Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль кинетохорассоциированного белка CENP-E в митотическом делении клеток млекопитающих
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Роль кинетохорассоциированного белка CENP-E в митотическом делении клеток млекопитающих"
На правах рукописи
ЛАДЫГИНА НАДЕЖДА ГРИГОРЬЕВНА
Роль кинетохорассоциированного белка СЕЫР-Е в митотическом делении клеток млекопитающих.
03.00 25-Гистология, цитология и клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА
2005 год
Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии Российского Государственного Медицинского Университета и в научной группе под руководством проф Тима Ена Онкологического центра Фокс Чейс, Филадельфия, США
Научные руководители'
Кандидат биологических наук, доцент Ляпис Рихард Вольдемарович
PhD, профессор Ен Тим (Yen Tim)
Официальные оппоненты Доктор биологических наук Кандидат биологических наук
Надеждина Елена Сергеевна Ильинская Ольга Петровна
Ведущая организация Институт биологии развития РАН, Москва
Защита состоится 3 июня 2005 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д208 073 02 в РКНПК МЗСР РФ по адресу 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15А
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗСР РФ
Автореферат разослан 26 апреля 2005 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук J Z ■> г г /* { " Т.И.Венгерова.
20Q6-4 65S1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Для правильной передачи генетической информации исключительно важны как основные механизмы функционирования главной генетической системы, обеспечивающие воспроизведение генетической информации путем удвоения молекул ДНК - системы репликации, так и молекулярные механизмы, обеспечивающие расхождение удвоившихся хромосом между дочерними клетками у про - и эукариот в процессах митоза и мейоза Учитывая тот фат, чю 2,5хЮ8 клеток человека подвергаются делению в каждый данный момент времени, появление хотя бы одной ошибки в данном процессе повлечет за собой возникновение множества генетически анормальных клеток на протяжении жизни индивидуума в целом
Точность расхождения хромосом определяется сложными механическими процессами, главными из которых являются выравнивание и сегрегация хромосом, для правильного протекания которых необходимо прикрепление хромосом к веретену деления Прикрепление - процесс стохастический, при этом хромосомы прикрепляются к микротрубочкам посредствам прямых столкновений Это объясняет, почему хромосомы подвергаются выравниванию у клеточного экватора несинхронно, а также свидетельствует о необходимости наличия системы специального контроля - так называемой точки рестрикции (точки перехода митоза) (МТР)
Система точки рестрикции в клетках млекопитающих представлена эволюционно-консервативной группой белков, которая контролирует взаимодействие кинетохора и микротрубочек, предотвращая переход клетки в состояние анафазы при наличии невыравненных у клеточного экватора хромосом. Генетические и биохимические исследования выявили мишень митотической точки рестрикции - это макрокомплекс циклосом, известный также как Anaphase Promoting Complex/cyclosome (АРС/С), являющийся мультисубьединичной убиквитин-зависимой протеазой, подвергающей деградации ключевые митотические белки, такие как циклинВ, обуславливая тем самым завершение MHTO3a(Rieder and Salmon 1998, Maiato, DeLuca et al 2004). Ингибирование АРС/С осуществляется комплексом белков митотической точки рестрикции, получившим название MCC (Mitotic Checkpoint Complex), через взаимодействие с субстраюм АРС/С - Cdc20 Впервые выявленные в дрожжевых клетках белки митотической точки рестрикции являются высоко консервативными в эволюционном плане Гомологи дрожжевых BUB1, BUB3, MAD1, MAD2, MAD3 и Mpsl белков были идентифицированы у высших организмов, где также была показана их роль в регуляции митотической точки рестрикции
Расхождение хромосом осуществляется и отчасти контролируется белками-биологическими моторами Представителем данной группы является кинезиноподобный Centromere-associated Protein Е (CENP-E) белок, обеспечивающий
формирование контакта между кинетохором и микротрубочками (МТ) В структуре данного белка отмечают два микротрубочкосвязывающих ломена, расположенных на NH2- и СООН-терминальных концах, роль которых на сегодняшний день остается до конца не изученной, кинетохорсвязывающий домен, а также домен взаимодействия с белками митотической точки рестрикции, в частности киназой hBUBRl Функциональные исследования CENP-F показали, что активность этого белка регулируется системой митотической точки рестрикции через прямое взаимодействие данного белка с киназой hBUBRl, гомологичной белкам точки рестрикции дрожжей MAD3 и BUBI И что наиболее важно, было показано, что арест митоза, индуцируемый отсутствием CFNP-E, зависит от киназной активности hBUBRl Учитывая все вышеприведенные результаты и тот факт, что hBUBRl также локализуется на кинетохоре, можно предположить, что CENP-E и hBUBRl являются неотъемлемой частью механосенсорного комплекса, который связывает функционирование кинетохоров и системы точки рестрикции
В данной работе будут рассмотрены некоторые из аспектов функционального значения доменной структуры белка CENP-F, механизмы регуляции его активности и определена роль взаимодействия данного белка с белками митотической точки рестрикции, в частности киназы hBUBRl Всесторонняя оценка активности CENP-E в осуществлении митоза позволит использовать его в качестве избирательной мишени при лечении онкологических заболеваний, а также внесет вклад в понимание механизма атипичных митозов
Цель и задачи работы. Цель данной работы - изучить роль белка CENP-E в процессах прикрепления кинетохоров сестринских хроматид к микротрубочкам веретена клеточного деления, хромосомной конгрессии и прохождения митотической точки рестрикции в делящихся культивируемых клетках млекопитающих (Hel.a) Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи-
1 Восстановить полноразмерную 8 кб кДНК копию гена CENP-E из имеющихся перекрывающихся фрагментов Показать in vitro и in vivo, что полученная в процессе работы кДНК гена CENP-E является функциональным гомологом эндогенной формы
2 Используя технологию pSHAG (короткогапилечных малых интерферирующих РНК) для ингибирования активности эндогенного белка, оценить in vivo роль каждого из двух микротрубочкосвязывающих доменов CFNP-E в процессе митоза по отдельности и эффект удаления двух МТ-связывающих доменов одновременно Описать значение АТФ-азной активности N1 Г2-терминал1.ного района CENP-E в процессе внутриклеточного турновера данного белка
3 Используя технологию pSHAG, описать значение фосфорилирования CENP-E киназами MPF (комплексом циклила В и cdc2) и MAP р38 в процессе регуляции
активности кинетохорсвя ганного пула белка CENP-H на протяжении митотического цикла клетки.
4 Картировать район взаимодействия CENP-E и киназы митотической точки рестрикции hBUBRl и охарактеризовать in vivo роль подобного взаимодействия для завершения клеткой митотического деления Научная новизна Все представленные в работе результаты имеют научную новизну Полученная в этой работе полноразмерная копия кДНК является впервые описанной функционально полноценной формой гена CENP-E Использование данного клона в совокупности с технологиями GATFWAY (Invitrogen, США) и pSHAG позволило всесторонне оценить значение каждого из МТ-связывающих районов CENP-E и значение взаимодействия данного белка с киназой митотической точки рестрикции hBUBRl Впервые было показано in vivo, что ингибирование активности любого из МТ-связывающих доменов приводит к нарушению функционирования CENP-E и как следсшие машины клеточного деления в целом Впервые in vivo было показано значение ингибирующего эффекта фосфорипирования CENP-F в процессе митоза Также на основании полученных данных было получено подтверждение гипотезы о инактивирующем влиянии CENP-E на сигнал митотической точки рестрикции через взаимодействие данного белка с hBUBRl Результаты проведенной работы приоткрывают завесу на выяснение молекулярных механизмов функционирования CENP-E.
Практическое значение Как широко известно, раковые клетки обладают высоким темпом пролиферашвною росга вследствие нарушения контроля процесса деления Действие одних из традиционно применяемых в онкотерапии лекарственных препаратов направленно на остановку деления опухолевых клеток через ингибирование определенного этапа полимеризации МТ Однако, при этом затрагиваются все внутриклеючные процессы, вовлекающие МТ (везикулярный транспорт, клеточная адгезия и т д) Для достижения необходимого терапевтического действия в процессе лечения назначаются как правило большие дозы таких препаратов, при длительном приеме которых у пациентов отмечаются множественные нежелательные побочные эффекты В дополнение к этому клетки злокачественных новообразований с большой частотой вырабатывают резистентность к применяемым препаратом Вот почему в настоящее время перед учеными ставится проблема нахождения новых лекарственных препаратов, специфически регулирующих пролиферацию раковых клеток Для решения данной проблемы в настоящее время большую популярность приобретает подход ингибирования
кинетохорассоциированных белков, обуславливающих взаимодействие хромосом и микротрубочек, и активных, таким образом, только во время митоза Белок CENP-E в силу выполняемых им функций, скорее всего, может быгь реальной мишенью для
поиска соответствующих фармакологических препаратов Было показано, что в клетки в отсутствие данного белка остаются блокироваными в митозе из-за невозможности завершить деление при наличии несвязанных с микротрубочками хромосом Механизм данного явления на сегодняшний день не являлся детально изученным, однако авторы выражают надежду, что полученные в работе результаты помогут в поиске селективных ингибиторов функций кинетохорассоциированного белка CFNP-E В частности, мы полагаем, что применение препаратов, блокирующих АТФ-азную активность NH2 -терминального района сможет вызвать арест клеток в митозе и тем самым остановить пролиферацию раковых клеток
Апробация Материалы работы были представлены на 8-ой ежегодной научной конференции имени Эдварда Д Лайсбайдера, Филадельфия, США 2003, 43-ей и 44-ой ежегодных конференциях Американского общества клеточных биологов (American Society of Cell Biology), Сан-Франциско. США, 2003 и Вашингтон, США, 2004 соответственно Диссертационная работа была апробирована на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии Российского Государственного Медицинского Университета
Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисных сообщения
Структура работы Диссертационная работа состоит из следующих глав введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы благодарности, список литературы Диссертация изложена на 105 страницах и включает в себя 17 рисунков и 2 таблицы Список литературы содержит 177 источников
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Полпмеразпая цепная реакция и ПЦР-мутагенез. Для получения полноразмерной копии гена CENP-E смесь фрагментов А91-4099 по и о"00"8080 амплифицировалось с использованием праймеров TJY992 5' - CACCATGGCGGAGGAAGGAGCCGTGGCC - 3', TJY103 5' - ATGTCGACAGTTTTGCACTCAGGCACA - 3' и 0 5 единиц Advantage ДНК-почимеразы (Clontech, США) согласно условиям фирмы-производителя ПЦР продукт полноразмерной копии CENP-F-91'8"8""0 был использован для проведения IOPO-реакциии для перехода в систему векторов GA I I WAY (Invitrogen, США) с испотьзовапием эксмрессивующего вектора pSHAG3xFLAG для по.пчения плазмиды pSHAG3xFLAG mmCENP-E91 8"80"ОД,Ш'Г° ™па (лт), которая использовалась как ДНК магрица для ПЦР-мутагенеза
Для получения мутаций в позноразмерной копии гена бьи испочьзован набор QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, США) Для получения мутаций в
МТ связывающих доменах были использованы следующие пары праймеров' мутация, удаляющая последние 99 аминокислот в последовательности по средствам привнесения Stop-кодона в положение 2562аа - СД99 - TJY1058 5' -CTCACAAACAAGTAACTTGAGAGAATTCTCCAAAG - 3' и TJY1059 5' -CTTTGGAGAATTCTCTCAAGTTACTTGTTTGTGAG - З';мутация в АТФ-связывающем домене - TJY1182 5' - GGACAGACTGCTTCAGTAGAAACATATACCATG -3' и TJY1183 5'- CATGGTATATGTTTCTACTGAAGCAGTCTGTCC -3' Для сочетания дух этих мутаций в одном клоне ПЦР проводилась в два этапа с использованием двух nap(TJY1058 и TJY1059, TJY1182 и TJY1183) праймеров последовательно Для получения формы, имитирующей гиперфосфорилированное состояние CENP-E, -CENP-ES2567E S257üe S2601E S2616E - производилась ПЦР реакция с использованием двух пар праймеров последовательно TJY1191 5'-
GATATCTGTGAGAATGAACCAAAGGAACCTAAAGCGACTGGA-3' и TJY1192 5'-TCCAGTCGCTTTAGGTTCCTTTGGTTCATTCTCACAGATATC- 3' Продукты этого раунда ПЦР использовались для проведения следующего с применением пар праймеров TJY1196 5'AAGGAAGAACCAAAATCTTGTTTTTTGATAGCCGATCAAAGTC ТТТАСС AGAACCTC АТ-3' и TJ Y11975 'ATGAGGTTCTGGTAAAGACTTTGATCGGCTATCA AAAAAACAAGATTTTGGTTCTTCCTT-3' Для картирования района взаимодействия с киназой hBUBRl в качестве матрицы использовались pSHAG3xFLAG-MMCENP-E91" 8080г,одг, так и СООН-терминальная область PSHAG3XFLAG-CENP-E5965"8080"° " Мутации, удаляющие петлю I (Delta 1) получали с помощью пар праймеров -TJY 1838 5'-AATACTCGTTTTGATATAGAAAAGCTTAAAAATGGCCAAGACAATAAGCCTCATGTTC ATCAAGAGCT-3' и TJY 1850 5'AGCTCTTGATGTAACATGAGGATTCTTATTGTCTTGGCC ATTTTTAAGCTTTTCTATATCAAAACGAGTATT-3', Мутации, удаляющие петлю II (Delta2) - TJY1839 5'GCCCAGGTTAATCCTACCACACAAGACAATAAGAATGATCTCAAA ATGCTTGTGAAAATAGACCTAGAG 3' и TYJ 1840 5'СТСТАООТСТАТПТСЛСЛЛОСГТС ATTTTGAGATCATTCTTATTGTCTTGTGTGGTAGGATTAACCTGGGC 3', Мутации, удаляющие петлю III (Delta3) TJY 1841 5'GCTTTAGGAGCTAAAGCCATATAAAGAAGA AAITGAAG1GA1A1CAGAACATACTGATCCTCAGCCTTCAAAT3' и TJY 1842 5'ATTTGA AGGCTGAGGATCATGTTCTGATATCACTTCAATTTCTTCTTTATATGGCTTAGCTCCTAAA GC3'; Мутации, удаляющие петлю lV(Delta4) - TJY 1843 5'TCAGTGATATCAGAACAT ACTATCCTCAGCCTTCAACAGCTTCTAAAAAGAAACAAATTACACCCTCTCAA-3' и TJY1844 5'-TTGAGAGGGTGTAATITGTTTCTITTTAGAAGCTGTTGAAGGCTGAGGATCA GTATGTTCTGATATCACTGA- 3'
Все продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и визуализировали в УФ свете, используя систему документации и анализа Alpha Imager 2200 documentation and analysis system (Alpha Innotech, San Leandro, США)
Технология GATEWAY. В отличие от применяемых традиционных методов клонирования GATEWAY технология позволяет использовать неограниченное количество систем для экспрессии единожды проклонированного гена, что минимизирует ошибки, связанные с сохранением целостности последовательности гена Основой данного метода является хорошо изученный на сегодняшний день процесс сайт-специфической рекомбинации бактериофага X Единожды полученный pFNTRY клон, содержащий интересующий ген, фланкированный с двух сторон кассетами рекомбинации бактериофага, в процессе реакции рекомбинации с pDESTINATION вектором, также содержащим аналогичные кассеты, переносит ген в pDFSTINATION с образованием экспрессирующего клона Производители гарантируют целостность передачи всей последовательности проклонированного гена и сохранение открытой рамки считывания При этом описанная реакция является эквивалентом проведения высоко специфических реакций рестрикции и лигирования В качестве pDESTINATION могут быть использованы различные векторы, применяемые для биохимических или функциональных исследований, что делает технологию методом выбора при экспрессии исследуемого гена в различных системах Для получения более полной информации автор рекомендует официальный веб-сайт компании Invitogen- www invitrogen com
Технология pSHAG (Short hairpin RNAs-короткошпилечные РНК). Короткошпилечные РНК (кшРНК) являются функциональными гомологами малых интерферирующих РНК В настоящей работе был использован метод получения кшРНК для гена CENP-E в процессе ПЦР, разработанный в лаборатории Г Ханнона(СШАХС Hannon) Суть этого метода сводиться к использованию плазмидного вектора для доставки кшРНК в клетки Для создания подобного вектора в процессе амплификации иб-содержашего вектора используется модифицированный 3'-праймер, включающий в себя всю последовательность кшРНК определенного гена, что составляет в среднем 90 нуклеотидов (в данной работе использовался фрагмент гена CENP-E946"97' по) Получаемый продукт ПЦР содержит кшРНК, расположенную даунстрим от U6 промотора В дальнейшем подобный фрагмент при наличии соответствующих рестрикционых сайтов может быть проклонирован в любой плазмидный вектор и использован для транзиторной трансфекции клеточных линий Более полная информация относительно данного метода может быть получена на http//www cshl org/public/SCIENCE/hannon/html
Культивирование клеточных линий HeLa, HeLa GFPH2B 7.1 и IleLa GFPa-тубулин. Для проведения исследований клетки HeLa, полученные из банка АТСС (номер в каталоге CCL-2, США), культивировались согласно стандартам фирмы-производителя Для культивирования клеток линий HeLa, содержащих GFP-форму гистона Н2В, и HeLa, содержащих GFP-форму а-тубулина, (любезно предоставленных
проф С Яблонски, США) в среду дополнительно добавлялся антибиотик G418 в конечной концентрации 300 мгл/мл
Трансфекция клегок Hel a и иммуиоокрашивание клеток. Для трансфскции клеток PEI трансфицирующим реагентом (Sigma, США) использовалось 2 мкг ДНК согласно протоколу фирмы-производителя Через 48 часов трансфицированные клетки фиксировались в растворе 3,5% параформальдегида для проведения иммунофлуоресцентного исследования Наличие в трансфицированных клетках FLAG-рекомбинантного белка определялось с помощью FLAG моноклональных или поликлональных антител (Sigma, США) Белки МТР (hBUBRl,MADl) окрашивались с помощью поликлональных кроличьих антител, полученных в лаборатории проф Тима Ена (Chan, Schaar et al 1998) Выявление паттерна экспрессии белка CENP-E производилось с помощью как поликлональных (Schaar, Chan et al 1997), так и моноклональных антител (Yen, Compton et al 1991), также полученных в лаборатории проф Тима Ена МТ окрашивались с помощью моноклональных антител к а-тубулину (Sigma, США) Для окрашивания центромер использовалась сыворотка больных аутоиммунной склеродермией (ACAXEarnshaw, Bordwell et al 1986) Ядра клеток и хромосомы выявлялись с использованием 0,1 мкг/мл 4',6'-диаминофенилиндола (ДАПИ) Клетки анализировали под микроскопом Nikon Microphot SA с использованием объектива lOOxNAl 4 и видеокамеры 512F CCD (Dage-MTI) Анализ изображений производился с помощью пакета программ Metaview (Nicon, США) Микроиньекции ДНК и цейтраферная фотосъемка. Клетки линий HcLa, содержащие GFP-форму гистона Н2В,и HeLa, содержащие GrP-форму а-1убулина, кулыивировались на решетчатых 3 5 см чашках со стеклянным дном (MatTek Corp,США) в течение 15 часов до момента проведения микроиньекций Для проведения микроиньекций ДНК разводилась до конечной концентрации 20 нг/мкл Микроиньекции ДНК производились с использованием полуавтоматического инжектора (модель 5412, Eppendorf Scientific, 1пс,США) и авюматическою микроманипулятора (модель 5402 Eppendorf Scientific, 1пс,США) В течение следующих двух дней культивирования производилась синхронизация инъецированных клеток при добавлении в среду ЗН-тимидина На третий день клетки, синхронизированные в Gl/S-фазе, переносились в предварительно нагретую до 37°С камеру спиндискового микроскопа (Perkin Elmer, США) для проведения цейтраферной фотосъемки с использованием масляного объектива 60xNAl 4 Съемка прои¡водилась каждые 5 минут на протяжении 16 часов с использованием фильтра RGB Реакция трансляции in vitro. Фрагменты CFNP-F9'"'600 дикого типа и содержащий мутации в АТФ-связывающем домене были проклонированы в вектор рЕТЗа (Novagen) 1 мкг каждой из плазмидных ДНК использовался для проведения одной реакции трансляции с использованием набора TNT Т7 Coupled Reticulocyte Lysate
System согласно протоколу фирмы-производителя (Promega,CIIIA) в присутствие 35S-метионина
Исследование способности связывать микротрубочки. ЮмМ МТ использовались для проведения исследования способности связывать МТ как oriHcanoiWordeman 1995) с использованием 3 мкл продуктов каждой трансляции in vitro Анализ образцов проводился с использованием 4%-20% градиентных ПААГ гелей методом радиографии
ПААГ и иммуиоблотииг- анализ белков проводился с использованием 10% или 420% градиентных полиакриламидных гелей Трансфицированные клетки HeLa лизировались в NP40 буфере Концентрация белка определялась с помощью ВСА protein assay (Pierce Chemical Co) Перенос осуществлялся на мембрану PVDF (Millipore, США) В работе использовались поликлональные антитела к CENP-E, моноклональные антитела к тубулину, поликлональные антитела к hBUBRl и моноклонапьные антитела к белку FLAG (Sigma, США)
Реакция иммунопрепипитяпии и киназняя реакция - киназа hBUBRl очищалась при помощи реакции иммунопренипитации из нативных лизатов клеток HeLa (500 мкг), синхронизированных в Gl/S-фазе Поликлональные антитела к CFNP-F и hBUBRl и моноклональные антитела к FLAG разводились до конечной концентрации 2 мкг/мл Для проведения киназной реакции образны иммунопреципитации CENP-E и hBUBRl в соотношении 14 В качестве субстрата в киназной реакции использовалось 0 5 мкг рекомбинантного гистона НЗ Киназная реакция производилась по описанному методу (Chan, Jablonski et al 1999) Полученные образцы разгонялись в 4-20% градиентном ПААГ, окрашивались с применением красителя Кумасси и высушивались для дальнейшего использования методом радиоавтографии
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Восстановление полноразмерной копии кДНК гена CENP-E, создание кшРНК CENP-E экспрессирующего вектора pSHAG3xFLAG и кшРНК резистентной аллели mmCENP-E1"2462". Размер эндогенного CFNP-F белка составляет 312 кДа, а его кДНК соответствует 8кб (Yen, Compton et al 1991) При этом на сегодняшний лень не опубликовано ни одного сообщения, в котором бы проводились исследования с применением полноразмерной копии человеческого гена CFNP-F Поэтому на начальных этапах выполнения работы первостепенной задачей стало восстановление полноразмерной копии человеческою гена CENP-E из имеющихся в лаборатории фрагментов Для проведения ПЦР была использована смесь фра! ментов А(4 кб NH2-терминальный участок) и D (СООН-терминальныШ 6 кб) в качестве матрицы, и пара праймеров, фланкирующих 5'- и З'-концы полноразмерной копии кДНК С Г MP-Г (TJY992 и TJY103 соответственно) Полученный 8 кб ПЦР (рис 1,А) продукт был
проклонирован в 3xFLAG экспрессирующий вектор (GATFWAY модификация коммерческого вектора Sigma, США) и использован для трансфекции клеток HeLa Трансфицированные данной плазмидой клетки показали следующие распределение FLAG-рекомбинантного белка - в профазе и метафазе FLAGCENP- Н91"2602 л накапливался на кинетохорах хромосом и перемещался в зону образования первичной перетяжки к моменту перехода клетки в анафазу, оставаясь в этом районе до моменга завершения цитокинеза (см рис1, Ь) Подобное внутриклеточное распределение соотносится с поведением эндогенного белка, выявляемою поликлональными кроличьими антителами к CENP-E Также лизаг трансфицированных клеток использовался для проведения вестерн-блотг исследования с применением FLAG антител, и было показано, что размер рекомбинантно! о белка соответствует размеру эндогенного (см рис 1, А)
Рис 1 Восстановление полнорамерной копии кДНК CENP-E в ПЦР реакции. А Для проведения ПРЦ использовались два перекрывающихся участка (Л и D) и праймеры для 5'- и З'-конца полноразмерной копии CENP-E Продукт данной реакции составил 8 kb и соответствовал кДНК CENP-E (блотт слева) Блотт справа -CENP-E вестерн-блотгинг с использованием лизатов клеток HeLa (линия ]-нативный лизат, линия 2- трансфекция плазмидой CENP-E912Ш ') Б Иммумофлуоресценция с применением моноклональных антител FLAG и аутоантител к АСА на клетках HeLa, трансфицированных плазмидой P3xFLAG CENP-E" 26&,n
Ранее проведенные электронномикрос-копические исследования выявили, чго CENP-E локализуется на внешней пластинке кинетохора в виде димера, поэтому было предположено, что привносимый рекомбинантный белок способен образовывать димеры с эндогенной формой, при этом эффект рекомбинантного белка будет компенсироваться активностью эндогенного В ходе исследований нами был разработан вектор pSHAG3xFLAG, кодирующий малую интерферирующую РНК (миРНК) для гена CENP-E в виде короткой шпилечной РНК (кшРНК) к району-мишени CENP-E975'990 Применение этого конструкта для трансфекции клеток показало существенное (более 70%) падение уровня экспрессии эндогенного CENP-E белка, определяемого с помощью соответствующих антител, как при проведении вестерн-блотгинга (см рис 2, А), так и при использовании метода иммунофлуоресценции (на кинетохорах трансфицированных клеток было отмечено падение сигнала CENP-E в 12,5 раз по сравнению с контролем (см рис 2, Б)), а также
появление в трансфииированных клетках фенотипа Брюса (Пара (несколько хромосом перемешаются в зону полюсов деления, отделяясь от метафазной пластинки, при этом клетка задерживается в митозе вследствие активации МТР (см рис 2, Б)) Наблюдаемый нами фенотип трансфииированных клеток соотносится с ранее опубликованными работами(МсЕ\уеп, Chan et al 2001, Мао, Abrieu et al 2003) о накоплении моноориентированных хромосом у клеточного экватора в клетках млекопитающих при потере CENP-E В дополнение к этому, в трансфииированных клетках было отмечено увеличение сигнала таких белков МТР, как hBUBRI и MAD1 на кинетохорах моноориентированных(приближенных к одному из полюсов) хромосом трансфииированных клеток (см рис 2,В), в то время как на кинетохорах контрольных клеток MAD1 полностью отсутствует, а сигнал hBUBRI падает в несколько раз с момента достижения хромосомами биполярного прикрепления(рис2, В)
Рис2. Нокдаун эндогенного белка CENP-F с помощью вектора pSHAG3xFLAG в клетках HeLa А, Лизаты клеток HeLa, трансфииированных плазмидой,
содержащей контрольную кшР1 IK (линия 1), кшРНК к CFNP-E (линия2) и PSHAG3xFLAGmmCENP-E' 266288 (линия!), использовались для проведения вес терн-блоттинга с применением поликлональных антител к CENP-E (верхняя панель), моноклональных airr-итет к FLAG (средняя панель) и антител к тубулину( нижняя панель) Б, Клетки HeLa трансфицировали с помощью pSHAG3xFl AG вектора (верхняя панель) и контрольного вектора p3xF-LAG (нижняя панель), фиксировали и испотьзовали для проведения
иммунофлуоресценххии с использованием поликлональных антител к CENP-E (средняя панель) моноклональных антител к тубулину (правая панель), человеческих аугоантитст распознающих центромерный район хромосом - АСА (правая панель) и ДАПИ (левая панель) В,
Трансфицированныс клетки окрашивались с помощью моноклональных антител к CENP-h, поликлональных к hBUBRI и MAD1 АСА и ДАПИ Время экспозиции одинаково для контрольных и опытных образцов
Вышеописанные дефекты выравнивания хромосом полностью нивелировались привнесением в вектор pSHAG3xFLAG резистентной к действию кшРНК аллели CENP-E - (молчащие мутации) мм CENP-F) Для этого в полноразмерной кДНК CENP-Е в области, соответствующий району распознавания кшРНК, третий нуклеотид в 3-ех аминокислотах был заменен на незначащий CENP-ECGA^:GC958no , CENP-EA7T"ATC961no
CENP-E'
СТТ-СТС 964п о
При этом последовательность аминокислотных остатков в
рекомбинантном белке не изменялась, однако его мРНК не могла быть распознана кшРНК Полученный конструкт получил название pSHAGSxFLAGmmCENP-E91"8080"01'" 1662 aai дикого типа даннь1д подход позволили экспрессировать в трансфицированных клетках полноразмерную FLAG-рекомбинантную форму CENP-E при одновременном подавлении активности эндогенного белка В клетках, трансфицированных подобным вектором, было отмечено накопление белка CENP-E11 или содержащего определенные мутации с помощью антител к FLAG, несмотря на присутствие в них кшРНК CENP-E (см рисЗ, А) на вестер-блоттинге В популяции клетках, трансфицированных плазмидой pSHAG3xFLAGmmCENP-E Ь1662 " ДИ110Г° ™™ не наблюдалось появление фенотипа Брюса Шара, в профазе, прометафазе и метафазе рекомбинантный FI.AGCi:NP-EJT белок накапливался на кинетохорах и перемещался в район образования борозды деления в момент перехода клетки в анафазу Наличие рекомбинантного FLAGCENP-E ди*°г0 ™1М на кинетохорах не влияло на паттерн распределения hBUBRl или MAD1(cm рис 3,Б) по сравнению с контролем Рис.З Характеристика
кшРНК резистентного аллея -MMCENP-F1 2Ш ™ 1™ro ™" А,
Лиза ты клеток трансфицированных иламидами pSHAG3xFLAG
(линия!), d$HAG3xFLAGmmCENP-
ri 2662 da ликою лини ,
1 (лнння2),
PSHAG3xFLAGmmCENP-E' 2Ш ^(лииия!)
pSHAG3xFI AGmmCTNP-F1
NMl
1 2662 аа
(г1иния4)
АПН_I FLAG_I АСА
(-lag тубулин
ПИ FLAG hBUBRl АСА
рЧНАОЗхП АОмм( I NP-rl 2"2 *М| "" (линия5)
pSHA(JЗxt-LAGммCh^l1-tl 2'"2 " 4 ' (линияб) использова шсь , и» проведения вестерн-блоттипга с исполыованием ашжел к |1Л<т и тубулину Б, Клетки НеЬа [рансфицированные :ми.юи
рЧНАОЗхГ! АОммСРМР-Р1 2"2* дик« о 1Н11а использовались ДЛЯ
иммунофлуоресценции с применением поликлональных антител к Г1 АС и моноклинальных к а тубулину и поликлональных антител к ЬВиВЯ! и МАП1 , АСА и ДАПИ
Распределение трансфицированных клеток по фазам митоза и их митотический индекс (МИ), офажающий процент митотических клеток в популяции (МИ для клеток, трансфицированных pSIIAGммCENP-E1"26<;2aa ™га, составлял 4 1%),
соответствовали таковым в контрольных образцах (МИ нетрансфицированных клеток 3 6%)(см рис 7) Таким образом, нивелирование эндогенного белка, обусловленное активностью кшРНК pSHAGЗxH.AG вектора, полностью компенсировалось привнесением рекомбинаншой полноразмерной копией дикого типа СЕ№-Е, резистентной к кшРНК, что свидетельствует об успешном "спасении" фежмипа И!
полученных результатов следует, что разработанная нами модельная система поможет однозначно оценивать эффект каждой из полученных в ходе работы мутации CENP-E (см ниже) на нулевом уровне активности эндогенного белка
Значение каждого нз микротрубочко-связываюшнх доменов для функционирования CENP-E in vivo. Как было сказано ранее, CENP-E имеет два биохимически различных МТ-связывающих домена - первый МТ-свяэываюший район охватывает 540 ЫШ-тсрминальных а а и содержит АТФ-связывающий домен Второй располагается в СООН-терминальном конце и содержит 554 а а, при этом делеция последних 99 их них полностью ингибирует его МТ-связываюшую активность Однако на данный момент времени не было описано функциональное значение каждого из МТ-связывающих доменов в процессе образовании связей между МТ и кинетохорами in vivo, а также создании напряженности на кинетохорах сестринских хроматид Для проведения этих исследований методом ПЦР-мутагенеза были получены определенные мутации как в NH2-, так и СООН-терминальном МТ-связывающих доменах
ЫН2-теуминш1ьмый МТ-связывающий домен Способность белка CENP-E перемещаться вдоль МТ опосредована его АТФ-связываюшим доменом, расположенным на 1ЧН2-терминальном конце Было показано(Пс1,иса 2001), что для активного передвижения CENP-E вдоль поверхности МТ необходима работа NH2-терминального АТФ-связывающего района, однако in vivo не было показано, является ли он единственно необходимым, равно как не был оценен вклад этого домена в процесс выравнивания хромосом Для ответа на этот вопрос нами была проведена экспрессия в культивируемых клетках полноразмерной рекомбинантной формы белка с нарушенной АТФ-связывающей активностью
На первом этапе работы МН2-терминальный участок CENP-E1501 ™ был использован в качестве матрицы для проведения ПЦР-мутагенеза с использованием пар праймеров TJY1182 и TJY1183 продукт которого содержал замену двух аминокислот в АТФ-связывающем домене Р-петли (замена GXXXXGGK91aa на GXXXXGVE91aa), после чего данный мутантный вариант и дикая форма CENP-E были проклонированы в ЗхН.AG-экспрессирующий и РЕТЗа векторы Для оценки АТФ-связывающей активности рекомбинантного белка FLAGCENP-E1 503 " было произведено исследование его способности связывать МТ с использованием продуктов реакции трансляции in vitro Рекомбинантные белки дикого типа и содержащий мутации в АТФ-связывающем районе (NMT), полученные в ходе проведения реакции трансляции in vitro, инкубировались с МТ в отсутствие или присутствие ЮмМ АТФ Затем производилось ультрацентрифугирование образцов, и белки, связавшиеся с МТ, выпадали в вместе с ними в осадок Как показали результаты подобного исследования (см рис 4, А), рекомбинантная форма CENP-E91"l60ün° дикого типа является чувствительной к наличию АТФ в среде, и при таких условиях не связывается с МТ
(однако, при отсутствии в среде АТФ белок связывается с МТ), в то время как рекомбинантный белок, содержащий мутацию в АТФ-связывающим районе не реагирует на присутствие АТФ - процент белка, связавшегося с МТ независимо от присутствия или отсутствия АТФ, остается неизменным (см рис 4,Б) Фенотип клеток, трансфицированных FLAG рекомбинантной МН2-терминальной CENP-E1"'03 ™ лт,ого ™ги, отличается от такового для клеток, трансфицированных рекомбинантной формой, CFNP-F1"503 ™ NMT В последнем случае внутриклеточное распределение FLAG-сигнала привносимого белка, ассоциированного с МТ, является нечувствительным к наличию в среде АТФ, что было подтверждено методом иммунофлуоресценции с применением антител к ос-тубулину (см рис 4, А), в то время как белок дикого типа диффузно распределен в цитоплазме клеток (в данном случае рекомбинантный белок лишен кинетохорсвязывающего района, расположенного на СООН-конце белка) Данные результаты липший раз свидетельствуют о том, что МТ-связываюшая активность белка CENP-E тесно сопряжена с его АТФ-связывающем доменом, нарушения в структуре которого отражаются на способности рекомбинантного белка связываться с МТ веретена деления, изменяя при этом его внутриклеточный турновер
Рис 4 Эффект мутации ЫШ-терминального АТФ-связываюшего района CENP-E
А, для трансфекции д клеток HeLa
испольповались конструкты О АТФ 3xbLAGCENP-b' 503 ™ NMr (мутант) и ЗхГ! AGCTNP-
5<Л яа таюн» типа / , ЮмМ
Е (контроль) дтф
Через 24 часа клетки фиксировались в отсутствие с АТФ (О АТФ) и при добавлении в среду 10 мМ АТФ с постедуюшей иммунофлуоресиенцией с применением поликлоналъных антител к FLAG и моноклональных антител к тубулину Б, Исследование способности связывать МТ на продуктах трансляции in vitro 3xFLAGCENP-Ei .. lArr (мугант) „ 3XFI.AGCENP-F1*501" """ ™™ (контроль) линии 1,2 в присутствие ОмМ АТФ, линии 3 4 - в присутствие ЮмМ АТФ, линии 5,6- в отсутствие АТФ и МТ
На следующем этапе работы мутация, нарушающая структуру АТФ-связывающего района CENP-E, была получена в виде полноразмерной копии кДНК CENP-E и проклонирована в вектор pSHAG3xFLAG для получения PSHAG3xFLAGmmCENP-Enmt При трансфекции клеток HeLa данной конструкцией отмечалось увеличение количества клеток в митозе (МИ=13%) при наличии в них множественных дефектов выравнивания хромосом Распределение трансфицированных клеток по фазам митоза указывает на накопление их в метафазе (59% от общего числа трансфицированных клеток, находящихся в митозе) с доминантным фенотипом фрагментации веретена деления (см рис 5, 7) Нами было отмечено, что в трансфицированных клетках на начальных стадиях митоза рекомбинантный белок связывается с кинетохорами, однако к моменту вступления
клетки в метафазу большая часть белка перемещается на полюса деления При этом в трансфицированных клетках на этапе метафазы было отмечено появление фенотипа Брюса Шара и фенотипа фра1 ченгации веретена деления (появление клеток с тремя и более (до восьми) полюсами деления, содержащими множественные моноориентированные хромосомы (подтверждено методом иммунофлуоресценции при использовании антител к тубулину (см рис 5)) Мы считаем, что появление фенотипа фрагментации веретена деления обуславливается процессом тредмиллинга рекомбинантно! о белка с кинетохоров к полюсам, оказавшись у которых мутантный CENP-E не способен диссонировать в цитоплазму, поскольку утрачивает способность связывать молекулы АТФ (таким образом, турновер белка нарушается) При этом локальное увеличение белка в сотни раз на полюсах вызывает их физическое разделение, в то время как отсутствие белка ни кинетохорах вызывает дефекты выравнивания хромосом (связывания МТ) Подтверждение подобному предположению было получено при проведении цейграферной фотосъемки
В ответ на возникновение анормального фенотипа трансфицированных клеток происходит активация сигнала внутриклеточной МТР Так, на несвязанных с МТ кинетохорах выявлено увеличение плотности сигнала таких белков МТР, как hBUBRl и MAD1 Увеличение активности МТР обуславливает арест трансфицированных клеток в митозе, что отражается в увеличении МИ популяции (см рис 5) Рис 5 Фенотипы клеток Не1 а при потере белком CENP-E МТ-связывающих районов или жспрессии формы, имширующей его гиперфосфорилированное состояние A Hel а
клетки трансфицировали
пташиаами еолержашими
Г1 ЛОС TNP-Г С мутациями в NH2- и/или ГООН-
юрминальных М I-связывающих районах и при имитации I иперфоефори жрованжм о состояния Для окраски веретена деления использовались
моноклинальные к тубупину поликлональные акжжела к FLAG для определения
панерна экспрессии
рекомбинантно! о CENP-E Б, Для иммунофлуоре-спентного исследования использовались моноклональне антитела к FLAG, поликлональне к HBUBRl и MAD1 (В), и АСА
Таким образом, потеря белком CENP-E его NH2-терминальмоного МТ-связывающего домена (АТФ-связывающей активности) нарушает процесс нормального турновера белка
фенотип Брюса Шара
феиопит фрагментации веретена деления
CENP-E с кинетохоров Накопление белка, содержащего мутацию в АТФ-связывающем районе, на кинетохорах вызвано, скорее всего, процессом тредмиллинга и определяется его неспособностью покинуть центросомы из-за отсутствия АТФ-связывающей активности Возникающе при этом в клетках фенотип фрагментации веретена деления и фенотип Брюса Шара свидетельствует также о нарушении в них МТ-связывающей активности CENP-E, что контролируется системой МТР, вызывающей задержку трансфицированных клеток в митозе
СООН-терминальный МГ-свяшваюший домен Второй МТ-связывающий район CENP-E отделен от моторного домена 1800-2000 аминокислотным стеблем и располагается на СООН-терминальном конце МТ-свяэывающая способность данного домена является резистентной к высокой концентрации NaCL (>0 5М) и нечувствительной к наличию в среде АТФ, однако фосфорилирование данного домена киназами MPF (Liao Н, G Li et al 1994)и р38 MAP (Zecevic, Catling et al 1998) резко угнетает его МТ-связывающие свойства Наличие второго МТ-связывающего домена может предположить наличие у CENP-E активности, направленной на сшивку МТ, что в свою очередь объясняет появление данного белка в зоне образования первичной перетяжки начиная с момента ранней анафазы Однако на сегодняшний день функциональное значение данного домена in vivo остается неизученным
В процессе работы район CENP-F195*26112»« был использован для очистки GST-рекомбинантной СООН-терминальной формы CFNP-E из бактерий, которая использовалась для проведения m vitro исследований Нами было показано, что эгог белок способен активировать полимеризацию и стабилизацию МТ В частности, при концентрации 0 5 мкМ GST-CFNP-F1958-2662 ак стимулирует полимеризацию МТ Кинетика полимеризации МТ убыстряется с увеличением количества рекомбинантного белка до 3 5 мкМ (рис 6 А, В) При дальнейшем увеличении концентрации до ЮмкМ мы наблюдали сшивание МТ, подобное тому, что происходит в зоне первичной перетяжки (рис 6,В) Дополнительно было показано, что СООН-терминальный конец CENP-E способен также предо!вращать деполимеризацию МТ, при этом данная особенность является зависимой от концентрации рекомбинантного белка (данные получены в сотрудничестве с лабораторией Л Касамирес, Сиэтл, США (см рис 6,Г)) Рис 6. Исследования in vitro функциональной активности СООН-терминального МТ-связываюшего района CENP-E195f! 2662 33 А Исследования полимеризации МТчек Различные
В
г
концентрации
рекомбинантного GST-CENP-E'958-2662 аа
инкубировались с ]8мкМ тубулнна свиньи О Г),,, измерялось в различные моменты времени Б,В -
Фазово-контрас ная
микроскопия Ml,
полимеризованных в
присутствие 3 5 мкМ
(верхняя панель) и 10 мкМ (нижняя панель) рекомбинантного gst-cenp-E1958-2662 а;1 с использованием о&ьектива lOOxNAl 4 Г, Исследования по стабилизации МТ МТ, полимеризованные из тубулииа свиньи разводились в буфере РЕМ с рмчичмой концентрацией рекомбинантного GST-CFNP-£1958-2662 аа, OD}50 измерялось в различные моменты времени
Ранее было показано, что деления 99 терминальных аминокислотных остатков вызывает полную потерю рекомбинантным белком CENP-E1958-2'*'2 ш его МТ-связывающей aKTHBHOCTH(Liao Н, G Li et al 1994) В ходе выполнения данной работы удалось смоделировать ситуацию, когда в клетках рекомбинантная полноразмерная копия белка будет экспрессирована в отсутствие 99 С ООН-терминальных аминокислотных остатков (СД99) - эксперссирующий вектор pSHAG3xFLAGmmCENP-Е, содержащий стоп-кодон в положении 2562 аа - pSHAG3xFLACiMMCENP-ECa" Этот вектор был использован для трансфекции клеток HeLa, в результате которой было выявлено, что экспрессия рекомбинантного белка FLAGCENP-ECi99 не замещает эффект, привносимый кшРНК (потерю активности эндогенного белка), как это делает FLAGCENP-E ди*ого ™ш, и вызывает увеличение МИ более чем в два раза (МИ FLAGCENP-ECi" -трасфицированных клеток составлял 9 6%) Также было отмечено, что экспрессия рекомбинантного белка CENP-E, лишенного последних 99 аминокислотных остатков, приводит к появлению фенотипа Брюса Шара (в 10% случаев) и резкому снижению количества клеток на ¡авершающих этапах миюза (ана-и гелофазах) (см рис 7) На монополярных кинетохорах трансфицированных клеток было отмечено значительное увеличение сигнала белков МТР, таких как hBUBRl и MAD1, что свидетельовуе! о задержке лих клеток в митозе Однако большинство трансфицированных клеток (82%) находятся в прометафазе митоза
На основании полученных результатов нами было предположено, что СООН-терминальный МТ-связывающий домен необходим для правильною функционирования белка CENP-E на ранних этапах митоза, в частности, выполнения таких его функций, как полимеризация и стабилизация концов МТ, захваченных кинеюхорами Помимо этою, мы полагаем, что способность данного домена стимулировав полимеризацию МТ может быть использована хромосомой в процессе инициации растущей из кинетохора (Mitchison and Knschner М 1985) в сторону противоположного полюса деления.
Нарушения в структуре второго МТ-связывающего домена CENP-E приводят к проявлению фенотипа Брюса Шара и задержке клеток в митозе вследствие активации системы МТР, при этом распределение трансфицированных клеток по фазам митоза говорит о накоплении клеток преимущественно в прометафазе, что лишний раз свидетельствует о нарушении МТ-связывающей активности в целом Эффекты потери двух МТ-связываюших доменов В ходе выполнения диссертационной работы была создана в процессе ПЦР-мутагенеза полноразмерная копия кДНК CENP-E, лишенная как NH2-, так и СООН-терминальных МТ-
связывающих доменов Полученная pS Н AG 3 х F' I. A G м м С FNP- l-NMT+Ca'w гшазмида использовалась для трансфекции клеток При анализе полученных результатов было выявлено увеличение МИ трансфицированных клеток (МИ=9%) и накопление митотических дефектов, аналогичных описанным выше - появление фенотипа Брюса Шара и фрагментации веретена деления (см рис 5) При этом подобные клетки накапливались в метафазе (64% от общего числа трансфицированных митотических клеток) с доминирующим фенотипом Брюса Шара Также, в этих клетках наблюдается активация системы МТР (отмечено накопление сигнала hBUBRl и MAD1 на кинетохорах, неоккупированных МТками(см рис 5, панель Б и В)) Мы считаем, что низкий МИ скорее всего вызван гибелью трансфицированных клеток на более ранней стадии культивирования, чем в тех случаях, когда мутации присутствуют только в одном из МТ-связывающих доменов
Итак, проведенный нами анализ показывает, что для правильного функционирования CENP-E на кинетохорах in vivo необходимо наличие двух МТ-связываюших доменов одновременно В результате проведения гидродинамических исследований нативного CENP-E было выяснено, что данный белок связывается с кинетохором своим СООН-концом, в то время как МЕ-терминальный МТ-связывающий район экспонируется для связывания с МТками Мы предполагаем, что СООН-терминальный МТ-связывающий домен вносит свой вклад в постоянное добавление субъединиц а-тубулина к плюс-концу кМТки растущей непосредственно из кинетохора или стабилизирует плюс-конец захваченной от противоположного полюса МТки Параллельно с этим ЫН2-терминальный домен за счет расходования энергии АТФ способен передвигаться вдоль МТ, что обеспечивает физическое перемещение хромосомы, связанной с CENP- Е через СООН-конец белка, в пространстве Таким образом, совместный вклад двух МТ-связывающих доменов определяет функционирование CENP- Е в процессе конгрессии. Нарушение функций хотя бы одного из них приводит к потере напряженности на кинетохорах (см ниже) и накоплению в клетках дефектов связывания хромосом и МТ
Значение фосфорилирования CENP-E в процессе митоза. Ранее было установлено, что регуляция активности CENP-E осуществляется путем его фосфорилирования В исследованиях проведенных in vitro было показано, что CENP-E является субстратом как минимум двух киназ - MPF и p38MAP(Zecevic, Catling et al 1998) При этом фосфорилирование CENP-E осуществляется по строго консервативным сериновым остаткам в положениях S2567, S2570, S2601, S2616 аа и ингибирует МТ-связывающую активность СООН-терминального домена послсднсгоОлао Н , G Li et al 1994) Мы решили оценить функциональное значение фосфорилирования CENP-E in vivo Для этого аминокислота серии в четырех известных сайтах фосфорилирования в процессе ПЦР-мутагенеза заменялась на глутаминовую кислоту при последовательном использовании двух пар праймеров - TJY1191 и TJY1192, TJY1196 и TJY1197 с получением вектора для экспрессии в клетках - pSHAG3xFLAGmmCENP- es2567e s2570e S2601E S2616E ÍS 'E) pjpH rr0M полученный мутант имитировал гиперфосфорилированное
состояние CENP-E белка Данный вектор использовался для трансфекции клеток HeLa Как и в случае трансфекции МТ-связывающих мутантов, оверэксперсиия гиперфосфорилнрованной формы в векторе pSHAG3xFLAG не замещала эффекты ингибирования функций эндогенного CENP-E В результате трансфекции плазмидой pSHAG3xFLAGMMCENP- Е <s^E) клетки останавливались в митозе с МИ = 10 5% Также, в популяции трансфицированных клеток, было отмечено появление фенотипа Брюса Шара (10% от общего числа митотических клеток), однако распределение клеток по фазам митоза свидетельствует о накоплении последних в профазе (89% от всех трансфицированных митотических клеток, (см рис 7), нежели в метафазе, (при этом все метафазные клетки проявляли фенотип Брюса Шара)) На неоккупированных кинетохорах трансфицированных клеток также как иве случаях потери МТ-связывающей активности выявлялась активация сигнала МТР, через накопление белков hBUBRl и MAD1 (см рис 5).
На основании полученных данных мы сделали заключение о юм, чш при экспрессии in vivo рекомбинантной формы белка CENP-E, имитирующей гиперфосфоршшрованное состояние, клетки теряют способность связывать МТ веретена деления, что объясняет их накопление в прометафазе Как следует из полученных нами данных, гиперфосфорилирование CF.NP- F нарушает функции данного белка на кинетохорах, поэтому мы считаем, что для поддержания правильного функционирования CENP-E в процессе связывания МТ веретена деления пул данного белка, находящийся на кинетохорах, должен поддерживаться в гипофосфорилированном состоянии, в то время как в цитоплазме клетки киназами MPF и р38 MAP осуществляется фосфорилирование свободного CFNP-F, вызывающее его дезактивацию, чем достигается регулирование его активности Рис 7. Распределение трансфицированных клеток HeLa по стадиям митоза Трансфицированные митотическне клетки идентифицировались по наличию FLAG-сигнала и подразделялись на стадии прометафазы, метафазы (без или при наличии монополярных хромосом), анафазы и телофазы Для каждой используемой плазмиды подсчитывалось более 500 митотических клеток, экспрессиирующих FLAG-сигнал Группа клеток 1- нетрансфицированные клетки НеТл Группа клеток 2- HeLa, трансфицированные pSHAG3xFLAGmmCENP-E яяшго Группа клеток 3- HeLa, трансфицированные pSHAG3xFLAGmmCENP-E С4" Группа клеток 4- HeLa, трансфицированные PSHAG3xFLAGmmCENP-E NM1 Группа клеток 5- HeLa, трансфицированные pSHAG3xFLAGmmCENP-E nmt*ca99 Группа клеток 6- HeLa, трансфицированные pSHAG3xFLAGmmCENP-E ь '' (п-прометафаза, м-метафаза, а-анафаза, т-телофаза)
f ф "
i \ "' '' " *
5 „
х S £ 1 й
А Я
i ■ я.......
1
V 1
* ft п п ц _ ti
3F п м а т п м а т п м а т п м а т п м а т п м а т
Нфенопл фрагментами веретена деяния 38 26
В фенотип Epoca Шара 3 10 16 34 10
□ нерма^ньи фенотип 51 32 8 7 58 29 6 4 82 7 1 0 ÍI 5 1 0 36 4 0 0 69 1 0 0
2 2 3 4 5 6
Опенка напряженности на кинетохорах сестринских хромосом при нарушении микротрубочкосвязывающей активности CENP-E или его регуляции. Наиболее полно состояние кинетохоров в трансфицированных клетках можно оценить через значение напряженности между сестринскими хроматидами Так, при присоединении МТ веретена деления к каждому из сестринских кинетохоров хромосома испытывает на себе противоположные по направлению силы, возникающие вследствие работы белков-моторов Напряженность на кинетохоре прямо пропорциональна расстоянию между сестринскими кинетохорами, ее измерение эквивалентно расстоянию между центрами АСА-локусов (антител, распознающих центромеры хромосом)
К моменту образования метафазной пластинки напряженность между сестринскими кинетохорами достигает максимума и соответствует 1 25 цм Тогда как нулевая напряженность, измеряемая при обработке культуры нокадазолом, соответствует 0 77дм Как и было показано ранее, трансфекция клеток с использованием pSHAG3xFLAG вектора, кодирующего миРНК для гена CENP-E, приводит к падению напряженности на кинетохорах до 0 85 цм В результате проведения "спасения" фенотипа - трансфекции клеток с помощью PSHAG3xFLAGmmCENP-E ш™ого тк™ - удалось практически полностью восстановить напряженность до нормального значения - 120 цм При трансфекции клеток плазмидами, приводящими к утрате белком CFNP-E МТ-связывающих способностей, были получены следующие результаты - при трансфекции клеток плазмидами PSMAG3xFI.AGmmCFNP-í:cí'w и р8НАСЗхРЬЛОммСЕт>-Е*мтнапряженность на кинетохорах падала до 0 85 и 0 88 цм соответственно, в то время как трансфекция плазмидой pSHAG3xKI.AGMMCFNP-Eaw,NMT приводила к падению напряженности до 0 79 цм, что сравнимо с состоянием нулевой напряженности (0 77 цм) (см табл I) Напряженность на кинетохорах клеток, трансфицированных с помощью pSHAG3xFLAGmmCENP-E плазмиды, имитирующей гиперфосфорилированное состояние, равнялась 0 81 цм, что также существенно ниже нормы Табл. 1 Напряженность между сестринскими кинетохорами при трансфекции клеток HeLa различными типами плазмид
pSHAGFLAG cim pSHAGFLAGSKfI pSHAGFLAG'™'* Lm pSHAGFLAG" * pSHAGFLAG"
Среднее разделение сестринских кинетохоров
рм 0 85 0 88 0 79 0 81 1 20
CP 0 25 0 22 0 13 0 09 0 21
Ранг 1 1-0 7 1 1 0 8 0 95-0 71 0 98-0 72 1 42-1 06
Кол-во измерений 11 15 18 13 13
Таким образом, на основании полученных результатов мы полагаем, что белок CENP-E необходим для правильного функционирования аппарата митотического деления клетки Изменение в структуре или нарушение функций каждого их МТ-связываюших доменов данного белка приводит к потери хромосомой способности
образовывать правильные связи с МТ веретена деления, и как следствие - потерю напряженности между сестринскими хроматидами, что отражается на процессе клеточного деления в целом Существенно, что для правильного функционирования in vivo CENP-E в процессе клеточного деления, пул данного белка, находящийся на кинетохорах, должен поддерживаться в гипофосфорилированном состоянии
Многочисленные исследования ((Wood, Sakowicz et al 1997, Tanudji, Shoemaker et al 2004)) указывают на то, что CENP-E является необходимым, но не единственным компонентом, определяющим связывание кинетохора и МТ Стабильная связь между кМТ и кинетохорами является результатом сопряженного действия различных белков Например, кинетохоры при истощении CENP-E все же способны связываться с кМТ через другие белки Однако подобное взаимодействие не является функциональным, что дает нам основание высказать предположение о первичной роли CENP-E в формировании напряженности
Учитывая тот факт, что каждая кМТка одномоментно связывается с множеством кинетохорных белков, предполагается, что данное взаимодействие строго контролируется (Cleveland, Мао et al 2003) Взаимодействие различных беков на кинетохоре в процессе формирования напряженности является крайне сложным и далеким от окончательного понимания процессом Одним из примеров в ряду таких взаимодействий может послужить взаимоотношения мевду CENP-F и киназой МТР-hBUBRl, которое относится к первостепенным (Chan 2003)
Функциональные основы взаимодействия CENP-E с киназой митотичеекой точки рестрикции - hBUBRl Изучение функций полных гомологов дрожжевого белка BUBI, мышиного BUBI и человеческого hBUBRl указывают на основополагающую роль этих белков в процессе митотического ареста клеток при наличии дефектов формирования полюсов деления или ошибочного формирования связей между кинетохорами и МТ веретена деления Так, при ингибировании активности подобных белков клетка получает возможность завершить процесс деления при наличии дефектов взаимодействия кинетохоров хромосом и МТ полюсов деления, например при наличии в клетке фенотипа Брюса LLIapa(Chan, Jablonski et al 1999) Данное наблюдение и тот факт, что hBUBRl и CFNP-F формируют стабильный комплекс in vivo (Chan, Jablonski et al 1999), дают основание полагать, что через взаимодействие данных белков происходит передача сигнала МТР
В нескольких работах m vitro было показано, что CENP-F способен активировать киназную активность hBUBRl (Мао, Abrieu et al 2003) Однако, значение подобного взаимодействия in vivo оценено не было Поэтому на последнем этапе работы мы провели исследования, посвященные выяснению данного вопроса
Взаимодействие между hBUBRl и CENP-E впервые было показано в лаборатории проф. Тима Ена в двухгибридной системе с использованием CENP-E1958"
662311 в качестве эатравки(СЬап, 1аЫо1«к1 й а1 1999) В ходе моделирования вторичной структуры СЕ№-Е нами было выявлено наличие четырех спиральных доменов в СООН-терминальном районе (см рис 8, А), которые, как мы полагали, могут отвечать
за взаимодействие с hBUBRl Участок CENP-E
' был проклонирован в вектор
p3xFLAG и использован в процессе ПРЦ-мутагенеза для получения делеиий каждой из петель В результате мы получили четыре различные плазмиды - p3xFLAG CENP-Е195М662 .til (пара праймеров TJY 1838 и TJY 1850), p3xFLAG CENP-E1958"2662 38 del2 (пара праймеров TJY 1839 и TJY 1840), p3xFLAG CFNP-E1958"2662"'1'13 (пара праймеров TJY 1841 и TJY 1842), p3xFLAG CENP-E1958"2662 02 dd4(napa праймеров TJY 1843 и TJY 1844) Данные плазмиды были использованы для трансфекции клеток HeLa с последующим анализом их методом иммунопреципитации с эндогенным hBUBRl В итоге нами было показано, что деления петли I существенно уменьшает взаимодействие рекомбинантного FLAG CENP- Г.|95я"2ы'2а'"1с" и hBUBRl, в то время как деления других районов не оказывает существенного влияния на данное взаимодействие (см рис 8, Б)
Рис 8. Эффект нарушения взаимодействия CENP-F и hBUBRl А Вторичная структура С ООН-терминального района CENP-E1958"2661 "(по данным программы Mac Vector) Б, Результаты иммунопреципитации с а в
использованием поликлональных антител к hBUBRl лизатов клеток, трансфицированных p3xFLAG CENP-E1958*2662 (dell) p3xFLAG CENP-E195* 2662 ** del2(del2), p3xFLAG CENP-F1958"2662 " dd3 (del3), p3xFLAG CENP-E1958"2662 " ^(deM и p3xFLAG CENP-E1958'2662 " дни,,<' ™т{суп-супернатант, ос -осадок) В, Результаты иммунопреципитации с использованием поликлональных антител к hBUBRl лизатов клеток, трансфицированных PSHAG3XFLAGMMCENP- F 12662 " de" и pSHAG3xFLAGmm CENP- E1*
2662 а« тк^го ткп*. г ре1удьта7Ъ1
иммунопреципиташти с
использованием поликлональных hBUBRl анти1ет ли5атов клеток трансфицированных PSHAG3xFLAGmm( ENP- Е!ак Д, F Киназная реакция с применением l-FLAGCFNP-Г 12662 « ли, тип» FLAGChNP-h
ах ««.но ж.ш ^ FLAGCFNP-E 1 mi " да«« ти™ 4 FLAGCENP-E 12662" ^1 , 5- эндогенного hBUBRl МТ и гистона НЗ в качестве субстрата Ж Результат иммунофлуоресцентного исследования на клетках HeLa,
трансфицированных pSI IAG3xi LAGmmC LNP-Fddl, с применением моноклональных
антител к FLAG, поликлональных к hBUBRl и MAD1, АСА (подробное описание рис 16Ж см в тексте) 3, Результаты цейтраферной фотосъемки Верхняя панель - клетки HeLa, содержащие GFP-форму гистона Н2В, были микроиньецированы плазмидой p3xFLAG CENP-E12 2 1н™ и
синхронизированы при помощи ЗН-тимвдинового блока Время 0 сек соответствует моменту распада ядерной оболочки Нижняя панель - аналогичные клетки были микроиньецированы плазмидой PSHAG3xFLAGmmCENP- Е ,'ж'2"6е11 и синхронизированы с использованием ЗН-тимндинового блока
На следующем этапе исследований деления петли I была привнесена в вектор pSHAG3xFLAGmmCENP- F '~ш'2 " диюг0 шт с применением соответствующей пары праймеров После проведения трансфекции и сходной с вышеописанной реакцией иммунопреципитации мы обнаружили, что FLAGCENP- е''ш2 " ddl несмотря на отсутствие петли I способен взаимодействовать с киназой hBUBRl (см рис 8,В) Подобное наблюдение натолкнуло нас на мысль о существовании дополнительного домена в полноразмерной копии CENP- Е для взаимодействия с hBUBRl Данное предположение нашло свое подтверждение - при экспрессии в клетках Нетерминальных 1331 аминокислотных остатков Было показано, что этот район CENP- Е способен связывать hBUBRl Таким образом, мы может говорить о существовании как минимум двух районов CENP-F, ответственных за взаимодействие с hBUBRl (см рис 8, Г).
Ранее было опубликовано, что в киназной реакции in vitro эндогенный CENP- Е активирует рекомбинантный GST-hBUBRl(Yao, Abneu et al 2000; Mao, Abneu et al 2003) В нашем исследовании мы использовали FLAG-конструкции CENP-E -PSHAG3xFLAGmmCENP- Е1'2662 " ди,,оп' ™* , PSHAG3xFLAGmmCENP- Е1"2662 а" dc" , PSHAG3xFLAGmmCENP- е|958"26й2"к Jm""° ™m , pSHAG3xFLAGMMCENP-EM331aK, полученные из лизатов трансфицированных HeLa и эндогенный hBUBRl из лизатов HeLa, синхронизированных с помощью двойного ЗН-тимидинового блока в Gl-фазе (активность hBUBRl минимальна) Нами было установлено, что используемый в реакции hBUBRl обладает изначально низким уровнем активности (линия 5 на рис 8, Д), однако добавление в реакцию полноразмерной копии FLAGCENP- р'-2662!и1;ш1юго™г1а активировало киназную активность hBUBRl, что отражается в фосфорилировании субстрата - гистона НЗ и аутофосфорилировании киназы Привнесение FLAGCENP-Е1958 2Ша* дхю.с (соон-терминальная область), и FLAGCbNP-El l331'K (NH2-терминальная область) приводило к сходным результатам, что говорит о корреляции способности физически связываться с hBUBRl и активировать киназу В свою очередь полноразмерная копия , лишенная петли 1 в своем СООН-терминальном районе -FLAGCENP- е1'2662"1"1®11, активирует киназу hBUBRl в значительно меньшей степени, на основании чего нами было предположено, что для правильного функционирования CENP-E требуется наличие двух доменов активации hBUBRl, переключение активности между которыми возможно определяет состояние киназы
В начале нашего исследования мы предполагали, что hBUBRl является механосенсором, регулирующим взаимодействие CENP-E и МТ Чтобы проверить данное предположение мы добавили в киназную реакцию с использованием
FLAGCENP- E1"2662 " д""ого ™™ и эндогенного hBUBR 1 полимеризованные in vitro MT (рис 16 F) При этом мы наблюдали значительное падение киназной активности в образце, содержащем МТ Полученные нами результаты дают достаточно оснований сформулировать рабочую гипотезу о том, что в момент прикрепления МТ конформация CENP-E изменяется таким образом, что два активирующих района экспонируются внутрь белка В такой конформации CENP- Е не может активировать hBUBRl, и сигнал МТР выключается, что позволяет клетке закончить деление и выйти из митоза.
При трансфекции клеток с использованием pSHAG3xFLAGmmCENP- Е1"2"'2""1'" мы наблюдали накопление сигналов белков МТР на кинетохорах - на рис 8Ж представлены иммуноокрашивание трансфинированных клеток с использованием антител к MAD1 и hBUBRl На первой панели представлена трансфицированная клетка, все кинетохоры которой являются MADl-положительными На нижней панели - трансфицированная и контрольная (нетрансфицированная) клетки - при использовании hBUBRl-антител мы наблюдали значительное (примерно трехкратное) увеличение сигнала на кинетохорах трансфицированных клеток Данные иммуногистохимии говорят об активации сигнала МТР в случае нарушения взаимодействия CENP- Е и hBUBRl В дополнение к этому мы провели цейтраферную фотосъемку клеток, предварительно инъецированных плазмидой PSHAG3xFLAGmmCFNP- Е1 2662 ™га или PSHAG3xFLAGmmCENP- Емш "" ddI плазмидой соответственно При этом мы использовали линию клеток HeLa, содержащую GFP-форму гистона Н2В, что позволило нам наблюдать процесс деления индивидуально инъецированной клетки в реальном времени (см рис 8, 3) Мы наблюдали вступление клеток в митоз, однако на стадии прометафазы все без исключения инъецированные клетки вступали в апоптоз, в отличие от контрольных (иньецированных pSHAG3xFLAGmmCENP- Е1"2662" д"к"го ™"а) клеток, что лишний раз свидетельствует о гиперактивированном состоянии МТР в инъецированных клетках вследствие отсутствия взаимодействия между CENP-E и hBUBRl
Функциональное значение взаимодействия CENP-E и hBUBRl для пролиферации клеток изучалось нами на примере использования ингибитора киназы МТР Aurora В (Hauf, Cole et al 2003) - гесперадина, на линиях опухолевых клеток простаты РСЗ и молочной железы MCF7 Нами было показано, что при угнетении функций Aurora В наблюдается остановка пролиферации раковых клеток при наличии в них множественных митотических дефектов вследствие утраты активности hBUBRl и потери CFNP-E с кинетохоров митотических хромосом (Ладыгина, Лацис et al 2005) Таким образом, полученные в данной работе результаты могут быть использованы для понимания молекулярных механизмов ингибирования митотических киназ и кинетохорассоциированных беков новым поколением фармакологических агентов, способных необратимо подавлять рост гтролиферирующих опухолевых клеток
Обобщая результаты, полученные на данном этапе работы, мы полагаем, что нам удалось наглядно показать значение внутриклеточного взаимодействия белка
CENP-E и киначы hBUBRl Мы считаем, что кинетохориый пул hBUBRl регулирует активность МТР (процесс выхода из митоза) как механосенсор, улавливающий присоединение кМТ к хромосомам, обусловленное работой кинезина CENP-E В отсутствие МТ на кинетохоре CENP-E находится в напряженном состоянии, при этом два его активирующих домена экспонируются на поверхность белка, что активирует киназную активность hBUBRl (МТР), и клетка останавливается в митозе до момента связывания кМТ от противоположного полюса (или инициации роста кМТ из самого кинетохора) При присоединении кМТ к кинетохору конформация CENP-E изменяется таким образом, что сайты активации hBUBRl экспонируются внутрь молекулы, что ингибирует киназную активность hBUBRl, что в свою очередь вызывает инактивацию сигнала МТР, и переход клетки в состояние анафазы
ВЫВОДЫ
1. В ходе выполнения диссертационной работы впервые была получена полноразмерная копия кДНК человеческого гена CENP-E, которая при использовании в модельной системе in vivo в сочетании с технологией pSHAG (использование короткошпилечных РНК) полностью компенсировала эффекты ингибирования активности эндогенной формы этого белка.
2 Два микротрубочкосвязывающих района CENP-E (как NH2-, так и СООН-терминальный) одинаково важны для создания функционального взаимодействия между кинетохором и микротрубочками веретена деления и для формирования напряженности между сестринскими хроматидами Осуществление функций CENP-E на начальных этапах митоза обеспечивается способностью СООН-терминального домена стабилизировать и полимеризовать захваченные плюс-концы кинетохорных микротрубочек, в то время как ЫН2-терминальный домен обеспечивает шаговое передвижение молекулы CENP-E в комплексе с хромосомой вдоль микротрубочки Элиминация любого из этих доменов приводит к активации сигнала митотической точки рестрикции и как следсгвие, задержку клеток в ми юзе, в связи с потерей напряженности на кинетохорах сестринских хроматвд и появлением дефектов связывания кинетохоров и микротрубочек веретена деления
3 Создание полноразмерной копии гена CENP-E, искусственно имитирующей его гиперфосфорилированное состояние, позволило показать ш vivo, что фосфорилирование СООН-терминального района CENP-E ингибирует его микротрубочко-связывающую активность. Из чего нами был сделан вывод о том, что пул CENP-E, находящийся на кинетохорах, в процессе митоза поддерживается в гипофосфорилированном состоянии для активного связывания микротрубочек, в то
время как в цитоплазме клетки митотические киназы осуществляют фосфорилирование свободного CENP-E, вызывая тем самым его дезактивацию
4 Взаимодействие кинетохораесоциированного белка CENP-E и киназы митотической точки рестрикции hBUBRl является необходимым условием правильности передачи сигнала митотической точки рестрикции. Нами было показано, что после завершения процесса выстраивания хромосом у клеточного экватора, CENP-E подавляет киназную активность hBUBRl, что обуславливает блокировку сигнала митотической точки рестрикции, в результате чего клетка получает возможность завершить деление При нарушении подобных взаимоотношений мы наблюдали вступление клеток в митоз, его незавершение и быструю клеточную гибель, что, как мы полагаем, является следствием гиперактивации системы митотической точки рестрикции. Полученные нами результаты позволяют считать, что киназа hBUBRl является механосенсором, контролирующим взаимодействие CENP-E и микротрубочек (то есть процесс выравнивания хромосом), активность которого ингибируется присоединением микротрубочки к CENP-E.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Ладыгина Н Г., Лацис Р В, Ен Т Эффект применения фармакологического агента гесперадина на культурах опухолевых клеток молочной железы и просты Вопросы биомедицинской химии, т52, №2, стр 170-176, апрель 2005
2 N Ladygina, В S Spittle, L. Cassimeris, R. Latcic, Т. Yen., The C-terminal microtubule binbing domain of CENP-E is essential for its function at the kinetochore Current biology, принято в печать, март 2005.
3 N Ladygina, R Latcic, T Yen Interaction between CENP-E abs hBUBRl is important for metaphase-anaphase transaction 44-ая ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (American Society of Cell Biology), Вашингтон, США декабрь 2004.176.
4 N Ladygina, В S Spittle, L Cassimeris, R Latcic, T. Yen Importance for CENP-E microtubule binding domains for its function 43-ая ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (American Society of Cell Biology), Сан-Франциско, США декабрь 2003 1463-1464
5 N Ladygina, Т Yen C-terminal domain of CENP-E is important for hBUBRl binding Седьмая ежегодная научная конференция имени Эдварда Д Ластбайдера
« Филадельфия, США, июнь 2002. 52-53.
РНБ Русский фонд
2006-4 6551
»"7924
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ладыгина, Надежда Григорьевна
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Процесс прикрепления хромосом к микротрубочкам веретена деления.
1.1 Организация митотического веретена деления.
1.2 Инициация взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами митотических хромосом.
1.3 Передвижение хромосом во время прометафазы.
1.4 Динамика микротрубочек веретена деления в процессе митоза.
Глава 2. Механизм передвижения митотических хромосом.
2.1 Роль белков-биологических моторов в процессе передвижения хромосом.
2.2 Турновер микротрубочек в процессе передвижения хромосом.
Глава 3.Значение взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами в регуляции митотической прогрессии.
3.1 Точка перехода митоза.
3.2 Сборка компонентов системы точки перехода на кинетохоре.
3.3 Динамика компонентов митотической точки перехода.
Глава 4. Кинетохорассоциированный белок Е (СЕИР-Е).
4.1 Роль белка СЕ№-Е в передвижении хромосом во время митоза.
4.2 Роль белка СЕ№-Е в регуляции расхождения хромосом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1.Полимеразная цепная реакция и ПЦР-мутагенез.
2. Культивирование клеточных линий НеЬа, НеЬа СЕР Н2В 7.1 и НеЬа СЕР а-тубулин.
3. Трансформация клеток HeLa и иммуноокрашивание слайдов.
4. Микроиньекции ДНК и цейтраферная фотосъемка.
5. Реакция трансляции in vitro.
6. Исследование способности связывать микротрубочки.
7. ПААГ и иммуноблоттинг.
8. Реакция иммунопреципитации и киназная реакция.
9. Анализ состояния клеточного цикла.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль кинетохорассоциированного белка CENP-E в митотическом делении клеток млекопитающих"
Существование биологических видов, а, следовательно, и феномена жизни как такового, целиком зависит от точности передачи генетической информации как по вертикали - от организмов родителей к потомкам, так и по горизонтали - от одной соматической клетки к другой в процессе онтогенетического развития многоклеточных организмов. Для правильной передачи генетической информации исключительно важны как основные механизмы функционирования главной генетической системы, обеспечивающие воспроизведение генетической информации путем удвоения молекул ДНК - системы репликации; так и молекулярные механизмы, обеспечивающие расхождение удвоившихся хромосом между дочерними клетками у про - и эукариот в процессах митоза и мейоза. О
Учитывая тот факт, что 2,5x10 клеток человека подвергаются делению в каждый данный момент времени, появление хотя бы одной ошибки в данном процессе повлечет за собой возникновение множества генетически анормальных клеток на протяжении жизни индивидуума в целом.
В процессе деления клетка подвергается комплексу высоко организованных морфологических изменений, которые привлекают внимание биологов больше 100 лет, со времен открытия Вальтером Флемингом в 1882 году процесса, названного митозом. Основное событие митоза - это разделение реплицированных хромосом на две эквивалентные и чаще всего, физически обособленные клетки. Точность расхождения хромосом определяется сложными механическими процессами, главными из которых являются выравнивание и сегрегация хромосом, для правильного протекания которых необходимо прикрепление хромосом к веретену деления. Прикрепление - процесс стохастический, при этом хромосомы прикрепляются к микротрубочкам посредствам прямых столкновений. Это объясняет, почему хромосомы подвергаются выравниванию у клеточного экватора несинхронно, а также свидетельствует о необходимости наличия системы специального контроля - так называемой точки рестрикции (точки перехода митоза) (МТР).
Система точки рестрикции в клетках млекопитающих представлена эволюционно-консервативной группой белков, которая контролирует взаимодействие кинетохора и микротрубочек, предотвращая переход клетки в состояние анафазы при наличии невыравнеиных у клеточного экватора хромосом и, как следствие, появление в популяции клеток с неравномерным распределением генетической информации - анеуплоидов. Генетические и биохимические исследования выявили мишень митотической точки рестрикции - это макрокомплекс циклосом, известный также как Anaphase Promoting Complex (АРС/С), являющийся мультисубьединичной убиквитин-зависимой протеазой, подвергающей деградации такие ключевые митотические белки, как секурин и циклинВ, обуславливая тем самым расхождение хромосом и завершение митоза (Maiato et al., 2004; Rieder and Salmon, 1998). Ингибирование АРС/С осуществляется комплексом белков митотической точки рестрикции, получившим название MCC (Mitotic Checkpoint Complex), через взаимодействие с субстратом АРС/С - Cdc20.
Впервые выявленные в дрожжевых клетках белки МТР являются высоко консервативными в эволюционном плане. Гомологи дрожжевых BUB1, BUB3, MAD1, MAD2, MAD3 и Mpsl белков были идентифицированы у высших организмов, где также была показана их роль в регуляции митотической точки рестрикции. Характерной чертой представителей этой группы белков является их локализация на кинетохоре, где, как предполагается, они регулируют активность последних в процессе выстраивания хромосом. Наличие в клетке неприкрепленного к микротрубочкам веретена деления кинетохора вызывает увеличения плотности сигнала белков МТР на подобной хромосоме, что еще раз подтверждает, что белки митотической точки рестрикции чувствительны к взаимодействию кинетохоров и микротрубочек. На этапе, когда хромосома достигает состояния метафазного выравнивания, такие белки точки перехода как MAD1 и MAD2 полностью покидают кинетохоры, в то время как сигнал BUB1 и hBUBRl уменьшается в несколько раз(СЬап, 2003; King et al., 2000а).
Расхождение хромосом осуществляется и отчасти контролируется белками-биологическими моторами, локализующихся на кинетохорах клетки. Представителем данной группы является кинезиноподобный Centromere-associated Protein Е (CENP-E) белок, обеспечивающий формирование контакта между кинетохором и микротрубочками (МТ). В структуре данного белка отмечают два микротрубочко-связывающих домена, расположенных на NH2- и СООН-концах, роль которых на сегодняшний день остается до конца не изученной; кинетохорсвязывающий домен, а также домен взаимодействия с белками митотической точки рестрикции, в частности киназой hBUBRl. Функциональные исследования CENP-E показали, что активность этого белка регулируется системой митотической точки рестрикции. Так, клетки HeLa с делецией CENP-E-гена подвергаются аресту или существенной задержке в митозе. Молекулярная связь CENP-E с системой точки рестрикции была показана на примере прямого взаимодействия данного белка с hBUBRl киназой, гомологичной MAD3 и BUBI белкам точки рестрикции почкующихся дрожжей. И что наиболее важно, было показано, что митотический арест, индуцируемый отсутствием CENP-E, зависит от киназной активности hBUBRl. Учитывая все вышеприведенные результаты и тот факт, что hBUBRl также локализуется на кинетохоре, можно предположить, что CENP-E и hBUBRl являются неотъемлемой частью механосенсерного комплекса, который связывает функционирование кинетохоров и системы точки рестрикции.
В данной работе будут рассмотрены некоторые из аспектов функционального значения доменной структуры белка CENP-E, механизмы регуляции его активности и определена роль взаимодействия данного белка с белками митотической точки рестрикции, в частности киназы hBUBRl. Всесторонняя оценка активности данного белка в процессе митоза позволит использовать его в качестве избирательной мишени при лечении онкологических заболеваний (автору представляется, что потеря клетками данного CENP-E вызывает арест быстро делящихся раковых клеток), а также внесет вклад в понимание механизма атипичных митозов.
Цель и задачи работы. Цель данной работы - изучить роль белка CENP-E в процессах прикрепления кинетохоров сестринских хроматид к микротрубочкам веретена клеточного деления, хромосомной конгрессии и прохождения митотической точки рестрикции в делящихся культивируемых клетках млекопитающих (HeLa). Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Восстановить полноразмерную 8 кб кДНК копию гена CENP-E из имеющихся перекрывающихся фрагментов. Показать in vitro и in vivo, что полученная в процессе работы кДНК гена CENP-E является функциональным гомологом эндогенной формы.
2. Используя технологию pSHAG (короткошпилечных интерферирующих РНК) для ингибирования активности эндогенного белка, оценить in vivo роль каждого из двух микротрубочкосвязывающих доменов CENP-E в процессе митоза и эффект удаления двух МТсвязывающих доменов одновременно. Описать значение АТФ-азной активности МН2-терминального района CENP-E в процессе внутриклеточного турновера данного белка.
3. Используя технологию pSHAG, описать значение фосфорилирования CENP-E киназами MPF (комплексом циклина В и cdc2) и MAP р38 в процессе регуляции активности кинетохорсвязанного пула белка CENP-E на протяжении митотического цикла клетки.
Картировать район взаимодействия CENP-E и киназы митотической точки рестрикции hBUBRl и охарактеризовать in vivo роль подобного взаимодействия для завершения клеткой митотического деления.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Ладыгина, Надежда Григорьевна
ВЫВОДЫ:
1. В ходе выполнения диссертационной работы впервые была получена полноразмерная копия кДНК человеческого гена CENP-E, которая при использовании в модельной системе in vivo в сочетании с технологией pSHAG (использование короткошпилечных РНК) полностью компенсировала эффекты ингибирования активности эндогенной формы этого белка.
2. Два микротрубочко-связывающих района CENP-E (как NH2-, так и СООН-терминальный) одинаково важны для создания функционального взаимодействия между кинетохором и микротрубочками веретена деления и для формирования напряженности между сестринскими хроматидами. Осуществление функций CENP-E на начальных этапах митоза обеспечивается способностью СООН-терминального домена стабилизировать и полимеризовать захваченные плюс-концы кинетохорных микротрубочек, в то время как ЫШ-терминальный домен обеспечивает шаговое передвижение молекулы CENP-E в комплексе с хромосомой вдоль микротрубочки. Элиминация любого из этих доменов приводит к активации сигнала митотической точки рестрикции и, как следствие, задержку клеток в митозе в связи с потерей напряженности на кинетохорах сестринских хроматид и появлением дефектов связывания кинетохоров и микротрубочек веретена деления.
3. Создание полноразмерной копии гена CENP-E, искусственно имитирующей его гиперфосфорилированное состояние, позволило показать in vivo, что фосфорилирование СООН-терминального района CENP-E ингибирует его микротрубочко-связывающую активность. Из чего нами был сделан вывод о том, что пул CENP-E, находящийся на кинетохорах, в процессе митоза поддерживается в гипофосфорилированном состоянии для активного связывания микротрубочек, в то время как в цитоплазме клетки митотические киназы осуществляют фосфорилирование свободного CENP-E, вызывая тем самым его дезактивацию.
4. Взаимодействие кинетохорассоциированного белка СЕИР-Е и киназы митотической точки рестрикции ЬВиВШ является необходимым условием правильности передачи сигнала митотической точки рестрикции. Нами было показано, что после завершения процесса выстраивания хромосом у клеточного экватора, СЕИР-Е подавляет киназную активность ЬВиВШ, что обуславливает блокировку сигнала митотической точки рестрикции, в результате чего клетка получает возможность завершить деление. При нарушении подобных взаимоотношений мы наблюдали вступление клеток в митоз, его незавершение и быструю клеточную гибель, что, как мы полагаем, является следствием гиперактивации системы митотической точки рестрикции. Полученные нами результаты позволяют считать, что киназа ЬВиВШ является механосенсором, контролирующим взаимодействие СЕМР-Е и микротрубочек (то есть процесс выравнивания хромосом), активность которого ингибируется присоединением микротрубочки к СЕИР-Е.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям доценту к.б.н. Рихарду Вольдемаровичу Лацису за внимательное руководство и конструктивную критику, проф. Тиму Ену за предоставленную возможность выполнения работы в его лаборатории и оказанную поддержку в осуществлении проекта и коллективу лаборатории, Джиму Ниттлу и Беатрис Конер за помощь в проведении экспериментов.
Автор также выражает благодарность проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой, проф. Эрике Големис и к.б.н. Илье Серебрийскому за организацию программы сотрудничества между Россиийским Государственным Медицинским Университетом и Онкологическим центром Фокс Чейс, Филадельфия, США (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia,USA).
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ладыгина, Надежда Григорьевна, Москва
1. Васильев Ю.М. (1996) Клетка как архитектурное чудо. Часть 1. Живые нити. Соросовский образовательный журнал. Биология, с. 36-43.
2. Васильев Ю.М. (1999) Клетка как архитектурное чудо. Часть 3. Клетка единая, но делимая. Соросовский образовательный журнал. Биология, 18-23.
3. Кикнадзе И.И. (1972) Функциональная организация хромосом, JI., Наука.
4. Ладыгина Н.Г, Лацис, Р.В. and Ен, Т. (2005) Эффект применения фармакологического агента Гесперадина на клетках опухолевых клеток молочной железы и простаты. Вопросы медицинской химии, 52 , №2, стр 170-176.
5. Минин А.А., Кулик А.В, (2004) Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции. Успехи биологической химии, т.44,225-262.
6. Хемлебен В., Беридзе Т., Бахман Л., Коварик Я., Торрес Р. (2003) Сателлитные ДНК. Успехи биологической химии, jA3 с. 267-306.
7. Ченцов Ю.С. (1996) Современные представления о строении митотических хромосом. Соросовский образовательный журнал. Биология, с. 14-22.
8. Abrieu, А., КаЬапа, J.A., Wood, K.W. and Cleveland, D.W. (2000) CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell, 102, 817-826.
9. Abrieu, A., Magnaghi-Jaulin, L., Kahana, J.A., Peter, M., Castro, A., Vigneron, S., Lorca, Т., Cleveland, D.W. and Labbe, J.C. (2001) Mpsl is a kinetochore-associated kinase essential for the vertebrate mitotic checkpoint. Cell, 106, 83-93.
10. Amon, A. (1999) The spindle checkpoint. Curr Opin Genet Dev, 9,69-75.
11. Andrews, P.D., Ovechkina, Y., Morrice, N., Wagenbach, M., Duncan, K., Wordeman, L. and Swedlow, J.R. (2004) Aurora В regulates MCAK at the mitotic centromere. Dev Cell, 6, 253-268.
12. Bajer, A.S., Cypher, C., Mole-Bajer, J. and Howard, H.M. (1982) Taxol-induced anaphase reversal: evidence that elongating microtubules can exert a pushing force in living cells. Proc Natl AcadSci USA, 19, 6569-6573.
13. Basto, R., Gomes, R. and Karess, R.E. (2000) Rough deal and ZwlO are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nat Cell Biol, 2,939-943.
14. Beinhauer, J.D., Hagan, I.M., Hegemann, J.H. and Fleig, U. (1997) Mal3, the fission yeast homologue of the human APC-interacting protein EB-1 is required for microtubule integrity and the maintenance of cell form. J Cell Biol, 139,717-728.
15. Berrueta, L., Tirnauer, J.S., Schuyler, S.C., Pellman, D. and Bierer, B.E. (1999) The APC-associated protein EB1 associates with components of the dynactin complex and cytoplasmic dynein intermediate chain. CurrBiol, 9,425-428.
16. Biggins, S. and Murray, A.W. (1999) Sister chromatid cohesion in mitosis. Curr Opin Genet Dev, 9, 230-236.
17. Biggins, S. and Murray, A.W. (2001) The budding yeast protein kinase Ipll/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes Dev, 15, 3118-3129.
18. Biggins, S., Severin, F.F., Bhalla, N., Sassoon, I., Hyman, A.A. and Murray, A.W. (1999a) The conserved protein kinase Ipll regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev, 13,532-544.
19. Biggins, S., Severin, F.F., Bhalla, N., Sassoon, I., Hyman, A.A. and Murray, A.W. (1999b) The conserved protein kinase Ipll regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev., 13, 532-544.
20. Carpenter, A.T. (1991) Distributive segregation: motors in the polar wind? Cell, 64, 885-890.
21. Cassimeris, L. (2002) The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers. Curr Opin Cell Biol, 14,18-24.
22. Chan, G.K., Jablonski, S.A., Starr, D.A., Goldberg, M.L. and Yen, T.J. (2000) Human ZwlO and ROD are mitotic checkpoint proteins that bind to kinetochores. Nat Cell Biol, 2, 944-947.
23. Chan, G.K., Jablonski, S.A., Sudakin, V., Hittle, J.C. and Yen, T.J. (1999) Human BUBR1 is a mitotic checkpoint kinase that monitors CENP-E functions at kinetochores and binds the cyclosome/APC. J. Cell. Biol., 146,941-954.
24. Chan, G.K., Schaar, B.T. and Yen, T.J. (1998) Characterization of the kinetochore binding domain of CENP-E reveals interactions with the kinetochore proteins CENP-F and hBUBRl. J. Cell Biol., 143,49-63.
25. Cheeseman, I.M., Anderson, S., Jwa, M., Green, E.M., Kang, J., Yates, J.R., 3rd, Chan, C.S., Drubin, D.G. and Barnes, G. (2002) Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipllp. Cell, 111, 163-172.
26. Cheeseman, I.M., Brew, C., Wolyniak, M., Desai, A., Anderson, S., Muster, N., Yates, J.R., Huffaker, T.C., Drubin, D.G. and Barnes, G. (2001) Implication of a novel multiprotein Damlp complex in outer kinetochore function. J Cell Biol, 155, 1137-1145.
27. Cheeseman, I.M., Niessen, S., Anderson, S., Hyndman, F., Yates, J.R., III, Oegema, K. and Desai, A. (2004) A conserved protein network controls assembly of the outer kinetochore and its ability to sustain tension. Genes Dev., 18,2255-2268.
28. Chen, R.H. (2002) BubRl is essential for kinetochore localization of other spindle checkpoint proteins and its phosphorylation requires Madl. J Cell Biol, 158,487-496.
29. Cleveland, D.W., Mao, Y. and Sullivan, K.F. (2003) Centromeres and kinetochores: from epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Cell, 112,407-421.
30. Cooke, C.A., Schaar, B., Yen, T.J. and Earnshaw, W.C. (1997) Localization of CENP-E in the fibrous corona and outer plate of mammalian kinetochores from prometaphase through anaphase. Chromosoma, 106,446-455.
31. Coue, M., Lombillo, V.A. and Mcintosh, J.R. (1991) Microtubule depolymerization promotes particle and chromosome movement in vitro. J Cell Biol, 112, 1165-1175.
32. DeLuca, J.G., C.N.Newton, R.H.Himes, M.A. Jordan, L. Wilson. (2001) Purification and characterisation of natife conventional kinesin, HSET, and CENP-E from mitotic HeLa cells. J Biol Chem, 276, 28014-28021.
33. DeLuca, J.G., Moree, B., Hickey, J.M., Kilmartin, J.V. and Salmon, E.D. (2002) hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment and induces mitotic cell death in HeLa cells. J Cell Biol, 159, 549-555.
34. DeLuca, J.G. and Salmon, E.D. (2004) kinetochores: if you build it, they will come. Curr Biol, 14, 921-923.
35. Desai, A. and Mitchison, T.J. (1997) Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol, 13, 83-117.
36. Dogterom, M., Felix, M.A., Guet, C.C. and Leibler, S. (1996) Influence of M-phase chromatin on the anisotropy of microtubule asters. J Cell Biol, 133,125-140.
37. Donaldson, A.D. and Kilmartin, J.V. (1996) Spc42p: a phosphorylated component of the S. cerevisiae spindle pole body (SPD) with an essential function during SPB duplication. J Cell Biol, 132, 887-901.
38. Dujardin, D., Wacker, U.I., Moreau, A., Schroer, T.A., Rickard, J.E. and De Mey, J.R. (1998) Evidence for a role of CLIP-170 in the establishment of metaphase chromosome alignment. J Cell Biol, 141,849-862.
39. Earnshaw, W., Bordwell, B., Marino, C. and Rothfield, N. (1986) Three human chromosomal autoantigens are recognized by sera from patients with anti-centromere antibodies. J Clin Invest, 77, 426-430.
40. Endow, S.A., Kang, S.J., Satterwhite, L.L., Rose, M.D., Skeen, V.P. and Salmon, E.D. (1994) Yeast Kar3 is a minus-end microtubule motor protein that destabilizes microtubules preferentially at the minus ends. Embo J, 13,2708-2713.
41. Fang, G., Yu, H. and Kirschner, M.W. (1998) The checkpoint protein MAD2 and the mitotic regulator CDC20 form a ternary complex with the anaphase-promoting complex to control anaphase initiation. Genes Dev, 12, 1871-1883.
42. Faulkner, N.E., Dujardin, D.L., Tai, C.Y., Vaughan, K.T., O'Connell, C.B., Wang, Y. and Vallee, R.B. (2000) A role for the lissencephaly gene LIS1 in mitosis and cytoplasmic dynein function. Nat Cell Biol, 2,784-791.
43. Fraschini, R„ Beretta, A., Lucchini, G. and Piatti, S. (2001) Role of the kinetochore protein NdclO in mitotic checkpoint activation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Genet Genomics, 266, 115-125.
44. Funabiki, H. and Murray, A.W. (2000) The Xenopus chromokinesin Xkid is essential for metaphase chromosome alignment and must be degraded to allow anaphase chromosome movement. Cell, 102,411-424.
45. Gaglio, T., Dionne, M.A. and Compton, D.A. (1997) Mitotic spindle poles are organized by structural and motor proteins in addition to centrosomes. J Cell Biol, 138,1055-1066.
46. Garcia, M.A., Koonrugsa, N. and Toda, T. (2002) Two kinesin-like Kin I family proteins in fission yeast regulate the establishment of metaphase and the onset of anaphase A. Curr Biol, 12, 610-621.
47. Garcia-Saez, I., Yen, T., Wade, R.H. and Kozielski, F. (2004) Crystal Structure of the Motor Domain of the Human Kinetochore Protein CENP-E. Journal of Molecular Biology, 340, 1107-1116.
48. Gepner, J., Li, M., Ludmann, S., Kortas, C., Boylan, K., Iyadurai, S.J., McGrail, M. and Hays, T.S. (1996) Cytoplasmic dynein function is essential in Drosophila melanogaster. Genetics, 142, 865-878.
49. Gorbsky, G.J. and Borisy, G.G. (1989) Microtubule dynamics and the movement of chromosomes. Prog Clin Biol Res, 318,159-169.
50. Gorbsky, G.J. and Ricketts, W.A. (1993) Differential expression of a phosphoepitope at the kinetochores of moving chromosomes. J Cell Biol, 122,1311-1321.
51. Gorbsky, G.J., Sammak, P.J. and Borisy, G.G. (1988) Microtubule dynamics and chromosome motion visualized in living anaphase cells. J Cell Biol, 106, 1185-1192.
52. Gordon, M.B., Howard, L. and Compton, D.A. (2001) Chromosome movement in mitosis requires microtubule anchorage at spindle poles. J Cell Biol, 152,425-434.
53. Goshima, G. and Yanagida, M. (2000) Establishing biorientation occurs with precocious separation of the sister kinetochores, but not the arms, in the early spindle of budding yeast. Cell, 100, 619-633.
54. Guacci, V., Hogan, E. and Koshland, D. (1997a) Centromere position in budding yeast: evidence for anaphase A. Mol Biol Cell, 8,957-972.
55. Guacci, V., Koshland, D. and Strunnikov, A. (1997b) A direct link between sister chromatid cohesion and chromosome condensation revealed through the analysis of MCD1 in S. cerevisiae. Cell, 91,47-57.
56. Gunawardane, R.N., Lizarraga, S.B., Wiese, C., Wilde, A. and Zheng, Y. (2000) gamma-Tubulin complexes and their role in microtubule nucleation. Curr Top Dev Biol, 49,55-73.
57. Hannak, E., Kirkham, M., Hyman, A.A. and Oegema, K. (2001) Aurora-A kinase is required for centrosome maturation in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol, 155,1109-1116.
58. Harper, J.W., Burton, J.L. and Solomon, M.J. (2002) The anaphase-promoting complex: it's not just for mitosis any more. Genes Dev, 16, 2179-2206.
59. Heald, R., Tournebize, R., Habermann, A., Karsenti, E. and Hyman, A. (1997) Spindle assembly in Xenopus egg extracts: respective roles of centrosomes and microtubule self-organization. J Cell Biol, 138,615-628.
60. Hill, T.L. (1985) Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. Proc Natl Acad Sci USA, 82,4404-4408.
61. Hiramoto, Y. and Nakano, Y. (1988) Micromanipulation studies of the mitotic apparatus in sand dollar eggs. CellMotil Cytoskeleton, 10,172-184.
62. Hoffman, D.B., Pearson, C.G., Yen, T.J., Howell, B.J. and Salmon, E.D. (2001) Microtubule-dependent Changes in Assembly of Microtubule Motor Proteins and Mitotic Spindle Checkpoint Proteins at PtKl Kinetochores. Mol. Biol Cell, 12,1995-2009.
63. Hofmann, C., Cheeseman, I.M., Goode, B.L., McDonald, K.L., Barnes, G. and Drubin, D.G. (1998) Saccharomyces cerevisiae Duolp and Damlp, novel proteins involved in mitotic spindle function. J Cell Biol, 143,1029-1040.
64. Holy, T.E. and Leibler, S. (1994) Dynamic instability of microtubules as an efficient way to search in space. Proc Natl Acad Sci USA, 91,5682-5685.
65. Hori, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y., Kimura, H. and Fukagawa, T. (2003) Dynamic behavior of Nuf2-Hecl complex that localizes to the centrosome and centromere and is essential for mitotic progression in vertebrate cells. J Cell Sci, 116, 3347-3362.
66. Howell, B.J., Hoffman, D.B., Fang, G., Murray, A.W. and Salmon, E.D. (2000) Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J Cell Biol, 150,1233-1250.
67. Hoyt, M.A. (2001) A new view of the spindle checkpoint. J Cell Biol, 154,909-911.
68. Hoyt, M.A., Totis, L. and Roberts, B.T. (1991) S. cerevisiae genes required for cell cycle arrest in response to loss of microtubule function. Cell, 66,507-517.
69. Hunt, A.J. and Mcintosh, J.R. (1998) The dynamic behavior of individual microtubules associated with chromosomes in vitro. Mol Biol Cell, 9,2857-2871.
70. Hyman, A.A. and Sorger, P.K. (1995) Structure and function of kinetochores in budding yeast. Annu Rev Cell Dev Biol, 11,471-495.
71. Joglekar, A.P. and Hunt, A.J. (2002) A simple, mechanistic model for directional instability during mitotic chromosome movements. Biophys J,83,42-58.
72. Jones, M.H., Bachant, J.B., Castillo, A.R., Giddings, T.H., Jr. and Winey, M. (1999) Yeast Damlp is required to maintain spindle integrity during mitosis and interacts with the Mpslp kinase. Mol Biol Cell, 10,2377-2391.
73. Kang, J., Cheeseman, I.M., Kallstrom, G., Velmurugan, S., Barnes, G. and Chan, C.S. (2001) Functional cooperation of Daml, Ipll, and the inner centromere protein (INCENP)-related protein Slil5 during chromosome segregation. J Cell Biol, 155,763-774.
74. Kaplan, K.B., Burds, A.A., Swedlow, J.R., Bekir, S.S., Sorger, P.K. and Nathke, I.S. (2001) A role for the Adenomatous Polyposis Coli protein in chromosome segregation. Nat Cell Biol, 3, 429-432.
75. Khodjakov, A., Copenagle, L., Gordon, M.B., Compton, D.A. and Kapoor, T.M. (2003) Minus-end capture of preformed kinetochore fibers contributes to spindle morphogenesis. J. Cell Biol, 160,671-683.
76. Khodjakov, A. and Rieder, C.L. (1996) Kinetochores moving away from their associated pole do not exert a significant pushing force on the chromosome. J Cell Biol, 135, 315-327.
77. Khodjakov, A. and Rieder, C.L. (1999) The sudden recruitment of gamma-tubulin to the centrosome at the onset of mitosis and its dynamic exchange throughout the cell cycle, do not require microtubules. J Cell Biol, 146,585-596.
78. Khodjakov, A. and Rieder, C.L. (2001) Centrosomes enhance the fidelity of cytokinesis in vertebrates and are required for cell cycle progression. J Cell Biol, 153,237-242.
79. King, J.M., Hays, T.S. and Nicklas, R.B. (2000a) Dynein is a transient kinetochore component whose binding is regulated by microtubule attachment, not tension. J Cell Biol, 151, 739748.
80. King, J.M., Hays, T.S. and Nicklas, R.B. (2000b) Dynein Is a Transient Kinetochore Component Whose Binding Is Regulated by Microtubule Attachment, Not Tension. J. Cell Biol., 151, 739-748.
81. King, J.M. and Nicklas, R.B. (2000) Tension on chromosomes increases the number of kinetochore microtubules but only within limits. J Cell Sci, 113 Pt 21, 3815-3823.
82. Maddox, P.S., Bloom, K.S. and Salmon, E.D. (2000) The polarity and dynamics of microtubule assembly in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Cell Biol, 2,36-41.
83. Maiato, H., A, F.E., Rieder, C.L., Swedlow, J.R. and Earnshaw, W. (2003) Human CLASP 1 is an outer kinetochore component that regulates spindle microtubule dynamics. Cell, 167, 831840.
84. Maiato, H„ DeLuca, J., Salmon, E.D. and Earnshaw, W.C. (2004) The dynamic kinetochore-microtubule interface. J Cell Sci, 117, 5461-5477.
85. Maney, T., Ginkel, L.M., Hunter, A.W. and Wordeman, L. (2000) The kinetochore of higher eucaryotes: a molecular view. Int Rev Cytol, 194, 67-131.
86. Maney, T„ Hunter, A.W., Wagenbach, M. and Wordeman, L. (1998) Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol, 142,787-801.
87. Maney, T., Wagenbach, M. and Wordeman, L. (2001) Molecular dissection of the microtubule depolymerizing activity of mitotic centromere-associated kinesin. J Biol Chem, 276, 3475334758.
88. Mao, Y., Abrieu, A. and Cleveland, D.W. (2003a) Activating and silencing the mitotic checkpoint through CENP-E-dependent activation/inactivation of BubRl. Cell, 114, 87-98.
89. Mao, Y., Abrieu, A. and Cleveland, D.W. (2003b) Activating and silencing the Mitotic checkpoint through CENP-E-dependent activation/inactivation of hBUBRl. Cell, 114, 87-98.
90. Martin-Lluesma, S., Stucke, V.M. and Nigg, E.A. (2002) Role of heel in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of madl/mad2. Science, 297, 2267-2270.
91. McEwen, B.F., Heagle, A.B., Cassels, G.O., Buttle, K.F. and Rieder, C.L. (1997) Kinetochore fiber maturation in PtKl cells and its implications for the mechanisms of chromosome congression and anaphase onset. J Cell Biol, 137,1567-1580.
92. Mcintosh, J.R. and Pfarr, C.M. (1991) Mitotic motors. J Cell Biol, 115,577-585.
93. Millband, D.N. and Hardwick, K.G. (2002) Fission yeast Mad3p is required for Mad2p to inhibit the anaphase-promoting complex and localizes to kinetochores in a Bublp-, Bub3p-, and Mphlp-dependent manner. Mol Cell Biol, 22,2728-2742.
94. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N. and Tsukita, S. (2000) The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol, 10, 865-868.
95. Mitchison, T.J. (1989) Polewards microtubule flux in the mitotic spindle: evidence from photoactivation of fluorescence. J Cell Biol, 109,637-652.
96. Mitchison, T.J. and Krischner M, W. (1985) Properties of the kinetochores in vitro.I. Mictotuble nucleation and tubulin binding. J Cell Biol, 101,755-765.
97. Mitchison, T.J. and Salmon, E.D. (1992) Poleward kinetochore fiber movement occurs during both metaphase and anaphase-A in newt lung cell mitosis. J Cell Biol, 119,569-582.
98. Molina, I., Baars,-S., Brill, J.A., Hales, K.G., Fuller, M.T. and Ripoll, P. (1997) A chromatin-associated kinesin-related protein required for normal mitotic chromosome segregation in Drosophila .J Cell Biol, 139, 1361-1371.
99. Moore, J.D. (2001) The Ran-GTPase and cell-cycle control. Bioessays, 23,77-85.
100. Moores, C.A., Yu, M., Guo, J., Beraud, C., Sakowicz, R. and Milligan, R.A. (2002) A mechanism for microtubule depolymerization by KinI kinesins. Mol Cell, 9,903-909.
101. Nasmyth, K., Peters, J.M. and Uhlmann, F. (2000) Splitting the chromosome: cutting the ties that bind sister chromatids. Science, 288, 1379-1385.
102. Nicklas, R.B. (1997) How cells get the right chromosomes. Science, 275, 632-637.
103. Nicklas, R.B. and Arana, P. (1992) Evolution and the meaning of metaphase. J Cell Sci, 102 ( Pt 4), 681-690.
104. Nicklas, R.B., Ward, S.C. and Gorbsky, G.J. (1995) Kinetochore chemistry is sensitive to tension and may link mitotic forces to a cell cycle checkpoint. J Cell Biol, 130,929-939.
105. Nicklas, R.B., Waters, J.C., Salmon, E.D. and Ward, S.C. (2001) Checkpoint signals in grasshopper meiosis are sensitive to microtubule attachment, but tension is still essential. J Cell Sci, 114, 4173-4183.
106. Oakley, B.R. (2000) gamma-Tubulin. Curr Top Dev Biol, 49,27-54.
107. Ohkura, H., Garcia, M.A. and Toda, T. (2001) Disl/TOG universal microtubule adaptors one MAP for all? J Cell Sci, 114,3805-3812.
108. Perez, F., Diamantopoulos, G.S., Stalder, R. and Kreis, T.E. (1999) CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell, 96,517-527.
109. Peters, J.M. (2002) The anaphase-promoting complex: proteolysis in mitosis and beyond. Mol Cell, 9,931-943.
110. Pluta, A.F., Mackay, A.M., Ainsztein, A.M., Goldberg, I.G. and Earnshaw, W.C. (1995) The centromere: hub of chromosomal activities. Science, 270,1591-1594.
111. Putkey, F.R., Cramer, T., Morphew, M.K., Silk, A.D., Johnson, R.S., Mcintosh, J.R. and Cleveland, D.W. (2002) Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Dev Cell, 3, 351-365.
112. Rieder, C.L. and Salmon, E.D. (1998) The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol, 8,310-318.
113. Rodionov, V. (Родионов В.И.), Nadezhdina, E (Надеждина E.C.). and Borisy, G. (1999) Centrosomal control of microtubule dynamics. PNAS, 96,115-120.
114. Salic, A., Waters, J.C. and Mitchison, T.J. (2004) Vertabrate shugoshin links sister centromere cohesion for chromosome alignment. Cell, 118, 567-578.
115. Salinà, D., Enarson, P., Rattner, J.B. and Burke, B. (2003) Nup358 integrates nuclear envelope breakdown with kinetochore assembly. J Cell Biol, 162, 991-1001.
116. Salmon, E.D., McKeel, M. and Hays, T. (1984) Rapid rate of tubulin dissociation from microtubules in the mitotic spindle in vivo measured by blocking polymerization with colchicine. J Cell Biol, 99,1066-1075.
117. Savoian, M.S., Goldberg, M.L. and Rieder, C.L. (2000) The rate of poleward chromosome motion is attenuated in Drosophila zwlO and rod mutants. Nat Cell Biol, 2, 948-952.
118. Sawin, K.E. and Mitchison, T.J. (1994) Microtubule flux in mitosis is independent of chromosomes, centrosomes, and antiparallel microtubules. Mol Biol Cell, 5,217-226.
119. Saxton, W.M., Stemple, D.L., Leslie, R.J., Salmon, E.D., Zavortink, M. and Mcintosh, J.R. (1984) Tubulin dynamics in cultured mammalian cells. J Cell Biol, 99, 2175-2186.
120. Scaerou, F., Aguilera, I., Saunders, R., Kane, N., Blottiere, L. and Karess, R. (1999) The rough deal protein is a new kinetochore component required for accurate chromosome segregation in Drosophila. J. Cell Sci., 112,3757-3768.
121. Schaar, B.T., Chan, G.K.T., Maddox, P., Salmon, E.D. and Yen, T.J. (1997) CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. J. Cell Biol., 139,1373-1382.
122. Schiebel, E. (2000) gamma-tubulin complexes: binding to the centrosome, regulation and microtubule nucleation, CurrOpin Cell Biol, 12,113-118.
123. Shang, C., Hazbun, T.R., Cheeseman, I.M., Aranda, J., Fields, S., Drubin, D.G. and Barnes, G. (2003) Kinetochore protein interactions and their regulation by the Aurora kinase Ipllp. Mol Biol Cell, 14,3342-3355.
124. Sharp, D.J., Rogers, G.C. and Scholey, J.M. (2000) Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat Cell Biol, 2, 922-930.
125. Shelden, E. and Wadsworth, P. (1992) Microinjection of biotin-tubulin into anaphase cells induces transient elongation of kinetochore microtubules and reversal of chromosome-to-pole motion. J Cell Biol, 116,1409-1420.
126. Skibbens, R.V. and Salmon, E.D. (1997) Micromanipulation of chromosomes in mitotic vertebrate tissue cells: tension controls the state of kinetochore movement. Exp Cell Res, 235,314-324.
127. Skibbens, R.V., Skeen, V.P. and Salmon, E.D. (1993) Directional instability of kinetochore motility during chromosome congression and segregation in mitotic newt lung cells: a push-pull mechanism. J Cell Biol, 122, 859-875.
128. Skoufias, D.A., Andreassen, P.R., Lacroix, F.B., Wilson, L. and Margolis, R.L. (2001) Mammalian mad2 and bubl/bubRl recognize distinct spindle-attachment and kinetochore-tension checkpoints. Proc Natl Acad Sci USA, 98,4492-4497.
129. Starr, D.A., Williams, B.C., Hays, T.S. and Goldberg, M.L. (1998) ZW10 helps recruit dynactin and dynein to the kinetochore. J. Cell Biol., 142,763-774.
130. Sudakin, V., Chan, G.K. and Yen, T.J. (2001) Checkpoint inhibition of the APC/C in HeLa cells is mediated by a complex of BUBR1, BUB3, CDC20, and MAD2. J Cell Biol, 154,925-936.
131. Tang, Z., Bharadwaj, R., Li, B. and Yu, H. (2001) Mad2-lndependent inhibition of APCCdc20 by the mitotic checkpoint protein BubRl. Dev Cell, 1,227-237.
132. Tanudji, M., Shoemaker, J., L'ltalien, L., Russell, L., Chin, G. and Schebye, X.M. (2004) Gene Silencing of CENP-E by Small Interfering RNA in HeLa Cells Leads to Missegregation of Chromosomes after a Mitotic Delay. Mol. Biol. Cell, 15, 3771-3781.
133. Thorower, D.A., M.A. Jordan, B.T. Scharr, T.J. Yen and Wilson, L. (1995) Mitotic HeLa cells contain a CENP-E-associated minus-end directed mivrotuble motor. Embo J, 14,918-926.
134. Tippit, D.H., Pickett-Heaps, J.D. and Leslie, R. (1980) Cell division in two large pennate diatoms Hantzschia and Nitzschia HI. A new proposal for kinetochore function during prometaphase. J Cell Biol, 86,402-416.
135. Verde, F., Berrez, J.M., Antony, C. and Karsenti, E. (1991) Taxol-induced microtubule asters in mitotic extracts of Xenopus eggs: requirement for phosphorylated factors and cytoplasmic dynein. J Cell Biol, 112, 1177-1187.
136. Wang, S.Z. and Adler, R. (1995) Chromokinesin: a DNA-binding, kinesin-like nuclear protein. J Cell Biol, 128,761-768.
137. Waterman-Storer, C.M. and Salmon, E.D. (1998) How microtubules get fluorescent speckles. BiophysJ, 75,2059-2069.
138. Waters, J.C., Chen, R.H., Murray, A.W. and Salmon, E.D. (1998) Localization of Mad2 to kinetochores depends on microtubule attachment, not tension. J Cell Biol, 141,1181-1191.
139. Waters, J.C., Mitchison, T.J., Rieder, C.L. and Salmon, E.D. (1996) The kinetochore microtubule minus-end disassembly associated with poleward flux produces a force that can do work. Mol Biol Cell, 7,1547-1558.
140. Weiss, E. and Winey, M. (1996) The Saccharomyces cerevisiae spindle pole body duplication gene MPS1 is part of a mitotic checkpoint. J. Cell Biol, 132, 111-123.
141. West, R.R., Malmstrom, T. and Mcintosh, J.R. (2002) Kinesins klp5(+) and klp6(+) are required for normal chromosome movement in mitosis. J Cell Sci, 115, 931-940.
142. West, R.R., Malmstrom, T., Troxell, C.L. and Mcintosh, J.R. (2001) Two related kinesins, klp5+ and klp6+, foster microtubule disassembly and are required for meiosis in fission yeast. Mol Biol Cell, 12, 3919-3932.
143. Westermann, S., Cheeseman, I.M., Anderson, S., Yates, J.R., III, Drubin, D.G. and Barnes, G. (2003) Architecture of the budding yeast kinetochore reveals a conserved molecular core. J. Cell Biol., 163,215-222.
144. Wigge, P.A. and Kilmartin, J.V. (2001a) The Ndc80p complex from Saccharomyces cerevisiae contains conserved centromere components and has a function in chromosome segregation. J Cell Biol, 152, 349-360.
145. Wigge, P.A. and Kilmartin, J.V. (2001b) The Ndc80p Complex from Saccharomyces cerevisiae Contains Conserved Centromere Components and Has a Function in Chromosome Segregation. J. Cell Biol., 152, 349-360.
146. Wise, D., Cassimeris, L., Rieder, C.L., Wadsworth, P. and Salmon, E.D. (1991) Chromosome fiber dynamics and congression oscillations in metaphase PtK2 cells at 23 degrees C. Cell Motil Cytoskeleton, 18,131-142.
147. Wittmann, Т., Hyman, A. and Desai, A. (2001) The spindle: a dynamic assembly of microtubules and motors. Nat Cell Biol, 3, E28-34.
148. Wojcik, E., Basto, R., Serr, M., Scaerou, F., Karess, R. and Hays, T. (2001) Kinetochore dynein: its dynamics and role in the transport of the Rough deal checkpoint protein. Nat Cell Biol, 3, 1001-1007.
149. Wood, K.W., Sakowicz, R., Goldstein, L.S. and Cleveland, D.W. (1997) CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell, 91, 357366.
150. Wordeman, L. and Mitchison, T.J. (1995) Identification and partial characterization of mitotic centromere-associated kinesin, a kinesin-related protein that associates with centromeres during mitosis. J Cell Biol, 128,95-104.
151. Wordeman, L., Steuer, E.R., Sheetz, M.P. and Mitchison, T. (1991) Chemical subdomains within the kinetochore domain of isolated CHO mitotic chromosomes. J Cell Biol, 114,285-294.
152. Wu, H., Lan, Z., Li, W., Wu, S., Weinstein, J., Sakamoto, K.M. and Dai, W. (2000) p55CDC/hCDC20 is associated with BUBR1 and may be a downstream target of the spindle checkpoint kinase. Oncogene, 19,4557-4562.
153. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y„ Sullivan, K.F. and Cleveland, D.W. (2000) CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nat Cell Biol, 2,484-491.
154. Yao, X., Anderson, K.L. and Cleveland, D.W. (1997) The microtubule-dependent motor centromere-associated protein E (CENP-E) is an integral component of kinetochore corona fibers that link centromeres to spindle microtubules. J Cell Biol, 139,435-447.
155. Yeh, E., Skibbens, R.V., Cheng, J.W., Salmon, E.D. and Bloom, K. (1995) Spindle dynamics and cell cycle regulation of dynein in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol, 130, 687-700.
156. Yen, T.J., Compton, D.A., Wise, D., Zinkowski, R.P., Brinkley, B.R., Earnshaw, W.C. and Cleveland, D.W. (1991) CENP-E, a novel human centromere-associated protein required for progression from metaphase to anaphase. EmboJ, 10, 1245-1254.
157. Yucel, J.K., Marszalek, J.D., Mcintosh, J.R., Goldstein, L.S., Cleveland, D.W. and Philp, A.V. (2000) CENP-meta, an essential kinetochore kinesin required for the maintenance of metaphase chromosome alignment in Drosophila. J Cell Biol, 150, 1-11.
158. Zecevic, M., Catling, A.D., Eblen, S.T., Renzi, L., Hittle, J.C., Yen, T.J., Gorbsky, G.J. and Weber, M.J. (1998) Active MAP kinase in mitosis: localization at kinetochores and association with the motor protein CENP-E. J Cell Biol, 142, 1547-1558.
159. Zheng, L., Chen, Y. and Lee, W.-H. (1999) Heclp, an Evolutionarily Conserved Coiled-Coil Protein, Modulates Chromosome Segregation through Interaction with SMC Proteins. Mol. Cell. Biol., 19,5417-5428.
160. Zhou, J., Panda, D., Landen, J.W., Wilson, L. and Joshi, H.C. (2002) Minor alteration of microtubule dynamics causes loss of tension across kinetochore pairs and activates the spindle checkpoint. J Biol Chem, 277, 17200-17208.
-
Ладыгина, Надежда Григорьевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.25
- Взаимодействие кинезина CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек
- Индукция патологических митозов и изменение клеточного цикла в первичных фибробластах человека, инфицированных цитомегаловирусом
- Структура и свойства центромерного комплекса мыши в клеточном цикле
- Белок Р70, связывающий сателлитную ДНК in vitro: характеристика и локализация
- Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe
