Роль белкового ингибитора полигалактуроназы в устойчивости растений к болезням

Буза, Наталья Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль белкового ингибитора полигалактуроназы в устойчивости растений к болезням
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль белкового ингибитора полигалактуроназы в устойчивости растений к болезням"

¥ На правок рукописи

БУЗА НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА

РОЛЬ БЕЛКОВОГО ИНГИБИТОРА ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ В УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К БОЛЕЗНЯМ

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории биохимии фитоиммунитета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук М. А. Процент

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. Д. Щербухнн

кандидат биологических наук А. Н. Смирнов

Ведущая организация: Главный ботанический сад им. И. В. Цшюна РАН

Защита диссертации состоится " СЦг^ииЬЯ _2006 г. в " -У V " часов на

заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корт. 1.

Автореферат разослан " " и&р^п/Х. 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, { Ш^Т^*

кандидат биологических наук / А.Ф. Орловский

2.00С д

>БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы В устойчивости растений к болезням важную роль играет клеточная стенка, которая препятствует внедрению фитопатогенных микроорганизмов. Поэтому изучение биохимических процессов, развивающихся в клеточной стенке весьма актуально для изучения механизмов устойчивости и разработки способов ее повышения.

Многочисленные фитопатогенные грибы различаются по приуроченности к разным растениям: некоторые плесени поражают практически любой органический субстрат, другие грибы более специализированы, а некоторые поражают только определенные сорта одного вида растения и не поражают другие. Фитопатогенные грибы сильно различаются по воздействию на ткани растения. Некоторые из них вызывают размягчение и гнили тканей, внедрение других приводит к локальному повреждению и образованию разнообразных пятнистостей, третьи распространяются в растении, не вызывая развития видимых симптомов, но приводя к снижению урожая. Для разработки методов борьбы с болезнями необходим анализ биохимических процессов, которые развиваются в растении при том или ином заболевании

Внедрение фитопатогенного гриба в значительной степени обеспечивается активностью секретируемого грибом фермента полигалактуроназы (поли-[1,4-а-0-галактуронид] гликаногидролаза, КФ 3.2.1.15 - ПГ)> который катализирует гидролиз гликозидной связи а-1,4 в полигалаюгуроновой цепи деметоксилированного пектина растительной клеточной стенки. ПГ присутствует также в интактных растительнных тканях, обеспечивая превращения пектиновых веществ при растяжении клеток в растущих побегах и подземных органах, при прорастании пыльцы, сбрасывании листьев, размягчении созревающих плодов и других процессах.

В числе белков клеточной стенки обнаружен ингибитор полигалактуроназы (белковый ингибитор полигалактуроназы - БИ111). Пока мало изучена его роль в клеточной стенке растения, однако, интенсивно изучается его участие в устойчивости растений к болезням. Снижая активность ПГ, ингибитор затрудняет внедрение микроорганизмов и уменьшает разрушающее

197]). Кроме того, его действие приводит к видоизменению продуктов расщепления пектина, которые возникают в процессе патогенеза и оказывают влияние на многие биохимические процессы в клетке, в частности стимулируют реакции, препятствующие распространению патогена по тканям (Nothnagel et al., 1983). Многие исследователи выявили корреляцию содержания БИПГ в растительных тканях с их устойчивостью к поражению фитопатогенными грибами (De Lorenzo et al., 2001) Выявлены существенные различия в действии БИПГ из одного вида растения на ПГ разных грибов, а также в действии БИПГ из разных растений на ПГ из одного источника. Отмечено, что БИПГ, часто не действует на ПГ грибов, не поражающих растение, из которого он выделен, и в значительно меньшей степени влияет на ПГ грибов-патогенов данного растения (Глинка и др., 2001). Следовательно, растение поражается грибами, ПГ которых не ингибируется при действии БИПГ данного растения. Это позволяет считать БИПГ одним из важных факторов устойчивости растений к болезням.

Таким образом, БИПГ участвует в регуляции процессов в растении, как связанных с ростом и развитием, так и обусловливающих устойчивость к внедрению фитопатогенных микроорганизмов.

В настоящее время БИПГ обнаружен практически во всех тканях всех изучавшихся растений. Выяснена структура его молекулы, показано его сходство с белками - продуктами многих генов устойчивости (белками PR), охарактеризованы гены БИПГ из некоторых растений. Сравнение нуклеотидных последовательностей показало, что гены БИПГ ряда растений гомологичны в высокой степени (Favaron et al., 1994). Они кодируют полипептиды, содержащие повторности, обогащенные лейцином (белки LRR) и имеющие фиксированное положение цистеина.

Получены данные о различиях в экспрессии генов БИПГ в разных органах растений (Toubart et al., 1992, Stotz et al., 1993) и стимуляции экспрессии при поранении, заражении фитопатогенными грибами и действии некоторых других повреждающих факторов (Favaron et al., 1994; Bergman et al., 1994).

Роль БИПГ в биохимических процессах как в интактном растении, так и при патогенезе, остается неясной.

Пели и задачи исследования. Основная цель настоящей работы: изучение изменения содержания БИПГ в тканях растений на разных стадиях роста и развития, и влияние его на устойчивость к поражению фитопатогенными микроорганизмами.

В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Получить высокоочищенный препарат БИПГ из клубней картофеля.

2 Получить препараты ПГ из культуральной жидкости разных микроорганизмов и тканей растений для выявления действия ингибитора.

3 Изучить действие БИПГ растений на активность ПГ из разных источников.

4 Изучить изменение содержания БИПГ в плодах яблони сортов, различающихся по срокам созревания, и сопоставить с интенсивностью поражения их фитопатогенными грибами.

Научная новизна работы Получен высокоочищенный препарат БИПГ из клубней картофеля сорта Невский, что позволило выявить по крайней мере две его изоформы и определить для одной из них молекулярную массу 40±1 кДа и р! 8,8. Изучено содержание БИПГ в плодах яблони различных сортов. Показано изменение его содержания в плодах в процессе роста и созревания Обнаружена обратная корреляция содержания БИПГ с интенсивностью поражения плодовой гнилью Monilia fructigetta, что свидетельствует о его участии в процессах, препятствующих распространению патогена по тканям плода. Впервые выявлена активность БИПГ в плодах банана и обнаружено его действие на собственную ПГ, которое свидетельствует о роли БИПГ в регуляции активности ПГ в тканях растения. Также впервые выявлена активность БИПГ в тканях клубней топинамбура.

Теоретическая и практическая значимость работы В работе получена дополнительная информация по характеристике БИПГ из клубней мало изученного в этом отношении растения картофеля Полученные результаты существенно дополняют информацию о роли БИПГ как в устойчивости к болезням, так и в процессах, связанных с ростом и развитием растения Особенный интерес представляют данные об изменении содержания БИПГ в плодах яблони в процессе роста и хранения, а также об обратной корреляции устойчивости яблок к плодовой гнили с содержанием БИПГ в них. Получены новые сведения о действии БИПГ на ПГ из растения, подтверждающие его участие в биохимических процессах в растении. Материалы диссертации могут быть использованы в специализированных учебных курсах, а также учтены при разработке способов повышения устойчивости растений к болезням и тестирования физиологического состояния растительного материала.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III Съезде Биохимического общества в Санкт-Петербурге, 2002; на V Съезде Общества физиологов растений в Пензе, 2003; на международных симпозиумах и конференциях: в г. Санкт-Петербурге, 2001, в г. Пущино, 2002, в г. Пенза, 2003, в г Саратове и г Минске, 2005 и др По результатам диссертации опубликовано 15 печатных работ (3 статьи и 12 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (-$/ссылок) Работа изложена на UCiлр. машинописного текста содержит Л?Грисунков и . .^-таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты исследования. Частично очищенные препараты, обладающие активностью БИПГ, получены из следующих растений: клубни и листья картофеля (Solanum tuberosum) сорта Невский, клубни топинамбура (Helianthus tuberosus), плоды перца (Capsicum mexicanum), плоды яблони (Malus domestica) сортов: Коричное полосатое, Памяти Тихомирова, Антоновка обыкновенная, Студенческое, Московское зеленое, Московское позднее, и двух диких видов Malus platycarpa, Malus caerulescens, плоды банана (Musa sp.) сортов Кавендиш и Королевский, листья капусты (Brassica oleráceo).

Препараты ПГ были получены из следующих источников- Verticillium dahliae (выделен с хлопчатника), Monilia fructigena (с яблок), Fusarium solani (с томата), F graminearum (с пшеницы), Phytophtora infestans (с картофеля), Gloeosporium musarum (с банана), а также ризосферные бактерии рода Pseudomonas (штаммы 464, 30-84, 445, 279,66,146, 33-А), этиолированные ростки картофеля, плоды банана.

Выделение БИПГ. Для получения препарата БИПГ из вышеперечисленных растений определенное количество ткани гомогенизировали (в соотношении 1 -2, весюбъем) в среде выделения, содержащей 20 мМ ацетатный буфер, pH 5.2 с 2 мМ меркаптоэтанола. Гомогенат, содержащий клеточные стенки, промывали и экстрагировали таким же буфером, содержащим 1 М NaCl, на магнитной мешалке при 4сС в течение 1 часа. Из экстракта материал осаждали (NH^SOí при насыщении 90%, инкубировали в течение ночи при 4°С и центрифугировали 30 мин при 6000 g. Осадок растворяли с последующим обессоливанием.

Очистку препаратов БИПГ проводили с помощью гель-фильтрации (сефадекс G-75), ионообменной хроматографии (КМ-сефадекс G-25) и препаративного изоэлекрического фокусирования (в градиенте плотности сахарозы в диапазоне pH 7-9) в соответствии с рекомендациями фирмы "LKB" (Hougland, 1971).

Получение культуральных фильтратов V dahliae, М fructigena, F solani, F graminearum культивировали в жидкой питательной среде, приготовленной на основе прописи, предложенной Малка и др. (Malka et al., 1966). Для выращивания Р infestans использовали модифицированный вариант среды Гроссмана (Grossmann, 1968).

Бактерии рода Pseudomonas выращивали на среде по прописи Шелл и др. (Schell et al., 1988).

Получение препаратов ПГ. После культивирования грибов в течение 10 суток из культуральных фильтратов получали ферментные препараты Мицелий отфильтровывали через капроновый фильтр, споры гриба осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 минут при 4°С. Полученный супернатант пропускали через миллипоровые фильтры фирмы "Synpor" с размером пор 0,45 мкм. Ферментные препараты получали осаждением сернокислым аммонием при 90% насыщении. После внесения в культуральный фильтрат навески (NfL^SC^ раствор оставляли на ночь при +4°С, затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 минут Полученные осадки растворяли в дистиллированной воде и диализовали в течение 20 часов против 200 объемов дистиллированной воды в диализных трубках "Visking Diálisis Tubing 8/32" ("Serva", Германия). Получение препаратов ПГ из бактерий проводили аналогично Из тканей растений препарат ПГ получали путем экстракции 20 мМ ацетатным буфером pH 5,2 с 2 мМ меркаптоэтанола, с последующим осаждением (NH^SO^

Определение активности методом «cup-plate». В обессоленных препаратах определяли активность полигалактуроназы «чашечным» методом (Dingle, 1953). Препарат вносили в лунки со специализированной, модифицированной средой содержащей 1% деметоксилированный пектин. Активность фермента проявлялась (с использованием 1% цетавлона) в виде обесцвеченной зоны вокруг лунок. Интенсивность ингибирующего действия выражали в условных единицах (Усл. ед.), рассчитанных как процент уменьшения под действием БИПГ радиуса обесцвеченной зоны, отнесенный к количеству белка препарата и сырому весу ткани, из которой получен препарат.

Определение активности по редуцирующим группам Активность ПГ определяли спектрофотометрически по увеличению количества редуцирующих групп, измеряемого при длине волны 595 нм (Milner, 1967). В качестве стандарта использовали D-галактуроновую кислоту (фирма "Sigma", США) За единицу активности (1 Ерг) принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль редуцирующих групп за 1 мин при 30° С За единицу ингибирующей активности принимали количество ингибитора, необходимое, для уменьшения активности 1 Ерр в культурапьном фильтрате V. dahliae на 50 %. Ингибирующую активность рассчитывали на 1 г веса сырого материала и выражали в единицах ингибирования (Ей).

Содержание белка в препаратах определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

SDS-электроФорез в 10 % ПААГ проводили в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN II Electrophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США).

Аналитическое изоэлектрическое Фокусирование осуществляли в пластинах ПААГ на приборе Multiphor II 2117 "LKB" (Швеция) в 1 % растворе амфолинов в градиенте pH 7-9.

Препаративное изоэлектрическое фокусирование проводили в соответствии с рекомендациями фирмы LKB (Haglund, 1971) на аналитической колонке LKB (Швеция).

Определение интенсивности выделения этилена проводили методом ГЖХ на приборе Хром-4 (Чехия) с плазменно-ионизационным детектором. Количество этилена определяли по калибровочной кривой и выражали в мкл/кг/сут.

Определение интенсивности поражения. Для определения интенсивности поражения возбудителем плодовой гнили М fructigena яблоко разрезали на диски толщиной 1,5-2 см, которые помещали во влажную камеру и инокулировали кусочком мицелия. Локализацию пораженной ткани определяли по побурению и изменению консистенции (размягчению). При необходимости проводили также микроскопическое исследование.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTIKA-5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. БЕЛКОВЫЙ ИНГИБИТОР ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ В РАСТЕНИИ КАРТОФЕЛЯ (SOLANUM TUBEROSUM L.).

1.1. Выделение и очистка БИПГ из клубней картофеля.

Хотя исследованию ингибитора в сочных плодах посвящено значительное число работ, в вегетирующих растениях он мало изучен, практически отсутствуют данные, посвященные клубням растений, в частности картофелю. Поскольку картофель является традиционным объектом исследования в нашей лаборатории и имеет большое практическое значение, мы провели изучение ингибитора полигалактуроназы в клубнях и побегах растения картофеля.

БИПГ выделяли из клубней картофеля сорта Невский. Для его очистки использовали гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-75 (рис. 1). Фракции 8-25, содержащие активность БИПГ, объединяли и дальнейшую очистку проводили с использованием ионнообменной хроматографии на КМ-сефадексе G-25.

Номер фракции

Рис. 1. Гель-фильтрация через сефадекс 0-75 препарата БИПГ из клубней картофеля сорта Невский. 1 - О (280), 2 -ингибирующее действие (% ингибирования).

Во фракциях, полученных при элюции с КМ-сефадекса, определяли ингибирующее действие БИПГ. При хроматографировании с использованием ацетатного буфера рН 5,2 ингибитор связывался с КМ-сефадексом и элюировался 0,2 М ЫаС1 в двух пиках (рис. 2).

Рис. 2. Ионнообменная хроматография препарата БИПГ на КМ-сефадексе 0-25 (2,4 х 12,5). Скорость элюирования 0,5 мл/мин, объем фракции - 2 мл. 1 - 0(280), 2 - ингибирующее действие (% ингибирования).

Активность БИПГ была обнаружена во фракциях 14-15 и во фракциях 22-24, которые сконцентрировали в концентрационных пробирках и использовали в аналитическом изоэлектрофокусировании на пластинах полиакриламидного геля с диапазоном рН 7 - 9. После изоэлектрофокусирования одна часть геля была окрашена, другую часть отрезали без покраски. Неокрашенную часть геля, содержащую трек с исходным препаратом разрезали на фрагменты размером 1 см, которые поместили в 10 эппендорфов с ацетатным буфером рН 5,2 Элюция белков из геля проводилась 2 часа при комнатной температуре. Тестирование на активность показало наличие БИПГ в пробирках № 7 и № 8. Ингибирование ПГ тест-объекта в пробирке № 7 составляло 90 %,

а в пробирке № 8 - 100%. Фрагменты геля в пробирках соответствуют области с р1>8 на окрашенном геле {рис. 3).

р1

8.15

8.45 8.65

_1_

10 5 6

Рис. 3. Аналитическое изоэлектрофокусирование в дипазоне рН 7-9. 1 - после в -75, 2-14 фракция после КМ - сефадекса, 3-15 фракция после КМ -сефадекса, 4-22 фракция после КМ-сефадекса, 5 -исходный препарат БИПГ из клубней картофеля сорта Невский, 6 - неокрашенная часть геля, разрезанная на фрагменты.

Треки с фракциями 14 и 15 содержат полосу в области р18.8, а в треке с фракцией № 22 она не обнаружена. По-видимому, р1 формы БИПГ, локализующейся во фракции 22, находится за пределами исследуемого интервала рН (7-9).

Препаративное изоэлектрическое фокусирование предварительно очищенного на сефадексе С-75 препарата БИПГ проводили в колонке с градиентом плотности сахарозы в диапазоне рН 7-9. Первый этап очистки представлен на рис. 4. Фракции № 21-26 содержали активность БИПГ. Фракции 21-24 соответствовали рН 8.8, а фракции 25-26 имели рН 8.9.

Рис. 4. Первый этап препаративного изоэлектрофокусирования в интервале рН 7-9. 1 - Э (280), 2 -рН. Стрелками указаны начальная и конечная фракции с активностью БИПГ.

Фракции 21-28 с иигибирутощей активностью объединили, сконцентрировали и использовали во втором этапе препаративного изоэлектрофокусирования с диапазоном рН 7-9. На рис. 5 видно, что только одна фракция № 23 имеет активность БИПГ. Значение р! также соответствует ранее установленному значению равному 8 8

Рис. 5.11-й этап препаративного изоэлектрофокусирования в интервале рН 7-9. 1 - Б (280), 2 - рН. Стрелкой указана фракция с активностью БИПГ.

Как показали результаты БОв-ПААТ электрофореза, в этой фракции содержится высокоочищенный препарат БИПГ, обладающий высокой ингибирующей активностью (рис. 6). Все три полосы были вырезаны из геля и после элюции в ацетатном буфере рН 5,2 белки протестированы на активность. Только в одной полосе в районе 40 кДа обнаружена активность БИПГ.

Номер фракция

Рис. 6. ЭОЗ- ПААГ форез после препаративного

Ша

116 —► -66 —► ~ 45 —►

35 _*" изоэлектрофокусирования в диапазоне рН 7-9.

1 - маркеры, 2 - фракция № 23.

25 —► «

18.4 —► ,

1 2

Результаты очистки БИПГ из клубней картофеля сорта Невский приведены в табл. 1.

Табл. 1. Частичная очистка БИПГ из клубней картофеля сорта Невский.

Стадия очистки Удельное ингибирование (усл.ед.)

Исходный препарат 7,5

Сефадекс G-75 34,8

КМ-сефадекс 75,0

I этап изоэлектрофокусирования 80,0

II этап изоэлектрофокусирования 93,8

Ранее при очистке БИПГ из клубней картофеля сорта Истринский с использованием SP-сефадекса, выявлено также две формы БИПГ (Глинка и др., 1996). Молекулярная масса одной из них определена в пределах 56-65 кДа. Молекулярная масса БИПГ из листьев картофеля сорта Spunta, составляла 41 кДа (Machinandiarena et. al., 2001). Следовательно, в соответствии с имеющимися в настоящее время данными, БИПГ картофеля разных сортов несколько различаются по молекулярной массе.

Таким образом, мы получили высокоочищенный препарат БИПГ из клубней картофеля, что позволило выявить по крайней мере две его изоформы и определить для одной из них молекулярную массу 40±1 кДа и pl 8,8.

1.2. Содержание БИПГ в листьях картофеля на разных стадиях развития растения.

Растения в разной степени подвержены заражению теми или иными фитопатогенными микроорганизмами в зависимости от стадии онтогенеза (Дунин, 1946). Поскольку БИПГ может служить одним из факторов устойчивости, мы анализировали его содержание в листьях картофеля в связи со стадиями развития растения. БИПГ выделяли из листьев, расположенных в среднем ярусе побега картофеля сорта Невский на стадиях: 1) вегетативной, 2) генеративной: 2а) в фазе формирования соцветия, 26) в фазе активного цветения, 2в) в фазе плодоношения и клубнеобразования.

В полностью сформировавшихся листьях картофеля выявлена активность БИПГ, содержание которого в конце вегетативной стадии было сравнительно высоким (рис. 7). К началу генеративной стадии (в первой половине июля) его содержание уменьшалось, и к моменту формирования соцветия и закладки клубней (середина июля) было минимальным. Затем до конца цветения (конец июля) содержание ингибитора увеличивалось, а количество белка несколько снижалось к началу формирования плодов.

вегетативная стадия генеративная стадия генеративная стадия генеративная стадия (формирование (аютюиое цветение) (плодоношение) соцветия)

Стадии развития растения

Рис. 7. Содержание БИПГ из листьев картофеля сорта Невский на разных стадиях развития растения, а - ингибирование, б - содержание общего белка.

Изменение содержания БИПГ в листьях одного яруса, по-видимому, отражает важные изменения в обмене веществ всего растения, связанные как с переходом от вегетативной к генеративной стадии, так и с интенсификацией ростовых процессов при формировании клубней. При этом возможно изменение устойчивости растения к поражению теми фитопатогенными микроорганизмами, ПГ которых подвержена ингибирующему действию БИПГ картофеля.

1.3. Содержание БИПГ в клубнях картофеля в процессе хранения при разных условиях.

Как известно, температура окружающей среды существенно влияет на биохимические процессы в растении. Мы определяли содержание БИПГ в клубнях картофеля сразу после уборки и после хранения в течение 14 и 28 дней при температуре +18° С и +4° С (рис. 8). Через 14 дней после уборки содержание БИПГ в клубнях увеличивалось, причем несколько сильнее при +4° С, чем при +18° С. После 28 дней хранения содержание БИПГ несколько снижалось и оказалось практически одинаковым, независимо от температуры хранения Действие низких температур способствует закаливанию некоторых растений, в том числе картофеля (Vega et al., 2000). При закаливании в растениях увеличивается содержание белков с LRR (Meyer et al., 1999). Поскольку БИПГ также содержит LRR, возможно, в картофеле он играет роль такого белка, который накапливается при действии низкой температуры

ЛтЛ

Рис. 8. Содержание БИПГ из клубней картофеля сорта Невский в условиях хранения при температуре +18 С (а) и +4 С (б).

Активность БИПГ обнаружена в этиолированных ростках, образовавшихся на клубнях в конце хранения. Кроме того, нам удалось получить из ростков препарат, содержащий активность ПГ, которую обычно довольно трудно выявить в растительных тканях, вероятно, из-за низкой ее активности или маскировки действием ингибитора. Препараты БИПГ, полученные из ростков, а также из клубней картофеля и плодов яблони, снижали активность ПГ в препарате из ростков. Ранее не удавалось выявить действие БИПГ на ПГ растения. По-видимому, при интенсивном растяжения клеток в этиолированных ростках происходят превращения пектиновых веществ, требующие накопления значительных количеств как ПГ, так и регулирующего ее активность БИПГ, что позволило их обнаружить в этом материале.

2. БЕЛКОВЫЙ ИНГИБИТОР ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ В КЛУБНЯХ ТОПИНАМБУРА (НЕШКГНиБ ТиВЕЯОБиЗ I.).

Топинамбур НеИамкив ¡иЬегохш Ь. возделывается в ограниченных масштабах, хотя имеет большое значение в качестве источника витаминов и лекарственных веществ. Он относится к группе растений, имеющих подземные запасающие органы в виде клубней (модифицированных стеблей) (Маркаров, 2001). В его тканях, как и в тканях картофеля, можно ожидать присутствие БИПГ. Ранее БИПГ топинамбура не изучали.

Препараты БИПГ получали из сформировавшихся клубней, собранных в октябре, а также хранившихся при температуре 4°С и 20°С. Препараты из свежесобранных клубней топинамбура ингибировали ПГ V ёаЬНае на 9%, что свидетельствует о присутствии в препарате БИПГ. В препаратах из клубней, хранившихся при 4°С, активность БИПГ не выявлялась уже в ноябре, т.е. через месяц, тогда как при 20°С она была в это время довольно высокой и приводила к ингибированию ПГ на 10%. В декабре активность БИПГ в клубнях топинамбура не выявлялась. Французские

исследователи отмечали иигибирование прорастания клубней топинамбура при повышенной температуре (Coudroux, 1967). Возможно, что более высокое содержание БИПГ при 20°С связано с его участием в ингибировании ростовых процессов.

3. БЕЛКОВЫЙ ИНГИБИТОР ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ В ПЛОДАХ ЯБЛОНИ (MALUS DOMESTICA Borkh.).

3.1. Содержание БИПГ в плодах яблони разных сортов в процессе роста и созревания.

Плоды яблони содержат значительное количество пектиновых веществ, поэтому они могут служить удобным объектом для изучения процессов, связанных с их превращениями, в частности, содержания БИПГ. БИПГ был ранее обнаружен в плодах яблони, однако динамика его содержания в процессе роста плодов ранее не изучалась. Мы определяли содержание БИПГ в течение двух сезонов вегетации в плодах яблони б сортов, различающихся по скороспелости, в процессе их роста на дереве, начиная с 40-го дня после цветения с интервалом 2 недели.

Использованные в работе сорта яблок существенно различались по активности БИПГ, и содержанию белка, что, по-видимому, связано с разными темпами роста и развития плодов и сортовой специфичностью. Максимальное значение содержания БИПГ, достигаемое за все время эксперимента, у летних сортов (Коричное полосатое и Памяти Тихомирова) было существенно ниже, чем у ранне-зимнего (Антоновка обыкновенная) и поздне-зимних сортов (Московское позднее и Студенческое). Исключение составлял поздне-зимний сорт Московское зеленое, в плодах которого максимальная активность БИПГ была такой же, как у летнего сорта Коричное полосатое. При этом у Московского позднего высокое содержание БИПГ (рис. 9), так же, как и

потребительские качества плодов, сохранялись в течение длительного времени (до ноября при хранении без охлаждения) Кривая, характеризующая содержание БИПГ,

Рис. 9. Динамика содержания БИПГ в плодах яблони сорта Московское позднее. 1 - 2002 г., 2 - 2003 г.

//////mv^w////

полученная в 2002 году, коррелирует с кривой, полученной в экспериментах 2003 года, что подтверждает коэффициент корреляции. Для Московского позднего он был равен 0,5 при уровне значимости р<0,05.

В процессе роста на дереве и затем после съема содержание БИПГ изменялось по-разному в плодах яблони разных сортов, однако выявлены некоторые общие закономерности. Отмечены два основных пика увеличения содержания БИПГ. Один, меньший, выявлен в период до наступления технической зрелости. Второй, значительно больший,'проявлялся в процессе дозревания после съема плодов.

В период технической зрелости (ко времени съема плодов с дерева) происходило снижение содержания БИПГ, которое затем сильно возрастало. Следует отметить, что эти изменения происходили независимо от момента фактического отделения плодов от дерева. У сортов Антоновка и Московское зеленое кривая изменения содержания БИПГ имела несколько пиков, но сохранялась общая закономерность снижения его содержания ко времени технической зрелости и значительного повышения в период дозревания.

В плодах двух других исследованных видов рода Malus динамика содержания БИПГ сохраняла те же закономерности, что и в плодах сортов М domestica (рис. 10).

Рис. 10. Динамика содержания БИПГ из плодов яблони двух диких видов рода Malus.

1 - содержание БИПГ из плодов яблони

Malus coerulescens (2003 г.) 2- содержание БИПГ из плодов яблони Malus platycarpa (2003 г.)

В плодах М р1а1усагра, имеющих очень плотную консистенцию, максимальное содержание БИПГ было выше, чем в других плодах. Плоды более скороспелого М саеги1езсет размягчались к концу периода созревания и содержание БИПГ в них было более низким. Эти данные могут служить подтверждением участия БИПГ в формировании структуры тканей плодов яблони.

Показано, что кривая, характеризующая содержание растворимого пектина в процессе роста и созревания яблок, имеет два пика (НоЬбоп, 1981). Один из них приходится на период роста плодов, второй - после наступления технической зрелости (Сапожникова, 1965). Выявленные нами два периода повышения активности БИПГ, по-видимому, связаны с динамикой превращения пектиновых веществ в плодах.

3.2. Интенсивность поражения плодов яблони возбудителем плодовой гнили МотПа ТгисНеепа в процессе роста и созревания

В процессе созревания плодов яблони в саду не только формируются характерные потребительские качества, но и закладываются основы для дальнейшего успешного хранения. Несмотря на то, что бурая гниль плодов яблони, вызываемая грибом М /гис11§епа, известна давно и является одной из самых распространенных болезней в садах, механизмы, обеспечивающие устойчивость к ней, изучены явно недостаточно. Для изучения этих механизмов необходимы сведения об изменении степени поражения плодов в разные периоды их созревания, когда происходят значительные изменения состава н биохимических процессов в тканях плода. Поэтому в задачу нашего исследования входило проследить изменение интенсивности распространения гриба по тканям плодов яблони в течение вегетационного периода от начала созревания до периода технической зрелости и далее в процессе хранения.

Скорость распространения М. /гис^епа по тканям всех исследованных сортов яблок была значительно выше в начале периода созревания и снижалась ко времени технической зрелости плодов (рис. 11). Максимальная интенсивность поражения М /гис^епа достигала более высоких значений у летних и ранне-зимнего сортов, чем у поздне-зимннх. По мере созревания плодов скорость распространения гриба по тканям существенно снижалась. У летних сортов (Коричное полосатое и Памяти Тихомирова) это снижение продолжалось до периода технической зрелости в конце августа - начале сентября. Затем отмечено некоторое увеличение интенсивности поражения в начале сентября у Коричного полосатого и в середине сентября у сорта Памяти Тихомирова, после чего скорость распространения гриба опять снижалась. Интенсивность поражения тканей плодов более позднеспелых сортов постепенно снижалась к середине сентября, а затем несколько увеличивалась. Скорость распространения гриба изменялась обратно пропорционально содержанию БИПГ. Коэффициент корреляции между интенсивностью поражения и содержанием ингибитора для сорта Московское позднее составлял р = -0,59, для сорта Антоновка р= -0,57, что свидетельствует об участии БИПГ в снижении поражаемости яблок плодовой гнилью. Интенсивность поражения мало различалась для плодов, хранившихся при 4'С или 20'С, несмотря на то, что товарные качества утрачивались раньше при высокой температуре.

2 >

«О 40 20

Zim 22.08 13.09 05.08 03X19 27.09

усл. ед. мкг/г ' ri4

2 0

'»-■»о

мм

усл. ед. мкг/г

усл. ед. nrrt:

_ Til

40 20 О

22.07 22.08 13.09 " 05.08 03.09 27.09

усл. ед. мкг/г

22.07 22.08 13.09 11.10 11.11 05.08 03.09 27.09 2S.10 22.11

22.07 22.08 13Л9 11.10 11.П 05.08 03.09 27.09 25.10 22.11

Рис. 11. Содежаиие БИПГ в плодах яблони и интенсивность поражения их Л/ fructigena. Коричное полосатое (а), Студенческое (б), Памяти Тихомирова (в), Московское позднее (г), Московское зеленое (д), Антоновка обыкновенная (е). 1 - активность БИПГ (усл.ед); 2 - интенсивность поражения (мм), 3 - содержание общего белка (мкг/г).

Устойчивость растений к поражению фитопатогенными грибами связывают с действием присутствующего в апопласте растительной ткани БИПГ на активность ПГ патогена (De Lorenzo, 2001). Роль БИПГ в устойчивости плодов яблони к болезням мало изучена. В литературе приводятся на этот счет только отрывочные сведения. Как правило, действие БИПГ не влияет на распространение по тканям растения грибов, поражающие разнообразные субстраты, например, видов Penicillium. В то же время, присутствие БИПГ ограничивает поражение тканей некоторыми специализированными патогенами. К числу таких патогенов относятся Nectria galligena, Phomopsis mali, Fusarium lateritium, Glomerella cingulata (Wu et al., 1993). Наши исследования добавили к этому списку М fructigena

Устойчивость плодов яблони к болезням издавна связывали с разными биохимическими показателями, в частности, с кислотностью клеточного сока и содержанием Сахаров (Вартапетян, 1976). В нашей работе выявлена корреляция интенсивности поражения разных сортов М. fructigena и содержания БИПГ в тканях (Рис. 12). У более сильно поражающихся летних сортов Коричного полосатого и Памяти Тихомирова содержание ингибитора ниже, чем у поражающихся слабее зимних сортов.

В то же время, у зимних сортов выше кислотность клеточного сока и ниже содержание Сахаров.

<0 О.

аб

Сорта

аб

Рис. 12. Некоторые показатели состояния плодов яблони разных сортов в период технической зрелости. 1 - Московское позднее; 2 - Студенческое; 3 - Антоновка; 4 -Московское зеленое; 5 - Коричное полосатое; 6 - Памяти Тихомирова; а - поражение М. fructigena, мм; б - БИПГ (усл. ед); в - титруемая кислотность (%); г - сахара (%).

Очевидно, и эти факторы в определенной степени обусловливают интенсивность поражения тканей яблок М. fructigena. При этом вклад каждого из них оказывается разным для разных сортов.

Проведенное нами исследование показало, что интенсивность поражения плодов яблони возбудителем плодовой гнили М fructigena снижается по мере созревания и несколько увеличивается в конце периода хранения. Биохимические изменения при формировании и созревании плодов характеризуются комплексом процессов (Hulme, Rhodes, 1971). Высокое содержание в плодах яблони пектиновых веществ, являющихся важной составной частью клеточной стенки, обусловливает не только потребительские качества плодов, но и ряд их физиологических особенностей. Поскольку внедрение фитопатогенных микроорганизмов связано с разрушением пектиновых веществ, БИПГ, осуществляющий определенные функции при созревании плодов, может препятствовать распространению по тканям растения тех грибов, ПГ которых чувствительна к его ингибирующему действию.

4. БЕЛКОВЫЙ ИНГИБИТОР ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ В ПЛОДАХ БАНАНА (MUSA sp.).

