Сравнительное исследование эффектов токсинов разной природы на стрессовый ответ лимфоидных клеток: роль некоторых каскадов внутриклеточной сигнализации

Парфенюк, Светлана Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное исследование эффектов токсинов разной природы на стрессовый ответ лимфоидных клеток: роль некоторых каскадов внутриклеточной сигнализации
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование эффектов токсинов разной природы на стрессовый ответ лимфоидных клеток: роль некоторых каскадов внутриклеточной сигнализации"

4843862

(

Парфснюк Светлана Борисовна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТОВ ТОКСИНОВ РАЗНОЙ ПРИРОДЫ НА СТРЕССОВЫЙ ОТВЕТ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК. РОЛЬ НЕКОТОРЫХ КАСКАДОВ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ

Биохимия 03.00.04

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 /> ДПР 2011

ПУЩИНО 2011

4843862

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Новоселова Елена Григорьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Гордон Рита Яковлевна

кандидат биологических наук, Ушакова Татьяна Евгеньевна

Ведущая организация - Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «21 » апреля 2011 года в 14 ч. 00 мин на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН.

Автореферат разослан « марта 2011 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Исследование механизмов адаптации организма к действию токсических агентов является важной фундаментальной проблемой, которая имеет отношение как к вопросам экологической безопасности, так и клинической медицины. Известны некоторые молекулярно-клеточные механизмы, связанные с каскадом реакций, инициированных токсинами грамотрицательных бактерий и представляющие собой систему врожденной антимикробной резистентности. Между тем, механизмы действия низкоинтенсивных химических агентов, широко распространенных в сфере существования биологических систем, до сих пор остаются почти неизученными.

Несмотря на то, что исследования эффектов бактериальных токсинов проводятся достаточно активно, до сих пор имеются проблемы, связанные с септическими воспалениями у человека, вызывающими высокий процент случаев гибели пациентов. Достаточно отметить, что уровень смертности пациентов в результате воспалений септической природы позволил включить сепсис в пятерку важнейших социально-значимых заболеваний. Большинство исследований по выявлению механизмов взаимодействия бактериальных токсинов с живыми системами выполнены с использованием трансформированных клеток (Nishina et. al., 2004, Li et.al., 2010), у которых чувствительность к патогенам значительно отличается от той, что свойственна нормальным животным клеткам. Кроме того, наибольшее количество работ, посвященных этим проблемам, выполнено с использованием клеточных моделей in vitro. С учетом перечисленных обстоятельств, представляется актуальным исследование новых закономерностей возникновения и развития септических состояний с использованием более адекватных животных моделей.

Очевидно, что изучение механизмов ответа клетки на бактериальные и химические токсины целесообразно проводить с учетом современных представлений о роли различных каскадов внутриклеточной сигнализации в формировании резистентности клеток к повреждающим агентам. Действительно, имеется большой пробел в изучении роли белков сигнальных

каскадов в формировании ответов организма на действие повреждающих факторов сверхслабой интенсивности, которые, тем не менее, присутствуют в сфере деятельности человека. Среди этих каскадов в первую очередь, следует исследовать путь активации NF-кВ, а также стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK, которая активируется многими типами экстраклеточных сигналов (Wada et al., 2004). Кроме того, актуально исследовать пути активации рецептора TLR4, ответственного за связывание эндотоксина с клеткой-мишенью, и выяснить степень его участия при формировании ответа клетки на действие химических сигналов. Наконец, очень важно провести поиск подходов для снижения последствий действия токсических факторов на клетку. В этом плане представляется актуальным исследование закономерностей функционирования защитных систем клетки с оценкой общего состояния цитокиновой сети (продукция про- и антивоспалительных цитокинов), уровень экспрессии белков теплового шока БТШ70 и БТШ90, продукцию оксида азота и уровень активации каскадов сигнальной трансдукции NF-кВ, SAPK/JNK и рецептора TLR4 при действии модифицирующих факторов, включая иммуномодуляторы и ингибиторы отдельных участков путей сигнализации.

Цели и основные задачи:

Целью данной работы было сравнительное исследование эффектов in vivo и in

vitro эндотоксина (ЛПС) и ряда химических токсинов в предельно допустимой концентрации (аммиак, уксусная кислота и диэтиловый эфир) на ключевые звенья клеточного иммунитета. Кроме того, актуальным было изучение способов модуляции уровня резистентности животных и рецепторной чувствительности клеток к действию токсинов разной природы и поиск методов, снижающих чувствительность клеток к ЛПС и к химическим токсинам. Поскольку клетки иммунной системы очень быстро формируют ответ на внешние сигналы, в качестве главного объекта исследования были использованы макрофаги и лимфоциты животных, а также макрофагальные клетки RAW 264.7. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать роль некоторых цитокинов: фактора некроза опухолей (ФНО-а), интерферона-у (ИФН-у), интерлейкина-1а (ИЛ-1а), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-3 (ИЛ-3), интерлейкина-6 (ИЛ-6), интерлейкина-10 (ИЛ-10), а также белков теплового шока БТШ72 и БТШ90, оксида азота в защитной реакции животных клеток и целого организма в условиях токсического стресса, индуцированного эндотоксином или химическими агентами в предельно допустимых концентрациях. Провести сравнительную оценку степени активации сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и экспрессии рецептора TLR4 при действии in vivo и in vitro бактериального и химических токсинов.

2. Учитывая развитие окислительного стресса при токсическом воздействии, использовать комплекс липорастворимых природных антиоксидантов, способных снизить продукцию активных форм кислорода в клетках животных. Исследовать защитный потенциал антиоксидантов путем оценки уровня продукции белка теплового шока БТШ72, а также уровней активации двух сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK в клетках мышей.

3. Изучить закономерности воздействия in vitro (на клетках RAW 264.7) ряда ингибиторов активации сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и рецептора TLR4 на уровень провоспалительного ответа клетки в условиях действия ЛПС и химических токсинов путем оценки продукции цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-у), белков теплового шока БТШ72 и БТШ90, а также оценить эффект снижения активации сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и экспрессии рецептора TLR4.

Научная новизна. С использованием животных моделей in vitro и in vivo было установлено, что химические вещества в предельно допустимой концентрации способны вызывать активацию сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK, а также стрессовый ответ лимфоидных клеток, сопровождающийся увеличением продукции провоспалительных цитокинов, оксида азота и белков теплового шока HSP70 и HSP90. При этом доказано, что эндотоксин в оптимально действующей концентрации и аммиак в предельно допустимой концентрации вызывают сопоставимые по уровню стрессовые ответы в лимфоцитах и макрофагах мышей. Впервые установлено, что диета, обогащенная липорастворимыми антиоксидантами (а-токоферол, p-каротин и кофермент Q9) снижает токсические эффекты ЛПС и аммиака, уменьшая пики продукции белков теплового шока, а также подавляет активацию каскадов NF-кВ и SAPK/JNK. С использованием линии макрофагальных клеток RAW 264.7 было показано, что эндотоксин и аммиак в предельно допустимой концентрации стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов, рецептора TLR4, а также вызывают активацию каскадов сигнальной трансдукции NF-кВ и SAPK/JNK. Несмотря на схожесть эффектов, вызванных аммиаком и эндотоксином, ингибиторный анализ выявил различие механизмов формирования стрессового ответа на токсины разной природы.

Научно-практическая ценность. В работе содержатся новые сведения о механизмах стрессового ответа, индуцированного токсинами различной природы. Результаты исследования указывают на перспективу использования ингибиторов сигнальных каскадов при разработке новых препаратов для лечения острых и хронических воспалений. В работе получены результаты,

указывающие на возможность применения профилактических подходов для снижения риска развития тяжелых септических состояний. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции молодых ученых и III школе им. академика Н.М. Эмануэля, (Москва, 2008), на конференциях и семинарах по Программе "Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2008, 2009, 2010), на 13-й и 14-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА (Пущино, 2009, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 листах машинописного текста и содержит 36 рисунков. Библиографический указатель содержит 250 источников литературы.

Список сокращений ЛПС - липополисахарид, TLR -сигнальный toll-like (toll-подобный) рецептор, ФИО - фактор некроза опухолей, ИФН - у - интерферон -гамма, ИЛ - интерлейкины, АО - антиоксиданты, HSP — белки теплового шока, NF-kB - ядерный фактор кВ, phNF-кВ - фосфорилированная форма NF-kB, 1кВа - nuclear factor of kappa - ингибиторный 1кВ-белок, IKK - 1кВ киназа, SAPK/JNK - стресс-активируемая протеинкиназа.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Животные и модели. В экспериментах использовали половозрелых мышей-самцов аутбредного стока NMRI, весом 20-25 г и мышей-самцов Balb/c. Острое воспаление вызывали однократным введением внутрибрюшинно 2,5 мг/кг липополисахарида (ЛПС) из Escherihia coli (Serotype 026.В6, Sigma, США). После инъекции ЛПС ни одно животное не погибло во время экспериментов. Контролем служили животные, получающие внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора. Для создания модели химического загрязнения атмосферы мыши содержались в герметичной камере из оргстекла (размером 0,48 м3) при температуре 21-22°С и нормальном освещении в течение 60 мин в присутствии химических токсинов. Токсические вещества добавляли в следующих концентрациях: аммиак - 20 мг/м3, диэтиловый эфир 300 мг/м3, уксусная кислота 5 мг/м3. В экспериментах in vitro химические вещества добавлялись непосредственно в среду культивирования лимфоидных клеток : аммиак в виде гидроксида аммония - 1,5 мг/л, диэтиловый эфир - 0,3 мг/л, уксусная кислота - 0,1 мг/л. Диета, обогащенная антиоксидантами, содержала: убихинон Q9 - 8 мг, ß-каротин - 2 мг, а-токоферол - 2 мг на кг веса животных, которые получали ее ежедневно в течение 15 дней. Для исследования влияния ингибиторов сигнальных путей на клетки макрофагальной линии RAW 264.7 использовали: ОхРАРС (ингибитор TLR2 и TLR4), рабочая концентрация 30 мкг/мл, CLI-095 также известный как ТАК-242 (ингибитор TLR4 сигнализации), рабочая концентрация 1 мкг/мл, SP600125 (JNK ингибитор),

рабочая концентрация 2,2 мг/мл, IKK Inhibitor XII, рабочая концентрация 0,11 мг/мл.

Функциональная активность клеток. Продукцию оксида азота измеряли по концентрации нитритов, являющихся конечным продуктом метаболизма N0, с использованием реактива Грисса (Green et al., 1982). Измерение концентрации цитокинов в сыворотке крови, а также продукцию цитокинов перитонеальными фагоцитами, лимфоцитами селезенки и клетками RAW 264.7 измеряли методом иммунофсрментного анализа с использованием наборов антител (Murine ELISA Development Kits, PeproTech ЕС, Великобритания) для каждого из цитокинов (ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-10, ИЛ-6, ИФН-у, ИЛ-1а). Измерение продукции белков теплового шока и сигнальных белков каскадов NF-кВ и SAPK/JNK проводили с помощью Вестерн блот анализа, с использованием следующих кроличьих первичных антител: HSP70 (HSP 72, клон SPA-812, StressGen Biotechnologies, индуцибельная форма);ШР 90 (HSP 90а, клон SPA-828, StressGen Biotechnologies) или к одному из белков сигнальной трансдукции: NF-кВ (NF-кВ р65, Cell Signaling); ph-NF-kB (ph-NF-kB р65, Cell Signaling); ph-IKK (ph-IKKct/ß(Ser 176/180), Cell Signaling); ph-SAPK/JNK (ph-SAPK/JNK (Thrl83/Tyrl85), Cell Signaling); Toll-like Receptor 4 (Toll-like receptor 4, Cell Signaling) В качестве вторичных антител использовали козьи IgG к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные биотином (StessGen, Канада) и комплекс, содержащий стрептавидин и пероксидазу хрена (Sigma, США). Для выявления белков использовали систему ECL (Amersham, Швеция). Количественную оценку проводили с использованием программы Qapa. Статистическую обработку проводили с использованием пакета прикладных статистических программ Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО ВОСПАЛЕНИЯ, ВЫЗВАННОГО ЭНДОТОКСИНОМ, НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК А) Продукция цитокинов и оксида азота. На первом этапе исследовали

эффекты бактериального токсина, который вводили внутрибрюшинно мышам

NMRI. На рисунках 1 и 2 представлены результаты измерений показателей

иммунного статуса животных в условиях острого воспаления, индуцированного

введением ЛПС. Введение ЛПС (2,5 мг/кг) вызывает увеличение продукции ИЛ-

3 и некоторое повышение продукции ИФН-у в лимфоцитах селезенки мышей

(Рис. 1А). В этих условиях происходит резкое увеличение продукции ФНО-а и

оксида азота в макрофагах (Рис. 1Б). Активация цитокин-продуцирующей

функции лимфоидных клеток и связанная с этим усиленная секреция цитокинов

должна была привести к увеличению концентрации цитокинов в крови при

введении ЛПС. Действительно, в крови наблюдали увеличение концентрации

почти всех исследованных цитокинов, за исключением ИЛ-3. Наиболее заметное накопление в крови показано для ФНО-а и ИЛ-2 (Рис. 2).

200

с о i *

О- ян

о а*

ИЛ-2 ИЛ-3 ИФН-д

А)

«0

5 300

5210

35100 *

ФНО-а ИЛ-6 N0

Б)

Рис. 1. Продукция цитокинов при введении ЛПС. А- продукция цитокинов лимфоцитами селезенки, Б- продукция цитокинов и оксида азота перитонеальными макрофагами.

*-достоверное отличие от контроля, р<0,05, п=3.

Рис. 2. Концентрация цитокинов в плазме крови при введении ЛПС.

*-достоверное отличие от контроля, р<0,05, п=3.

Б) Продукция белков теплового шока при введении эндотоксина

На следующем этапе работы определяли влияние острой интоксикации in vivo на экспрессию стрессовых белков, а именно HSP72 и HSP90. Было показано, что при остром воспалении уровень экспрессии белка теплового шока 72 увеличивается примерно в 1,5 раза, тогда как экспрессия белка теплового шока 90 увеличивается почти в 2,5 раза (Рис. 3).

к лпс

...... ..

HSP72

HSP90

100

158

100 123&I

Рис. 3. Продукция белков теплового шока при введении ЛПС in vivo

К-контроль. Цифры под фото — относительная концентрация белка в процентах от контроля. Данные обработаны с использованием программы Qapa.

Таким образом, результаты настоящей работы позволили выявить некоторые неизвестные раннее закономерности ответов клеток при остром воздействии эндотоксина на целый организм. Среди всех исследованных продуктов иммунокомпетентных клеток основными мессенджерами, участвующими в ответах на эндотоксин, являются ФНО-а и оксид азота, продукция которых возрастает примерно в 3 раза. Как и следовало ожидать, острое воспаление вызывало заметное накопление цитокинов в крови, что отражает наличие системного воспалительного процесса в организме мышей. Проведенное исследование позволило обнаружить факт участия белка теплового шока HSP90 в ответе организма на эндотоксин. То обстоятельство, что при действии ЛПС происходит увеличение продукции HSP90, указывает на вероятность включения некоторых сигнальных белков в патогенез эндотоксического стресса. В) Влияние эндотоксина на фосфорилирование сигнальных белков Сигнальные каскады NF-кВ и SAPK/JNK играют существенную роль в регуляции многих метаболических процессов в клетке. Необходимой стадией активации этих сигнальных каскадов является фосфорилирование белков NF-kB и SAPK/JNK, поскольку, например, NF-кВ проникает в ядро только после фосфорилирования. На Рис. 4 показано, что при введении ЛПС наблюдается увеличение продукции phNF-кВ примерно в 1,5 раза, что свидетельствует об активации данного сигнального каскада.

к лпс

лпс

phNF-кВ

100

146

з> - ph-SAPK/

JNK

100 257

tubulin

^ .....: ::

tubulin

Рис. 4. Продукция phNF-kB и phSAPK/JNK при введении ЛПС in vivo

К-контроль. Цифры под фото - относительная концентрация белка в процентах от контроля. Данные обработаны с использованием программы Qapa.

Увеличение продукции phSAPK/JNK также показано на Рис. 4, причем в присутствии ЛПС активность этого сигнального каскада увеличивалась более, чем в 2,5 раза. Известно, что активация SAPK/JNK может происходить под действием множества типов клеточных стрессов и экстраклеточных сигналов. Интересным является тот факт, что обнаруженное увеличение содержания фосфорилированной формы SAPK/JNK в клетках, было весьма значительным. Это согласуется с результатами предыдущих исследований, согласно которым SAPK/ЖК-сигнальный каскад может функционировать по принципу «все или ничего», многократно усиливая внешний сигнал (Bagowski et al., 2003).

ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ

В соответствии с поставленными целями на втором этапе исследования изучали влияние химических токсинов в низкой концентрации на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. В экспериментах использовались токсины с предельно-допустимыми концентрациями, поэтому, строго говоря, эти воздействия априори не могут рассматриваться как повреждающие. В экспериментах in vivo загрязняющие вещества содержались в атмосфере, в которой находились животные, а в экспериментах in vitro исследуемые вещества добавлялись непосредственно в среду культивирования клеток.

А) Влияние химических токсинов in vivo

Цитокины В экспериментах in vivo было показано, что присутствие примеси аммиака в атмосфере в той или иной степени вызывает увеличение

КЛЕТОК

концентрации всех исследованных цитокинов в плазме крови животных. Следует отметить, что самый заметный эффект был выявлен для ФНО-а и ИЛ-2, на продукцию других цитокинов присутствие аммиака оказывало не столь существенного влияния (Рис. 5). Присутствие в атмосфере низких концентраций диэтилового эфира и уксусной кислоты приводило к незначительным изменениям содержания цитокинов в плазме, при этом наблюдали как тенденцию к их увеличению (ФНО-а, ИЛ-2 ИФН-у), так и к уменьшению (ИЛ-6, ИЛ-1а).

300

ФНО ИЛ-6 ИЛ-10 ИЛ-2 ИФН ИЛИ a ■ аммиак И диэтиловый эфир □ уксусная кислота

Рис. 5 Влияние низких концентраций химических веществ на концентрацию цитокинов в плазме мышей

Измерения проводили через 6 час после воздействия. Контроль — животные, содержащиеся в герметичной камере в течение 1 часа без добавления химических веществ. Каждое значение есть среднее от 3-х независимых экспериментов, все измерения проводили индивидуально для каждого животного в 6-ти повторах. *-достоверное отличие от контроля, р<0,05; ** - достоверное отличие от контроля, р<0,01.

Экспрессия белков теплового шока ÍHSP72 и HSP90-a) и активность каскадов NF-кВ и SAPK/JNK в экспериментах in vivo

При использовании Вестерн блот анализа было показано увеличение

продукции HSP72 при воздействии всех трех химических веществ, особенно

заметный эффект наблюдали после экспозиции животных в присутствии

диэтилового эфира. Продукция HSP90-a в присутствии атмосферных примесей

эфира и уксусной кислоты была также увеличена, а наличие примесей аммиака

не влияло на экспрессию этого белка в клетках животных (Рис. 6).

! - з 4 5 1 2 3 4.5

; Шит- - HSP72 + щш** ~ HSP90

100 158 131 100 136 100 147 134 100 102

Рис. 6. Экспрессия HSP72 и HSP90 в лимфоцитах селезенки мышей при воздействии химических веществ in vivo.

1 - контроль, 2 - диэтиловый эфир, 3 - уксусная кислота, 4 - контроль для аммиака, 5 — аммиак. Цифры под фото - относительная концентрация белка в процентах от контроля. Данные обработаны с использованием программы Qapa.

На Рис. 7 показаны результаты исследования экспрессии белков двух сигнальных каскадов, NF-кВ и SAPK/JNK, а также приведены данные по экспрессии рецептора TLR4, ответственного за связывание бактериальных токсинов с клеткой.

1 2 3 4 S 1 2 3 4 5

— ■ m .у» Щтшт —«•» Штт ph-SAPK/ JNK

100 168 168 100 129 100 206 153 100 154

12 3 4 S 1 2 3 4 5

100 171 210 100 ФШ» phNF-kB 121 100 * .щ 99 * 103 J00Í 100 M »M 133 TLR4

1 2 3 4 5

Щ$т цтт тят шит «Ив ph-IKK **"* *......11 '*■"* Ч**» tubulin

100 77 107 100 199

Рис. 7. Экспрессия белков каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и рецепторного белка TLR4 в лимфоцитах мышей при воздействии химических веществ in vivo 1 - контроль, 2 — диэтиловый эфир, 3 - уксусная кислота, 4 - контроль для аммиака, 5 — аммиак. Цифры под фото - относительная концентрация белка в процентах от контроля. Данные обработаны с использованием программы Оара.

Результаты показали, что присутствие в атмосфере каждого из трех

использованных химических веществ приводило к активации каскада NF-kB.

Действительно, все атмосферные примеси вызывали повышение содержания

неактивного димера NF-кВ в клетке, но, что еще важнее, стимулировали

фосфорилирование белка Reí А (панель phNF-кВ), а аммиак повышал

фосфорилирование IKK специфической киназы, классического пути активации

этого сигнального каскада. С другой стороны, повышение экспрессии

фосфорилированной формы SAPK/JNK было показано в том случае, когда в

атмосфере находились примеси аммиака, эфира и уксусной кислоты (Рис. 7).

Что же касается рецепторного белка TLR4, то его экспрессия изменялась только

при добавлении в атмосферу одного из трех веществ, а именно, аммиака.

Влияние химических токсинов на функциональную активность клеток /и vi'/ro

Цитокины in vitro На Рис. 8 А приведены результаты измерения продукции ФНО-а, ИЛ-6 и ИЛ-10 перитонеальными макрофагами мышей, культивируемыми в присутствии аммиака, диэтилового эфира и уксусной кислоты.

Макрофаги

Лимфоциты селезенки

Рис.8. Влияние in vitro низких концентраций химических веществ на продукцию цитокинов. А - продукция цитокинов макрофагами, Б - продукция цитокинов лимфоцитами селезенки

Контроль - клетки, культивированные без добавления химических веществ. Каждое значение есть среднее от 3-х независимых экспериментов, все измерения проводили индивидуально для каждого животного в 6-ти повторах. * - достоверное отличие от контроля, р<0,05; ** - достоверное отличие от контроля, р<0,01.

Добавление химических веществ в среду культивирования клеток приводило к увеличению продукции ФНО-а. При этом присутствие аммиака и диэтилового эфира в среде увеличивало продукцию ФНО-а почти в три раза, тогда как добавление уксусной кислоты стимулировало его синтез в меньшей степени. Концентрация ИЛ-6 и ИЛ-10, в отличие от ФНО-а, изменялась не столь значительно, при добавлении эфира и уксусной кислоты наблюдали снижение образования ИЛ-6, а синтез ИЛ-10 заметно увеличивался только в присутствии уксусной кислоты.

Другая популяция клеток, продуцирующих цитокины, лимфоциты селезенки, была менее чувствительна к действию токсических веществ. На Рис. 8Б

приведены результаты измерения продукции ИФН-у, ИЛ-2 и ИЛ-10. Из трех

измеренных цитокинов только для ИФН-у наблюдали стимуляцию продукции в

присутствии аммиака и диэтилового эфира. Не было обнаружено заметных

изменений продукции ИЛ-2 и ИЛ-10 в лимфоцитах, культивируемых в

присутствии низких концентраций всех используемых токсинов.

Экспрессия белков теплового шока (HSP72 и HSP90-a) и активность каскадов NF-кВ и SAPK/JNK в экспериментах in vitro

Эффекты низких концентраций токсинов, добавленных в среду

культивирования клеток, были следующими: продукция стрессового белка

HSP72 повышалась в присутствии аммиака и уксусной кислоты и не отличалась

от контрольного уровня при воздействии диэтилового эфира. Стимуляция

экспрессии HSP90-a была показана только в присутствии аммиака (Рис. 9).

1234 1 2 3 4

«—«И¡*mw» -ww>:4iMt':HSP72 wmm —w» HSP90

100 180 51 117 100 166 66 114

Рис. 9. Экспрессия HSP72 и HSP90 в спленоцитах при воздействии химических веществ in vitro.

1 - контроль; 2 - аммиак, 3 - диэтиловый эфир, 4 - уксусная кислота.

Цифры под фото - относительная концентрация белка в процентах от контроля.

Интересно, что аммиак вызывал активацию каскада NF-кВ и не влиял на каскад

SAPKAINK (Рис. 10), хотя при воздействии in vivo было показано его

стимулирующие действие на оба сигнальных каскада. Напротив, диэтиловый

эфир in vitro вызывал активацию каскада SAPK/JNK, но не NF-кВ. С другой

стороны, добавление уксусной кислоты к изолированным клеткам приводило к

активации как каскада NF-кВ, так и SAPK/JNK, что совпадало с эффектами

уксусной кислоты при ее воздействии на целый организм. Самое большое

отличие эффектов химических токсинов при сравнении их воздействия на

изолированные клетки и на целый организм было обнаружено при измерении

экспрессии рецепторного белка TLR4. Действительно, в условиях in vitro его

экспрессия увеличивалась примерно в пять раз при добавлении к клеткам

низких концентраций аммиака и уксусной кислоты, и примерно в два раза при

добавлении диэтилового эфира (Рис. 10).

В целом можно отметить, что воздействие низких концентраций химических

1 2 3 4 1 2 3 4

Щ**тю ..............О NF-kB Ж: МЩг llNiiipilS: МММНММ». ph-SAPK/

JNK

100 233 109 148 100 71 136 180

1 2 3 4 1 2 3 4 «■«•* я.......... -mil— .........—. phNF-kB *"*"*' "iiluJ- тшг'Щ TLR4

100 180 100 109 100 491 184 487

1 2 3 4

•и».—' <■—• ph-IKK

tubulin

100 205 80 131

Рис. 10. Экспрессия белков каскадов NF-кВ и SAPK/JNK и рецепторного белка TLR4 в спленоцитах при воздействии химических веществ in vitro . I-контроль, 2-аммиак, 3-диэтшовый эфир, 4-уксусная кислота. Цифры под фото -относительная концентрация белка в процентах от контроля. Данные обработаны с использованием программы Qapa.

токсинов не вызывало драматических изменений цигокинового профиля, хотя во всех случаях была отмечена достоверная стимуляция продукции ФНО-а. Сравнивая эффективность воздействия трех используемых веществ на продукцию цитокинов, их можно расположить в следующем порядке по уменьшению оказываемого действия: аммиак > диэтиловый эфир > уксусная кислота. Учитывая уровни активации продукции цитокинов и белков теплового шока, можно сделать вывод о том, что из всех использованных токсинов именно аммиак вызывает наиболее заметный стрессовый ответ - как на уровне клетки, так и на уровне всего организма. Интересно, что такую же закономерность наблюдали в отношении белков сигнального каскада NF-кВ. В этих же условиях была показана и активация фосфорилирования стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK, что указывает на участие этого каскада в стрессовом ответе клетки на действие низких концентраций химических токсинов. Итак, мы впервые показали, что химические вещества в сверхнизкой концентрации способны вызывать стрессовый ответ лимфоидных клеток, сопровождающийся увеличением продукции провоспалительных цитокинов, оксида азота, а также белков теплового шока и сигнальных белков.

ЗАЩИТНЫЕ СВОЙСТВА ЛИПОРАСТВОРИМЫХ АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА И ХИМИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ В НИЗКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ

Считается доказанным, что воспаление, индуцированное бактериальным

токсином, вызывает окислительный стресс. Окислительный стресс способен

вызвать целый ряд патологических нарушений иммунной системы, клетки

которой нуждаются в определенном уровне антиоксидантов для того, чтобы

нейтрализовать избыточную концентрацию активных форм кислорода, и в этих

условиях добавление экзогенных продуктов может быть полезным. В работе

использовали комплекс липорастворимых антиоксидантов: а-токоферол, Р-

каротин и коэнзим Qg, которые добавляли в пищу животных.

А) Влияние антиоксидантов на активацию сигнальных каскадов в условиях токсического стресса

к ЯК АО П1К+А0 к АО ЛПС ЛПС*АО

■: ¡го ! 546 58

— '^^■■'■--r'.r; ШШШШШт

К ЛПС AO ЛПС+А0

■Bni * p

100 257 85 143

-»ill 1Г~ IDWI Willi»' .III ""in.....• ЩИШШ' ШЯШИЯШШвШИШШШШВш»

phNF-tcB

tubulin

¡ps*** •mm ph-IKK 600 200

тят* tubulin

pmawo К до ЛПС ЛПС+А0

Ш&.,.. liirif щ&шШк тШШк riSp /i

ШШшЩ*- ЩЩШШ^^ <

100 94 2Q5 78 tubulin «■**« —Mm tubulin

Рис. 11. Влияние диеты, обогащенной антиоксидантами на экспрессию фосфорилированных форм белка NF-кВ, IKKa/(3, SAPK/JNK, и продукцию белка теплового шока 72.

К-контролъ, АО-диета с антиоксидантами, ЛПС-острое воспаление, ЛПС+АО- острое воспаление на фоне диеты с антиоксидантами. Цифры под фото - относительная концентрация белка в процентах от контроля. Данные обработаны с использованием программы Qapa.

Для того чтобы выяснить возможные механизмы защитного эффекта антиоксидантов, активность сигнальных каскадов, NF-кВ и SAPK/JNK, оценивалась путем измерения содержания фосфорилированных форм этих белков. Результаты показали, что диета с АО предотвращает активацию фосфорилирования NF-кВ в клетках у мышей, которым вводили ЛПС (Рис. 11).

Была проведена оценка другой независимой стадии активации NF-кВ через 1кВ киназу (IKK), которая обеспечивает фосфорилирование ингибиторных молекул, включая 1кВа/(3. Применение диеты подтвердило способность антиоксидантов снижать активацию каскада NF-кВ в условиях острого токсического стресса, вызванного ЛПС. На Рис. 11 показана также продукция ph-SAPK/JNK в лимфоцитах селезенки мышей 4-х экспериментальных групп. При этом обнаружили эффект диеты, подобный тому, что наблюдали в отношении транскрипционного фактора NF-кВ. Из данных, показанных на Рис. 11, видно, что предварительная диета с антиоксидантами достоверно снижала также и продукцию белка теплового шока 72, уменьшая, таким образом, токсическое действие ЛПС на клетки мышей.

На следующем этапе работы мы провели серию экспериментов для того, чтобы выяснить, оказывают ли антиоксиданты защитное действие на организм мышей в неблагоприятных условиях загрязнения атмосферы, и на какие именно системы стрессового ответа будет распространяться их протекторное действие.

Ам Дм+АО К АО Ам Ам+АО

tmern щphNF-kB

100 74 181 3S

ph-SAPK I JNK

100 1017 258

К АО Ам Ам+АО

100 106 130 103 |иЬиПп

Рис. 12. Влияние диеты с антиоксидантами на экспрессию фосфорилированной формы ОТ-кВ, ЗАРК/ЛЧК и продукцию рецепторного белка ТЬЯ4.

К-контроль, АО-диета с антиоксидантами, А-аммиак, А+АО- влияние аммиака на фоне диеты с антиоксидантами. Цифры под фото - относительная концентрация белка в процентах от контроля. Данные обработаны с использованием программы <2ара.

Нами были получены следующие результаты: в клетках животных, подвергнутых воздействию загрязненной атмосферы, выявили эффекты, сходные с таковыми, обнаруженными при моделировании острого токсического стресса, вызванного введением ЛПС. Диета с антиоксидантами полностью предотвращала эффекты аммиака,' снижая уровень фосфорилирования

транскрипционного фактора NF-кВ. Что же касается действия диеты с антиоксидантами на продукцию фосфорилированной SAPK/JNK в лимфоцитах селезенки, то в этом случае было показано, что предварительная диета с антиоксидантами снижает эффект токсического воздействия аммиака. Кроме этого, диета с антиоксидантами снижала экспрессию рецепторного белка TLR4, продукция которого была повышена при воздействии аммиака.

РОЛЬ ИНГИБИТОРОВ СИГНАЛЬНЫХ КАСКАДОВ В ОТВЕТЕ КЛЕТОК RAW 264.7 НА ДЕЙСТВИЕ ТОКСИНОВ РАЗНОЙ ПРИРОДЫ

В последнее время в мировой литературе стали появляться работы, направленные на поиски природных и синтетических ингибиторов различных сигнальных путей. Очевидно, что они представляют большой интерес, как возможные терапевтические агенты, способные снижать уровень токсических реакций при различных патологиях.

А) Влияние ингибиторов сигнальных путей на продукцию цитокинов клетками макрофагальной линии RA W264.7

Все эксперименты по исследованию влияния ингибиторов в условиях

действия на клетку эндотоксина и химического токсина проводили в условиях in vitro. На Рис. 13 (панель А) представлены результаты измерения продукции ФНО-а и ИФН-у в присутствии ЛПС. При этом наблюдали ожидаемое увеличение продукции ФНО-а, a блокирование рецептора TLR4 с использованием CLI-095 вызывало достоверное снижение продукции ФНО-а, примерно в два раза. Интересно, что при использовании ингибитора ОхРАРС наблюдали почти полное блокирование продукции ФНО-а. Наиболее мощным ингибитором для эффектов, вызванных ЛПС, является SP600125, который подавляет активность каскада SAPK/JNK. Продукция ИФН-у клетками макрофагальной линии выражена гораздо слабее, но закономерности, выявленные для ФНО-а, сохраняются.

250 225 200

1 175

g 150

2 125 S ioo

* 75 50 25

нн •

("Т^Зг?^ • 1 - ' Lhm

-а-.- **

ФНО-а ИФН-д

□ ЛПС ■ Jinc+CLI-095 □ JinC+SP600125 □ ЛПС+IKK Inhibitor XII ВЛПС+ОхРАРС

Панель Б

350

300 | 250

| 200 = 150 100

НП-la ИЛ-10 ИЛ-6

_ПЛПС ■ nnCtCLI-095 □ nnc+SP600125 И ЛПС+IKK Inhibitor XII

Рис. 13. Влияние ингибиторов на продукцию цитокинов клетками RAW 264.7 при действии ЛПС. Панель А - продукция ФНО-а и ИФН-у , панель Б -продукция ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-10. * -р<0,05; ** - р<0,01, п=3.

Из результатов, приведенных Рис. 13 Б видно, что в ответ на введение ЛПС в среду культивирования клеток продукция анти-воспалительного цитокина ИЛ-10 снижается по сравнению с контрольными образцами, а добавление ингибиторов еще сильнее снижает его продукцию. Интересно, что наиболее сильным воздействием на продукцию ИЛ-10 и ИЛ-6 обладает ингибитор ОхРАРС. Что касается ИЛ-1а, то было показано резкое увеличение его продукции в присутствии ЛПС и снижение его продукции в присутствии ингибиторов, особенно ингибитора IKK Inhibitor XII. Интересно, что при добавлении ОхРАРС наблюдается увеличение продукции ИЛ-1а выше уровня, характерного для ответа на ЛПС.

350

зоо

1250 i 200 о

J 150

Д 100

50 0

ФНО-а

а аммиак ■ аммиак+Си-095

Оаммнак+iKK Inhibitor XII П амииакЮхРАРС

ИФН-д □ аммиак+5Р600125

Панель Б

225 200 5 175 8 150 Е 125 2 100 Б 75 * 50 25 0

1—

"»J *•

- ^ ** " " ** ** **

ИЛИ а

ИЛИ 0

Е аммиак ■ аммиак+Ш-095

□ аммиэк+IKK Inhibitor XII □ аммиак+ОхРАРС

ИЛ-6

□ аммиак+БР600125

Рис.14. Влияние ингибиторов на продукцию цитокинов клетками RAW 264.7 в условиях загрязнения примесями аммиака. Панель А - продукция ФНО-а и ИФН-у, панель Б-продукция ИЛ-la, ИЛ-6, ИЛ-10. *-р<0,05; **-р<0,01, п=3.

На Рис. 14 А приведены результаты исследования, которые показывают, что аммиак в предельно-допустимой концентрации вызывает резкое увеличение продукции ФНО-а и ИФН-у. При использовании ингибиторов IKK и JNK продукция этих цитокинов в клетках была подавлена. Интересно, что ингибитор рецептора TLR4 весьма незначительно снижает продукцию ФНО-а и ИФН-у, тогда как применение ОхРАРС снижает продукцию этих цитокинов до контрольного уровня. Добавление аммиака к клеткам не вызывало изменения продукции ИЛ-1а, хотя ингибиторы снижали его продукцию ниже контрольного уровня. Противовоспалительный цитокин ИЛ-10 в лизатах клеток был обнаружен в следовых концентрациях - как при действии аммиака, так и при воздействии ингибиторов в сочетании с аммиаком. Что же касается ИЛ-6,

то его продукция была повышена в условиях загрязнения аммиаком, при этом использование ингибитора TLR4 не только не снимало стимулируюшего действия аммиака, но, напротив, усиливало его. Остальные три ингибитора блокировали стимулирующее действие химического токсина на продукцию ИЛ-10. Интересно отметить следующую закономерность: в условиях острого токсического стресса, вызванным эндотоксином, наибольшим ингибирующим действием на клетки обладает ингибитор сигнального пути JNK, тогда как в условиях токсического действия аммиака в низкой концентрации наиболее выраженное защитное действие принадлежит ингибитору классического пути активации NF-kB.

Б) Экспрессия белков теплового шока, сигнальных белков и рецепторпого белка TLR4 в присутствии ингибиторов

Проведя исследование продукции цитокинов клетками макрофагалыгой

линии RAW 264.7 в присутствии ингибиторов сигнального пути TLR4, а также в условиях воздействия ЛПС и аммиака, и получив достоверные данные о защитной функции ингибиторов, далее определяли уровень экспрессии белков теплового шока. На Рис. 15 показано изменение продукции белка теплового шока 72 в клетках линии RAW 264.7, подвергнутых воздействию токсинов и ингибиторов. Результаты показали, что при добавлении в среду культивирования клеток бактериального токсина происходит увеличение продукции этого стрессового белка, причем ингибиторы TLR4, JNK и IKK снижали продукцию HSP72 до контрольного уровня. Добавление аммиака незначительно повышало продукцию белка, а используемые ингибиторы подавляли продукцию HSP72 до значений ниже контрольных. Результаты показали, что в условиях острого, токсического стресса наблюдается значительное повышение продукции HSP90-a - примерно в 2,5 раза. Это согласуется с данными о том, что ЛПС способен увеличивать продукцию HSP90 в спленоцитах мышей. Таким образом, нормальные клетки животных (Рис.3) и трансформированные клетки RAW 264.7 отвечают примерно одинаково. При этом все три исследованных ингибитора значительно снижали продукцию HSP90-a при токсическом стрессе, вызванном бактериальным токсином,

особенно эффективным был ингибитор JNK. Что касается влияния аммиака в предельно допустимой концентрации, то нами не было показано изменения продукции HSP90 клетками RAW 264.7. Интересно, что действие ингибитора рецептора TLR4 в сочетании с аммиаком увеличивает концентрацию HSP90 примерно в 1,5 раза, а с ингибитором IKK - почти в 2 раза, при этом ингибитор

каскада JNK не влиял на продукцию этого стрессового белка.

К : ЛПС Л+1 Л+2 Л+3 Ам Ам+1 Ам+2 Ам+3

I иЩШИ «мм» HSP72 I

100 175 65 24 94 117 62 71 50

к ЛПС Л + 1 Л+2 Л+3 Ам Ам+1 Ам+2 Ам+3

та-. - ««weir' - .............. ....... ни HSP оо I

100 247 128 83 167 97 167 Ю1 194 L

Рис. 15. Продукция HSP 72 и HSP 90 клетками RAW 264.7.

К-контролъ, ЛПС — добавление эндотоксина, Л+1- клетки с ЛПС, которые были прединкубированы с ингибитором CLI-095, Л+2- ЛПС+ингибитор SP600125, Л+3 - ЛПС+ ингибитор IKK inhibitor XII, AM -клетки, культивированные в среде с примесями аммиака в концентрации 1ПДК, АМ+1-клетки культивированные в среде с примесями аммиака в концентрации 1ПДК и прединкубированные с ингибитором CLI-095, AM+2-клетки культивированные в среде с примесями аммиака в концентрации 1ПДК и прединкубированные с ингибитором SP600125, АМ+З-клетки культивированные в среде с примесями аммиака в концентрации ШДК и прединкубированные с ингибитором IKK inhibitor XII.

На следующем этапе работы определяли уровень продукции сигнальных белков. Известно, что этап фосфорилирования NF-кВ является маркером активации сигнального каскада NF-кВ, и только phNF-кВ проникает в ядро для последующей транскрипции определенных генов, ответственных за

ph-NF-lcB

Установлено, что ЛПС вызывает более, чем двукратное повышение продукции рЬМР-кВ (Рис. 16). При подавлении активности рецептора Т1Ж4 ингибитором наблюдалось резкое снижение уровня экспрессии рКЫР-кВ, вплоть до I контрольного. Это обстоятельство подтверждает тот факт, что ингибирование

противовоспалительный ответ клетки.

К ЛПС Л+1 Л+2 Л+3 Ам Ам+1 Ам+2 Ам+3

№..1)МЦ

100 226 104 32 534 331 147 399 521

Рис.16. Продукция рЬОТ-кВ клетками 264.7. Все обозначения, как на Рис. 15.

начального этапа сигнализации на уровне TLR4 блокирует дальнейшую активацию всего сигнального пути NF-кВ. Интересно, что, используя ингибитор JNK, мы получили аналогичные результаты. Возможно, это связано с тем, что существующая связь между сигнальными каскадами SAPK/JNK и NF-kB затрагивает именно процесс фосфорилирования NF-kB. Неожиданными оказались результаты по применению ингибитора IKK, классического пути активации сигнального каскада NF-kB. Так, на Рис. 16 показано, что использование данного ингибитора не только не снижает продукцию phNF-кВ, но, напротив, вызывает почти пятикратное увеличение его продукции. Важно, что при воздействии аммиаком на макрофаги, обработанные ингибитором IKK, наблюдается такое же сильное увеличение продукции phNF-кВ. Аналогично действию ЛПС, аммиак повышает продукцию фосфорилированной формы NF-кВ, но в большей степени, нежели бактериальный токсин (Рис. 16). В этих условиях ингибитор TLR4 вызывал аналогичные эффекты, если сравнивать с его действием в присутствии бактериального токсина. Действительно, ингибитор TLR4 снижал почти до контрольного уровня продукцию phNF-кВ. В отличие от действия ингибитора JNK при токсическом стрессе, вызванном ЛПС, в присутствии аммиака этот ингибитор не снижал продукцию phNF-кВ, а увеличивал ее почти в четыре раза по сравнению с контролем (Рис. 16).

Важным звеном ответа клетки на стресс является каскад SAPK/JNK. На Рис. 17 представлены результаты работы по изучению роли токсинов различного происхождения на клетки макрофагальной линии RAW 264.7, культивируемые в разных условиях (в присутствии, либо в отсутствии токсинов и ингибиторов). Результаты показали, что при воздействии in vitro бактериальным токсином наблюдается резкое увеличение продукции SAPK/JNK. При этом происходит накопление обеих изоформ этого белка, р54 и р46. Кроме того, ингибиторы TLR4 и JNK полностью подавляют эту активацию. Ингибитор классического пути сигнализации NF-кВ, напротив, повышал продукцию изоформы р46 сигнального белка в условиях острого воспаления, и не обладал активирующей активностью в отношении изоформы р54.

ph-SAPK/JNK p 54

p46

SAPK/JNK К ЛПС Л+1 Л+2 Л+3 Ам Ам+1 Ам+2 Ам+3

Р 54 100 200 103 24 87 87 131 170 140

Р 46 100 500 100 100 644 738 413 1160 888

Рис. 17. Продукция SAPK/JNK клетками RAW 264.7.

Все обозначения, как на Рис. 15.

Результаты, полученные на макрофагальных клетках в условиях загрязнения среды культивирования примесями аммиака, представляют большой интерес. Так, показано, что присутствие аммиака увеличивает продукцию изоформы р46 SAPK/JNK более, чем в семь раз по сравнению с контрольным уровнем, хотя содержание изоформы р54 не изменяется (Рис. 17). Удивительно то, что специфический ингибитор JNK не снижал содержание обоих изоформ SAPK/JNK при действии аммиака. Напротив, использование ингибитора TLR4 почти в два раза уменьшало пик продукции р46 SAPK/JNK и не оказывало подобного воздействия на изоформу р54. Как и при действии ЛПС, ингибитор IKK в присутствие аммиака значительно усиливал продукцию стресс-активированной протеинкиназы JNK. При исследовании влияния ингибиторов сигнального пути TLR4 необходимо было определить уровень продукции самого рецепторного белка - как в условиях стресса, так и при воздействии специфических ингибиторов. В соответствии с полученными ранее на других клетках данными, обнаружили повышение продукции TLR4 при остром стрессе, вызванным ЛПС (Рис. 18). Напротив, все ингибиторы не только не снижали продукцию TLR4 при воздействии аммиаком, но резко ее увеличивали.

К ЛПС Л+1 Л+2 Л+3 Ам Ам+1 Ам+2 Ам+3

!*-*- ШЦИ ъафф ЧПШ' »»»» »■■ ■ИНИН' К >1|»

100 249 141 106 91 200 483 493 463

Рис.18. Продукция TLR4 клетками RAW 264.7. Все обозначения, как на Рис. 15. Фото внизу — контроль загрузки белка.

Выводы

1. Впервые было установлено, что in vitro и in vivo химические вещества в предельно допустимой концентрации способны вызывать стрессовый ответ лимфоидных клеток, сопровождающийся увеличением продукции провоспалительных цитокинов, оксида азота, белков теплового шока HSP70 и HSP90, а также активацию сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK. Среди исследованных химических токсинов аммиак был наиболее эффективным индуктором стрессового ответа.

2. Показано, что эндотоксин, а также предельно допустимые концентрации аммиака вызывают сопоставимые по уровню стрессовые ответы в лимфоцитах и макрофагах мышей.

3. Впервые установлено, что диета, обогащенная липорастворимыми антиоксидантами (а-токоферол, (3-каротин и кофермент Q9) снижает токсические эффекты ЛПС и аммиака, уменьшая пики продукции белков теплового шока, а также подавляет активацию каскадов NF-кВ и SAPK/JNK.

4. Установлено, что в макрофагальных клетках RAW 264.7 эндотоксин и аммиак стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов, рецептора TLR4, а также вызывают активацию каскадов сигнальной трансдукции NF-кВ и SAPK/JNK.

5. Использование ряда ингибиторов сигнальных путей (ингибитор CLI-095, SP600125, IKK Inhibitor XIII, ОхРАРС) показало, что в клетках RAW 264.7, культивируемых в присутствии эндотоксина, наибольшим ингибирующим воздействием на продукцию цитокинов обладает ингибитор сигнального пути JNK, а в условиях действия аммиака наиболее заметный защитный эффект наблюдается при использовании ингибитора классического пути активации каскада NF-кВ.

6. В клетках RAW 264.7 показана стимуляция экспрессии TLR4 в присутствии эндотоксина и аммиака, при этом использование ингибиторов снижало практически до контрольных значений экспрессию TLR4, активированную ЛПС. Напротив, все использованные ингибиторы не снижали продукцию рецепторного белка в присутствии аммиака.

7. Несмотря на то, что провоспалительные ответы, вызванные аммиаком и эндотоксином, демонстрировали очевидное сходство, ингибиторный анализ

выявил различие механизмов формирования стрессового ответа на токсины разной природы.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи:

1. Новоселова Е.Г., Глушкова О.С., Парфенюк С.Б., Новоселова Т.В., Лунин С.М., Хренов М.О., Фесенко Е.Е. Продукция белков теплового шока, цитокинов и оксида азота при токсическом стрессе. Биохимия. 2006. вып. 4. С. 471-480.

2. S. М. Lunin, М. О. Khrenov, Т. V. Novoselova, S. В. Parfenyuk, Е. G. Novoselova. Thymulin, a thymic peptide, prevents the overproduction of pro-inflammatory cytokines and heat shock protein Hsp70 in inflammation-bearing mice. Immunological Investigations. 2008.37:8, p. 858 — 870.

3. C.M. Лунин, T.B. Новоселова, M.O. Хренов, O.B. Глушкова, С.Б. Парфенюк, Е.Е. Фесенко, Е.Г. Новоселова. Иммуномодулирующие эффекты тимопентина при остром и хроническом воспалениях у мышей. Биофизика. 2009. Т.54. вып.2. С. 260-266.

4. С.Б. Парфенюк, М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, Е.Е. Фесенко, Е.Г., Новоселова. Стрессовые ответы химических токсинов в низких концентрациях II Биофизика. 2010. Т.55. вып. 2. С. 375-382.

5. О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова, М.О. Хренов, С.Б. Парфенюк, С.М. Лунин, Е.Е. Фесенко, Е.Г. Новоселова. Роль белка теплового шока Hsp90 в формировании защитных ответов при остром токсическом стрессе II Биохимия. 2010. Т. 75. вып. 6. С. 789-795.

Тезисы докладов на конференциях:

6. Новоселова Т.В., Лунин С.М., Хренов М.О., Глушкова О.В., Парфенюк С.Б. Исследование продукции цитокинов, оксида азота при токсическом стрессе // 10-я Путинская школа-конференция молодых ученых. Сб. трудов, 2006. - С. 116.

7. Новоселова Т.В., Хренов М.О., Лунин С.М., Парфенюк С.Б. Роль оксида азота и белка теплового шока (БТШ70) в развитии окислительного стресса, вызванного хроническим воспалением // Окисление, окислительный стресс, и антиоксиданты: Всероссийская конференция молодых ученых и III школа им. академика Н.М. Эмануэля. Доклады и тезисы. - М.: Изд-во РУДН,- 2008. С. 261 - 263.

8. Е.Г. Новоселова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, Т.В Новоселова, О.В. Глушкова, С.Б. Парфенюк. Исследование молекулярных механизмов функционирования защитных систем клетки при системном воспалительном синдроме и сепсисе у мышей. Поиск новых направлений лечения II Фундаментальные науки - медицине. Тезисы докладов. М.: Фирма «Слово», 2008. С. 36-37.

9. Парфенюк С.Б., Новоселова Т.В., Хренов М.О., Глушкова О.В., Лунин С.М., Новоселова Е.Г. Иммуномодулирующие эффекты химических соединений в предельно допустимых концентрациях //13-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сб. трудов, 2009. - С.114.

10. Парфенюк С.Б., Глушкова О.В., Новоселова Е.Г. Стрессовые эффекты химических токсинов в низких концентрациях //14-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сб. трудов, 2010. - С. 163.

11. Е.Г. Новоселова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, Т.В Новоселова, О.В. Глушкова, С.Б. Парфешок. Исследование молекулярных механизмов функционирования защитных систем клетки при системном воспалительном синдроме и сепсисе у мышей. Поиск новых направлений лечения // Фундаментальные науки - медицине. Тезисы докладов по Программе ФНМ. - М.: Фирма «Слово», 2009,20-22.

12. Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, Т.В Новоселова, С.Б. Парфенюк,. Исследование молекулярных механизмов функционирования защитных систем клетки при системном воспалительном синдроме и сепсисе у мышей. Поиск новых направлений лечения // Фундаментальные науки - медицине. Тезисы докладов по Программе ФНМ. М.: Фирма «Слово», 2010,22-23.

Подписано в печать:

16.03.2011

Заказ №5146 Тираж-75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoieferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Парфенюк, Светлана Борисовна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Сепсис и механизмы его развития.

1.2. Т1Л4 сигнализация.

1.3. Сигнальный каскад ]ЧР-кВ.

1.4. Сигнальный путь БАРК/ЛЧК.

1.5. Химические токсины.

1.6. Белки теплового шока.

1.7. Цитокины.

1.8. Окислительный стресс при воспалениях и роль антиоксидантов в регуляции уровня прово спалительного ответа.

1.8.1. Витамин Е (а-токоферол).

1.8.2. Р-каротин.

1.8.3. Коэнзим (убихинон).

1.9. Ингибиторы Т1Л4. Их применение для лечения и предупреждения сепсиса.

1.9.1. Антитела против ТЬЯ4 и комплекса ТЬЯ4-М02.

1.9.2. Эриторан или Е5564.

1.9.3. ТАК 242.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные и модель токсического стресса.

2.2. Модель острого токсического стресса.

2.3. Диета с антиоксидантами.

2.4. Культура клеток и измерение их функциональной активности.

2.4.1. Выделение сыворотки.

2.4.2. Культивирование клеток макрофагальной линии КА"\У 264.7 в присутствии ингибиторов.

2.4.3. Культивирование изолированных клеток в присутствии химических веществ.

2.4.4. Выделение лимфоцитов.

2.4.5. Выделение перитонеальных фагоцитов.

2.4.6. Измерение продукции фактора некроза опухолей, интерлейкинов и интерферона-у.

2.4.7. Измерение оксида азота.

2.4.8. Ds-Na-ПААГ электрофорез и иммуноблотинг.

2.5. Статистическая обработка полученных данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние острого воспаления, вызванного бактериальным эндотоксином на функциональную активность клеток in vivo.

3.1.1.Цитокины и оксид азота при остром воспалении.

3.1.2. Цитокины в плазме крови при остром воспалении.

3.1.3. Экспрессия белков теплового шока при остром воспалении.

3.1.4. Влияние острого стресса на фосфорилирование сигнальных белков.

3.2. Влияние химических токсинов на функциональную активность клеток.

3.2.1.Влияние химических токсинов на функциональную активность клеток in vivo.

3.2.1.1. Цитокины in vivo.

3.2.1.2. Оксид азота in vivo.

3.2.1.3. Экспрессия белков теплового шока (HSP72 и HSP90-a) и активность каскадов NF-кВ и SAPK/JNK в экспериментах in vivo.

3.2.2.Влияние химических токсинов на функциональную активность клеток in vitro.

3.2.2.1. Цитокины in vitro.

3.2.2.2. Оксид азота in vitro.

3.2.2.3. Экспрессия белков теплового шока (HSP72 и HSP90-ot) и активность каскадов NF-кВ и SAPK/JNK в экспериментах in vitro.

3.3. Защитные свойства липорастворимых антиоксидантов при воздействии липополисахарида и химических токсинов в низкой концентрации.

3.3.1. Фосфорилирование сигнальных белков.

3.4. Роль ингибиторов сигнальных каскадов.

3.4.1. Влияние ингибиторов TLR4 сигнальных путей на продукцию цитокинов клетками макрофагальной линии RAW 264.7.

3.4.2. Экспрессия белков теплового шока, сигнальных белков и рецепторного белка TLR4 в присутствии ингибиторов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное исследование эффектов токсинов разной природы на стрессовый ответ лимфоидных клеток: роль некоторых каскадов внутриклеточной сигнализации"

Исследование механизмов адаптации организма к действию токсических агентов является важной фундаментальной проблемой, которая имеет отношение как к вопросам экологической безопасности, так клинической медицины. Известны некоторые молекулярно-клеточные механизмы, связанные с каскадом реакций, инициированных токсинами грамотрицательных бактерий, и представляющие собой систему врожденной антимикробной резистентности организма млекопитающих. Между тем механизмы действия низкоинтенсивных химических агентов, широко распространенных в сфере существования биологических систем, до сих пор остаются почти неизученными.

Несмотря на то, что исследования эффектов бактериальных токсинов проводятся достаточно активно, до сих пор имеются проблемы, связанные с септическими воспалениями у человека, вызывающими высокий процент случаев гибели пациентов. Достаточно отметить, что уровень смертности пациентов в результате воспалений септической природы позволяет включать сепсис в пятерку важнейших социально-значимых заболеваний. Большинство исследований по выявлению механизмов взаимодействия бактериальных токсинов с живыми системами выполнены с использованием трансформированных клеток (Nishina et al., 2004, Li et. al., 2010), у которых чувствительность к патогенам значительно отличается от той, что свойственна нормальным животным клеткам. Кроме того, наибольшее количество работ, посвященных этим проблемам, выполнено с использованием клеточных моделей in vitro. С учетом перечисленных обстоятельств, представляется актуальным исследование новых закономерностей возникновения и развития септических состояний с использованием более адекватных животных моделей.

Очевидно, что изучение механизмов ответа клетки на бактериальные и химические токсины целесообразно проводить с использованием современных представлений о роли ряда каскадов внутриклеточной сигнализации в формировании резистентности клеток к повреждающим агентам.

Действительно, имеется большой пробел в изучении роли белков сигнальных каскадов в формировании ответов организма на действие повреждающих факторов сверхслабой интенсивности, которые, тем не менее, присутствуют в сфере деятельности человека. Среди этих каскадов в первую очередь, следует исследовать путь активации NF-кВ, а также стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK, которая активируется многими типами экстраклеточных сигналов (Wada et al., 2004). Кроме того, актуально исследовать пути активации рецептора TLR4, ответственного за связывание эндотоксина с клеткой-мишенью, и выяснить степень его участия при формировании ответа клетки на действие химических сигналов. Наконец, очень важно провести поиск подходов для снижения последствий действия токсических факторов на клетку. В этом плане представляются актуальными исследования закономерностей функционирования защитных систем клетки, учитывая общее состояние цитокиновой сети (продукция про- и антивоспалительных цитокинов), уровень экспрессии белков теплового шока БТШ70 и БТШ90, оценку продукции оксида азота и уровня активации каскадов сигнальной трансдукции NF-кВ, SAPK/JNK и TLR4 при действии модифицирующих факторов, включая иммуномодуляторы и ингибиторы отдельных участков путей сигнализации.

Целью данной работы было сравнительное исследование эффектов in vivo и in vitro эндотоксина (ЛПС) и ряда химических токсинов в предельно допустимой концентрации (аммиак, уксусная кислота и диэтиловый эфир) на ключевые звенья клеточного иммунитета. Кроме того, в задачу работы входило изучение способов модуляции уровня резистентности животных и рецепторной чувствительности клеток к действию токсинов разной природы и поиск методов, снижающих чувствительность клеток к ЛПС из стенок грамотрицательных бактерий Escherihia coli и к химическим токсинам. Поскольку клетки иммунной системы очень быстро формируют ответ на внешние сигналы, в качестве главного объекта исследования были использованы макрофаги и лимфоциты животных, которые являются основными продуцентами защитных молекул, а также макрофагальные клетки RAW 264.7.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать роль некоторых про- и анти-воспалительных цитокинов: фактора некроза опухолей (ФНО-а, интерферона-у (ИФН-у), интерлейкина-lct (ИЛ- 1а), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-3 (ИЛ-3), интерлейкина-6 (ИЛ-6), интерлейкина-10 (ИЛ-10), белков теплового шока БТШ72 и БТШ90, оксида азота в защитной реакции животных клеток и целого организма в условиях токсического стресса, индуцированных эндотоксином и химическими агентами. Провести сравнительную оценку степени активации сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и экспрессии рецептора TLR4 при действии in vivo и in vitro бактериального и химических токсинов.

2. Учитывая развитие окислительного стресса при токсическом воздействии, использовать комплекс липорастворимых природных антиоксидантов, способных снизить продукцию активных форм кислорода в клетках животных. Исследовать анти-воспалительный потенциал антиоксидантов путем оценки уровня продукции белка теплового шока БТШ72, а также уровней активации двух сигнальных каскадов: фактора транскрипции NF-кВ и стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK в клетках мышей.

3. Изучить закономерности воздействия in vitro (на клетках RAW 264.7) ряда ингибиторов активации сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и рецептора TLR4 на уровень провоспалительного ответа клетки в условиях действия ЛПС и аммиака путем оценки продукции цитокинов (ФНО-а, ИЛ- 1а, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-у), белков теплового шока БТШ72 и БТШ90, а также оценить эффект снижения активации сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и экспрессии рецептора TLR4.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Парфенюк, Светлана Борисовна

выводы

1.Впервые было установлено, что in vitro и in vivo химические вещества в предельно допустимой концентрации способны вызывать стрессовый ответ лимфоидных клеток, сопровождающийся увеличением продукции провоспалительных цитокинов, оксида азота, белков теплового шока HSP70 и HSP90, а также активацию сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK. Среди исследованных химических токсинов аммиак был наиболее эффективным индуктором стрессового ответа.

2.Показано, что эндотоксин, а таюке аммиак в предельно допустимой концентрации вызывают сопоставимые по уровню стрессовые ответы в лимфоцитах и макрофагах мышей.

3.Впервые установлено, что диета, обогащенная липорастворимыми антиоксидантами (а-токоферол, Р-каротин и кофермент Q9) снижает токсические эффекты ЛПС и аммиака, уменьшая пики продукции белков теплового шока, а также подавляет активацию каскадов NP-кВ и SAPK/JNK.

4.Установлено, что в макрофагальных клетках RAW 264.7 эндотоксин и аммиак стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов, рецептора TLR4, а также вызывают активацию каскадов сигнальной трансдукции NF-кВ и SAPK/JNK.

5.Использование ряда ингибиторов активности сигнальных путей (ингибитор CLI-095, SP600125, IKK Inhibitor XII, ОхРАРС) показало, что в клетках RAW 264.7, культивируемых в присутствии эндотоксина, наибольшим ингибирующим воздействием на продукцию цитокинов обладает ингибитор сигнального пути JNK, а в условиях действия аммиака наиболее заметный защитный эффект наблюдается при использовании ингибитора классического пути активации каскада NF-kB.

ЛПС. Напротив, все использованные ингибиторы не снижали продукцию рецепторного белка в присутствии аммиака.

7,Несмотря на то, что провоспалительные ответы, вызванные аммиаком и эндотоксином, демонстрировали очевидное сходство, ингибиторный анализ выявил различие механизмов формирования стрессового ответа на токсины разной природы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа была посвящена выяснению вопроса о сходстве или различии механизмов формирования ответов животных клеток на действие бактериального токсина в нелетальной дозе или химических токсинов в малых концентрациях (ПДК). Объектами служили мыши-самцы NMRI и Balb/C, либо клетки, выделенные из этих животных, а также макрофагальные клетки линии RAW 264.7. Бактериальным токсином служил липополисахарид (ЛПС), выделенный из стенок грамотрицательных бактерий E.coli, в качестве химических токсинов использовали аммиак, уксусную кислоту и диэтиловый эфир. Последние использовали в виде атмосферных примесей, либо добавляли непосредственно в среду культивирования клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Парфенюк, Светлана Борисовна, Пущино

1. Бобырева Л.Е. Антиоксиданты в комплексной терапиидиабетических ангиопатий. // Эксперим. и клин. Фармакология. 1998. Т.61,№ 1.С.74-80.

2. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. // Сорос, образоват. журн. 2000. №12. С.13-19.

3. Глушкова О.В., Новоселова Е.Г., Хренов М.О., Новоселова Т.В., Черенков Д.А., Лунин С.М., Фесенко Е.Е. Роль белков теплового шока HSP90 в ответе иммунных клеток на сантиметровые микроволны// Биофизика. 2008. Т. 53. - № 1. — С. 93-99.

4. Губский Ю.И., Левицкий У.Л., Примак Р.Г. Влияние витамина Е на структурно-функциональную организацию хроматина печени в условиях повреждения тетрахлорметаном. // Биополимеры и клетка. 1993. №3.C.27-34.

5. Гужова И.В. Механизмы работы шаперона Hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии. Дисс. докт. биол. наук, Институт цитологии РАН, С.-Петербург. 2004.

6. Иванов И.И., Мерзляк М.Н., Тарусов Б.Н. Витамин Е, биологическая роль в связи с антиоксидантыми свойствами. // Биоантиокислители. М.:Наука, 1975. С.30-52.

7. Касаинкина О.Т., Картпшева З.С., Лобанова Т.В., Сирота Т.В. Влияние окружения на реакционную способность ß-каротина по отношению к кислороду и свободным радикалам. // Биолюмембраны, 1998. -V. 15. № 2. - Р. 168-175.

8. Кольман Я., Рем К.- Г. Наглядная биохимия. М.:Мир, 2000. 469 с.

9. Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Клеточные механизмы токсичности аммиака. Изд-во ЛКИ, М., 2008.

10. Меныцикова Е.Б., Панкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Кругловых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. Москва, 2006.

11. Негреску Е.В., Лебедев A.B., Балденков Г.Н. Антиоксиданты, перекисное окисление липидов и рецепторзависимое увеличение концентрации Са2+ в тромбоцитах человека. // Вопр. Мед. химии. 1992.-№ 1, с.36-39.

12. Adhikary G. et al., C-Jun NH2 terminal kinase (JNK) is an essential mediator of Tolllike receptor 2-induced corneal inflammation. // J. Leukoc. Biol. 2008. V.83. - p. 991-997.

13. Alcami A., Symons J.A., Smith G.L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. // J Virol. 2000. V. 74. - P. 11230-11239.

14. Amolins M.W., Blagg B.S. Natural product inhibitors of HSP90: potential leads for drug discovery. // Mini Rev Med Chem. 2009. — V. 9. -№2.-P. 140-152.

15. Anckar J., Sistonen L. Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and developmental pathways. // Adv Exp Med Biol. 2007. V. 594. - P. 7888.

16. Aruoma O.I., Grootveld M., Bahorun T. Free radicals in biology and medicine: from inflammation to biotechnology. // Biofactors. 2006. V. 27.-№ 1-4.-P. 1-3.

17. Baeuerle P.A, Baltimore D. Activation of DNA-binding activity in an apparently cytoplasmic precursor of the NF-kappa B transcription factor. // Cell. 1988. V.22. - № 3. - P. 211-217.

18. Bagowski C.P, Ferrell J.E. Jr. Bistability in the JNK cascade. // Curr Biol. 2001.-V. 11.-№ 15. P. 1176-1182.

19. Bagowski C.P., Besser J., Frey C.R., Ferrell J.E. The JNK cascade as biochemical switch in mammalian cells: Ultrasensitive and all-or-none responses // Curr. Biol. 2003. V. 13 - P. 315-320.

20. Bao X.Q., Liu G.T. Bicyclol: a novel antihepatitis drug with hepatic heat shock protein 27/70-inducing activity and cytoprotective effects in mice. // Cell Stress Chaperones. 2008. V. 13. - № 3. - P. 347-355.

21. Barnes P.J, Karin M. Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases. // N Engl J Med. 1997. V. 336.-№ 15.-P. 1066-1071.

22. Basak S., Kim H., Kearns J.D., Tergaonkar V., O'Dea E., Werner S.L., Benedict C.A., Ware C.F., Ghosh G., Verma I.M., Hoffmann A. A fourth IkappaB protein within the NF-kappaB signaling module // Cell 2007.-V.128.-P. 369-381.

23. Basu S., Eriksson M. Vitamin E in relation to lipid peroxidation in experimental septic shock. // Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2000.-V. 62.-P. 195-199.

24. Beadling C., Smith K.A. DNA array analysis of interleukin-2-regulated immediate/early genes. // Med Immunol. 2002. V. 1. - P. 1-2.

25. Bélanger M.C., Mirault M.E., Dewailly E., Berthiaume L., Julien P. Environmental contaminants and redox status of coenzyme Q10 and vitamin E in Inuit from Nunavik. // Metabolism. 2008. V. 57. - Jte 7. -P. 927-933.

26. Bellman K., Laattela M., Wissing D., Burkart V., and Kolb H. // FEBS Lett., 1995.-V. 391.-P. 185-188.

27. Bennett BL. et al., SP600125, an anthrapyrazolone inhibitor of Jun N-terminal kinase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. - p.13681-13686.

28. Beyer R.E. The analysis of the role coenzyme Q in free radical generation and as an antioxidant. // Biochem.Cell Biol. 1992. V. 70. -P. 390-403.

29. Beyer R.E. The analysis of the role coenzyme Q in free radical generation and as an antioxidant. // Biochem.Cell Biol. 1992. V. 70. -P. 390-403.

30. Billiau A. Interferon-y in autoimmunity. // Cytokine Growth factor rev. 1996.-V. 7.-P. 25-34.

31. Blackwell T.S., Blackwell T.R., Holden, E.R., Christman, B.W., Christman J.W. In vivo antioxidant treatment suppresses nuclear factor-kB activation and neurtrophilic lung inflammation. // J. Immunol. 1996. -V. 157.-P. 1630-1637.

32. Blackwell T.S., Christman J.W. Sepsis and cytokines: current status. // Br J Anaesth. 1996. V. 77. - P. 110-177.

33. Bochkov V.N., Kadi A., Huber J., Gruber F., Binder B.R., Leitinger N. Protective role of phospholipids oxidation products in endotoxin-induced tissue damage. // Nature. 2002. V. 419. - P. 77-81.

34. Boekholdt S.M., Agema W.R.P., Peters R.J.P. Variants of Toll-like receptor 4 modify the efficacy of statin therapy and the risk of cardiovascular events. II Circulation. 2003. V. 107. - № 19. - P.2416-2421.

35. Boldyrev A.A., Yuneva M.O., Sorokina E.V., Kramarenko G.G., Fedorova T.N., Konovalova G.G., Lankin V.Z. Antioxidant systems in tissues of senescence accelerated mice. // Biochemistry (Mose). 2001. — V. 66. -№10. -P. 1157-1163.

36. Bown M.J., Nicholson M.L., Bell P.R.F., Sayers R.D. Cytokines and inflammatory pathways in the pathogenesis of multiple organ failure following abdominal aortic aneurysm repair. // Eur J Vase Endovasc Surg. 2001. V. 22. - P. 485-495.

37. Bult H., Boeckxstaens G.E., Pelckmans P.A., Jordaens F.H., Van Maercke Y.M., Herman A.G. Nitric oxide as an inhibitory non-adrenergic non-cholinergic neurotransmitter. // Nature. 1990. V. 345. -№ 6273. - P. 346-347.

38. Caamano J. and Hunter C.A. NF-kappaB family of transcription factors: central regulators of innate and adaptive immune functions. // Clin Microbiol Rev. 2002. V. 15. - № 3. - P. 414-429.

39. Caplan. What is a co-chaperone? // Cell stress and chaperones. 2003. — V. 8.-№2.-P. 105-107.

40. Carlstedt F., Lind L., Lindahl B. Pro-inflammatory cytokines, measured in a mixed population on arrival in the emergency department, are related to mortality and severity of disease. // J Intern Med. 1997. V. 242.-P. 361-365.

41. Casey L.C., Balk R.A., Bone R.C. Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome. // Ann Intern Med. 1993.-V. 119.-P. 771-778.

42. Chachkhiani I., Gurlich R., Maruna P., Frasko R., Lindner J. The postoperative stress response and its reflection in cytokine network and leptin plasma levels. // Physiol Res. 2005. V. 54. - P. 279-285.

43. Chang C.Y., Chen J.Y., Ke D., Hu M.L. Plasma levels of lipophilic antioxidant vitamins in acute ischemic stroke patients: correlation to inflammation markers and neurological deficits. // Nutrition. 2005. V. 21.-№ 10.-P. 987-993.

44. Chang L. and Karin M. Mammalian MAP kinase signaling cascades // Nature. 2001. -V. 410. P. 37-40.

45. Chew B.P., Park J.S. Carotenoid action on the immune response. // J Nutr. 2004. V. 134. - P. 257-261.

46. Ciocca D.R., Calderwood S.K. Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications. // Cell Stress Chaperones. 2005. V. 10. - № 2. - P. 86-103.

47. Cordeiro C.A., Moreira P.R., Costa G.C., Dutra W.O., Campos W.R., Orefice F., Teixeira A.L. Interleukin-1 gene polymorphisms and toxoplasmic retinochoroiditis. // Mol Vis. 2008. V. 14. - P. 1845-1849.

48. Craig E.A., Weissman J.S., Horwich A.L. Heat shock proteins and molecular chaperones: mediators of protein conformation and turnover in the cell. // Cell. Vol. 1994. V. 78. - P. 365-372.

49. Crinnion W.J. Organic foods contain higher levels of certain nutrients, lower levels of pesticides, and may provide health benefits for the consumer. // Altern Med Rev. 2010. V. 15. - № 1k> - P. 4-12.

50. Czeslick E., Struppert A., Simm A., and Sablotzk I.A. E5564 (eritoran) inhibits lipopolysaccharide-induced cytokine pro-duction in human blood monocytes. // Inflammation Research. 2006. V. 55. - № 11. - P. 511-515.

51. Czura C.J., Tracey KJ. Autonomic neural regulation of immunity. // J Intern Med. 2005. V. 257. - P. 156-166.

52. Damas P., Canivet J., De Groote D., et al. Sepsis and serum cytokine concentrations. // Crit Care Med. 1997.V. 25. P. 405-412.63 .Davis R. J. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases //Cell. 2000. -V. 103. P. 239-252.

53. Delhase M., Hayakawa M., Chen Y., Karin M. Positive and negative regulation of IkappaB kinase activity through IKKbeta subunit phosphorylation. // Science. 1999. -V. 284. № 5412. - P. 309-313.

54. Delhase M., Karin M. The I kappa B kinase: a master regulator of NF-kappa B, innate immunity, and epidermal differentiation. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1999. -V. 64. P. 491-503.

55. Didelot C., Lanneau D., Brunet M., Joly A.L,. De Thonel A., Chiosis G., Garrido C. Anti-cancer therapeutic approaches based on intracellular and extracellular heat shock proteins. // Curr Med Chem. 2007. V. 14. - № 27.-P. 2839-2847.

56. Didelot C., Schmitt E., Brunet M., Maingret L., Parcellier A., Garrido C. Heat shock proteins: endogenous modulators of apoptotic cell death. // Handb Exp Pharmacol. 2006. -V. 172. P. 171-198.

57. DiDonato J., Mercurio F., Rosette C., Wu-Li J., Suyang H., Ghosh S., Karin M. Mapping of the inducible IkappaB phosphorylation sites that signal its ubiquitination and degradation. // Mol Cell Biol. 1996. V.16. -P. 1295-1304.

58. DiDonato J., Mercurio F., Rosette C., et al. Mapping of the inducible IkappaB phosphorylation sites that signal its ubiquitination and degradation. // Mol. Cell Biol. 1996. V.16. - P. 1295-1304.

59. Dinarello C.A. The endogenous pyrogens in host defense interactions. Hospital practice. 1989. V. 24 - P. 111-128.

60. Divanovic S., Trompette A., Atabani S. F. Negative regulation of Tolllike receptor 4 signaling by the Toll-like receptor homolog RP105. // Nature Immunology. 2005. V. 6. - № 6. - P.571-578.

61. Doyle S. L. and O'Neill L. A. Toll-like receptors: from the discovery of NFkappaB to new insights into transcriptional regulations in innate immunity. // Biochem. Pharmacol. 2006. V. 72. - P. 1102-1113.

62. Dragsted L.O. Biomarkers of exposure to vitamins A, C, and E and their relation to lipid and protein oxidation markers. // Eur J Nutr. 2008. V. 2.-P. 3-18.

63. Esmon C.T. Possible involvement of cytokines in diffuse intravascular coagulation and thrombosis. // Baillieres Clin Haem. 1994. V. 7. — P. 453-466.

64. Feinstein D.L., Galea E., Aquino D.A., Li G.C., Xu H., Reis D.J. Heat shock protein 70 suppresses astroglial-inducible nitric-oxide synthase expression by decreasing NFkappaB activation. // J Biol Chem. 1996. — V. 271.-№30.-P. 17724-17732.

65. Fiorentino D.F., Zlotnik A., Mosman T.R., Howard M. and O' Garra A. IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. // J.Immunol. 1991. V. 147. - P. 3815-3822.

66. Folkers K., Langsjoen P., Langsjoen P.H. Therapy with coenzyme Q10 of patients in heart failure who are eligible or ineligible for a transplant. // Biochem, Biophys. Res.Commun. 1992. V. 182. - P. 247-253.

67. Fox E.S., Brower J.S., Bellezzo J.M., Leingang K.A. N-Acetylcysteine and a-tocopherol reverse the inflammatory response in activated rat Kupffer cells. // J. Immunol. 1997. V. 158. - P. 5418-5423.

68. Gao B., Tsan M. F. Endotoxin contamination in recombinant human heat shock protein 70 (Hsp70) preparation is responsible for the induction of tumor necrosis factor «release by murine macrophages. // J. Biol. Chem. 2003.-V. 278.-P. 174-179.

69. Gay N. J. and Gangloff M. Structure and function of toll receptors and their ligands. // Annu. Rev. Biochem. 2007. V. 76. - P. 141-165.

70. Ghosh A.R., Sehgal S.C. Haemolysin production by environmental isolates of Vibrio parahaemolyticus from Andamans. // Indian J Med Res. 1998.-V. 107.-P. 151-154.

71. Giffard R.G., Han R.Q., Emery J.F., Duan M., Pittet J.F. Regulation of apoptotic and inflammatory cell signaling in cerebral ischemia: the complex roles of heat shock protein 70. // Anesthesiology. 2008. — V. 109.-№2.-P. 339-348.

72. Giffard R.G., Yenari M.A. Many mechanisms for hsp70 protection from cerebral ischemia. // J Neurosurg Anesthesiol. 2004. V. 16. - № 1. - P. 53-61.

73. Gille L., Nohl H. The existence of a lysosomal redox chain and the role of ubiquinone. //Arch.Biochem.Biophys. 2000. V. 375. - P. 347-354.

74. Gogvadze V., Orrenius S. Mitochondrial regulation of apoptotic cell death. // Chem Biol Interact. 2006. V. 27. - № 163(1-2). - P. 4-14.

75. Granucci F.C., Vizzardelli N., Pavelka S., Feau M., Persico E., Virzi M., Rescigno G., and P. Ricciardi-Castagnoli. Inducible 11-2 production by dendritic cells revealed by global gene expression analysis. // Dev.Immunol. 2001. P. 2-882.

76. GroS P., Brandl K., Dierkes C. Lipopolysaccharide-Trap-Fc, a multifunctional agent to battle gram-negative bacteria. // Infection and Immunity 2009. V. 77. - № 7. - P. 2925-2931.

77. Grossmann M., O'Reilly L.A, Gugasyan R., Strasser A., Adams J.M., Gerondakis S. The anti-apoptotic activities of Rel and RelA requiredduring B-cell maturation involve the regulation of Bcl-2 expression. // EMBO J. 2000. V. 19. - № 23. - P. 6351-6360.

78. Guo L.-H., Schluesener H.J. The innate immunity of the central nervous system in chronic pain: the role of Toll-like receptors. //Cellular and Molecular Life Sciences. 2007. V. 64. - № 9. - P. 1128-1136.

79. Guo S., Wharton W., Moseley P., Shi H. Heat shock protein 70 regulates cellular redox status by modulating glutathione-related enzyme activities. // Cell Stress Chaperones. 2007. V. 12. - № 3. - P. 245-254.

80. Hashimoto C., Hudson K. L., and Anderson K. V. The Toll gene of Drosophila, required for dorsal-ventral embryonic polarity, appears to encode a transmembrane protein. // Cell. 1988. V. 52. - P. 269-279.

81. Hawkins L. D., Christ W. J. and Rossignol D. P. Inhibition of endotoxin response by synthetic TLR4 antagonists. // Curr. Top Med. Chem. 2004. -V. 4.-P. 1147-1171.

82. Hoch R.C., Rodriguez R., Manning T., et al. Effects of accidental trauma on cytokine and endotoxin production. // Crit Care Med. 1993. V. 21. -P. 839-845.

83. Horiuchi H., Nagata I., Komoriya K. Protective effect of vitamin D3 analogues on endotoxin shock in mice. // Agents and Action. 1991. V. 33. - № 3-4. - P.343-348.

84. Hoshino K., Takeuchi O., Kawai T. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide evidence for TLR4 as the Lps gene product. // Journal of Immunology. 1999. V. 162. - № 7. - P. 3749-3752.

85. Ivanina A.V., Cherkasov A.S. and Sokolova I.M. Effects of cadmium on cellular protein and glutathione synthesis and expression of stress proteins in eastern oysters, Crassostrea virginica Gmelin.// J Exp Biol. 2008. -V. 211. P. 577-586.

86. Janeway C.A. Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition. // Annu Rev Immunol. 2002. V. 20. - P. 197-216.

87. Jerala R. Structural biology of the LPS recognition. // Int. J. Med. Microbiol. 2007. V. 297. - P. 353-363.

88. Jiang J.X., Tian K.L., Chen H.S., Zhu P.F., Wang Z.G. Plasma cytokines and endotoxin levels in patients with severe injury and their relationship with organ damage. // Injury. 1997. V. 28. - P. 509-513.

89. Jiang Z., Georgel P., Du X., Shamel L., Sovath S., Mudd S., Huber M., Kalis C., Keck S., Galanos C., Freudenberg M. and Beutler B. CD 14 is required for MyD88-independent LPS signaling. // Nat. Immunol. 2005.-V. 6.-P. 565-570.

90. Jude B. A., Pobezinskaya Y., Bishop J., Parke S., Medzhitov R. M., Chervonsky A. V., and Golovkina T. V. Subversion of the innate immune system by a retrovirus. // Nat. Immunol. 2003. V. 4. - P. 573578.

91. Kanda, H., Miura, M. Regulatory roles of JNK in programmed cell death. // J.Biochem. 2004. V. 136. - P. 1-6.

92. Karin M., Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-kappa. B activity. // Annu Rev Immunol. 2000. V. 18.-P. 621-663.

93. Kato M., Suzuki H., Murakami M., Akama M., Matsukawa S., Hashimoto Y. Elevated plasma levels of interleukin-6, interleukin-8, and granulocyte colony-stimulating factor during and after major surgery. // J Clin Anesth. 1997. V. 9. - P. 293-298.

94. Kawamoto T. et al., TAK-242 selectively suppresses Toll-like receptor 4-signaling mediated by the intracellular domain. // Eur J Pharmacol. 2008. V.584 (1). - p. 40-48.

95. Kelly R.A., Smith T.W. Cytokines and cardiac contractile function. // Circulation. 1997. V. 95. - P. 778-781.

96. Kenzel S. c-Jun Kinase Is a Critical Signaling Molecule in a Neonatal Model of Group B Streptococcal Sepsisl. // J Immunol. 2006. -V.176.-p. 3181-3188.

97. Kheir-Eldin A.A., Motawi T.K., Gad M.Z., Abd-ElGawad H.M. Protective effect of vitamin E, (3-carotene, and N-acetylcysteine from the brain oxidative stress induced in rats by lipopolysaccaride. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2001. V. 33. - P. 475-482.

98. Kim H. M., Park B. S., KimJ.-I. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist eritoran. // Cell. 2007 -V. 130.-№.-P. 906-917.

99. Koh Y., Lim C.M., Kim M.J., Shim T.S., Lee S.D., Kim W.S., Kim D.S., and Kim W.D. Heat shock response decreases endotoxin-induced acute lung injury in rats. // Respirology 1999. V. 4. - P. 325330.

100. Komarova E.Y., Afanasyeva E.A., Bulatova M.M., Cheetham M.E., Margulis B.A., and Guzhova I.V. Downstream caspases are novel targets for the antiapoptotic activity of the molecular chaperone hsp70. // Cell Stress & Chap. 2004. V. 9. - P. 265-275.

101. Kovarik P., Stoiber D., Novy M., Decker T. Statl combines signals derived from IFN-gamma and LPS receptors during macrophage activation. // EMBO J. 1998. V. 17. - P. 3660-3668.

102. Kroemer G., Martin S.J. Caspase-independent cell death. // Nat Med. 2005. V. 11. - № 7. - P. 725-730.

103. Kuan C.Y., Yang D.D., Samanta Roy D.R., Davis R.J., Rakic P., Flavell R.A. The Jnkl and Jnk2 protein kinases are required for regional specific apoptosis during early brain development. // Neuron. 1999. V. 22.-№4.-P. 667-676.

104. Kudoh A., Katagai H., Takazawa T., Matsuki A. Plasma proinflammatory cytokine response to surgical stress in elderly patients. // Cytokine. 2001. -V. 15. P. 270-273.

105. Kumar A., Takada Y., Boriek A.M., Aggarwal B.B. Nuclear factor-kappaB: its role in health and disease. // J Mol Med. 2004. V. 82.-№7.-P. 434-448.

106. Kwon W.J., Kim S.H., Park Y.O., Cho M., Kang C.D., Lee G., An W.G., Joo W.H., Kim D.W. IKKgamma inhibits activation of NF-kappaB by NIK. // Mol Cells. 2004. V. 18. - № 2. - P. 200-206.

107. Lang J.D., McArdle P.J., O'Reilly P.J., Matalon S. Oxidant-antioxidant balance in acute lung injury. // Chest. 2002. V. 122, - P. 314-320.

108. Lanneau D., de Thonel A., Maurel S., Didelot C., Garrido C. Apoptosis versus cell differentiation: role of heat shock proteins HSP90, HSP70 and HSP27. // Prion. 2007. V. 1. - № 1. - P. 53-60.

109. Lantz M., Gullberg U., Nilsson E., Olsson I. Characterization in vitro of a human tumor necrosis factor-binding protein. A soluble form of a tumor necrosis factor receptor. // J Clin Invest. 1990. V. 86. - P. 1396-1402.

110. Lass A., Forster M.J., Sohal R.S. Effects of coenzyme Q10 and a-tocopherol administration on their tissue evels in the mouse: elevation of mitochondrial a-tocopherol by coenzyme Q10. // Free Radic.Biol.Med. 1999.-V. 26,-P. 1375-1382.

111. Lawler S., Fleming Y., Goedert M., Cohen P. Synergistic activation of SAPK1/JNK1 by two MAP kinase kinases in vitro. // Curr Biol. 1998. V. 8. - № 25. - P. 1387-1390.

112. Lee S.U., Choi Y.H., Kim Y.S., Min Y.K., Rhee M., Kim S.H. Anti-resorptive saurolactam exhibits in vitro anti-inflammatory activity via ERK-NF-kappaB signaling pathway. // Int Immunopharmacol. 2010. -V. 10. -№3.-P. 298-303.

113. Li Q., Van Antwerp D., Mercurio F., Lee K. F., and I. M. Verma. Severe liver degeneration in mice lacking the IkB kinase 2 gene // Science. 1999.- V.284.-P. 321-325.

114. Liew F. Y., Xu D., K. Brint E. and O'Neill L. A. Negative regulation of toll-like receptor-mediated immune responses. // Nat. Rev. Immunol. 2005. V. 5. - P. 446^158.

115. Lin E., Calvano S.E., Lowry S.F. Inflammatory cytokines and cell response in surgery. // Surgery. 2000. V. 127. - P. 117-126.

116. Liu S.F., Malik A.B. NF-kappa B activation as a pathological mechanism of septic shock and inflammation. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2006. V. 290. - № 4. - P. 622-645.

117. Lowe G.M., Vlismas K., Young A.J. Carotenoids as prooxidants? // Mol.Aspects Med. 2003. V. 24. - P. 363-369.

118. Macdonald J., Galley H.F. and Webster N.R. Oxidative Stress and jene expression in sepsis. // British j. Of Anaesthesia. 2003. V. 90. - P. 221-232.

119. Makarovsky G., Markel T., Dushnitsky T. and Eisenkraft A. Ammonia-when something smells wrong. // IMAJ. 2008. V. 10. - P. 537-543.

120. Malyshev I.Yu., Malugin A.V., Golubeva L.Yu., Zenina T.A., Manukhina E.B., Mikoyan V.D., Vanin A.F. Nitric oxide donor induces HSP70 accumulation in the heart and in cultured cells. // FEBS Lett. 1996.-V. 391.-P. 21-23.

121. Manning A.M., Davis R.J. Targeting JNK for therapeutic benefit: from junk to gold? // Nat. Rev. Drug. Discov. 2003. V.2. - P. 554-565.

122. Martin T.E. Lung cytokines and ARDS: Roger S. Mitchell lecture. // Chest. 1999. V. 116. - 2S-8S.

123. Mastorakos G., Ilias I. Interleukin-6: a cytokine and/or a major modulator of the response to somatic stress. // Ann N Y Acad Sci. 2006. -V. 1088.-P. 373-381.

124. May M.J, Ghosh S. Rel/NF-kappa B and I kappa B proteins: an overview. // Semin Cancer Biol. 1997. V. 8. - № 2. - P. 63-73.

125. Mayer M.P., Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. // Cell Mol Life Sci. 2005. V. 62. - № 6. - P. 670-684.

126. McBride W.T., Armstrong M.A., McBride S.J. Immunomodulation: an important concept in modern anaesthesia. // Anaesthesia. 1996. -V. 51. P. 465-473.

127. McBride W.T., Armstrong M.A., McBride S.J. Immunomodulation: an important concept in modern anaesthesia. // Anaesthesia. 1996. -V. 51. P. 465^73.

128. Means T.K., Golenbrock D.T., Fenton M.J. Structure and function of Toll-like receptor proteins. // Life Sci. 2000. V. 68. - P. 241-258.

129. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P. and Janeway C. A. Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. // Nature. 1997. V. 388. - P. 394-397.

130. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., and Janeway C. A. Jr. A human homologue of the Drosophila toll protein signals activation of adaptive immunity. //Nature. 1997. V. 388. - № 6640. - P. 394-397.

131. Meydani S.N., Wu D., Santos M.S., Hayek M.G. Antioxidants and immune response in aged persons: overview of present evidence. // Am J ClinNutr. 1995. V. 62. - P. 1462-1476.

132. Miyake K., Shimazu R., Kondo J. Mouse MD-1, a molecule that is physically associated with RP105 and positively regulates its expression. // Journaloflmmunology. 1998. V. 161. - № .3. - P. 1348-1353.

133. Morimoto R.I. Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators. // Genes Dev. 1998. V. 12. - № 24.-P. 3788-3796.

134. Mullarkey M., Rose J. R., Bristol J. Inhibition of endotoxin response by E5564, a novel Toll-like receptor 4- directed endotoxin antagonist. // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2003. V. 304. - № 3. - P. 1093-1102.

135. Nacy C.A., Meierovics A.I., Belosevic M., Green S.J. Tumor necrosis factor-alpha: central regulatory cytokine in the induction of macrophage antimicrobial activities. // Pathobiology. 1991. V.59. - P. 182-184.

136. Neckers L. Heat shock protein 90: the cancer chaperone. // J Biosci. 2007. V. 32. - № 3. - P. 517-530.

137. Nishina H., Nakagawa K., Azuma N., Katada T.J. Activation mechanism and physiological roles of stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase in mammalian cells. // Biol Regul Homeost Agents. 2003. -V. 17. № 4. - P. 295-302.

138. Novoselova E.G. Lipid metabolism in rat tissues under chronic y-irradiation and ubiquinone Q9 diet. // Biochemistry (Moscow). 1992. -V. 57.-P. 531-538.

139. Novoselova E.G. The role of ubiquinones in the regulation of lipid metabolism in rat thymocytes. // FEBS Lett. 1989. V. 249. - P. 371374.

140. O'Neill L. A. and Bowie A. G. The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling. // Nat. Rev. Immunol. 2007. -V. 7. -P.353-364.

141. Okamura Y., Watari M., Jerud E. S., Young D. W., Ishizaka S. T., Rose J., Chow J. C., and Strauss J. F. 3rd. The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4. // J. Biol. Chem. 2001. — V. 276.-P. 10229-10233.

142. Oral H., Dorn G.W., Mann D.L. Sphingosine mediates the immediate negative inotropic effects of tumor necrosis factor- in the adult mammalian cardiac myocyte. // J Biol Chem. 1997. -V. 272. P. 4836^4842.

143. Pagani F.D., Baker L.S., His C., Knox M., Fink M.P., Visner M.S. Left ventricular systolic and diastolic dysfunction after infusion of tumor necrosis factor- in conscious dogs. // J Clin Invest. 1992. — V. 90. — P. 389-398.

144. Palozza P, Calviello G, Bartoli GM. Prooxidant activity of beta-carotene under 100% oxygen pressure in rat liver microsomes. // Free Radic Biol Med. 1995. V. 19. - P. 887-892.

145. Palozza P., Luberto C., Calviello G., Ricci P., Bartoli G.M. Antioxidant and prooxidant role of beta-carotene in murine normal andtumor thymocytes: effects of oxygen partial pressure. // Free Radic Biol Med. 1997. V. 22. - P. 1065-1073.

146. Papa S., Zazzeroni, F., Pham, C.G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-kB: a key to survival, J. of Cell. // Science. 2004.-V. 117.-P. 5197-5208.

147. Pawelec G., Adibzadeh M., Pohla H., Schaudt K. Immunosenescence: ageing of the immune system. // Immunol Today. 1995.-V. 16.-P. 420-422.

148. Pobezhimova T.P., Voinikov V.K. Biochemical and physiological aspects of ubiquinone function. Membr. // Cell.Biol. 2000. V. 13. - P. 595-602.

149. Poltorak A., He X., Smirnova I. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutationsin Tlr4 gene. // Science. 1998. V. 282. - № 5396. - P. 2085-2088.

150. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. // Arch Biochem Biophys. 1991. V. 288. -№ 2. - P. 481-487.

151. Renner F., Schmitz M.L. Autoregulatory feedback loops terminating the NF-kappaB response. // Trends Biochem Sei. 2009. V. 34. - № 3. — P. 128-135.

152. Richter C. Biophysical consequences of lipid peroxidation in membranes. // Chem Phys Lipids. 1987. V. 44. - № 2-4. - P. 175-189.

153. Ritossa F.M. Experimental activation of specific loci in polytene chromosomes of Drosophila. // Exp Cell Res. 1964. V. 35. - P. 601607.

154. Roger T., Froidevaux C., LeRoy D. Protectionfrom lethal Gramnegative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2009. V. 106. - № 7. - P 2348-2352.

155. Rossignol D.P., Wong N., Noveck R., and Lynn M. Con-tinuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. // Innate Immunity. 2008. V. 14. - № 6. - P. 383-394.

156. Sabapathy K., Jochum W., Hochedlinger K., Chang L., Karin M., Wagner E.F. Defective neural tube morphogenesis and altered apoptosis in the absence of both JNK1 and JNK2. // Mech Dev. 1999. V. 89. - № 1-2.-P. 115-124.

157. Sakai K., Kino S., Takeuchi M., Ochi T., Da Cruz G., Tomita I. Analysis of antioxidant activities in vegetable oils and fat soluble vitamins and biofactors by the PAO-SO method. // Methods Mol Biol.2010.V. 594.-P. 241-250.

158. Salo M. Cytokines and attenuation of responses to surgery. // Acta Anaesthesiol Scand. 1996. -V. 40. P. 141-142.

159. Schafer M., Carter L., Stein C. Interleukin lp and corticotrophin-realising factor inhibit pain by realeasing opiods from immune cells in inflamed tissue. // PNAS. 1994. V. 91. - P. 4219-4223.

160. Scheibel T., Buchner J. The Hsp90 complex—a super-chaperone machine as a novel drug target. // Biochem Pharmacol. 1998. V. 56. -№6.-P. 675-682.

161. Schmitt E., Gehrmann M., Brunet M., Multhoff G., Garrido C. Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy. // J Leukoc Biol. 2007. V. 81. - № 1. -P. 15-27.

162. Schmitz M.L., Bacher S., Kracht M. I KB-independent control of NF-k B activity by modulatory phosphorylations. // Trends Biochem. Sci. 2001.-V. 26.-P. 186-190.

163. Schopfer F., Riobo N., Carreras M.C. et al. Oxidation of ubiquinol by peroxynitrite: implications for protection of mitochondria agains nitrosative damage. // Biochem.J. 2000. V. 349. - P. 35-42.

164. Sharov V.S., Driomina E.S., Vladimirov Y.A. Two processes responsible for chemiluminescence development in the course of iron-mediated lipid peroxidation. // J Biolumin Chemilumin. 1996. V. 11.-№2.-P. 91-98.

165. Sheeran P., Hall G.M. Cytokines in anaesthesia. // Br J Anaesth. 1997.-V. 78.-P. 201-219.

166. Sheeran P., Hall G.M. Cytokines in anaesthesia. // Br J Anaesth. 1997.-V. 78.-P. 201-219.

167. Shenkar R., Coulson W.F., Abraham E. Hemorrhage and resuscitation induce alterations in cytokine expression and the development of acute lung injury. // Am J Respir Cell Mol Biol. 1994. — V. 10.-P. 290-297.

168. Shimazu R., Akashi S., Ogata H., Nagai Y., Fukudome K., Miyake K. and Kimoto M. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4. // J. Exp. Med. 1999. V. 189. -P. 1777-1782.

169. Siebenlist U, Franzoso G, Brown K. Structure, regulation and function of NF-kappa B. // Annu Rev Cell Biol. 1994. V. 10. - P. 405455.

170. Siemieniuk E., Skrzydlewska E. Coenzyme Q10: its biosynthesis and biological significance in animal organisms and in humans. // Postepy Hig Med Dosw. 2005. V. 59. - P. 150-159.

171. Silverman N., Maniatis T. NF-kB signaling pathways in mammalian and insect innate immunity. // Genes & Development. 2001. -V. 15.-P. 2321-2342.

172. Sinke A.P., Jayakumar A.R., Panickar K.S., Moriyama M., Reddy P.V.and Norenberg M.D. NFkappaB in the mechanism of ammonia-induced astrocyte swelling in culture. // J Neurochem. 2008. V. 106. -№6.-P. 2302-2311.

173. Sirard J. C., Bayardo M. and Didierlaurent A. Pathogen-specific TLR signaling in mucosa: mutual contribution of microbial TLR agonists and virulence factors. // Eur. J. Immunol. 2006. — V. 36. P. 260-263.

174. Soti C., Csermely P. Chaperones come of age. // Cell Stress Chaperones. 2002. -V. 7. № 2. - P. 186-190.

175. Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity. // Nat Rev Immunol. 2002. V. 2. - № 3. - P. 185-194.

176. Srivastava P.K., Menoret A., Basu S., Binder R.J., McQuade K.L. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. // Immunity. 1998. V. 8. - № .6. - P. 657-665.

177. Stoll L. L., Denning G. M., and Weintraub N. L. Endotoxin, TLR4 signaling and vascular inflammation: potential therapeutic targets in cardiovascular disease. // Curr. Pharm. Des. 2006. V. 12. - P.4229-4245.

178. Summers D.W., Douglas P.M., Ramos C.H., Cyr D.M. Polypeptide transfer from Hsp40 to Hsp70 molecular chaperones. // Trends Biochem Sci. 2009. V. 34. - № 5. - P. 230-233.

179. Szkopinska A. Ubiquinone.Biosynthesis of quinone ring and its isoprenoid side chain. Intracellular localization. // Acta Biochim.Pol. 2000.-V. 47.-P. 163.

180. Takeda K., Takeuchi O., Tsujimura T., Itami S., Adachi O., Kawai T., Sanjo H., Yoshikawa K., Terada N., and Akira S. Limb and skin abnormalities in mice lacking IKKa. // Science. 1999. V.284. - P. 313-316.

181. Targowski S.A.,Klucinski W., Babiker S and Nonnecke B.J. Effect of ammonia on in vivo and in vitro immune responses. // Infection and Immunity. 1984. V. 43. - JV« 1. P. 289-293.

182. Tarkowski A., Bjersing J., Shestakov A., Bokarewa M.I. Resistin competes with lipopolysaccharide for binding to toll-like receptor 4. // J Cell Mol Med. 2010.-V. 14.-P. 1419-1431.

183. Thornton A.M., Donovan E.E., Piccirillo C.A., Shevach E.M. Cutting edge: IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+ T cell suppressor function. // J Immunol. 2004. V. 172. -P.6519-6523.

184. Tidswell M., Tillis W., Larosa S. P. Phase 2 trial of eri-toran tetrasodium (E5564), a Toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. // Critical Care Medicine. 2010. V. 38. - № 1. - P.72-83.

185. Towbin, T. Staeheln, and J. Gordon, ProcElectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Natl. Acad. Sci. USA, 7, 4350-4354 (1979)

186. Tracey K.J. The inflammatory reflex. // Nature. 2002. V. 420. -P. 853-859.

187. Vgontzas A.N., Bixler E.O., Lin H.M., Prolo P., Trakada G., Chrousos G.P. IL-6 and its circadian secretion in humans. // Neuroimmunomodulation. 2005. V. 12. - P. 131-140.

188. Von Schlieffen E. et al., Multi-Hit Inhibition of Circulating and Cell-Associated Components of the Toll-Like Receptor 4 Pathway by Oxidized Phospholipids. // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2009. V. 29.-p. 356-362.

189. Wada T., Penninger J.M. Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation. // Oncogene. 2004. V. 23. - № 16. - P. 28382849.

190. Wakefield C.H., Barclay G.R., Fearon K.C.H., et al. Proinflammatory mediator activity, endogenous antagonists and the systemic inflammatory response in intra-abdominal sepsis. // Br J Surg. 1998.-V. 85.-P. 818-825.

191. Wald P.H., Becker C.E. Toxic gases used in the microelectronics industry. // Occup Med. 1986. V. 1. - № 1. - P. 105-117.

192. Waldmann T A. The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design. // Nat Rev Immunol. 2006.-V. 6.-P. 595-601.

193. Wang H.-D., Lu D.-X., Qi R.-B. Therapeutic stratedies targeting the LPS signaling and cytokines. // Pathophysiology. 2009. — V.16. № 4. -P.291-296.

194. Ware B.L., Matthay M.A. The acute respiratory distress syndrome. // N Engl J Med. 2000.- -V. 342, P. 1334-1349.

195. Welch W.J. How cells respond to stress. // Sci Am. 1993. V. 268.-№5.-P. 56-64.

196. Westerheide S.D., Anckar J., Stevens S.M. Jr, Sistonen L., Morimoto R.I. Stress-inducible regulation of heat shock factor 1 by the deacetylase SIRT1. // Science. 2009. V. 323. - № 5917. - P. 10631066.

197. Weston C.R. and Davis R.J. The JNK signal transduction pathway // Curr. Opini. Genes Dev. 2002. -V. 12. P. 14-21.

198. Winnie A.P., Nader A.M. Santayana's prophecy fulfilled. // Reg Anesth Pain Med. 2001. V. 26. - № 6. - P. 558-564.

199. Wright S. D., Ramos R. A., Tobias P. S., Ulevitch R. J. and Mathison J. C. CD 14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. // Science. 1990. V. 249. - P. 14311433.

200. Wullaert A., Heynick K., Beyaert R. Mechanisms of creactive oxygen speciesstalk between TNF-induced NF-kappaB and JNK activation in hepatocytes. // Biochem. Phannacol. 2006. V. 72. - P. 1090-1101.

201. Xiao G., Rabson A.B., Young W., Qing G., Qu Z. Alternative pathways of NF-kappaB activation: a double-edged sword in health and disease // Cytokine Growth Factor Rev. 2006. V.17. - P.281-293.

202. Young A.J., Lowe G.M., Antioxidant and prooxidant properties of carotenoids. // Arch Biochem Biophys. 2001. V. 385. - P. 20-27.

203. Young J.C., Barral J.M. More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. // Ulrich Hartl FTrends Biochem Sci. 2003. V. 28.-№ 10.-P. 541-547.

204. Young J.C., Moarefi I., Hartl F.U. Hsp90: a specialized but essential protein-folding tool. // J Cell Biol. 2001. V. 154. - P. 267273.

205. Yu M., Shao D., Yang J., Freng S., Xu J. Ketamine suppresses intestinal TLR4 expression and NF-kB activity in lipopolysaccharide-treated rats. //Croatian Medical Journal. 2006. V. 47. - № 6. - P. 825831.

206. Zhang H., Spapen H., Nguyen D.N., Benlabem M., Buurman W.A., Vincent J.L. Protective effects of N-acetyl-l-cysteine in endotixaemia. // Am. J. Physiol 1994. V. 266. - P. 1746-1754.

Информация о работе

Парфенюк, Светлана Борисовна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.00.04

Диссертация

Сравнительное исследование эффектов токсинов разной природы на стрессовый ответ лимфоидных клеток: роль некоторых каскадов внутриклеточной сигнализации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы