Роль белков теплового шока и сигнальных белков в регуляции провоспалительного ответа у мышей

Новоселова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль белков теплового шока и сигнальных белков в регуляции провоспалительного ответа у мышей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль белков теплового шока и сигнальных белков в регуляции провоспалительного ответа у мышей"

□□3481174

На правах рукописи

НОВОСЕЛОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

Роль белков теплового шока и сигнальных белков в регуляции провоспалительного ответа у мышей

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2009

О о

•л

003481174

Работа выполнена в учреждении Российской академии наук Институт биофизики

клетки РАН

Научны й ру ководите л ь:

член-корр. РАН, профессор, Фссепко Евгении Евгеньевич

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических паук, профессор Ланкип Валим Зиновьевич (ФГУ РКНПК Росмедтсхнологий)

доктор биологических наук, Галина Дмитриевна Миронова

профессор

(ИТЭБ РАН)

Ведущая организация - учреждение Российской академии наук Институт фундаментальных проблем биологии РАН

Защита состоится «И» ноября 2009 г в часов

на заседании Диссертационного совета Д 20В.057.01 в Федеральном государственном учреждении "Научио-исследовательский институт физико-химической медицины" (Федерально-медико-биологического агенства) но адресу: Москва уд. Малая Пироговская д. I

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины" (Федералыю-медико-биологическое агенство)

Автореферат разослан " октября 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, """ МуринаМ.А.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Воспалительные хронические патологии и особенно сепсис, как их наиболее тяжелое

последствие, являются одними из наиболее частых причин смертности и относятся к социально-значимым заболеваниям. Обычно септические состояния возникают как постоперационные или посттравматические последствия, в основе которых лежат расстройства функционирования иммунитета, гибель клеток и повреждение тканей.

Известны некоторые молекулярко-клеточные механизмы, связанные с каскадом реакций, инициированных токсинами грамотрицатсльцых или грамположительных бактерий (Прохоренко и др., 2005; Opal et al., 2003), и представляющие собой систему врожденной антимикробной резистентности организма млекопитающих. Особенно тяжелые формы сепсиса индуцируются токсинами грамотрицательных бактерий — даже при использовании современных достижений интенсивной терапии летальность пациентов с диагностированным заболеванием достигает 30-60% для разных видов сепсиса.

Большинство исследований по выявлению механизмов взаимодействия бактериальных токсинов с живыми системами выполнены с использованием трансформированных клеток (Nishina et al., 2004), у которых чувствительность к патогенам значительно отличается от той, что свойственна нормальным животным клеткам. Кроме того, наибольшее количество работ, посвященных этим проблемам, выполнено с использованием клеточных моделей in vitro. С учетом перечисленных обстоятельств, представляется актуальным исследование новых закономерностей возникновения и развития септических состояний с использованием более адекватных животных моделей, которые максимально точно воспроизводят реальную картину сепсиса.

Принимая во внимание тот факт, что наличие иммунной недостаточности является одним из главных условий развития сепсиса, необходимо исследовать ключевые процессы и мессенджеры иммунного ответа клеток, а также провести поиск подходов для снижения риска возникновения тяжелых последствий септического процесса. В этом плане представляются актуальными исследования закономерностей функционирования защитных систем клетки, учитывая общее состояние цитокиповой сети (продукция про- и анти-воспалительаых цитокшюв), уровень экспрессии белков теплового шока БТШ70, БПШ5 и БТШ90, а также их локализацию во внутриклеточных структурах, оценку продукции оксида азота и уровня активации каскадов сигнальной транедукции NF-кВ и SAPK/JNK в условиях острого и хронического воспалений. С учетом мнения большинства клиницистов о том, что сепсис легче предотвратить, чем лечить, целесообразно исследовать ряд подходов, направленных на превентивные меры снижения риска развития септических состояний.

Цели и осповные задачи:

Целью данной работы было исследование роли ключевых защитных систем клетки при остром токсическом стрессе, а также исследование динамики изменений клеточного иммунитета при хроническом воспалении. Кроме того, в задачу работы входило изучение способов модуляции уровня резистентности животных к действию бактериальных эндотоксинов и поиск методов, снижающих чувствительность клеток к липоплисахариду (ЛПС) из стенок грамотрицательных бактерий Escherihia coli. Поскольку клетки иммуипой системы очепь быстро формируют ответ на эндотоксины, в качестве главного объекта исследования были использованы макрофаги и лимфоциты животных, которые являются основными продуцентами защитных молекул. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать роль белков теплового шока БТШ72 и БТШ90, некоторых про- и антивоспалительных цитокинов: фактора некроза опухолей (ФНО-а и ФНО-ß), интерферона-у (ИФН-у), интерлейкина-1а (ИЛ-1а), интерлейкина-lß (ИЛ-lß) интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-3 (ИЛ-3), интерлейкина-6 (ИЛ-6), интерлейкина-10 (ИЛ-10) и оксида азота в защитной реакции клеток и целого организма в условиях острого и хронического воспалений, индуцированных эндотоксином из грамотрицательных бактерий.

2. Учитывая развитие окислительного стресса при остром воспалении, подобрать комплекс липорастворимых природных антиоксидантов, способных снизить продукцию активных форм кислорода in vivo в условиях острого воспаления. Исследовать анти-воспалительный потенциал антиоксидантов путем оценки уровня продукции цитокинов (ФНО-а, ИФН-у, интерлейкинов - ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10), белка теплового шока БТШ72, оксида азота, а также уровней активации двух сигнальных каскадов: фактора транскрипции NF-кВ и стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK.

3. Изучить закономерности воздействия in vitro и in vivo ингибитора активности белка теплового шока БТШ90 - гелданамицина - на уровень провоспалительпого ответа клетки в условиях острого воспаления путем оценки продукции цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-у), белков теплового шока БТШ72, БТШ25 и БТШ90, оксида азота, а также оценить уровень активации сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK.

Научная новизна. Впервые установлено, что острое воспаление, индуцированное бактериальным эндотоксином, сопровождается более высоким уровнем молекулярно-клеточного ответа на стресс, чем тот, что индуцируется при хронической интоксикации. Так, острое воспаление вызывает более значительное увеличение продукции ФНО-а, ФНО-ß, белка теплового шока БТШ72 и N0, в сравнении с теми изменениями, которые наблюдаются при хроническом воспалении у мышей. Это означает, что при развитии хронического воспаления в клетках организма снижается способность отвечать на стресс

высоким уровнем продукции белков теплового шока, иитокинов и оксида азота - основных мессенджеров иммунного ответа.

С использованием животных моделей острого и хронического воспаления впервые установлено, что не только БТШ70, но и БТШ90, субстратами которого являются сигнальные белки, экспрессируется в клетках в условиях токсического стресса, вызванного эндотоксином. Показало, что снижение уровня окислительного стресса, индуцированного бактериальным токсином, путем превентивной защиты клеток организма комплексом антиокеидантов приводит к снижению провоспалитсльпого ответа и реализуется через уменьшение степени активации сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK. Установлено, что гелданамицин, специфически связывающийся с БТШ90 и подавляющий активность этого белка, обладает анти-воспалительной активностью, снижая продукцию и оксида азота в условиях острого воспаления. Этот препарат предотвращает чрезмерную активацию сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK при действии эндотоксина in vitro и in vivo, а также приводит к изменению локализации белков теплового шока БТШ72 и БТШ25 в субклеточных структурах.

Научно-практическая ценность. В работе содержатся новые сведения об иммунопатогенезе острого и хронического воспалений, что указывает на необходимость переосмысления механизмов патогенеза сепсиса и поиск на основе этих исследований новых медикаментозных средств терапии. Результаты исследования указывают на перспективу использования антибиотика гелданамицина и его производных при разработке новых препаратов для лечения острых и хронических воспалений. В работе получены результаты, указывающие на возможность применения профилактических подходов для снижения риска развития тяжелых септических состояний.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной школе-конференции 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, (Moscow, 2007), на конгрессе INTERNATIONAL SOCIETY FOR ADAPTIVE MEDICINE.-MOSCOW, 2006, на 11-й и 12-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых БИОЛОГИЯ - НАУКА 21-го ВЕКА (Нущино, 2007,2008).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе

4 статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем дпесертапии: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 139 листах машинописного текста и содержит 29 рисунков и четыре таблицы. Библиографический указатель содержит 273 источника литературы.

Список сокращений: ИЛ - интерлейкин, ФНО - фактор некроза опухолей, ИФН-у -интерферон-гамма, БТШ - белок теплового шока, ЛПС - липополисахарид, NO - оксид азота, ИФА - иммуноферментный анализ, АФК - активные формы кислорода, ГА -

гелданамицин, АО - антиоксида]пы, NF-kB - nuclear factor кВ, ядерный фактор кВ, SAPK/JNK - stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase, стресс-активируемая протеинхиназа JNK.

.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Животные и модели. В экспериментах использовали мышей-самцов аутбредного стока NMRI, весом 25-30 г. Острое воспаление вызывали однократным введением внутрибрюшинно 250 мкг на 100 г веса тела липополисахарида (ЛПС) из Escherihia coli (Serotype 026.В6, Sigma, USA). Хроническое воспаление индуцировали путем ежедневных инъекций ЛПС в течение 11 дней, увеличивая дозу ЛПС каждые 2 дня, при этом первая доза составляла 25 мкг/100 г веса, последняя - 250 мкг/100 г веса. После инъекций ЛПС ни одно животное не погибло во время экспериментов. Контролем служили животные, получающие внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора. При изучении эффектов гелданамицина in vitro этот антибиотик в концентрации 1 мкг/мл добавляли в культуральную среду с клетками (перитонеальпые фагоциты или лимфоциты селезенки мышей) на 6 час, в экспериментах in vivo гелданамицин вводили внутрибрюшинно в количестве 2,5 мг/кг веса. Диета, обогащенная антиоксидантами, содержала дополнительно: убихинон Q9 — 8 мг, p-каротин - 2 мг, а-токоферол - 2 мг на кг веса животных.

Функциональная активность клеток. Продукцию оксида азота измеряли по концентрации нитритов, являющихся конечным продуктом метаболизма короткоживущего соединения NO с использованием реактива Грисса (Green et al.s 1982). Продукцию ФНО-р измеряли методом цитотоксического теста с использованием в качестве мишеней клетки L929. Оценку пролиферативной активности лимфоцитов мыши проводили по измерению включения [3П]-тимидина в клетки, стимулированные конконавалином А. Измерение концентрации цитокинов в сыворотке крови, а также продукцию цитоюшов макрофагами и спленоцитами измеряли методом гетерогенного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов антител для определения цитокинов мыши (Murine ELISA Development Kits, PeproTech EC, Великобритания). Измерение продукции белков теплового шока и сигнальных белков каскадов NF-kB и SAPK/JNK проводили с помощью Вестерн блот анализа с использованием следующих первичных антител: лоликлопальные кроличьи антитела к Hsp70 (HSP 72, клон SPA-812, StressGen Biotechnologies, индуцибельная форма); к Hsp25 (HSP 25, клон SPA-801, StressGen Biotechnologies); к Hsp 90 (HSP 90a, клон SPA-828, StressGen Biotechnologies). В качестве первичных антител к сигнальным белкам использовали политональные кроличьи антитела: Phospho-NF-кВ Antibody (Phospho-NF-кВ р65 (Scr 536), Cell signaling technology, США), NF-кВ Antibody (NF-кВ p65, Cell signaling technology, США) и 1кВ-а Antibody (1кВ-а, Cell signaling

technology, США), к синтетическому фоефопептиду SAPK/JNK, фосфорилированному по Thrl83/Tyrl85 (Cell Signaling technology, США); Phospho- IKKa/p антитела II (Ser 176/180 (Cell Signaling Technology, США). В качестве вторичных аптител использовали биотшшлированные козьи IgG к иммуноглобулинам кролика (StessGen, Канада), и затем добавляли коныогат стрептавидин-пероксидаза хрена (Sigma, США). Для выявления белков использовали систему ECL (Amersham, Швеция). Количественную оценку проводили с использованием программы Qapa. Разделение клеток на субклеточные органеллы проводили с использованием набора для фракционирования субклеточных фракций (Qproteome Cell Compartment Kit, Qiagen, Германия).

Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Продукция цитокинов, оксида азота и белков теплового шока при остром и хроническом воспалениях

Продукция цитокинов и оксида азота. Исследование механизмов адаптации организма к действию токсических агентов является важным как для фундаментальной биологии, так и для клинической медицины. Известно, что хроническое воспаление и сепсис сопровождаются нарушениями регуляции иммунного ответа, основными мсссенджерами которого являются цитокины и другие биоактивные молекулы, продуцируемые клетками иммунной системы.

На двух рисунках (Рис. 1,2) представлены результаты измерений показателей иммунного статуса животных в условиях острого и хронического воспалений, индуцированных введением ЛПС. Показано, что однократное введение сублетальпой дозы ЛПС (острое воспаление) индуцирует резкое увеличение продукции ФНО (ФНО-а в макрофагах и ФНО-Р в Т-лимфоцитах) и оксида азота. В этих условиях наблюдали не столь значительное, но достоверное увеличение продукции ИЛ-3 и ИФН^у в лимфоцитах селезенки мышей, получивших однократную инъекцию ЛПС (250 мкг/100 г веса тела).