В плодах банана, как и в некоторых других сочных плодах, активность ПГ увеличивается по мере созревания. В процессе созревания плодов изменяется интенсивность выделения этилена, сопровождающаяся изменением целого комплекса процессов, в том числе связанных с мацерацией тканей, обусловленной разрушением пектина. При этом, хотя несомненна корреляция содержания БИПГ в плодах со

степенью их размягчения при созревании, не показано непосредственное действие БИПГ из растения на собственную ПГ (Сегтопе, 1990). В плодах банана БИПГ не изучали.

В экспериментах использовали плоды банана сортов Королевский и Кавендиш. В мякоти плодов банана выявлена ПГ, при этом сорта различались по активности фермента. В кожуре активность фермента не обнаружена. Отмечено, что в процессе созревания размягчение тканей сопровождается интенсификацией выделения этилена и активизацией ПГ. В нашу задачу не входило изучение динамики созревания плодов банана, однако, мы выявили некоторое различие между сортами по интенсивности выделения этилена, которое коррелировало с активностью ПГ. Очевидно, биохимические процессы отражают состояние плода в зависимости не только от стадии развития, но и от сорта.

БИПГ выявлен во всех тканях плодов банана, причем в кожуре интенсивность его действия существенно выше, чем в мякоти (Табл. 2).

Таблица 2. Выделение этилена (мкл/кг/сут.) плодами банана, активность ПГ (Е. а. - мм/мг белка/г сырого веса ткани) и интенсивность действия БИПГ (усл. ед. - % ингибирования/мкг белка/г сырого веса ткани) из плодов банана на ПГ V. с1аЫюе.

Сорт Этилен ПГ БИПГ

мякоть кожура мякоть

Кавендиш 9,8±0,50 6,3±0,31 1,7±0,22 0,3±0,05

Королевский 12,0±0,70 9,6±0,41 1,2±0,32 0,2±0,02

Вероятно, более высокая плотность кожуры по сравнению с мякотью обусловлена, в частности, присутствием БИПГ, ингибирукмцего действие ПГ -фермента, вызывающего мацерацию тканей. Хотя исследованные нами сорта бананов мало различались по содержанию БИПГ, но как в кожуре, так и в мякоти сохранялась тенденция его обратной корреляции с активностью ПГ (Табл. 2). БИПГ из плодов банана довольно интенсивно ингибировал собственную ПГ (Табл. 3).

БИПГ из плодов банана сорта Кавендиш слабо действовал на ПГ из патогена банана О тшагит, в то же время БИПГ из картофеля, перца и яблок несколько сильнее ингибировал фермент (Табл. 3). Следует отметить, что в ти.чагит не является характерным патогеном этих растений, а V сЗаИНае относится к числу патогенов широкого спектра действия. При использовании этого гриба в качестве тест-объекта обнаружены некоторые различия в действии БИПГ из разных растений на его ПГ.

Наиболее интенсивным оказалось действие БИПГ из яблок на ПГ как из V. dahliae, так и из G. musarum.

Действие БИПГ in vitro на ПГ из растения ранее не удавалось обнаружить Мы выявили действие БИПГ из плодов банана на ПГ из тех же плодов, что определенно доказывает не только его участие в устойчивости к болезням, но и роль в обмене веществ растения, в котором он синтезируется.

5. ДЕЙСТВИЕ БИПГ ИЗ РАСТЕНИЙ НА ПГ РИЗОСФЕРНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS.

Некоторые виды свободноживущих бактерий, обитающие в ризосфере растения, оказывают на него благоприятное действие, повышая всхожесть, стимулируя рост, повышая устойчивость к болезням (Hallmann, 1997). К числу таких бактерий относятся представители рода Pseudomonas (Frommel, 1991). Представляет интерес исследование механизмов взаимодействия бактерий этого рода и метаболитов растения, в частности, действие БИПГ растения на ПГ, выделяемую бактериями.

При культивировании некоторых видов и штаммов Pseudomonas в жидкой среде выявлена активность ПГ, которая была в 10 раз более низкой, чем у фитопатогенного гриба V dahliae. По-видимому, низкая активность ПГ у видов рода Pseudomonas, в числе прочих факторов, обусловливает отсутствие патогенного действия на растение. У одного из штаммов Р. aureofaciens активность ПГ не была обнаружена при использованных условиях культивирования. Другие исследованные виды и штаммы различались по активности фермента (Рис. 13).

БИПГ, выделенный из яблок, ингибировал активность ПГ одного из штаммов Р. aureofaciens (шт. 30-84) примерно на 10%, в то время как БИПГ из клубней картофеля не действовал на ПГ Pseudomonas.

Гл. Ря. 464 30-84 ее

р.р. p.f. 146 2-79

Рис. 13. Активность ПГ у видов и штаммов Pseudomonas. P.a. - Pseudomonas aureofaciens; P.l. -Р. lachrimans; P.p. - P putida; P.f. - P. fluorescens. Стрелкой указан штамм, на ПГ которого оказывал ингибирующее действие БИПГ из плодов яблони.

Штаммы бактерий

Вероятно, при взаимодействии растения и бактерии функционирует достаточно сложная система механизмов, в которой ингибитор полигалактуроназы занимает пока еще не выясненное место.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Мы выявили присутствие БИПГ в клубнях, ростках, листьях, плодах растений. Его действие проявлялось менее эффективно в периоды интенсивного роста побегов или созревания и размягчения плодов. Представляется важным обнаруженное нами изменение содержания БИПГ в листьях картофеля в период формирования цветков, а также во время образования клубней. По-видимому, интенсивность синтеза БИПГ изменяется во всем растении, а локальное его функционирование в тех или иных органах обеспечивается дополнительными механизмами. Несомненно, что БИПГ играет важную роль в регуляции превращений пектиновых веществ, связанных с процессами роста и развития тканей растения. В настоящее время в литературе отсуствуют данные о действии БИПГ из растения на ПГ. также присутствующую в растительных тканях. Возможно, это объясняется высокой согласованностью процессов в растении, когда активность ПГ проявляется только строго локализовано, а при выделении маскируется действием БИПГ. Вероятно, что выбранные нами объекты (банан, этиолированные ростки картофеля) отличаются особенностями биохимических процессов, которые позволили выявить активность ПГ и действие на нее БИПГ.

При исследовании соотношения содержания БИПГ в тканях плодов яблони и скорости поражения их М /гисЧ$епа, в наших экспериментах выявлена четкая корреляция между устойчивостью яблок всех исследованных сортов к поражению плодовой гнилью и содержанием БИПГ. Проведенное нами заражение ткани яблок в процессе роста и созревания, показало, что их устойчивость к поражению по мере созревания увеличивалась. Одновременное увеличение содержания БИПГ свидетельствует о его важной роли в снижении поражаемости яблок плодовой гнилью.

В процессе работы мы получили частично очищенные препараты БИПГ из различных растений и испытали их действие на препараты ПГ из фитопатогенных грибов как поражающих, так и не поражающих изучаемые растения (табл. 3). Эффективность действия БИПГ на ПГ грибов существенно различалась в зависимости как от растения-донора ингибитора, так и гриба-продуцента фермента.

Таблица 3. Действие БИПГ (усл. ед. - % ингибирования/мкг белка) из разных

источников на ПГ из культуральной жидкости различных фитопатогенных грибов и из мякоти плодов банана сорта Королевский.

Источники ПГ

Источники У dahliae F solam Fgrami- Р infestans М fructigena G musarum Musasp

БИПГ (хлопчатник) (томат) пеагит (картофель) (яблоня) (банан)

(пшеница)

Банан 0,30±0,05 1,28±0,07 0,4810,03 2,1110,25 0 0,1710,05 1,0010,12

Капуста 0 ,21 ±0,02 3,00±0,11 1,3010,06 0 0,25Ю,03 0,0810,01 0

Картофель 0,19±0,09 2,40±0,13 1,6910,15 0 0 0,2! ±0,03 0,5910,02

Перец 0,33±0,04 4,1210,16 1,5110,08 0 0,1610,08 0,2510,05 0,67Ю,06

Топинамбур 0,5410,03 2,21 ±0,05 2,43+0,19 0 0 0,!0Ю,01 0

Яблоки 1,33±0,11 !,54±0,09 1,0210,03 1,1210,09 0,3910,05 0,3310,04 0

Наиболее интенсивное ингибирование выявлено при действии БИПГ из перца, несколько меньшее - БИПГ из капусты, картофеля, топинамбура. БИПГ из бананов и яблок действовали несколько слабее на ПГ исследуемых грибов. Наиболее подверженными действию БИПГ оказались ПГ грибов рода Fusarium. На ПГ из V dahliae действовали, хотя и не очень интенсивно, все испытанные препараты БИПГ. На ПГ из Р infestans достаточно эффективно действовали препараты БИПГ из бананов и яблок. ПГ из М fructigena и G. musarum оказались наименее подверженными действию препаратов БИПГ. Заметное действие препараты БИПГ оказывали на ПГ из плодов банана.

Таким образом, действие препаратов БИПГ на ПГ фитопатогенных грибов оказалось весьма разнородным по интенсивности В случае активного ингибирующего действия БИПГ, по-видимому, участвует в ограничении поражения растения соответствующим патогеном. При менее интенсивном действии БИПГ может влиять на развитие болезни в периоды повышения его содержания в растении, как мы это наблюдали при поражении яблок плодовой гнилью. Отсутствие ингибирующего действия должно, вероятно, способствовать успешному паразитированию при отсутствии иных механизмов устойчивости.

Представляется перспективным использование естественного механизма устойчивости путем трансформирования растений методами генной инженерии с применением генов БИПГ для обеспечения устойчивости к поражению соответствующим патогенным организмом. При этом необходим тщательный подбор

материала для получения БИПГ, который можно было бы использовать в таких экспериментах.

ВЫВОДЫ

1. Получен высокоочищенный препарат БИПГ из клубней картофеля сорта Невский с молекулярной массой ингибитора 40±1 kDa и изоэлектрической точкой pl=8,8.

2. Показано, что содержание БИПГ в листьях одного яруса картофеля сорта Невский изменяется в процессе роста растения и различается в разных фазах генеративной стадии, отражая связанные с онтогенезом изменения в обмене веществ всего растения.

3. Выявленное ингибирующее действие БИПГ из ростков картофеля и плодов банана на ПГ из тех же растений, дает основание предполагать, что именно БИПГ регулирует активность собственной ПГ. Впервые показано действие БИПГ на активность ПГ из того же растения.

4. Изучены изменения содержания БИПГ в плодах яблони 6 культурных сортов и двух диких видов. Общая закономерность изменения активности БИПГ сохраняется у всех сортов на протяжении двух сезонов вегетации. Выявлены два основных пика активности БИПГ, которые соответствуют двум пикам на кривой, характеризующей содержание растворимого пектина в процессе роста и созревания яблок.

5. Выявлена обратная корреляция между интенсивностью поражения плодов М fructigena и содержанием БИПГ в них, что подтверждает участие БИПГ в предовращении поражения растения фитопатогенными грибами.

6. БИПГ препятствует распространению некоторых фитопатогенных грибов по тканям растения в тех случаях, когда он эффективно действует на фермент, выделяемый патогеном.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ:

1. Глинка Е.М., Буланцева Е.А., Буза Н.Л., Салькова Е.Г., Проценко М.А. Роль белкового ингибитора полигапактуроназы в устойчивости растений к болезням. Тезисы докладов всероссийской конференции "Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках", Санкт-Петербург, 2001, с. 48.

2. Глинка Е.М., Буза Н.Л., Буланцева Е.А., Шапошников Г.Л., Проценко М.А. Влияние ингибиторов биосинтеза этилена на активность ингибитора полигалактуроназы в плодах яблони Тезисы докладов VI международной конференции "Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях", Москва, Издательство МСХА, 2001, с. 22.

3. Буланцева Е.А. Глинка Е.М. Буза Н.Л. Черных A.A., Проценко М.А., Салькова Е.Г. Роль белкового ингибитора полигалактуроназы в созревании плодов и устойчивости к болезням. Сборник тезисов 6-ой Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущине, 2002, с. 192-193.

4. Проценко М.А., Глинка Е.М., Буланцева Е.А., Буза Н.Л., Салькова Е.Г. Участие белкового ингибитора полигалактуроназы в процессах регуляции покоя, роста и устойчивости растений к болезням. Тезисы докладов III съезда Биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, с. 457.

5. Буза НЛ., Проценко М.А., Мазин В.В. Белковый ингибитор полигалактуроназы в клубнях топинамбура. Материалы V симпозиума "Новью и нетрадиционные растения и перспективы их использования". Том 1, г. Пущине, 2003, с. 125-127.

6. Buza N.L., Protsenko М.А., Glinka Е.М. Involvement of poligalakturonase inhibiting protein in plant disease resistance. Materials 11-th International congress on Molecular plant-microbe interactions, St.-Petersburg, 2003, p.261.

7. Buza N.L., Krinitsina A.A., Vartapetian V.V., Bulantseva E.A., Salkova E.G., Protsenko M.A. Role of poligalagturonase inhibiting protein in post-havest apple resistance to patogens. Materials 11-th International congress on Molecular plant-microbe interactions, St.-Petersburg, 2003, p.260.

8. Проценко M.A., Буза Н.Л., Криницына A.A., Вартапетян B.B. Изменение активности белкового ингибитора полигалактуроназы в процессе созревания плодов яблони и его роль в устойчивости к поражению Monilia fruetigena Pers. Тезисы докладов V съезда общества физиологов растений России и Международная конференция "Физиология растения - основа фитобиотехнологии", Пенза, 2003, с. 190.

9. Черных A.C., Буза Н.Л., Буланцева Е.А., Проценко М.А., Шапошников Г.Л., Салькова Е.Г. Влияние обработок бутилоксианизолом и препаратом, синтезированном на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты, на регуляцию системы биосинтеза этилена и распространение плодовой гнили на яблоках при хранении. Тезисы докладов V съезда общества физиологов растений России и Международная конференция "Физиология растения - основа фитобиотехнологии", Пенза, 2003, с. 197.

10. Буза Н.Л., Криницына A.A., Проценко М.А., Вартапетян В.В. Роль белкового ингибитора полигалактуроназы в созревании плодов яблони и их устойчивости к поражению возбудителем плодовой гнили Monilia fruetigena Прикладная биохимия и микробиология. Том 40, № 1, 2004, с. 104-108.

11. Буза Н.Л., Криницына A.A., Проценко М.А., Вартапетян В.В. Интенсивность поражения возбудителем бурой гнили Monilia fructigena плодов яблони в процессе созревания. Микология и фитопатология. Том 38, Вып. 5, 2004, с. 62-66.

12. Буза Н.Л., Криницына A.A., Веселова М.А., Хмель И.А , Проценко М А Действие белкового ингибитора полигалактуроназы растений на полигалактуроназу из ризосферных бактерий рода Pseudomonas. Материалы Всероссийской конференции "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты", Саратов, 2005, с. 26-27.

13. Буза Н.Л., Криницына A.A., Проценко М.А. Активность белкового ингибитора полигалактуроназы из листьев картофеля сорта Невкий на разных стадиях развития растения и в процессе хранения клубней. Материалы конференции "Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков", Минск, 2005, с. 392-396.

14. Криницына A.A., Буза Н.Л., Буланцева Е.А., Проценко М.А., Вартапетян В.В. Белковый ингибитор полигалактуроназы в плодах яблони. Материалы конференции "Актуальные проблеммы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков", Минск, 2005, с. 396-400.

15. Буланцева Е.А., Нгуен Тьен Тханг, Буза Н.Л., Криницына A.A., Проценко М.А. Активность белкового ингибитора полигалактуроназы плодов банана. Прикладная биохимия и микробиология. Том 41, №3,2005, с. 288-291.

Подписано в печать 15.03.2006 г. Зак. 18. Тир. 100 экз. Объем 1,2 п.л. Москва, Нахимовский проспект, 32.

ZOOGÈ 492.5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Буза, Наталья Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Участие БИПГ в метаболических процессах в клетке растения и в устойчивости к болезням

2. Условия выделения и свойства БИПГ

3. Действие БИПГ на препараты ПГ фитопатогенных микроорганизмов in vitro

4. Локализация БИПГ в тканях и органах растений

5. Изменение содержания БИПГ в тканях растений при внешних воздействиях

6. Влияние присутствия БИПГ в тканях растений на устойчивость к внедрению фитопатогенных микроорганизмов

7. Устойчивость к болезням трансгенных растений, экспрессирующих БИПГ

8. Геномная организация БИПГ

9. Структура молекулы БИПГ 37 Ю.Взаимодействие БИПГ, ПГ и пектина

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Получение препаратов белкового ингибитора полигалактуроназы

1.1. Биологический материал, используемый для получения белкового ингибитора полигалактуроназы

1.2. Метод выделения белкового ингибитора полигалактуроназы

2. Получение препаратов полигалактуроназы

2.1. Культивирование грибов и бактерий и состав используемых сред

2.2. Приготовление культуральных фильтратов и получение ферментных препаратов

2.3. Метод выделения полигалактуроназы из растительных источников

3. Определение активности полигалактуроназы и белкового ингибитора полигалактуроназы

3.1. Определение активности ПГ и БИПГ методом "cup-plate"

3.2. Определение активности ПГ и БИПГ методом редуцирующих групп

4. Определение белка по методу Бредфорд

5. Определение интенсивности выделения этилена

6. Оценка интенсивности поражения растительных тканей фитопатогенными грибами

7. Методы, используемые при очистке белкового ингибитора полигалактуроназы и изучении его свойств

7.1. Гель-фильтрация

7.2. Ионнообменная хроматография

7.3. Аналитическое изоэлектрофокусирование

7.4. Препаративное изоэлектрофокусирование

7.5. Электрофорез в ПААГ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Белковый ингибитор полигалактуроназы в растении картофеля (Solatium tuberosum L.)

1.1. Выделение и очистка БИПГ из клубней картофеля

1.2. Содержание БИПГ в листьях картофеля сорта Невский на разных стадиях развития растения

1.3. Содержание БИПГ в клубнях картофеля процессе хранения при разных условиях

2. Белковый ингибитора полигалактуроназы в клубнях топинамбура (Helianthus tuberosus L.)

3. Белковый ингибитор полигалактуроназы в плодах яблони {Malus domestica Borkh)

3.1. Содержание БИПГ в плодах яблони разных сортов в процессе роста и развития

3.2. Интенсивность поражения плодов яблони возбудителем плодовой гнили Monilia fructigena в процессе роста и созревания

4. Белковый ингибитор полигалактуроназы в плодах банана (Musa acuminata L.)

5. Действие БИПГ на ПГ ризосферных бактерий рода Pseudomonas

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль белкового ингибитора полигалактуроназы в устойчивости растений к болезням"

В устойчивости растений к болезням важную роль играет клеточная стенка, которая препятствует внедрению фитопатогенных микроорганизмов. Поэтому изучение биохимических процессов, развивающихся в клеточной стенке весьма актуально для изучения механизмов устойчивости и разработки способов ее повышения.

Как известно, растительная клеточная стенка представляет собой сложный комплекс, состоящий из микрофибрилл целлюлозы, погруженных в матрикс из пектиновых веществ, гемицеллюлоз, гликопротеинов, белков, низкомолекулярных веществ (Showalter, 1993). Пектиновые вещества, представленные полисахаридами, обогащенными галактуроновой кислотой, являются наиболее массивным классом макромолекул в матриксе первичной клеточной стенки. Пектин составляет около 30-35% клеточной стенки (Crookes, Grierson, 1983; Bird et al., 1988; Fry, 1988). Его основным компонентом является гомогалактуронан, который состоит из остатков a-D-галактуроновой кислоты, связанных между собой а-1,4 гликозидными связями. Карбоксильные группы остатков галактуроновой кислоты могут образовывать сложные эфиры с метальными группами (Doond et al., 1995), степень эстерификации которых зависит от степени дифференциации клетки. Иногда карбоксильные группы, так же как и гидроксильные, могут быть ацетилированы или образовывать связи с другими сахарами, например, с ксилозой (Willats et al., 2001). К основной цепи гомогалактуронана присоединяются ответвления, состоящие из рамнозы, арабинозы и арабиногалактанов, соединенных в цепочки (Lang et al., 2000).

Фитопатогенные микроорганизмы продуцируют комплекс пектиназ, которые разрушают пектин срединной пластинки и первичной клеточной стенки растения-хозяина и обеспечивают внедрение патогена в ткани растения (Uritani, Stahmann, 1961; Albersheim, Anderson, 1971; Васильева и др., 1984; Collmer, Keen, 1986; Alghisi, Favaron, 1995; Bateman, 1966; Jones, 1972; Karr, 1970). Пектинметилэстеразы отщепляют метокси-группы (Giovane et al., 2004), пектин- и пектатлиазы разрушают гликозидные связи в высоко эстерифицированном пектине (Herron et al., 2000), недавно обнаруженные рамногалактуроназы специфически отщепляют рамнозу (Jan et al., 1985).

При начале роста гриба на препаратах растительных клеточных стенок первым секретируемым ферментоми является ПГ (поли-[1,4-сс-0-галактуронид] гликаногидролаза; КФ 3.2.1.15) (Albersheim, Anderson, 1971). Она катализирует гидролиз гликозидной связи а-1,4 в полигалактуроновой цепи деметоксилированного пектина клеточной стенки растения. Известны две формы ПГ: экзо-ПГ отщепляют мономеры только на концах молекулы пектина, тогда как эндо-ПГ способны разрушать а-1,4 D-гликозидную связь между двумя неметилированными остатками D-галактуроновой кислоты в середине молекулы (Lang et al., 2000). Наибольшее внимание исследователей привлекают эндо-ПГ, которым отводится основная роль в разрушении молекул пектина. Изменения в молекуле пектина, вызванные действием ПГ, существенно влияют на структуру и свойства растительных тканей. ПГ присутствуют в интактных растительных тканях, обеспечивая превращения пектиновых веществ при растяжении клеток в растущих побегах и подземных органах (Branka et al., 1988; Bellincampi et al., 1993), при сбрасывании листьев, размягчении созревающих плодов (Fielding, 1981; Abu-Goukh et al., 1983a; Fisher, Bennett, 1991; Colin et al., 1994), прорастании пыльцы (Brown, Crouch, 1990), а также при цветении (Marfa et al., 1991; Родионова и др., 1999) и других процессах.

Эндо-ПГ, секретируемые различными патогенами, могут быть представлены изоформами, которые различаются по стабильности, специфичности, оптимальным pH, субстратной специфичности и характеру образующихся олигосахаридных остатков. Различные изоформы полигалактуроназ обеспечивают способность патогена поражать достаточно широкий спектр растений (Walton, 1994; De Lorenzo et al., 1997; Herron et al., 2000). Часто даже расы и изоляты одного и того же фитопатогенного микроорганизма могут содержать разные наборы ПГ, эффективно расщепляющие различающиеся по своим свойствам пектиновые вещества разных видов растений.

Участие ПГ выявлено практически во всех случаях внедрения микроорганизмов в ткани растения (Cervone, 1986; Byrde, 1977). Хотя наиболее высокая их активность отмечена у патогенов, вызывающих мягкие гнили, обусловленные интенсивной мацерацией тканей, эти ферменты участвуют также при проникновении в растение микроорганизмов, мало нарушающих структуру тканей, в том числе образующих микоризу (Peretto et al., 1995) и клубеньки бобовых растений (Munoz et al., 1998). У растений-паразитов, например, представителей рода Orobanche, также описаны, как минимум, три формы ПГ (Ben-Hod et al., 1997).

БИПГ локализуется в апопласте растительных тканей. Он был выявлен по ингибирующему действию на ПГ, выделяемую фитопатогенными микроорганизмами, и считается одним из важных факторов устойчивости растений к болезням (Albersheim 1971; Anderson, 1972; Powel, 1995). '

В связи с этим целью настоящей работы было изучение изменения содержания БИПГ в тканях растений на разных стадиях роста и развития, и влияние его на устойчивость к поражению фитопатогенными микроорганизмами.

Получение высокоочищенного препарата БИПГ из клубней картофеля, а также выявление его в клубнях топинамбура позволяет охарактеризовать органы и ткани, в которых БИПГ мало изучен.

Использование набора фитопатогенных грибов для получения препаратов ПГ дает возможность определить специфичность и спектр действия препаратов БИПГ из разных источников.

Действие БИПГ на ПГ из растительных тканей практически не изучено. Известны только одиночные попытки в этом направлении. Потому выбор материала (плоды банана, ростки картофеля), получение препаратов ПГ и выявление действия на них БИПГ существенно дополняет информацию о роли БИПГ в растении.

Анализ изменения в процессе роста содержания БИПГ в плодах яблони сортов, различающихся по срокам созревания в связи с интенсивностью поражения их фитопатогенными грибами позволяет получить новые сведения об участии БИПГ в устойчивости плодов к одному из основных заболеваний, вызываемому М. /гис^епа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Буза, Наталья Леонидовна

выводы

1. Получен высокоочищенный препарат БИПГ из клубней картофеля сорта Невский с молекулярной массой ингибитора 40±1 кОа и изоэлектрической точкой р1=8,8.

3. Выявленое ингибирующее действие БИПГ из ростков картофеля и плодов банана на ПГ из тех же растений, дает основание предполагать, что именно БИПГ регулирует активность собственной ПГ. Впервые показано действие БИПГ на активность ПГ из того же растения.

5. Выявлена обратная корреляция между интенсивностью поражения плодов М. /гис^епа и содержанием БИПГ в них, что подтверждает участие БИПГ в предовращении поражения растения фитопатогенными грибами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы выявили присутствие БИПГ в клубнях, ростках, листьях, плодах растений. Его действие проявлялось менее эффективно в периоды интенсивного роста побегов или созревания и размягчения плодов. Представляется важным обнаруженное нами изменение содержания БИПГ в листьях картофеля в период формирования цветков, а также во время образования клубней. По-видимому, интенсивность синтеза БИПГ изменяется во всем растении, а локальное его функционирование в тех или иных органах обеспечивается дополнительными механизмами. Несомненно, что БИПГ играет важную роль в регуляции превращений пектиновых веществ, связанных с процессами роста и развития тканей растения. В настоящее время в литературе отсуствуют данные о действии БИПГ из растения на ПГ, также присутствующую в растительных тканях. Возможно, это объясняется высокой согласованностью процессов в растении, когда активность ПГ проявляется только строго локализованно, а при выделении маскируется действием БИПГ. Вероятно, что выбранные нами объекты (банан, этиолированные ростки картофеля) отличаются особенностями биохимических процессов, которые позволили выявить активность ПГ и действие на нее БИПГ.

При исследовании соотношения содержания БИПГ в тканях плодов яблони и скорости поражения их М. /гис^епа, в наших экспериментах выявлена четкая корреляция между устойчивостью яблок всех исследованных сортов к поражению плодовой гнилью и содержанием БИПГ. Проведенное нами заражение ткани яблок в процессе роста и созревания, показало, что их устойчивость к поражению по мере созревания увеличивалась. Одновременное увеличение содержания БИПГ свидетельствует о его важной роли в снижении поражаемости яблок плодовой гнилью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Буза, Наталья Леонидовна, Москва

1. Буланцева Е.А., Глинка Е.М., Проценко М.А., Салькова Е.Г. Белковый ингибитор полигалактуроназы в плодах яблони, обработанных аминоэтоксивинилглицином и хлористым кобальтом // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 1. С. 100-104.

2. Вартапетян В.В. Биологически активные вещества в плодах яблони // Биология и селекция яблони. М. 1976. С.146-161.

3. Васильева К.В., Гладких Т.А., Давыдова М.А. // Биохимия иммунитета, покоя и старения. // Ред. И.В. Березин. М.: Наука. 1984. С. 105-124.

4. Глинка Е.М., Гладких Т.А., Проценко М.А. Белковый ингибитор полигалактуроназы в тканях картофеля // ДАН, 1996. Т. 349. №3. С. 421-423.

5. Глинка Е.М., Гладких Т.А., Проценко М.А. Выделение белкового ингибитора полигалактуроназы из клубней картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. № 5. С. 503-507.

6. Глинка Е.М., Проценко М.А. Белковый ингибитор полигалактуроназы из клеточной стенки растения // Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 9. С. 1189-1195.

7. Глинка Е.М., Проценко М.А. Функции белкового ингибитора полигалактуроназы в растении (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 1. С. 3-9.

8. Глинка Е.М., Проценко М.А. Активность белкового ингибитора полигалактуроназы в растениях картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 2. С. 225-228.

9. Глинка Е.М., Проценко М.А. Динамика активности белкового ингибитора полигалактуроназы в онтогенезе картофеля // Физиология растений. 2001. Т. 48. №6. С. 886-889.

10. Глинка Е.М., Проценко М.А., Буланцева Е.А., Салькова Е.Г. Действие белкового ингибитора полигалактуроназы из тканей плодов яблони на фермент, выделяемый фитопатогенными грибами // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 3. С. 421-423.

11. Глинка Е.М., Буланцева Е.А.,Проценко М.А., Салькова Е.Г. Влияние белкового ингибитора полигалактуроназы на интенсивность образования олигоуронидов // Физиология растений. 2003. Т. 50. № 2. С. 260-264.

12. Марка ров A.M., Головко Т.К., Табаленкова Г.Н. Морфофизиология клубне-образующих растений // СПб. Наука. 2001. С. 208.

13. Салькова Е.Г., Никифорова Т.А. Состав и динамика нелетучих органических кислот в созревающих плодах // ДАН СССР. 1968. Т. 179. № 1.С. 218-220.

14. Салькова Е.Г. // Биохимия хранения картофеля, овощей и плодов. М.: Наука. 1990. С. 117-122.

15. Сапожникова Е. В. Пектиновые вещества плодов. М.: Наука. 1965. С. 182.

16. Тарчевский И. А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 321-331.

17. Abu-Goukh А.А., Greve L.C., Labavitch J.M. Purification and partial characterizatopn of "Bartlett" pear fruit polygalacturonases inhibitors // Physiol. Plant Pathol. 1983a. V. 23. P. 111-122.

18. Abu-Goukh A.A., Strand L.L., Labavitch J.M. Development-related changes in decay susceptibility and polygalacturonase inhibitor content of "Bartlett" pear fruit//Physiol. Plant Pathol. 1983. V. 23. P. 101-109.

19. Abu-Goukn A.A., Labavitch J.M. The in vivo role of "Bartlett" pear fruit polygalacturonase inhibitors // Physiol. Plant Pathol. 1983b. V. 23. P. 123-135.

20. Ahsan N., Yoon H.-S., Jo J. Molecular cloning of BcPGIP cDNA from Brassica campestris and its expression to several stress // Plant Science. 2005. V. 169. P. 1081-1089.

21. Albersheim P., Anderson A.J. Proteins from plant cell walls inhibit polygalacturonases secreted by plant pathogen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. P. 1815-1819.

22. Alghisi P., Favaron F. Pectin-degrading enzymes and plant-parasite interacion // Eur. J. Plant Pathol. 1995. V. 101. P. 365-375.

23. Barmore C.R., Nguyen T.K. Polygalacturonase inhibition in rind of Valencia orange infected with Diplodia natalensis // Phytopathology. 1985. V. 75. № 4. P. 446-449.

24. Bateman D.F., Millar R.L. Pectic enzymes in tissue degradation // Annu.Pev.Phytopatol. 1966. V. 4. P.l 19-146.

25. Bellincampi D., Salvi G., De Lorenzo G., Cervone F., Marfa V., Eberhard S., Darvill A., Albersheim P. Oligogalacturonides inhibit the formation of roots on tobacco explants. // Plant J. 1993. V. 4. № 2. P. 207-213.

26. Ben-Hod G., Nun N.B., Tzaban S., Mayer A.M. Inhibitors of polygalacturonase in calli of Orobanche aegyptiaca I I Phytochemistry. 1997. V. 45. №6. P. 11151121.

27. Berger D.K., Oelofse D., Arendse, M.S., Du Plessis E., Dubery I.A. Bean polygalacturonase-inhibiting protein-1 (PGIPs-1) inhibits polygalacturonases0 from Stenocarpella maydis // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2000. V. 57. P. 5-14.

28. Bergmann C.W., Ito Y., Singer D., Albersheim P., Darvill A.G.

29. Polygalacturonase-inhibiting protein accumulates in Phaseolus vulgaris L. in response to wounding, elicitors and fungal infection // The Plant Journal. 1994. V. 5. №5. P. 625-634.

30. Bezier A., Lambert B., Baillieul F. Study of defense-related gene expression in grapevine leaves and berries infected with Botrytis cinerea II European Journal of• Plant Pathology. 2002. V. 108. P. 111-120.

31. Bird C.R., Smith C.J., Ray J.A., Moreau P., Bevan M.V., Bird A.S., Huges A.S., Morris P.C., Grierson D., Schuch W. // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P 651-662.

32. Bishop J.G. Directed mutagenesis confirms the functional importance of positively selected sites in polygalacturonase inhibitor protein // Mol. Biol. Evol. 2005. V. 22. №7. P. 1531-1534.

33. Bishop P.D., Makus D.J., Pearce G., Ryan C.A. Proteinase ingibitor-inducing factor activity in tomato leaves residues in oligosaccharides enzymically released from cell walls // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 3536-3540.

34. Branca G, De Lorenzo G., Cervone F. // Physiol. Plant. 1988. V. 72. P. 499• 504.

35. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Analyt. Biochem. 1976. № 72. P. 248-254.

36. Brown A.E. Relationship of endopolygalacturonase inhibitor activity to the rate of fungal rot development in apple fruits // Phytopath. Z. 1984. V. 111. №2. P. 122-132.

37. Brown A.E., Adicaram N.K.B. A role for pectinase and protease inhibitors in % fungal rot development in tomato fruits // Phytopath. Z. 1983 V. 106. P. 239-251.

38. Brown A.E., Adicaram N.K.B. The differential inhibition of pectic enzymes from Glomerella cingulata and Botrytis cinerea by a cell wall protein Capsicum• annuum fruit // Phytopath. Z. 1982 V. 105. №1. P. 27-38.

39. Brown S.M., Crouch M.L. Characterization of a gene family abundantly expressed in Oenothera organensis pollen that shows sequence similarity to polygalacturonase//Plant Cell, 1990. V. 2. P. 263-274.

40. Cervone F., De Lorenzo G., Salvi G., Camardella L. Biology and molecular biology of plant-pathogen interactions: molecular evolution of fungal polygalacturonase//Ed. J.A. Baileu.- Berlin: Springer-Verlag. 1986. P. 385-392.

41. Cervone F., De Lorenzo G., Degra L., Salvi G. Elicitation of necrosis in Vigna unguiculata Walp. by Aspergillus niger endo-polygalacturonase and by -D-galacturonate oligomers //Plant. Physiol. 1987. V. 85. P.626-630.

42. Cervone F., Anderbrhan T., Kotts R., Wood R. Effect of French bean tissue and leaf protoplasts on Colletotrichum lindemuthianum polygalacturonase // Phytopathology Journal. 1981. V 102., №3-4. P. 238-246.

43. Cervone F., De Lorenzo G., Degra L., Salvi G., Bergmani M. Purification and characterization of a polygalacturonase-inhibiting protein from Phaseolus vulgaris L.//Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 631-637.

44. Cervone F., De Lorenco G., Pressey R., Darvill A., Albersheim P. Can Phaseolus PGIPs inhibit pectic enzymes from microbes and plants? // Phytochemistry. 1990. V. 29. P. 447-449.

45. Cervone F., Hahn M.G., De Lorenzo G., Darvill A., Albersheim P. Host-pathogen interactions. XXXIII. A plant protein converts a fungal pathogenesis factor into an elicitor of plant defense responces // Plant Physiol. 1989. V. 90. P. 542-548.

46. Chimwamurombe P.M., Botha A.-M., Wingfield M.D., Wingfield B.D.

47. Molecular relatedness of the polygalacturonase-inhibiting protein genes in Eucalyptus species // Theor. Appl. Genet. 2001. V. 102. P. 645-650.

48. Colin W.F., Liansheng L., Dellpenna D. Reduction tomato polygalacturonase P subunit expression affects pectin solubilization and degradation during fruit ripening//Plant Cell. 1994. V.6.№11.P. 1623-1634.

49. Collmer A., Keen N.T. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis // Annu. Rev. Phytopathol. 1986. V. 24. P. 383-409.

50. Costa M.M.R., Costa J., Ricardo C.P.P. A Lupinus albus root glycoprotein homologous to the polygalacturonase inhibitor proteins // Physiologia plantarum. 1999. V. 99. P. 263-270.

51. Crookes P.R., Grierson D. //Plant Physiol. 1983. V. 72. P. 1088-1093.

52. Courduroux J.-C. Etude de mechanisme physiologique de la tuberization chez le topinambour (Helianthus tuberosus L.) // Ann. Sci. Nat. Bot. 1967. Ser. 12. V. 8, P. 215-356.

53. Davis K.R., Darvill A.G., Albersheim P. Host-pathogen interactions. XXXI. Oligogalacturonides released from sodium polypectate by endopolygalactyronic acid lyase are elicitors of phytoalexinsin soybean // Plant. Physiol. 1986. V. 80. P.568-577.

54. Davis K.R., Hahlbrock K. Induction of defense responses in cultured parsley cells by plant cell wall fragments // Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 1286-1290.

55. De Lorenzo G., Castoria R., Bellincampi D., Cervine F. Fungal invasion enzymes and their inhibition // The Mycota. V. Plant Relationships, Part B. Gc Carroll, P Tudzynski. Berlin: Springer-Verlag. 1997. P. 61-83.

56. De Lorenzo G., D'Ovidio R., Cervone F. The role of polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) in defense against pathogenic fungi // Annu. Rev. Phytopathol. 2001. V.39. P. 313-335.

57. Degra L., Salvi G., Mariotti D., De Lorenzo G., Cervone F. A polygalacturonase inhibiting protein in alfalfa callus cultures // J. Plant Physiol. 1988. V. 133, №3. P. 364-366.

58. Deo A., Shastry N.V. Purification and characterization of polygalacturonase-inhibitory proteins from Psidium guajava Linn, (guava) fruit // Plant Science. 2003. V. 164. P. 147-156.

59. Devoto A., Clark A. J., Nuss L., Cervone F., Delorenzo G., Developmental and pathogen induced accumulation of transcripts of polygalacturonase-inhibiting protein in Phaseolus vulgaris L. //PLANTA. 1997. V. 202. № 3. P.284-292.

60. Deziderio A., Aracri B., Leckie F., Mattei B., Salvi G., Tigelaar H., Van Roekel J.S.C., Baulcombe D.C., Melchers L.S., De Lorenzo G., Cervone F.

61. Polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) with different specificities are expressed in Phaseolus vulgaris II Mol. Plant-Microbe Interact. 1997. V. 10. P. 852-860.

62. Dingle J., Reid W.W., Solomons G.L. The enzymatic degradation of pectin and other polysaccharides. II. Application of the "cup-plate" assay to the estimation of enzymes // J.Sci. Food Agric. 1953, V. 4, № 2, P. 149-155.

63. Favaron F. Gel detection of Allium porrum polygalacturonase-inhibiting protein reveals a high number of isoforms // Physiological and Molecular Plant Pathology. 2001. V. 58. P. 239-245.

64. Favaron F., Castiglioni C., Di Lenna P. Inhibition of some rot fungi polygalacturonases by Allium cepa L. and Allium porrum L. extracts // J. Phytopathol. 1993. V. 139. P. 201-206.

65. Favaron F.D., D'Ovidio R., Porceddu E., Alghisi P. Purification and molecular characterization of a soybean polygalacturonase-inhibiting protein // Planta. 1994. V. 195. P 80-87.

66. Fielding A.H. Natural inhibitors of fungal polygalacturonases in infected fruit tissue//J. Gen. Microbiol. 1981. V. 123. P. 377-381.

67. Fish W.W. Polygalacturonase-inhibiting protein activity in cantaloupe fruit as a function of fruit maturation and tissue origin // European Journal of Plant Pathology. 2005. V. 111. P. 67-76.

68. Fish W.W., Madihalli S.V. Modeling the inhibitor activity and relative binding affinities in enzyme-inhibitor-protein systems: application to developmental regulation in a PG-PGIP system // Biotechnol. Prog. 2004. V. 20. P. 721-727.

69. Fisher R.L., Bennett A.B. Role of cell wall hydrolases in fruit ripening // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 675-703.

70. Fredianiani M., Ceremonini R., Salvi G., Caprari C., Desiderio A., D'Ovidio R., Cervone F., De Lorenzo G. Cytological localization of the pgip genes in theembryo suspensor cells of Phaseolus vulgaris II Theor. Appl. Genet. 1993. V. 87. P. 369-373.

71. Frommel, M.I., Nowak, J., Lazarovits, G. Growth enhancement and developmental modifications in vitro grown potato (Solanum tuberosum spp. tuberosum) as affected by a non-fluorescent Pseudomonas sp. II Plant Physiol. 1991. V. 96. P. 928-936.

72. Fry S.C. // The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis. New York: John Wiley and Sons. 1988.

73. Gao S., Shain L. Activity of polygalacturonase produced by Cryphonectriaparasitica in chestnut bark and its inhibition by extracts from American and Chinese chestnut // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1995. V. 46. P. 199-213.

74. Gazendam I., Oelofse D., Berger D.K. High-level expression of apple PGIP1 is not sufficient to protect transgenic potato against Verticillium dahlia II Physiological and Molecular Plant Pathology. 2004. V. 65. P. 145-155.

75. Giovane A., Servillo L., Balestrieri C., Raiola A., D'Avino R., Tambburrini M., Ciardiello M.A., Camardella L. Pectin methylesterase inhibitor //• Biochimica et Biophysica Acta. 2004. V. 1696. P. 245-252.

76. Gnmathi V„ Gnanamanickam S.S. oolvsalacturonase-inhibitins oroteins in

77. Grossmann F. Zur Bildung pektischer und cellulolytischer Enzyme durch Phytophtora infestans de By. I Kultur des Pilzes in einer Nährlösung // Phytopathol. Zeitschrift. 1968. V. 62. P. 371-380.

78. Haglund H. Isoelectric focusing in pH gradients a techique for fractionation and characterization of ampholytes // Methods of biochemical analysis. USA. 1971. V. 19. P. 1-104.

79. Hallmann J., Quadt-Hallmann A., Mahafee W.F. Klopper J.W. Bacterial endophytes in agricultural crops // Can. J. Microbiol. 1997. V. 43. P. 895-914.

80. Hahn M.G., Cheong J.J., Alba R., Enkerli J., Cote F. // Mechanisms of plant defence responses. // Eds. B. Fritig, M. Legrand. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. 1993.

81. Herron S.R., Benen J.A., Scavetta R.D., Visser J., Jurnak F. Structure and function of pectic enzymes: virulence factors of plant pathogens // Prot. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. V. 97. P. 8762-8769.

82. Hobson G.E. Recent advances in the biochemistry of fruits and vegetables // Acad. Press. London, New-York, San-Francisco. 1981. P. 275.

83. Hoffman R.M., Turner J.G. Occurrence and specificity of an endopolygalacturonase inhibitor in Pis um sativum II Physiol. Plant Pathol. 1984. V. 24. P. 49-59.

84. Hoffman R.M., Turner J.G. Partial purification of proteins from pea leaf lets that inhibit a Scochyta pisi endopolygalacturonase // Physiol. Plant Pathol. 1982. V. 20. P. 173-197.

85. Howell C.R. Use of enzyme deficient mutants of Verticillium dahliae to assess the importance of pectolytic enzymes in symptom expression of Verticillium wilt of cotton // Physiol. Plant Pathol. 1976. V. 9. P.279

86. Hulme A.C., Rhodes M.J.C. Pome fruits // The biochemistry of fruits and their products. V.2. London and New York: Academic Press. 1971. P. 333-373.

87. James J.T., Dubery I.A. Inhibition of polygalacturonase from Verticillium dahliae by a polygalacturonase inhibiting protein from cotton // Phytochemistry. 2001. V. 57. P. 149-156.

88. Jang S., Lee B., Kim C., Kim S.-J., Yim J., Han J.-J., Lee S., Kim S.-R., An G. The OsFPRl gene encodes polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) that regulates floral organ number in rice // Plant Molecular Biology. 2003. V. 53. P. 357-369.

89. Jan J.M., Mc Neil M., Darvill A.Q., Albersheim P. Structure of back bone of rhamnogalacturonan I, a pectic polysaccharide in the primary walls of plants // Carbohydr.Pes. 1985. V. 137. P. 111-125.

90. Johnston D.J., Williamson B., McMillan G.P. The interaction in planta of polygalacturonases from Botrytis cinerea with a cell-wall bound polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) in raspberry fruits // J. Exp. Bot. 1994. V. 45. № 281. P.1837-1843.

91. Johonston D.J., Ramanathan V., Williamson B. A protein from immature raspberry fruits which inhibits endopolygalacturonases from Botrytis cinerea and other microorganism//J. Exp. Bot. 1993. V. 262. P. 971-977.

92. Jones T.M., Anderson A.J., Albersheim P. Host-pathogen interactions IV. Studies on the polysaccharide-degrading enzymes secreted by Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici // Plant Physiol. Pathol. 1972. V. 2. P. 153-166.

93. Jones D. A., Jones J. D. G. The role of leucine-rich repeat proteins in plant defences // Adv. Bot. Res. 1997. V. 24. P. 89-167.

94. Karr A.L., Albersheim P. Polysaccharide degrading enzymes are unable to attack plant cell walls without prior action by a "wall-modyfuing enzyme" // Plant Physiol. 1970. V. 46. P. 69-80.

95. Kaneko T., Katoh T., Sato S., Nakamura A., Asamizu E., Tabata S. Structural analysis of Arabidopsis thaliana chromosome 3. II. Sequence features of the 4,251,695 bp regions covered by 90 PI, TAC and TAC clones // DNA Res. 2000. V. 7. P. 217-221.

96. Kemp G., Bergmann C.W., Clay R., Van der Westhuizen A.J., Pretorius Z.A. Isolation of polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) from wheat // Mol. Plant-Microb. Interact. 2003. V. 16. P. 955-961.

97. Kemp G., Stanton L., Bergmann C.W., Clay R., Albersheim P., Darvill A. Polygalacturonase-inhibiting proteins can function as activators of• polygalacturonase // Mol. Plant-Microb. Interact. 2004. V. 17. №8. P. 888-894.

98. Lakso A.N., Corelli G.L., Barnard J., Goffinet M.C. An expolinear model of the growth pattern of the apple fruit. // J. Hortic. Sc. 1995. V. 70. № 3. P. 389394.

99. Lamb D.J., Lawton M.A., Dron M., Dixon R.A. Signals and transduction mechanisms for activation of plant defenses against microbial attack // Cell. 1989 V. 56. P. 215-224.

100. Lang C., Dornenburg H. Perspectives in the biological function and the technological application of polygalacturonases // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 53. P. 366-375.

101. Langley K.R., Martin A., Stenning R., Hobson G.E., Shuch W.W., Bird C.R. Mechanical and optical assessment of the ripenning of tomato fruit with reduced polygalacturonase activity // J. Sc.Food Agr. 1994. V. 66. № 4. P. 547554.

102. Leckie F., Mattei B., Capodicasa C., Hemmings A., Nuss L., Aracri B., De

103. Lorenzo G., Cervone F. The specificity of polygalacturonase-inhibiting protein

104. PGIP): a single amino acide substitution in the solvent-exposed p-strand/p-turn region of the leucine-rich repeats (LRRs) confers a new recognition capability //

105. EMBO J. 1999. V. 18. P. 2352-2363.

106. Liang F., Zhang K., Zhou C., Kong F., Li J., Wang B. Cloning, characterization and expression of the gene encoding polygalacturonaseinhibiting proteins (PGIPs) of peach .Prunus persica (L.) Batch. // Plant Science. 2005. V. 168. P. 481-486.

107. Malka J., Erwin D.C., Moje W., Jones B. Effect of pH and carbon and nitrogen sources on the growth of Verticillium albo-atrum // Phytopathology. 1966. V. 56, P. 401.

108. Marfa V., Gollin D.J., Eberhard S., Mohnen D., Darvill A. G., Albersheim

109. Meyer K., Keil M., Naldrett M.J. A leucine-rich repeat protein of carrot that exhibits antifreeze activity//FEBS Letters. 1999. V. 447. P. 171-178.

110. Milner Y., Avigad G. A cooper reagent for the determination of hexuronic asids and certain ketohexoses // Carbohydr. Res. 1967. V. 4. P.359-361.

111. Munoz J.A., Coronado C., Perez-Hormaeche J., Kondorosi A., Ratet P., Palomares A.J. MsPG3, a Medicago sativa poygalactunase gene expressed during the alfalfa-Rhizobium meliloti interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 9687-9692.

112. Nalumpang S., Gotoh Y., Tsuboi H., Gomi K., Yamamoto H., Akimitsu K. Functional characterization of Citrus polygalacturonase-inhibitor protein // J. Gen. Plant pathol. 2002. V. 68. P. 118-127.

113. Nothnagel, E.A., McNeil, M., Albersheim, P and Dell A. Host-pathogen interactions. XXII. A galacturonic acid olygosaccharide from plant cell walls elycits phytoalexins // Plant Physiol. 1983. V. 71. P. 916.

114. Pathak N., Asif M.H., Dhawan P., Srivastava M.K., Nath P. // Plant Growth Regulation. 2003. V. 40. № 1. P. 11-19.

115. Peretto P., Bettini V., Favaron F., Alghisi P., Bonfante P. Polygalacturonase activity and location in arbuscular mycorrhizal roots of Allium porrum L. // Mycorrhiza. 1995. V. 5. № 2. P. 157-163.

116. Powell A.L.T., van Kan J., ten Have A., Visser J., Greve L.C., Benett A.B., Labavitch J.M. Transgenic expression of pear PGIP in tomato limits fungal colonization // Molecular Plant Microbe Interaction. 2000. V. 13. № 9. P. 942950.

117. Powell A.L.T., D'hallewin G., Hall B.D., Stotz H., Labavitch J.M., Bennet

118. A.B. Glycoprotein inhibitors of fungal polygalacturonases: expression of pear PGIP improves resistance in transgenic tomatoes (abstr.) // Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 880.

119. Powell A.L.T., Stots N.U., Labavitch J.M., Bennett A.B. Glycoprotein inhibitors of fungal polygalacturonases //Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions. 1995. V. 3. P. 399-402.

120. Pressey R. Polygalacturonase inhibitors in bean pods // Photochemistry. 1996. V. 42. №5. P. 1267-1270.

121. Ramanathan V., Simpson C.G., Thow G., Ianetta P.P.M., McNicol R.J., Wniamson B. cDNA cloning and expression of polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) from red raspberry (Rubus idaeus) // J. Exp. Bot. 1997. V. 48. P. 1185-1193.

122. Reymond D., Phaff H.J. Purification and certain properties of avocado polygalacturonase// Journal of Food Science. 1965. V. 30. P. 266-273.

123. Sakamoto T., Bonnin E., Thibault J.-F. A new approach for studying interaction of the polygalacturonase-inhibiting proteins with pectins // Biochimica et Biophysica Acta. 2003. V. 1621. P. 280-284.

124. Salvi G., Giarizzo F., De Lorenzo G., Cervone F. A polygalacturonase inhibiting protein in the flowers of Phaseolus vulgaris L. // J. Plant Physiology. 1990. V. 136. P. 513-518.

125. Schell M.A. Purification and charecterization of an endoglucanase from Pseudomonas solanacearum. II Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53. P. 22372241.

126. Sharma V.K., Nowak J. Enhancement of Verticillium wilt resistance in tomato transplants by in vitro co-culture of seedlings with a plant growth promoting rhizobacterium (Pseudomonas sp. Strain PsJN) // Can.J.Microbiol.1998. № 44, P.528-536.

127. Sharma R.L., Kaul J.L. Susceptibility of apples to brown rot in relation to qualitative characters II Indian Phytopathol. 1988. V. 41. № 3. p. 410-415.

128. Sharma R.L., Kaul J.L. Temperature effect on the development of brown rot of apple // Indian Phytopathol. 1988, V. 41, № i, p. 152-153.

129. Shanmugam V. Role of extracytoplasmic leucine rich repeat proteins in plant defence mechanisms // Microbiological research. 2005. V. 160. P. 83-94.

130. Showalter A.M. Structure and function of plant cell wall proteins // Plant Cell. 1993. V. 5. P. 9-23.

131. Shiffmann-Nadel M., Michaely H., Zauberman G., Chet J. Physiological changes occurring in picked climacteric fruit infected with different pathogenic fungi // Phytopathol. Z. 1985. V. 113. № 3. p. 277-284.

132. Spotts R.A., Cervantes L.A. Mielke E.A. Variability in postharvest decay among apple cultivars // Plant Dis. 1999. V. 83. № 11. P. 1051-1054.

133. Steinmayr M., Motte P., Sommer H., Saedler H., Schwarz-Sommer Z. FIL2, an extracellular leucine-rich repeat protein, is specifically expressed in Antirrhinum flowers // Plant J. 1994. V. 5. P. 459-467.

134. Stotz H.U., Contos J.J.A., Powell A.L.T., Bennett A.B., Labavitch J.M. Structure and expression of an inhibitor of fungal polygalacturonases from tomato // Plant Mol. Biol. 1994. V. 25. № 4. P. 605-617.

135. Stotz H.U., Powell A.L.T., Damon S.E., Greve L.C., Bennett A.R., Labavitch J.M. Molecular characterization of a polygalacturonase inhibitor from Pyrus communis L. cv. Bartlett//Plant Physiol. 1993. V. 102. № 1. P. 133-138.

136. Tepper C.S., Anderson A.G. Interactions between pectic fragments and extracellular components from the fungal pathogen Colletotrichum lindemuthianum//Physiol. Mol. Plant. Pathol. 1990. V. 36. P. 147-158.

137. Thornburg R.W., Carter C., Powell A., Mittler R., Rizhsky L., Horner H.T. A major function of tobacco floral nectary is defense against microbial attack // Plant Syst. Evol. 2003. V. 238. P. 211-218.

138. Toubart P., Desiderio A., Salvi G., Cervone F., Daroda L., De Lorenzo G. Cloning and characterization of the gene encoding the endopolygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) of Phaseolus vulgaris L. // The Plant Journal. 1992. V. 2. №3. P. 367-373.

139. Uritani I., Stahmann M.A. Pectolytic enzymes of Ceratocystis fimbriata II Phytopathology. 1961. V. 51. № 5. P. 277-285.

140. Voragen A.G.J., Pilnic W. Biocatalisis inagricultural biotehnology: Pectin-degrading enzymes in fruit and vegetable processing // Ed. Whitaker J.R. 1989. P. 93-115.

141. Walton J.D. Deconstructing the cell wall // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 1113-1118.

142. Wang I.I., Michailides T.J., Bostock R.M. Improved detection of polygalacturonase activity due to Mucor pirifomis with a modified dinitrosalicylyc acid reagent // Phytopathology. 1997. V. 87. № 2. P. 161.

143. Wang G.L., Song W.Y., Ruan D.L., Sideris S. Ronald P.C. The cloned gene, Xa21, confers resistance to multiple Xanthomonas oryzae pv. oryzae isolates intransgenic plants // Mol. Plant-Microb. Interact. 1996. V. 9. P. 850-855.

144. Worrall D., Elias L., Ashford D., Smallwood M., Sidebottom C., Lillford P., Telford J., Holt G, Bowles D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization // Science. 1998. V. 282. P. 115-117.

145. Xu X.-M., Robinson J.D., Berrie A.M., Harris D.C. Spatio-temporal dynamics of brown rot (Monilinia fructigena) on apple and pear // Plant Pathol. 2001. V. 50. № 5. P. 569-578.

146. Yalpani N., Silverman P., Wilson T.M.A., Kleier D.A., Raskin I. Salicylic acid is a systemic signal an inducer of pathogenesis related proteins in virus-infected tobacco // The Plant Cell. 1991 V. 3. P. 809-818.

147. Yao C.L., Conwey W.S., Ren R.H., Smith D., Ross G.S., Sams GE. Gene encoding polygalacturonase inhibitor in apple fruit is developmentally regulated and activated by wounding and fungal infection // Plant Mol. Biol. 1999. V. 39. P. 1231-1241.

148. Yao C.L., Conwey W.S., Sams C.E. Purification and characterization of a polygalacturonase-inhibiting protein from apple fruit // Phytopathol. 1995. V. 85. P. 1373-1377.

149. Yoshioka H., Aoba K., Fukumoto M. Relationships between qualitative and physiological changes during storage and maturation in apple fruit // Sc. 1989. V. 58. № l.p. 31-36.

Информация о работе

Буза, Наталья Леонидовна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль белкового ингибитора полигалактуроназы в устойчивости растений к болезням - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы