Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка роли ионогенных групп ксеноперикардиального трансплантата в связывании Ca2+ после обработки глутаровым альдегидом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Оценка роли ионогенных групп ксеноперикардиального трансплантата в связывании Ca2+ после обработки глутаровым альдегидом"

Р Г Б ОД

■) |-:;чи На правах рукописи

(ш С » ; I V » I (и^.'-..'

БОЕВ

Константин Васильевич

ОЦЕНКА РОЖ ИОНОГЕННЫХ ГРУПП КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНОГО ТРАНСПЛАНТАТА В СВЯЗЫВАНИИ Са** ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 1995

Работа выполнена в Воронежской Государственной медицинской академии им. Н.Н.Бурденко

Научный руководитель -

доктор медицинских наук, профессор Алабовский В.В.

Консультант

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Булынин В.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Гусев Н.Б.

кандидат медицинских наук, доцент Шмелев В.П.

Ведущая организация: Российский Государственный медицинский

Университет

Защита диссертации состоится £> июля 1995 года в час. на заседании Диссертационного Совета К 063. 48. 14 при Воронежском государственном университете по адресу: 394693, г.Воронеж, Университетская площадь, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан "С " июня 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических' наук,

доцент ■/^р' / Ковалева Т.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

В настоящее время в практике кардиохирургии применяют материалы животного происхождения- ксеногрансплантаты. Они служат материалом для изготовления протезов клапанов сердца. Несмотря на преиущества клапалов данного типа перед механическими, биоматериал имеет один существенный недостаток- через 5-6 лет после операции наблюдается нарушение функций биопротеза вследствие накопления в биоткани солей кальция /Д.Ф.Вильяме и Р.Рауф, 1977; В.В.Зайцев, .1988; Р.Л.ЗсЬоеп е1 а1, 1985/. Данное обстоятельство сдерживает широкое применение ксеноткани, поскольку не известны молекулярные механизмы ее кальцификации, отсутствуют надежные способы предупреждения этого процесса.

Одной из причин повышенной способности ткачи накапливать соли кальция является ее химическая обработка глутаровым альдегидом (ГА). Этот прием необходим для подавления иммунологической активности биоткани и увеличения ее прочности. Обработка указанным агентом является обязательным этапом изготовления и стерилизации ксенотрансплантатов /В.В.Зайцев, 1988; Б.А.Фурсов, 1982/.

В доступной нам литературе мы не нашли ответа на вопрос о причине усиления Са -связывающей способности биоткани после ее обработки ГА. Неизвестны также способы или рекомендации, снижающие у обработанной ГА ткани способность связывать ионы кальция и накапливать его нерастворимые соли фосфатов. Известно, что ионы кальция способны взаимодействовать с заряженными группами органических компонентов соединительной ткани. Такими компонентами могут быть неколлагеновые белки и липиды. Однако остается неизвестной возможность подобного взаимодействия в ксеноперикардиальном трансплантате. Неясно, какие именно функциональные группы могут принимать участие в данном взаимодействии.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось выяснение биохимических основ повышения сродства ксеноперикардиальных трансплантатов, используемых в кардиохирургии, к ионам кальция после обработки глутаровым альдегидом.

Задачи исследования:

1. Изучить Са2*'-связывающую способность ксеноперикардиального трансплантата при его обработке глутаровым альдегидом в разных

концентрациях.

2. Выяснить роль ионогенных групп биополимеров перикарда в процессе связывания ионов кальция.

3. Оценить значение неколлагеновых белков перикарда в процес се связывания ионов кальция.

4.- Выяснить роль липидного компонента поверхности перикарда е связывании тканью глутарового альдегида и Са -связывающей способности ксеноперикардиального трансплантата.

5. Обосновать более оптимальные по сравнению с существующими, методические приемы обработки ксенотрансплантата с целью замедления процесса его каяьцификации.

Научная новизна.

Работа отражает один из этапов работы, проводившейся в клинике госпитальной хирургии ВГМА под руководством профессора В.И.Булынина по программе Государственного комитета по науке и технике Совета Министров СССР по решению научно-технической проблемы 0.61.01, темы 06.04.03 - "Разработка и внедрение в клиническую практику новых образцов биологических клапанов для хирургического лечения пороков сердца". Впервые показано, что ГА не только связывает ¿-аминогруппы соединительной ткани, но и увеличивает количество реакционно-способных карбоксильных групп аспарта-та, глутамата и сульфгидрильных групп цистеина белкового компонента перикарда. Увеличение количества реакционных групп, способных связывать С*, происходит вследствие изменения нативной кон-формации молекул неколлагеновых белков перикарда. Установлено,что увеличение количества доступных титрованию карбоксильных и сульфгидрильных групп резко повышает способность ксеноперикардиального трансплантата к связыванию Са и увеличивает в нем количество кальция при подкожной имплантации. Протеолиз неколлагеновых белков с помощью фермента папаина уменьшает количество доступных титрованию сульфгидрильных групп остатков цистеина. Обработка перикарда неионогенным детергентом тритоном Х-100 снижает количество карбоксильных групп. В обоих случаях происходит значительное уменьшение Са -связывающей способности трансплантата. Последовательная обработка нативной ткани указанными агентами перед дублением ГА понижает содержание реакционно-способных функциональных групп белкоБ, взаимодействующих с ионами кальция и еще больше снижает Са" - связывающую способность перикарда по сравнению с

тканью, обработанной только ГА, а также полностью предотвращает накопление кальция в образцах при подкожной имплантации.

Практическая значимость.

Полученные данные расширяют представления о механизме взаимодействия ГА с соединительно-тканными образованиями, раскрывают причины повышенной Са -связывающей способности и кальцификации ксенотрансплантатов в результате обработки перикарда ГА. Эксперименты с использованием фермента папаина и детергента ■ тритона Х-100 позволили выявить роль карбоксильных и сульфгидрильных групп биополимеров перикарда в связывании ионов Са^ . Выяснение роли указанных групп в процессе' минерализации дает возможность вести более целенаправленный поиск мер предотвращения кальцификации ксеноперикардиадьных трансплантатов. Определение количества доступных титрованию карбоксильных групп аспартата, глутамата и сульфгидрильных групп цистеина образцов перикарда методом кислотно-основного титрования позволило предложить данную методику для экспресс-оценки резистентности ксенотрансплантатов к связыванию ионов кальция (заявка на патент N95104081 от 20.03.95 г., акт внедрения от 10 октября 1994 г.). Результаты проведенных исследований позволили усовершенствовать методику обработки перикарда ГА (акт внедрения от 15 марта 1993 г.). Полученные таким образом ксеноперикардиальные трансплантаты внедрены в практику Воронежского межобластного кардиохирургического Центра, где применяются для хирургического лечения врожденных пороков сердца (авторское свидетельство N1792677, 1992 г., два акта внедрения от 12 апреля 1993 г.). Результаты исследования используются в научно-педагогическом процессе на кафедрах биохимии и госпитальной хирургии ВГМА. По материалам диссертации получено 2 удостоверения на рационализаторские предложения.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на: Первом Всесоюзном съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 1990 ); на Всесоюзном симпозиуме "Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия" (Суздаль, 1991 ); на VIII Областной конференции "Молодые ученые-меди-цинской науке" (Воронеж, 1992); на Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Обработка перикарда глутаровым альдегидом увеличивает количество доступных титрованию карбоксильных групп аспартата, глу-тамата и сульфгидрильных групп цистеина.что сопровождается повышением Саг' -связывающей способности ксеноперикардиального трансплантата.

2. Карбоксильные группы остатков дикарбоновых аминокислот и сульфгидрильные группы остатков цистеина неколлагеновых белков перикарда принимают непосредственное участие в связывании Са'и кальцификации ксеноперикардиального трансплантата.

3. Предварительная обработка перикарда папаином или тритоном Х-100 уменьшает количество карбоксильных и сульфгидрильных групп, определяющих Са -связывающую способность и снижает интенсивность процесса кальцификации ксенотрансплантата.

4. Наилучший эффект ингибироЕания Са"-связывающей способности ксенотрансплантата наблюдается при последовательной предварительной обработке нативной ткани папаином и тритоном Х-100.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 12 рисунков. Состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. Список литературы содержит 200 работ, из них 94 отечественных и 106 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В главе представлен обзор основных работ, дающих представление о роли компонентов соединительной ткани и ионогенных групп биополимеров в связывании ионов кальция и процессе кальцификации. Приведены современные концепции,касающиеся механизмов кальцификации ксенотрансплантатов, обработанных глутаровым альдегидом.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В экспериментах использовался перикард 6-8 месячных быков.

Биоткань обрабатывали ГА двумя вариантами при рН 4,0-5,0 с разными начальными (0,02 и 0,001 М), но одинаковыми конечными (0,05 М) концентрациями альдегида в растворе.Использовался глута-ровый альдегид "Реала!", (Венгрия). Растворы готовились на 0,17 М

NaCl.

Количество глутарового альдегида в фиксирующем растворе до и после его замены определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ЧДА "Реахим", Россия).

Обработку перикарда 0,1% раствором папаина ("Merck", ФРГ) проводили со стороны слоя рыхлой соединительной ткали. Раствор готовился на 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,0. Протеолиз проводили при 40 С в течение трех часов.

Обработку перикарда 15 мМ тритоном Х-100 ("Sigma", США) осуществляли при комнатной температуре в течение 20 минут.

Удельное разрушающее напряжение образцов определяли с помощью разрывной машины 200 УР-0,5 (СССР).

Экстрагируемый из перикарда с помощью 0,5 М NaCl белок определяли по методу Лоури-Фолина.

Оценку Са -связывающей способности трансплантата осуществляли по количеству кальция, связываемого образцом в расчете на см2 поверхности образца после 24 часов инкубации в среде, содержащей CaCl^- 2,2 мМ кальция и КН^РО*- 1,5 мМ фосфора (Б.П.Мищенко и соавторы, 1989; M.E.Nimni et al. ,1987). Концентрацию кальция определяли с помощью Арсеназо-III (С.Б.Саввин, 1966), содержание фосфора - по методу И.О.Вершининой и В.К.Леонтьева (1981). Ингибиро-вание процесса кальцификации наблюдали с помощью общепринятой модели подкожной имплантации лоскутов перикарда крысам (Б.А.Фурсов и соавторы, 1989).

Определение буферной емкости трансплантата и расчет числа ионогенных групп разных типов проводили с помощью метода кислотно-основного титрования (В.Калоус, З.Павличек, 1985) на установке, собранной с учетом рекомендаций сотрудников кафедры биофизики Воронежского госуниверситета.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили на ЭВМ типа IBM 80386 SX с помощью пакета прикладных статистических программ "Statgraphics".

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Обработка перикарда 0,001-0,05 М ГА позволяет получить более прочный биоматериал,из которого экстрагируется на 40% меньше белка, что может свидетельствовать о его большей биологической инертности.

Буферная емкость полученных трансплантатов достоверно не отличалась от показателя нативной ткани,в то время как образцы, обработанные 0,02-0,05 М ГА имели буферную емкость, в два раза большую, чем нативная ткань (таблица 1).

Таблица 1

Физико-химические свойства нативного и обработанного ГА ксеноперикарда.

(6 - удельное разрушающее напряжение-, Е -относит, удлинение)

Способ обработки ткани Связывание ГА, мкмоль/г 6 2 КГ/СМ Е,% Экстрагируемый белок, мкг/г- Буферная емкость, мкМ ИаОН

Необработанная ткань (группа 1) 94,0+5,0 47,0±1,0 1400,0+40,0 53,0+5,0

0,02-0,05 М ГА (варианту 253,0+3,0 130,0+4,0 д<0,001 72,0±2,0 ц< 0,001 164,0+3,0 £<0,001 81,0±3,2 0,001

0,001-0,05 М ГА (вариант2! 274,0+5,0 р/0,05 145,0+4,0 й<0,001 Р/0,01 76,0+2,0 й< 0,001 Р/0,05 117,0+1,0 р<0,001 Р/0,01 43,0+2,6 П>0,05 §<0,001

р< и р2-достоверность различии между соответствующими сравниваемыми группами.

Таблица 2

Количество титруемых ионогенных групп образцов нативного и обработанного ГА перикарда. ,

(Количество ионогенных групп/см х 10 )

Вид обработки ткани карбоксильные группы сульфгидрильные группы -ОН 1£-амино-тирозина группы

Нативная (группа 1) 0,5 + 0,054 0,6 + 0,15 3,6 + 0,26 8,5+1,26

0,02-0,05 М ГА (группа 2) 1,2 + 0,1 р,< 0,001 1,4 + 0,09 й<0,01 2,5 + 0,5 р>0,05 3,0+0,26 ц<0,01

0,001-0,05 М ГА (группа 3) 0,73 * 0,053 р<0,05 ¿<0,01 1,0 ± 0,018 Д< 0,001 р<0.01 2,2 ± 0,38 р,<0,05 р,.>0,05 4,7+0,6 Ц<0,05 р>0,05

р, и Рц-достоверность различий между соответствующими опытными группами.

Расчет числа ионогенных групп разных типое показал,что после обработки перикарда ГА наряду с уменьшением количества ¿-аминогрупп, наблюдается резкое увеличение карбоксильных групп аспарта-та, глутамата и сульфгидрильных групп цистеина белкового комлонен-

р,

нмоль/см" 300 -

Рис.1. Изменение Са" -связывающей способности перикарда после обработки Глухаревым альдегидом вариантами 1 и 2.

1 -нативная ткань; 2 -ГА 0,02-0,05 М; 3 -ГА С,001-0,05 и

та перикарда (таблица 2). При этом более выраженные изменения в соотношении выявляемых групп наблюдаются при использовании 0,02 М ГА в начале обработки биоматериала.

-Са2-связывающая способность образцов группы 3 (0,001-0,05 М ГА) была на 18% ниже по сравнению с материалом,обработанным 0,02-0,05 М ГА (рис.1).

Таким образом, чем выше начальная концентрация ГА в растворе, тем происходит более выраженная модификация белкового компонента перикарда. Изменение количества реакционно-способных групп может свидетельствовать об изменении нативной конформации белков соединительной ткани. В этой связи последующие группы образцов обрабатывались 0,001-0,05 М ГА.

Предварительная обработка нативного перикарда папаином позволила получить биоматериал с высокой прочностью, из которого экстрагировалось белка на 40% меньше по сравнению с тканью, обработанной только ГА (таблица 3). Относительное удлинение остава-

Таблица 3

Физико-химические свойства ксеноперикарда,модифицированного разными способами.

(«»-удельное разрушающее напряжение^ -относит.удлинение)

Способ обработки ткани Связывание ГА, мкмоль/г 6 X кг/см* Е,% Экстрагируемый белок, мкг/г Буферная емкость, мкМ ИаОН

Необработанная ткань (группа 1) - 94,015,0 47,0+1,0 1400,0+40,0 53,0+5,0

0,001-0,05 М ГА (группа 3 274,0+5,0 145,0+4,0 Ц< 0,001 76,0+2,0 р„< 0,001 117.0+1,0 ц< 0,001 43,0+2,6 р„>0,05

Папаин + ГА (группа 4) 260,0+2,0 ^<0,05 170,0+8,0 р,< 0,001 Р/0,01 44,0+2,5 р,>0,05 4< 0,001 85,0+3,0 В,< 0,001 рэ< 0,001 27,0+1,0 п<0,001 $0,001

Т.Х-100 + ГА (группа 5) 306,0+2,5 р.<0,05 0x0,05 180,0+5,0 Ц<0,01 р(<0,01 р>0,05 90,0±4,0 р,<0,01 р.<0,01 Р<0,01 120,0+3,0 д<0,001 р>0,05 р^ 0,001 29,0+4,5 р/0,05 р>0,05

Папаин + + Т.Х-100 + ГА (группа 6 278,0^2,5 р>0,05 р<:0,05 {£<0,05 161,0+5,0 р,< 0,001 р,<0,05 р^ 0,05 р^0,05 66,0+3,0 й<0,01 р>0,05 Р^0,01 Р<=0,01 95,0+3,0 В,< 0,001 р,<0,01 р>0,05 $0,01 Х'Х'.РР О) ооооо ооооо слооо-

р, - р*-достоверность различии между соответствующими сравниваемыми группами.

лось на уровне нативной ткани.

Таблица 4

Количество титруемых ионогенных групп образцов ксено-перикарда, модифицированного разными способами. (Количество ионогенных групп/см х 10т)

N группы п/п Карбоксильные Сульфгидрильные -ОН тирозина аминогруппы

1. Нативный 0,5 + 0,054 0,6 + 0,15 3,6 + 0,26 8,5 + 1,26

3. 0,001 -0.05М ГА 0,73 ¿- 0,05 р4<0,05 1,0 ± 0,018 £<0,001 2,2 ± 0,38 Ер 0,05 4,7 + 0,6 ¡э<0,05

4. Папаин + + ГА 0,46 t 0,034 Д>0,05 $0,01 - 0,4 + 0,11 Ц< 0,001 $0,01 0,94 + 0,25 п<0,01 ■ Р<0,01

5. Т.Х-100+ + ГА 0,36 + 0,03 р>0,05 р*0,001 $0,001 1,0 ± 0,17 п<0,001 Й0.05 р<0,05 1,64 + 0,37 р,<0,01 р4<0,01 р> 0,05

6. папаин + +Т.Х-100+ + ГА 0,32 +0,1 р>0,05 ¿<0,05 Й>0,05 р^< 0,001 0,3 X 0,055 р>0,05 р^ 0,001 ¿<0,001 ^0,05

р, - р$-достоверность различии между соответствующими сравниваемыми группами.

Полученные образцы характеризовались тем, что их сульфгид-рильные группы не были доступны титрованию. Существенно уменьшилось по сравнению с тканью, обработанной только ГА число гидрок-сильных групп тирозина и ¿-аминогрупп (таблица 4). Возможно, что это связано с частичным выходом из ткани пептидов, содержащих ли-зильные и тирозильные остатки.

Выяснено, что после предварительной обработки папаином Са -связывающая способность трансплантатов снизилась на 50% (рис.2), кальцификация при подкожной имплантации образцов крысам уменьшилась в 25 раз по сравнению с перикардом, обработанным только ГА (рис.3). Выявленный эффект мы связываем с тем., что после воздействия папаина и дальнейшей обработки ГА, конформация белковых молекул макромолекулярных комплексов перикарда изменилась таким образом, что -БН группы стали менее доступны титрованию и не могли связывать Са2*. Число доступных титрованию карбоксильных групп ас-партата и глутамата не отличалось от уровня нативной ткани.

нмоль/см^ 250 -

Рис.2. Влияние разных способов обработки перикарда на Са - -связывающую способность ксенотрансплантата. 1 -нативная ткань; 2 -обработка 0.001-С,0о М ГА;

3 -обработка 0.1% раствором папаина + ГА 0,001-0.05 /Л;

4 -обработка 15 мМ тритоном Х-ЮС + ГА С,..01-0,0ь V»;

5 -лапаин ь тритон Х-100 -н ГА 0,001-0,05 Ж

Калытай, мкмоль/мг

□ i Шг ЕШз Ш4 Шъ

Рис.3, йлияние разных способов обработки перикарда на количество кальция в образцах после 45 суток подкожной имплантации. 1 -неимплантированная ткань; 2 -обработка G,C01-C,05 М ГА;

3 -обработка и,1% раствором папаина + ГА 0,001-С,, 05 М;

4 -обработка 15 ш тоитоном Х-100 + ГА 0,001-С,Оо М;

5 -папаин +• тритон Х-100 + ГА 0,001-0,05 М

Таким образом, неколлагеновые белки соединительной ткани принимают непосредственное участие в связывании ионов кальция и кальцификации.

Предварительная обработка детергентом - тритоном Х-100 (группа 5) привела к повышению на 14% количества связываемого перикардом ГА по сравнению с группой 3 (обработка только ГА) и увеличению на 20 % относительного удлинения образцов (таблица 3). Это свидетельствует о том, что липиды препятствуют связыванию ГА тканью.

Количество экстрагируемого из образцов данной группы белка было идентично таковому образцов, обработанных только ГА. Следовательно, детергент не оказывал влияния на убыль белкового компонента.

Нашими исследованиями установлено, что после предварительного воздействия тритона Х-100 (группа 5) карбоксильные группы ас-партата и глутамата становятся недоступными для титрования, что выражается как и в случае обработки папаином, в значительном снижении буферной емкости трансплантата. В то же время, количество доступных титрованию сульфгидрильных групп цистеина оставалось на уровне нативной ткани (таблица 4). Роль карбоксильных групп аминокислот в связывании Са хорошо известна, г*

Са -связывающая способность образцов, обработанных тритоном Х-100 (рис.2) и уровень накопления в них кальция при имплантации под кожу крыс (рис.3) были идентичны группе 4 (обработка папаином). Это дает возможность предположить, что карбоксильные и сульфгидрильные группы имеют непосредственное отношение к связыванию трансплантатом ионов кальция и его последующей кальцификации.

Последовательная предварительная обработка перикарда папаином и тритоном Х-100 (группа 6) позволила на 70% снизить Са2+ -связывающую способность биоткани по сравнению с группой 3 (обработка только ГА), на 30% по сравнению с группами 4 и 5 (Рис.2). По отношению к нативной ткани (группа 1) показатель оставался все же высоким: 72±2,0 и 13,0±1,0 нмоль кальция /см соответственно. Тем не менее,образцы группы 6 под кожей не кальцифицировались (Рис.3).

Было выяснено, что образцы, подвергнутые сочетанной обработке, характеризовались недоступностью для титрования гидроксила тирозина и 6-аминогрупп. Резкое падение количества заряженных групп выразилось в минимальной буферной емкости образцов (таблица

3). Количество карбоксильных групп аслартата, глутамата и сулъ-фгидрильных групп цистеина было идентично нативной ткани (таблица

4).

Следовательно, и в данном случае конформация белковых молекул отличалась от нативной. Между числом доступных титрованию карбоксильных,сульфгидрильных групп и количеством связываемых ионов кальция обнаружена взаимосвязь: трех-кратное уменьшение числа групп указанных типов приводит к трех-кратному снижению количества связываемого кальция (230+15 нмоль/см'2- группа 3 и 72,0+2,0 нмоль/Ы*-группа 6). Это может говорить о непосредственном участии ионогенных групп данных типов в связывании ионов кальция трансплантатом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результаты проведенных экспериментов показали, что обработка нативного перикарда ГА вне зависимости от используемой начальной концентрации, приводит к резкому увеличению количества карбоксильных групп аспартата, глутамата и сульфгидрильных групп остатков цистеина белкового компонента соединительной ткани. Это может свидетельствовать о том, что изменяется нативная конформация белковых молекул.

Установлено, что чем выше начальная концентрация ГА в растворе, тем наблюдается более выраженная модификация белкового компонента перикарда.

Экспериментами с использованием папаина и тритона Х-100 выявлено участие неколлагеновых белков и липидного компонента пери-

■3'

карда в связывании Са трансплантатом после обработки ГА.

Выяснено, что карбоксил аспартата, глутамата, сульфгидрильные группы остатков цистеина принимают непосредственное участие в связывании ионов кальция ксеноперикардиальным трансплантатом после обработки глутаровым альдегидом.

Проведенные исследования позволили нам представить вариант схемы индуцирующего влияния обработки ГА на кальцификацию ксено-перикардиальных трансплантатов (Рис.4).

ГА

„ I

Перикард Связывание ¿-аминогрупп

Изменение нативной конформа-ции неколлагеновых белков

палайн соединительной ткани тритон Х-100 -

Увеличение количества Увеличение количества титруемых -5Н групп титруемых -С00Н групп

V_.,_*

I

ности ксенотрансплантата

ь

Увеличение Са -связывающей способ-

Развитие внеклеточной кальцификации ксенотрансплантата в условиях среды, пересыщенной гидроксиапатитом

Рис.4. Схема индуцирующего влияния обработки глутаровым альдегидом на кальцификацию ксеноперикардиальных трансплантатов и ингибирующего воздействия на этот процесс папаина и тритона Х-100.

Связывание глутаровым альдегидом значительного числа ¿-аминогрупп приводит к изменению нативной конформации макромолекул основнного вещества соединительной ткани. Это выражается в увеличении количества карбоксильных и сульфгидрильных групп, способных акцептировать ионы кальция. Вследствие этого, увеличивается Са' -связывающая способность ксенотрансплантата. Пересыщенность крови гидроксиапатитом и постоянный ее поток через клапан создают благоприятные условия для развития процессов, сопровждающих отложение нерастворимых фосфатов кальция в матриксе.

ВЫВОДЫ

1. Обработка глутаровым альдегидом увеличивает Сал-связывающую способность ксеноперикардиального трансплантата вне зависимости от используемой начальной концентрации альдегида в растворе. При этом глутаровый альдегид увеличивает количество доступных титрованию карбоксильных групп аспартата, глутамата и сульфгидрильных групп цистеина, что свидетельствует об изменении нативной конформации белков соединительной ткани.

2. Более мягкая обработка перикарда глутаровым альдегидом на начальном этапе (0,001 М/л) по сравнению с общепринятой (0,02 М/л) снижает буферную емкость биоматериала и в меньшей степени способствует связыванию трансплантатом ионов кальция. -

3. Предварительная обработка нативного перикарда 0,1% раствором палаина уменьшает Са*'-связывающую способность трансплантата и снижает интенсивность процесса кальцификации при имплантации под кожу крысам.

4. На процесс связывания Са*'" перикардом и кальцификацмо ксенотрансплантата после обработки глутаровым альдегидом существенное влияние оказывают неколлагеновые белки соединительной ткани.

5. Карбоксильные группы аспартата,глутамата,сульфгидрильные группы цистеина принимают непосредственное участие в процессе связываниия Са" трансплантатом и способствуют его кальцификации.

6. Предварительная обработка нативного перикарда тритоном Х-100 в концентрации 15 ммоль/л увеличивает взаимодействие глута-рового альдегида с перикардом. При этом снижается Са"-связывающая способность трансплантата и подавляется процесс кальцификации. Установлено, что данное свойство обусловлено воздействием детергента, которое уменьшает количество карбоксильных групп аспартата

и глутамата после обработки перикарда глутаровым альдегидом.

7. Протеолиз с помощью папаина неколлагеновых белков и последующая экстракция дипидов с поверхности перикарда уменьшает количество реакционно-способных функциональных групп белков, взаимодействующих с ионами кальция.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Обработку ксеноперикардиальных трансплантатов ГА следует начинать с концентрации 0,001 М, так как при использовании 0,02 М ГА наблюдается более значительное изменение нативной конформа-ции белков перикарда, приводящее к повышенной Саг-связывающей способности ксенотрансплантата.

2. Для оценки резистентности биоматериала к кальцификации наряду с определением количества связанного перикардом кальция, целесообразно также проводить определение количества доступных титрованию -СООН и -SH групп, поскольку они принимают непосредственное участие в процессе кальцификации ксенотрансплантата.

3. Последовательную обработку ксеноперикарда 0,1% раствором папаина и 15 мМ тритоном Х-100 перед дублением ГА можно считать одним иэ эффективных способов аамедления процесса кальцификации ксеноперикардиальных трансплантатов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Боев К.В., Корденко А.Н., Мараева О.Б., Сенцова И.Г. Влияние ферментативной обработки на толщину и прочность ксенопе-рикрда, используемого для биопротезов клапанов сердца //Материалы 1-го Всесоюзного съезда сердечно-сосудистых хирургов. - Москва, 1990. - С.421-422:

2. Боев К.В., Морозова И.В. Влияние ферментативной обработки перикарда палаином на его кальцификацию //Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия: Материалы международного симпозиума. -Суздаль,1991. - С.90-91.

3. Боев К.В., Морозова И.В. Получение прочного биоматериала, резистентного к кальцификации в эксперименте //Реконструктивная и восстановительная хирургия. Воронеж, 1992. - С.83-89.

4. Ермакова А.И., Морозова И.В., Боев К.В. Опыт применения консервированного ксеноприкарда в клинике //Реконструктивная и

восстановительная хирургия. Воронеж, 1992. - С.90-92.

5. Боев К.В. Выявление' роли белкового и липидного компонентов в кальцификации ксеноперикардиальных трансплантатов, используемых в кардиохирургии //Актуальные вопросы современной медицины. Воронеж, 1993. - С.17.

6. Булынин В.И., Боев К.В. "Способ формирования створки мо-ноклалана легочной артерии" A.c. СССР N1792677 //Бюллетень N5, 07.02.93 г.

7. Булынин В.И., Ермакова А.И., Вульф В.Н., Ковалев С.А., Боев К.В. Научно-практические аспекты развития сердечной хирургии в Воронеже //Актуальные проблемы медицины. В 2-х Т. Воронеж, 1993. - Т. 2 - С. 33-37.

8. Алабовский В.В., Булынин В.И., Боев К.В., Резван С.Г. Роль ионизированных групп ксенотрансплантата в его кальцификации после обработки глутаровым альдегидом //Физико-химические осноеы функционирования белков и их комплексов: Материалы Международного симпозиума. - Воронеж, 1S95.

9. Алабовский В.В., Боев К.В., Резван С.Г. Роль глутарового альдегида в кальцификации ксеноперикардиальных трансплантатов. В печати.

Заказ 203 от 2.5.95 г. Тир, 100 экз. Формат 60 X 90 1Дб. Объем I п.л. Офоетная лаборатория В1У.