На этих же рисунках (Рис.1, 2) представлены результаты измерений показателей

иммунного статуса животных в условиях хронического воспаления. При этом измерения

проводилисьна 3-х стадиях развития процесса интоксикации — на 4-й, 8-йи 11-й дни. Было

установлено, что продукция ФНО-а в макрофагах увеличивалась примерно в 1,5 раза на 4-й

и 8-й дни, а на 11-й день количество продуцируемого ФНО-а снижалось почти до

контрольного уровня. Такая же динамика наблюдалась и для продукции ФНО-Р в

лимфоцитах селезенки в течение хронического процесса (Рис.1). Продукция N0 в

макрофагах была существенно подавлена иа 8-й день, а на других стадиях хронического

стресса достоверных изменений продукции NO не было отмечено (Рис. 2). Для трех

исследованных интерлейкипов (ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-6) в лимфоцитах наблюдали немонотонные изменения уровней их продукции в зависимости от накопленной дозы лилополисахарида в период пролонгированной интоксикации.

Рис. 1. Влияние острого и хронического воспаления на продукцию цитокинов в лимфоцитах селезенки мышей.

Измерения проводили через 6 Ч после последней инъекции ЛПС.

□ - острое воспаление, 1Э - 4-й- день хронического воспаления (ХВ), Н - 8-й день ХВ, 0 - 11-й день ХВ. Каждое значение - среднее из 3-4-х независимых экспериментов, все измерения проводили индивидуально для каждого животного в 6-ти повторах.

■"-достоверное отличие от контроля, Р< 0,05;

** - достоверное отличие от контроля, Р< 0,01.

Таким образом, обнаружено отличие ответов организма на острое и хроническое воспаление. Реакция организма на острое токсическое воздействие выражается в адаптивном повышении функциональной активности клеток, продуцирующих цитокины. Другая тенденция прослеживается при длительном токсическом воздействии увеличивающейся дозы ЛПС. В начале процесса интоксикации продукция всех цитокинов в клетках, особенно ФНО-а и ФНО-|3, возрастала, хотя и не в такой степени, как при остром воспалении. При этом был отмечен резкий рост числа продуцирующих клеток — перитонеальиых фагоцитов (данные не показаны). Пролонгирование процесса интоксикации мышей приводило также к тому, что у них заметно возрастало количество лимфоцитов селезенки - клеток, продуцирующих ФНО-р (данные не показаны), при этом уровень продукции этого цитокина в лимфоцитах уменьшался в 2 раза. Таким образом, компенсаторный рост количества лимфоидных клеток при развитии хронической

интоксикации происходил одновременно со снижением функциональной активности этих клеток, выраженной в угнетении их способности продуцировать ФНО.

Рис.2. Продукция цитокинов и оксида азота в перитонеальных фагоцитах мышей в условиях острого и токсического воспаления. Все обозначения, как на Рис. I.

Продукция белков теплового шока при остром и хроническом воспалениях

Учитывая многочисленные экспериментальные доказательства, полученные в последние годы, можно было ожидать, что не только БТШ70, но и другие белки теплового шока, продуцируемые при действии целого ряда повреждающих факторов, могут принимать участие в защите организма от эндотоксического шока. Продукцию белков теплового шока - БТШ72 и БТШ90 — измеряли при остром и хроническом воспалениях. На Рис. 3 представлен иммуноблотинг белков лимфоцитов селезенки против антител к индуцибельной форме белков БТШ70 - БТШ72. Самый высокий уровень экспрессии индуцибельной формы этого белка был выявлен при однократном введении 250 мкг/100 г веса ЛЛС (острое воспаление).

При моделировании хронического воспаления индуцибельный белок БТШ72 выявлялся в течение всего периода наблюдения, но на 11-й день его продукция была несколько снижена в сравнении с уровнем этого белка на более ранних сроках введения ЛПС. Аналогичные измерения были проведены для БТШ90. На Рис. 4 представлен иммуноблотинг белков лимфоцитов селезенки против антител к БТШ90-а. Проведение Вестерн блот анализа выявило повышение экспрессии этого белка при остром воспалении, а также на на 4-й,

1 2 3 4 5 6 7

72 кВа

Рис. 3. Экспрессия БТШ72 в лимфоцитах при остром и хроническом воспалениях. 1 — интактные животные; 2 — контроль (...); 3 - острое воспаление; 4 — 4-й день хронического воспаления (ХВ); 5 - 8-й день ХВ; 6 - 1.1-й день ХВ; 7 - стандарт (рекомбинантный БТШ72). Все пробы нормированы по содержанию суммарного белка в пробе.

Рис. 4. Экспрессия БТШ90-а в лимфоцитах при остром и хроническом воспалении. 1- интактные животные; 2 - контроль (...); 3 - острое воспаление; 4 - 4-й день ХВ, 5 - 8-й день ХВ; 6 - 11-й день ХВ; 7 - стандарт (рекомбинантный БТШ90-а). Все пробы нормированы по содержанию суммарного белка в пробе.

8-й и 11 -й дни развития хронического процесса. Интересно, что на 11-й день интоксикации уровень экспрессии БТШ90 был меньше, чем на 8-й день хронической интоксикации, вызванной ЛПС.

Таким образом, среди всех исследованных продуктов иммунокомпстентных клеток основными мессенджерами, участвующими в ответах на острый токсический стресс, являются ФНО-а, ФН0-|3 и оксид азота, продукция которых возрастает примерно в 3 раза. При этом стимуляция продукции интерлейкинов (ИЛ-2, ИЛ-3 ) и ИФН-у была не столь значительна. Как и следовало ожидать, острое воспаление вызывало заметное накопление цитокинов в крови (данные не показаны), что отражает наличие системного воспалительного процесса в организме мышей, получивших высокую дозу ЛПС. В отличие от острого воспаления, при длительном введении ЛПС было отмечено угнетение продукции N0, а возрастание продукции ФИО было не столь велико, как при однократном введении большой дозы ЛПС. При пролонгировании воздействия увеличивающимися дозами ЛПС клетки животных утрачивали способность к сверхпродукции ФИО, особенно заметно это было в отношении продукции ФН0-|5 в лимфоцитах селезенки. Была отмечена синхронность изменений уровней продукции ФНО, N0 и белков теплового шока. Полученные результаты показывают, что при повторяющемся введении увеличивающихся доз эндотоксина в клетках организма снижается уровень провоспалительного ответа, оцениваемый по продукции белков теплового шока, ФНО и оксида азота.

1 2 3 4 5 6 7

«Г-»* - «о 4ММ1 *чь-

Таким образом, проведенное исследование позволило обнаружить неизвестный ранее факт участия белка теплового шока БТШ90 в ответе организма на острое и хроническое воздействие эндотоксина. Интересно, что в отличие от индуцибелыюй формы белка БТШ70, который не был обнаружен в отсутствие ЛПС, БТШ90 экспрессировался и в нормальных условиях. Эти результаты согласуются с тем обстоятельством, что БТШ90 играет важную роль в метаболизме клетки - как в норме, так и при стрессовых воздействиях.

Исследование влияния антиоксидантов на уровень провоспалительного ответа, индуцированного эндотоксином

Считается доказанным, что воспаление, индуцированное токсином грамотрицательных бактерий, сопровождается окислительным стрессом, который способен вызвать целый ряд нарушений в функционировании иммунной системы. В условиях окислительного стресса эндогенная система защиты клетки, включающая ферменты-антиоксидангы и низкомолекулярные соединения, по-видимому, оказывается не в состоянии нейтрализовать избыток активных форм кислорода. По этой причине при делом ряде патологий, сопровождающимся окислительным стрессом, применение экзогенных антиоксидантов оказывается весьма эффективным (Ланкии и др., 1999,2005,2008).

В настоящей работе методом хемолюминесцентного анализа мы показали, что предварительная диета с комплексом антиоксидантов (а-токоферола, p-каротина и кофермента Q9) значительно снижала продукцию активных форм кислорода в макрофагах и крови животных при остром воспалении (данные не показаны). Для выяснения молекулярных механизмов защитного действия липорасгворимых антиоксидантов было изучено их влияние на продукцию ключевых цитокинов: ФНО-а, Ю1-1а, ИЛ-1(3, ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН-у, ИЛ-10 и БТШ72 в клетках мышей при остром воспалении. Поскольку окислительный стресс способен активировать апоптоз, изучали также влияние диеты с антиоксидантами на некоторые звенья стресс-индуцируемого апоптоза, а именно, на активацию стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK и белки каскада NF-kB.

Влияние антиоксидантов на активность клеток in vitro

Для того чтобы предварительно оценить эффекты каждого из применяемых антиоксидантов, использов&ти клеточную модель in vitro. Каждый компонент диеты в концентрации 50 цМ добавляли к культивируемым Т клеткам, после чего прояиферативный ответ на митоген (Кон А) оценивался по включению меченого тимидина. При этом была проверена эффективность коферментов Q с различными длинами боковых цепей. Установили, что все убихиноны, а-токоферол и р-каротин, добавленные в культуральную

среду in vitro, стимулировали пролиферацию Т лимфоцитов, причем их стимулирующие эффекты были почти одинаковыми (Рис. 5).

Рис. 5. Влияние антиоксидантов, добавленных in vitro, на пролиферацию Т-клеток мышей.

Уровень блаеттрансформации оценивали по включению [3Н] тимидина в клетки.

* - Достоверное отличие от контроля, Р<0,05.

Важно отметить, что стимулирующая активность антиоксидантов почти не зависела от степени их гидрофобности - среди всех исследуемых соединений, одинаковая активация достигалась при использовании, например, водорастворимого убихинона Qi и жирорастворимого а-токоферола. Кроме того, не было выявлено существенного различия эффектов убихшюнов с короткими (Qi, Q2) и с длинными (Qc>, Qio) боковыми цепями. По этой причине в диету был включен эндогенный для мышей убихинон Qg.

Влияние антиоксидантов на продукцию цитокинов и белка теплового шока 72 в

клетках

На Рис. 6 показаны результаты измерения цитокинов в плазме крови мышей в условиях острого воспаления, а также у животных, получавших предварительную диету с антиоксидаптами. Было установлено, что введение эндотоксина вызывает ожидаемое увеличение в плазме концентрации всех исследуемых провоспалительных цитокинов, таких, как ИЛ-1а, ИЛ-ip, ИЛ-2, ИЛ-6, ФИО, ИФН-у, а также анти-воспалительного цитокина ИЛ-10. Предварительная диета с антиоксидантами до введения ЛПС животным практически полностью нормализует концентрацию провоспалительных цитокинов в плазме крови. Напротив, концентрация ИЛ-10 остается значительно выше контрольного уровня.

Рис. 6. Влияние диеты с антиоксидантами на концентрацию цитокинов в плазме крови. *- Достоверное отличие от контроля, Р< 0,05.

О Контроль: ■ Дпета ; Е2 .ШС: в Диета+ЛПС

Рис. 7. Влияние диеты с антиоксидантами на продукцию цитокинов перитонеальньши макрофагами (ФНО-а, ИЛ-10) и лимфоцитами селезенки (ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН-у). *- Достоверное отличие от контроля, Р< 0,05.

Интересно, что сама диета с антиоксидантами не влияет на продукцию цитокинов

перитонеальными макрофагами и лимфоцитами селезенки (Рис.7). Напротив, введение ЛПС

значительно увеличивает продукцию всех про - и анти-воепалительных цитокинов,

особенно заметно это было для ФНО^у, ИЛ-6 и ИЛ-10. При этом продукция почти всех

цитокинов, за исключением анти- воспалительного ИЛ-10, не индуцировалась в

присутствии ЛПС в том случае, когда животные предварительно получали диету с антиоксид антами.

Для того чтобы оценить влияние диеты на защитную систему клеток в процессе воспаления, в лимфоцитах селезенки была измерена продукция БТШ72, индуцибельной формы белка семейства БТШ70.

..¡Ш»'.И1|*>| «ИЦрм*. Ч»»«»'' -"•»•л I*««»1» БТШ72

12 3-1

Рис. 8. Влияние диеты на продукцию БТШ72 в лимфоцитах селезенки мышей.

1- контроль; 2- диета с антиоксидантами; 3- инъекция физ.раствором; 4- инъекция ЛПС; 5- диета+ЛПС. Крайняя правая полоса - рекомбинантный БТШ72. Здесь и далее порядок расположения пятен соответствует порядку колонок гистограммы, показывающей содержание белков в относительных единицах, вычисленного после денситометрии мембран из 5-ти независимых экспериментов с помощью компьютерной программы (2АРА. Рекомбинантный БТШ72 не денситометрировался.

*- Достоверное отличие от контроля, р< 0,05.

Результаты, представленные на Рис. 8, показывают, что острое воспаление увеличивает продукцию БТШ72 в лимфоцитах селезенки, а предварительная диета с антиоксидантами предотвращает рост продукции этого белка в лимфоцитах, выделенных у животных, которым вводили ЛПС.

Влияние антиоксидантов на уровень активации сигнальных каскадов МК-кВ и ЗАРМНК в условиях острого воспаления

Для того чтобы выяснить возможные механизмы защитного эффекта антиоксидантов, оценивалась активность двух сигнальных каскадов, ЫИ-кВ и 5АРК/ЖК, путем измерения уровня фосфоршшрования белков этих сигнальных путей. На Рис. 9 показано фосфорилирование №-кВ в лимфоцитах животных из разных экспериментальных групп.

Рис. 9. Уровень фосфорилирования NF-кВ в лимфоцитах.

^Достоверное отличие от контроля, Р<0,05.

Установлено, что введение ЛПС приводило к достоверному увеличению фосфорилирования NF-кВ, а диета с антиоксидантами предотвращала активацию фосфорилирования NF-кВ в клетках у мышей, которым вводили ЛПС.

Оценка другой независимой стадии активации NF-кВ через 1кВ киназу (IKK), которая обеспечивает фосфорилирование ингибиторных молекул, включая 1кВа/р, свидетельствует о том, что и второй, классический путь активации каскада NF-кВ и, соответственно, возможность транслокации фосфорилированной формы NF-кВ в ядро через активацию киназы IKK условиях острого токсического стресса, вызванного ЛПС, в значительной степени нормализуется путем предварительной диеты, насыщенной антиоксидантами (Рис.10).

Было установлено, что диета практически не влияла на уровень фосфорилирования SAPK/JNK в клетках здоровых мышей, но достоверно снижала этот показатель в условиях острого воспаления, индуцированного эндотоксином. Таким образом, влияние диеты на активность каскада SAPK/JNK было аналогично тому, что наблюдали в отношении транскрипционного фактора NF-кВ (Рис. 9, 10). Действительно, фосфорилирование киназы SAPK/JNK значительно увеличивалось после введения ЛПС, а предварительная нагрузка антиоксидантами предотвращала чрезмерный уровень фосфорилирования SAPK/JNK.

Таким образом, показано, что диета, обогащенная липораетворимыми антиоксидантами, предотвращает чрезмерную активацию исследуемых сигнальных каскадов NF-kB и SAPK/JNK при остром воспалении.

. ■' §»» -тЛШ рЬ-ГККа/р

титтт -ШШт ■ щ»1' ¡тшт tubulin

I ш

Котроль .ШС Диета Днета+ЛПС

Рис. 10. Влияние диеты, обогащенной антиоксидантами, на фосфорилирование 1ККа//1 в лимфоцитах.

* Достоверное отличие от контроля, Р<0,05.

Поскольку сигнальный каскад №-кВ регуляторно связан с другим каскадом сигнализации ЗАРКЛЫК, оценивали активность последнего путем измерения уровня фосфорилирования стресс-активируемой протеин киназы БАРК/ЛЧК. На Рис. 11 представлены результаты влияния предварительной диеты с антиоксидантами на уровень фосфорилирования вАРК/ТЖ в лимфоцитах селезенки здоровых мышей, а также животных с острым воспалением. Кроме того, диета значительно снижает продукцию индуцибельного белка теплового шока БТ1Л72, а также нормализует продукцию провоспалительных цитокинов в макрофагах и лимфоцитах мышей с острым воспалением.

SAPK/JNK

"» ' " ■ tubulin

I III

Коктроль ЛПС Диета Дкетя+ЛПС

Рис. 11. Влияние диеты с антиоксидантами на продукцию белка PhosphoSAPK/JNK в клетках здоровых мышей, а также при остром воспалении.

•Достоверное отличие от контроля, Р<0.05.

Исследование влияния гелданамицина in vitro и in vivo на уровень про-воспалительного ответа, индуцированного эндотоксином

Влияние гелданамицина на продукцию сигнальных белков и белков теплового шока в изолированных лимфоцитах мышей

Было исследовано влияние гелданамицина (ГА), который является ингибитором

активности БТШ90, на продукцию ключевых белков каскада сигаальной трансдукции, таких как NF-kB, PhNF-кВ, 1кВа, a также стресс-активируемой протеин киназы SAPK/JNK.

На Рис. 12 приведены результаты измерения фактора транскрипции NF-kB и его субъединиц в изолированных лимфоцитах мыши в присутствии гелданамицина. Использование иммуноблотинга с антителами к NF-kB показало, что после добавления к клеткам гелданамицина уровень NF-kB значительно снижается по сравнению с контролем. Обнаружено, что количество белка phNF-кВ, который является фосфорилированной формой NF-kB, также значительно снижается при добавлении гелданамицина к лимфоцитам in vitro. Уменьшение количества белка, способного индуцировать экспрессию генов, вызывающих повреждение и/или гибель клеток, указывает на антиапоптозную активность гелданамицина. Добавление этого антибиотика к клеткам приводит к резкому уменьшению количества рЫкВ-ц в лимфоцитах селезенки мыши, как это было показано для целого комплекса NF-kB и для его активированной формы, phNF-кВ. Отсоединяясь от phNF-кВ, белок 1кВ-а разрушается в протеосомах при участии IKK киназы, что способствует быстрому

12 12

ш - NF~kB р65 ш: 1кВ-а

Jj_-- -

•к» ** тубулин ' тубулин

1 2

; ■ : ~ V

Рис. 12. Влияние гепданамицина in vitro на количество белков NF-kB, phNF-кВ, рЫкВ-а и phSAPK/JNK в лимфоцитах селезенки мышей.

Для каждого бежа: 1 - контроль, 2 - лимфоциты, культивированные в присутствии 1 мкг/мл гедцанамицина. Контроль загрузки белков (loading control) - на нижних панелях.

перемещению phNF-кВ в ядро, вызывая транскрипцию определенных генов в ответ на повреждающие сигналы. На рис. 12 показано, что добавление гелданамицина к лимфоцитам in vitro резко снижает фосфорилирование SAPK/JNK. в клетках. Эти результаты согласуются с данными, обнаруженными на раковых клетках линии L929 (Berghe et al., 2003).

Таким образом, в настоящей работе показано ингибирующее воздействие гелданамицина на продукцию белков двух сигнальных каскадов, NF-kB и SAPK/JNK, в нормальных лимфоцитах мыши, что служит доказательством того, что гелданамицин подавляет активность мультимерного протеосошшго комплекса.

В следующей серии экспериментов было исследовано влияние гелданамицина на продукцию белков теплового шока из разных семейств - БТШ70, БТШ25 и БТШ90 - в нормальных условиях. При этом измеряли количество этих белков в целых клетках и в отдельных внутриклеточных структурах лимфоцитов. В этих экспериментах показано, что добавление гелданамицина к изолированным лимфоцитам мышей не вызывало значительных изменений экспрессии белков теплового шока БТЩ90, БТШ70, БТШ25, но приводило к изменению их распределения во внутриклеточных структурах (Рис. 13-15).

1 2

phoshpoNF-кВ р65 щ ¿a SAPK/JNK тубулин я**"* тубулин

контроль ГА

целые клетки мембрана

контроль ГА контроль ГА

.........„„.Ьажййа цитоплазма цитоскелет

Рис. 13. Продукция БТШ72 в лимфоцитах селезенки мышей. Все панели -иммуноблотинг белков различных субфракций клеток лимфоцитов селезенки против антител к БТШ72. БТШ25

контроль ГА

целые клетки м ем бра в а

контроль ГА . .козпрша ГА

...д,.^»——, цитоплазма ......;. цитоскелет

Рис. 14. Продукция БТШ25 в лимфоцитах селезенки мышей. Все панели -иммуноблотинг белков различных субфракций клеток лимфоцитов селезепки против антител к БТШ25.

контроль ГА БТШ90

Рис. 15. Продукция БТШ90 в лимфоцитах селезенки мышей.

Таким образом, в работе впервые показало, что в нормальных лимфоцитах мышей, культивируемых в присутствии гелданамицина, происходит значительное уменьшение количества NF-кВ, его фосфорнлированной формы pNF-кВ и белка, подавляющего его активность, 1кВ-а. Кроме того, присутствие гелданамицина в среде культивирования клеток вызывало заметное снижение фосфорилирования протеинкиназы SAPK/JNK. Это указывает на возможность использования гелданамицина и его нетоксичных производных при терапии ряда заболеваний, сопряженных с высоким уровнем апоптоза в клеточных системах, в этом случае мишенью гелданамицина могут служить короткоживущие регуляторные белки протеосомного каскада.

Влияние гелданамицина in vivo на продукцию цитокинов и сигнальных белков в условиях острого воспаления, индуцированного ЛПС

При введении гелданамицина животным эффекты этого антибиотика оценивали по уровню провоспалителыюго ответа, индуцированного эндотоксином. Было установлено, что введение гелданамицина мало влияет на цитокиновый профиль в крови здоровых животных. Однако при использовании инъекций с гелданамицином перед введением животным ЛПС этот препарат препятствует развитию провоспалительного ответа на токсин, снижая уровень ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-10, ИФН^у до контрольного уровня или даже ниже контроля (Рис. 16). Такой же эффект гелданамицин оказывал на продукцию оксида азота в макрофагах, при этом его ингибирующее действие на активность макрофагов проявлялось и при его введении здоровым животным. Следует отметить, что для концентрации ИЛ-6 в крови не было обнаружено такого значительного нормализующего влияния гелданамицина, как в отношении других исследованных цитокинов и N0. Тем не менее, концентрация ИЛ-6 в крови была достоверно снижена, хотя и не в такой степени, как для других цитокинов. В экспериментах in vivo была оценена также активность каскадов NF-кВ и SAPK/JNK в условиях острого воспаления (Рис. 17, 18). Важно отметить, что в этом случае эффекты гелданамицина на экспрессию сигнальных белков были подобны тем, что мы наблюдали при добавлении препарата к изолированным клеткам in vitro (Рис. 12). Особенно ярко ингибирующий эффект гелданамицина проявлялся в отношении киназы 1ККа/р, которая фосфорилирует ингибиторные белки 1кВа и 1кВР, способствуя переносу NF-кВ в ядро. Таким образом, активации каскада NF-кВ по классическому пути и, соответственно, возможность транслокации фосфорнлированной формы NF-кВ в ядро через активацию киназы IKK в условиях острого токсического стресса, вызванного ЛПС, в значительной степени предотвращается при введении гелданамицина. (Рис. 17). Кроме того, превентивное применение антибиотика предотвращает чрезмерную активацию каскада SAPK/JNK, что

о ЛПС ■ га В дпс+га

Рис. 16. Влияние гелданамицина in vivo на концентрацию цитокинов в плазме крови и на продукцию N0 в макрофагах. *- Достоверное отличие от контроля, Р< 0,05. ** -Достоверное отличие от группы ЛПС.

контроль ЛПС ГА ГА+ЛПС

а**»**»«** ЧНШ •» * Xkkp/a

99 1 60 61 30

Рис. 17. Влияние гелданамицина на фосфорипирование 1кВ-а в лимфоцитах. Цифры здесь и на Рис. 18 - количество белков в относит, единицах.

SAP К/ JNK

706 964 1393 747

Рис. 18. Влияние гелданамицина на фосфорипирование SAPK/JNK в лимфоцитах.

доказывает снижение уровня фосфорилирования этой протеинкиназы (Рис.18). Интересно, что такой эффект наблюдали только на фоне введения животным ЛПС, при этом у здоровых мышей введение гелданамицина активировало фосфорилирование SAPR/Л^К. Таким образом, установлено, что гелданамиции проявляет противовоспалительную активность в

----- ЛПС ГА ГА+ЛПС

условиях острого токсического стресса, индуцированного У животных введением эндотоксина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа направлена на выяснение новых закономерностей молекулярно-клеточного стресса при остром и хроническом воспалениях, индуцированных липополисахаридом из грамотрицательных бактерий Escherichia coli. Создание адекватной модели сепсиса представляет собой большую проблему. Действительно, при пролонгированном применении эндотоксина с повторяемым введением одной и той же дозы ЛПС в организме достаточно быстро формируется устойчивая толерантность к токсину. Учитывая это обстоятельство, была использована схема введения увеличивающейся дозы ЛПС — такая модель имитирует реальную ситуацию, когда в организме бактерии прогрессивно размножаются и секретируют возрастающие концентрации токсина. При моделировании хронической формы воспаления ЛПС вводили ежедневно в течение 11 дпей, при этом дозу токсина постепенно увеличивали в пределах от 25 до 250 мг/100 г веса тела. Было установлено, что при такой хронической интоксикации примерно 40% животных в течение месяца погибали, что было близко к показателю летальности у пациентов с сепсисом. С учетом того, что ЛПС из грамотрицательных бактерий индуцирует особенно тяжелую форму сепсиса, который обычпо сопровождается высокой степенью иммунодефицита, исследовали ключевые звенья клеточного иммунитета, обратив особое внимание на функционирование защитных систем клетки.

Была исследована динамика изменения продукции цитокинов, белков теплового шока и оксида азота при хроническом воспалении, а также уровень провоспалительного ответа при остром процессе и было установлено, что и острое, и хроническое воспаления вызывают дисбаланс иммунной системы животных: наблюдали значительную активацию продукции фактора некроза опухолей (ФНО-а и ФНО-ß), оксида азота и белков теплового шока (БТШ70 и БТШ90-а). Сравнительно более заметные изменения продукции защитных молекул были отмечены при остром токсическом стрессе; напротив, при хронической интоксикации способность клеток отвечать на стресс высоким уровнем продукции белков теплового шока, ФНО и N0 постепенно снижалась. Эти результаты не подтвердили широко распространенное представление о том, что повышение уровня цитокинов в тканях является основной причиной полиорганной недостаточности при септическом процессе. Напротив, обнаруженные закономерности свидетельствовали о том, что хроническое воспаление характеризуется ослаблением защитного потенциала клеток иммунной системы, которое выражалось в постепенном спижении способности клеток продуцировать белки теплового шока, оксид азота и цитокины.

С использованием модели острого воспаления были исследованы способы защиты животных, направленные на снижение уровня токсического стресса, индуцированного ЛПС. Доказано, что превентивное использование диеты, обогащенной липорастворимыми антиоксидантами, обладающими витаминной активностью, заметно снижало пики продукции цитокшгов, оксида азота и белка теплового шока БТШ72 при воспалении. Установлено, что основой молекулярно-клеточиого механизма противовоспалительного эффекта антиоксидантов является их способность предотвращать чрезмерную активацию двух исследованных каскадов системы сигнальной транедукции клетки, NF-kB и SAPK/JNK, при остром воспалении, индуцированном эндотоксином. Кроме того, показали, что предварительное введение гелданамицина, нового антибиотика, обладающего анти-опухолсвой активностью, и, главное, способного связываться с БТШ90, подавляя его активность, также снижает уровень ответа на острый токсический стресс. Эксперименты in vitro и in vivo позволили объяснить некоторые молекулярные механизмы реализации противовоспалительной активности гедданамицина. Было доказано, что этот антибиотик способен предотвращать активацию сигнального каскада NF-kB, а также активацию стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK в условиях острого воспаления.

Таким образом, в работе получены новые данные об участии стрессовых и сигнальных белков в регуляции провоспалительного ответа у мышей и доказано, что превентивные меры, способствующие предотвращению чрезмерной активации системы сигнальной транедукции клетки, могут служить профилактикой развития тяжелых септических состояний. В перспективе будущие исследования механизмов, контролирующих сигнальные каскады, помогут выявить новые мишени для предотвращения их чрезмерной активации при системном воспалительном синдроме и сепсисе у человека.

ВЫВОДЫ

1. Острое воспаление индуцирует более значительную активацию продукции цитоюшов (ФНО-а, ФНО-р, ИФН^), белков теплового шока (БТШ72 и БТШ90) и оксида азота, чем хроническое, при котором способность продуцировать эти биоактивные молекулы в макрофагах и лимфоцитах, постепенно снижается.

2. Установлено, что предварительная диета, обогащенная аптиоксидантами (убихинон Q9, (3-каротин и а-токоферол), уменьшает уровень ответа на воспаление, снижая продукцию провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-ip, Ш1-2, ИЛ-6, ИФН-у), белка теплового шока БТШ72 и оксида азота.

3. Показано, что один из возможных механизмов противовоспалительного эффекта антиоксидантов связан с их способностью предотвращать чрезмерную активацию, по крайней мере, двух каскадов системы сигнальной транедукции клетки, NF-kB и SAPK/JNK, при остром воспалении.

4. Установлено, что культивирование лимфоцитов с ингибитором активности БТШ90 гелданамицином подавляет продукцию сигнальных белков каскада NF-кВ и SAPK/JNK, а также изменяет локализацию белков теплового шока БТШ70 и БТШ25 во внутриклеточных структурах лимфоидных клеток.

5. Установлено, что превентивпое применение гелдапамиципа in vivo уменьшает чувствительность животных к эндотоксину, снижая продукцию провоспалительных цитокинов (ФНО-а, Ш1-1а, ИЛ-6, ИЛ-б, ИФ11-у), белка теплового шока БТШ72 и оксида азота в клетках. Механизм анти-воспалителыюго действия гелдапамиципа связан с его ингибирующим влиянием на активность каскадов системы сигнальной трансдукции NF-kB и SAPK/JNK.

Публикации по теме диссертации

Статьи:

1. Х.В. Новоселова, Д.А. Черенков, М.О. Хренов, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, Е.Г. Новоселова, Е.Е. Фесенко. Влияние гелданамиципа ца экспрессию сигнальных белков и белков теплового шока в нормальных лимфоцитах мьппей. Цитология. 2008. Т.50. №7. С.629-635.

2. Новоселова Е.Г., Глушкова О.С., Черенков Д.А., Парфенюк С.Б., Новоселова Т.В., Лунин С.М., Хренов М.О., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Фесенко Е.Е. Продукция белков теплового шока, цитокинов и оксида азота при токсическом стрессе. Биохимия. 2006. вып. 4. С. 471-480.

3. Novoselova E.G., Lunin S.M., Novoselova T.V., Khrenov M.O., Glushkova O.V., Avkhacheva N.V., Safronova. V.G., Fesenko E.E. Naturally occurring antioxidant nutrients reduce inflammatory response in mice. European Journal of Pharmacology. 2009. V. 615. p. 234-240.

4. Е.Г. Новоселова, M.O. Хренов, Д.А. Черенков, O.B. Глушкова, T.B. Новоселова, С.М. Лунин, Е.А. Лысенко, Е.Е. Фесенко. Участие рецептора TLR4 в формировании стрессового ответа лимфоцитов. Биофизика, 2008, Т. 53, № 3, С. 457-461.

Тезисы докладов на конференциях:

5. Новоселова Т.В., Лунин С.М., Хренов М.О., Глушкова О.В., Черенков Д А., Парфенюк С.Б. Исследование продукции цитокинов, оксида азота при токсическом стрессе // 10-я Путинская школа-конференция молодых ученых. Сб. трудов, 2006. - С.116.

6. Хренов М.О., Глушкова О.В., Черенков Д.А., Новоселова Т.В., Лунин С.М. Защитная роль антиоксидантов при окислительном эндотоксическом стрессе //Окисление, окислительный стресс, и антиоксиданты: Всероссийская конференция молодых ученых и П школа им. академика Н.М. Эммануэля. Доклады и тезисы. - М.: Изд-во РУДН. - 2006. - С. 201-202.

7. Новоселова Т.В., Глушкова О.В., Лунин С.М., Хренов М.О., Черенков Д.А., Новоселова Е.Г. Роль цитокинов и оксида азота в развитии стресса, индуцированного эндотоксином // Окисление, окислительный стресс, и антиоксиданты: Всероссийская конференция молодых ученых и II школа им. академика Н.М. Эммануэля. Доклады и тезисы. - М.: Изд-во РУДН. -2006.-С. 182- 184.

8. NovoseJova T.V., Khrenov М.О., Lunin S.M., Cherenkov D.A., Glushkova O.V., Novoselova E.G. Comparative study of immune cell functions in acute and chronic models of toxic stress // VIII World congress INTERNATIONAL SOCIETY FOR ADAPTIVE MEDICINE.- MOSCOW, 2006.-P. 121.

9. Новоселова Е.Г., Глушкова O.B., Черенков Д.А, Новоселова Т.В., Лунин С.М., Хренов М.О. Окислительный стресс при острых и хронических воспалениях; снижение токсического повреждения путем антиоксидантной защиты // Нейронаука для медицины и психологии. 2-й Международный междисциплинарный конгресс. Труды конгресса. - Судак: МАКС Пресс.-2006.-С. 136-137.

10. Novoselova T.V., Cherenkov D.A., Khrenov М.О., Novoselova E.G. The role of heat shock proteins, cytokines, and nitric oxide in animal models of inflammation and sepsis induced by microbial toxin // 8th JOHN HUMPHREY ADVANCED SUMMER PROGRAMME IN IMMUNOLOGY - MOSCOW, 2007. - P. 42.

11. Новоселова T.B., Черенков Д.А., Хренов M.O., Глушкова О.В., Лунин-С.М., Фесенко Е.Е., Новоселова Е.Г. Экспрессия белков теплового шока и сигнальных белков в лимфоцитах мышей при действии гелданамицина //11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сб. трудов, 2007. - С.153.

12. Новоселова Т.В. Механизмы развития острых и хронических воспалений, индуцированных бактериальным токсином. //12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сб. трудов, 2008. - С.97.

Подписано в печать:

09.10.2009

Заказ № 2668 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Новоселова, Татьяна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Актуальность исследования синдрома системного воспалительного ответа и сепсиса как общемедицинской проблемы.

1.1.1. Эволюция представлений о природе сепсиса.

1.1.2. Грамотрицательный сепсис и механизмы его развития.

1.2. Медиаторы провоспалительного ответа.

1.2.1. Цитокины.

1.2.1.1. Интерлейкин - 1 (ИЛ-1).

1.2.1.2. Интерлейкин - 6 (ИЛ-6).

1.2.1.3. Интерлейкин-10 (ИЛ-10).

1.2.1.4. Фактор некроза опухолей (ФНО).

1.2.1.5. Интерлейкин - 2 (ИЛ-2).

1.2.1.6. Интерферон -у (ИФН- у).

1.2.2. Активные формы кислорода.

1.2.3. Роль оксида азота при воспалении.

1.3. Защитные системы клетки в норме и при воспалении.

1.3.1. Белки теплового шока.

1.3.1.1. БТШ70.

1.3.1.2. БТШ90.

1.3.1.3. Малые белки теплового шока.

1.3.2. Сигнальный каскад ЫР-кВ.

1.3.3. Сигнальный каскад ЭАРКУЖК.

1.3.4. Гелданамицин как ингибитор активности БТШ90.

1.3.5. Антиоксиданты и их роль в защите клетки от окислительного стресса.

1.3.5.1. Витамин Е (а-токоферол).

1.3.5.2. р-каротин.

1.3.5.3. Коэнзим Q (убихинон).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные и модели токсического стресса.

2.2. Применение гелданамицина in vitro и in vivo.

2.3. Диета с антиоксидантами.

2.4. Культура клеток и измерение их функциональной активности.

2.4.1. Выделение лимфоцитов.

2.4.2. Выделение макрофагов.

2.4.3. Измерение продукции ФНО.

2.4.4. Измерение продукции интерлейкинов и интерферона-у.

2.4.5. Измерение оксида азота.

2.4.6. Вестерн блот анализ.

2.4.7. Выделение сыворотки.

2.4.8. Пролиферативный тест.

2.5. Измерение продукции АФК методом хемилюминесцентности.

2.5.1. Подготовка опсонированного зимозана (ОЗ).

2.5.2. Измерение хемилюминесценции в образцах изолированных клеток.

2.6. Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Продукция белков теплового шока, цитокинов и оксида азота при воспалении.

3.1.1. Цитокины и оксид азота при воспалениях.

3.1.1.1. Цитокины и оксид азота при остром воспалении.

3.1.1.2. Цитокины и оксид азота при хроническом воспалении.

3.1.1.3. Цитокины в плазме крови при остром воспалении.

3.1.2. Исследование белков теплового шока при остром и хроническом воспалении.

3.2. Исследование влияния гелданамицина in vitro и in vivo на уровень провоспалительного ответа, индуцированного эндотоксином.

3.2.1. Измерение цитотоксичности гелданамицина.

3.2.2. Влияние гелданамицина на продукцию сигнальных белков в изолированных лимфоцитах мышей.

3.2.3. Влияние гелданамицина на продукцию белков теплового шока в изолированных лимфоцитах мышей.

3.2.4. Влияние введения гелданамицина in vivo на продукцию цитокинов и сигнальных белков в условиях острого воспаления, индуцированного ЛПС.

3.3. Снижение уровня провоспалительных ответов у мышей с использованием диеты с антиоксидантами.

3.3.1. Липорастворимые антиоксиданты как пищевые добавки.

3.3.2. Влияние антиоксидантов, добавленных к изолированным клеткам in vitro.

3.3.3. Эффекты антиоксидантов при остром воспалении.

3.3.3.1. Цитокины в плазме крови.

3.3.3.2. Продукция белка теплового шока БТШ70.

3.3.3.3. Фосфорилирование сигнальных белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль белков теплового шока и сигнальных белков в регуляции провоспалительного ответа у мышей"

Воспалительные хронические патологии и сепсис, как их наиболее тяжелое последствие, являются одними из наиболее частых причин смертности и относятся к социально-значимым заболеваниям. Обычно септические состояния возникают как постоперационные или посттравматические последствия, в основе этих заболеваний лежат расстройства функционирования иммунитета, гибель клеток и повреждение тканей.

Известны некоторые молекулярно-клеточные механизмы, связанные с каскадом реакций, инициированных токсинами из грамотрицательных и грамположительных бактерий, которые представляют собой систему врожденной антимикробной резистентности организма млекопитающих. Особенно тяжелые формы сепсиса индуцируются токсинами грамотрицательных бактерий, даже при использовании современных достижений интенсивной терапии среди пациентов с диагностированным сепсисом летальность достигает 30-60% для разных видов сепсиса.

Большинство исследований по выявлению механизмов взаимодействия бактериальных токсинов с клетками выполнены с использованием трансформированных клеток, у которых чувствительность к патогенам значительно отличается от той, что свойственна нормальным животным клеткам. Кроме того, основной пул работ, посвященный этим проблемам, выполнен с использованием клеточных моделей in vitro. С учетом этих обстоятельств представляется целесообразным исследование новых закономерностей возникновения и развития септических состояний с использованием более адекватных животных моделей, которые максимально точно воспроизводят реальную картину сепсиса.

Принимая во внимание то обстоятельство, что наличие иммунной недостаточности является одним из главных условий развития сепсиса, необходимо исследовать ключевые процессы и мессенджеры иммунного ответа клеток, а также провести поиск подходов для снижения риска возникновения тяжелых последствий септического процесса.

В этом плане представляется актуальным исследование закономерностей функционирования защитных систем клетки, таких как цитокиновая сеть (продукция про - и анти-воспалительных цитокинов), уровень экспрессии белков теплового шока, а также их локализацию во внутриклеточных структурах, продукцию оксида азота и оценить уровень активации каскадов сигнальной трансдукции ЫБ-кВ и БАРК/ЖК в условиях острого и хронического воспалений.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Новоселова, Татьяна Владимировна

выводы

1. Острое воспаление индуцирует более значительную активацию продукции цитокинов (ФНО-а, ФНО-р, ИФН-у), белков теплового шока (БТШ72 и БТШ90) и оксида азота, чем хроническое, при котором способность продуцировать эти биоактивные молекулы в макрофагах и лимфоцитах, постепенно снижается.

2.Установлено, что предварительная диета, обогащенная антиоксидантами (убихинон Qs>, p-каротин и а-токоферол), уменьшает уровень ответа на воспаление, снижая продукцию провоспалительных цитокинов (ФНО-а, HJI-1а, ИЛ-ip, ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН-у), белка теплового шока БТШ72 и оксида азота.

3.Показано, что один из возможных механизмов противовоспалительного эффекта антиоксидантов связан с их способностью предотвращать чрезмерную активацию, по крайней мере, двух каскадов системы сигнальной трансдукции клетки, NF-кВ и SAPK/JNK, при остром воспалении.

4.Установлено, что культивирование лимфоцитов с ингибитором активности БТШ90 гелданамицином подавляет продукцию сигнальных белков каскада NF-кВ и SAPK/JNK, а также изменяет локализацию белков теплового шока БТШ70 и БТШ25 во внутриклеточных структурах лимфоидных клеток.

5.Установлено, что превентивное применение гелданамицина in vivo уменьшает чувствительность животных к эндотоксину, снижая продукцию провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-6, ИФН-у), белка теплового шока БТШ72 и оксида азота в клетках. Механизм антивоспалительного действия гелданамицина связан с его ингибирующим влиянием на активность каскадов системы сигнальной трансдукции NF-кВ и SAPK/JNK.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа направлена на выяснение новых закономерностей молекулярно-клеточного стресса при остром и хроническом воспалениях, индуцированных липополисахаридом из грамотрицательных бактерий Escherichia coli. Создание адекватной модели сепсиса представляет собой большую проблему. Действительно, при пролонгированном применении эндотоксина с повторяемым введением одной и той же дозы ЛПС в организме достаточно быстро формируется устойчивая толерантность к токсину. Учитывая это обстоятельство, была использована схема введения увеличивающейся дозы ЛПС — такая модель имитирует реальную ситуацию, когда в организме бактерии прогрессивно размножаются и секретируют возрастающие концентрации токсина. При моделировании хронической формы воспаления ЛПС вводили ежедневно в течение 11 дней, при этом дозу токсина постепенно увеличивали в пределах от 25 до 250 мг/100 г веса тела. Было установлено, что при такой хронической интоксикации примерно 40% животных в течение месяца погибали, что было близко к показателю летальности у пациентов с сепсисом. С учетом того, что ЛПС из грамотрицательных бактерий индуцирует особенно тяжелую форму сепсиса, который обычно сопровождается высокой степенью иммунодефицита, исследовали ключевые звенья клеточного иммунитета, обратив особое внимание на функционирование защитных систем клетки.

Была исследована динамика изменения продукции цитокинов, белков теплового шока и оксида азота при хроническом воспалении, а также уровень провоспалительного ответа при остром процессе и было установлено, что и острое, и хроническое воспаления вызывают дисбаланс иммунной системы животных: наблюдали значительную активацию продукции фактора некроза опухолей (ФНО-ос и ФНО-ß), оксида азота и белков теплового шока (БТШ70 и БТШ90-а). Сравнительно более заметные изменения продукции защитных молекул были отмечены при остром токсическом стрессе; напротив, при хронической интоксикации способность клеток отвечать на стресс высоким уровнем продукции белков теплового шока, ФНО и NO постепенно снижалась. Эти результаты не подтвердили широко распространенное представление о том, что повышение уровня цитокинов в тканях является основной причиной полиорганной недостаточности при септическом процессе. Напротив, обнаруженные закономерности свидетельствовали о том, что хроническое воспаление характеризуется ослаблением защитного потенциала клеток иммунной системы, которое выражалось в постепенном снижении способности клеток продуцировать белки теплового шока, оксид азота и цитокины.

С использованием модели острого воспаления были исследованы способы защиты животных, направленные на снижение уровня токсического стресса, индуцированного ЛПС. Доказано, что превентивное использование диеты, обогащенной липорастворимыми антиоксидантами, обладающими витаминной активностью, заметно снижало пики продукции цитокинов, оксида азота и белка теплового шока БТШ72 при воспалении. Установлено, что основой молекулярно-клеточного механизма противовоспалительного эффекта антиоксидантов является их способность предотвращать чрезмерную активацию двух исследованных каскадов системы сигнальной трансдукции клетки, NF-kB и SAPK/JNK, при остром воспалении, индуцированном эндотоксином. Кроме того, показали, что предварительное введение гелданамицина, нового антибиотика, обладающего антиопухолевой активностью, и, главное, способного связываться с БТШ90, подавляя его активность, также снижает уровень ответа на острый токсический стресс. Эксперименты in vitro и in vivo позволили объяснить некоторые молекулярные механизмы реализации противовоспалительной активности гелданамицина. Было доказано, что этот антибиотик способен предотвращать активацию сигнального каскада NF-kB, а также активацию стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK в условиях острого воспаления.

Таким образом, в работе получены новые данные об участии стрессовых и сигнальных белков в регуляции провоспалительного ответа у мышей и доказано, что превентивные меры, способствующие предотвращению чрезмерной активации системы сигнальной трансдукции клетки, могут служить профилактикой развития тяжелых септических состояний. В перспективе будущие исследования механизмов, контролирующих сигнальные каскады, помогут выявить новые мишени для предотвращения их чрезмерной активации при системном воспалительном синдроме и сепсисе у человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новоселова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Л.:Наука, 1985.

2. Барабой В.А., Брехман И.И., Голоткин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. Наука, 1992. С.148.

3. Бобырева Л.Е. Антиоксиданты в комплексной терапии диабетических ангиопатий. Эксперим. и клин. Фармакология. 1998. Т.61, № 1.С.74-80.

4. Винк Д.А., И. Водовоз, Дж. А. Кук, М.С. Кришна, С.Ким, Д. Коффин, В. ДеГрафф, А.М, Делюка, Дж. Либман, Дж. Б. Митчелл. Значение химических свойст оксида азота для лечения онкологических заболеваний. Биохимия, 1998, том. 63, вып. 7, с. 948-957.

5. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. Сорос, образоват. журн. 2000. №12.С.13-19.

6. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных. 1989. Итоги науки и техники. М: ВИНИТИ, т. 24, с. 176.

7. Воскресенский О.Н., Жутаев И.А., Бобырев В.Н., Безуглый Ю.В. Антиоксидантая система, онтогенез и старение. Вопр. мед. химии. — 1982. №5, С.479-481.

8. Горрен А.К., Майер Б. Универсальная и комплнксная энзимология синтазы оксида азота. Биохимия, 1998, том 63, вып.7, с.870-880.

9. Гриневич В.В., Поскребышева У.Ф., Савелов H.A. и др. 1999. Усп. физиол. наук, 30, 50-66.

10. Ю.Губский Ю.И., Левицкий У.Л., Примак Р.Г. Влияние витамина Е на структурно-функциональную организацию хроматина печени в условиях повреждения тетрахлорметаном. Биополимеры и клетка. 1993. №3. С. 27-34.

11. П.Гужова И.В. 2004. Механизмы работы шаперона Hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии. Дисс. докт. биол. наук, Институт цитологии РАН, С.-Петербург.

12. Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия. Эксперим. клин.фармакол. 2003 .Т.66, №4. С. 66-70.

13. Иванов И.И., Мерзляк М.Н., Тарусов Б.Н. Витамин Е, биологическая роль в связи с антиоксидантыми свойствами. Биоантиокислители. М.:Наука, 1975. С.30-52.

14. Н.Касаинкина О.Т., Картпшева З.С., Лобанова Т.В., Сирота Т.В. Влияние окружения на реакционную способность ß-каротина по отношению к кислороду и свободным радикалам. Биол.мембраны, 1998, 15 (2): 168175.

15. Козлов В.К. Сепсис: этиология, иммунопатогез, концепция современной иммунотерапии. Диалект. Санкт-Петербург. 2006. С. 7778.

16. Кольман Я., Рем К.- Г. Наглядная биохимия. М.:Мир, 2000. 469 с.

17. Панкин В.З., Капелько В .И., Руге Э.К., Тихазе А.К.ДО.Н. Беленков. Коэнзим Q: Физиологическая функция и перспективы использования в комплексной терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы. Пособие для врачей, Москва, 2008.

18. Панкин В.З., Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Козаченко А.И. Концентрационная инверсия антиоксидантного и прооксидантного действия ß-каротина в тканях in vivo. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1999, 128(9):314-316.

19. Лозовская Е.Р., Левин A.B., Евгеньев М.Б. Тепловой шок у дрозофилы и регуляция активности генома. Генетика. 1982. Т. 18, № 2. С. 17491762.

20. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Кругловых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксид анты. Москва, 2006.

21. Негреску Е.В., Лебедев A.B., Балденков Г.Н. Антиоксиданты, перекисное окисление липидов и рецепторзависимое увеличение концентрации Саг+ в тромбоцитах человека. Вопр. Мед. химии. 1992. №1, с.36-39.

22. Ресненко А.Б., Абрамова H.A., Мишарин A.B. Регуляция центральных звеньев гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы при длительном воспалительном стрессе. 2002. Вест. Мол. Уч., 4, 16-22.

23. Симбирцев A.C. Биология семейства интерлейкина-1. Иммунология. 1998, №3.С.9-17.

24. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло. Сорос.образоват.журн. 1996. №3,с.4-10.

25. Спиричев В.Б., Конь И.Я. Биологическая роль жирорастворимых витаминов. Итоги науки и техники. Сер. Физиология человека и животных. 1989.Т.37.

26. Стокле Ж.-К., Б.Мюлле, Р.Андриацитохайна, А. Клещев. Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии кровеносных сосудов. Биохимия, 1998, том 63, вып. 7, с.976-983.

27. Тяжелова В.Г. Механизмы активации лимфоцитов периферической крови. М.: Наука, 2003 - 192 с.

28. Франциянц Е.М., Сидоренко Ю.С., Розенко Л .Я. Перекисное окисление липидов в патогенезе опухолевой болезни. Ростов-на Дону: Изд-во Ростовского ун-та. 1995.176 с.

29. Хаитов P.M., Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. Иммунология."Медицина", 2000.

30. Ярилин A.A. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и патологии. Иммунология.-1997.-№5.-С.7-14.

31. Aggarwal, В. В. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. 2003. Nat. Rev. Immunol. Vol. 3, p. 745-756.

32. Akira S, Taga T, Kishimoto T. Interleukin-6 in biology and medicine. Adv. 1993. Immunol. Vol. 54, p. 1-78.

33. Alcami A, Symons JA, Smith GL The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. 2000. J Virol. Vol.74, p. 11230-9.

34. Alexander C, Rietschel ET. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. 2001. J Endotoxin Res. Vol. 7, p. 167—202.

35. Allen R.G., Tresini M. Oxidative status and gene regulation. 2000. Free Radic. Biol.Med. Vol.28, p. 463-499.

36. Ananthan J, Goldberg AL, Voellmy R. Abnormal proteins serve as eukaryotic stress signals and trigger the activation of heat shock genes. 1986. Science, p. 522-4.

37. Archer S. Measurement of nitric oxide in biological models. 1993. FASEB J. Vol.7, p. 349-360.

38. Arrigo AP, Firdaus WJ, Mellier G, Moulin M, Paul C, Diaz-latoud C, Kretz-remy C. Cytotoxic effects induced by oxidative stress in cultured mammalian cells and protection provided by Hsp27 expression. 2005. Methods. Vol.35, p. 126-38.

39. Astiz ME, Saha DC, Brooks K, Carpati CM, Rackow EC. Comparison of the induction of endotoxin tolerance in endotoxemia and peritonitis by monophosphoryl lipid A and lipopolysaccharide. 1993. Circ Shock. Vol.39, p. 194-8.

40. Basu S., Eriksson M. Vitamin E in relation to lipid peroxidation in experimental septic shock. 2000. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids Vol. 62, p. 195-9.

41. Beadling C, Smith KA. DNA array analysis of interleukin-2-regulated immediate/early genes. 2002. Med Immunol. Vol.1, p. 1-2.

42. Bellman K., Laattela M., Wissing D., Burkart V., and Kolb H. 1995 FEBS Lett., 391, 185-188.

43. Berger FG. The interleukin-6 gene: a susceptibility factor that may contribute to racial and ethnic disparities in breast cancer mortality. 2004. Breast Cancer Res Treat. Vol.88, p. 281-5.

44. Berghe T.V., Kalai M., Geert van Loo, Declerq W., Vandenabeel P. Disruption of HSP90 function reverts tumor necrosis factor-induced necrosis to apoptosis. 2003. J. Biol. Chem. Vol. 278, p. 5622-5629.

45. Beutler B. LPS in microbial pathogenesis: promise and fulfilment. 2002. J Endotoxin Res. Vol.8, p. 329-35.

46. Beutler B., Milsark I.W., and Cerami A.C. Passive immunization against chachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. 1985. Science. Vol. 229, p. 869-871.

47. Beyer R.E. The analysis of the role coenzyme Q in free radical generation and as an antioxidant. 1992. Biochem.Cell Biol. Vol.70, p.390-403.

48. Billiau A. Interferon-y in autoimmunity. 1996. Cytokine Growth factor rev. Vol.7, p. 25-34.

49. Blackwell T.S., and J.W. Christian. Sepsis and cytokines:current status. 1996. British journal of anaesthesia. Vol. 77, p. 110-117.

50. Blackwell, T.S., Blackwell, T.R., Holden, E.R., Christman, B.W., Christman, J.W. In vivo antioxidant treatment suppresses nuclear factor-KB activation and neurtrophilic lung inflammation. 1996. J. Immunol. Vol. 157, p.1630-1637.

51. Blagosklonny MV, Toretsky J, Neckers L. Geldanamycin selectively destabilizes and conformationally alters mutated p53. 1995. Oncogene. Vol. 11, p.933- 9.

52. Bochkov, V.N., Kadi, A., Huber, J., Gruber, F., Binder, B.R., Leitinger, N. Protective role of phospholipids oxidation products in endotoxin-induced tissue damage. 2002. Nature. Vol. 419, p. 77-81.

53. Broemer M, Krappmann D, Scheidereit C. Requirement of Hsp90 activity for IkappaB kinase (IKK) biosynthesis and for constitutive and inducible IKK and NF-kappaB activation. 2004. Oncogene. P. 5378-86.

54. Bruey JM, Ducasse C, Bonniaud P, Ravagnan L, Susin SA, Diaz-Latoud C, Gurbuxani S, Arrigo AP, Kroemer G, Solary E, Garrido C. Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c. 2000. Nat Cell Biol. Vol. 2, p. 645-52.

55. Butterfield L., Zentrich E., Beekman A., and L E Heasley. Stress- and cell type-dependent regulation of transfected c-Jun N-terminal kinase and mitogen-activated protein kinase kinase isoforms 1999. Biochem J. Vol. 338, p. 681-686.

56. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L, Green S, Fiore N and Williamson B. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. 1989. Proc. Natl.Acad. Sci.U.S.A. Vol. 72, p. 3666-70.

57. Chang SY, Su PF, Lee TC. Ectopic expression of interleukin-1 receptor type II enhances cell migration through activation of the pre-interleukin 1 alpha pathway. 2008. Cytokine. Vol. 45, p. 32-8.

58. Chang YH, Hsieh SL, Chen MC, Lin WW. Lymphotoxin beta receptor induces interleukin 8 gene expression via NF-kappaB and AP-1 activation. 2002. Exp Cell Res. Vol. 278, p. 166-74.

59. Chang, L. and Karin, M. Mammalian MAP kinase signaling cascades. 2001. Nature. Vol. 410, p. 37-40.

60. Chen B, Piel WH, Gui L, Bruford E, Monteiro A. The HSP90 family of genes in the human genome: insights into their divergence and evolution. 2005. Genomics. Vol. 86, p. 627-37.

61. Chew BP, Park JS. Carotenoid action on the immune response. 2004. J Nutr. Vol.134, p. 257-261.

62. Chung KF. Cytokines in chronic obstructive pulmonary disease. 2001. Eur Respir J Suppl. Vol, 34, p.50-59.

63. Conde A.G., Lau S.S., Dillmann W.H., Mestril R. Induction of heat shock proteins by tyrosine kinase inhibitors in rat cardiomyocytes and myogenic cells confers protection against simulated ischemia. 1997. Moll. Cell. Cardiol. Vol. 29, p. 1927-1938.

64. Content J, De Wit L, Pierard D, Derynch R, De Clercq E, Fiers W. Secretory proteins induced in human fibroblasts under conditions used for the production of interferon beta. 1982. Proc Natl. Acad Sci. USA Vol.79, p. 2768-2772.

65. Cordeiro CA, Moreira PR, Costa GC, Dutra WO, Campos WR, Orefice F, Teixeira AL. Interleukin-1 gene polymorphisms and toxoplasmic retinochoroiditis. 2008. Mol Vis. Vol. 14, p. 1845-9.

66. Craig EA, Weissman JS, Horwich AL. Heat shock proteins and molecular chaperones: mediators of protein conformation and turnover in the cell. 1994. Cell. Vol.78, p.365-72.

67. Cuturi M.C., Murphy M, Costa-Giomi M.P., Weinmann R, Perussia B., and Trinchieri G. Independent regulation of tumor necrosis factor and lymphotoxin production by human peripheral blood lymphocytes. 1987. J.Exp. Med. Vol.165, p. 1581-95.

68. Davis, R. J. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases. 2000. Cell. Vol. 103, p. 239-252.

69. De Smaele E, Zazzeroni F, Papa S, Nguyen DU, Jin R, Jones J, Cong R, Franzoso G. Induction of gadd45beta by NF-kappaB downregulates pro-apoptotic JNK signalling. 2001. Nature. Vol. 414, p. 308-13.

70. De Wit. H., Hoogstraten D., Halie R.M., Vellenga E. Interferon-gamma modulates the lipopolysaccharide-induced expression of Ap-1 and NF-kB at the mRNA and protein level in human monocytes. 1996. Exp.Hematol. Vol.24,-p. 228-235.

71. DeBoer C, Meulman PA, Wnuk RJ, and Peterson DH.1970. Geldanamycin, a new antibiotic. 1970. J Antibiot. Vol. 23, p. 442-447.

72. Decker, T., S. Stockinger, M. Karaghiosoff, M. Müller, P. Kovarik. 2002. IFNs and STATs in innate immunity to microorganisms. 2002. J. Clin. Invest. Vol.109, p. 1271-1277.

73. DiDonato J, Mercurio F, Rosette C, Wu-Li J, Suyang H, Ghosh S, Karin M. Mapping of the inducible IkappaB phosphorylation sites that signal its ubiquitination and degradation. 1996. Mol Cell Biol. Vol.16, p. 1295-304.

74. Dinapoli MR, Calderon CL, Lopez DM. The altered tumoricidal capacity of macrophages isolated from tumor-bearing mice is related to reduce expression of the inducible nitric oxide synthase gene. 1996. J Exp Med. Vol.183, p. 1323-9.

75. Dragsted LO. Biomarkers of exposure to vitamins A, C, and E and their relation to lipid and protein oxidation markers. 2008. Eur J Nutr. Vol. 2, p. 3-18.

76. Dubinski A, Zdrojewicz Z. The role of interleukin-6 in development and progression of atherosclerosis. 2007. Pol Merkur Lekarski. Vol.22, p. 291-4.

77. Elenkov IJ, Iezzoni DG, Daly A, Harris AG, Chrousos GP. Cytokine dysregulation, inflammation and well-being. 2005. Neuroimmunomodulation. Vol.12, p. 255-69

78. Fahmi H., Chaby R. Selective refractoriness of macrophages to endotoxin-induced production of tumor necrosis factor, elicited by an autocrin-induced mechanism. 1993. J. Leukoc. Biol. Vol. 53, p. 45-52.

79. Fan J, Ye RD, Malik AB. Transcriptional mechanisms of acute lung injury. 2001 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. Vol. 281, p. 1037- 1050.

80. Fanny N. Lauw, Dasja Pajkrt, C. Erik Hack, Masashi Kurimoto, Sander J.H., van Deventer and Tom van der Poll. Proinflammatory effects of IL-10 during human endotoxemia. 2000. The journal of immunology. Vol. 165, p. 2783-2789.

81. Fiorentino DF, Zlotnik A, Mosman TR, Howard M and O' Garra A. IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. 1991. J.Immunol. Vol. 147, p. 3815-3822.

82. Fleming I, Gray GA, Schott C, Stoclet JC. Inducible but not constitutive production of nitric oxide by vascular smooth muscle cells. 1991. Eur J Pharmacol. Vol. 200, p.375-6.

83. Flesch IE, Hess JH, Kaufmann SH. NADPH diaphorase staining suggests a transient and localized contribution of nitric oxide to host defence against an intracellular pathogen in situ. 1994. Int Immunol. Vol.11, p. 1751-7.

84. Folkers K., Langsjoen P., Langsjoen P.H. Therapy with coenzyme Q10 of patients in heart failure who are eligible or ineligible for a transplant. 1992. Biochem, Biophys. Res.Commun. Vol.182, p.247-253.

85. Fox, E.S., Brower, J.S., Bellezzo, J.M., Leingang, K.A. N-Acetylcysteine and a-tocopherol reverse the inflammatory response in activated rat Kupffer cells. 1997. J. Immunol. Vol.158, p. 5418-5423.

86. Franchi A.M., Chaud M., Rettori V. Et al. Role of nitric oxide in eicosanoid synthesis and uterine motility in estrogen-treated rat uteri. 1994. Proc. Natl.Acad.Sci.USA. Vol. 91, p.539-543.

87. Freeman B.C., Morimoto R.I. The human cytosolic molecular chaperones in hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. 1996. EMBO J. Vol. 15, p. 2969-2979.

88. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. 1995. Annu Rev. Biochem. Vol. 64, p.97-112.

89. Gabai V.L., Meriin A.B., Yaglom J.A., Volloch V.Z., Sherman M.Y. 1998. Role of Hsp70 in regulation of stress-kinase JNK: implications in apoptosis and aging. 1998. FEBS Letts. Vol. 438, p. 1-4.

90. Gabai V.L., Sherman M.Y. Invited review: Interplay between molecular chaperones and signaling pathways in survival of heat shock. 2002. J. Appl. Physiol. Vol. 92, p. 1743-1748.

91. Gao, B., M. F. Tsan. Endotoxin contamination in recombinant human heat shock protein 70 (Hsp70) preparation is responsible for the induction of tumor necrosis factor «release by murine macrophages. 2003. J. Biol. Chem. Vol.278, p. 174-179.

92. Gerondakis, S., Grumont, R., Rourke, I., and Grossmann, M. The regulation and roles of Rel/NF-kappa B transcription factors during lymphocyte activation. 1998. Curr. Opin. Immunol. Vol, p. 10, 353—359.

93. Ghosh S and Karin M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. 2002.Cell. Vol. 109, p.81-96.

94. Gilbert D.L. Perspective on the history of oxigen and life. In: oxigen and the living process:an inter-disciplinatory approach. 1981. Springer Verlag, New York, p. 1-43.

95. Gille L., Nohl H. The existence of a lysosomal redox chain and the role of ubiquinone. 2000. Arch.Biochem.Biophys.Vol. 375, p.347-354.

96. Gleckman R, Hibert D. Afebrile bacteraemia: A phenomenon in geriatric patients. 1982. Journal I Of the American Medical Association. Vol. 248, p.1478— 1481.

97. Goode, H.F., Cowley, H.S., Walker, B.E., Howdle, P.D., Webster, N.R. Decreased antioxidant status and increased lipid peroxidation in patients with septic shock and secondary organ dysfunction. 1995. Crit. Care Med. Vol. 23, p. 646-651.

98. Gordon B.R., T.S. Parker, D.M. Levine, S.D. Saal, J.C. Wang, B.J. Sloan, P.S. Barie, and A.L. Rubin. Low lipid concentrations in clinical illness: implications for preventing and treating endotoxemia. 1996. Crit. Care Med. Vol. 24, p. 584-589.

99. Gordon J.R. and Galli S.J. Mast cells as a sourse of both pre-formed and immunologically inducible TNFa/cachectin. 1990. Nature. Vol. 346, p. 274-6.

100. Granger DL, Hibbs JB Jr, Perfect JR, Durack DT. Specific amino acid (L-arginine) requirement for the microbiostatic activity of murine macrophages. J 1988. Clin Invest. Vol. 4, p. 1129-36.

101. Granucci F.C., Vizzardelli N., Pavelka S., Feau M., Pérsico E., Virzi M., Rescigno G., and P. Ricciardi-Castagnoli. Inducible IL-2 production by dendritic cells revealed by global gene expression analysis. 2001. Dev.Immunol. p. 2-882.

102. Gregg D., de Carvalho D.D., Kovacic H. Integrins and coagulation: a role for ROS/redox signaling? Antioxid.redox.signal.2004.Vol.6, p. 757764.

103. Green L.A., Wagner D.A., Glogowarski J. et al. Analysis of nitrate, ninrite, and 15N. nitrate in biological fluids. Anal. Biochem, 1982, 126, 131138.

104. Gusev NB, Bogatcheva NV, Marston SB. Structure and properties of small heat shock proteins (sHsp) and their interaction with cytoskeleton proteins. 2002. Biochemistry (Mosc). Vol.67, p. 511-9.

105. Gutteridge JMC, Mitchell J. Redox imbalance in the critically ill.Br. Med. 1999. Bull. Vol. 55, p. 49-75.

106. Guzhova IV, Darieva ZA, Meló AR, Margulis BA. Major stress protein Hsp70 interacts with NF-kB regulatory complex in human T-lymphoma cells. 1997. Cell Stress Chaperones. Vol. 2, p. 132-9.

107. Hirano T, Taga T, Nakano N, Yasukawa K, Kashiwamura S, Shimizu K, Nakajima K, Pyun KH, Kishimoto T. Purification to homogeneity and characterization of human B-cell differentiation factor (BCDF). 1985. Proc Natl. Acad Sci. USA. Vol. 82, p. 5490-5494.

108. Hirotaka Kuwata, Yasuyuki Watanabe, Hiroyuki Miyoshi, Masahiro Yamamoto, Tsuneyasu Kaisho, Kiyoshi Takeda, and Shizuo Akira. 11-10 -inducible Bcl-3 negatively regulates LPS-induced TNFa production in macrophages. 2003. Blood. Vol. 102, p. 4123-4129.

109. Houry WA. Chaperone-assisted protein folding in the cell cytoplasm. Curr 2001. Protein Pept Sci. Vol. 2, p. 227-44.

110. Hu J., Seeger C. Hsp90 is required for the activity of a hepatitis B virus reverse transcriptase. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 93, p. 1060-1064.

111. Huang, D. B., Huxford, T., Chen, Y. Q., and Ghosh, G. 1997. The role of DNA in the mechanism of NFkB dimer formation: crystal structures of the dimerization domains of the p50 and p65 subunits. 1997. Structure. Vol. 5, p. 1427—1436.

112. Jain, A., C. A. Ma, S. Liu, M. Brown, J. Cohen, and W. Strober. Specific missense mutations in NEMO result in hyper-IgM syndrome with hypohydrotic ectodermal dysplasia. 2001. Nat. Immunol. Vol. 2, p. 223228.

113. James P., Pfund C., Craig EA. Functional specificity' among Hsp 70 molecular chaperones. 1997. Science. Vol.275, p. 387-389.

114. Jeremy A. Scott, Sanjay Mehta, Michele Duggan, Aurelia Bihari, and David G. McCormack. Functional Inhibition of Constitutive Nitric Oxide Synthase in a Rat Model of Sepsis. 2002. Am. J. Respir. Crit. Care Med. Vol.165, p. 1426- 1432.

115. Johnson JL, Toft DO. Binding of p23 and hsp90 during assembly with the progesterone receptor. 1995. Mol Endocrinol. Vol. 9, p. 670-8.

116. Johnsen M.D., Peterson J.M., Xu Q.-P., Graves B.J. Characterization of the cooperative function of inhibitory sequences in Ets-1 // Mol. and Cell. Biol.1999. Vol. 16, N 5. P. 2065-2073.

117. Julou-Schaeffer G, Gray GA, Fleming I, Schott C, Parratt JR, Stoclet JC. Loss of vascular responsiveness induced by endotoxin involves L-arginine pathway. 1990. Am J Physiol. Vol. 259, p. 1038-43.

118. Jurkovich G J., Mileski W.J., Maier R.V., Winn R.K., Rice C.L. Interferon gamma increases sensitivity to endotoxin. 1991. J. Surg.Res. Vol. 51, p. 197-203.

119. Kamradt MC, Chen F, Cryns VL. The small heat shock protein alpha B-crystallin negatively regulates cytochrome c- and caspase-8-dependent activation of caspase-3 by inhibiting its autoproteolytic maturation. 2001. J Biol Chem. p. 16059-63.

120. Kanda, H., Miura, M. Regulatory roles of JNK in programmed cell death. 2004. J.Biochem. Vol. 136, p. 1-6.

121. Karin M and Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-kappa B activity. 2000. Annu Rev Immunol. Vol. 18, p. 621663.

122. Kheir-Eldin, A.A., Motawi, T.K., Gad, M.Z., Abd-ElGawad, H.M. Protective effect of vitamin E, p-carotene, and N-acetylcysteine from the brain oxidative stress induced in rats by lipopolysaccaride. 2001. Int. J. Biochem. Cell Biol. Vol.33, p. 475-482.

123. Kiang JG. Inducible heat shock protein 70 kD and inducible nitric oxide synthase in hemorrhage/resuscitation-induced injury. 2004. Cell Res. Vol.14, p. 450-9.

124. Koh Y., Lim C.M., Kim M.J., Shim T.S., Lee S.D., Kim W.S., Kim D.S., and Kim W.D. Heat shock response decreases endotoxin-induced acute lung injury in rats. 1999. Respirology. Vol. 4, p. 325-330.

125. Komarova E.Y., Afanasyeva E.A., Bulatova M.M., Cheetham M.E., Margulis B.A., and Guzhova I.V. Downstream caspases are novel targets for the antiapoptotic activity of the molecular chaperone hsp70. 2004. Cell Stress & Chap. Vol. 9, p. 265-275.

126. Kovarik P., Stoiber D., Novy M., Decker T. Statl combines signals derived from IFN-gamma and LPS receptors during macrophage activation. 1998. EMBO J. Vol. 17, p. 3660-3668.

127. Kuhns DB, Alvord WG, Gallin JI. Increased circulating cytokines, cytokine antagonists, and E-selectin after intravenous administration of endotoxin in humans. 1995. Journal of infectious diseases. Vol. 171, p. 145152.

128. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. 1970. Nature. Vol. 227, p. 680-685.

129. Lamb JR, Bal V, Mendez-Samperio A, et al. Stress proteins may provide a link between the immune response to infection and autoimmunity. 1989. Int Immunol. P. 191-196.

130. Landar A, Darley-Usmar VM. Nitric oxide and cell signaling: modulation of redox tone and protein modification. 2003. Amino Acids. Vol.25, p. 313-21.

131. Lang J.D., McArdle P.J., O'Reilly P.J., Matalon S. Oxidant-antioxidant balance in acute lung injury. 2002. Chest. Vol. 122, p. 314-320.

132. Lass A., Forster M.J., Sohal R.S. Effects of coenzyme Q10 and a-tocopherol administration on their tissue evels in the mouse: elevation of-mitochondrial a-tocopherol by coenzyme Q10. 1999. Free Radic.Biol.Med. Vol.26, p.1375-1382.

133. Latha B, Babu M. The involvement of free radicals in burn injury: a review. 2001. Vol. 27, p.309-317.

134. Leon P., Redmond H.P., Shou J., Daly J.M. Interleukinl and its relationship to endotoxin tolerance. 1992. Arch. Surg. Vol.127, p.146-151.

135. Liu S. and Malik A. NF-kB activation as a pathological mechanism of septic shock and inflammation. 2006. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. Vol. 290, p. 622-645.

136. Liu YJ. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. 2005. Annu Rev Immunol. Vol.23, p. 275-306.

137. Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ. "The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology".2001. Cell. Vol. 104, p. 487-501.

138. Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. 2001 Cell. Vol. 104, p. 487501.

139. Lomedico P.T., Gubler R., Hellmann C.P., Dukovich M, Giri J.C., Pan Y.E., Collier K, Semionow R, Chua A.O., and Mizel S.B. Cloning and expression of murine interleukin-1 cDAN in Escherichia coli. 1984. Nature Vol. 312, p. 458-462.

140. Lowe G.M., Vlismas K., Young A.J. Carotenoids as prooxidants? 2003. Mol.Aspects Med. Vol.24, p.363-369.

141. Luo J-L., Kamata H., Karin M. IKK/NF-kappaB signaling: balancing life and death—a new approach to cancer therapy. 2005. J. Clin. Invest. Vol. 115, p. 2625-2632.

142. Macdonald J., H.F. Galley and N.R. Webster. Oxidative stress and jene expression in sepsis. 2003. British j. Of Anaesthesia. Vol. 90, p. 221-32.

143. Malhotra V, Shanley TP, Pittet JF, Welch WJ, and Wong HR. Geldanamycin inhibits NF-kappaB activation and interleukin-8 gene expression in cultured human respiratory epithelium. 2001. Am J Respir Cell Mol Biol. Vol.25, p. 92-97.

144. Malyshev IYu, Malugin AV, Golubeva LYu, Zenina TA, Manukhina EB, Mikoyan VD, Vanin AF. Nitric oxide donor induces HSP70 accumulation in the heart and in cultured cells. 1996. FEBS Lett. Vol.391, p. 21-3.

145. Marcu MG, Chadli A, Bouhouche I et al. The heat shock protein 90 antagonist novobiocin interacts with a previously unrecognized ATP-binding domain in the carboxyl terminus of the chaperone. 2000. J Biol Chem. Vol. 275, p. 37181-37186.

146. Marczin N.A., Papapetropoulos P., Catravas J.D. Tyrosine kinase inhibitors suppress endotoxin- and IL-1 beta-induced NO synthesis in aortic smooth muscle cells. Am. 1993. J. Physiol. Vol. 265, p. 1014-1018.

147. Mastorakos G, Ilias I. Interleukin-6: a cytokine and/or a major modulator of the response to somatic stress. 2006. Ann N Y Acad Sci. Vol.1088, p. 373-81.

148. Mattews N. Tumor necrosis factor from the rabbit 1. Mode of action, specificity and physicochemical properties. 1978. Br.J. Cancer. Vol. 38, p. 310.

149. Matthew J., Sweet adn David A. Hume. Endotoxin signal transduction in macrophages. 1996. Journal of Leukocyte biology. Vol. 60, p. 8-26.

150. May MJ, Ghosh S. Signal transduction through NF-kappa B. 1998. Immunol Today. Vol.19, p. 80-8.

151. McGown C. C. and Z. L. S. Brookes. Beneficial effects of statins on the microcirculation during sepsis: the role of nitric oxide. 2007. Br. J. Anaesth. Vol.98, p. 163 175.

152. Mckay L. and Cidlowski J. Molecular Control of Immune/Inflammatory Responses: Interactions Between Nuclear Factor-kB and Steroid Receptor-Signaling Pathways. 1999. Endocrine Reviews. Vol. 20, p. 435-459.

153. Medzhitov R., Janeway C. A. Jr. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition. 1997. Cell. Vol. 91, p. 295-298.

154. Meller S.T., Gebhart G.F. Nitric oxide and nociceptive processing in the spinal cord. Pain. 1993. Vol.52, p. 127-136.

155. Memon, R. A., C. Grunfeld, A. H. Moser, and K. R. Feingold. Tumor necrosis factor mediates the effects of endotoxin on cholesterol and triglyceride metabolism in mice. 1993. Endocrinology. Vol. 132, p.2246-2253.

156. Meydani SN, Wu D, Santos MS, Hayek MG. Antioxidants and immune response in aged persons: overview of present evidence. 1995. Am J Clin Nutr. Vol.62, p. 1462-1476.

157. MocMillan K., Bredt D.S., Hirsch D.J. et al. Cloned, expressed rat cerebellar nitric oxide synthase contains stoichiometric amounts of heme, with binds carbon monoxide. 1992. Proc.Natl. Acad.Sci. USA. Vol.89, p.11141-11145.

158. Morgan D.A., Ruscetti F.W., Gallo R.C. Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows. 1976. Science. Vol.193, p. 1007-1008.

159. Morrow L.E., J.L. McClellan, C.A. Conn, and M.J. Kluger. Glucocorticoids alter fever and IL-6 responses to psychlological stress and to lipopolisaccharide. 1993. Am. J. Physiol. Vol.264, p. 1010-1016.

160. Mortensen, S., Leth, A., Agner, E., Rohde, M. Dose-related decrease of serum coenzyme Q-10 during treatment with . HMG-CoA reductase inhibitors. 1997. Mol. Aspects Med. Vol.18, p. 137-144.

161. Nacy C.A., Meierovics A.I., Belosevic M., Green S.J. Tumor necrosis factor-alpha: central regulatory cytokine in the induction of macrophage antimicrobial activities. 1991. Pathobiology. Vol.59, p. 182-4.

162. Nagano T, Yoshimura T. Bioimaging of nitric oxide. 2002. Chem Rev. Vol.102, p. 1235-70.

163. Nataro JP. Diarrhoeagenic Escherichia coli. In: Sussman M, editor. Molecular medical microbiology. 2002. London: Academic Press. Vol. 2, p. 1463-1504.

164. Nathan AT., Singer M. The oxygen trail:tissue oxygenation. 1999. Br Med Bull. Vol. 55, p. 96-108.

165. Nazarenko I, Marhaba R, Reich E, Voronov E, Vitacolonna M, Hildebrand D, Elter E, Rajasagi M, Apte RN, Zoller M. Tumorigenicity of1.-1 alpha- and IL-1 beta-deficient fibrosarcoma cells. 2008. Neoplasia. Vol.10, p. 549-62.

166. Nikolov R, Lazarov S Interleukins and endocrine function. 2001. Vutr Boles. Vol. 33, p. 41-7.

167. Nishina H., Wada T., Katada T. Physiological roles of SAPK/JNK signaling pathway. 2004. Jap. Biolchem. Soc. Vol. 136, p. 123-126.

168. Novoselova EG. The role of ubiquinones in the regulation of lipid metabolism in rat thymocytes. 1989. FEBS Lett. Vol.249, p. 371-4.

169. Novoselova, E.G. Lipid metabolism in rat tissues under chronic y-irradiation and-ubiquinone Q9 diet. 1992. Biochemistry (Moscow). Vol. 57, p. 531-538.

170. Opal S.M., Gluck T. Endotoxin as a drug target. 2003. Crit Care Med Vol.31, p. 57-64.

171. Palleros D.R., Welch WJ., Fink A.L. Interaction- of hsp70 with unfolded proteins: effects of temperature and-nucleotides on the kinetics of binding. 1991. Proc. Natl Acad. Sci. USA. Vol. 88, p. 5719-5723.

172. Palozza P, Calviello G, Bartoli GM. Prooxidant activity of beta-carotene under 100% oxygen pressure in rat liver microsomes. 1995. Free Radic Biol Med: Vol.19, p. 887-92.

173. Palozza P, Luberto C, Calviello G, Ricci P, Bartoli GM. Antioxidant and prooxidant role of beta-carotene in murine normal and tumor thymocytes: effects of oxygen partial pressure. 1997. Free Radic Biol Med. Vol. 22, p. 1065-73.

174. Papa S., Zazzeroni, F., Pham, C.G., Bubici, C., Franzoso, G., Linking JNK signaling to NF-kB: a key to survival, J. of Cell. 2004. Science. Vol. 117, p. 5197-5208.

175. Parillo J.E. Pathogenetic mechanisms of septic shock. 1993. N. Engl. J.Med. Vol. 328, p. 1471-1477.

176. Pobezhimova T.P., Voinikov V.K. Biochemical and physiological aspects of ubiquinone function.Membr. 2000. Cell.Biol. Vol. 13, p.595-602.

177. Preiser JC, Schmartz D, van der Linden P, Content J, vanden Bussche P, Buurman W, Sebald W, Dupont E, Pinsky MR, Vincent JL. Interleukin-6 administration has no acute hemodynamic or hematologic effects in the dog. 1991. Cytokine. P. 3:1.

178. Pulendran B, Kumar P, Cutler CW, Mohamadzadeh M, Van Dyke T, Banchereau J. Lipopolysaccharides from distinct pathogens induce different classes of immune responses in vivo. 2001. J. Immunol. Vol.167, p. 506776.

179. Pulverer, B.J., M.Kyriakis, J. Avruch, E. Nikolakaki, and J.R. Woodgett. Phosphorylation of c-Jun mediated by MAP kinases. 1991. Nature. Vol. 354, p. 494-496.

180. Radomski MW, Palmer RM, Moncada S. Glucocorticoids inhibit the expression of an inducible, but not the constitutive, nitric oxide synthase in vascular endothelial cells. 1990. Proc Natl Acad Sci USA. Vol. 87, p. 10043-7.

181. Ran R., Lu A., Zhang L., Tang Y., Zhu H., Xu H., Feng Y., Han C., Zhou G., Rigby A.C., Sharp F.R. Hsp70 promotes TNF-mediated apoptosis by binding IKK gamma and impairing NF-kappa B survival signaling. 2004. Gens and Develop. Vol. 18, p. 1466-1481.

182. Rees DD, Cellek S, Palmer RM, Moncada S. Dexamethasone prevents the induction by endotoxin of a nitric oxide synthase and the associated effects on vascular tone: an insight into endotoxin shock. 1990. Biochem Biophys Res Commun. Vol. 173, p. 541-7.

183. Reinhart, K., and W. Karzai. Anti-tumor necrosis factor therapy in sepsis: update on clinical trials and lessons learned. 2001. Crit. Care Med. Vol. 29, p. 121-125.

184. Renz H., Henke A., Hofman P., et al. Sensitization of rat alveolar macrophages to enhanced TNF-alpha release by in vivo treatment with dexamethasone. 1992. Cell. Immunol. Vol.20, p. 249-257.

185. Rietschel E.T., and H.Brade. Bacterial endotoxins. 1992. Sci.Am. Vol. 267, p. 156-163.

186. Rutherford S, Hirate Y, S walla BJ. The Hsp90 capacitor, developmental remodeling, and evolution: the robustness of gene networksand the curious evolvability of metamorphosis. 2007. Crit Rev Biochem Mol Biol. Vol. 4223, p. 355-72.

187. Sandy S. Lau, Tina M. Griffin, and Ruben Mestril. Protection against endotoxemia by HSP70 in rodent cardiomyocytes. 2000. Am J Physiol Heart Circ Physiol. Vol. 278, p. 439-1445.

188. Schmitz, M.L., Bacher, S.} Kracht, M. I kb-independent control of NF-k B activity by modulatory phosphorylations. 2001. Trends Biochem. Sci. Vol.26, p. 186-190.

189. Schopfer F., Riobo N., Carreras M.C. et al. Oxidation of ubiquinol by peroxynitrite: implications for protection of mitochondria agains nitrosative damage. 2000. Biochem.J. Vol. 349, p.35-42.

190. Schroder K., Paul J. Hertzog, Timothy Ravasi, and David A.Hume. Interferon-y: an overview of signals, mechanisms and functions. 2004. Journal of leukocyte biology. Vol. 75, p. 163-189.

191. Schulte, T. W., An, W. G., and Neckers, L. M. Geldanamycin-induced destabilization of Raf-1 involves the proteasome. 1997. Biochem Biophys Res Commun. Vol. 239, p. 655-659.

192. Secco D.D., ParonJ.A., de Oliveira S.H. et al.Neutrophil migration in inflammation: nitric oxide inhibits rolling, adhesion and induces apoptosis. 2003. Nitric oxide. Vol. 9, p. 153-164.

193. Segnitz B, Gehring U. The function of steroid hormone receptors is inhibited by the hsp90-specific compound geldanamycin. 1997. J Biol Chem. Vol. 272, p. 18694-701.

194. Sen R, Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences. 1986. Cell. Vol. 46, p. 705-716.

195. Shaner L, Morano KA. All in the family: atypical Hsp70 chaperones are conserved modulators of Hsp70 activity. 2007. Cell Stress Chaperones. Vol. 12, p. 1-8.

196. Siebenlist U, Brown K, and Claudio E. Control of lymphocyte development by nuclear factor-kappaB. 2005. Nat Rev Immunol. Vol. 5, p. 435-445.

197. Silverman, N., Maniatis, T. NF-kB signaling pathways in mammalian and insect innate immunity. 2001.Genes & Development. Vol. 15, p. 2321-2342.

198. Srethapakdi M, Liu F, Tavorath R, et al. Inhibition of Hsp90 function by ansamycins causes retinoblastoma gene product-dependent G1 arrest. 2000. Cancer Res. Vol. 60, p. 3940-6.

199. Stamler JS, Singel DJ, Loscalzo J. Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated forms. 1992. Science. Vol.258, p. 1898-902.

200. Stuehr D.J., Marietta M.A. Mammalian nitrate biosynthesis:mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide. 1985. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. Vol. 82, p.773 8-7742.

201. Suffredini A.F., Fromm R.E., Parker M.M., Brenner M., Kovacs J.A., Wesley R.A., Parrillo J.E. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. 1989. New england journal of medicine. Vol. 321, p. 280-287.

202. Suffredini AF. Current prospects for the treatment of clinical sepsis. 1994. Chest. Vol. 21, p. 12-18.

203. Supko JG, Hickman RL, Grever MR, et al. Preclinical pharmacologic evaluation of geldanamycin as an antitumor agent. 1995. Cancer Chemother Pharmacol. Vol. 36, p. 305-15.

204. Szkopinska A. Ubiquinone.Biosynthesis of quinone ring and its isoprenoid side chain. Intracellular localization. 2000. Acta Biochim.Pol. Vol. 47, p.163.

205. Tadros T, Traber DL, Heggers JP, Herndon DN. Effects of interleukin-1 alpha administration on intestinal ischemia and reperfusion injury, mucosal permeability, and bacterial translocation in burn and sepsis. 2003. Ann Surg. Vol. 237, p.101-9.

206. Takai Y, Wong GG, Clark SC, Burakoff S, Hermann SJ. B cell stimulatory factor-2 is involved in the differentiation of cytotoxic T lymfocytes. 1988. J. Immunol. Vol. 140, p. 508-512.

207. Takimoto C.H., Diggikar S. Heat shock protein and proteasome targeting agents. 2002. Hematol. Oncol. Clin. Vol.16, p. 1269-1285.

208. Thornton AM, Donovan EE, Piccirillo CA, Shevach EM. Cutting edge: IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+ T cell suppressor function. 2004. J Immunol. 2004. Vol. 172, p. 6519-23.

209. Towbin H., Staeheln T., and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 7, p. 4350-4354.

210. Tracey KJ, Wei H, Manogue KR, et al. Cachectin/tumor necrosis factor induces cachexia, anemia, and inflammation. 1988. J Exp Med. Vol.167, p. 1211-1227.

211. Triantafilou M and K. Triantafilou. Heat-shock protein 70 and heat-shock protein 90 associate with toll-like receptor 4 in response to bacterial lipopolysaccaride. Biochemical society. 2004. Vol. 32, p. 636-639.

212. Tsuneyoshi I, Kanmura Y, Yoshimura N. Nitric oxide as a mediator of reduced arterial responsiveness in septic patients. 1996. Crit Care Med. Vol. 24, p. 1083-6.

213. Uehara Y, Murakami Y, Suzukake-Tsuchiya K, et al. Effects of herbimycin derivatives on src oncogene function in relation to antitumor activity. 1988. J Antibiot. Vol. 41, p. 831-4.

214. Vadiveloo P.K., Vairo G., Hertzog P., Kola I., Hamilton J.A. Role of type 1 interferons during macrophage activation by lipopolysaccharide. 2000. Cytokine. Vol.12, p. 1639-1646.

215. Van Oss CJ. Historical brevium -viral interference and interferon. 2004. Immunol Invest. Vol.33, p. 481-2.

216. Van Amersfoort ES, Van Berkel TJ, Kuiper J. Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. 2003. Clin. Microbiol. Rev. Vol.16, p. 379-414.

217. Van der Poll, T.S.J, van Deventer. Cytokines and anticytokines in the pathogenesis of sepsis. 2000. Infect. Dis.Clin. North.Am. 13:413.

218. Vassali P.: The pathophysiology of tumor necrosis factor alpha. 1992. Annu Rev Immunol. Vol.10, p. 411-452.

219. Vega VL and De Maio A. Geldanamycin treatment ameliorates the response to LPS in murine macrophages by decreasing CD 14 surface expression. 2003. Mol Biol Cell. Vol. 14, p. 764-773.

220. Velasquez J., Sonoda S., Bugaisky J., Lindquist S. Is the major Drosophila heat shock proteins present in cell that have not been heat shocked? 1983. J. Cell. Biol. 1983. Vol.96, p. 286-290.

221. Vgontzas AN, Bixler EO, Lin HM, Prolo P, Trakada G, Chrousos GP. IL-6 and its circadian secretion in humans. 2005. Neuroimmunomodulation. Vol. 12, p. 131-40.

222. Virginia L., Vega, and Antonio De Maio. Geldanamycin treatment ameliorates the response to LPS in murine macrophages by decreasing CD 14 surfase expression. 2003. Molecular Biology of the cell.Vol.14, p. 764-773.

223. Wajant H, Pfizenmaier K, Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling. 2003. Cell Death Differ. Vol.10, p. 45-65.

224. Waldmann TA. The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design. 2006. Nat Rev Immunol. Vol.6, p. 595-601.

225. Waldmann T.A., C.K.Goldman, RJ.Robb. Expression of interleukin-2 receptors on activated human B-cells. 1984. J. Exp. Med. 1984. Vol. 160, p. 1450-1466.

226. Walter S, Buchner J. Molecular chaperones—cellular machines for protein folding. 2002. Angew Chem Int Ed Engl. Vol. 41, p.1098-113.

227. Wang, C.-Y., M. W. Mayo, R. G. Korneluk, D. V. Goeddel, and A. S. Baldwin. NF-kB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAPl and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation. 1998. Science. Vol. 281, p. 1680-1683.

228. Ware B.L., Matthay M.A. The acute respiratory distress syndrome. 2000. N Engl J Med. Vol. 342, p. 1334-1349.

229. Wegele H, Miiller L, Buchner J. Hsp70 and Hsp90—a relay team for protein folding. 2004. Rev Physiol Biochem Pharmacol. Vol.151, p. 1-44.

230. Whitesell, L., Sutphin, P., An, W. G., Schulte, T., Blagosklonny, M. V., and Neckers, L. Geldanamycin-stimulated destabilization of mutated p53 is mediated by the proteasome in vivo. 1997. Oncogene. Vol. 14, p. 28092816.

231. Wullaert, A., Heynick, K., Beyaert, R. Mechanisms of creactive oxygen speciesstalk between TNF-induced NF-kappaB and JNK activation in hepatocytes. 2006. Biochem. Pharmacol. Vol.72, p. 1090-1101.

232. Wysocki L.J. and Sato V.L. "Panning" for lymphocytes: a method for cell selection. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 75, p. 2844-2848.

233. Yokoyama, T., L. Vaca, R. D. Rossen, W. Durante, P. Hazarika, and D. L. Mann. Cellular basis for the negative inotropic effects of tumor necrosis factor-a in the adult mammalian cardiac myocyte. 1993. J. Clin. Invest. Vol. 92, p. 2303-2312.

234. Young AJ, Lowe GM. Antioxidant and prooxidant properties of carotenoids. 2001. Arch Biochem Biophys. Vol. 385, p. 20-7.

235. Young JC, Moarefl I, Hartl FU. Hsp90: a specialized but essential protein-folding tool. 2001. J Cell Biol. Vol. 154, p. 267-273.

236. Zhang G., Ghosh S. Molecular mechanisms of NF-kappaB activation induced by bacterial lipopolysaccharide through Toll-like receptors. 2000. J. Endotoxin Res. Vol. 6, p. 453-457.

237. Zhang, H., Spapen, H., Nguyen, D.N., Benlabem, M., Buurman, W.A., Vincent, J.L. Protective effects of N-acetyl-l-cysteine in endotixaemia. 1994. Am. J. Physiol. Vol. 266, p. 1746-1754.

238. Zimmerman JJ. Defining the role of oxyradicals in the pathogenesis of sepsis. 1995. Crit Care Med. Vol. 23, p. 616-17.

Информация о работе

Новоселова, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль белков теплового шока и сигнальных белков в регуляции провоспалительного ответа у мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы