Исследование механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка способов его предотвращения

Рындина, Наталья Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка способов его предотвращения
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка способов его предотвращения"

На правах рукописи

Рындина Наталья Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ИНИЦИАЦИИ КАЛЬЦИНОЗА ТРАНСПЛАНТАТОВ КЛАПАНОВ СЕРДЦА И РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ЕГО ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ

03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2006

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Научные руководители: доктор физико-математических наук

Акатов Владимир Семенович доктор медицинских наук Муратов Равиль Муратович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Гаврилюк Борис Карпович доктор биологических наук Попов Виктор Иванович

Ведущая организация: Институт биологии развития

им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится <Ж СШЛ^ 2006 года в /3

на заседании диссертационного совета Д 002.093.01

при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по

адресу: 142 290, г. Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142 290, г.Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан « ¿3 » ^¿^¿2/1^^-2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета, л

кандидат физико-математических наук Н.Ф. Панина

J, сое Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В кардиохирургии клапанных пороков сердца наряду с механическими клапанами и биопротезами применяются трансплантаты клапанов сердца, которые, в отличие от биопротезов, не подвергаются обработке фиксирующими агентами, такими, как глутаровый альдегид или эпоксисоединения. Преимуществами использования трансплантатов являются отсутствие необходимости применения пациентом долговременной антикоагулянтной терапии, оказывающей повреждающее действие на печень, а также возможность ремоделирования трансплантатов путем внедрения в них клеток реципиента перед имплантацией юга за счет миграции клеток из окружающих тканей после имплантации (Angell et al., 1973). Способность к ремоделированию особенно важна у детей и пациентов молодого возраста, когда необходимо обеспечить не только поддержание и обновление структуры трансплантата, но и его рост. Однако сроки функционирования трансплантатов ограничены из-за их кальцификации. Предлагаются различные гипотезы о механизме инициации кальциноза трансплантатов и биопротезов клапанов сердца. В частности, рассматривается предположение о связи инициации кальциноза с компонентами погибших клеток (мембраны клеток и органоидов, фрагменты ДНК, кальций-связывающие белки - кальсеквестрин, кислые фосфолипиды и др.) (Ferrans et al., 1980; Valente et al., 1985; Розанова и др., 1999). Согласно другому предположению, центры инициации кальциноза связаны с компонентами тканевого матрикса: с коллагеном I типа, фибронектином (Watson et al., 1998), эластином, кальций-связывающими белками (гла-протеины, остеокальцин, остеопонтин, остеонектин), фосфопротеинами (Shanahan et al., 1998; Proudfoot et al., 1998), щелочной фосфатазой (Hui et al., 1998). При гибели клеток в результате ферментативного лизиса может также нарушаться связь гликозаминогликанов с коллагеном в тканевом матриксе, что также может способствовать образованию сайтов, аффинных к фосфатам кальция (Loose et al., 1993). Однако ясного представления о механизме инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов нет.

БИБЛИОТЕКА С Петербург1

од

илишм j

основном клетками, а не компонентами тканевого матрикса (Johnson et al., 1997). Кроме того, предполагается, что в результате лизиса и разрушения клеток донора до имплантации будут элиминированы центры нуклеации кальциноза, что будет способствовать его предотвращению. Однако неизвестно, в какой степени девитализация трансплантатов клапанов сердца может предотвращать кальциноз.

Для ускорения ремоделирования и предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов предложено также заселять их после девитализашш клетками реципиента: миофибробластами, эндотелиальными, стволовыми клетками (Eberl et al., 1992; Loose et al., 1993; Curtil et al., 1997; Steinhoff et al, 2000; Акатов и др., 2001; Hoerstrup et al., 2002). При этом подразумевается, что посеянные клетки будут предотвращать кальциноз путем поддержания гомеостаза кальция и фосфатов, pH среды и т.д. Несмотря на достаточно большое количество работ в этом направлении, остается неясно, в какой степени девитализация трансплантатов и последующий посев клеток реципиента могут способствовать ремоделированию ткани и предотвращать кальциноз.

В связи с этим возникает настоятельная необходимость в исследовании механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца с целью разработки на основе полученных представлений способов его предотвращения. Цель работы. Целью данной работы являлось изучение механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка на основе полученных представлений способов его предотвращения. Основные задачи исследования.

1. Изучение кальциноза трансплантатов клапанов сердца после их девитализации известными способами.

2. Изучение локализации центров инициации кальциноза в трансплантатах клапанов сердца.

3. Разработка способа предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца.

4. Исследование кальциноза трансплантатов клапанов сердца после их девитализации и заселения клетками реципиента.

Научная новизна работы. Впервые предложена гипотеза о ведущей роли митохондрий в инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Впервые с помощью электронной микроскопии показано, что центрами кальцификации в трансплантатах стенок аорты являются митохондрии. Впервые показана возможность полного предотвращения кальцификации трансплантатов

клапанов сердца и сосудов путем обеспечения гибели клеток в условиях, препятствующих аккумуляции кальция митохондриями. Впервые показано, что гладкомышечные клетки, изогенные реципиенту, посеянные на девитализированные трансплантаты стенок аорты, снижают их кальциноз. Полученные данные расширяют представление о механизмах нормальной и патологической кальцификации биологических тканей, что актуально не только для проблемы понимания механизма кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов, но и для проблемы патологической минерализации тканей в организме, в частности при атеросклерозе сосудов.

Практическая значимость. На основе проведенных исследований разработан эффективный способ предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Предложенный способ запатентован и внедряется в технологический регламент производства аллотрансплантатов клапанов сердца в НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН, г. Москва. Полученные результаты также являются основой для разработки способа снижения кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов с помощью посева гладкомышечных клеток реципиента на девитализированные трансплантаты клапанов сердца и сосудов.

Апробация диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 2002 г., на конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении», Москва, 2003 г., на 6 и 8 Пущинских школах-конференциях молодых ученых, Пущино, 2002,2004 гг., на международном симпозиуме «Биологическая подвижность», Пущино, 2004 г., на 1П Российском Конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)», Москва, 2004 г., на конференции «Фундаментальные науки-медицине» Москва, 2004 г., на Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», Санкт-Петербург, 2004 г., на III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам, Москва, 2005 г., на секции Ученого Совета ИТЭБ РАН, 2006 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах. Получен 1 патент.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на.....

страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их

обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Содержит ... рисунков. Список цитируемой литературы включает.....наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы. В экспериментах были использованы аортальные клапаны сердца свиньи и человека, предоставленные НЦ ССХ им. Бакулева РАМН. Клапаны сердца человека были получены при аутопсии или во время операции но замене пораженного клапана. Аортальные клапаны сразу после забора помещали в питательную среду RPMI 1640, в которую были добавлены гентамицин (400 мкг/мл) и флуконазол (50 мкг/мл) и хранили при 4°С.

Девитализация ткани. Для разрушения клеток в тканях клапанов использовали известные методы с помощью гипотонического шока и нуклеаз (О' Brien et al., 1999), обработку ферментами в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), содержащем трипсин (0.12%), ЭДТА (0.01%), ДНК-азу (0.2 мг/мл) и РНК-азу (20 мкт/мл) (Teebken et al., 2000). Некротическую гибель клеток вызывали путем инкубации тканей клапана в 0,01-0.02 % дигитонина в питательной среде ДМЕ или физиологическом растворе без кальция и фосфатов (ФР).

Модель исследования кальцификации ткани. Для оценки степени кальцификации тканей сердечного клапана использовали известную модель подкожной имплантации крысам (Lee et al., 1998). В качестве экспериментальных животных использовались крысы линии Wistar, самцы, вес 180-200 г. (всего 203 крысы). Фрагменты стенки аорты и створок аортального клапана сердца свиньи, либо человека размером 5x5 мм2 помещали в пористые камеры с размерами пор 50 мкм, выполненные из нержавеющей стали, и имплантировали подкожно крысам в область спины под тиопенталовым наркозом (3 мг/100 г веса). Животные содержались в стандартных условиях вивария, корм и вода - ad libitum. В рацион питания крыс включали витамин Дз. Работу с животными осуществляли в соответствии с требованиями этического комитета Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Культура клеток. Культуру гладкомышечных клеток из аорты крыс линии Wistar получали по методике, описанной в работе (Leung et al., 1977). В экспериментах использовали клетки 4-6 пассажей. Культуру клеток из костного мозга получали по стандартной методике (Хант, 1990). В экспериментах использовали клетки костного мозга, селектированные путем прикрепления к культуральным флаконам.

Иммуноцшпохимия. Для идентификации полученной клеточной культуры использовали моноклональные антитела к альфа-актину гладкомышечных клеток (Sigma, США) (Skalli, 1986).

Люминесцентная микроскопия. Соотношение числа живых и погибших клеток в тканях определяли методом прижизненной люминесцентной микроскопии с использованием окраски ткани ядерными красителями этидиум бромидом и Bisbenzimide Hoechst 33342 (Акатов и др., 2000). Метод использовали также для анализа наличия клеток в поперечных срезах стенок аорты толщиной 100-200 мкм, не подвергая их фиксации. Метод позволяет быстро оценить жизнеспособность гладкомышечных, эндотелиальных клеток, фибробластов в ткани, а также определять форму клеточной гибели в ткани (апоптоз-некроз) но аберрантному распределению хроматина, митотическую активность клеток.

Гистология. Для изучения разрушения клеток в тканях использовали стандартный гистологический анализ, включая фиксацию фрагментов ткани раствором Буэна, получение парафиновых срезов толщиной 5-7 мкм, окраску гематоксилин-эозином (Лилли, 1969), а также получение срезов фиксированных тканей в эпоксидной смоле толщиной 2-3 мкм и окраску метиленовым синим, азуром И и основным фуксином (Humphrey, and Pittman, 1974).

Электронная микроскопия. Для ультраструктурного исследования локализации связанного кальция в клетках и тканях использовали фрагменты стенки аорты до и после подкожной имплантации крысам на 1, 3 и 5 суток. Образцы фиксировали 1 % раствором глугаральдегида в фосфатном буфере (0.05 М, pH 7.4) в течение 16 ч. Затем образцы промывали фосфатным буфером, дофиксировали 2 ч 1 % 0s04 в фосфатном буфере, промывали в этом же буфере, обезвоживали и заливали в Эпон-812. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-3 и докрашивали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Часть срезов перед контрастированием обрабатывали раствором 20 мМ ЭГТА (контроль на специфичность реакции) при 37°С в течение 60 мин.

Сканирующая электронная микроскопия. Изучение адгезии клеток к поверхности фрагментов аортальной стенки человека проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии (Baechler et al., 1973). Образцы просматривали на сканирующем электронном микроскопе (JSM-2), снабженного 200цш апертурой, при 25 квольт и наклоне образца 0-40°.

Абсорбционная спектроскопия. Содержание кальция во фрагментах тканей клапанов сердца после 2 месяцев подкожной имплантации определяли методом атомной абсорбционной спектроскопии. После эксплантации фрагменты ткани

отмывали в течение 1 сут в PBS без Са2+, высушивали в течение 2 часов при 100°С, измеряли сухой вес образцов, растворяли минерализованный кальций в 0.1Н HCl и затем проводили измерение количества минерализованного кальция в них, используя прибор AAS-5100/Zeeman фирмы Perkin-Elmer.

Радиоизотопный метод. Синтез коллагена, как показа] ель синтетической активности гладкомышечных клеток, посеянных на девитализированные фрагменты стенок аорты, определяли по включению |4С-меченого пролина (Van der Kamp and Nauta 1979).

Статистический анализ. Содержание кальция в каждом эксперименте усредняли по 10-12 образцам варианта, имплантированным разным крысам, определяли среднеквадратическую ошибку. Достоверность различия средних значений оценивали по критерию Стьюдента. Эксперименты проводили не менее чем в трех повторах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Оценка адекватности использования модели изучения кальциноза трансплантатов клапанов сердца путем подкожной имплантации крысам.

Кальцификация трансплантатов клапанов сердца и сосудов при имплантации их in situ является длительным процессом. Поэтому для исследования кальциноза мы использовали известную модель подкожной имплантации биоматериалов крысам. Кроме того, подкожная имплантация биоматериалов мелким животным является более дешевой и практически удобной моделью, чем интракардиальная имплантация крупным животным (телятам, овцам). Однако при этом имеются сомнения в адекватности данной модели изучения кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Поэтому для оценки правомочности использования этой модели мы изучали кальцификацию нативных тканей аортального клапана свиньи после подкожной имплантации крысам и сравнивали полученные результаты с данными литературы о кальцификации трансплантатов клапанов сердца, имплантированных in situ.

Было показано, что при подкожной имплантации крысам фрагментов тканей аортального клапана свиньи (стенка аорты, створка и мышцы) происходила кальцификация только аортальной стенки и мышечной ткани, о чем можно было судить визуально и по результатам измерения минерализованного кальция (рис.1). Известно, что в аллотрансплантатах клапанов сердца, имплантированных in situ, створки клапанов практически не кальцифицируются, тогда как в стенках аорты, а также в участках створок,

прилегающих к аорте, и в мышечной ткани трансплантатов клапанов наблюдается значительный кальциноз. Поэтому полученные результаты могут служить подтверждением адекватности метода подкожной имплантации для изучения кальцификации тканей трансплантатов клапанов сердца и сосудов

Рис. 1. Кальцификации стенок и створок клапанов сердца свиньи после 30 суток подкожной имплантации крысам линии Wistar.

1 - сборки до имплантации.

2 - створки после импланищии.

3 - стенки до имплантации.

4 - стенки после имплантации.

Изучение кальцификации трансплантатов клапанов сердца после их девитализации способами, предлагаемыми в литературе.

В настоящее время для разрушения клеток донора используются различные методы, в частности, гипотонический шок с последующей обрабо1кой нуклеазами, ферментативная обработка. Согласно нашим данным, полученным меходами люминесцентной микроскопии и гистологического анализ, обработка фрагментов аорты и створок клапана свиньи гипотоническим шоком и нуклеазами (О Впеп е1 а/., 1999) вызывала гибель клеток, однако полною их разрушения не наблюдалось, о чем свидетельствовало сохранение ядер клеток в тканях. В то же время обработка ферментами (ТееЬкеп е/ а!.. 2000) приводила к практически полному разрушению клеток в тканях трансп тнтатов (рис.2) До обрабо1ки. согласно тюминесцентнои микроскопии, от 50 до 80? о миофибробласгов в лепестках и от 30 до 60% гладкомышечмых клеток в стенка^ аорты были живыми

После обработки стенок аорты гипотоническим шоком и ¡ак-м нуклеазами катьиификация после 2 месяцев подкожной имплантации была выше, чем в необработанных стенках. Лизис клеток с применением трипсина, ЭДГА и нуклеаз не снижал кальцификацию с:енок аорты (рис.3). Створки после указанных обработок не кальцифицировались.

Таким образом, предлагаемые в литературе способы разрушения клеток в тканях трансплантатов клапанов сердца и сосудов не только не снижают и\ кальцификацию после имплантации, но даже усиливают ее Эти данные

подчеркивают необходимость изучения роли гибели клеток в инициации калышноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов.

Рис. 2. Разрушение клеток во фрагментах стенки аорты свиньи после 2 сут инкубации с трипсином, ЭДТА и нуклеазами в ФР (В, D) и до инкубации (А, С).

А. В - люминесцентная микроскопия среза, окраска ядерными красителями ethidium bromide и bisbenzimide hoechst 33342. С и D - гистологический анализ, окраска гематоксилин-эозином. Светлые пятна на А и темные пятна на С - ядра клеток.

120 -J я j

i 100 ->

12 3 4

Рнс. 3. Кальциноз в стенках аорты свиньи после разрушения клеток донора известными методами до имплантации крысам под кожу на 1 мес.

1 и 2 - содержание кальция в нативных стенках до и после имплантации. Разрушение клеток до имплатации вызывали гипотоническим шоком (Н20) и нуклеазами в ФР (3) либо 0.25% трипсин (Т) с 0,02% ЭДТА и нуклеазами (рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза) в ФСБ (4).

Гипотеза о роли митохондрий в инициации кальцификааии трансплантатов клапанов сердца и сосудов.

Основываясь на том, что после гибели клеток часть митохондрий может оставаться интактньши и активно аккумулировать кальций при концентрациях выше 0.5-1 мкМ синпортно с фосфатами (Ленинджер, 1966), нами было выдвинуто предположение, что важная роль в процессе инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов может принадлежать митохондриям (рис.4). В результате аккумуляции концентрация фосфатов кальция в нативных митохондриях может достигать больших значений, при которых происходит образование кластеров фосфатов кальция (аморфная форма) с последующим формированием кристаллов гидроксиапатита (Eanes et al., 1965; Ленинджер, 1966). После накопления кальция до высоких концентраций открываются митохондриальные поры и митохондрии погибают (Zoratti and Szabo, 1995). Активная аккумуляция фосфатов кальция может осуществляться при гибели клеток донора до забора трансплантатов и после их имплантации, поскольку концентрация внеклеточного кальция и фосфатов в этих случаях превышает 1 мМ, и в околоклеточной среде имеются субстраты, необходимые для функционирования митохондрий. Поэтому митохондрии могут играть ключевую роль в зарождении центров кальцификации при гибели клеток в трансплантатах клапанов сердца и сосудов.

Изучение роли клеток и тканевого матрикса в инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов.

Для изучения роли органоидов клетки и компонентов тканевого матрикса в инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов было проведено электронно-микроскопическое исследование локализации центров нуклеации минеральных отложений. В исследованиях, учитывая отсутствие кальциноза в створках клапана, использовались только стенки аорты человека: нативные, взятые в ходе операции, и стенки, полученные при аутопсии, через

Рис.4. Схема зарождения кальцификации в трансплантатов сердца.

MX - митохондрии.

механизма центров клетках клапанов

Са ~ 10"3 М Са~10"3М

15-18 часов после гибели донора (стандартные условия для забора трансплантатов клапанов сердца человека). По данным люминесцентной микроскопии, нативные стенки содержали живые гладкомышечные и эндотелиальные клетки, а в стенках аорты, полученных при аутопсии, живых клеток не наблюдалось. Фрагменты аортальных стенок с погибшими клетками имплантировали подкожно крысам на 1, 3 и 5 суток. Было установлено, что во фрагментах нативных стенок аорты до имплантации отложения кальция ни в клетках, ни в тканевом матриксе не обнаруживались. Во фрагментах стенки аорты после аутопсии электронно-микроскопический анализ не выявил достоверного накопления кальция в миюхондриях, ЭПР, в других частях клетки, также как и в тканевом матриксе. Электронно-плотные участки в ядре и в цитоплазме не устранялись обработкой ЭГТА, что свидетельствует о том, что они не являлись отложениями кальция.

Через 1 сут. после подкожной имплантации крысам отложения кальция в стенках аорты не выявлялись. Ультраструктура клеток была повреждена. Митохондрии выглядели набухшими с частично фрагментированными кристами. Цистерны ЭПР были значительно увеличены. Через 3 и 5 суток после имплантации в 30-40 % клеток в стенках аорты большая часть митохондрий была заполнена электронно-плотным осадком (рис.5С). Обработка срезов раствором ЭГТА полностью удаляла электронно-плотный осадок из митохондрий, указывая на то, что они содержали именно кальций (рис.5О).

Рис.5. Выявление локализации кальция в митохондриях погибших гладкомышечных клеток фрагментов стенки аорты человека через 3 суток после ее имплантации под кожу крысам.

С - электронно-плотные участки отложений кальция в митохондриях (М). Б -кальций в срезах удален из митохондрий обработкой 20 мМ ЭГТА. Увеличение -20000.

В разрушающихся митохондриях отложения кальция сохранялись. В тканевом матриксе на всех сроках имплантации отложения кальция не обнаруживались. 10

Ядра в клетках также содержали электронно-плотные участки, но обработка раствором ЭГТА не удаляла их.

Таким образом, обнаруженное отложение кальция в митохондриях и отсутствие связанного кальция в других частях погибших клеток донора и в тканевом матриксе стенки аорты после имплантации указывает на то, что инициация кальциноза в трансплантатах клапанов сердца и сосудов осуществляется в митохондриях. Тот факт, что отложений кальция не было обнаружено в митохондриях погибших клеток стенок аорты перед имплантацией тканей в крысу, можно объяснить тем, что центры инициации кальциноза, возникающие при гибели клеток в организме донора в результате тепловой ишемии, имели малые размеры - около 10 нм, подобно тому, что обнаруживалось другими авторами в фиксированных глутаральдегидом биопротезах аорты (Lee, 1993).

Полученные результаты позволяют рассматривать митохондрии погибших клеток центрами нуклеации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов.

Разработка способов предотвращения кальцификации трансплантатов клапанов сердда.

Изучение кальцификации трансплантатов клапанов сердца после их девиталюации агентами, вызывающими апоптотическую гибель клеток.

Основываясь на гипотезе о ключевой роли митохондрий в инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца, было предложено инициировать апоптотическую гибель клеток для предотвращения аккумуляции кальция митохондриями. Этот подход был основан на том, что, как известно, в ходе реализации апоптотической программы повреждение митохондрий происходит до нарушения целостности плазматической мембраны. Поэтому можно ожидать, что после гибели клеток не будет происходить накопления фосфатов кальция в митохондриях. В связи с этим изучалась возможность предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца путем инициации апоптотической гибели клеток под воздействием гипертермии, аноксии, сорбитола, ионофора А23187 и ЭДТА до имплантации. Контролем служили нативные ткани и ткани, обработанные дигитонином, который позволяет вызывать некроз клеток без повреждения митохондрий.

Используя метод прижизненной люминесцентной микроскопии, было установлено, что в условиях аноксии, либо через 2 сут. после инкубации в среде ДМЕМ с добавлением ионофора А23187 или сорбитола наблюдалось абберантное распределение хроматина, что свидетельствовало о запуске

апоптотической гибели клеток. Обработка фрагментов стенок аорты 5 или 10 мМ ЭДТА в бескальциевой среде MEM, также как и инкубация фрагментов аортальных стенок и створок клапана в 10 мМ ЭДТА в ДМЕМ, содержащем 2 мМ кальция, тоже вызывала апоптоз. В то же время инкубация фрагментов стенки в 0,5 или 2,5 мМ ЭДТА в бескальциевой MEM не вызывала апоптоз. Дигитонин (0,02%) в среде ДМЕМ, согласно люминесцентной микроскопии, вызывал некротическую гибель всех клеток в течение 1ч в створках и 4 часов в стенках аорты.

При сравнении кальцификации стенок, обработанных различными агентами, вызывающими гибель клеток, было обнаружено уменьшение содержания связанного кальция в стенках, обработанных 10 мМ раствором ЭДТА в бескальциевой среде MEM, в 4 раза по сравнению с необработанными стенками, хранившимися до имплантации в стандартных условиях в среде RPMI 1640 (рис.6). Использование 0,5 и 2,5 мМ растворов ЭДТА в MEM (без кальция) не приводило к снижению калыданоза стенок аорты, что коррелировало с отсутствием запуска апоптотической гибели клеток при таких концентрациях ЭДТА. Обработка фрагментов аортальной стенки 10 мМ раствором ЭДТА в ДМЕМ также снижала содержание связанного кальция в ткани, однако всего в ~ 2 раза (рис.7).

140

0 1 2 3 4 5 6

Рис.6. Кальцификация стенок аорты свиньи после 2 мес. подкожной крысам.

Ткани перед импл. инкубировали в среде ДМЕМ:

1 - без повреждающего клетки воздействия;

2 - при 44С;

3 - без кислорода;

4 - с 2М сорбитолом;

5 - с ионофором А 23187 (5мкМ);

6 - в среде MEM без кальция с 10 мМ ЭДТА.

* - р<0.05 отн. варианта 1.

Стенки аорты, обработанные другими агентами, запускающими апоптоз без хелатирования кальция, калъинфицировались практически в той же степени, как и необработанные стенки. Возможно, в этих случаях при апоптотической гибели происходит перераспределение внутриклеточного кальция из кальциевых депо клетки, таких как ЭПР, в митохондрии, что приводит к

образованию в них отложений фосфатов кальция. Уменьшение степени кальцификации стенок аорты после обработки 10 мМ ЭДТА в бескальцисвой среде, либо в среде ДМЕМ, и отсутствие такого эффекта при использовании остальных апоптотических агентов свидетельствует о том, что снижение кальциноза было связано не только с инициацией апоптотической гибели клеток, но также с хелатированием ионизованного кальция во внеклеточном пространстве с помощью ЭДТА. Некротическая гибель клеток, вызванная дигитонином в среде ДМЕМ, содержащей фосфаты и кальций, не снижала кальциноз стенок аорты. Исходя из нашей гипотезы, полученный результат можно объяснить тем, что использование дигитонина при концентрациях, не повреждающих митохондрии, приводит к накоплению в них фосфатов кальция. Добавление 10 мМ ЭДТА в инкубационную среду ДМЕМ с 0,01% дигитонина снижало содержание связанного кальция после имплантации в 4 раза по сравнению с необработанными стенками (рис. 7).

Рис.7. Кальцификации стенок аорты после 2 мес. имплантации крысам.

Ткани перед имплантацией инкубировали в среде ДМЕ:

1- без агентов, повреждающих клетки;

2-с 10 мМ ЭДТА;

3- с 0.02% дигитонина;

4- 0.02% дигитонина и 10 мМ ЭДТА. * - р<0.05 отн. варианта 1.

По-видимому, быстрая гибель клеток в результате повреждения клеточной мембраны под воздействием дигитонина препятствовала процессам перераспределения внутриклеточного кальция с аккумуляцией последнего в митохондриях. При этом ионизированный кальций, как вне-, так и внутри клетки связывался ЭДТА, что уменьшало отложение фосфатов кальция в митохондриях. Обработка тканей раствором дигитонина в бескальциевой среде MEM без ЭДТА также снижала их кальцификацию в 3-4 раза.

На основании проведенных исследований сделан вывод, что апоптотическая гибель клеток в стенках аорты в общем случае не обеспечивает снижения кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Как апоптогическая, так и некротическая гибель клеток в бескальциевой среде или при

хелатировании внеклеточного кальция способны снижать кальциноз трансплантатов стенок аорты.

Разработка способов полного предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца.

Учитывая то, что для связывания кальция митохондриями необходимы неорганический фосфат, ионы М§, АТФ, а также субстраты для дыхания митохондрий, было проведено изучение возможности полного предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца путем создания условий гибели клеток в физиологическом растворе с буфером НЕРЕБ без кальция, магния, фосфатов и субстратов. Используя модель подкожной имплантации крысам, было установлено, что после 2 сут. инкубации в ФР, рН 7,4 с 10 мМ ЭДТА кальцификация стенок аорты свиньи уменьшалась в 5-7 раз. Снижение рН с 7.4 до 6.0 вызывало дополнительное снижение кальциноза в 2 раза. Однако полного предотвращения кальцификации при этом не происходило. Инкубация в ФР с 0.02 мМ дигитонина, обеспечивающего быструю гибель клеток, и с 10 мМ ЭДТА, обеспечивающем хелатирование ионов кальция, позволила добиться полного предотвращения кальциноза (рис.8). Гибель клеток под действием

Рис.8. Подавление минерализации фрагментов стенки аорты свиньи после различных антикальципозных обработок в течение 2 суток до имплантации крысам на 1 месяц.

1 - Среда ЯРМ! 1640, 4С, контроль

2 - ФР рН 6.0 с 0.02% диг., 20С

3 - ФР рН 6.0 с 10 мМ ЭДТА, 20С

4 - ФР рН 6.0 с 10 мМ ЭДТА и 0.02% диг., 20С.

дигитонина в бескальциевом ФР также позволяла добиться полного предотвращения кальциноза. Казалось бы, что для полного предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца достаточно вызывать гибель клеток дигитонином в бескальциевой среде. Однако, эксперименты выполненные на стенках аорты человека, показали, что это не так. Инкубация стенок аорты аорты человека в ФР с дигитонином не снижала кальциноз полностью, в отличие от инкубации с 10 мМ ЭДТА или с комбинацией дигитонина и ЭДТА (рис.9).

Причину различного воздействия ЭДТА и дигитонина в отдельности на капьциноз стенок аорты человека и свиньи можно объяснить, исходя из данных о жизнеспособности клеток в исследуемых тканях и о характере гибели клеток,

' ]

Рис.9. Подавление минерализации фрагментов стенки аорты человека после различных антикальцинозных обработок в течение 2 суток до имплантации крысам на 1 месяц.

1 - Среда ЯРМ1 1640. 4С, контроль

2 - ФР рН 6.0 с 0.02% диг., 20С

3 - ФР рН 6.0 с 10 мМ ЭДТА, 20С

,_1_

4 - ФР рН 6.0 с 10 мМ ЭДТА и 0.02% дш .

20С

инициируемой этими агентами в ФР. Люминесцентный микроскопический анализ показал, что в стенках аорты свиньи, которые использовались в опытах с результатами, представленными на рис.8, большинство гладкомышечных клеток были живыми. После обработки дигитонином, либо дигитонином с ЭДТА, все клетки были погибшими. Следовательно, клетки погибали при отсутствии кальция во внеклеточной среде и при этом не происходило аккумуляции кальция в митохондриях. После инкубации фрагментов аорты свиньи в ФР с ЭДТА клетки оставались живыми не только сразу после инкубации, но и после помещения в ФР на двое суток (рис. 10). Если после 2 I инкубации в ФР с ЭДТА ткани переносили в среду ДМЬ, то уже в первые часы наблюдалась активная апоптотическая гибель клеток. Это указывает на то, что при инкубации в ФР с ЭДТА инициируется аиоптотическая гибель, но развитие апоптотической программы не происходит из-за отсутствия субстратов, подавления энергетики клетки и синтеза белка. При перенесении гкани в питательную среду происходит развитие и завершение апоптотической программы. Поэтому после инкубации в ФР с ЭДТА в аортальных стенках свиньи происходило завершение апоптотической программы после имплантации, при физиологической концентрации кальция и фосфатов в тканевой жидкости, что могло приводить к аккумуляции фосфатов кальция в митохондриях и последующей кальцификации имплантатов.

В стенках аорты человека практически все клетки были пен ибшими до забора имплантатов, то есть при физиологических концентрациях фосфатов и кальция, и, следовательно, имели центры нуклеации кальциноза. Инкубация в ФР с дигитонином не могла воспрепятствовать образованию центров

кальцификации ткани, а инкубация с ЭДТА при низких рН могла обеспечить растворение имеющихся зародышей кристаллов гидроксиапатита. Поэтому в этом случае инкубация с дигитонином не предотвращала кальциноз фрагментов стенок аорты человека полностью, а инкубация тканей в ФР с ЭДТА полностью

Рис.10. Жизнеспособность клеток в ходе антикальцинозной обработки

путем инкубации клеток в физ. растворе рН 6.0 с 10 мМ ЭДТА 48 часов при 20С с последующей отмывкой в ФР 1 час и инкубацией в течение 1 сугок в ФР ( 1) или в среде ДМЕ (2) при 37С .

ингибировала их кальциноз после имплантации. Это подтверждают результаты опытов (рис.11), согласно которым инкубация стенок аорты свиньи с живыми клетками в ФР с 10 мМ ЭДТА, предварительно инкубированными в среде ДМЕ с дигитонином (сохраняет кальциноз, подобно тому, как при гибели клеток в организме), полностью предотвращала кальциноз ткани. Следует подчеркнуть, что инкубация в ФР с сочетанием дигитонина и ЭДТА вызывала полное предотвращение кальциноза в обоих случаях, поскольку препятствовала аккумуляции фосфатов кальция в погибающих клетках и способствовала растворению образовавшихся до инкубации центров кальцификации ткани. Инкубация мышечной ткани ксенотрансплантатов аортальной ткани в ФР, рН 6.0, с дигитонином и ЭДТА при подкожной имплантации крысам на 1 -2 месяца также снижала кальциноз ткани с 60-100 мкг/мг сухого веса кальция до нуля. Створки клапанов сердца после этой обработки не кальцифицировались. В стенках аорты, подвергнутых антикальцинозной обработке в ФР с дигитониом и с ЭДТА не обнаружено электронно-плотных участков в первые 3-5 суток после подкожной имплантации крысам в отличие от кальцифицирующихся нативных фрагментов стенки аорты человека.

Таким образом, основываясь на представлении о ведущей роли митохондрий погибающих клеток в инициации кальциноза нами был разработан способ полного предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов.

Время инкубации, часы

Разработанный способ патентуется и внедряется в технологический регламент производства аллотрансплантатов клапанов сердца человека в НЦ ССХ РАМН им. А.Н.Бакулева (Москва).

Рис.11. Создание центров

минерализации в стенках аорты человека путем инкубации в среде ДМЕ с 0.02% дигитонина и и\ устранение путем инкубации в ФР с ЭДТА или цитратом до имплантации крысам на 1 месяц.

1 - ЯРМ1 1640,4С (нативные, контроль)

2 - Среда ДМЕ+диг. 0.02% (девитализация)

3 - Среда ДМЕ-'диг.. затем ФР. рН 6 0 с 25мМ ЭДТА

4 - Среда ДМЕ+диг. затем ФР, рН 6.0 с 0.1М цитрата

Оценка возможности снижения кальиификации трансплантатов клапанов сердца путем заселения их после девитализации клетками реципиента.

Для снижения иммуногенности и ускорения репопуляции трансплантатов клапанов сердца в настоящее время предлагается разрушать клетки донора и заселять такие девитализированные трансплантаты клетками реципиента до имплантации. В какой степени такой подход может реально способствовать ремоделированию ткани, остается неясно. С целью выяснения возможности использования такого подхода для предотвращения кальциноза имплантированной ткани было проведено исследование кальцификации фрагментов аортальной стенки свиньи после разрушения или гибели клеток донора способами, не предотвращающими кальциноз (ТееЬкеп ег а!., 2000), и последующего посева гладкомышечных клеток крысы линии \Vistar перед подкожной имплантацией крысам этой же линии.

Из фрагментов аорты крысы линии \yistar была получена культура клеток. Цитоскелет подавляющего большинства полученных клеток (97-99%) окрашивался монокпональными антителами к альфа-актину гладкомышечных клеток (ГМК). Этот факт указывает на то, что была получена популяция именно ГМК, поскольку ГМК являются основной составляющей клеточной популяции в стенках аорты, а эндотелиальные клетки и фибробласты не окрашиваются антителами к альфа-актину ГМК. Косвенным указанием принадлежности

полученных клеток к ГМК служил также характерный вид полученной культуры (hill-and-valley) и то, что не наблюдалось характерных для фибробластов «потоков клеток» или морфологических признаков культуры типа «cobble stone», характерного для эндотелиальных клеток Время удвоения числа клеток в культуре составляло около 24 часов, плотность насыщения культуры не превышала 30 тыс. клеток/кв.см. Число удвоений клеток в культуре (лимит Хейфлика) не превышало 20-25. К этому времени рост клеток прекращался и наблюдалась их дегенерация. Поэтому для экспериментов использовали клетки 4-6 пассажей.

Исследование адгезии ГМК к стенкам aopibi свиньи после разрушения или гибели клеток донора, вызванных ферментативной обработкой или инкубацией в среде ДМЕ с дигитонином, показало, что клетки прикрепляются к интиме аорты в течение первых десяти минут, о чем судили по убыли клеток из суспензии над тканью и по данным люминесцентной микроскопии В первые сутки клетки находились, согласно данным, полеченным методами люминесцентной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии, на поверхности ткани (рис.12, 13). Через 2 суток после посева наблюдалась миграция клеток вглубь ткани на глубину до 40 мкм. Люминесцентная микроскопия показала, что в некоторых клетках (2%) наблюдалось распределение хроматина, характерное для метафазы и анафазы, указывающее па митозы мигрировавших в ткань клеток. Через 4 суток, согласно люминесцентной микроскопии, клетки мигрировали на глубину до 120 мкм. Включение 14С-пролина свидетельствовало о синтетической активности клеток, посеянных на ткань. Стенки аорты имплантировали крысам через 4 суток после посева на них гладкомышечных клеток плотностью 5*104 клеток/см2.

Рис.12. Ядра эндотелиальных клеток на интиме стенки аорты свиньи до ферментативной обработки (А), разрушение хроматина клеток после обработки (Б), присутствие ядер гладкомышечных клеток через 1 сут после их посева (В).

Люминесцентная микроскопия, окраска ядерными красителями Hoechst 33342 и этидиум бромидом. Увеличение 800х. Ядра погибших клешк (оранжевая люминесценция) в черно-белом изображении светятся более ярко (рис.1а). поскольк> окрашены обоими красителями. Ядра живых клеток (зеленая люминесценция) в 18

черно-белом изображении светятся более тускло. На рис.1 В светятся остатки хроматина разрушенных клеток.

Рис. 13. Эндотелиальные клеток иа интиме стенки аорты свиньи до ферментативной обработки (А), отсутствие клеток после обработки (Б), присутствие гладкомышечных клеток через 1 сут после их посева (В). Сканирующая электронная микроскопия. Увеличение ЮООх.

Исследование кальциноза показало, что посев изогенных реципиенту ГМК на ксенотрансплантат стенки аорты после гибели клеток донора под действием дигитонина или ферментативной обработки, либо их сочетания приводил к 2-4 кратному снижению кальциноза относительно контроля без клеток (рис.14). Посев изогенных клеток, выделенных из костного мозга крысы линии \^131аг, не вызывал снижение кальциноза. Полученные результаты дают основание полагать, что посев аутологачных реципиенту ГМК также будет способствовать снижению кальциноза.

ДЭДГА.Н Д ДТ.ЭДГА.Н

Рис.14. Уменьшение кальциноза во фрагментах стенки аорты свиньи после 2 месяцев подкожной имплантации крысам линии \Vistar за счет посева на девитализированные фрагменты

стенок аорты гладкомышечных клеток, полученных из крыс этой же линии. Фрагменты ткани перед посевом клеток и имплантацией крысам девитализировали путем инкубации в растворах, содержащих дигитонин (Д), трипсин (Т), ЭДТА и нуклеазы (Н) в различных сочетаниях с последующей отмывкой от повреждающих клетки агентов.

Необходимо отметить, плотность посева ГМК на ткань составляла около 1/100 от количества клеток в нативной ткани, и, тем не менее, это вызвало

значительный эффект. Это дает основание надеяться на то, что разработка способа посева и перфузионного культивирования, обеспечивающего внедрение большего количества ГМК может усилить эффект предотвращения кальциноза.

Таким образом, внедрение in vitro гладкомышечных клеток, родственных реципиенту, в трансплантаты стенок аорты, которые являются одной из составляющих частей трансплантатов аортальных клапанов сердца, достоверно снижало их кальцификацию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Следует отметить, что до настоящего исследования в литературе не обсуждалась ведущая роль митохондрий в инициации кальциноза погибающих клеток в трансплантатах клапанов сердца и сосудов. В то же время, исследования разных авторов показали решающую роль митохондрий в процессе зарождения центров инициации патологической кальцификации различных тканей (почечный эпителий, кардиомиоциты сердца). Поэтому полученные нами данные дополняют представление о роли митохондрий погибающих клеток в инициации кальциноза не только при патологических состояниях тканей в организме, но и в трансплантатах, используемых для сердечно-сосудистой хирургии. Именно ясность гипотезы и представления о механизме позволили впервые разработать способ полного предотвращения кальциноза алло-(ксено)трансплантатов, который в настоящее время внедряется в технологический процесс подготовки аллотрансплантатов клапанов сердца в НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. Проводятся предклинические и начинаются клинические испытания трансплантатов, подготовленных с помощью антикальцинозного способа обработки.

Предотвращение кальциноза трансплантата является необходимым, но недостаточным условием репопуляции и последующего ремоделирования ткани. Создание очагов репопуляции трансплантатов путем посева на них клеток реципиента до имплантации может способствовать ускорению этого процесса. Полученные нами результаты о том, что посев на девитализированные стенки аорты клеток, изо генных реципиенту, перед имплантацией тканей сдерживают их кальциноз, впервые демонстрируют положительный эффект такого подхода. Представленные данные являются научным обоснованием для разработки технологии повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца путем их девитализации и заселения клетками реципиента до имплантации.

выводы.

1. Девитализация тканей трансплантатов клапанов сердца с помощью ферментативной обработки или сочетанием гипотонического шока с нуклеазами не уменьшают их кальциноз.

2. Предложена гипотеза о ключевой роли аккумуляции фосфатов кальция в митохондриях погибающих клеток донора в инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца.

3. Установлено, что кальциевые отложения в трансплантатах стенок аорты человека возникают в митохондриях погибших клеток, но не в других частях клеток или тканевом матриксе. Полученные результаты позволяют рассматривать митохондрии погибших клеток донора как центры зарождения кальциноза трансплантатов клапанов сердца.

4. Разработан способ полного предотвращения кальциноза тканей трансплантатов клапанов сердца путем обеспечения некротической гибели клеток донора в физиологическом растворе с хелаторами кальция до имплантации.

5. Установлено, что посев гладкомышечных клеток, изогенных реципиенту, на девитализированные фрагменты стенки аорты свиньи способствует уменьшению их кальциноза при имплантации крысам. Полученные результаты впервые указывают на возможность предотвращения кальциноза и повышения биосовместимости девитализированных трансплантатов клапанов сердца после их заселения клетками реципиента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Акатов B.C., Соловьев В.В., Рындина Н.И., Муратов P.M., Бритиков Д.В., Костава В.Т., Бокерия Л.А. Кальцификация бесклеточных ксенотрансплантатов клапанов сердца. Вестник трансплангологии и искусственных органов, 2002, № 4,39-42.

2. Рындина Н.И., Соловьев В.В., Акатов B.C. Повышение биосовместимости ксенотрансплантатов клапанов сердца методами тканевой инженерии. Тез. докл. конф. "Биология - наука 21 века", Пущино, 2002, т.1, 135.

3. Акатов B.C., Рындина Н.И., Соловьев В.В., Муратов P.M., Бокерия Л.А. Тканевая инженерия трансплантатов клапанов сердца. Сб. статей

« Горизонты биофизики. От теории к практике», Пущино, 2003,216-220.

4. Акатов B.C., Рындина Н.И., Соловьев В.В., Муратов P.M., Бокерия Л.А. Культура гладкомышечных клеток в тканевой инженерии трансплантатов клапанов сердца. Информационный бюллетень «Клеточные культуры». Вып. 18 / Ассоциация специалистов по клеточным культурам, Институт цитологии РАН, СПб., 2003,27-35.

5. Акатов B.C., Рындина Н.И, Соловьев В.В., Муратов P.M., Костава В.Т., Бритиков Д.В., Бакулева Н.П., Бокерия JI.A. Снижение кальцификации бесклеточных трансплантатов клапанов сердца путем внедрения в них перед имплантацией изогенных гладкомышечных клеток. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2003, №4, 39-44.

6. Д.В. Бритиков, B.C. Акатов, P.M. Муратов, Н.И. Рындина. «Использование клеточных технологий для улучшения качества криосохраненных аллографтов». Медицинские науки, 2004, №1, с.3-9.

7. Акатов B.C., Рындина Н.И., Соловьев В.В., Муратов P.M., Бокерия Л.А. Способ обработки тканей трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии. Патент РФ № 233/997 от 10.07.2004. Бюллетень № 19.

8. Рындина Н.И., Соловьев В.В., Северьянова М.С., Акатов B.C. Подавление кальцификации трансплантатов клапанов сердца. Сб. тезисов 8-й международной путинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века», Пущино, 2004,126-127.

9. N.I. Rindina, V.S. Akatov, M.S.Sevefyanova, V.V.Soloviev. Application of smooth muscle cell seeding for inhibition of calcinosis in heart valve transplants. International symposium "Biological motility", Pushchino, May 2004,151-152.

10.B.C. Акатов, Н.И. Рындина, P.M. Муратов, B.B. Соловьев, Д.В. Бритиков, М.С. Северьянова, В.Т. Костава. Применение культуры гладкомышечных клеток для снижения кальциноза трансплантатов клапанов сердца. Цитология, 2004 г., том 46, № 10, с. 895.

П.Акатов B.C., Муратов P.M., Рындина Н.И., Бритиков Д.В., Соловьев В.В., Северьянова М.С., Бокерия JI.A. Подавление кальциноза аллографтов клапанов сердца. Сб. тезисов III Российского Конгресса по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)», Москва, 2004, с.218.

12. Акатов B.C., Н.И. Рындина, В.В. Соловьев, P.M. Муратов, В.Т. Костава, Д.В. Бритиков, Л.А. Бокерия. Разработка технологии подавления кальциноза в трансплантатах клапанов сердца. Материалы конференции «Фундаментальные науки - медицине». Москва, 2004 г. - М.: Фирма «Слово», 2004., с. 156.

13.Акатов B.C. Муратов P.M. Рындина Н.И. Соловьев В.В. Бритиков Д.В. Костава В.Т. Бокерия Л.А. О возможности повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца путем их девитализации и посева на них клеток сосудов реципиента. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2005, № 3, с. 46.

14.В.С.Акатов, Н.И.Рындина, Р.М.Муратов, И.М.Санталова, В.В.Соловьев, Д.В.Бритиков, Д.А.Мошков, Л.М.Чайлахян, Л.А.Бокерия. Участие митохондрий в инициации кальциноза в трансплантатах клапанов сердца и сосудов. ДАН. 2006. Т.246. №6. с.832-834.

Диссертационная работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 04-04-97284,

Министерства Образования РФ Е02-6.0-265, программы Университеты России

УР.11.01.001 и УР.015.11.01.18, Министерства Образования РФ для аспирантов

АОЗ-2.12-717 и А 04-2.12-1123 и программы «Фундаментальные науки - медицине

(2004).

Принято к исполнению 21/03/2006 Исполнено 22/03/2006

Заказ № 200 Тираж: 75 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900

Г Г» Л -

(495)975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

¿P&6A ¿>A-S J

чг 6 2 11

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рындина, Наталья Ивановна

Список сокращений

Введение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Анатомия и морфология аортального клапана человека

ГЛАВА 2. Типы протезов и трансплантатов, используемых в хирургии пороков клапанов сердца

2.1. Механические протезы клапанов сердца

2.2. Биологические протезы клапанов сердца

2.3. Трансплантаты клапанов сердца

ГЛАВА 3. Кальцификация трансплантатов клапанов сердца

3.1. Общие представления о кальцификации

3.1.1 .Характеристика отложений фосфатов кальция .29 3.1.2.Физико-химические механизмы образования кристаллов гидроксиапатита в растворе

3.2. Общие представления о механизме кальцификации биоматериалов

3.2.1. Концентрационная гипотеза кальцификации биоматериалов.

3.2.2. Клеточная гипотеза кальцификации биоматериалов.

3.3. Кальцификация трансплантатов клапанов сердца

ГЛАВА 4. Использование клеточных технологий для уменьшения кальцификации трансплантатов клапанов сердца

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. ф Материалы и методы исследований к> 1. Материалы

2. Девитализация тканей

3. Модель исследования кальцификации ткани

4. Культуры клеток

5. Иммуноцитохимия

6. Люминесцентная микроскопия

7. Гистология

8. Электронная микроскопия

9. Сканирующая электронная микроскопия

10. Атомная абсорбционная спектроскопия

11.Радиоизотопный метод

12.Статистический анализ

Результаты исследований и их обсуяедение.

1. Оценка адекватности использования модели изучения кальциноза трансплантатов клапанов сердца путем их подкожной имплантации крысам

2. Изучение кальцификации трансплантатов клапанов сердца после их девитализации способами, предлагаемыми в литературе

3. Гипотеза о роли митохондрий в инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов

4. Изучение роли клеток и тканевого матрикса в инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов.

5. Разработка способов предотвращения кальцификации трансплантатов клапанов сердца.

5.1. Изучение кальцификации трансплантатов клапанов сердца после их девитализации агентами, вызывающими апоптотическую гибель клеток.

5.2. Разработка способов полного предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца.

6. Оценка возможности снижения кальцификации трансплантатов клапанов сердца путем заселения их после девитализации клетками реципиента.

Ф 6.1. Изучение адгезии и миграции гладкомышечных клеток крысы в створки и стенки аортального клапана сердца свиньи.

6.2. Изучение кальцификации трансплантатов после внедрения в них гладкомышечных клеток, родственных реципиенту.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка способов его предотвращения"

В кардиохирургии клапанных пороков сердца наряду с механическими клапанами и биопротезами применяются трансплантаты клапанов сердца, которые, в отличие от биопротезов, не подвергаются обработке фиксирующими агентами, такими, как глутаровый альдегид или эпоксисоединения. Преимуществами использования трансплантатов являются отсутствие необходимости применения пациентом долговременной антикоагулянтной терапии, оказывающей повреждающее действие на печень. Это имеет большое значение, поскольку отмечаются случаи гибели пациентов с механическими протезами клапанов сердца из-за нарушения приема пациентами антикоагулянтных средств. Другим преимуществом является возможность ремоделирования трансплантатов путем их репопуляции клетками реципиента перед имплантацией, а также за счет миграции клеток из окружающих тканей после имплантации (Angell et al., 1989). Способность к ремоделированию особенно важна у детей и пациентов молодого возраста, когда необходимо обеспечить не только поддержание и обновление структуры трансплантата, но и его рост. Однако сроки функционирования трансплантатов ограничены из-за их кальцификации. Предлагаются различные гипотезы о механизме инициации кальциноза трансплантатов и биопротезов клапанов сердца. В частности, рассматривается предположение о связи инициации кальциноза с компонентами погибших клеток (мембраны клеток и органоидов, фрагменты ДНК, кальций-связывающие белки - кальсеквестрин, кислые фосфолипиды и др.) (Ferrans et al., 1980; Valente et al., 1985; Розанова и др., 1999). Согласно другому предположению, центры инициации кальциноза связаны с компонентами тканевого матрикса: с коллагеном I типа, фибронектином (Watson et al., 1998), эластином, кальций-связывающими белками (гла-протеины, остеокальцин, остеопонтин, остеонектин), фосфопротеинами (Shanahan et al., 1998; Proudfoot et al., 1998), щелочной фосфатазой (Hui et al., 1998). При гибели клеток в результате ферментативного лизиса может также нарушаться связь гликозаминогликанов с коллагеном в тканевом матриксе, что также может способствовать образованию сайтов, аффинных к фосфатам кальция (Loose et al., 1993). Однако ясного представления о механизме инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов в настоящее время нет.

Для повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца и сосудов предлагается разрушать в них клетки донора до имплантации (девитализация ткани) (О' Brien et al., 1999; Teebken et al., 2000). Предполагается, что девитализация уменьшит иммунную реакцию организма реципиента на трансплантат, поскольку считается, что его иммуногенность определяется в основном клетками (Johnson et al., 1997). В первую очередь это относится к ксенотрансплантатам, однако говорится о повышении биосовместимости и аллографтов. На основе этого подхода уже производятся ксенографты, которые имплантируются больным. Широкое внедрение ксенографтов было бы важным этапом в кардиохирургии, поскольку они являются более дешевыми, доступными и снимают этические проблемы, связанные с использованием трансплантатов клапанов сердца человека. Однако их использование осложнено риском зоонозов. Помимо снижения иммуногенности трансплантатов, предполагается, что в результате лизиса и разрушения клеток донора до имплантации будут элиминированы центры нуклеации кальциноза. Однако неизвестно, в какой степени девитализация трансплантатов клапанов сердца может предотвращать кальциноз, поскольку остается неясным, какую роль играют клетки и их гибель в инициации кальциноза трансплантатов.

Для ускорения ремоделирования и предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов предложено также заселять их после девитализации клетками реципиента: миофибробластами, эндотелиальными, стволовыми клетками (Eberl et al., 1992; Loose et al.,

1993; Curtil et al., 1997; Steinhoff et al., 2000; Акатов и др., 2001; Hoerstrup et al., 2002). При этом подразумевается, что посеянные клетки будут предотвращать кальциноз путем поддержания гомеостаза кальция и фосфатов, рН среды и т.д. Несмотря на достаточно большое количество работ в этом направлении, остается неясно, в какой степени девитализация трансплантатов и последующий посев клеток реципиента могут способствовать ремоделированию ткани и предотвращать кальциноз. Неизвестно, будут ли посеянные клетки мигрировать в ткань и что для этого необходимо.

Цель работы. Целью данной работы являлось изучение механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка на основе полученных представлений способов его предотвращения. Основные задачи исследования.

1. Изучение кальциноза трансплантатов клапанов сердца после их девитализации известными способами.

2. Изучение локализации центров инициации кальциноза в трансплантатах клапанов сердца.

3. Разработка способа предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца.

Научная новизна работы.

Впервые предложена гипотеза о ведущей роли митохондрий в инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Впервые с помощью электронной микроскопии показано, что центрами кальцификации в трансплантатах стенок аорты являются митохондрии.

Впервые показана возможность полного предотвращения кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов путем обеспечения гибели клеток в условиях, препятствующих аккумуляции кальция митохондриями. Впервые показано, что гладкомышечные клетки, изогенные реципиенту, посеянные на девитализированные трансплантаты стенок аорты, снижают их кальциноз. Полученные данные расширяют представление о механизмах нормальной и патологической кальцификации биологических тканей, что актуально не только для проблемы понимания механизма кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов, но и для проблемы патологической минерализации тканей в организме, в частности при атеросклерозе сосудов. Практическая значимость.

На основе проведенных исследований разработан эффективный способ предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Предложенный способ запатентован и внедряется в технологический регламент производства аллотрансплантатов клапанов сердца в НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН, г. Москва. Полученные результаты также являются основой для разработки способа снижения кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов с помощью посева гладкомышечных клеток реципиента на девитализированные трансплантаты клапанов сердца и сосудов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Рындина, Наталья Ивановна

Выводы.

3. Установлено, что кальциевые отложения в трансплантатах стенок аорты человека возникают в митохондриях погибших клеток, но не в других частях клеток или тканевого матрикса. Полученные результаты позволяют рассматривать митохондрии погибших клеток донора как центры зарождения кальциноза трансплантатов клапанов сердца.

5. Установлено, что посев гладкомышечных клеток, изогенных реципиенту, на девитализированные фрагменты стенки аорты свиньи способствует уменьшению их кальциноза при имплантации крысам. Полученные результаты впервые указывают на возможность предотвращения кальциноза и повышения биосовместимости девитализированных трансплантатов клапанов сердца путем их заселения клетками реципиента.

Считаю приятным долгом выразить глубокую благодарность своим научным руководителям д.ф.-м.н. Владимиру Семеновичу Акатову, д.м.н. Равилю Муратовичу Муратову, а также к.б.н. Валерию Владимировичу Соловьеву за постоянное внимание к работе, ценные указания и активное содействие в проведении исследований. Автор выражает признательность сотрудникам НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева к.б.н. Вахтангу Тенгизовичу Коставе, к.б.н. Наталье Петровне Бакулевой, д.м.н. Дмитрию Вячеславовичу Бритикову, сотрудникам лабораторий ИТЭБ РАН к.б.н. Наталье Юрьевне Сахаровой, к.б.н. Ирине Михайловне Санталовой, д.б.н. Дмитрию Алексеевичу Мошкову, д.б.н. Александру Григорьевичу Погорелову, сотруднику лаборатории механизмов рецепции ИБК РАН Вадиму Валерьевичу Рогачевскому за помощь в проведении исследований, а также всем сотрудникам группы тканевой инженерии и лаборатории цитотехнологии ИТЭБ РАН за создание благоприятного климата для работы и за помощь при проведении экспериментов.

Заключение

Следует отметить, что до настоящего исследования в литературе не обсуждалась ведущая роль митохондрий в инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов. В то же время, исследования разных авторов показали решающую роль митохондрий в процессе зарождения центров инициации кальцификации в различных тканях (Caulfield, Schrag, 1964; Borle, 1973; Ferrans et al., 1980; Trump, Berezesky, 1984; Crescenzo et al., 1993; Trump, Berezesky, 1995). Поэтому полученные нами данные дополняют представление о роли митохондрий погибающих клеток в инициации кальциноза не только при патологических состояниях тканей в организме, но и в трансплантатах, используемых для сердечнососудистой хирургии. Именно ясность представления о механизме инициации кальциноза позволила впервые разработать способ полного предотвращения кальциноза алло(ксено-)трансплантатов, который в настоящее время внедряется в технологический процесс подготовки аллографтов клапанов сердца в НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. В НЦ ССХ проводятся клинические испытания аллографтов, подготовленных с помощью представленной в диссертации антикальцинозной обработки, включающей инкубацию в ФР (рН 6.0) с ЭДТА и дигитонином. В 2005 г было осуществлено около 40 имплантаций аллографтов клапанов сердца с использованием данной обработки.

Предложенный способ антикальцинозной обработки аллотрансплантатов клапанов сердца, очевидно, может быть использован и для трансплантатов сосудов.

Разработанный способ открывает новые перспективы для использования ксенотрансплантатов клапанов сердца и сосудов, поскольку после гибели в них клеток донора снижается не только иммуногенность имплантируемых тканей, но и предотвращается их кальциноз. Для реального внедрения ксенотрансплантатов необходимо устранить риск зоонозов и для этого в настоящее время уже ведется поиск подходов. Использование для сердечно-сосудистой хирургии ксеноматериалов позволит снизить стоимость трансплантатов, сделать их более доступными и снять этические проблемы, связанные с забором аллотрансплантатов.

Предотвращение кальциноза трансплантатов является необходимым, но недостаточным условием репопуляции и последующего ремоделирования ткани. Создание очагов репопуляции трансплантатов путем посева на них до имплантации клеток реципиента может способствовать ускорению этого процесса. Полученные нами результаты о том, что посев перед имплантацией на девитализированные стенки аорты клеток, изогенных реципиенту, снижает кальциноз тканей, впервые показал положительный эффект такого подхода. Необходимо отметить, что на этом пути возникает ряд сложных задач и вопросов. Несмотря на то, что, согласно нашим данным, наблюдается миграция клеток с поверхности интимы аорты в медию, остается открытым вопрос о том, почему это происходит. Что может заставить клетки двигаться внутрь тканевого матрикса сосудов, створок клапана, в каком масштабе возможна такая миграция, можно ли добиться репопуляции ткани до уровня нативной, какие ростовые факторы, цитокины могут быть аттрактантами для их миграции? Такие вопросы являются чрезвычайно актуальными для разработки способов репопуляции трансплантатов в сердечно-сосудистой хирургии, особенно для детей раннего возраста, поскольку это позволило бы получить трансплантаты, способные к росту в организме пациента. Представленные данные являются научным обоснованием для разработки технологии повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца путем их девитализации и заселения клетками реципиента до имплантации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рындина, Наталья Ивановна, Пущино

1. Акатов B.C., Муратов P.M., Скопин И.И., Бритиков Д.В., Костава В.Т., Бокерия JT.A. Следующий шаг в тканевой инженерии аллографта: оценка возможности заселения клетками стенки аорты. 7 Всероссийский Съезд сердечно-сосудистых хирургов. М., 2001. С.67.

2. Акатов B.C., Рындина Н.И., Соловьев В.В., Муратов P.M., Бокерия JI.A. Тканевая инженерия трансплантатов клапанов сердца. Сб. статей «Горизонты биофизики. От теории к практике», Пущино, 2003, 216-220.

3. Акатов B.C., Рябоконь Е.Н., Муратов P.M., Скопин И.И., Лежнев Э.И. Изучение миграции фибробластов в ткань створок клапанов сердца in vitro. Цитология. 2000. т.42. № 1, С. 57-62.

4. Барбараш JI.C. Биологические протезы артерий. Кемерово. Кемеровский полиграфкомбинат, 1996. 208 с.

5. Бритиков Д.В. Оптимизация технологии изготовления криосохраненных аллографтов и первый опыт их клинического применения. Дисс. канд. мед. наук. М. 1999.

6. Везер В. Фосфор и его соединения. М., Иностранная литература, 1962.

7. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. 2-е изд. М.: Медицина, 1982, 304 с. ил.

8. Елисеев В.Г. Соединительная ткань. М.: Медгиз. 1961.

9. Зайцев В.В. Способы профилактики кальциноза биопротезов клапанов сердца. Дисс. канд. мед. наук. М.- 1988.

10. Иванова О.В. Анатомия человека. Большой иллюстрированный справочник. Пер. с франц. М.: Мир книги, 2003. - С. 81 - 84.

11. Касавина Б.С., Торбенко В.П. Жизнь костной ткани. М., «Наука», 1972, с. 59 62.

12. Кобеко П.П. Аморфное состояние. Д.- М.: Гостехиздат. 1933. 88 с. с черт.

13. Константинов Б.А., Дземешкевич C.JL Протезирование клапанов сердца. В кн.: Большая медицинская энциклопедия: В 30-ти т./ АМН СССР. Гл. ред. Б.В. Петровский. 3-е изд. М.: Сов. энцикл. т. 21, 1983, XXI, 560 с. с ил., 11 л. ил. с. 177-180.

14. Круглый М. М., Ярцев Ю.А. Аорта (морфолого-физиологические и клинико-экспериментальные исследования). Изд-во Сарат. ун-та, 1981, с. 71-72.

15. Ленинджер А. Митохондрия. Молекулярные основы структуры и функции. М., Мир, 1966.

16. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: «Мир», 1969. 624 с.

17. Мейер К. Физико-химическая кристаллография. Пер. с нем. О.П. Никитиной. Под ред. Е.Д.Щукина и Б.Д.Сумма. М.: «Металлургия». 1972. 480 с. с ил.

18. Мищенко Б. П. Кальциноз биоклапанов сердца: биохимические и метаболические факторы развития и пути профилактики. Дисс. на соиск. уч. док. биол. наук. М., 1995.

19. Пирс Э. Гистохимия. М.: Изд. ин. лит-ры, 1962. 929 с.

20. Прохончуков А.А., Жижина Н.А., Тигранян Р.А. Гомеостаз костной ткани в норме и при экстремальном воздействии. М.: Наука. 1984. с. 18 -35. Проблемы космической биологии, т. 49.

21. Родионова Н.В. Функциональная морфология клеток в остеогенезе. Киев: Наук. Думка. 1989, стр. 65 66.

22. Розанова И.Б., Васин C.JI. Кальцификация имплантатов. В кн. Биосовместимость. Под ред. В.И. Севастьянова. М., 1999. С. 246 294.

23. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. М.: Гос.изд. «Сов. наука», 1946.

24. Собовый В. Анатомия человека. М.: ООО «Издательство Астрель»: ООО «Издательство ACT». 2002. С. 88-89.

25. Соловьева М.Е., Акатов B.C., Лещенко В.В., Кудрявцев А.А. Механизм гибели клеток миеломы NS/0 в культуре. Известия Академии Наук, 1998, N2, с. 194-199.

26. Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций. Соровский образовательный журнал, т.7, №1, 2001, с. 10-15.

27. Торбенко В.П., Б.С. Касавина. Функциональная биохимия костной ткани. М., «Медицина», 1977, 272 е., ил.

28. Фурсов Б.А., Мищенко Б.П., Зайцев В.В., Быкова В.А. Биопротезы клапанов сердца «Бионике», 6-летний опыт замещения митрального клапана. Грудная сердечно-сосудистая хирургия, 1991, 10. 11-16.

29. Хамский Е.В. и др. Кристаллизация и физико-химические свойства кристаллических веществ. Изд-во «Наука», Ленинградское отделение. Ленинград. 1969.

30. Хамский Е.В. Некоторые проблемы кристаллизации из растворов. В кн.: Кристаллизация и свойства кристаллических веществ. Изд-во «Наука», Ленинградское отделение. Ленинград. 1971. с.3-17.

31. Хант С. Выделение лимфоцитов и вспомогательных клеток. В кн.: Лимфоциты. Методы. Под ред. Дж. Клауса. М.: Мир, 1990. с. 29 45.

32. Хэм А., Кормак Д. Гистология: Пер. с англ. М.: Мир, 1983 (а). Т. 3. с. 48 -53.

33. Хэм А., Кормак Д. Гистология: Пер. с англ. М.: Мир, 1983 (б). Т. 4. с. 6 -46.

34. Шумаков В.И. Трансплантация органов и тканей. В кн.: Большая медицинская энциклопедия: В 30-ти т./ АМН СССР. Гл. ред. Б.В. Петровский. 3-е изд. М.: Сов. энцикл. т. 25, 1985, XXV, 544 с. с ил., 8 л. ил. с. 212-213.

35. Эльгудин Я.Л. Ксеноаортальные биопротезы в хирургии клапанных пороков сердца. Дисс. доктора мед. наук. М. 1995.

36. Akatov V.S, Muratov R.M.,.Ryabokon' E.N, Chekanov A.V., Scopin 1.1. Tissue engineering of heart valve allografts. In Abstr. International Symposium "Biological motility: new trends in research". Pushchino, 2001.P.5-6.

37. Angell WW, Angell JD, Oury JH, Lamberti JJ, Grehl TM. Long-term follow-up of viable frozen aortic homografts. A viable homograft valve bank. J Thorac Cardiovasc Surg. 1987 Jun;93(6):815-22.

38. Angell W.W., Oury J.H., Lamberti J.J., et al. Durability of the viable aortic allograft. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1989; 98:48-56.

39. Bader A., Schilling Т., Teebken O.E. Tissue engineering of heart valves: human endothelial cell seeding of detergent acellularized porcine valves. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 1998;14:279-284.

40. Barratt-Boyes R.G., Roche M.B., Subramanyan R., Pemberton J.R.,

41. Whitlock R.M. Long-term follow-up of patients with the antibiotic-sterilized aortic homograft valve inserted freehand in the aortic position. Circulation. 1987. 75:768-777.

42. Bernardi P., Vassanelli S., Veronese P., Colonna R., Szabo I., and Zoratti M. Modulation of the mitochondrial permeability transition pore: effect of protons and divalent cations. J.Biol.Chem. 1992 267, 2934-2939.

43. Borle A.B. Calcium metabolism at the cellular level. Federation Proceedings. September 1973, vol. 32, no.9, 1944-1950.

44. Bostrom K. Insights into the mechanism of vascular calcification. Am. J. Cardiol. 2001; 88(suppl):20E-22E.

45. Carafoli E., Crompton M. Calcium ions and mitochondria. Symp. Soc. Exp. Biol. 1976.30:89-115.

46. Caulfield J.B., Schrag P.E. Electron microscopy study of renal calcification. Am. J. Pathol. 1964, 44, 365-381.

47. Cochran RP, Kunzelman KS. Cryopreservation does not alter antigenic • expression of aortic allografts. 1989. J. Surg. Res. 46:597-599.

48. Crescenzo D.G., Hilbert S.L., Messier R.H., Domkowski M.S., Barrick M.K., Lange P.L., Ferrans V.J., Wallace R.B., Hopkins R.A. Human cryopreserved homografts: electron microscopic analysis of cellular injury. Ann Thorac Surg. 1993;55:25-31.

49. Curtil A., Peg D.E., Wilson A. Freeze drying of cardiac valves in preparation for cellular repopulation. Cryobiology. 1997. 34, 13-22.t

50. Dahm M., Prufer D., Mayer E., Hafner G., Groh E., Oelert H. Effects of surface seeding with vital cells on the calcium uptake of biological materials for heart valve replacement. J. Heart Valve Dis. 1996. Vol.5.№ 2. 148 151.

51. Deck J.D. Histology and cytology of the aortic valve. In: The aortic valve. Ed. M. Thubrikar.N.-Y.: CRC Press. 1986, pp. 21-38.

52. Demer L. Vascular calcification and osteoporosis: inflammatory responses to oxidized lipids. Int. J. Epidemiology. 2002. 31: 737 741.

53. Eanes E.D., Gillessen I.H. and Posner A.S. Intermediate states in the precipitation of hydroxyapatite, Nature, 1965, 208, 365-367.

54. Eanes E.D., and Posner A.S. Structure and chemistry of bone mineral. In: Biological Calcification: Cellular and Molecular Aspects. Ed. by H. Schraer. New York: Appleton-Century-Crofts, 1970, p. 1-26.

55. Eanes E.D. and Termine J.D. Calcium in mineralized tissues. Metal ions in biology. Edited by Spiro T.G. Vol.6. Calcium in biology. N.York. "A Wiley-Interscience publication". 1983.- 201-233.

56. Eberl Т., Siedler S., Schumacher В., Zilla P., Schlaudraff K., Fasol R. Experimental in vitro endothelialization of cardiac valve leaflets. Ann. Thorac. Surg. 1992. Mar;53(3):487-92.

57. Elkins R.C., Dawson P.E., Goldstein S., Walsh S.P., Black K.S. Decellularized human valve allografts. Ann. Thorac. Surg. 2001. 71 (5 Suppl). -P. S428-432.

58. Ferrans V.J., Boyce S.W., Billingham M.E., Jones M., Ishihara Т., Roberts W.C. Calcific deposits in porcine bioprostheses: structure and pathogenesis. The Am. J. Cardiology. 1980 Nov. 46 (5): 721- 734.

59. Fujiwara Т., Коп K. Endothelial Cells Transformed from Fibroblasts During Angiogenesis In "Tissue Engineering of Vascular Prosthetic Grafts", edited by P. Zilla and H. P. Greisler, 2001 (www.eurekah.com)

60. Gerald L. Becker. Regulation of free Ca by liver mitochondria and endoplasmic reticulum. The journal of biological chemistry. 1980. Vol. 255, No. 19, Issue of October 10, pp. 9009-9012

61. Gilinskaya L.G., Grigorieva T.N., Okuneva G.N. and Vlasov Yu.A. Investigation of pathogenic mineralization on human heart valves. 1. Chemical and phase composition. J. Structural Chemistry. 2003. Vol. 44, No. 4, pp. 622631.

62. Goldstein S., Clarke D.R., Walsh S.P., Black K.S., O'Brien M.F. Transpecies heart valve transplant: advanced studies of a bioengineered xeno-autograft. Ann. Thorac. Surg. 2000. 70. P. 1962-1969.

63. Gonzales-Lavin L., Bianchi J., Graf D., Amini S, Gordon CI. Degenerative changes in fresh aortic root homografts in a canine model: evidence of an immunologic influence. Transplant Proc. 20 (Suppl 1): 815-819.

64. Gonzalez-Lavin L., Spotnitz A.J., Mackenzie J.W., Gu J., Gadi I.K., Gullo J., Boyd C., and Graf D. Homograft valve durability: host or donor influence? Heart Vessels. 1990, 5:102-106.

65. Hancox N.M. Biology of bone. London. Cambridge University Press. 1972. 82-92.

66. Hancock W.D., Fogarty T.J. Preparing natural tissue for implantation so as to provide improved flexibility. U.S. patent № 3966401.1976. June.29.

67. Hanzlikova V., and Schiaffino S. Mitochondrial changes in ischemic skeletal muscle. J. Ultrastruct. Res. 1977. 60:121-133.

68. Harasaki H., McMahon J.T., and Nose Y. Pathogenesis of valve calcification comparison of three tissue valves. Calcium in biological systems. Ed. Rubin R.P., Weiss G.B. and Putney J.W. N. York: Plenum press, 1985. C. 669-675.

69. Hilbert SL, Ferrans VJ. Porcine aortic valve bioprostheses: morphologic -and functional considerations. J Long Term Eff Med Implants. 1992; 2(2-3): 99-112. Review.

70. Hilbert SL, Luna RE, Zhang J, Wang Y, Hopkins RA, Yu Z et al: Allograft heart valves: the role of apoptosis-mediated cell loss. J Thorac Cardiovasc Surg. 1999;117:454-62.

71. Hsu H.H.T., Tawfik O., Sun F. Mechanisms of calcification by vesicles isolated from atherosclerotic rabbit aortas. Biochimica et biophysica Acta. 2002. 1563. 18-22.

72. Hui M., Tenenbaum H.C. New Face of an old enzyme: alkaline phosphatase may contribute to human tissue aging by inducing tissue hardening and calcification. Anat. Rec. (New Anat.). 1998. 253:91 94.

73. Hultgren H. N. Calcific disease of the aortic valve. Arch. Path., 1948, vol. 45, p.694.

74. Humphrey C.D. and Pittman F.E. Methylene blue-azure II and basic fucsin. Stein. Techno. 1974. 42:9-14.

75. Jamieson W.R.E. Stented porcine bioprostheses- durability and outcomes. 1975-1993. In: Pivnica A., Westaby S. (ed). Stentless bioprostheses. ISIS Medical Media, Oxford, 1995. pp. 24-35.

76. Jockenhoevel S., Chalabi K., Sachweh J.S., Groesdonk H.V., Demircan L., Grossmann M., Zund G., Messmer B.J. Tissue engineering: completeautologous valve conduit—a new moulding technique. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2001. 0ct.;49(5):287-90.

77. Johnson D.L. Rose M.L., and Yacoub M.H. Immunogenicity of human heart valve endothelial cells and fibroblasts. Transplantation proceedings. 1997. 29, 984-985.

78. Kerr D.N.S. Hypercalcemia and metastatic calcification. Cardiovasc. Res. 1997.36.293 -297.

79. Kim K.M. Cellular mechanism of calcification and its prevention in glutaraldehyde treated vascular tissue. Z. Kardiol. 2001. 90: Suppl 3, 111/99 -III/105.

80. Koen W R. Circulating Stem Cells: A Fourth Source for the Endothelialization of Cardiovascular Implants. In "Tissue Engineering of Vascular Prosthetic Grafts", edited by P. Zilla and H. P. Greisler, 2001 (www.eurekah.com)

81. Коп K, Fujiwara T. Transformation of fibroblasts into endothelial cells during angiogenesis. Cell Tissue Res. 1994; 278:625-628

82. Koolbergen DR, Hazekamp MG, Kurvers M, de Heer E, Cornelisse CJ, Huysmans HA, Bruijn JA : Tissue chimerism in human cryopreserved homograft valve explants demonstrated demonstrated by hybridization. Ann Thorac Surg 1998. 66:S225-232,

83. Koolbergen D.R., Hazekamp M.G., E. de Heer, et al. The pathology of fresh and cryopreserved homograft heart valves: An analysis of forty explanted homograft valves. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2002;124:689-697.

84. Mavrilas D., Apostolaki A., Kapolos J., Koutsoukos P.G., Melachrinou M., Zolota V., Dougenis D. Development of bioprosthetic heart valve calcification in vitro and in animal models: morphology and composition. J. Crystal Growth. 1999. 205.554-562.

85. Maxwell L., Gavin J.B. and Barratt-Boyes B.G. Differences between heart valve allografts and xenografts in the incidence and initiation of dystrophic calcification. Pathology. 1989, 21.5-10.

86. Mirzaie M., Meyert Т., Schorn В., Schwartz P., Baryalei M., Rastan A., Lotfi S. and Dalichau H. Calcification tendency of various biological aortic valves in an experimental animal model. Cardivasc. Surgery. 1999. Vol. 7, №7, pp. 735-741.

87. Mitchell R.N., Jones R.A., Schoen F.J. Structure-function correlation in cryopreserved allograft cardiac valves. Ann. Thorac. Surg. 1995. 60. P.S108-113.

88. Mohler E.R. Mechanisms of aortic valve calcification. The Am. J. Cardiology. 2004. Vol.94. December 1.

89. O' Brien M.F., Stafford E.G., Gardner M.A.H.,et al. The viable cryopreserved allograft aortic valve.//J. Cardiac. Surg. 1987(a); 2(suppl):153-67.

90. O'Brien M. F., Stafford E.G., Gardner M.A.H., Pohlner P.G., McGiffin D.C. A comparison of aortic valve replacement with viable cryopreserved and fresh allograft valves, with a note on chromosomal studies. J.Thorac. Cardiovasc. Surg. 1987; 94:812-23.

91. Olson N.E., Chao S., Lindner V., and Reidy M.A. Intimal smooth muscle cell proliferation after balloon catheter injury. American Journal of Pathology. May 1992. Vol. 140, No. 5, 1017-1023.

92. Orrenius S., McConkey D.J., Bellomo G. and Nicotera P. Role of Ca2+ in toxic cell killing. TiPS. July 1989 Vol.10. 281-285.

93. Plissonier D, Henaff M, Poncet P, Paris E, Tron F, Thuillez C. Involvement of antibody-dependent apoptosis in graft rejection. Transplantation. 2000;69:2601-08.

94. Rashtian M.Y., Stevenson D.M., Allen D.T., Yoganathan A.P., Harrison E.C., Edmiston W.A., Rahimtoola S.H. Flow characteristic of bioprosthetic heart valves. Chest. 1990. 98. pp.365-375.

95. Robbins R.C., Frederick O.B., Malm J.R. Cardiac valve replacement in children: a twenty-year series. The Annals of Thoracic Surgery. Jan. 1988. №1. Vol.45.

96. Sands M.P., Rittenhouse EA, Mohri H, Merendino KA. An anatomical comparison of human, pig, calf and sheep aortic valves.- Ann Thorac Surg.-1969,- 8.- p.807.

97. Schmidt С. E., Baier J. M. Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering. Biomaterials, 2000. Vol. 21, pp. 2215 -2231.

98. Schraer R., Elder J.A. and Schraer H. Aspects of mitochondrial function in calcium movement and calcification. Federation proceedings. September 1973. Vol.32. No.9, 1938-1943.

99. Shanahan C.M., Proudfoot D., Farzaneh-Far A., and Weissberg P.L. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 1998. 8(3&4): 357 375.

100. Shinoka Т., Breuer C.K., Tanel R.E., Zund G., Miura Т., Ma P.X., Langer R., Vacanti J.P., Mayer J.E.Jr. Tissue engineering heart valves: valve leaflet replacement study in a lamb model. Ann. Thorac. Surg. 1995. Dec;60(6 Suppl):S513-6.

101. Skalli O., Ropzaz P., Trzeciak A., Benzonana G., Gillessen D., Gabbiani G. A Monoklonal Antibody against a-smooth Muscle Actin: A New Probe for Smooth Muscle Differentiation. J Cell Biol., 1986, V. 103, p. 2787 2796.

102. Stock U.A., Vacanti J.P., Mayer J.E., Wahlers T. Tissue engineering of heart valves current aspects. Thorac. Cardiov. Surg. 2002; 50: 184- 193.

103. Teebken O.E., Bader A., Steinhoff G. and Haverich A. Tissue Engineering of Vascular Grafts: Human Cell Seeding of Decellularised Porcine Matrix. Eur J Vase Endovasc Surg, 2000. Vol. 19, pp. 381 386.

104. Termine J.D. and Posner A.S. Infra-red determination of the percentage of crystallinity in apatitic calcium phosphates. Nature. July 16, 1966. Vol.211. 268 -270.

105. Thubrikar M.J., Deck J.D., Aouad J., Nolan S.P. Role of mechanical stress in calcification of aortic bioprosthetic valves. J Thorac Cardiovasc Surg. 1983. 86. pp.115-125.

106. Tomazic В. В. Physicochemical principles of cardiovascular calcification. Z Kardiol. 2001. 90: Suppl 3,111/68 -111/80.

107. Tomazic В. В., Brown W.E., Queral L.A. and Sadovnik M. Physicochemical characterization of cardiovascular calcified deposits. Atherosclerosis. 1988. 69, 5-19.

108. Tomazic B.B., Edwards W.D., Schoen F.J. Physicochemical characterization of natural and bioprosthetic heart valve calcific deposits. Implication for prevention. Abstracts of VI International Symposium Cardiac Bioprostheses, Barselona, Spain. 1994, 124.

109. Trump B.F. and Berezesky I.K. Calcium-mediated cell injury and cell death. FASEB J. 1995,9,219-228.

110. Trump B.F. and Berezesky I.K. Role of sodium and calcium regulation in toxic cell injury. Drug Metabolism and Drug Toxicity. Ed. by J. R. Mitchell and M.G. Horning. Raven Press. New York. 1984.

111. Trump B.F., Goldblatt P.J., and Stowell R.E. An electron microscopic study of early cytoplasmic alterations in hepatic parenchymal cells of mouse liver during necrosis in vitro (autolysis). Lab. Invest. 1962, 11, 986-1015.

112. Tung M.S. and Brown W.E. An intermediate state in hydrolysis of amorphous calcium phosphate. Calcif. Tissue Int. 1983. 35: 783 790.

113. Valente M., Bortolotti U., Thiene G. Ultrastructural substrates of dystrophic calcification in porcine bioprosthetic valve failure. Am. J. Pathol. 1985, 119: 12 -21.

114. Valente M., Faggian G., Billingham M., Talenti E., Calabrese F., Casula R., Shumway N.E., Thiene G. The aortic valve after heart transplantation. Ann. Thorac. Surg. 1995. 60:S135 40.

115. Van Der Kamp AWM, Visser WJ, Dongen JM, Nauta J, Galjaard H : Preservation of aortic heart valves with maintenance of cell viability. J Surg Res 30:47-56, 1981

116. Vasin S.L., Rosanova I.B., Sevastianov V.I. The role of proteins in the nucleation and formation of calcium-containing deposits on biomaterials surface. J. Biomed. Mater. Res., 1998, 39, 491-498.

117. Vesely I, Boughner D, Song T. Tissue buckling as a mechanism of bioprosthetic valve failure. Ann Thorac Surg. 1988. 46. 302-308. .

118. Watson K.E., Parhami F., Shin V., Demer L.L. Fibronectin and collagen I matrixes promote calcification of vascular cells in vitro, whereas collagen IV matrix is inhibitory. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1998; 18: 1964-1971.

119. Wheatley D.J. and McGregor C.G.A. Post implantation viability in canine allograft heart valves. Cardiovasc. Res. 1977, 11, 78-85.

120. Wright J.E.C. Elasticity of human aortic valve cusps. Cardiovasc Res. 1974.8. p.384.

121. Ye Q, Zund G, Benedikt P, Jockenhoevel S, Hoerstrup SP, Sakyama S, Hubbell JA, Turina M. Fibrin gel as a three dimensional matrix in cardiovascular tissue engineering. Eur J Cardiothorac Surg 2000 (a). May; 17(5):5 87-91

122. Zoratti M. and Szabo I. The mitochondrial permeability transition. Biochim.Biophys.Acta. 1995, 1241, 139-176.

123. Zund G., Breuer C.K., Shinoka Т., Ma P.X., Langer R., Mayer J.E., Vacanti J.P. The in vitro construction of a tissue engineered bioprosthetic heart valve. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 1997. Mar;l l(3):493-7.

Информация о работе

Рындина, Наталья Ивановна
кандидата биологических наук
Пущино, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка способов его предотвращения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы