Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноэлектрофоретическое исследование пектолитических ферментов фитопатогенных грибов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуноэлектрофоретическое исследование пектолитических ферментов фитопатогенных грибов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ КАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХЛ

за правах рукописи

ГЛИНКА ЕЛЕНА МАКСИМОВНА

УДК 581.1Э + 577.154

1Ш1УН0ЭЛЕКТР0Ф0РЕ7ИЧЕСК0Е ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕКТОЛ1ГГИЧЕСКИХ ФЕЯМЕНТОВ ФСТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ.

03.00.04 - биологическая хкыия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой стеьсни кандидата биологических ньук

Москва - 195л

Работа выполнена в лаборатории иммунитета растений Института биохимии им.' А.И. Баха РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Е.Г. Сальксва

Официальные опповентн: доктор биологических наук Л.И. Ильинская.

кандидат биологических наук Л.М. Левкина

Ведущая организация: Главный Ботанические сад РАН

Зашита диссертация состоится- " Н^'^Я 1993 г. в час. на заседании специализированного совета (К.002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии- иы. А.Н. Баха РАН {Москва. Ленинский проспект, зз, корпус 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической , литературы РАН (Москва. Ленинский проспект, 33, корпус I)

Автореферат разослав и/Я'?/ 1993 Г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

М.И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

'Актуальность проблемы. Исследование механизмов

взаимодействия гриба - паразита и растеши - хозяина относится к числу основных проблем современной фитопатологии.

Прели многочисленных патогенных факторов возбудителей болезней растений пектолитические ферменты привлекает особое вникание, так как они участвуют в процессах проникновения патогеноа в растение, развитии симптомов поражения и индуцируют запрлиае реакции растения. Поскольку пектолитические ферменты являются гликопротеинами. они могут принимать участие в процессах узнавания при установлении контактов меаду взаимодействующими организмами {Albersheim, Anderson-Prouty. 1975; Davis et al., 1986].

Познание биохимических процессов взаимодействия паразита и растения-хозяина имеет большое народно-хозяйственное значение для создания новых способов борьбы с болезнями растения с помощью специфического подавления ключевых звеньев в процессах взаимодействия организмов безвредными для окружающей среды веществами.

В настоящее время пектолитические ферменты ряда грибов охарактеризованы по некоторым -биохимическим параметрам (Cervone et al., 1986}

Однако у некоторых фитопатогенннх грибов, в частности у Verticilliuia dahliae и Phytophthorа . infestaos. пектолитические ферменты слабо изучены. Очень мало сведений об кммунохимических свойствах этих ферментов у названных грибов. Иежду тем такие свойства могут иметь большое значение при взаимодействии гриба и растения íDe Vay et al.. 1981]. Интерес представляет изучение не только самих пектолитических ферментов. но и механизма взаимодействия их с клеткой растения - хозяина. Именно этот аспект проблемы может быть решен с помощью методов иммунохими.

Цель и задачи исследования. Целью представленной работы было иммуноэлектрофоретическое исследование пектолитячгских ферментов: полигалактуроназы. пектинлиазы и пектинметилэстеразы и их миояеетвенных ферм у грибов. различавшихся по характеру взаимодействия с растешгями: Verticiiiiun dahliae - возбудитель вилта хлопчатника, Phytophthora infestans - возбудителя фитофтороза картофеля, а также определение, изоэдектрических точек множественных форм пектолитических ферментов, р.infestans и

Aspergillus niger. инвертаэы препаратов V. dahliae.

Были поставлены следующие задачи.

1. Разработать методику идентификации активности пектолитических ферментов в иммунопреципитатах и проанализировать проявление активности пектолитических ферментов з иммунопреципитатах.

2. Исследоззть иммунологическое сродство множественных форм полигалактуроназа v.dahliae, пектинметилэстеразы р.infestaos, шшертазы V.dahliae

3. Изучить участие пектолитических ферментов в связывании экстрацеллюлярных метаболитов гриба (ЭМГ) р.infestañe с препаратом цитопаазматических мембран картофеля.

Ншзваа_новизна работа. В результате проведенных

исследований разработана методика идентификации пектолитических ферментов (по лигалактуроназы, пектинлиазы и петинметилэстеразы) в иммунопреципитатах. Показано, что полигалактуроназа v. dahliae имеет множаственяве формы как нммунологически родственные, так и иммунологически различные. Множественные формы

пектиныетилэстеразы P. infestans иммунологически различны. Пектолитические ферменты р.infestaos могут связываться с препаратом цитовлазматических мембран картофеля. Уточнены изоэлектрические точки множественных форм пектолитических ферментов Р.infestans и Л.niger.

Практическое.. значение... работа ■ Разработанная нами методика идентификации пектолитических ферментов в иммунопреципитатах позволяет определять эти ферменты в смеси, в культуральном фильтрате. в гочогенате мицелия и не требует очистки ферментов до гомогенного состояния. Иммуноэлектрофорез проводится с поливалентной савороткой. Использование таких препаратов и разработанной методики делает более доступным и удобным проведение исследований, а так же серийных экспериментов.

Разделение множественных форм ферментов перекрестным ИЭФ -иммуноэлектрофорезом дает возможность исследозать избирательное влияние различных веществ, ослабляющих и уничтожающих фитопатогенный гриб, на множественные формы,, выявляя формы более подверженные их действию.

Апробация. Результаты исследования доложены на 4-ой Бессоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент. 198S); Всесоюзном совещании "Биохимия хранения

картофеля, овощей и плодов" (Москва. 1988): Всесоюзном совещании "Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями" (Пущино. 1989).

Публикации. Результаты исследований изложены в 8 публикациях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и содержит таблицы. рисунков. Список литературы включает названий, из них ва русском и на иностранных языках -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ.

1. Биологический материал. Объектом исследования служили три фитопатогенных гриба Verticilliura dahlias. Phytophthora infestans. Aspergillus niger.

A. Культивирование V. dahliae. В работе использовали два штамма гриба V. dahliae: "хл 1-3" и "хл 4-6".

Культивирование проводили в жидкой питательной среде. приготовленной на основе прописи, предложенное Малка с сотр. [Malka et al, 1966], вводя в качестве источника углерода яблочный пектин.

Культивирование проводили на качалках при 220 об/мин. и температуре 28® С в колбах объемом 750 мл со Ив мл питательной среды.

Б. Получение препарата из . культураяьной жидкости.

Культуральную жидкость после 7-дневного выращивания гриба центрифугировали для отделения от мицелия и спор при 6000 g 20 мин. и фильтровали через миллипоровые фильтры я 6 с размером пор 0.45 мкм фирмы Сынпор (ЧССР). Полученный культуральный фильтрат обессоливали на сефадексе с - 25, лиофильно выеувивали и хранили при -20® С.

Культуральный фильтрат использовали для иммунизации кроликов, для изоэлектрофокусированкя и кммуноэлектрофореза.

B. Получение препарата из глпделия v. dahliae. Мицелиальную массу, полученную после отделения культурального фильтрата дважды отмывали водой, разрушали в дезинтеграторе со стеклянными бусами в фосфатном буфере (20 пм, рН 7.4), содержащем Nad (0,15 М) и центрифугировали при 3000 g И 17000 д (Kang. Bartnicki-Garcia. 1970J. Полученную надосадочную жидкость обессоливали на сефадексе

с-25. Полученный экстракт мицелия использовали для иммунизации кроликов.

Г. Культивирование гриба Р. 1&£е8Ьгпа. В исследованиях использовали две расы гриба Р. ¿пкегьапз - раса 1, совместимая и раса 4. несовместимая с использованным в работе сортом картофеля.

Гриб Р. ^евьапэ выращивали в микробиологических матрасах на агаризованной овсяной среде в течение 10 суток при температуре 20® С. после чего заливали культуру стерильной дистиллированной водой и выдерживали 2 часа при 40® С. чтоб и вышли зооспоры. Полученную суспензию зооспорангиев и зооспор вносили в качалочные колбы. содерхадое 56 мл синтетической питательной среды [Сгоазтап, 1968].

Суспензию вносили с таким расчетом, чтобы в каждой колбе было 1во мл раствора и 106 пропагул гриба (зооспоор и спорангиев). Культуру инкубировали на качалке в течение з-х и 14-ти дней [Проценко и др., 1990]. После выращивания гриба 3-х и 14-ти -дневный культуральный фильтрат отделяли от мицелия фильтрованием через миллипоровые фильтры N1 Сынпор (ЧССР) и затем фракционировали его сульфатом аимокия.

Д. Получение препарата экстрацеллюлярных метаболитов (ЭМГ) р. еэЬапя. к культуральному фильтрату • добавляли сернокислый аммоний до полного насыщения. Осадок собирали центрифугированием (8000д. 30 мин.). растворяли в ацетатном буфере (0.1 М. рН 5,0) и диаяизовали сначала против дистиллированной воды, а затем против фосфатного буфера (0,015 М, рН 7,3). Полученный суммарный препарат ЭКГ использовали для иммунизации кроликов-

Суммарный препарат ЭКГ разделяли на две фракции: фракцию 1, осаждающуюся при 60% от полного насыщения сернокислым аммонием и фракцию 2, осаждающуюся при полном насыщении.

2. Получение икмунной сыворотки. Кроликам весом около 3 кг вводили 1,5 мл раствора препарата (3,5 мг/мл белка) в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда подкожно в 6 точек спины з раза с интервалом 2 недели. На 7-ой, 9-ый и 11-ый день после второй иммунизации брали кровь из краевой вены уха и получали из нее сыворотку, которую использовали в опытах и для выделения препарата гамма-глобулинов. Гамма-глобуляны получали путем осаждения сернокислым аммонием [Брок. 1979].

3. Истошеняе гамма-глобудинов. Меченные изотиоционатом флуоресцеина анти-кроличьи гамма-глобулины (ФИТЦ-гамма-

глобулины). полученные из Института эпидемиологии и микробиологии им. II.-Ф. Гамалея, использовали в рекомендованных производителем разведениях. Для уменьшения кеспсцифическкх реакций предварительно истощали их стабилизированным препаратом из паренхимы клубней картофеля и мицелием гриба. Подобным образом для уменызенил перекрестных реакций антиЭМГ-гамма-глобулины истощали препаратом из картофеля. а антиПЦМ-гаммэ-глобулшш истощали мицелизм гркба.

_Определение активности пектолитическот—Ферментов в

полиакриламидном (ПААГ) геле проводили, используя методику, разработанную Васильевой с сотр. [1984]. При окрашивании рутениевым красным полигалактуроназа и пектинлиаза проявлялись в виде пятен просветления на красном фоне. Одновременно с пектинлиазой проявлялась пектинметилэстераза ШМЭ) в виде ярко-красных пятен.

При окрашивании цетавлоном полигалактуроназа и пектинлиаза прявлялись в вг!де пятен просветления на молочном Фоне, а пектинметилэстераза з виде молочно - белых пятен.

5. Определение актипноуг)! иквеота.чн в геле- Определение проводили по методу Cluing et al. Г19703 . Подготовленную пластину помещали в реакционную смесь и инкубировали при 3713 С до появления четкого коричневого окрашивая;;.»!. Затем гель погружали на 5 кик. в 10% раствор ТХУ для остановки реакции и отмывали дистиллированной водой.

е. Иммун<?эл?ктроФооез. В работе применяли три кодификации метода иммуноэлектрофореза - ракетнкй, ракетно - линейичп и перекрестный: в первоы ¡¡вправлении проводили

изоэлектрофокусирование ШЭФ), а во втором - гмиуноэлектрофорез (ракетный или ракетно - линейный) [Аксельсен и др.. 1977]. Ракетниц иммунофорез проводили в 1,5* агарезш-гх гелях на пласт-мах, расположенных горизонтально. В качестве электродного бусера ::спсльзовали я. f-2 И барбитурат натрия, dH Е.б; В буфзр для приготовления геля вводили Тритон X-1S3 с концентрации 1%. При перекрестном ИЭФ-игалукоэлектрсОсрезе из оглекгро фокусирование проходило в течение 90 мин. затем трек сфокусированного препарата вырезали и переносили на вторую пластину на середину или на край-стекла. Свободную часть пластины заливая!: гелем для иммуноэлектрофороеза. Иммунофорез проводили в перпендикулярном направлении по отношению к изоэлектрофокусирсванию в течение 16

часов- После »вдноэлектрофореза пластины с гелем окрашивали или на белок Кумасси R-2S0 или выявляли в них активность пектолитических ферментов и инвертазы.

7. ИзоэлеетроФокусированце. в исследованиях использовали несколько способов изоэлектрофокусирования.

A. Изоэлектрофокусировшше препарата в колонке с, градиентом сахарозы на приборе Multiphore (Швеция). Проводили изоэлектрофокусировшше в диапазонах рНЗ-1виЗ-5в соответствии с рекомендациями фирмы "ькв" [Hougland. 1971]. Собранные фракции обессоливали гельфильтрацией через сефадекс с -25.

Б. Аналитическое изоэлектрофокусироваяие в пластине ПААГ на приборе Multiphore. Использовали пластины Anpholin PAG - plate с диапазоне»! pH 3,5 - 9,5 И 4,5 - 6,5. Подготовку пластин проводили согласно инструкции фирмы "ысв*. В качестве электродных растворов использовали 1М П3ро4 (анод) и 1М НаОН (катод). Процесс контролировали по движение окрашенных белковых маркеров. Окрашивание на бедок проводили по Брэдфорду в растворе Кумасси G г 250 [Bradford, 1976]. Активность пектолитических ферментов проявляли непосредственно в геле.

B. Изоэлектрофокусирование в пластинах агарозы хер. В качестве электродак растворов использовали 0.05М h2so4 (анод) и IM Наов (катод). 1* гель агарозы содержал 2,5% амфолинов. 12« сорбита. ПрефОБусцрование проводили при напряжении 50 В и силе тока 4 шК. Фокусирование - при напряжении 300 В и силе тока 18 вА. Время фокусирования 90 мин.

8. Получение препарата шггоплазматических мембран (ГШМ) из паренхимы клуДяеЯ кяртойедя. Препарат получали путем дифференциального центрифугирования микросомальной фракции в градиенте плотности сахарозы [Ладыженская и др.. 1980]. Препарат содержал преимядаствеяно мшеровезикулы плазмалемш. Этот препарат использовали для иммунизации кроликов.

Препарат цитоплазматических мембран стабилизировали обработкой в течение 1 часа 0.5« раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере (в. 15 М. pH 7.3). Затем многократно промывали тем же буфером. Стабилизация способствует сохранение белков мембраны в процессе обработок. ' не уменьшая их антигенную активность [Процеяко, Ладыженская. 1987].

Осадок из гомогената паренхимы клубней картофеля (8690g) и

мицелий гриба. 'которые использовали для истощения препаратог. гамма-глобулинов, стабилизировали как описано выше.

9. Обработка мембпан (П11М) метаболитами гриба. Суспензию, стабилизированных глутаровым альдегидом ПЦМ осаждали путем центрифугирования (геев о. зе мин.). Обработку мембран метаболитами гриба проводили трехкратно. добавляя к суспензии мембран равные количества растворов экстрацеллюлярных метаболитов гриба (ЭКГ). выравненных по содержанию белка (поглощение при 280 км), после чего ПЦМ промывали. Обработанные таким образом пробы ПЦМ инкубировали с предварительно истощенными гамма-глобулинами. При этом для уменьшения неспецифических реакций проводили трех -кратное инкубирование с гамма-глобулинами, при их концентрации не превышающей 30 мкг/мл. После соответствующих отмывок заключительной стадией в этих опытах были инкубации ПЦМ с ФИТЦ -гамма - глобулинами и последующая серия отмывок.

10. Измерение интенсивности (Ттуопесиеншп:. Для измерения интенсивности флуоресценции обработанные ПЦМ суспендировали в фосфатном буфере (0,815 М. рН 7,3). Флуоресценция измеряли при длике волны возбуздения 492 км и длине волны испускания 520 нм на спектрофотометре " Hitachi мр-4 " (Япония). Интенсивность флуоресценции рассчитывали в относительных единицах, притязал за единицу шпеиеквностъ флуоресценции ПЦМ, обработанного антиПЦМ или контрольными (от неиммунизированных кроликов) гамма-глобулинами и ФИТЦ-гаА!ма-глобулииэы(.

11. Определение содержания кальц>.д в пробах. Определение проводили ка атсмно-абсорбцг.онком спектрофотометре "Hitachi 17010" методом добавок [Прайс, 1976J.

Приведенные величины рассчитывали как среднее арифметическое из 3-5 биологических повторностей с учетом средаей квадрзтичноп ошибки. В расчете« использовали данные, достоверные по первому порогу вероятности. Достоверность разницы оцешшала по критерию Стьидпвга.

12. Прэпапчт из Aspergillus nioer. В работе использовали дза препарата. Пзктолиткческий препарат "Пектиказа". полученный из A. nigeir. ь котором полкгалактурокгзная активность (ПГА) составляла 30000 - 170690 ед./г, пеглинзстеразная активность (ПЭА) 54-21® ед./г, содержание б^лка - 14,4-23,2%. Пектинзстеразннй препарат, полученный на химическом комбинате в Ботевграде имел лектинэстеразную активность равную 100 ед./г.

-ь-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ И ПЕЕСГИНЛИАЗЫ) В ИММУНОПРЕЦИПИТАТАХ.

Для исследования пектолитических ферментов изучаемых грибов методами иымукоэлехтрофореза "необходимо было провести анализ полученных иммунных сывороток и препаратов иммуноглобулинов, а также разработать метода выявления пектолитических ферментов в юмунопреципитахах.

Препарат лиофильно высушенного культурального фильтрата у.<1аЫ1ае "хл 1-3" испытывали, используя метод ракетного иммуноэлектрофореза. После проведения юмуноэлектрофореза 1ыли хорошо видны в проходящем свете шмунопреципитаты. Их окрашивали на белок Кумвсси К.-25В. при этом были выявлены 5 иммунопреципитадаошшх пиков, направленных к аноду и 3 -направленных к катоду.(Рис.1).

Рис. 1. Схема ракетного иммуноэлектрофореза препарата культурального фильтрата \г.йаЬ11ае "хл 1-3" с сывороткой против этого препарата. Концентрации культурального фильтрата: 58; 25: 10: 5 мг/мл (по 2.8 мел в лунку). Окрашивание Кумасси я-25в.

В образовавшихся иммунопреципитатах выявляли активность пектолитических фе.чеятов. Для "этого применили ранее разработанный метод идентификации активностей пектолитических Ферментов в пожакрилаыидном геле (Васильева и др.. 1984], введя некоторые изменения. Пластины с агарозой выдерживали в

реакционной смеси 2 часа при ь-зе^ (время выдержи в реакционной смеси -было предварительно подобрано).

Реакционная смесь для проявления активности подмгалактуроназы: в,5 * свекловичинй пекткн. 20 *м ЭДТЛ. 0,02 м оцстатдай буфэр, рН 5,2.

Роакцкснияя сиеоь для проявления активности пектшииази: в,5* яблочная пектки, в.вг И сас12 . в,в2вч Трие-вс1 буфер. рН 3.4.

Затем пластину продавали дистиллированной водой (2 раза по 5 мин.) и помечали в раствор 0.1 и яблочной кислоты, содержащей 0.692 н СаСХц (для пекткнлказы) или в раствор 0,1 и яблочной кислоты (для» полигаяактуровазы). Время инкубации ее более 1 часа. После этого прокявали в дистиллированной воде 2 раза по 5 мин., заливали раствором цетавлона (1%) или рутениевого красного (0.85%). Окрашталось в течение 0,5 - 2 часов.

Активность ферментов в иыыунопреципитатах проявлялась в виде линий просветления на иопочном фоне (цетавлон) или на красном фоне (рутениевый красный). При использования реакционной снеси, содерзацэй яблочный пектин, в икаунопраципитатах выявлялась и активность пекткнмзтилэстеразы. Образовывались линии молочно-белого цвета (цетавлон) ила ярко-краевого цвета (рутениевый красный). После окрашивания цетавлон или рутениевая красный сливали, пластины с агарезой проковали дистиллированной водой (1 час).

2.ВЫЯВЛЕНИЕ ПЕКТОЖГИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В СОСТАВЕ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ГРИБОВ МЕТОДОМ РАКЕТНОГО МШНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА.

Исследуеаые препараты были охарактеризованы при покици методики идентификации активностей пектолкти^еских ферментов н кгзертазы в иьыукопрецкгагтатах.

Для этих целей использовали ратует ный икчуноэлектроЛорез препарата культуралиюго фильтрата V. ¿аЬНае "хл 1-3" с гомологичной сывороткой. После ракетного кммуноэлетрофореза е проходяа^эм свете «а пластика?: были видны нынут:опреципитатв. Эти пластины обрабатывали для выявле!:ия белка и фэркзнтов.

Окрашивание на белок позволило шлвкть восемь линий иимунопроципитацни. причем пять было наярвлзно к аноду, а три - к катоду. Полигалактуроназкая активность обнаружена в двух линиях

преципитации. направленных к аноду. Одна линия прецшштции. направленная к катоду имела активность подигалактуроказы. Активность поктиалиазы наедена в 5-ти линиях иынунопрецитггащш, направленных к аноду и в 2-х - к катоду. Активность пектииметклэотеразы выявлялась в одном преципитате, расположенном со стороны катода. Две линии преципитации, содержащие активность инвертазы были валравлены только к аноду ..(Табл. 1).

Таблица 1.

' Распределение активностей пектолитичесхих ферментов в

вммунопрештитаяях.

СПОСОБ ОБРАБОТКИ ЧИСЛО ПРЕЦИПИТАТОВ

ОБЩЕЕ НАПРАВЛЕННЫХ

К АНОДУ К КАТОДУ

У.ааЫ1ае

ОКРАСКА НА БЕЛОК 8 5 3

АКТИВНОСТЬ ОТ 3 2 1

ПЛ 7 5 2

ИЫЭ 1 в 1

Р.1п£еаЬап&

ОКРАСКА НА БЕЖЖ 4 4 4 • в

АКТИВНОСТЬ ПГ 2 2 3 2 в 0

ПЛ 3 X 3 1 в 0

пмэ в 2 в 2 в в

ВОЗРАСТ ГРИБА, ДИК 3 14 3 14 3 14

Эти результаты бши получены для культуралышх фильтратов гриба У.йаЬИаа "хя 1-3" и "хл 4-6" с гомологичными сыворотками. получении« против культуральяого фильтрата.

Для исследовакия экстрацеллаляриых метаболите» гриба Р. 1а£ез(ава использовали метод ракетного иымуиоэлектрофореза с послелушцим проявлением активности пектодитических ферментов в юмунопреципитатах. разработанный для гриба V. ¿аЬ11ае.

У исследовали препараты экстрацеллпдярных

метаболитов, полученных из культуралышх фильтратов грибов 3-х и

-1114-ти дневного возраста г Ракетный иммуноэлектрофорез проводили с гомологичными гамма-глобулинами. После проведения иммуноэлектрофореза образовалось четыре линии преципитации, направленных только к аноду.

В 3-х - дневной культуре Р.1п£ез1апз полигалактуроназа выявлялась в 3-х линиях преципитации, пектинлиаза в 3-х. В более старой культуре активность полигалактуроназы выявлялась _в 2-х линиях преципитации, пектинлиаза в одной.' Обнаружена также пектинметилэстераза, которая выявлялась в 2-х линиях кммукопреципитации. Таким образом в более старой культуре Р.1п£езйапг уменьшается число выявляемых форм пектиклиазы и накапливается пектинметилэстераза.

3.АНАЛИЗ МНОЖЕСТВЕННЫХ ФОРШ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, ВЫЯВЛЕННЫХ МЕТОДОМ ПЕРЕКРЕСТНОГО ИЭФ - ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА.

Проведенный анализ экстрацеллюлярных метаболитов исследуемых грибов методом изоэлектрофокусирования позволил выявить разное число множественных форм пектолитических ферментов, отличающихся по изоэлектрическим точкам у у.йаЬНае (Васильева и др., 1984].

Для дальнейшей их характеристики мы воспользовались перекрестным ИЭФ-иммуноэлектрофорезом. В первом направлении проводили изоэлектрофокусирование в геле агарозы. а во втором -ракетный иммуноэлектрофорез. Во время разделения белков препарата культуралького фильтрата у.йаЬНае "хл 1-3" образовывался градиент рН от- 4,3 до 8,8. Пять .множественных форм полигалактуроназы расположились в интервале рН от 4,8 до 8,0. Им соответствовали две линии иммунопреципитации, расположенные одна над другой в ракетном кммуноэлектрофорезе во втором направлении. Кроме этого изоэлектрофокусирование показало существование («елочной формы полигалактуроназы (рН 8.6 - 8,8). В перекрестном иммунсэлектрофорезс• ей соответствует одна дуга преципитации, направленная в сторону катода. (Рис. 2).

Следовательно существует группа множественных форм, которым соответствует одна линия преципитации, а другой группе - вторая линия преципитации. Значит должны существовать две группы множественных форм, являющиеся иымунологически различными. А те множественные формы. которым соответствует общая линия преципитации являются иммунологически родственными.

Таким образом. выявлены множественные формы полигалактуроназы. находящиеся в интервале рН 4.8 - 8.8, как кммунологически родственные. так и иммунологически различные.

После перекрестного ИЭФ-иммуноэлектрофореза в образовавшихся иммунопреципитатах, одновременно с проявлением активности полигалактуроназы определяли активность инвертазы.

I

со

W £ S

о

ас

QOOOD О

М ft

рНм да &о и

ИЗОаЛЕЭДРОФСКУСИРОВАНИЕ

Рис. 2. Схема перекрестного ИЭФ-иммуноэлектрофореза в агарозе. Активность полигалактуроназы v. dahliae.

При изоэлектрофокусировании в ПААГ инвертаза V. dahliae "хл 1-3- проявлялась в виде двух форы при рН 4.1-4,3 и З.а-4.4; а методом ИЭФ-иммуноэлектрофореза выявлялась активность в четырех линиях преципитатации в интервалах рН: 4,3-4,8; 4,8-5,2; две линии при 4,8-6,9.

Ракетным иммукоэлектрофорезом было показано. что инвертаза проявлялась в 2-х линиях юиунопреципитации. Следовательно, можно сделать заключение, что есть форма инвертазы нымунслогически различные. Известно. что инвертаза играет важную роль в углеводном обмене в тканях растения [Callow et al.. 19С01.

^2 3 4 5

(\ ЛЛЛЛЛЛДДААА ЛалЛАЛАа.. б о 0 о О О о о 00 О О 0 о О О О О О О, а о; О

I 15 17 19 2527 31 34 37 41 44 454647"' ¿0

¡С* фракции

Рис. 3. Разделение ЗМГ Р.1п4еа1апа (раса 4. 3 дня культишфования) методом изоэлектрофокусирования (рН 3-5) в градиенте плотности сахарозы. А: 1-поглощение при 28» км; 2-рН; Б: проявление активности ПФ во фракция! после проведения ракетного кымуноэлектрофореза. 1-суюгаркый препарат ЭМГ; 2 - 1534-я фракции. ПМЭ; з - 27-41-я; 4 - 41-47-я фракции (пектиновые депо лиме разы и ПМЭ, с плоеная линия; 5 - 46-50-я фракции (ПМЭ. пунктир).

Для фермента пектинметилэстераза Р.1п£ез(о1ш методом ракетно-линейного тмуиоэлектрофореза было показано, что три его множественные формы икнунологически различны. Фракции, содержадае пектинкетилэстеразу получили путем препаративного

изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы. Эти фракции проанализировали. используя метод ракетного иыцуноэлектрофореза с последующим выявлением активности

пектинмети лэстераз ы в иммунопреоипитатах. Ранее ухе было показано. что пектинметилэстераза локализуется в везикулах на кончиках молодых гиф и ' является одним из ферментов активно участвующих в поражении растения грибом frorster. Hendgen, 1987).

Пока в литературе нет четкого представления биологической роли существования множественных форм пектолитических ферментов ICervone et al., 1986]. Но может быть иммунологические различия множественных форм увеличивают приспособляемость гриба г. разным условиям инфицирования растений.

4. ДИНАМИКА ПРОЯВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В

СОСТАВЕ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ГРИВА Phytophtbora infestons.

При изучении пектолитических ферментов фитопатогенных грибов большое значение имеет выбор состава среда культивирования и срока выращивания. Известно, что включение картофельного отвара, содержащего пектин, в питательную среду для культивирования индуцирует образование пектолитических ферментов. Кроме того количество ввделяемьк ферментов иеачется с возрастом культуры. Поэтому методом изоэлектрофокусирования и ракетного иммуноэлектрофореза ки исследовали препараты культуральных фильтратов гриба P. infestans расы 1 трех возрастов (3-х: 7-ми и 14-ти - дневные), выращенные яа ерздах. содержащих картофель и без него.

Препараты экстрацсллюлярннх кгтаболитов гриба трех возрастов разделили методом изоэлектрофокусирования в полкакрияамидиом геле в интервале рН 4 - 6,5 и в них еыявссли активность пектолилгчееггих Ферментов. Полигалактуроназа в этих препаратах проявилась при рН 4,6 - 4,9 одним пятном во всех случаях. Причем существенной разницы в проявлении активности полигалактуроназы в препаратах не было обнаружено.

При выявлении активности пектишшазы и пектикметимэстеразы во всех образцах проявлялось несколько множественных форм. Наиболее четко проявились кножественниз формы, находящиеся в щелочной области (рН 6,5 - 7.3). В • препаратах культурального фильтрата P. infestacs, выращенных на среде с ;сарто0злнкм отваром этих форм было больше и выявлялись они в более сирокок диапазоне рН, а в препарате 14-дневного культурального фильтрата Р.

-15- ________________________________________

з.п£еясапз-выявляется^ три' множественные формы пектинметилэстеразы в виде ярко-красных пятен.

Проявив активность полигалактуроназы и пекткнлиазы в иммукопреципитатах можно отметить следующее: и в препаратах, полученных на среде с картофельным отваром и в препаратах, полученных на среде без него во всех случаях есть активность этих Ферментов (в двух - трех иммукопреципитатах). Но в препаратах из культура р. хп£е51апв 7-дневного возраста, выращенной на среде с картофельным отваром выявляется активность пектинметилэстеразы (в двух иммукопреципитатах). Причем, в препаратах 3-дневнои культуры в ракетном икмунофорезе в иммунопреципитатах активность пектинметилэстеразы не выявляется по-видимому из-за низкой ее активности.

А

4,6

4,9

о о о О О

<©

©

©

©

&

& © €Э

0,0

?,3

3 дн. 14 дн. 3 дн. 7. 14 дн.

Рис. 4. Схема изоэлектрофокусирования препарата экстрацеллюлярных метаболитов гриба Р. infestans. Активность полигалактуроназы (А! и пектинметилэстеразы (В).

Таким образом. обнаружены различия в активности пектолитических ферментов гриба Р. 1п£езъапз, выращенного на

среде с картофельным отваром и без него в зависимости от возраста культуры. У гриба, выращеного на среде без картофельного отвара в культуральном фильтрате обнаруживаются полигалактуроназа и пектинлиаза, а на среде с картофельным, отваром с увеличением возраста гриба появляется пектинметилэстераза.

А

У сл. ед.

12 12 Рис. 5. Иммунофлуоресценция инкубирования с ЭМГ Р.о-пГеа^пз. X,

3 4 5 6 микровезикул ПЦМ после 2-суммарный препарат ЭМГ (расы 1 и 4 соответственно); 3, 4-фракции 1 и 2 (раса 1): 5, б-фракции 1 и 2 (раса 4). Сверху: диаграммы, поясняющие схему опытов А-В. Условные обозначения: М-микровезикулы ПЦМ; " АМГ-антиГЩМ-гамма-глобулины; ЭМГ-экстрацеллвлярные метаболиты гриба: АГГ-антиЗМГ-гамьга-глобулины; ФКТЦ-ФИТЦ-гамма-глобулины.

5. ПЕКТОЖГИЧьСКИЕ ФЕРМЕНТЫ В СОСТАВЕ ЭКСТРАЦЮШШРНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ГРИБА РЬуСорЬЬЬога ±п£еЫап!=, ВЗАЯМОДЕИСГГЗУЩИХ С ЦИТ0ПЛАЗМАТИЧЕСК0Й МЕМБРАНОЙ КАРТОФЕЛЯ.

Первые реакции узнавания при контакте организмов разыгрываются на уровне меточных стскок, мембран и секретируемих метаболитов. Циголлазматические мембраны растительных клеток являются потенциальным местом передачи сигналов из внешне!! среды

внутрь клетки.------------------------------

Было проведено исследование взаимодействия экстрацеллюлярных метаболитов гриба р. 1п£е5(апа с препаратом цитоплазматической мембраны из клеток клубня картофеля методом непрямой иимунофлуоресцзнции с антителами кеченниги изотноцианатсм флуоресцеина.

Для этого провели инкубирование экстрацеллюлярных метаболитов гриба о препаратом цктоплазыатических мембран. Использовали различную последовательность связывайся метаболитов гриба, цитоплазматических мембран. гамма-глобулинов против экстрацеллюлярных метаболитов гриба или против препарата цитоплаз«этических мембран. В качестве критерия связывания использовали интенсивность флуоресценции препаратов.

В результате получили, что экстрацеллюлярные метаболиты гриба саязнзаотся с цитоплау".^ тическЪй мембраной. причем препараты из разных рас даюгг различную интенсивность флуоресценции (Рис. 5. А).

Блокирование антигенноактивных участков мембран не препятствовало связыванию г^етаболитоп. Вероятно, метаболиты гриба связывазотся с какими-то другими участками на мембране. Обработка препаратами, полученными из разных рас давала в этом случае Флуоресценцию различной интенсивности (Рис. 5, Б).

Суммарная препарат экстрацеллюлярных метаболитов гриба разделили па две Фракции. содерлащие лрзинущественно белей (({»акция 1) и преимущественно гликопротеикы (фракция 2).

Проводили связывание этих фракций с препаратом цитоплазмагических мембран. При.этом метаболиты гриба связывались с к?змбранами. но существенной разницы в связывании ни по фрзкцил-м, ни по расам не было (Рис. 5, В).

Таким образом, использование последовательных обработок мембран ыгтаболитаыи гриба, антителами к ним, а также антителами к препарату мембраны позволило показать, что экстрацеллюлярные метаболиты гриба Р. 1п£евЪмпа связываются с препаратом цьтопяазыатических мембран. Полученные данные подтверждает вывод о разиокачественности рецепторов на мембране растения. При Фракцисноровании экстрацеллюлярных метаболитов изучаеьий эффект, не разделялся (не было разницы в интенсивности флуоресценции гликопротеиновой фракции 2 и белковой фракции 1.

Поэтому в следующих опытах проводили разделение суммарного

-1Ь-

препарата э кстрацеллюлярных метаболитов гриба методом изоэлектрофокусирования. Препарат метаболитов гриба получали после 3-х и 14-ти дней культивирования. После изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы проводили ракетный имкуноэлектрофорез фракций с последующей селективной идентификацией пектолитических ферментов в иммунопреципитатах.

При разделении препаратов 3-х и 14-ти - дневного возраста в градиенте рН от 3,5 до 9.5 активность пектолитических Ферментов находилась в анодной области при рН 3,5 - 4,2.

Усл. ед.

3 4 5 6 7 8

9 ^(рращии

Рис. 6. Разделение ЭМГ г.1пгея1мпа (раса 1, 3 дня культивирования) методом изоэлектрофокусирования (рН 3-10) в градиенте плотности сахарозы и иммунофлуоресценция ПЦМ. а -поглощение при 280 км; 6-рН; в - иммунофлуоресценция, выявляемая антиЭМГ-гажа-глобулинами; г - иммунофлуоресценция, выявляемая актиПЦМ-гсима-глобулинами. (Контроль-обработка мембраны гамма-глобулинами неиммунизированного кролика).

___________________Следует отметить, что пектинметилэстераза Р.infestaos

элюировалась в анодной области вместе с полигалактуроназой и петинлиазой. Хотя ранее было показано, что изоэлектрические точки множественных форм пектинметилэстеразы имеют щелочные значения рН [Forater. Kascned, 1985J. очевидно подобно экстрацеллюляриым ферментам других грибов пектолитические ферменты P.infestans образуют высокомолекулярные комплексы с низкими значениями изоэлектряческих точек.

Фракции, иксощке активность полигалактуроназы. пектинлиази, пектинметилэстерази обладали наибольшим связывнием с мембраной (Рис. 6). Таким образом при взаимодействии экстрацеялюяяртя кетаболититов гриба с препаратом цитоплазматических мембран могут участвовать пектолитические фермекты.

При изоэлектрофокусировании препаратов метаболитов граба в интервале рН от 4.5 до 6,5 показано, что метаболиты, концентрирующиеся в более кислой области (рН 2,3) слабо связывались с препаратом цитоплазматических мембран. Хотя предварительное инкубирование препарата цитоплазматических мгмбран с этой фракцией значительно увеличивает их способность связываться с гомологичными '. антимембранными) гв»е.!а-глобугошами. Такой эффект, возмоано, связан с удалением с поверхности мембран молекул, экранируете« антигенно активные группы растительной мембрани, которые отличагггся от рецепторов для метаболитов гриба.

Полученные данные позволяют предположить. что пектолитические ферменты гряба способны действовать на растительную мембрану, модифицируя ее рецепторные свойства.

6. ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ¿¡ПИВНОСТИ ПЕКТОЛИТИЧЕсгШХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИИ ПЕКТОЛИРИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА из Aspergillus niger.

Исследовали препарат пектолитических ферментов "Пектиназа" из A. niger, а также пектинэстеразный препарат, для выяснения -особенностей проявления полигалактуроназы. пектиялиазы и пектинметилэстерази при изоэлектрофокусировании. Пектолитические ферменты, находящиеся в комплексе, как правило влияют друг на друга, изменяя, проявление фермента.

Провели изоэлектрическое фокусирование этих препаратов в более широком диапазоне рН 3,5 - 9.5 и для более достоверного

разделения в более узком диапазоне рН 4, в - 6,5. Используя процедуру проявления пектолитических ферментов в ПААГ. сравнили исследуемые препараты. Было показано, что полигалактуроназа и пектинметилэстераза из л. niaer проявляются при рН 3.5. причем полигалактуроказа мешает проявлению пектинметилэстеразы в препарате "Пектиназа". В этом препарате обнаружено десять пектиндеполимераз, располагающихся в интервале рН от 4,s до 6.4.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана методика идентификации пектолитических ферментов в юмунопреципитатах.

2. В юмунопреципитатах, образованных - экстрацеллюлярными метаболитами гриба V. dahliae и P. infestans, выявлена активность полигалактуроназы, пектинлиазы и пектинметилэстеразы.

3. Существуют кммунологически различные множественные формы полигалактуроназы у v. dahliae и пектинметилэстеразы у Р. "infestans.

4. Экстрацеллюлярные метаболиты гриба F. infestans связываются с различными сайтами на мембране картофеля.

5. ' Экстрацеллюлярные метаболиты гриба F. infestans, содержащие множественные формы пектолитических ферментов, имеющие низкие значения изоэлектрических точек (3.5-4,2) связываются с цнтоплазкатическими ыембрсяами картофеля.

6. Пектинметилэстераза способна образовывать комплексы с полигалактуроиазой и пектинлиазой у P. infestans и с полигалактуроназой у A.niger. проявляясь при низком значении изоэлектрических точек (3,5-4,2).

7. На основании проведенной работы можно заключить, что неполитические ферменты фитопатогенных грибов способны участвовать во взаимодействии с растением-хозяином на разных стадиях, включая разрушение пектиновых полимеров и взаимодействие с цитоплазматической мембраной.

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Васильева К.В.. Гладких Т.А.. Глинка Е.М., Проценко М.А. Идентификация fi - фруктофуранозидазы (инвертазы) и

пектол;ггических ферментов (полигалактуроназы и пектинлиазы) при

иммунохимкческом

изучении

экстрацеллюлярных

факторов

фнтопатогенчых грибов / Новые методы практической биохимии. М.: Наука. 1985. - С-Зв4-211

2. Lutskanov H.L.. Pishtiysfci t.в.. Glinka E.H.. Ehaposhsikov G.L., Glatücikh T.A., Varjsileva K.V. Studies on the pectolitic complex of pectinase iron Aspergillus niger // Comptes rendus de h'Acsdetaie Buigsre des Scions. - 1988. - T.41, И 10. -P.107 - 110.

3. Васильева К.В.. Гладких Т.Д.. Проценко М.А., Ладксевокая Э.П., Глинка Е.М., Шапошников Г.Л. Действие экстрацеллюлярных метаболитов фктопатегекных грибов на изолированные клеточные стенки и препараты цктоплазыатических мембран растений // Труды Всесоюзного совещания "Иолекулярние и генетические механизмы взаимодействуя микроорганизмов с растениями". Пущино: 1989, с. 13« - 138.

4. Васильева ' К.В.. Гладких Т.А., Глинка Е.М.. Шапошников Г.Л., Люцканов Н.Л., Яищийс::я И.Г. Пектолктическне ферменты Aspergillus niger II Сборник трудов Всесоюзного совещания: "6иох»адия хранения картофеля, овощей и плодов". М.: Наука. 199в, С. 77 - 83.

5. Проценко М.А., Ладихенс;оя Э.П., Васильева К.В.. Гладких Т.Д., Глккка Е.М., Шапозии;:ов Г.Л. Изучение взаимодействия экстрацаллюлярних метаболитов phytopnthora infestans с цитоплазиатической мембраной картофеля II Прикладная биохимия и №ЖР0бИ0.ЮГИЙ. - 19S1. - т.27. N.3. - С.411-421.

С. Васильева К.В., Гладких Т.Д., Шапоашков Г.Л., Глинка Е.М.. Люцканов Н.Л.. Пицийски И.Г. Пектолитические ферменты из Aspergillus niger // Тезисы дохлздов 4-оЯ Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами". Ташкент: Фан. 1988. -с.165-166. •

7. Васильева К.В.. Гладких Т.А., Проценко М.А.. Войтович О.И.. Глинка Е.М. Изучение роли пектолитичзских ферментов а патогенезе растений // Тезисы докладов Э-ей Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и друпяс компонентов клеточной стенки". Казань, 1993. - с.9-10.

з. Проценко М.А.. Ладыженская Э.П.. Кораблева Н.П.. Гладких Т.А.. Глинка Е.М.. Васильева К.В. Мембрана клетки картофеля как мишень действия экстрацеллюлярных метаболитов возбудителя фнтофтороза // Тезисы докладов Второго съезда Всесоюзного общества физиологов растений. Минск. 1990. М.: 1992. - с.169.