).

Изучение биосовместимости девитализированных и(или)

децеллуларизированных тканей in vitro. Дополнительно отмытые (ФР, рН 7.0, 20 мкг/мл флуконазола, 80 мкг/мл гентамицина) фрагменты стенок аорты человека после девитализации и(или) децеллуларизации выдерживали в течение 1 суток в среде ДМЕ

с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, USA). Затем фрагменты ткане площадью 0.3 кв.см и диаметром 3,25 мм помещали в лунки культуральных 96 луночных планшетов, в лунки добавляли по 0.2 мл суспензии клеток концентрации 105 клеток/мл, создавая плотность посеянных клеток, приблизительно равнуи плотности насыщения стационарных культур (без перфузии, без смены среды). Поел 24 часов культивирования, фрагменты тканей с прикрепленными клеткам] переносили в лунки 12 луночного культурального планшета по 1 фрагменту на лунк; и добавляли среды по 2 мл на 1 фрагмент для устранения ограничений массообмен клеток со средой. Ткани с посеянными на них клетками культивировали в С02 инкубаторе, осуществляя замену среды на свежую 1 раз в сутки. Цитотоксически эффект или его отсутствие оценивали по отношению доли живых клеток в опытных i контрольных фрагментах ткани на 0, 1 и 3 сутки культивирования. Количественно соотношение числа живых и погибших клеток оценивали методом флуоресцентно1 микроскопии, одновременно окрашивая клетки флуоресцентными зондам] Bisbenzimide Hoechst 33342 (Sigma, USA) и этидиум бромид (ЭБ) (Sigma, USA (Акатов и др., 2000).

Модель подкожной имплантации биоматериалов крысам. Для исследовани кальциноза использовали известную модель подкожной имплантации биоматериало] крысам (Schoen et al., 1986; Lee et al., 1998; Волова, 2009). Фрагменты стенки аорть или ее адвентиции размером 8x12 мм2 помещали в пористые камеры, изготовленньг из титановой сетки, с размерами пор 50 мкм (группа 2) и имплантировали подкож» крысам в область спины под Золетил/Ксилазиновым наркозом (6.0/12.0 мг/1 кг веса) С целью выявления роли клеток реципиента в кальцификации ТСКС, фрагмента стенки аорты размером 8х 12 мм2 помещали в герметичные пористые лавсановые камеры с размерами пор 0,2 мкм (группа 1) и имплантировали крысам в область спины подкожно. Эта модель исключает прямой контакт клеток окружающих тканей с поверхностью исследуемого образца, и позволяет провести сравнительный анализ вклада клеточных и гуморальных факторов в механизм кальцификации.

Лабораторные животные. В качестве экспериментальных животных использовались крысы линии Wistar, самцы, вес 180-200 г. Животные содержались в стандартных условиях (температура 21-23°С, влажность 30-70%, 12 часовой период освещения, корм и вода - ad libitum). Все манипуляции с животными осуществлялись в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009.

Гистологический анализ. Гистологический анализ фрагментов стенок аорты и створок клапанов до и после имплантации проводили по следующей методике: фрагменты стенок аорты фиксировали в растворе нейтрального формалина (10%) при 4°С, 18 часов, отмывали от фиксатора 24 часа, помещали в заливочную среду GSV— 1 (Slee, Germany) или О.С.Т. Compound Tissue Тек (Sakura, Japan), замораживали на замораживающем столике Cryobar Boost (элемент Пельтье) при температуре -60°С в камере криотома Shandon CRYOTOME 620Е (Thermo Fisher Sei., USA) и делали криосрезы толщиной 11 мкм при рабочей температуре камеры —18°С. Часть криосрезов подвергали стандартному гистологическому окрашиванию (гематоксилин/эозин, судан III/Гемалаун Май ера, амидочерный 10В в пикриновой кислоте, окраска по Ван-Гизону, окраска по Вейерхгофу в модификации Муто и т.д. (Лилли, 1969; Саркисов, Перов, 1996)). Окрашенные препараты анализировали и

лали их микрофотографии используя микроскоп Leica DM6000 В (Leica Licrosystems, Germany) и цифровую камеру Go-3 (Qlmaging, Canada).

Гистохимический анализ минерализации матрикса. Определение степени мнерализации тканевого матрикса проводили с помощью индикаторного красителя лизариновый красный S (2%, pH 4,4) (Роскин, 1957). С целью дифференцирования гложений минерализованного кальция (характерное образование яркого, малиново-фасного окрашивания - «кальциевый лак») к ядрам клеток и компонентам матрикса эепараты докрашивались 0,05% раствором толуидинового синего (ядра клеток -шие, волокна матрикса - бежево-голубые). Для определения точной локализации инерализованного кальция использовали гистохимический способ окрашивания юзов по методу ван Косса (Лилли, 1969). Окрашенные препараты анализировали и ¡лали их микрофотографии используя микроскоп Leica DM6000 В (Leica microsystems, Germany) и цифровую камеру Go-3 (Qlmaging, Canada).

Флуоресцентная микроскопия. Экспресс-анализ соотношения числа живых и огибших клеток в тканях определяли методом прижизненной люминесцентной икроскопии (ДЛО, двойное люминесцентное окрашивание) с использованием краски тотальных препаратов ядерными красителями ЭБ и Hoechst 33342 (Акатов и

2000). Живые клетки флуоресцировали зеленым светом, погибшие - оранжевым, кспресс-анализ наличия клеток и(или) ядер клеток криосрезов нативных и евитализированных образцов до и после имплантации проводили на конфокальном икроскопе TCS SP5 (Leica, Germany), окрашивая криосрезы ткани перед анализом дерными красителями ЭБ (10 мкг/мл) в среде ДМЕ в течение 3 мин. Ядра клеток, роматин флуоресцировали оранжевым или красным цветом, а волокна тканевого атрикса - зеленым цветом.

Количественное определение минерализованного кальция. Содержание альция во фрагментах тканей клапанов сердца до и после имплантации определяли етодом абсорбционной спектроскопии. После эксплантации фрагменты ткани тмывали в течение 1 суток в ФСБ без Са2+, высушивали в течение 2 часов при 100°С, змеряли сухой вес образцов, растворяли минерализованный кальций в 1Н HCl и атем проводили измерение количества минерализованного кальция в них с помощью тандартного набора Calcium AS FS (Arsenazo III) (DiaSys, Germany), используя рибор Infinity F200 (Tecan, Austria).

Статистический анализ. Результаты усредняли по 10-12 образцам, мплантированным разным крысам и определяли среднеквадратическую ошибку, ксперименты проводили не менее чем в трех повторах. Результаты исследований редставлены в виде среднего ± т, где т - стандартная ошибка среднего, остоверность отличия выборок экспериментальных данных, а также средних начений оценивали с помощью критерия критерия Уитни-Манна для независимых ыборок. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторах (п > 3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние разрушения клеток донора на степень дегенерации кальцификации трансплантатов стенки аорты

Несмотря на активную разработку способов обесклеточивания матрикса ТСК перед имплантацией, вопрос о влиянии известных способов децеллуларизации г развитие дегенеративных процессов и возникновение минерализации трансплантате при имплантации в организм реципиента остается невыясненным. Опираясь г данные научной литературы, исследовали влияние ферментативной и детергент децеллуларизации на степень обесклеточивания, структуру матрикса фрагменте аорты свиньи до имплантации (рис. 1, рис. 2) и после 6 недель подкожно имплантации крысам (рис. 3).

На первом этапе работы исследовали следующие способы предимплантационно обработки ТСКС: (1) обработка гипотоническим (осмотическим) шоком и нуклеазам (далее ГШ) по методике (O'Brien et al., 1999); (2) ферментативная обработка (дале ФО) трипсином и нуклеазами по методике (Teebken et al, 2000); обработка неионным детергентами - (3) 0,1%-ным, (4) 1%-ным р-ром додецилсульфата натрия (далее 0.1° или 1% SDS) и (5) лизирующим буфером RIPA по методике (Erdbriigger et al., 200i Dohmen et al., 2006; Tudorache et al., 2007; Ott et al., 2008; Caamano et al., 2009 (6) обработка 2%-ным р-ром детергента трибутил фосфата (далее ТпВР) по методик (Cartmell et al., 2000; Deeken et al., 2011); (7) антикальцинозная девитализация (дале АКД) по методике (Акатов с соавт., Патент РФ №2291675, 2007).

До обработки, согласно флуоресцентной микроскопии, до 50% эндотелиальны клеток на поверхности t. intima, а также от 50 до 80% гладкомышечных клеток стенках аорты были живыми (рис. 1а). Для сравнения степени сохранности ил нарушения целостности ядер клеток донора, а также структуры тканевого матрикс трансплантатов стенки аорты после проведения девитализирующих и(или децеллуларизирующих процедур со структурой нативного матрикса (рис. 16) бы проведен гистологический анализ криосрезов с помощью конфокальной микроскопии

Гистологический анализ обработанных фрагментов стенок аорты показал, чт такие известные способы децеллуларизации, как применение детергентов 2% р-р трибутил фосфата (ТпВР) (рис. 1в), SDS (в концентрации 0,1%) (рис. 1г), а такж лизирующего буфера RIPA (рис. 1д) не обеспечивает значимого удаления клето донора из матрикса стенки аорты. В связи с отсутствием децеллуларизирующег эффекта образцы данных групп исключались из эксперимента по исследовани разрушения клеток донора на степень дегенерации трансплантатов стенки аорты.

Использование методики гипотонического шока (ГШ) также не вызывало полной элиминации ядер клеток донора, оказывая при этом значительное повреждающее действие на структуру матрикса трансплантата (рис. le). Использование SDS в 1%-ной концентрации обеспечивало полную децеллуларизацию трансплантата, при этом в значительной степени повреждая волокнистую структуру матрикса (рис. 1ж). Применение способа ферментативной обработки (ФО) обеспечивало элиминацию ядер клеток донора только вблизи t. intima (рис. 1з) трансплантата, при этом в основном среднем слое матрикса графтов (t. media) обесклеточивания не наблюдалось (рис. 1и).

Рисунок 1 - Микрофотографии препаратов нативных и подвергшихся известным из литературы способам децеллуларизации фрагментов стенки аорты свиньи до имплантации а- тотальный препарат нативной стенки аорты свиньи до обработки (t. intima, вид сверху). Конфокальная микроскопия, ДЛО, окраска ЭБ и Hoechst 33342; ядра живых клеток - зеленые, ядра погибших клеток - оранжевые.

6-и- микрофотографии криосрезов нативных и обработанных стенок аорты свиньи перед имплантацией: б- t. media нативной стенки аорты; в- t. media фрагментов после обработки 2% ТпВР; г- t. media фрагмента после обработки 0.1% SDS; д- t. media фрагмента после обработки лизирующим буфером RIPA; е- t. media фрагмента после обработки ГШ; ж- t. media фрагмента после обработки 1% SDS; з-и- фрагменты после ФО (з- t. intima, и- t. media). Конфокальная микроскопия, окраска ЭБ; ядра клеток красного или желто-оранжевого цвета (или их отсутствие) на фоне собственной флуоресценции матрикса зеленого цвета.

В предыдущих исследованиях (Акатов и др., 2006; 2010; Muratov et al., 2010) эыло установлено, что как при имплантации в системный кровоток (ортотопическая Имплантация) собакам, так и при подкожной (гетеротопическая) имплантации крысам Наблюдалось сохранение структуры матрикса аортальной стенки графта и \ бесклеточивание матрикса за исключением узкой, вторично репопуляризованной !зоны вблизи t. intima и t. adventitia. Это наблюдение привело нас к выводу о том, что в процессах децеллуларизации погибших клеток имплантированной ткани может принимать участие либо внутриклеточная система лизосомальных пептидогидролаз клеток донора, обеспечивающая аутолиз/протеолиз внутриклеточных белков, либо тканевая протеолитическая система плазмы крови и тканевой жидкости, обусловленная секрецией ферментов макрофагами и нейтрофилами.

В дальнейшем определяли возможность аутолиза клеток донора в результате длительной инкубации нативных и девитализированных образцов стенки аорты in vitro (рис. 2). В работе выясняли возможность децеллуларизации нативных и АКД-

обработанных фрагментов стенки аорты после их длительной инкубации: (1) в сре; ДМЕМ; (2) в среде ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки (HyClone, USA (3) в эмбриональной сыворотке (HyClone, USA); (4) в 150 мМ р-ре NaCl, 3 м? HEPES, pH 7.0.

Инкубация фрагментов в каждой группе также осуществлялась при различны температурных режимах (4°С, 20°С и 37°С) и различных сроках инкубации (14 сут, 3 сут, 2 мес и 4 мес).

Установлено, что даже через 4 месяца инкубации в различных средах и пр: различных температурных режимах и в образцах АКД и в нативных фрагмента разрушения клеток донора не происходило, о чем свидетельствовало сохранени целостности ядер клеток. Микрофотографии криосрезов гистологических препарато указанных групп были подобны рис. 2а.

Рисунок 2 - Микрофотографии криосрезов стенок аорты свиньи после инкубации в различных средах а- микрофотографии криосрезов нативных и обработанных АКД, инкубированных в различных средах (физ. р-р, ДМЕ, эмбриональная сыворотка) и при различных температурах в течение 4 мес (подобный результат); б- фрагмент после АКД/Тр; в- фрагмена после АКД/Пл; г- фрагмент после АКД/Тр/инк; <>-фрагмент после АКД/Пл/инк; е- фрагмента после ФО/инк. Конфокальная микроскопия, окраска ЭБ; ядра клеток красного или желто-оранжевого цвета (или их отсутствие) на фоне собственной флуоресценции матрикса зеленого цвета.

Полученные данные о децеллуларизации имплантированных стенок сосудов также позволили предположить, что можно добиться обесклеточивания ТСКС бе: повреждения интактной структуры матрикса in vitro, путем их обработки до имплантации трипсино-подобными протеазами тканевой протеолитической системы. Для этого исследовали следующие методики энзиматической децеллуларизации: (I) инкубация фрагментов стенки аорты, подвергшихся ФО (ФО/инк); (II) инкубация фрагментов, подвергшихся АКД и последующему краткосрочному воздействию р-ра трипсина (0.25%) и ЭДТА (0.02%, 0.5 мМ) в течение 6 часов при 37°С (АКД/Тр/инк); (III) инкубация фрагментов, подвергшихся АКД и последующей краткосрочной обработке плазмином (300 ЕД/мл, Биофарма, Россия) в течение 24 ч при 37°С (АКД/Пл/инк). Инкубация образцов стенок аорты всех групп осуществлялась в

мскальциевой среде (ФР, рН 7.2) в условиях шейкера-инкубатора(Вю8ап, Latvia) при 7°С в течение 20 суток.

Было установлено, что во фрагментах АКД сразу после воздействия тротеолитических ферментов (0.25% р-р трипсина, 6 ч; ЗООЕД/мл плазмина, 24 ч) Ьазрушения клеток донора в матриксе стенки аорты свиньи не наблюдалось рис. 26,в). Однако при длительной инкубации этих групп уже через 20 суток мблюдалась полная элиминации хроматина в матриксе трансплантатов (рис. 2г,д). Аналогичная картина наблюдалась и для фрагментов, подвергшихся полному протоколу ферментативной обработки с последующей инкубацией (ФО/инк) (рис. 2е).

Следует отметить, что использование инкубационных сред, содержащих 1 мМ <альция (СаСЬ) и(или) 1 мМ магния (MgC^) на скорость или качество ^ецеллуларизации не влияло. Обнаружено, что элиминация хроматина в матриксе фрагментов ФО/инк начиналась раньше (к 5 суткам), но полное разрушение ядер леток донора во всех группах заканчивалось приблизительно к 20-24 суткам ¡нкубации. При этом было отчетливо видно, что во фрагментах после АКД и краткосрочной трипсинизации (6 ч), в отличие от длительного воздействия трипсина при ФО (48 ч) наблюдались менее выраженные повреждения волокнистой структуры матрикса (см. рис. 2г, рис. 2е и рис. 16).

Полученные результаты позволяют предположить, что достижение децеллуларизирующего эффекта во фрагментах стенки аорты свиньи при инкубации в бескальциевой и не содержащей протеаз среде происходит за счет непосредственного действия удержанного в тканевом матриксе трипсина или плазмина, а также на ¡неспецифическую активацию эластазы и, возможно, ряда металлопротеиназ (Broekelmann et al., 1997; Basalyga et al., 2004; Qin et al., 2006; Shetty et al., 2009; Вовчук, 2010).

Полученные данные указывают на то, что использование трипсина даже в течение короткого периода времени (6 ч) вызывает разрушение клеток в ходе последующей инкубации in vitro. Следовательно, для разрушения структур клеток донора, включая ядро и содержащийся в нем хроматин, необходима в первую очередь обработка трипсином или другим аналогичным протеолитическим ферментом без использования нуклеаз (сохранение эндогенной нуклеазной активности). При этом отчетливо видно, что применение трипсина или плазмина с последующей инкубацией, несмотря на достижение децеллуларизирующего эффекта повреждает внеклеточный матрикс трансплантатов.

В дальнейшем оценивали степень дегенерации и минерализации матрикса децеллуларизированных трансплантатов стенки аорты свиньи через 6 недель подкожной имплантации крысам. Имплантация проводилась в сравнении с известным положительным (АКД) и отрицательным (нативная ткань) контролем (рис. 3, рис. 4).

Результаты по исследованию степени минерализации имплантированных фрагментов через 6 недель гетеротопической имплантации крысам представлены на рисунке 3. Из диаграммы следует, что использование протеаз для достижения децеллуларизирующего эффекта в группах после АКД спровоцировало восстановление способности трансплантатов к кальцификации. При этом интенсивность реакции клеток реципиента и вызванные этим интенсивные дегенеративные изменения матрикса имплантов напрямую соотносилась со степенью их минерализации.

Рисунок 3 — Содержание минерализованного кальция в нативных и децеллуларизированных стенках аорты свиньи после 6 недель подкожной имплантации крысам

АКД - антикальцинозная девитализация (.р<0.01 относи-тельно контроля); АКД/Пл/инк - АКД + Плазмин, 24 ч + инкубация в ФР 20 сут; АКД/Тр/инк - АКД + Трипсин,6 ч + инкубация в ФР 20 сут; ФО -ферментативная обработка; ФО/инк -ФО + инкубация в ФР 20 сут (,р<0.05 относительно контроля); ГШ -гипотонический шок (.р<0.05 относительно контроля); 1% —

обработка 8Б8.

Для всех экспериментов п > б. Достоверного снижения

кальцификации в сравнении с нативным контролем нет при всех вариантах обработки, кроме АКД.

Результаты флуоресцентного гистологического анализа представлены на рисунке 4.

В образцах, обработанных до имплантации 1% р-ром SDS, наблюдалась выраженная иммунная реакция клеток реципиента, а также формирование фиброзной капсулы, указывающей на токсическое действие матрикса импланта, обработанного SDS (рис. 46). В группах нативных образцов наблюдалась стандартная реакция, проявляющаяся в клеточной инфильтрации и фиброзном перерождении пограничных (t. intima, t. adventitia) зон (рис. 4а). Более выраженная картина дегенеративных изменений наблюдалась во фрагментах ФО, при этом иммунная реакция была более выражена со стороны t. adventitia (рис. 4в).

Наиболее интенсивная клеточная реакция и тотальное фиброзно-дегенеративное изменение матрикса трансплантатов наблюдалось во фрагментах ГШ (гис. 4г) и ФО/инк (рис. 4д). При этом во фрагментах ГШ наблюдалось дегенерация и рубцовое слияние эластиновых мембран матрикса трансплантата (рис. 4г), а в группе ФО/инк наблюдалось практически полная замена матрикса импланта реактивно измененной волокнистой соединительной тканью (рис. 4д). Во фрагментах АКД/Тр/инк (рис. 4е) и АКД/Пл/инк (рис. 4ж) также наблюдалась клеточная инфильтрация матрикса и более выраженное, чем в группе ФО, фиброзное изменение медиально-адвентициальных зон. В группе АКД наблюдались признаки полной сохранности матрикса, частичной репопуляции клетками реципиента, а также отсутствие иммунной реакции (рис. 4з).

Полученные данные свидетельствуют о том, что удаление клеток донора из матрикса трансплантатов с помощью известных литературных способов детергент-децеллуларизации, а также протеолитической децеллуларизации с помощью трипсина или плазмина не только не подавляют дегенерацию и патологическую минерализацию ткани, но и в значительной степени их усиливают. Помимо этого, полученные результаты указывают на то, что добиться удаления клеток донора из матрикса трансплантатов известными способами без повреждения при этом структуры внеклеточного матрикса ТСКС пока не представляется возможным.

АКД §*! АКД/Пл/инк АКД/Тр/инк

Нативный контроль _:

О 50 100 150 200 Содержание кальция, мкг/мг сухого веса ткани

Рисунок 4 - Микрофотографии криосрезов децеллуларизированных стенок аорты свиньи после 6-ти недель подкожной имплантации крысам а- нативный контроль; б- фрагмент после 1% 8Э8; в- фрагмент после ФО; г- фрагмент после ГШ; д- фрагмент после ФО/инк; е- фрагмент после АКД/Тр/инк; ж- фрагмент после АКД/Пл;/инк; з- фрагмент после АКД. Конфокальная микроскопия, окраска ЭБ; ядра клеток красного или желто-оранжевого цвета (или их отсутствие) на фоне собственной флуоресценции матрикса зеленого цвета.

Результаты, полученные при исследовании влияния разрушения клеток донора на ртепень дегенерации и кальцификации трансплантатов стенки аорты, особенно в группах после антикальцинозной девитализации с дополнительной обработкой ротеазами, показывают, что известные предлагаемые в литературе механизмы кальцификации ТСКС, в частности механизм, связанный с инициацией кальциноза митохондриями погибающих клеток донора (Фесенко (Рындина), 2006) недостаточен спя понимания полной картины патологической минерализации ТСКС.

2. Изучение роли клеток реципиента в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца

Недостаточность митохондриальной гипотезы для понимания кальцификации ТСКС, а также данные о том, что в контрольных фрагментах стенок аорты, имплантированных крысам, отложение кальцификатов осуществляется преимущественно на ее адвентиции, т.е. в местах локализации жировой ткани, привело к выводу о том, что механизм патологической кальцификации ТСКС во многом сходен с механизмом атеросклеротического поражения сосудов, в котором основным инициаторным моментом являются окисленные ЛНП, фосфолипиды и холестерин матрикса сосудов, выполняющие роль хемоаттрактантов для клеток моноцитарно-макрофагального звена реципиента, что запускает последующий каскад реакций, описываемый клеточной гипотезой кальцификации сосудов (Joño et al., 2000; El-Abbadi et al., 2007; O'Neill, 2007; Towler, 2008).

Основываясь на предложенной гипотезе, мы провели исследован^ калыдификации трансплантатов, которое должно было объяснить роль клето| реципиента в развитии кальциноза ТСКС (рис. 6, рис. 7).

Согласно данным флуоресцентной микроскопии, до обработки от 50 до 80° клеток донора в стенке фрагментов стенки аорты свиньи были живыми (см. рис. 1а'| Гистохимическое окрашивание криосрезов стенки аорты свиньи по методу ван Косс показало полное отсутствие минерализации трансплантатов (рис. 5 в).

Рисунок 5 - Микрофотографии криосрезов фрагментов нативных стенок аорты свиньи

до имплантации

а- Световая микроскопия, окраска гематоксилином и эозином; ядра клеток - темно-синие, компоненты ВКМ - красно-розовые. 6- Световая микроскопия, окраска гематоксилином Вейерхгофа в модификации Муто;. эластические волокна и ядра клеток - черные, иные компоненты ВКМ - не окрашены, в- Световая микроскопия, окраска кальциевых отложений по методу ван Косса. Кальцификаты - черно-коричневые (отсутствуют), компоненты ВКМ - розово-красные, ядра клеток -ярко красные.

Количественный анализ на содержание минерализованного кальция в нативных девитализированных фрагментах ткани до их имплантации показал его отсутствие у составлял <0.4±0.07 мг кальция/г сухого веса ткани.

Рисунок 6 - Микрофотографии криосрезов нативных и девитализированных фрагментов стенки аорты свиньи после 6 недель подкожной имплантации крысам а- нативная стенка аорты свиньи до имплантации; б,е- нативный контроль после имплантации; г,д,е- фрагменты ФО после имплантации (д- зона t. intima-t. media, е- зона t. media-t. adventitial ж,з- АКД. б,г,ж- при ограничении доступа клеток реципиент (группа 1), в,д,е,з- при свободном доступе клеток реципиента (группа 2). Световая микроскопия, окраска Ализариновым красным S (AKS), докрашивание 0.05% р-ром толуидинового синего; кальцификаты - красные, комопненты ВКМ - бежево-голубые, ядра клеток - темно-голубые.

Исследование кальцификации трансплантатов стенки аорты проводилось в одели подкожной имплантации крысам 2-х групп образцов: в группе 1 фрагменты, жлючались в лавсановые камеры с диаметром пор 0.2 мкм, (модель ограничения оступа клеток реципиента к фрагментам трансплантатов стенки аорты); в группе 2, рагменты, заключались в камеры из нержавеющей стали с диаметром пор 50 мкм юдель свободного доступа клеток реципиента к фрагментам трансплантатов стенки орты) (рис. 6).

По результатам эксперимента были получены следующие данные: в группах ативных образцов и особенно образцов, подвергшихся ФО, как в лавсановой, так и в еталлической камерах наблюдалась выраженная минерализация матрикса рансплантатов (рис. 6б-е), однако в образцах, заключенных в лавсановую камеру тепень кальцификации была значительно менее выражена (рис. 6 б,г, рис. 7).

При гистохимическом анализе нативных образцов и фрагментов после ФО, аключенных в лавсановую камеру, было замечено, что массивные отложения альцификатов в матриксе трансплантатов преимущественно локализуются в ежламеллярных (между эластиновыми мембранами) слоях (рис. 6в,г). При анализе рагментов, имплантируемых без ограничения доступа клеток реципиента, аблюдался тотальный кальциноз матрикса нативных и ФО трансплантатов, причем ассивные отложения кальцификатов в матриксе трансплантатов локализовались на )анице t. intima-t. media (рис. 6д) и, в значительной мере в зоне t. media-t. adventitia рис. бе). В средней оболочке кальцификаты были представлены в виде мелких и азрозненных очагов в межламилярных слоях матрикса. Как видно из рисунка аиболее выраженная минерализация наблюдается в зоне «старой» t. adventitia рис. бе), при этом массивные зоны минерализации были ассоциированы с игрировавшими клетками реципиента. Это явление, по мнению автора, подчеркивает ействие жировой ткани адвентиции как прямого хемоаттрактанта для клеток еципиента, с запуском всех описываемых клеточной гипотезой реакций.

Наиболее выраженная минерализация со стороны t. adventitia трансплантатов, бразование фиброзной реактивно измененной волокнистой соединительной ткани со тороны t. intima и ярко выраженная деградация матрикса в зоне t. media-t. adventitia, тчетливо ассоциированная с наличием клеток свидетельствует о преобладающей оли клеток реципиента в механизме кальцификации ТСКС.

Анализ фрагментов, подвергшихся АКД, показал наличие мельчайших диничных очагов кальцификации как в группе 1, так и в группе 2 (рис. 6ж,з), при том во фрагментах, заключенных в металлические камеры наличие кальцификатов ыло менее выраженным, что указывает на протекторную роль мигрировавших клеток еципиента.

Количественный анализ содержания минерализованного кальция представлен на исунке 7.

Содержание минерализованного кальция в нативных фрагментах стенок аорты после 6 недель имплантации в металлических сетках было в 6 раз больше, чем при имплантации в лавсановых камерах. Сопоставимое этому отличие было выявлено и для фрагментов стенок аорты, обработанных ферментативным способом, где разница в степени минерализации составляла 8 и более раз. В образцах, обработанных до имплантации способом антикальцинозной девитализации, минерализация была подавлена как в металлических, так и в лавсановых камерах.

Рисунок 7 — Содержание минерализованного кальция в нативных и девитализированных ФО и АКД стенках аорты свиньи при свободном (группа 1) и ограниченном (группа 2) доступе клеток реципиента после 6 недель подкожной имплантации крысам.

Для всех экспериментов п>6. р<0.05 только для групп нативного контроля и ферментативной обработки.

Полученные результаты указывают на важную роль клеток реципиента механизме кальцификации ТСКС, поскольку полное ограничение миграции клето» хозяина к имплантату многократно снижало активность минерализации образцов Следовательно, предположение о том, что кальциноз ТСКС, может осуществляться значительной мере по механизму, сходному с механизмом атеросклероза с| привлечением клеток реципиента, выглядит достаточно правдоподобно. С другой стороны, полное ограничение миграции клеток реципиента к трансплантату не подавляло полностью процесс его минерализации, что указывает на физико химическую составляющую в механизме кальциноза. Эта составляющая механизма кальцификации может быть связана с зарождением центров минерализации в митохондриях погибающих клеток донора (Фесенко (Рындина), 2006), а также с каким-либо иным пока не установленным фактором.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что минерализация трансплантатов клапанов сердца и сосудов осуществляется по двум механизмам, один из которых не зависит от клеток реципиента, а второй зависит от миграции клеток реципиента к трансплантату и является преобладающим (определяет 80-85% минерализации ткани).

Помимо этого важным результатом является то, что как при ограничении доступа клеток реципиента, так и при свободном их доступе наблюдалась естественная децеллуларизация трансплантатов. Использование модели полного ограничения доступа клеток реципиента к тканям имплантатов отчетливо показало, что в процессе обесклеточивания матрикса при имплантации участвуют ферменты тканевой протеолитической системы, а не клеточное звено клеток реципиента как предполагалось ранее.

3. Выяснение роли липидов в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца

С целью выяснения роли липидных компонентов матрикса в механизмах кальцификации ТСКС, исследовали степень минерализации фрагментов адвентиции

стенки аорты с ограничением доступа клеток реципиента (группа 1, лавсановые камеры с диаметром пор 0,2 мкр) и со свободным доступом клеток реципиента (группа 2, металлические камеры с диаметром пор 50 мкр) при подкожной имплантации крысам на срок 6 недель. В эксперименте фрагменты адвентиции были разделена на (1) нативные и (2) обработанные методом ФО образцы. В качестве отрицательного контроля использовались нативные стенки аорты. Через 6 недель подкожной имплантации крысам было обнаружено, что как при свободном (группа 2), так и ограниченном (группа 1) доступе клеток реципиента фрагменты адвентиции не подвергались минерализации. При этом в условиях свободного доступа клеток реципиента фрагменты адвентиции подвергшиеся ФО утилизировались клетками реципиента полностью. Анализ нативных стенок аорты свиньи, введенных в эксперимент, показал стандартные для этой ткани результаты (см. рис. 6 б,в, рис. 7). Количественное определение минерализованного кальция показало отсутствие кальцификации фрагментов адвентиции в обеих группах (рис. 11).

В дальнейшем, исследовали распределение липидных компонентов в тканевом матриксе и их соотношение с развитием кальциноза в образцах нативной стенки аорты и во фрагментах с искусственным удалением липидов перед имплантацией (рис. 8, рис. 9).

Рисунок 8 - Микрофотографии криосрезов фрагментов стенки аорты свиньи, обработанных 1 % р-ром дезоксихолата натрия и ацетоном в сравнении с нативным контролем до имплантации а-в- нативная стенка аорты; г-е- стенка аорты, обработанная 1% ДОАсп; ж-и- стенка аорты, обработанная ацетоном (24ч, 8°С). Световая микроскопия, окраска Суданом III и гемалауном Майера; липидные компоненты матрикса - ярко-оранжевые, компоненты ВКМ - серо-голубые, ядра клеток -темно-синие.

Удаление липидов из матрикса трансплантатов осуществляли путем обработки нативных стенок аорты перед имплантацией натуральным липофильным детергентом 1% р-ром дезоксихолата натрия (1% ДОАсп) (Фадеева с соавт., 2012, Патент №2012141322). Для сравнения с действием дезоксихолата натрия как липофильного детергента, часть фрагментов обрабатывали до имплантации ацетоном (24 ч, 8°С). Исследование степени кальцификации трансплантатов нативных и обработанных липофильными агентами (1% ДОАсп, ацетон 24 ч, 8°С) стенок аорты проводили при подкожной имплантации крысам с использованием модели свободного и ограниченного доступа клеток реципиента.

При окраске нативных и обработанных стенок аорты красителем Суданом III до имплантации обнаружено, что в нативных стенках аорты скопление липидных компонентов матрикса наблюдается не только в t. adventitia, но и в наружной трети t. media (рис. 8а-в), т.е. непосредственно в местах интенсивной клеточной инфильтрации и наиболее выраженного отложения минерализованного кальция, наблюдаемого в контрольных фрагментах стенки аорты при подкожной имплантации крысам (рис. бе). Помимо этого обнаружено, что обработка стенок аорты 1% р-ром дезоксихолата натрия или ацетоном (24 ч, 8°С) не сопровождалась разрушением хроматина, и, следовательно, ядер клеток, а также полностью удаляла липидные компоненты (рис. 8г-и) без видимых повреждений архитектоники и структуры волокнистого матрикса трансплантатов.

Окрашивание указанных фрагментов с помощью AKS показало полное отсутствие кальцификатов в матриксе фрагментов до имплантации (рис. 9а,г).

Рисунок 9 - Микрофотографии криосрезов фрагментов стенки аорты свиньи, обработанных 1 % р-ром дезоксихолата натрия и ацетоном после 6 недель подкожной имплантации крысам а- стенка аорты, обработанная 1% ДОАсп до имплантации; б,в- стенка аорты, обработанная 1% ДОАсп после 6 недель подкожной имплантации; г— стенка аорты, обработанная ацетоном (24ч, 8°С) до имплантации; д,е- фрагменты стенки аорты, обработанные ацетоном (24ч, 8°С) после 6 недель подкожной имплантации; б,д- при ограничении доступа клеток реципиента (группа 1), в,е- при свободном доступе клеток реципиента (группа 2). Световая микроскопия, окраска АКв, докрашивание 0.05% р-ром толуидинового синего; кальцификаты - красные, компоненты ВКМ -бежево-голубые, ядра клеток - темно-голубые.

Через 6 недель подкожной имплантации крысам были получены следующие результаты: во фрагментах 1% ДОАсп, как при свободном, так и при ограниченном доступе клеток реципиента кальцификация матрикса была полностью подавлена (рис. 96,в). Во фрагментах, обработанных ацетоном (24 ч, 8°С) и при ограниченном и при свободном доступе клеток реципиента, в матриксе трансплантата наблюдалось формирование кальцификатов (рис. 9д,е), при этом разница в степени минерализации была недостоверной (рис. 11). Было отмечено, что в условиях свободного доступа (группа 2) наблюдалось формирование фиброзной капсулы, свидетельствующей о токсичности обработанного ацетоном матрикса (рис. 9е). Анализ нативных стенок аорты свиньи, введенных в эксперимент, показал стандартные для этой ткани результаты (см. рис. 66,в, рис. 7).

Данные гистологического анализа коррелируют с данными количественного измерения минерализованного кальция (рис. 11).

Полученные данные свидетельствуют о том, что механизм кальцификации ТСКС обусловлен агграктантным действием липидных компонентов матрикса ТСКС на клетки реципиента с запуском всех реакций, описываемых клеточной гипотезой кальцификации сосудов.

Результаты, полученные при имплантации обработанных ацетоном (24ч, 8°С) образцов стенки аорты соотносятся с данными научной литературы. Известно, что использование ацетона в течение длительного времени (более 3 часов) вызывает сморщивание и уплотнение ткани (Лилли Р., 1969), т.е. оказывает повреждающее воздействие на структуру матрикса трансплантатов, а также тем, что ацетон оказывает обратимую (не убирает полностью) фиксацию белковых и пептидных компонентов матрикса (в том числе собственных пептидогидролаз и протеиназ матрикса ТСКС), что в совокупности с токсическим действием ацетона может усиливать иммуногенность имплантированной ткани. При этом достоверное, в сравнении с нативным контролем, снижение кальцификации трансплантатов стенки аорты, обработанных до имплантации ацетоном в модели свободного доступа клеток реципиента (группа 2) указывает на то, что липидные компоненты матрикса трансплантатов оказывают хемоаттрактантное действие на клетки реципиента и провоцируют развитие кальциноза ТСКС.

На основании полученных вышеуказанных результатов, для изучения возможности подавления атерогенного эффекта и ассоциированной с этим иммуногенности и минерализации ТСКС провели эксперимент, в котором в модели подкожной имплантации крысам в условиях свободного и ограниченного доступа клеток реципиента исследовали следующие фрагменты децеллуларизированных образцов стенки аорты свиньи: (1) фрагменты АКД/Тр/инк и (2) фрагменты АКД/Тр/инк, которые дополнительно обработали 1%-ным р-ром ДОА (АКД/Тр/инк/ДОА) для удаления липидных компонентов матрикса. Эксперимент проводился в сравнении с нативными стенками аорты (отрицательный контроль) и АКД (положительный контроль) (рис. 10).

Через 6 недель подкожной имплантации были получены следующие результаты: во фрагментах АКД/Тр/инк, и при свободном и при ограниченном доступе клеток реципиента наблюдался выраженный кальциноз матрикса трансплантатов (рис. 106,в), при этом в образцах, имплантируемых без ограничения доступа клеток реципиента

минерализация ткани в значительной степени наблюдалась во всей толще трансплантатов (рис. 10в).

Рисунок 10 - Микрофотографии криосрезов децеллуларизированных АКД/Тр/инк фрагментов стенки аорты свиньи, не обработанных и дополнительно обработанных перед имплантацией 1% ДОАсп после 6 недель подкожной имплантации крысам а- фрагмент АКД/Тр/инк до имплантации; б,в- фрагмент АКД/Тр/инк после 6 имплантации; г- фрагмент АКД/Тр/инк/ДОА до имплантации; д,е- фрагмент АКД/Тр/инк/ДОА после имплантации. б,д— при ограничении доступа клеток реципиент (группа 1), а, в,е- при свободном доступе клеток реципиента (группа 2). Световая микроскопия, окраска АК8, докрашивание 0.05% р-ром толуидинового синего; кальцификаты - красные, компоненты ВКМ - бежево-голубые, ядра клеток — темно-голубые.

В отличие от этого, во фрагментах АКД/Тр/инк/ДОА минерализация носила локальный характер, при этом и в условиях ограниченного и в условиях полного доступа клеток реципиента наблюдалось достоверное снижение кальцификации матрикса (рис. 10д,е, рис. 11).

Полученные результаты коррелируют с данными количественного измерения минерализованного кальция в образцах после 6 недель подкожной имплантации крысам (рис. 11).

100

о 90

0 80

« 70

1 5 60

1 50 ь

2 40

<и

" 30 20 10

] - 01 раннченнып доступ | — свободный дос п и

Жир. ткань Обработка идвен ишнн ацетоном

1% ДОАсп

АКД/Тр/ АКД/Тр/ннк пнк/ДОА

Рисунок 11 -Содержание кальция в нативных и

девитализированных стенках аорты свиньи при свободном и ограниченном доступе клеток реципиента после 6 недель подкожной имплантации крысам

Для всех

экспериментов п>6. р<0.05 только для АКД/Тр/инк

Необходимо отметить, что при ограничении доступа клеток реципиента в группе ьКД/Тр/инк/ДОА минерализация матрикса осуществлялась только по длине ластиновых ламелл (рис. 10д), что указывает на пассивную роль эластиновых олокон в инициации кальциноза поврежденных ТСКС.

Значительная и достоверная разница в степени минерализации групп АКД/Тр/инк АКД/Тр/инк/ДОА позволяет предположить, что вклад хемоаттрактантных липидных омпонентов матрикса трансплантатов в развитие зависимой от клеток реципиента альцификации матрикса ТСКС является решающим. Однако, данные по инерализации фрагментов АКД/Тр/инк/ДОА, полученные при ограничении доступа леток реципиента (рис. 10д, рис. 11) указывают, что существует еще один компонент :еханизма кальциноза ТСКС, независящий от нуклеации кальцификатов в :итохондриях погибающих клеток донора, от инициаторной роли липидных омпонентов матрикса ТСКС и активной роли клеток реципиента. Предполагается, то минерализация матрикса ТСКС может быть связана с пассивной ролью оврежденных эластиново-коллагеновых волокон и эластиновых ламелл матрикса рансплантата, пассивно адсорбирующих на себе кальциевые отложения по физико-имическому механизму кальцификации (Price Р.А. et al., 2006, 2008; Toroian D. et al., 2007, 2008). Данное предположение подтверждается также тем, что обработка 1% ДОАсп нативных (не поврежденных) фрагментов стенки аорты полностью подавляла их кальцификацию в организме реципиента.

4. Роль повреждений внеклеточного матрикса в кальцификации трансплантатов стенок аорты.

Для исследования роли повреждений компонентов ВКМ в кальцификации трансплантатов стенок аорты на первом этапе был проведен комплексный гистологический анализ фрагментов стенки аорты свиньи до и после подкожной имплантации крысам. С целью отграничения кальцификации, вызванной участием клеток реципиента, проводился анализ образцов, имплантированных только в модели ограничения доступа клеток реципиента (группа 1); эксперимент проводился в сравнении с нативным контролем. С целью выявления локализации кальциевых отложений в матриксе трансплантатов, криосрезы имплантированных образцов исследовались с помощью окрашивания по методу ван Косса (Лилли, 1969).

Результаты проведенного гистологического и гистохимического анализа показали, что степень повреждения структуры и целостности эластиновых ламелл и межламеллярных слоев, состоящих из коллагена, тонких эластиновых волокон и гликозоаминогликанов пропорциональна степени минерализации

девитализированных и(или) децеллуларизированных фрагментов стенки аорты (рис. 12, рис. 13).

Из всех исследованных способов децеллуларизации наиболее значимые повреждения обнаружились во фрагментах, подвергшихся методике ГШ (рис. 126), 1% SDS (рис. 12в) и ФО/инк (рис. 12г.). Из рисунка 12 следует, что во фрагментах ГШ и ФО/инк повреждались не только межламеллярные слои, но и эластиновые мембраны в целом (рис. 126,г). Во фрагментах после воздействия 1% SDS повреждались

межламиллярные, преимущественно содержащие коллаген, и пограничные коллагеново-эластиновые слои собственно ламелл матрикса (рис. 12в).

Результаты, полученные до имплантации, согласуются с данными гистохимического окрашивания кальциевых отложений (рис. 12и-м). Характерной отличительной особенностью локализации кальциевых отложений в образцах исследованных групп, является строгая выраженная ассоциация кальцификатов с эластиновыми ламеллами (рис. 12к,м) или же пограничными эластиново— коллагеновыми слоями матрикса (рис. 12и,л), а также «пересыпанность» этих ориентированных отложений хаотичными осколко-образными кальцификатами (рис. 12и,к,л,н), указывающими на инициацию формирования минеральных отложений в митохондриях погибающих клеток донора (Фесенко (Рындина), 2006) и(или) образованием кальциевых мыл из остаточных липидных и фосфолипидных компонентов матрикса (Demer, 1997; Vítek, Carey, 2012).

В отличие от образцов с повреждением структуры матрикса трансплантатов, во фрагментах с максимальным сохранением интактности матрикса и элиминацией центров нуклеации кальциноза до имплантации, т.е. во фрагментах после АКД (рис. 13а,г,ж) и воздействия 1% ДОАсп (рис. 136,д,з), отложения кальцификатов были единичными (рис. 13ж) или полностью отсутствовали (рис. 13з).

В образцах с комплексной предимплантационной элиминацией центров формирования кальцификатов за счет проведения полного цикла АКД и последующим удалением инициаторных липидных компонентов матрикса -АКД/Тр/инк/ДОА, при ограничении доступа клеток реципиента, кальцификация развивалась только по длине эластиновой ламеллы (рис. 13и).

Результаты, полученные при ограничении доступа клеток реципиента в указанных группах АКД/Тр/инк/ДОА были схожи с результатами, полученными в условиях их свободного доступа (см. рис. 11). Это указывает на то, что при отсутствии в матриксе инициаторных липидных компонентов, привлечения клеток моноцитарно-макрофагального звена реципиента не происходит, что, в свою очередь не сопровождается запуском кальцификации внеклеточного матрикса по клеточному механизму кальциноза ТСКС (Акатов и др., 2010).

На втором этапе исследования повреждений компонентов ВКМ в кальцификации трансплантатов стенок аорты провели эксперимент, предусматривающий инкубацию in vitro фрагментов АКД/Тр/инк/ДОА в средах, содержащих 2,5 мМ кальция (Grzesiak, Pierschbacher, 1995; Price et al., 2006) (рис. 14).

Образцы инкубировали в соотношении 1:30 (v/v): (1) в среде с 2,5 мМ СаС12 в 1 хФСБ, рН 7.2; (2) в сыворотке крупного рогатого скота (РАА, Austria); (3) в среде с 2,5мМ СаС12 в ФСБ с добавлением 5% BSA (Грызунов, Добрецов, 1998). Для сравнения результатов, полученных в модели подкожной имплантации крысам в условиях ограниченного доступа клеток реципиента, образцы инкубировались в условиях шейкера-инкубатора при 37°С также в течение 6 недель. Замена среды на свежую осуществлялась ежедневно. Через 20 суток инкубации обнаружили, что на поверхности фрагментов, инкубированных в среде с кальцием, фосфатами и альбумином (3), а также в сыворотке КРС (2), происходит отложения кальцификатов на поверхности фрагментов АКД/Тр/инк/ДОА.

Рисунок 12 — Микрофотографии криосрезов нативных, девитализированных и децеллуларизированпых фрагментов стенки аорты свиньи до и после 6 недель подкожной имплантации крысам а,д,е- нативный контроль; б,е,к- фрагменты после ГШ; 7- фрагменты после 1% БОв; фрагменты после ФО/инк. а—г— до имплантации, д—м после 6 недель подкожной имплантации (ограниченный доступ клеток реципиента), а-з- Световая микроскопия, окраска Амидочерным 1ОВ в пикриновой кислоте; коллагеновые волокна - ярко-синие, эластические ламеллы - желто-зеленые, им- Световая микроскопия, окраска кальциевых отложений по методу ван Косса; кальцификаты -черно-коричневые, компоненты ВКМ - розово-красные.

Рисунок 13 - Микрофотографии криосрезов девитализированных и децеллуларизированных с дополнительной обработкой 1 % ДОАсп фрагментов стенки аорты свиньи до и после 6 недель подкожной имплантации крысам

а,г,ж- фрагменты после АКД; б,д,з- фрагменты после 1% ДОАсп; в,е,и- фрагменты после АКД/Тр/инк/ДОА; а-в- до имплантации, г-и- после 6 недель подкожной имплантации (ограниченный доступ клеток реципиента), а-в- фрагменты до имплантации; г-н- фрагменты после 6 недель подкожной имплантации крысам в модели ограничения доступа клеток реципиента, а-е- Световая микроскопия, окраска Амидочерным 10В в пикриновой кислоте; коллагеновые волокна - ярко-синие, эластические ламеллы - желто-зеленые, ж-и- Световая микроскопия, окраска кальциевых отложений по методу ван Косса; кальцификаты - черно-коричневые, компоненты ВКМ -розово-красные .

Через 6 недель инкубации было обнаружено, что в группе (1) отложения аморфных кальцификатов осуществлялось на поверхности фрагмента в целом, без кальцификации собственно внеклеточного матрикса образца (рис. 14а). В группе (2) наблюдалась выраженная минерализация коллагеновых и эластиновых волокон в адвентиции образца (рис. 14д) и интенсивной минерализацией пограничного медиально-адвентициального слоя (рис. 146). В группе (3), также как и при подкожной имплантации крысам в модели ограничения доступа клеток реципиента, отложение кальцификатов (рис. 14в) осуществлялось только по длине эластиновой ламеллы (см. рис. 13и).

Рисунок 14- Микрофотографии криосрезов децеллуларизированных с дополнительной обработкой 1 % ДОАсп фрагментов стенки аорты свиньи, инкубированных в различных средах in vitro

в течение 6 недель при 37"С а- фрагменты АКД/Тр/инк/ДОА инкубированные в среде с 2,5мМ СаС12 в 1><ФСБ, рН 7.2; б— фрагменты АКД/Тр/инк/ДОА инкубированные в сыворотке крупного рогатого скота; е- фрагменты АКД/Тр/инк/ДОА инкубированные в среде с 2,5мМ СаС12 в 1 *ФСБ с добавлением 5% BSA. Световая микроскопия, окраска кальциевых отложений по методу ван Косса; кальцификаты -черно-коричневые, компоненты ВКМ - розово-красные.

Полученные данные свидетельствуют о том, что кальцификация коллагеновых фибрилл, пограничных коллагеново-эластиновых слоев и непосредственно эластиновых ламелл осуществляется пассивным способом независимо от клеток реципиента (физико-химическая составляющая механизма кальцификации ТСКС), а также о том, что непосредственным участником минерализации волокон ВКМ наравне с различными соединениями кальция является альбумин (мажорный фактор).

5. Разработка способа предотвращения кальциноза и повышения <~иосовместимости трансплантатов на основе полученных результатов.

С целью разработки способа предотвращения кальциноза и повышения биосовместимости ТСКС исследовалась возможность использования дезоксихолата натрия (ДОА) как антикальцинозного и подавляющего иммуногенность агента.

Опираясь на литературные данные, использовали 1%-ную концентрацию дезоксихолата натрия в 150 мМ р-ре NaCl, время инкубации - 40 ч, температурный режим 37°С (Dohmen et al., 2006; Erdbrügger et al., 2006; Tudorache et al., 2007; Ott et al., 2008 и др.). Исследовали активность липофильного действия ДОА, прочность его связывания с ВКМ в зависимости от значения рН, буферной системы, времени воздействия и способа отмывки. Было установлено, что оптимум липофильного действия ДОА наблюдается при значениях рН 6,2 и рН 7.8-8.0, при этом использование таких рН-буферов как PBS и, особенно Tris-НО, в значительной мере затрудняет вымывание ДОА из матрикса фрагментов. Из литературы известно, что растворимость солей желчных кислот зависит от концентрации ионов кальция в растворе (Hofmann, Mysels, 1992). Показано, что предварительная инкубация фрагментов стенки аорты в 2 мМ р-ре ЭДТА (рН 7.0, 2 часа) обеспечивает более полноценное вымывание ДОА из матрикса ТСКС. Установлено, что полное вымывание ДОА из ВКМ графтов обеспечивается использованием в качестве отмывочного раствора 20% этилового спирта в 150 мМ р-ре NaCl.

ш И I 1 w^Mä

я щщшвя ge¡g¡jjj

¡¡¡м

Рисунок 15 - Микрофотографии тотальных препаратов и криосрезов фрагментов стенки аорты, обработанных 1% р-ром ДОА в соответствии (1% ДОАсп) и без учета (1% ДОАн.о) разработанного способа предотвращения кальциноза и повышения биосовместимости ТСКС а,б- тотальные препараты фрагментов после 1% ДОАн.о; д,е- тотальные препараты фрагментов после 1% ДОАсп; а,д- сразу после посева и б,е- через 48 ч после посева клеток линии L929. а,б,д,е-Конфокальная микроскопия, ДЛО, окраска ЭБ (погибшие клетки - оранжевая флуоресценция) и Hoechst 33342 (живые клетки - зеленая флуоресценция), в,г- криосрезы фрагментов после воздействия 1% ДОАн.о через 1,5 мес подкожной имплантации крысам; е- фрагментов после обработки 1% ДОАсп через 1,5 мес подкожной имплантации крысам. в,г,ж,з- Конфокальная микроскопия, окраска ЭБ; ядра клеток - красные или желто-оранжевые, компоненты ВКМ - зеленые.

На рисунке 15 представлены данные по оценке цитотоксичности и исследованию биосовместимости трансплантатов стенки аорты, обработанных только 1 %-ным р-ром ДОА (ФР, рН 7.8, 5 мМ НЕРЕ8) с 10-кратной отмывкой образцов в физ. р-ре (1°/ ДОАн.о) и обработанных с помощью разработанного способа повышения биосовместимости ТСКС (1%ДОАсп). Из рисунка следует, что фрагменты стенки аорты свиньи обработанные только 1% ДОАн.о с 10-кратной отмывкой образцов в физ. р-ре обладают выраженной токсичностью: через 48 часов после посева клеток линии Ь929 наблюдалась гибель высеянных клеток (рис. 156); через 1.5 мес подкожной имплантации наблюдалось формирование объемной плотной «хрящеподобной» капсулы вокруг имплантированных фрагментов (рис. 15в,г). Во фрагментах стенки аорты свиньи, обработанных с помощью разработанного метода повышения биосовместимости ТСКС, наблюдалось отсутствие токсичности: через 48 часов после посева клеток линии Ь929 все высеянные клетки были живыми, наблюдалась митотическая активность (рис. 15е); через 1.5 мсс подкожной имплантации отсутствовали признаки капсулообразования и наблюдались признаки частичной репопуляции имплантированных фрагментов (рис. 15ж,з), свидетельствующие о биосовместимости имплантированной ткани.

На основании полученных данных был разработан способ предотвращения кальцификации и повышения биосовместимости трансплантатов сосудов и клапанов сердца; получен патент на изобретение (Фадеева с соавт., 2012, Патент РФ №2012141322).

6. Разработка способа ускорения репопуляции трансплантатов сосудов и

клапанов сердца.

Исследовали возможность использования рекомбинантных цитокинов РОСЕ ВВ и УЕСИ А для ускорения репопуляции ТСКС в организме реципиента (рис. 16, рис. 17).

Рисунок 16 - Микрофотографии криосрезов фрагментов после АКД и обработки 1 % ДОАсп с дополнительной модификацией комбинацией PDGF BB/VEGF А через 1.5 мес имплантации крысам а-6- t. media фрагментов АКД, модифицированных PDGF BB/VEGF А через 1.5 мес подкожной имплантации крысам; в,г- t. media фрагментов 1% ДОАсп, модифицированных PDGF BB/VEGF А через 1.5 мес подкожной имплантации крысам, а,в- Конфокальная микроскопия, окраска ЭБ; ядра клеток -красно-оранжевые, ВКМ - зеленый; б,г- Световая микроскопия, окраска AKS и 0.05% р-ром толуидинового синего; кальцификаты - красные, ВКМ - бежево-голубой, ядра клеток - темно-голубые.

Известно, что при имплантации ТСКС в организм реципиента даже через годы не происходит заселения t. media девитализированных и(или) децеллуларизированных [трансплантатов, а значит, не происходит ремоделирования и обновления структуры матрикса, что приводит к развитию аневризмы и разрыву матрикса трансплантата (Орловский и др., 2007). При этом технологии предварительного посева изогенных клеток реципиента или аллогенных реципиенту клеток на поверхность трансплантата со имплантации пока не имеют клинического успеха, в силу высокой вероятности гибели высеянных клеток при проведении хирургической замены поврежденного клапана или сосуда, а также в силу того, что даже при предварительном посеве клеток ла поверхность трансплантата, миграции этих клеток вглубь матрикса не происходит. Естественным выходом в данном случае является применение цитокинов для йредимплантационной модификации трансплантатов, которое может усилить репопуляцию матрикса графтов, т.е. обеспечить вживление ТСКС в организме реципиента.

На модели подкожной имплантации крысам показано, что предимплантационная модификация ТСКС комбинацией рекомбинантных ростовых факторов PDGF ВВ jiPeprotech, USA) и VEGF А (Peprotech, USA) в концентрации 100 нг/мл (24 ч) стимулирует миграцию клеток реципиента вглубь матрикса трансплантатов и образование микрососудов в матриксе фрагментов стенок аорты, обработанных АКД и 1%ДОАсп уже через 1,5 мес подкожной имплантации крысам (рис. 16а,в). Обнаружено, что при имплантации обработанных ростовыми факторами фрагментов аорты свиньи после АКД развивается кальциноз имплантированной ткани (рис. 16 6, рис. 17).

Натпвнын АКД АКД+ 1% 1%ДОАсп +

контроль PDGF/VEGF ДОАсп PDGF/VEGF

Рисунок 17 — Содержание кальция во фрагментах АКД и 1% ДОАсп, дополнительно модифицированных комбинацией ростовых факторов

РООРВВ/УЕОРА через 1.5 мес подкожной имплантации крысам

Для всех

экспериментов п>6. р<0.01 для групп АКД, 1% ДОАсп и 1% ДОАсп+РООР/УЕОР

В образцах стенки аорты, обработанных 1% ДОАсп и модифицированных до имплантации комбинацией РОСБ ВВ/УЕСР А (100 нг/мл, 24 часа) наблюдалась активная репопуляция матрикса имплантированной ткани клетками реципиента соединительнотканного происхождения без каких-либо признаков кальциноза

(рис. 16г). Данные, полученные с помощью гистологического анализа согласуются данными количественного измерения минерализованного кальция (рис. 17).

Полученные результаты позволяют предположить, что не удаленные, нй «законсервированные» использованием дигитонина (Акатов и др., 2006) атерогенньк липидные компоненты матрикса трансплантатов после АКД, при обработку цитокинами РОвБ и УЕОБ, провоцируют привлечение клеток моноцитарно макрофагального звена реципиента с запуском каскада реакций, описываемых клеточной гипотезой кальцификации ТСКС (Акатов и др., 2010).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, полученные в настоящей работе, позволили сформулировать новое представление об участии различных механизмов в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца, как зависимых, так и не зависимых от клеток реципиента.

Ранее в Лаборатории тканевой инженерии ИТЭБ РАН была предложена митохондриальная гипотеза (механизм) инициации кальцификации ТСКС. Согласно этой гипотезе часть митохондрий, оставаясь интактными после гибели клеток донора, аккумулируют кальций из тканевой жидкости синпортно с фосфатами с образованием первичных «затравочных» кристаллов гидроксиапатита (Акатов и др., 2005; Фесенко (Рындина), 2006). На основании предложенной гипотезы был разработан способ антикальцинозной девитализации (Акатов с соавт., 2007), который в настоящее время внедрен и активно применяется в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Последующие результаты наших исследований показали, что этого механизма недостаточно для понимания кальцификации ТСКС. Представленные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что механизм кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца является комплексным и включает зависимые (рис. 18) и не зависимые от клеток реципиента (рис. 19) процессы.

Исходя из полученных результатов, согласно которым ограничение миграции клеток реципиента в трансплантат, как и предварительная экстракция липидных компонентов из матрикса подавляют кальцификацию, а также основываясь на известных представлениях о механизме атеросклеротического поражения сосудов, мы предположили, что основной причиной кальцификации ТСКС является, прежде всего, наличие большого количества окисленных липопротеинов низкой плотности, липидов и холестерина не только в клетках донора, но также в интимальном «депо» (Обгш, Коуапеп, 2009) и собственно в жировой ткани адвентиции трансплантата (рис. 18). Согласно такому предположению окисленные липиды, холестерол в трансплантатах являются прямыми хемоаттрактантами для моноцитов/макрофагов, поглощаются макрофагами, провоцируя их превращение в пенистые клетки, которые затем масштабно погибают. Этот процесс сопровождается экспрессией целого ряда провоспалительных цитокинов (1Ь-1,-6,-8, БОР, РОСБ и др.) и ряда ростовых факторов (ЕСБ, ТОБ-Р, вМ-СББ и т.п.), провоцирующих миграцию клеток реципиента вглубь матрикса трансплантатов и запускающей дифференцировку гладкомышечных клеток и перицитов окружающих трансплантат тканей в остеобластоподобные клетки (рис. 18).

Рисунок 18 - Цитофизиологическая схема клеточного механизма кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца

Процесс сопровождается интенсивной выработкой остеогенных белков группы BMP, в первую очередь ВМР-2, а также щелочной фосфатазы, которая, в свою очередь, запускает процесс кальцификации сначала вблизи t. adventitia и t. intima трансплантата, а затем мигрировавшие остеобласто-подобные клетки проникают в t. media и вызывают минерализацию всей толщи стенки трансплантата. Отсутствие в матриксе трансплантатов регуляторных белков остеогенеза, таких как матриксный Gla-протеид (MGP), остеопонтин (OPN), остеопротегерин (OPG) - супрессоров (остеогенной дифференцировки прогениторных клеток окружающих тканей, вследствие гибели экспрессирующих их клеток донора может способствовать кальцинозу ТСКС (рис. 18).

Полученные в работе результаты свидетельствуют, что повреждение целостности компонентов внеклеточного матрикса ТСКС провоцирует развитие независимой от клеток минерализации матрикса трансплантата по физико-химическому механизму кальцификации ТСКС (рис. 19).

Судя по полученным результатам, при небольшом повреждающем воздействии нарушается связь пограничных коллагеновых и коллагеново-эластиновых слоев ламелл матрикса трансплантата с преимущественным отложением кальциевых депозитов на коллагеновых волокнах, подобно тому, как это происходит при нормальной минерализации костного коллагена (Price et al., 2006; 2008; Toroian et al., 2007). При повреждении эластиновых ламелл, отложение кальциевых депозитов осуществляется на тонких эластиновых волокнах «расплетенной» эластиновой ламеллы посредством реакций, свойственных патологическому процессу эластокальциноза (Yu, Blumenthal, 1965; Hall, 1967; Molinari-Tossati et al., 1971;

Keeley, Partridge, 1974; Hornbeek, Partridge, 1975; Bailey et al., 2001; Basalyga et al\ 2004; Kitauchi et al., 2004; Winlove et al., 2004; Atkinson, 2008).

2 «

Нормальная структура и архитектоника волокон ВКМ

Минерализация коллагена

Эластокальцнноз

Эластиновые волокна

Каилаген

Повреждение коллагена (детергент-воздействие, лизис, коллагенолиз т.п.) на фоне

повреждения/удаления протеогликанов

Нарушение архитектоники и «расплетение» эластиновых ламелл

(ММП, enzymatic treatment, эластолнз и т.п.)

- кальциевым депозит

Рисунок 19 - Схема физико-химического механизма кальцификации компонентов внеклеточного матрикса трансплантатов клапанов сердца и сосудов

В работе установлено, что при инкубации ТСКС в сыворотке крови in vitr кальцификации в первую очередь подвергается коллаген, в то время как прУ инкубации ТСКС в растворе альбумина с кальцием in vitro минерализации подвергаются только эластиновые ламеллы. Полученные результаты указывают на то что минерализация «расплетенных» коллагена и эластина осуществляется с участием белков, в частности альбумина и других белков плазмы/сыворотки/тканево:: жидкости. Детальные механизмы вовлечения белков в процессы минерализаци коллагена и эластина поврежденных волокон внеклеточного матрикса остаются неизвестными.

Понимание предложенных механизмов кальциноза ТСКС позволило разработат ' способ предотвращения патологической кальцификации и повышенна биосовместимости трансплантатов клапанов сосудов и клапанов сердца, путем и обработки до имплантации натуральным липофильным детергентом дезоксихолатоц натрия. На основании полученных данных был разработан способ полного подавления кальцификации и повышения биосовместимости трансплантатов сосудов и клапано:-1 сердца (Фадеева с соавт., 2012, Патент РФ №2012141322).

В работе впервые показано, что использование комбинации ростовых факторов (PDGF BB/VEGF А) в качестве хемоаттрактантов клеток реципиента может ка провоцировать минерализацию ткани, так и усиливать репопуляцию матрикса графт у клетками реципиента без развития кальциноза в зависимости от предимплантационной обработки трансплантатов сосудов и клапанов сердца.

выводы

1. Разрушение клеток донора в трансплантатах сосудов и клапанов сердца с омощью ферментативной обработки, неионных детергентов и других известных з литературы способов повреждает структуру матрикса трансплантатов, е подавляя их кальцификацию.

2. Кальцификация трансплантатов сосудов и клапанов сердца осуществляется в начительной степени (на 80-85%) при участии клеток реципиента.

3. Липидные компоненты трансплантатов сосудов и клапанов сердца играют ешающую роль в развитии их кальцификации.

4. Повреждение структуры коллагеновых и эластиновых волокон внеклеточного атрикса трансплантатов сосудов и клапанов сердца провоцирует их минерализацию езависимо от клеток реципиента.

5. Разработан способ предотвращения кальцификации трансплантатов сосудов и 1апанов сердца путем их многоступенчатой обработки липофильным детергентом езоксихолатом натрия.

6. Разработан способ ускорения репопуляции трансплантатов сосудов и клапанов ердца путем их модификации рекомбинантными цитокинами PDGF и VEGF -ттрактантами клеток реципиента соединительнотканного происхождения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Акатов B.C., Фесенко Н.И., Соловьев В.В., Фадеева И.С., Чеканов A.B., [уратов P.M., Критиков Д.В., Сачков A.C., Бокерия Л.А. Подавление кальцификации рансплантатов клапанов сердца путем их девитализации // Клеточная рансплантология и тканевая инженерия, 2010, Том V, №1, с. 41-46.

2. Акатов B.C., Соловьев В.В., Фадеева И.С., Чеканов A.B., Муратов P.M., ритиков Д.В., Сачков A.C. Изучение биосовместимости трансплантатов клапанов ердца, девитализированных антикальцинозным способом // Клеточная рансплантология и тканевая инженерия, 2010, Том V, №2, с. 36-41.

3. Акатов B.C., Фадеева И.С., Чеканов A.B., Соловьев В.В. Роль клеток еципиента в механизме патологической кальцификации трансплантатов клапанов ердца и сосудов И Биофизика, 2010, Том 55, В. 5, с. 937-942.

4. Ravil Muratov, Dmitriy Britikov, Anton Sachkov, Vladimir Akatov, Valeriy Soloviev, Irina Fadeeva, Leo Bockeria. New approach to reduce allograft tissue 'mmunogenicity. experimental data//Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg., 2010, V. 3. 10(3),

. 408-412.

5. Акатов B.C., Чеканов A.B., Фадеева И.С. Клеточные технологии в тканевой инженерии / В Кн. «Клеточные технологии для регенеративной медицины». Под ред. Г.И. Пинаева и др., 2011, СПб., изд.-во Политехнического ун-та, 333 стр. (стр. 306332). ISBN 987-5-7422-3489-0.

6. Акатов B.C., Фесенко Н.И., Фадеева И.С. Кальцификация трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Механизмы кальцификации и её предотвращение. 2012,

Saarbrücken: AV Akademikerverlag GmbH & Co. KG (Germany), 248 стр., ISBN 978-3 659-23289-3.

7. Фадеева И.С., Акатов B.C., Муратов P.M., Бритиков Д.В., Сачков A.C. Спосо повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Патент н изобретение РФ № 2012141322 от 28.09.2012 г.

Тезисы конференций:

1. Акатов B.C., Муратов Р.М, Соловьев В.В., Фадеева И.С., Бритиков Д.В., Сачков A.C., Бокерия JI.A. Проблемы повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца и сосудов // Тез. докл. IV Всероссийского съезда трансплантологов (Москва, 9-10 ноября, 2008 г.), стр. 293.

2. Фадеева И.С. Новые представления о механизме кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов // Материалы конференции «Экспериментальная и теоретическая биофизика '09» (Пущино, 2009), стр. 7.

3. Akatov V.S., Fadeeva I.S., Chekanov A.V., Soloviev V.V. The role of recipient cells in calcification of heart valve transplants // Abstr. International Symposium «Biological Motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (Pushchino, Moscow region, Russia May 11-15, 2010), стр. 4-5.

4. Фадеева И.С., Акатов B.C., Фадеев P.C., Чеканов A.B., Муратов P.M., Бритиков Д.В., Сачков A.C. Влияние децеллуларизации трансплантатов клапанов сердца и сосудов на их способность к кальцификации // Материалы V Всероссийского Симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Уфа, 17-18 мая 2012 г.), стр. 113-114.

5. Фадеева И.С., Фадеев P.C., Вежнина Н.О., Акатов B.C. Комплекс механизмов кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов // Материалы 17 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXIвека» (Пущино, 22-26 апреля 2013 г.), стр. 458-459.

6. Фадеева И.С., Фадеев P.C., Сачков A.C., Бритиков Д.В., Акатов B.C. Направленная миграция клеток реципиента в матрикс трансплантатов сосудов и клапанов сердца под действием рекомбинантных ростовых факторов // Цитология (по материалам «Всероссийского симпозиума и Школы-конференции для молодых ученых по биологии клетки в культуре», Санкт-Петербург, 21—25 октября 2013 г.), 2013, Т. 55, № 9.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2013 гт.» (Госконтракт №02.740.11.0710), ВП «Развитие научного потенциала высшей школы» 2012-2014 гг. (Проект №2.1.1/5244(11708), а также при поддержке Программы «У.М.Н.И.К.» (Госконтракт №9870р/14299) и стипендиального гранта Президента РФ (Грант №СП-6867.2013.4) с использованием приборов ЦКП ИТЭБ РАН и ЦКП ИБК РАН.

Заказ № 21-А/08/2013 Подписано в печать 12.08.2013 Тираж 76 экз. Усл. п.л. 1.6

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фадеева, Ирина Сергеевна, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

., _ _______На правах рукописи

04201361822

Фадеева Ирина Сергеевна

РОЛЬ КЛЕТОК РЕЦИПИЕНТА И НАРУШЕНИЯ СТРУКТУРЫ ТКАНЕВОГО МАТРИКСА В МЕХАНИЗМЕ КАЛЬЦИФИКАЦИИ ТРАНСПЛАНТАТОВ СОСУДОВ И КЛАПАНОВ СЕРДЦА

03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

В.С. Акатов

Пущино - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................................10

1.1 Морфология, анатомия и гистология клапанов сердца...................................................10

1.1.1 Анатомическое строение клапанов сердца 12

1.1.1.1 Строение аортального клапана..........................................................................12

1.1.1.2 Строение митрального клапана.........................................................................16

1.1.1.3 Строение клапана легочной артерии.................................................................18

1.1.1.4 Строение трикуспидального клапана................................................................19

1.1.2 Архитектоника внеклеточного матрикса клапанов сердца 20 1.1.2.1 Состав внеклеточного матрикса клапанов сердца...........................................21

1.1.2.1.1 Эластин и белки микрофибрилл эластических волокон....................21

1.1.2.1.2 Сосудистый коллаген и лизилоксидазы................................................23

1.1.2.1.3 Протеогликаны........................................................................................25

1.2 Тканевая инженерия трансплантатов клапанов сердца и сосудов.................................29

1.2.1 Становление тканевой инженерии трансплантатов клапанов сердца и сосудов 31

1.2.2 Основные направления тканевой инженерии трансплантатов клапанов сердца и сосудов...........................................................................................................33

1.2.2.1 Тканевая инженерия клапанов сердца и сосудов на основе девитализированных и децеллуларизированных биологических матриц..........................34

1.2.2.2 Техники репопуляции трансплантатов клапанов сердца и сосудов...............38

1.3 Общие представления о калыщфикации биологических тканей...................................41

1.3.1 Кальциноз собственных сосудов человека, минерализация биопротезов и их связь с и минерализацией трансплантатов сосудов и клапанов сердца 43

1.3.1.1 Митохондриальная гипотеза кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов.......................................................................................................46

1.3.1.2 Липидная гипотеза кальцификации биопротезов клапанов сердца и сосудов48

1.3.1.3 Клеточная гипотеза кальцификации клапанов сердца и сосудов...................51

1.3.2 Ингибиторы и активаторы гетеротопической кальцификации сосудистой ткани56

1.3.3 Эластокальциноз 60

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................................................................64

2.1 Материалы...........................................................................................................................64

2.1.1 Флуоресцентный экспресс-метод оценки жизнеспособности, митотической

активности и формы клеточной гибели in vitro и ex vivo 64

2.2 Обработка материала..........................................................................................................65

2.2.1 Девитализация/децеллуларизация ткани 65

2.3 Культура клеток..................................................................................................................67

2.3.1 Использование постоянной клеточной линии 67

2.3.2 Получение первичной культуры гладкомышечных клеток 67

2.4 Изучение биосовместимости девитализированных/децеллуларизированных тканей in vitro......................................................................................................................................................68

2.5 Модель подкожной имплантации биоматериалов крысам.............................................69

2.5.1 Техника подкожной имплантации биоматриалов крысам 70

2.5.2 Лабораторные животные 71

2.6 Проведение гистологического и гистохимического анализа.........................................71

2.6.1 Получение криосрсзов 71

2.6.2 Гистологический анализ 72

2.6.3 Гистохимический анализ 73

2.6.4 Флуоресцентная микроскопия 73

2.8 Количественное определение минерализованного кальция...........................................74

2.9 Статистический анализ......................................................................................................75

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................................76

3.1 Влияние разрушения клеток донора на степень дегенерации и кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца....................................................................................76

3.2 Изучение роли клеток реципиента в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца..............................................................................................................................94

3.3 Выяснение роли липидов в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца.............................................................................................................................100

3.4 Роль повреждений внеклеточного матрикса в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца.............................................................................................................................110

3.5 Разработка способа предотвращения кальциноза и повышения биосовместимости трансплантатов сосудов и клапанов сердца на основе полученных результатов......................122

3.6 Разработка способа ускорения репопуляции трансплантатов сосудов и клапанов сердца............................................................................................................................126

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................................................129

ВЫВОДЫ.................................................................................................................................................134

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА РАБОТЫ...........................................................................................135

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ..........................................................136

БЛАГОДАРНОСТИ................................................................................................................................138

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................139

ВВЕДЕНИЕ

Поражение клапанов сердца в виде их стеноза, недостаточности и смешанных (комбинированных) форм встречаются очень часто и составляют около 25% всех заболеваний сердца. По своей распространенности они уступают лишь ишемической, гипертонической болезням сердца и окклюзионным поражениям сосудов [108, 205, 219]. При этом численность больных с поражением сосудистых и клапанных структур увеличивается не только в ситуации демографического старения, но и среди молодого населения [66, 219]. Вместе с тем сердечно-сосудистая хирургия и тканевая инженерия являются одними из самых быстро и успешно прогрессирующих областей науки, и своевременно выполненные операции по замене патологически измененных сосудов или клапанов сердца не только предотвращают инвалидизацию многих тысяч больных, но и реально снижают уровень смертности [62, 108, 153,255].

Помимо врожденных и приобретенных изменений сосудов и клапанов сердца дегенеративного генеза, частым показанием для замены является кальциноз клапанов сердца и сосудов эластического типа. При этом такой тип патологической минерализации сосудистых тканей является терминальной стадией их патологических изменений и не поддается медикаментозной коррекции [1, 224]. Единственным способом лечения в данном случае также является хирургическая замена поврежденных структур соответствующим протезом или трансплантатом [10, 11,23, 149, 153,219].

Разработка и применение биологических заменителей клапанов сердца в значительной степени связано с недостатками механических клапанов, такими как тромбоэмболические осложнения, необходимость пожизненного приема антикоагулянтов, шумовой эффект, протезный эндокардит и т.д., а также недостатками фиксированных кросс-сшивающими агентами и эпоксисоединениями биопротезов, такими как неспособность к росту, поддержанию и обновлению структуры ткани, токсическое действие консервирующих агентов, развитие синдрома «несоответствие протез-пациент» и т.д. [13, 62, 108, 153, 154].

Альтернативой имеющимся протезам является применение модифицированных нефиксированных алло- и ксенотрансплантатов. Данные трансплантаты не требуют приема антикоагулянтов, иммунодепрессантов и потенциально способны к полному «вживлению» и, следовательно, росту в организме реципиента, что является крайне актуальной задачей детской кардиохирургии врожденных и приобретенных клапанных пороков сердца [109]. Однако, несмотря на имеющиеся преимущества, применение данных трансплантатов ограничено развивающейся после имплантации патологической кальцификацией их тканевого матрикса,

что требует проведения повторных операции [2, 6, 7, 10, 45, 62, 74, 82, 166, 199, 205] как правило, по истечении 10-летнего срока эксплуатации [255].

В мировой научной литературе споры об этиологии кальцификации сосудистой ткани продолжаются с 1904 г., когда в журнале «Архив патологической анатомии» 28-летний немецкий врач Иоганн Георг Монкеберг описал два случая стеноза устья аорты со значительным обызвествлением клапанов [1, 20]. Исследования по выявлению причин и механизмов кальциноза собственных сосудов человека и проводятся достаточно интенсивно. По данным современной сосудистой биологии патологическая минерализация сосудов является следствием трансдифференцировки сосудистых гладкомышечных клеток, являющейся следствием таких заболеваний как ревматизм, диабет, хроническая почечная недостаточность, гипервитаминоз витамина D3, патология паращитовидных желез и т.д. [1, 21, 102, 139, 150, 156, 158,230, 263].

Исследование механизмов кальцификации биологических фиксированных протезов клапанов сердца и сосудов проводится не менее интенсивно. В частности, рассматриваются предположения о связи инициации кальциноза фиксированной сосудистой ткани с компонентами погибших клеток [101, 122, 255, 257], апоптотическими тельцами [60], компонентами тканевого матрикса: коллагеном I типа, фибронектином [265, 192], эластином [44, 45, 114, 140, 192, 206], кальций-связывающими белками (Gla-протеины, остеокальцин, остеопонтин, остеонектин, фетуин-А) и фосфопротеииами [122, 196, 214], щелочной фосфатазой [118, 195], липидами [42, 83, 127, 128, 229] митохондриями погибших клеток донора или погибающих на биопротезе клеток реципиента [2, 32] и т.д..

Однако, несмотря на интенсивные исследования механизмов минерализации биопротезов клапанов сердца и кальциноза собственных сосудов человека, ясного представления о механизме кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца в настоящее время нет.

Основываясь на предположении о том, что основной причиной кальцификации и дегенерации в трансплантатах сосудов и клапанов сердца являются клетки донора, в последние двадцать лет активно разрабатываются способы предварительного обесклеточивания (децеллуларизации) матрикса графтов, либо принудительной, контролируемой гибели в них клеток донора до имплантации (девитализация ткани) [34, 74, 89, 94, 95, 131, 143, 176, 184, 256, 267]. Предполагается, что в результате лизиса или гибели клеток донора до имплантации будет снижена иммуногенность и элиминированы центры нуклеации кальциноза. Однако предложенные на настоящее время методы обесклеточивания не могут одновременно предотвращать дегенерацию, кальциноз и иммуногенность трансплантатов клапанов сердца и сосудов [2, 6, 7]. Таким образом, разработка новых высокоэффективных методов

предварительной модификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов остается одной из самых актуальных проблем тканевой инженерии.

Ранее в Лаборатории тканевой инженерии ИТЭБ РАН была сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза о том, что инициация кальциноза в трансплантатах клапанов сердца и сосудов обусловлена накоплением кальция и фосфатов в митохондриях погибающих клеток [4, 32]. На основании данной гипотезы был разработан и внедрен в медицинскую практику способ антикальцинозной девитализации позволивший радикально снизить кальцификацию имплантированной ткани в организме реципиента [3]. С целью дальнейшего повышения биосовместимости трансплантатов сосудов и клапанов сердца автором диссертации разработан способ ферментативного разрушения клеток донора в стенках аорты после антикальцинозной девитализации с максимальным сохранением нативной структуры тканевого матрикса. Однако такое разрушение спровоцировало восстановление способности трансплантатов к кальцификации [2, 6, 7]. Помимо этого, было отмечено, что в контрольных фрагментах стенок клапанов аорты, имплантированных крысам, отложение кальцификатов осуществляется наиболее интенсивно вблизи наружного слоя (Ч. ас!уеп1Ша), т.е. вблизи мест локализации жировой ткани [6, 7]. Данные наблюдения трудно объяснить на основе имеющихся представлений о митохондриальном механизме кальцификации, и указывают на то, что механизм кальциноза является многокомпонентным [2].

В связи с этим возникает необходимость в более широком исследовании механизмов инициации кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца с целыо разработки на основе полученных комплексных представлений способов предотвращения их кальцификации в организме реципиента.

Кроме вышесказанного, по имеющимся статистическим данным, без использования специальных методик даже через годы не происходит заселения толщи девитализированных/децеллуларизированных трансплантатов, а значит, не происходит ремоделирования и обновления структуры матрикса [23, 126, 129, 146, 189]. Естественным выходом в данном случае является применение цитокинов для предимплантационной модификации трансплантатов, которое может усилить заселение матрикса графтов клетками реципиента, т.е. обеспечить полноценное вживление трансплантата [31, 116, 126, 142, 183, 189]. Эта задача очень актуальна для тканевой инженерии трансплантатов клапанов сердца и сосудов. При этом крайне важной задачей является квалифицированное применение цитокинов, т.к. при неправильном их применении возможно провоцирование атерогенного эффекта с последующим усугублением дегенеративных процессов и развитием кальциноза [31].

Таким образом, ведущим направлением тканевой инженерии трансплантатов сосудов и клапанов сердца является разработка биосовместимых, ненммуногенных трансплантатов,

обладающих способностью к росту и ремоделированшо, что особенно необходимо в педиатрическом приложении. Одной из важнейших задач, стоящих перед тканевой инженерией является разработка способов снижения/предотвращения развития кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца [2, 6, 7, 62, 205], в основе которых должно лежать ясное понимание механизмов, приводящих к описанным необратимым последствиям.

Целью данной работы являлось выяснение механизмов кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца и разработка на основе полученных результатов способов ее подавления.

В соответствии с целыо были поставлены следующие задачи:

1. оценка возможности подавления кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца при разрушении в них клеток донора до имплантации;

2. изучение роли клеток реципиента в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца;

3. выяснение роли липидов в кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца;

6. разработка способа ускорения репопуляции трансплантатов сосудов и клапанов сердца.

Научная новизна работы. В работе впервые показано, что известные из научной

литературы способы децеллуларизации трансплантатов клапанов сердца и сосудов повреждают структуру тканевого матрикса, сохраняя и(или) усиливая их способность к кальцификации. Впервые установлено, что кальцификация трансплантатов сосудов и клапанов сердца осуществляется в значительной степени при участии клеток реципиента, и липидные компоненты ТСКС играют решающую роль в инициации кальциноза. Научная новизна заключается в том, что авторами впервые предложено представление о том, что механизм кальциноза трансплантатов сосудов и клапанов сердца является комплексным и включает механизмы зависимые и не зависимые от клеток реципиента. Авторами впервые предложена гипотеза о механизме зависимой от клеток реципиента кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца, основанная на представлениях об атеросклеротическом поражении сосудов и медиальном кальцинозе. Впервые показано, что независимые от клеток реципиента механизмы кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца определяются структурными повреждениями коллагеновых и эластиновых волокон матрикса. Показана возможность предотвращения кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца путем их обработки до имплантации натуральным липофильным детергентом дезоксихолатом натрия,

препятствующим аккумуляции кальция митохондриями, инактивирующим лизосомальные гидролазы и протеазы клеток донора, удаляющим инициаторные липидные компоненты матрикса и не нару

Информация о работе

Фадеева, Ирина Сергеевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2013
ВАК 03.03.01

Диссертация

Роль клеток реципиента и нарушения структуры тканевого матрикса в механизме кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Роль клеток реципиента и нарушения структуры тканевого матрикса в механизме кальцификации трансплантатов сосудов и клапанов сердца - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы