Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль генетических факторов в развитии врождённых расщелин губы и нёба среди населения Краснодарского края

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль генетических факторов в развитии врождённых расщелин губы и нёба среди населения Краснодарского края"

На правах рукописи

НЕХОРОШКИНА Мария Олеговна

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В РАЗВИТИИ ВРОЖДЁННЫХ РАСЩЕЛИН ГУБЫ И НЁБА СРЕДИ НАСЕЛЕНИЯ КРАСНОДАРСКОГО

КРАЯ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

5 ФЕВ 2015

Белгород-2014 005558422

005558422

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» (ГБОУ ВПО КубГМУ) Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

ГОЛУБЦОВ Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

Амелина Светлана Сергеевна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, заведующая отделом прикладной биологии Научно-исследовательского института биологии

Петрин Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России, заведующий лабораторией медицинских генетических технологий

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «3^ » ■£. с2015 года в « часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России и на сайте vvvvw.bsu.edu.ru. Автореферат разослан » 0 г.

И. о. учёного секретаря совета по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук Д 212.015.13, доктор медицинских наук

С. П. Пахомов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Врождённые расщелины губы и/или нёба (ВРГ и/или Н) - это патология индивидуального развития, которая формируется на ранних стадиях эмбриогенеза человека и характеризуется наличием частичного или полного незаращения верхней губы и/или мягкого и/или твёрдого нёба.

В структуре мониторируемых врождённых пороков развития (ВПР) ВРГ и/или Н по частоте встречаемости находятся на втором месте и являются тяжёлой челюстно-лицевой патологией у новорождённых детей, приводящей к существенным структурным и функциональным нарушениям. Диапазон колебаний данного порока в различных регионах РФ - от 0,63 до 2,09 на 1000 новорождённых [Демикова Н. С., 2006]. Ориентировочные затраты государства на лечение и восстановление 1 пациента с ВРГ и/или Н составляют около 200 000 $ [Wehby and Cassell, 2010]. ВРГ и/или Н входит в перечень ВПР, регистрируемых по мониторингу в регионе, проводимого согласно приказу Департамента здравоохранения Краснодарского края № 176 от 20.09.1996 «О создании службы слежения за врождёнными пороками у детей и обязательной их регистрации в Краснодарском крае».

Об этиологии этих пороков развития нет однозначных представлений, так как они могут быть симптомами ряда наследственных синдромов (Ван дер Вуда, Пьера Робена, Аазе, Адамса - Оливера, Миллера, Патау, Эдвардса и др.), а также являются следствием воздействия экзогенных тератогенных факторов (физических, химических, биологических).

В последние годы активно изучается роль генов детоксикации, биохимические продукты которых нейтрализуют действие тератогенов, участвующих в формировании ВПР. Устойчивость организма к негативным воздействиям окружающей среды во многом зависит от работы ферментов детоксикации ксенобиотиков (ФБК) [Christopher J. Kennedy, 2013]. Система детоксикации сложна, индивидуальна для каждого конкретного человека и генетически уникальна [Liska DA J, 1996]; она включает в себя болыцое количество звеньев, характеризующихся выраженными межиндивидуальными и популяционными различиями [Halliwell ВМС, Gutteridges, 2007]. На сегодняшний день установлена взаимосвязь нарушений в функционировании системы биотрансформации ксенобиотиков и возникновении различных заболеваний [Liska DAJ, 1996], в том числе и ВПР [Pauli-Magnus С, 2004]. В связи с этим очевидна необходимость проведения молекулярно-генетических исследований, направленных на анализ взаимосвязей генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с риском развития ВРГ и/или Н в различных популяциях мира.

Цель: Изучить генетические факторы развития врождённых расщелин губы и/или нёба у детей, родивщихся в Краснодарском крае - Юг России, за период 1996-2012 гг.

Задачи:

1. Определить распространённость ВРГ и/или Н среди детей, родившихся на территории Краснодарского края, за период 1996 - 2012 гг. с учётом клинического полиморфизма патологии и пола больных.

2. Установить основные генетические факторы - мутации (генные, хромосомные, геномные) у новорождённых детей с признаком ВРГ и/или Н.

3.Установить ассоциации полиморфизмов генов ФБК с учётом диагностированных клинических вариантов ВРГ и/или Н.

4. Изучить роль генов ФБК в патогенезе ВРГ и/или Н.

Научная новизна. Впервые на юге России проведено исследование распространённости ВРГ и/или Н среди новорождённых на территории Краснодарского края за период 1996 - 2012 гг. с анализом вероятных генетических факторов. Впервые установлена популяционная частота встречаемости и доля ВРГ и/или Н среди всех регистрируемых в крае пороков развития. Составлен регистр моногенно наследуемых синдромов с признаками ВРГ и/или Н, установлена частота встречаемости ВРГ и/или Н в сочетании с хромосомной патологией, а также доля ВРГ и/или Н мультифакториального генеза на территории Краснодарского края. Впервые был проведён анализ полиморфизмов генов ФБК: СУР1А2 (С154А), СУР1В1 (У432Ь), АВСВ1 (С3435Т), ид01 (Р1878) и ИАТ2 (С590А) с риском развития ВРГ и/или Н у жителей Краснодарского края и установлены пол-специфические эффекты полиморфных вариантов генов ФБК в отношении предрасположенности к ВРГ и/или Н.

Научно-практическое значение. По результатам молекулярно-генетического исследования установлена роль полиморфных вариантов генов ФБК (МЛТ2, АВСВ1,СУР1А2, СУР1В1, N(201) в этиологии изолированных ВРГ и/или Н, что расширяет научные представления о молекулярных механизмах тератогенеза на ранних этапах эмбриогенеза человека. Изучение генетического влияния на процессы регуляции биотрансформации ксенобиотиков посредством оценки полиморфных генов ФБК позволит более полно охарактеризовать генетические механизмы формирования ВРГ и/или Н мультифакториального генеза. Проведённое комплексное медико-генетическое обследование позволило определить этиологию ВРГ и/или Н на территории Краснодарского края, что имеет важное значение в практическом здравоохранении при выборе тактики лечения и дальнейшей реабилитации данных больных. Результаты исследования позволят адекватно прогнозировать вероятность рождения здоровых детей в семьях с отягощённым анамнезом по исследованной патологии и могут быть использованы при медико-генетическом консультировании больных в ЛПУ Краснодарского края, ЮФО и на других территориях РФ. Данные настоящего исследования могут быть приняты для создания методических рекомендаций по курсам генетики, неврологии и стоматологии в медицинских вузах, а также на курсах усовершенствования медицинских работников.

Апробация работы. Материалы диссертационного исследования были представлены на II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011 г.), Краевой научно-практической конференции «Обеспечение преемственности специалистов в комплексной реабилитации пациентов с врождённой патологией челюстно-лицевой области» (Краснодар, 2013 г.), 74-й студенческой научно-практической конференции студенческого научного общества им. проф. Н.П. Пятницкого (Краснодар, 2013 г.), III научно-практической конференция с международным участием «Медицина: новое в теории и клинической практике» (Дубай, 2013 г.), 2-й Международной научно-практической конференции «Современная наука: актуальные проблемы и пути их решения» (Липецк, 2013 г.).

Личный вклад автора. Автором лично проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, определены цель и задачи исследования, разработаны подходы для их решения, проведён ретроспективный анализ данных. Автор самостоятельно производил первичный осмотр больных с ВРГ и/или Н, клинико-генеалогический анализ и отбор семей для дальнейшего исследования, проводил цитогенетическое исследование. Диссертантом лично проведено выделение геномной ДНК и генотипирование 5 полиморфизмов генов ФБК на выборке 261 человек. Автор лично проводил статистическую обработку, анализ и интерпретацию полученных результатов, подготовку публикаций по теме выполненной работы и оформление рукописи. Диссертант участвовала в апробации и внедрении результатов исследования.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 3 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Частота ВРГ и/или Н и их нозологических форм в Краснодарском крае соответствует средним показателям по России. В структуре причин развития ВРГ и/или Н на территории Краснодарского края ведущее место занимают пороки развития мультифакториального генеза.

2. Гены ФБК участвуют в формировании предрасположенности к ВРГ и/или Н.

3. Ассоциации исследуемых генов ФБК с риском развития ВПР зависят от клинического варианта ВПР (ВРГ и/или Н), а также характеризуются пол-специфичными эффектами полиморфизмов на подверженность болезни у мужчин и женщин.

4. Полиморфные варианты генов ФБК взаимодействуют между собой, что определяет их совместную вовлечённость в молекулярно-генетические механизмы патогенеза заболевания.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы с результатами собственного исследования,

заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Текст диссертации изложен на 161 странице машинописи, иллюстрирован 45 таблицами и 15 рисунками. Библиографический список содержит 243 источника, из которых 159 - зарубежных.

Материалы и методы исследования Общая характеристика выборки Объектом для данного исследования являлись дети с ВРГ и/или Н, родившиеся в Краснодарском крае за период 1996 — 2012 гг. и зарегистрированные в Кубанской межрегиональной медико-генетической консультации (ККМГК) в порядке проводимого мониторинга ВПР, дети, состоящие на диспансерном учёте в Центре лечения детей с врождённой патологией челюстно-лицевой области (ЦЛДВПЧЛО) ГБУЗ ДККБ г. Краснодара, а также дети, проходившие послеоперационную реабилитацию в Центре восстановительной медицины и реабилитации (ЦВМиР) ГУЗ г. Краснодара. Критериями включения в группу исследования были: пациенты с изолированной ВРГ и/или Н (без сочетанной патологии со стороны других органов и систем), родившиеся и проживающие на территории Краснодарского края, преимущественно русской этнической группы, при наличии и согласии родственников I линии родства (родители исследуемых). Всего клинически обследованы 967 человек, в том числе 810 больных с ВРГ и/или Н и 157 человек без признаков исследуемой патологии -контрольная группа. Ретроспективно были проанализированы 1024 амбулаторных карт и историй болезни больных с ВРГ и/или Н из архивных материалов ЦЛДВПЧЛО, 810 амбулаторных карт ККМГК и 107 историй болезни ЦВМиР г. Краснодара.

При клиническом осмотре больных были учтены имеющиеся заключения смежных специалистов (ортопед, невролог, кардиолог и др.). Для постановки первичного диагноза использовалась клинико-анатомическая классификация Московского государственного медико-стоматологического университета (1990 г.). Для научно-исследовательских целей полученные данные протоколировались по стандартам Этического комитета Российской Федерации. Вся информация вносилась в специально составленную нами «Карту регистрации новорождённых с ВПР», в которую были включены: витальные характеристики (пол, масса тела, рост) пробанда, сведения о родителях: возраст, порядковый номер беременности/родов, протекание и исходы предыдущих беременностей, а также результаты генеалогического анализа.

Клинико-гепеалогический анализ Для формирования группы больных с изолированными ВРГ и/или Н всем зарегистрированным в крае семьям, отягощённым этой патологией и прибывшим на клинический осмотр, проведён клинико-генеапогический анализ. На основании полученных данных определяли доминирующий патогенетический фактор, а при выявлении наследственной природы порока

устанавливали тип наследования патологии. При наличии у больных с ВРГ и/или Н других патологических признаков определяли нозологическую форму наследственного синдрома.

Цитогенетическос исследование

Для проведения цитогенетического исследования у обследуемых проводился забор венозной крови. Лабораторное диагностическое обследование пациентов было проведено в цитогенетической лаборатории КММГК и включало в себя анализ числа и морфологической структуры хромосом стандартным цитогенетическим методом - кариотипированием. Культивирование крови и приготовление препаратов метафазных хромосом проводили по общепринятой методике Hungerford [Hungerford D.A., 1965; Кулешов Н.П., 1991]. Заключение о кариотипе составляли в соответствии с правилами Международной номенклатуры хромосом ISCN - 2005 [ISCN (2005), 2005]. Основной задачей использования данного метода в исследовании был анализ хромосом в метафазе с целью установления количественных и структурных отклонений от нормы в хромосомном наборе у больных с ВРГ и/или Н. Всего 214 пациентам было проведено первичное кариотипирование.

Молекулярпо-генетическое исследование

Молекулярно-генетические исследования проведены у 104 больных детей и 157 человек контрольной группы. Забор крови осуществляли в объёме 5 мл из локтевой вены в пробирки с консервантом 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0). После этого кровь замораживали при -20°С. Выделение геномной ДНК из цельнозамороженной крови осуществляли в медико-генетической лаборатории Курского государственного медицинского университета и лаборатории медико-генетических исследований на базе Кубанского государственного медицинского университета методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1984].

В рамках работы проводилось генотипирование 5 полиморфизмов (SNP-маркеры) 5 генов ФБК: CYP1B1 (V432L), MDR1 (С3435Т), NAT2 (G590A), CYP1A2 (А154С), NQOl (P187S).

Генотипирование осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени в лаборатории медико-генетических исследований на базе Кубанского государственного медицинского университета и молекулярно-генетической лаборатории кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета. Амплификацию проводили на амплификаторах CFX96 (Bio-Rad) и Rotor Gene Q5 plex HRM (Qiaqen) с использованием праймеров и зондов, синтезированных ООО «Синтол». Генотипирование полиморфизмов генов ФБК проводили методом дискриминации аллелей с помощью TagMan-зондов. С целью оптимизации ПЦР для каждой пары праймеров был рассчитан оптимальный температурно-временной режим отжига и подобрана соответствующая концентрация MgCl2.

Статистические методы исследования Статистический анализ полученных данных проводился на ПК с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США) и MS Excel. Оценка соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди — Вайнберга (РХВ) и сравнение распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных и здоровых осуществлялись с использованием критерия %2 Пирсона.

При сравнении частот аллелей и генотипов между различными группами использовали критерий уС с поправкой Йетса на непрерывность [Реброва О.Ю., 2003]. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеваниям судили по величине отношения шансов (OR) [Pearce N., 1993; Реброва О.Ю., 2003] - показателю, отражающему, во сколько раз вероятность оказаться в группе «случай» (больные) отличается от вероятности оказаться в группе «контроль» (здоровые) для носителя изучаемого генотипа: OR = (A/B)/(C/D), где А и В — количество больных, имеющих и не имеющих мутантный аллель или генотип соответственно; D и С - количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный аллель или генотип соответственно. При OR=l судили об отсутствии ассоциации; OR>l рассматривалось как наличие положительной ассоциации ДНК-маркера («фактор риска») и заболевания; OR<l - свидетельствовало об отрицательной ассоциации ДНК-маркера («фактор устойчивости») с заболеванием. Границы 95%-го доверительного интервала (CI) для OR вычисляли методом В. Woolf.

Результаты собственных исследований 1. Распространённость ВРГ и/или H на территории Краснодарского края. За период 1996 - 2012 гг. на территории Краснодарского края родилось 920 471 детей, из которых у 22 604 новорождённых (2,45 %) диагностировали ВПР, в том числе у 1024 — ВРГ и/или Н, что определило популяционную частоту этого порока на территории Краснодарского края -1,11 %о, а среди всех диагностированных пороков — 4,5 % и 70,6 % из числа всех зарегистрированных пороков развития челюстно-лицевой области в крае.

—•—ВРГ и/или H —ВРГ и/ияи H

А) Среди всех новорождённых Б) Среди всех зарегистрированных ВПР

Рисунок 1. Динамика ВРГ и/или Н на территории Краснодарского края за период

1996 - 2012гг.(%).

Как показано на рисунке 1, за период 1996 - 2012 гг. отмечается снижение доли ВРГ и/или Н, как среди всех регистрируемых ВПР на территории Краснодарского края, так и среди всех новорождённых.

Среди всех больных с ВРГ и/или Н данная патология чаще наблюдалась у лиц мужского пола - 53,7%, а показатель среди лиц женского пола - 46,3%. В нозологическом спектре больных с ВРГ и/или Н доминировали (40,33 %) изолированные расщелины нёба, 38,67 % составили сочетанные расщелины губы и нёба и 21,0 %- врождённые расщелины губы (ВРГ).

Частоты нозологических форм ВРГ и/или Н в соответствии с полом больных распределились следующим образом: ВРГ- 37,7 % (жен.) и 62,3 % (муж.), ВРН- 57,7 % (жен.) и 42,3 % (муж.), ВРГ и Н- 39,1 % (жен.) и 60,9 % (муж.).

При рассмотрении частоты ВРГ и/или Н в отдельных административных районах края выявлена выраженная дисперсия этого показателя, вследствие чего проведённый анализ частоты ВРГ и/или Н по отдельным районам края представлялся не корректным из-за статистически недостаточного числа рождений в них здоровых детей, а также больных. В связи с этим мы условно раздели территорию Краснодарского края на 6 регионов, в которые объединены административные районы с примерно одинаковым народонаселением и сходные по климато-географическим условиям (Рисунок 2).

1- Центральный 36,6%

2- Восточный 22,1 %

3- Причерноморский 17,6%

4- Южный предгорный 11,7%

5- Приазовский 7,4 %

6- Северный 4,6 %

Рисунок 2. Регионы условного территориального подразделения Краснодарского края и доля (%) среди всех больных ВРГ и/или Н в соответствующем регионе.

При этом увеличивалась общая численность народонаселения объединённых административных районов, что позволяло более объективно оценивать частоту рождения больных с ВРГ и/или Н применительно к конкретному региону края. В результате установлено, что наиболее часто ВРГ и/или Н регистрировались в Центральном регионе — 36,6 %, а более редко — в Северном регионе (4,6 %).

При расчёте частоты ВРГ и/или Н среди всех новорождённых, а также дифференцировано по нозологическим формам установлено, что в 5-ти регионах (кроме Приазовского) частота одинакова и составляет 1,0-1,3 %о (Таблица 1).

Таблица 1 - Распределение частоты ВРГ и/или Н в соответствии с клиническими формами, диагностированными среди новорождённых в отдельных регионах территориального условного подразделения Краснодарского края (1996 - 2012 гг.)_____

Регионы Краснодарского края Кол-во новорождённых Кол-во больных с ВРГ и/или Н Частота б-х с ВРГ и/или Н, %о ВРГ, %о ВРН, %0 ВРГ и Н, %0

Южный предгорный 107903 340 1,3 0,3 0,5 0,5

Причерноморский 177199 47 1,0 0,2 0,4 0,4

Восточный 193053 77 1,2 0,3 0,4 0,5

Центральный 296316 234 1,2 0,3 0,5 0,4

Северный 75076 183 1,0 0,2 0,5 0,4

Приазовский 70924 143 0,6 0,1 0,2 0,3

2. Клинико-генеалогический анализ при дифференциальной диагностике ВРГ и/или Н. Клинико-генеалогический анализ, проведённый в семьях больных, позволил установить аналогичную патологию у 41 (5,06 %) родственника пробандов. У остальных 769 осмотренных нами больных данный ВПР оценён как спорадический вариант патологии, из которых у 98 (12,1 %) больных с МВПР диагностировано 13 моногенных наследственных синдромов с разными типами наследования (Таблица 2).

Таблица 2 - Нозологический спектр моногенных наследственных синдромов с признаком

ВРГ и/или Н, диагностированных на территории Краснодарского края

Синдром Тип наследования Количество больных (% от всех ВРГ и/или Н)

Аномалад Пьера Робена АД, также спорадически 31 (3,8%)

Гольденхара АД 12(1,5%)

Ваарденбурга АД, АР 3 (0,4 %)

Ван дер Вуда АД 1 (0,1 %)

Грима Кабуки Предположительно АД 1 (0,1 %)

Адамса — Оливера АД, АР 1 (0,1 %)

Опица тригоноцефалии АР 17(2,1 %)

Робинова АР, АД 9(1,1%)

Ларсена АР, АД 7 (0,9 %)

Меккеля - Грубера АР 6 (0,7 %)

Оро-фацио-дигитальный АР 6 (0,7 %)

Ноя - Лаксовой X сцепленный рецессивный 2 (0,2 %)

Фримена - Шелдона АР 2 (0,2 %)

3. Цитогенетическое обследование больных с ВРГ и/или Н. С целью исключения хромосомной патологии был проведён цитогенетический анализ. Группа больных с ВРГ и/или Н была сформирована за период 1996 по 2012 гг., в группу обследуемых вошли больные, ранее прокариотипированные в ККМГК, а также дети, не проходившие обследование, не состоящие на учёте в ККМГК (214 пациентов, которым было проведено первичное

кариотипирование). Обследуемые имели как изолированные ВРГ и/или Н, так и сочетанные пороки развития со стороны других органов или систем. В результате цитогенетического исследования у 44 обследуемых был установлен аномальный кариотип. Структура и частота диагностированной хромосомной патологии на территории Краснодарского края за исследуемый временной период представлена в Таблице 3.

Таблица 3 - Структура и частота хромосомной патологии у больных с ВРГ и/или Н в Краснодарском крае за период 1996 - 2012 гг.___

Вид хромосомной патологии, кариотип Число больных (абс.) Частоты ВРГ и/или Н (%)

Среди всех ВРГ и/или Н (N=1024) Среди больных с хромосомной патологией (N=44)

Синдром Патау (47, XX, +13; 47, ХУ, +13) 18 1,76 40,91

Синдром Эдвардса (47, XX, +18; 47, ХУ, +18) 9 0,88 20,46

Синдром Дауна (47, XX, +21; 47, ХУ, +21) 6 0,59 13,64

Синдром Л ежена, делеции короткого плеча 5р~ (46, XX, с1е1(5)) 5 0,49 11,36

Синдром Ди Джорджи, делеции 22qll.2 (46, XX, <1е1(22) (я 11.2)) 3 0,29 6,82

Синдром трисомии 22 хромосомы (47,ХУ,+22) 2 0,20 4,54

Синдром Вольфа - Хиршхорна, делеции короткого плеча 4р~ (46ХУ, (ЗеК4) (р16)) 1 0,10 2,27

Из представленных в таблице данных видно, что ВРГ и/или Н могут проявиться как один из симптомов МВПР при хромосомных аномалиях и не являются специфичными для какого-либо одного хромосомного синдрома, возникая как при геномных мутациях, так и при хромосомных аберрациях (делециях). Диагностированная хромосомная патология чаще встречалась у лиц мужского пола - 56,82 %, а среди женского - 43,18 %. Частота встречаемости у больных ВРГ и/или Н в сочетании с хромосомной патологией на территории Краснодарского края составила 4,3 %.

Установлена популяционная частота встречаемости ВРГ и/или Н среди новорождённых с диагностированной хромосомной патологией по Краснодарскому краю, которая составила 0,05 %о.

4.1. Популяционная характеристика частот аллелей и генотипов исследованных генов ФБКу больных с ВРГ и/или Н и здоровых (контроль). Проведено молекулярно-генетическое исследование 104 семей, в которых были достоверно установлены изолированные ВРГ и/или Н у 104 пробандов; в качестве группы контроля были отобраны здоровые родители пробандов в количестве 157 человек. Распределение частот генотипов полиморфизмов генов системы ФБК и их соответствие популяционному равновесию уравнения Харди - Вайнберга проводилось раздельно в группе детей с ВРГ и/или Нив контрольной группе. Отклонения от равновесия уравнения Харди - Вайнберга в сравниваемых группах не обнаружено.

Таблица 4 - Распределение частот аллелей полиморфных вариантов генов NAT2, АВСВ1, CYP1A2, CYP1B1,NQ01 и их сравнительный анализ в обобщённой группе больных с ВРГ и/или Н и здоровых (контроль)_

Ген Аллели Частоты аллелей Х2(Р) OR (95 % CI)

Больные ВРГ и/или H Здоровые (контроль)

NAT2 п=103 п=157 0,88 (0,35) 1,20 (0,82-1,76)

G 0,675 0,713

А 0,325 0,287

АВСВ1 п=103 п=153 0,83 (0,36) 1,18 (0,83-1,68)

С 0,515 0,556

Т 0,485 0,444

CYP1A2 п=98 п=145 0,42 (0,52) 0,86 (0,56-1,34)

А 0,224 0,200

С 0,776 0,800

CYP1BI п=98 п=144 0,50 (0,48) 0,87 (0,60-1,28)

V 0,663 0,632

L 0,337 0,368

NQOl п=103 п=156 1,24 (0,27) 1,22 (0,86-1,24)

Р 0,476 0,526

S 0,524 0,474

Таблица 5 - Распределение частот генотипов полиморфизмов генов NAT2, ABCB1,CYP1A2, CYP1B1,

Ген Полиморфизм Генотипы 1 Частоты генотипов Критерий различий при X2 (Р)

Больные ВРГ и/или H Контроль

N % N %

NAT2 590G/A G/G 49 47,6 78 49,7 р>0,05

G/A 41 39,8 68 43,3 р>0,05

А/А 13 12,6 11 7,0 р>0,05

АВСВ1 3435С/Т С/С 26 25,2 46 30,1 р>0,05

САГ 54 52,4 78 51,0 р>0,05

Т/Т 23 22,3 29 19,0 р>0,05

CYP1A2 А154С АА 5 5,1 7 4,8 р>0,05

АС 34 34,7 44 30,3 р>0,05

СС 59 60,2 94 64,8 р>0,05

CYP1B1 V432L V/V 41 41,8 53 36,8 р>0,05

V/L 48 49,0 76 52,8 р>0,05

L/L 9 9,2 15 10,4 р>0,05

NQOl P187S РР 20 19,4 47 30,1 р>0,05

PS 58 56,3 70 44,9 р>0,05

SS 25 24,3 39 25,0 р>0,05

Как показано в таблицах 4—5, статистически достоверных различий между группами не обнаружено. Однако при проведении сравнительного стратификационного анализа в группах с различными нозологическими формами изучаемой патологии обнаружена взаимосвязь исследуемых маркеров с различными формами ВРГ и/или Н (результаты представлены в таблицах 6-7).

Таблица 6 - Статистически значимые ассоциации аллелей полиморфных вариантов генов

Ген Аллели Частоты аллелей У2 (Р) OR (95% CI)

Больные Контроль

CYP1A2 ВРГ п=19 п=146 3,87 (0,049*) 0,49 (0.24-1.01)

А 0,342 0,202

С 0,658 0,798

Уровни значимости р различий частот генотипов между группами (жирный шрифт *р <0,05 с1Г= 1)

Как показано в таблице 6, частота вариантного аплеля С полиморфизма А154С гена CYP1A2 ниже у больных с ВРГ по сравнению с группой контроля: Х2=3,87, Р=0,049; OR=0,49, 95% С1=0,24-1,01.

При анализе ассоциаций генотипов исследованных полиморфизмов генов с риском развития сочетанной патологии ВРГ и Н наблюдалось некоторое увеличение частоты мутантных гомозигот А/А полиморфизма 590G/A гена NAT2: х2=3,09, Р=0,08; OR=2,45, 95% С1=0,88-6,83. Частота вариантных гомозигот СС полиморфного варианта А154С гена CYP1A2 была выше в контрольной группе по сравнению с больными: '/2=3,54, Р=0,06; OR=2,49, 95 % 0=0,94-6,57 (Таблица 7).

Таблица 7 - Статистически значимые ассоциации генотипов полиморфизмов генов NAT2, АВСВ1, CYP1A2, CYP1B1, NOOI в группе больных и здоровых (контроль)__

Ген Полиморфизм Генотипы' Частоты генотипов Критерий различий прийр1,х2(р)

CYP1A2 А154С Больные с ВРГ Контроль

N % N %

АА 2 10,5 7 4,8 р>0,05

АС 9 47,4 45 30,8 р>0,05

СС 8 42,1 94 64,4 3,54(0,06)

NQOl P187S Больные с ВРГ Контроль

N % N %

РР 2 10,0 46 29,5 3,39 (0,07)

PS 14 70,0 71 45,5 4,26 (0,04*)

SS 4 20,0 39 25,0 р>0,05

NAT2 590G/A Больные с ВРГ и Н Контроль

N % N %

G/G 2 10,5 7 4,8 р>0,05

G/A 9 47,4 45 30,8 р>0,05

А/А 8 42,1 94 64,4 3,09 (0,08)

Уровни значимости р различий частот генотипов между группами (жирный шрифт *р <0,05 (1Г=1)

4.2. Особенности ассоциации полиморфизма генов ФБК с предрасположенностью к ВРГ и/или Н в зависимости от пола. При проведении сравнительного анализа частот аллелей исследованных генетических маркеров у больных мужского пола с ВРГ и здоровых мужчин из контрольной группы (Таблица 8) установлено статистически достоверное уменьшение частоты вариантного аллеля С полиморфизма А154С гена СУР1А2 у мужчин с ВРГ: х2=4,24, Р=0,04; (Ж=0,32, 95 % С1=0,12-0,84.

Таблица 8 - Статистически значимые ассоциации аллелей полиморфных вариантов генов N А Т2, АВСВ1,СУР1А2, СУР1В1, N(201 с риском развития исследуемых ВПР с учётом полового диморфизма

Ген Аллели Частоты аллелей, обобщённая группа х2 (Р) OR (95% CI)

CYP1A2 Больные ВРГ (муж.) Контроль (муж.) 4,24 (0,04*) 032 (0,12-0,84)

п=11 п=50

А 0,409 0,180

С 0,591 0,820

CYPIBI Больные ВРГ и/или Н (муж.) Контроль (муж.) 3,92 (0,05*) 0,55 (0,31-1,00)

п=52 п=50

V 0,731 0,600

L 0,269 0,400

CYPIBI Больные BPH (муж.) Контроль (муж.) 4,60 (0,03*) 0,30 (0,10-0,94)

п=12 п=50

V 0,250 0,180

L 0,750 0,820

CYPIBI Больные BPH (жен.) Контроль (жен.) 3,15 (0,08) 1,91 (0,93-3,92)

п=18 п=93

V 0,500 0,656

L 0,500 0,344

Уровни значимости р различий частот генотипов между группами (жирный шрифт *р <0,05 с!Г=1)

Также выявлен протективный эффект мутантного аллеля 432Ь полиморфизма У432Ь гена СУР1В1 относительно риска развития ВРН у мужчин: х2=3,92, Р=0,05; 0я=0,55, 95 % С1=0,31-1,00. При этом у женщин с ВРН частота мутантного аллеля по данному маркеру была выше, чем в контрольной группе, хотя различия не достигали статистически значимого уровня: х2=3,15, Р=0,08; 0(1=1,91, 95% С1=0,93-3,92. Нами обнаружено увеличение частоты гомозигот по дикому аллелю 432УУ полиморфного варианта У432Ь гена СУР1В1 в обобщённой группе больных мужского пола с ВРГ и/или Н (х2=3,92, Р=0,05; 011=0,55, 95 % С1=0,31-1,00).

У мужчин с ВРН наблюдалась тенденция к накоплению гомозигот по аллелю дикого типа 432УУ полиморфизма У432Ь гена СУР1В1 по сравнению с контрольной группой, однако различия не достигали уровня статистически значимых: х2=3,55, Р=0,06; 011=0,24,95% С1=0,06-0,90 (Таблица 9).

Таблица 9 - Статистически значимые ассоциации генотипов полиморфизмов генов NAT2, ABCBI, CYPIA2, CYPIBI, NQQ1 с риском развития ВРГ и/или Н с учётом полового диморфизма_

Ген Полиморфизм Генотипы i Частоты генотипов Критерий различий при dß=\,x2 (р)

CYPIBI V432L Больные BPH (муж.) Контроль (муж.)

N % N %

V/V 8 66.7 16 32.0 3.55 (0.06)

V/L 4 33.3 28 56.0 D>0.05

L/L 0 0.0 6 12,0 D>0.05

4.3. Анализ ассоциации парных комбинаций генотипов генов ФБК в формировании предрасположенности к ВРГ и/или Н. Проведён анализ межгенных взаимодействий, определяющих предрасположенность к исследуемым заболеваниям, без учёта полового диморфизма (Таблица 10).

Таблица 10 - Статистически значимые ассоциации межгенных взаимодействий генотипов генов ФБК с предрасположенностью к ВРГ и/или Н ____

№ Комбинации генотипов N % N % Критерий различий, OR (95%С1)

1 АВСВ13435СС х NAT2 590GG 11 10.7 28 18,7 2,99 (0,08) 0,52 (0,25-1.10)

2 АБС В /343 5ТТ х NAT2 590GG 5 4,9 1 0,7 2,99 (0,08) 5,57 (0,90-34,46)

3 АВСВ1 3435ТТ х CYP1B1 432LL 4 4,1 0 0,0 3,62 (0,06) 13,43(0,71-252,36)

4 АВСВ1 3435СТ х N001 187 PS 32 31,1 30 19,6 4,41 (0,04)* 1.85 (1,04-3,29)

5 CYP1A2 154АА х NQOl 187 РР 7 7.2 26 18,3 5,06 (0,02)* 0.36(0.15-0,86)

6 CYP1B1 432VL х N001 187 РР 9 9,3 26 18,4 3.15(0,08) 0.47 (0,21-1,03)

7 CYP1B1 432VL х N001 187 PS 31 32,0 31 22,0 2,97 (0,08) 1.67 (0,93-2,99)

Обнаружено 7 комбинаций, ассоциированых с риском развития ВРГ и/или Н. Наиболее значимые из них: гетерозиготное носительство по генам АВСВ1 и NQ01 коррелировало с увеличением риска ВРГ и/или Н почти в 2 раза (х~=4,41, Р=0,04; 011=1,85, 95 % 0=1,04-3,29), в тоже время сочетание гомозиготного генотипа по дикому аллелю 187 РР гена N(201 и гомозиготного генотипа по вариантному аллелю гена СУР1А2154АА ассоциировало с протективным эффектом (х2=5,06, Р=0,02; 011=0,36, 95 % 0=0,15-0,86).

В таблице 11 представлены статистически значимые ассоциации межгенных взаимодействий генотипов генов ФБК с развитием различных нозологических форм ВРГ и/или Н.

Таблица 11 - Статистически значимые ассоциации межгенных взаимодействий генотипов генов ФБК с предрасположенностью к различным нозологическим формам ВРГ и Н__

Нозологическая форма Комбинации генотипов N % N % Критерий различий. OR (95%С1)

ВРГ и Н АВСВ1 3435СС х NAT2 590GG 3 6,1 29 19,3 2,99 (0,0498)* 0,31 (0,10-0,99)

ВРГ NAT2 590GG * CYP1A2 154СС 2 11,1 28 0,7 4.68 (0.03)* 14,49(1,80-116,89)

ВРГ NAT2 590АА х NOOl 187 PS 3 15,0 4 2,6 4.16(0.04)* 6,64(1,51-29,25)

ВРГ CYP1B1 432LL х NOOim PS 3 15,8 4 2.8 4.02 (0.04)* 6,53 (1.48-28,89)

BPH АВСВ1 3435ТТ х CYP1B1432LL 2 6,7 1 0,0 4.58 (0.03)* 24,65(1,15-527.29)

Из данных таблицы видно, что сочетанное гомозиготное носительство по нормальному аллелю исследуемых полиморфных маркеров генов АВСВ1 и NAT2 обладало значимым протективным эффектом относительно риска развития сочетания ВРГ и Н (х2=2,99, Р=0,0498; OR=0,31, 95 % 0=0,10-0,99). С развитием ВРГ ассоциировано 3 комбинации генотипов: NAT2 590GG х CYP1A2 154СС (х2=4,68, Р=0,03; OR=14,49, 95 % 0=1,80-116,89), NAT2 590АА х NQOl 187 PS (х2=4,16, Р=0,04; OR=6,64,95 % 0=1,51-29,25 ) и CYPIB1 432LL х NQOim PS (х2=4,02, Р=0,04; OR=6,53, 95 % 0=1,48-28,89). Также установлено, что сочетанное носительство гомозигот по мутантному аллелю генов АВСВ1 и CYP1B1 увеличивало риск развития ВРН (х2=4,58, Р=0,03; OR=24,65, 95 % 0=1,15-527,29).

Выводы

1. Частота ВРГ и/или Н у детей, родившихся в Краснодарском крае за период 1996 - 2012 гг., составила 1,11 %о среди всех живорождённых и 4,5 % от числа всех зарегистрированных ВПР и практически одинакова во всех шести регионах условного территориального подразделения административных районов Краснодарского края.

2. В нозологическом спектре больных с ВРГ и/или Н доминировали (40,33 %) изолированные расщелины нёба, 38,67 % составили сочетанные расщелины губы и нёба, и 21,0 % составили врождённые расщелины губы.

3. В структуре исследованных ВПР у больных с признаком расщелины губы и/или нёба моногенные синдромы (13 нозологий) составили 12,1 %; наследственно детерминированные изолированные ВРГ и/или Н - 5,06 %; хромосомные синдромы - 4,3 % и пороки с невыясненной этиологией (по-видимому, мультифакториального генеза) — 78,54 %.

4. По результатам исследования пяти полиморфных генов ФБК (NAT2, АВСВ1, CYP1A2, CYP1BI, NQOl) установлено, что генотип 187PS гена NQOl, а также аллель 154А гена CYP1A2 ассоциированы с повышенным риском развития ВРГ.

5. Полиморфные варианты генов CYP1A2, CYP1B1 опосредуют формирование ВРГ и/или Н у больных мужского пола; при этом аллель 154А гена CYP1A2 ассоциирован с повышенным риском развития ВРГ, аллель 432V гена CYP1B1 - с повышенным риском развития ВРН.

6. Установлены ассоциации парных сочетаний генотипов, при которых предрасположенность к ВРГ и/или Н наблюдалась чаще, в их числе: 3 парных сочетания генотипов, определяющих предрасположенность к ВРГ, одно сочетание - к ВРН и 1 парная комбинация, связанная с предрасположенностью к сочетанной патологии ВРГ и Н.

Практические рекомендации

1. Рекомендовать практическим врачам при постановке первичного диагноза ВРГ и/или Н направлять пациентов в медико-генетическую консультацию с целью установления окончательного диагноза, а так же прогноза рождения здоровых детей в семьях с отягощённым анамнезом по данной патологии.

2. Рекомендовать для внедрения в практику медико-генетического консультирования генотипирование полиморфизмов генов ФБК (NQOl 187PS, CYP1B1 V432L, CYP1A2 А154С) с целью индивидуального прогнозирования риска развития несиндромальных ВРГ и/или Н в семьях с отягощённым анамнезом по данной патологии.

3. Рекомендовать клиническим врачам-генетикам при постановке диагноза ВРГ и/или Н применять комплексный алгоритм молекулярно-генетического обследования больных с целью установления генеза этих пороков для более точного прогнозирования рождения здоровых детей в семьях с отягощённым анамнезом по данной патологии.

4. Внедрить результаты молекулярно-генетического исследования в образовательный процесс в рамках лекций и практических занятий по генетике

человека и медицинской генетике в медицинских вузах с целью расширения представлений о генезе ВРГ и/или Н.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД аутосомно-доминантный (тип наследования)

АР аутосомно-рецессивный (тип наследования)

ВРГ и/или Н врождённые расщелины губы и/или нёба

ВРГ врождённые расщелины губы

ВРН врождённые расщелины нёба

ВРГ и Н врождённые расщелины губы и нёба

ВПР врождённые пороки развития

ГБОУ ВПО Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

ГБУЗ Государственное бюджетное учреждение здравоохранения

ГУЗ Государственное учреждение здравоохранения

ДККБ детская краевая клиническая больница

КММГК Кубанская межрегиональная медико-генетическая консультация

ЛПУ лечебно-профилактические учреждения

МВПР множественные врождённые пороки развития

ПЦР полимеразная цепная реакция

РФ Российская Федерация

РХВ равновесие Харди - Вайнберга

ФБК ферменты биотрансформации ксенобиотиков

ЦВМиР Центр восстановительной медицины и реабилитации

ЦЛДВПЧЛО Центр лечения детей с врождённой патологией челюстно-

лицевой области

ЭМ электронная микроскопия

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЮФО Южный Федеральный Округ

СУР1А2 цитохром Р-450, семейство А, подсемейство II

СУР1В1 цитохром Р-450, семейство В, подсемейство I

ЫА Т2 Ы-ацетилтрансфераза 2

NQ01 НАД(Ф) дегидрогеназа, хинон 1

АВСВ1 (\4DR1) Ген множественной лекарственной резистентности (гликопротеин-Р)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нехорошкина М.О. Анализ частоты врождённой расщелины губы и/или нёба среди новорождённых в Краснодарском крае/ М.О. Нехорошкина, К.Ю. Лазарев // Материалы II Всероссийской конференции с междунар. участием. «Медико-биологические аспекты мультифакториапьной патологии». -Курск, 2011.-С. 224.

2. Голубцов В.И., Лазарев К.Ю., Нехорошкина М.О. Наследственные синдромы с признаком расщелины верхней губы и/или нёба (учебное пособие для студентов). - Краснодар, 2013. - С. 46.

3. Нехорошкина М.О. Определение этиологических факторов, детерминирующих клинический полиморфизм врождённых расщелин губы и/или нёба у детей Краснодарского края / М.О. Нехорошкина, A.B. Кариди, О.Ю. Бушуева [и др.] // Научно-практический журнал «Врач-аспирант» - 2013. -№5,2 (60).-С. 374-381.

4. Нехорошкина М.О. Анализ структуры и распространённости врождённых расщелин губы и/или нёба на территории Краснодарского края за период 1996 -2012 гг. / М.О. Нехорошкина // Кубанский научный медицинский вестник Медицинский академический журнал. -2013. -№ 6 (141). - 134—138.

5. Нехорошкина М.О. Организация реабилитационных мероприятий при врождённых расщелинах губы и/или нёба в Краснодарском крае / М.О. Нехорошкина, Л.Е. Черкашина, A.B. Гонтмахер // Академический журнал Западной Сибири - 2013. - Т.9. - С. 5-6.

6. Нехорошкина М.О., Кариди A.B., Рыжкова A.B. Исследование кариотипов больных с врождённой расщелиной губы и/или нёба в Краснодарской популяции / М.О. Нехорошкина, A.B. Кариди, A.B. Рыжкова // Современная наука: актуальные проблемы и пути их решения -2013. —№ 2. -С.52-54.

7. Нехорошкина М.О. Клинико-генеалогический анализ при дифференциальной диагностике врождённых расщелин губы и нёба / М.О. Нехорошкина // Международный журнал экспериментального образования - 2013. - №5. -С. 432^34.

8. Нехорошкина М.О. Исследование ассоциации полиморфизма G590A гена NAT2 с развитием врождённых расщелин губы и нёба в Краснодарском крае. / М.О. Нехорошкина, О.Ю. Бушуева, A.B. Полоников [и др.] // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье» -2013. — № 4. - С. 33-38.