Роль белков GAF и Zeste в активации транскрипции и нейтрализации инсуляторов у Drosophila melanogaster

Зобачева, Полина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль белков GAF и Zeste в активации транскрипции и нейтрализации инсуляторов у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль белков GAF и Zeste в активации транскрипции и нейтрализации инсуляторов у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4.

ЗОБАЧЕВА ПОЛИНА ЮРЬЕВНА Роль белковСАЕ и Zeste в активации транскрипции и нейтрализации

инсуляторов у Drosophila melanogaster. Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

2003

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН

Научные руководители:

Чл.-корр. РАН., доктор биологических наук, профессор Георгиев П.Г., кандидат биологических наук Мельникова Л.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Любомирская Н.В.

кандидат биологических наук Симонова О.Б.

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

заседании

Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334,

Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.

В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва,ул. Вавилова, д.32.

Защита диссертации состоится

ноября 2003 года в

Автореферат разослан

октября 2003 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

канд.фарм.наук

Грабрвская Л.С,

2<ъоЗ-А

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы:

Геном высших эукариот содержит огромное количество генов и элементов их регуляции, таких как энхансеры и сайленсеры. Энхансеры могут активировать транскрипцию гена независимо от ориентации и, находясь от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов . Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию целого ряда генов. Так как в геноме гены часто располагаются достаточно близко друг к другу, существуют механизмы, « обеспечивающие взаимодействие энхансера с промотором только своего гена и

предотвращающие активацию других промоторов. В предотвращении взаимодействий между нежелательными энхансерами и промоторами важную роль могут играть инсуляторные элементы.

Инсуляторы - это цис-регуляторные элементы, которые способны блокировать взаимодействия между энхансером и промотором гена только в том случае, если находятся между ними. При этом ни энхансер, ни промотор не теряют своей функциональности. Изучение механизмов действия инсуляторов имеет огромное значение для понимания принципов независимой экспрессии генов, а также механизмов специфического взаимодействия между регуляторными элементами.

В настоящее время наиболее изученным инсулятором является 8и(Н\у) инсулятор, входящий в состав ретротранспозона МДГ4 у ОгохорИНа те1апо%аМег. В работе инсулятора участвуют два белка 8и(1^) и Мос1(тс^4). Хотя оба белка клонированы и определена их структура, единого мнения о механизме действия инсулятора не существует.

Недавно было показано, что если два 8и(Н\у) инсулятора находятся между энхансером и промотором, то происходит нейтрализация их активности Более того, взаимодействие между двумя инсуляторами может способствовать более эффективной активации промотора энхансером. Целью настоящего исследования явилось дальнейшее исследование механизмов, которые лежат в основе феномена нейтрализации 8и(Н\у) инсулятора

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ ) I БИБЛИОТЕКА |

Цель и задачи исследования:

Основной целью настоящего исследования являлось изучение с помощью генетических методов взаимодействия между Su(Hw) инсулятором и GAF сайтами, а также между сайтами связывания для белка Zeste.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Создать модельную систему для изучения взаимодействия между Su(Hw) инсулятором и GAF сайтами, базирующуюся на методе стабильной интеграции репортерных генов в геном Drosophila melcmogaster

2.Изучить как нейтрализация Su(Hw) инсулятора проявляется в регуляторных системах генов yellow и white.

3.Выяснить какую роль в явлении нейтрализации инсуляции играют белки Mod(mdg4) и GAF.

4.Выяснить, способен ли белок Zeste, образующий мультимерные комплексы in vitro, блокировать взаимодействие между энхансером и промотором гена yellow.

Научная новизна и практическое значение работы:

В данной работе впервые показано, что взаимодействие между белками GAF и Mod(mdg4) может привести к нейтрализации активности Su(Hw) инсулятора Данное явление продемонстрировано для регуляторной системы гена mimwhite. В тоже время для нейтрализации действия Su(Hw) инсулятора в регуляторной системе гена yellow необходимо взаимодействие между пока неидентифицированными белками. Кроме того продемонстрировано, что мультимерные сайты для белков GAF и Zeste не являются инсуляторами.

Полученные результаты предполагают, что взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами и другими регуляторными белками способны модулировать энхансер-промоторные взаимодействия, что может быть использовано для обеспечения специфичной активации и независимой экспрессии трансгенов в генно-инженерных конструкциях у дрозофилы, а также у других организмов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 42 и 43 Ежегодных конференциях по исследованию на дрозофиле (Питсбург, США, 2000 и Вашингтон, США, 2001), на международной конференции в ИБГ РАН (2003) и на межлабораторном семинаре ИБГ РАН(2003).

Публикации. По теме диссертации опубликованы две печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 81 странице, включает 6 таблиц и 13 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 123 источника.

Результаты исследования.

1. Модельная система для анализа функционального взаимодействия между белками инсуляторов. Основной задачей данного исследования было изучение взаимодействия между белками, которые связываются с Su(Hw) инсулятором и GAF. Ранее было показано, что инсерция двух Su(Hw) инсуляторов между энхансером и промотором приводит к нейтрализации инсуляции. Таким образом, взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами приводит к нейтрализации их активности. Следовательно эффект нейтрализации блокирования энхансеров, как результат взаимодействия между инсуляторами, можно использовать для изучения взаимодействия между различными инсуляторами или между инсуляторами и белками, которые связываются с областями энхансеров и промоторов. При изучении взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами были использованы регуляторные области генов yellow и white

Ген yellow отвечает за пигментацию кутикулярных структур личинки и имаго и контролируется несколькими тканеспецифичными энхансерами. Энхансеры, определяющие экспрессию в кутикуле тела и крыловых пластинках (в дальнейшем -энхансеры тела и крыльев), расположены перед промотором гена, а энхансер, отвечающий за экспрессию в щетинках - в интроне. Инсерция Su(Hw) инсулятора между энхансерами и промотором гена yellow приводит к блокированию SupHw) инсулятором изолированных энхансеров тела и крыльев, что фенотипически выражается в отсутствии пигмента в крыльях и кутикуле тела (желтые тело и крылья). Инактивация белка Su(Hw) путем введения комбинации мутаций приводила к восстановлению пигментации в теле и крыльях. Инсерция двух копий Su(Hw) инсулятора между энхансером и промотором гена yellow не блокирует взаимодействие между энхансерами тела и крыльев и промотором гена yellow. Таким образом, было продемонстрировано, что две копии Su(Hw) инсулятора нейтрализуют друг друга.

Рис.1 Схематичное изображение механизма нейтрализации блокирования энхансеров при взаимодействии двух Su(Hw) инсуляторов в гене yellow.

Е<») Е(Ь)

Второй используемой тест-системой была регуляторная система гена miniwhite. Его "предшественник" - ген white - отвечает за пигментацию глаз и контролируется тканеспецифичным энхансером, обеспечивающим экспрессию в глазах мух (в дальнейшем - энхансер глаз) и в семенниках. Ген miniwhite был получен in vitro путем делении значительной части первого интрона гена white. Ген miniwhite сохраняет способность активироваться энхансером. В присутствии энхансера глаза обычно окрашены в ярко красный цвет, в его отсутствии глаза мух имеют желтый или оранжевый цвегг. Ранее было показано, что Su(Hw) инсулятор способен эффективно блокировать взаимодействия между энхансером и промотором гена miniwhite в трансгенных конструкциях, кроме того, два Su(Hw) инсулятора, окружающие ген miniwhite полностью защищают его от эффекта положения. При введении двух копий Su(Hw) инсулятора происходило восстановление активации промотора гена white глазным энхансером. В некоторых трансгенных линиях, взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами способствовало более эффективному взаимодействию между глазным энхансером и промотором гена white. Таким образом, активация white промотора глазным энхансером также определяется взаимодействием между Su(Hw) инсуляторами.

Рис.2 Схематичное изображение механизма нейтрализации блокирования энхансеров при взаимодействии двух 8ц(Н\у) инсуляторов в гене тМяНМе.

E(w)\E(b)

Надо отметить, что недостатком гена mintwhile, как модельной системы для анализа взаимодействия между энхансером и промотором, является чувствительность его экспрессии к влиянию окружающих регуляторных последовательностей, т.е. эффекту положения. Хотя и можно говорить о среднем уровне пигментации для каждой конкретной конструкции, при инсерции в различные места генома окраска глаз может варьировать от почти белой до красной. Поэтому для изучения роли глазного энхансера в активации транскрипции он был фланкирован сайтами FLP-рекомбиназы дрожжей - FRT. Индукция сайт-специфичной рекомбинации между FRT-сайтами позволяет удалить энхансер, и в результате можно сравнивать экспрессию гена miniwhite в присутствии и в отсутствии энхансера в одном и том же месте генома. Для индукции сайт-специфической рекомбинации используются специальные линии, содержащие ген, кодирующий FLP-рекомбиназу, под контролем сильного индуцибильного промотора гена теплового шока. В наших конструкциях энхансер глаз, окруженный FRT-сайтами, был встроен между энхансерами тела и крыльев гена yellow. Это возможно благодаря тому, что энхансеры обоих генов специфичны и активируют только свой ген.

2. Изучение функционального взаимодействия менеду белками Su(Hw) инсулятора и caüiaMii связывания для GAF белка.

В качестве сайтов для GAGA binding protein (GAF) были использован фрагмент из регуляторной области гена heat shock 70, который содержит 4 сайта для GAF белка. Ранее было продемонстрировано, что с этими сайтами связывается GAF белок, который определяет структуру hsp70 промотора. Другие белки, в том числе белок для активатора hsp промоторов (HSF, heat shock factor), с этим фрагментом не связываются. Предполагается, что нативные сайты для белка GAF, которые имеют определенную структуру и определенное расстояние между сайтами, являются более эффективными, чем синтетические сайты для GAF. GAF фрагмент был получен с помощью амплификации ДНК на матрице плазмиды, содержащей последовательность hsp70 промотора между праймерами hspl и hsp2. Две копии полученного фрагмента были встроены в плазмиду pUC19. Структура вставки была проверена с помощью сиквенса. В результате оказалось, что две копии фрагмента встроились в одной ориентации. Таким образом, GAF фрагмент (сокращенно G8) содержит 8 сайтов связывания белка GAF.

Для установления функции GAF сайтов в блокировании энхансеров была создана Ey(e)(G8)YW конструкция (рис.3), в которой фрагмент G8 был встроен в положении -893 относительно начала транскрипции гена yellow В результате G8 фрагмент находится между энхансерами и промоторами генов yellow и white. Для выяснения роли G8 фрагмента в экспрессии генов он был встроен между сайгами для Сге рекомбиназы (LOX сайты). Количество копий трансгена и его структура в полученных линиях была проверена с помощью Саузерн- блот анализа. В результате было получено 22 линии с единственной копией Ey(e)G8YW конструкции. В 19 из 22 трансгенных линий мухи имели пигментированные тело и крылья на уровне линий с диким (у+) аллелем. Таким образом, GAF сайты не приводят к репрессии транскрицции гена yellow. Мухи большинства линий имели высокий уровень окраски глаз от темно-оранжевого до красного, что говорит о возможной активации гена white глазным энхансером. Чтобы определить роль энхансера глаз в активации транскрипции гена mmiwhite, в 8 линиях было индуцировано его вырезание с помощью сайт-специфичной рекомбинации по FRT-сайтам. Отсутствие энхансера существенно снизило окраску глаз у всех тестируемых линий до темно-желтых - светло-желтых глаз. Таким образом, энхансер глаз способен активировать транскрипцию гена white через восемь сайтов для белка GAF. В то же время слабая окраска глаз у мух в трангенных линиях свидетельствует о том, что сами GAF сайты не активируют транскрипцию гена white. Для подтверждения данных выводов, G8 фрагммент был делегирован в 15 трансгенных Ey(e)(G8)YW линиях, содержащих глазной энхансер и 7 трансгенных линиях без глазного энхансера. Во всех исследованных линиях деления G8 фрагмента не привела к видимому изменению пигментации глаз. Таким образом, GAF сайты не влияют на экспрессию гена white и не блокируют взаимодействие с глазным энхансером.

Рис. 3 Схема конструкции Ey(e)(G8)YW

E(b) и E(w) -энхансеры, активирующие ген yellow в крыльях и теле дрозофилы;. Е(е)-энхансер глаз Энхансер глаз окружен FRT сайтами GAF - восемь сайтов связывания для белка GAF. Фрагмент, содержащий GAF окружен LOX сайтами; yellow - полноразмерная копия гена yellow, mmiwhite - ген while с частично делегированным первым интроном. Стрелки указывают направление транскрипции yellow и mimwhile генов, черные треугольники на концах конструкций обозначают последовательности Р элемента, К-исходная конструкция, AGAF-делеция GAF сайтов, + обозначает активацию гена white энхансером глаз и активацию гена yellow энхансерами тела и крыльев

E(e) GAF

yellow

mini-white

E(w) E(b)

К AGAF yellow + + white + +

Для установления возможной роли GAF сайтов в активации транскрипции гена yellow была создана производная Ey(e)(G8)YW конструкции, в которой область энхансеров гена yellow была делегирована -(G8)YW (рис.4). В результате трансформации в эмбрионы мух было получено 14 трансгенных (G8)YW линий, которые были протестированы с помощью Саузерн-блот анализа. Все линии имели у2-подобный фенотип (желтое тело и крылья, окрашенные щетинки), что характерно для линий, в которых ген yellow не имеет энхансеров тела и крыльев. Делеция G8 фрагмента не изменяла пигментацию тела и крыльев мух из трансгенных линий. Таким образом, GAF сайты не влияют на транскрипцию гена yellow . Одновременно, делеция G8 фрагмента не изменяла экспрессии гена white, что еще раз подтверждает, что GAF белок не способен активировать транскрипцию гена white.

Таким образом, мультипликация GAF сайтов в G8 фрагменте не приводит к появлению функционального инсулятора, что противоречит ранним литературным данным, свидетельствующим, что GAF сайт в области промотора может блокировать энхансеры.

GAF

LOX

yellow

mim-white

К AGAF

yellow

Рис.4 Схема KoHcrpyKmm(G8)YW . -обозначает отсутствие активации гена white энхансером глаз и отсутствие активации гена yellow энхансерами тела и крыльев. Все остальные обозначения как на рис.3

3. Сайты связывания для белка GAF частично нейтрализуют блокирование глазного энхансера Su(Hw) инсулятором.

В более раннем исследовании было показано, что один Su(Hw) инсулятор полностью блокирует глазной энхансер Так как одним из основных компонентов Su(Hw) инсулятора является белок Mod(mdg4), который содержит BTB/POZ домен, то представляется возможным взаимодействие между GAF белком и Mod(mdg4) через ВТВ домен, наличие которого способствует образованию мультимерных комплексов. Для проверки этой гипотезы была создана конструкция Eye(G8)Y(S)W. В этой конструкции G8 фрагмент окруженный FRT сайгами, был встроен в положение -893 п н. относительно начала транскрипции гена yellow, в то время как Su(Hw) инсулятор, окруженный LOX сайтами, был встроен между генами yellow и white. Глазной энхансер был встроен между энхансерами тела и крыльев как в ранее описанных конструкциях (рис 5).

В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы линии yw было получено 17 трансгенных Eye(G8)Y(S)W линий с единичной инсерцией конструкции в геном. Молекулярная структура линии и количество копий в геноме были проверены с помощью Саузерн- блот анализа. Как и ожидалось в 15 из 17 трансгенных линий мухи имели пигментацию тела и крыльев на уровне дикого типа, что является следствием неспособности GAF сайтов блокировать взаимодействие между энхансерами и промотором гена yellow . Уровень пигментации глаз у мух в данных линиях варьировал в пределах от темно-оранжевого до красно-коричневого, что предполагает активацию гена white глазным энхансером. Делеция Su(Hw) инсулятора в 11 из 17 трангенных Eye(G8)Y(S)W линий приводила к увеличению уровня пигментации глаз, что предполагает неспособность GAF сайтов блокировать взаимодействие между глазным энхансером и white промотором. Отсутствие влияния GAF сайтов на экспрессию гена white было подтверждено при получении производных линий, которые одновременно имели делецию GAF сайтов и делецию Su(Hw) инсулятора: пигментация глаз была одинакова в присутствии и отсутствии GAF сайтов. Таким образом, GAF сайты не влияют на транскрипцию генов yellow и white как инсуляторы. Они не способны блокировать взаимодействие между энхансерами и промоторами этих генов. Однако делеция G8 фрагмента в 16 из 17 трансгенных F.ye(G8)Y(S)W линий приводила к снижению пигментации глаз до уровня, который характерен для экспрессии гена white с полностью блокированным энхансером Таким образом, в

присутствии GAF сайтов Su(Hw) инсулятор частично теряет способность блокировать взаимодействие между энхансером и промотором гена white.

Рис.5 Схема конструкции Еуе(С8)¥(8^; 5и(Н\у) - инсулятор 8и(Н\у). Двойная стрелка обозначает отсутствие фенотипических изменений на фоне мутаций по вАР и по Mod(mdg4). Стрелка, направленная вниз, обозначает уменьшение уровня пигментации глаз, стрелка, направленная в верх, обозначает увеличение уровня пигментации глаз. А 8и(Н«г)-делеция инсулятора 5и(Н\у). Остальные обозначения как на рис 3

Е(е) GAF

Su(Hw)

yellow

mini-while

E(w) H(b)

AGAF

К AGAF ASUCHw) ASU(HW)

yellow + + +

white —h — + while

GAF" ф Ф <-+ Mod(mdg4)~ ф «-►

+ +

4. Взаимодействие между белками GAF и Mod(mdg4) приводит к

нейтрализации Su(Hw) инсулятора в конструкции Eye(G8)Y(S)W.

Ранее было показано, что в явлении инсуляции важны функции двух белков:

Su(Hw) и одной из изоформ белка Mod(mdg4) (Kuhn and Geyer 2002; 2003). Было также

установлено генетическое и физическое взаимодействие между этими белками

(Georgiev and Kozycina 1996; Gause et al. 2001; Ghosh et al. 2001). Так как белок

Mod(mdg4) содержит на N-конце ВТВ домен, который имеет высокую степень

гомологии с ВТВ доменом белка GAF, мы решили выяснить, какова роль белков

Mod(mdg4) и GAF в осуществлении нейтрализации действия Su(Hw) инсулятора. С

этой целью была использована мутация mod(mdg4)"', которая инактивирует только

одну изоформу белка Mod(mdg4), отвечающую за взаимодействие с белком Su(Hw)

(Gerasimova et al. 1995).

Мутации в гене tri, который кодирует две изоформы белка GAF, являются

рецессивными деталями В настоящем исследовании нами были использованы trf85 и

tri'30 аллели, которые приводят к полной инактивации гена Так как ген tri активно

экспрессируется в яйцеклетках, т е он имеет материнский эффект, для максимального

снижения количества белка GAF в анализируемых мухах при скрещивании использовали гетерозиготных по trl мутации самок и самцов с анализируемой конструкцией.

В присутствии гомозиготной mod(mdg4)u' мутации происходило заметное снижение пигментации глаз в 11 из 15 проанализированных трансгенных Eye(G8)Y(S)W линий. В тоже время мутация mod(mdg4)u1 не влияла на пигментацию глаз в производных Eye(G8)Y(AS)W линиях, где был удален Su(Hw) инсулятор. В производных Eye(AG8)Y(S)W линиях с удаленным G8 фрагментом, мутация mod(mdg4)"' приводила к увеличению пигментации глаз в 9 из 15 проанализированных трансгенных линий, что согласуется с ранее опубликованными данными о роли Mod(mdg4) в активности Su(Hw) инсулятора. Таким образом, полученные данные показывают, что белок Mod(mdg4) необходим для нейтрализации Su(Hw) инсулятора сайтами связывания белка GAF.

На фоне гетерозиготных мутаций trfssh- и trl'x/+ происходило значительное снижение окраски глаз в 13 из 15 проанализированных Eye(G8)Y(S)W линиях. Одновременно trl/+ гетерозиготрые мутации не влияли на пигментацию глаз у мух производных линий с делитированным G8 фрагментом (Eye(AG8)Y(S)W) или делитированным Su(Hw) инсулятором (Eye(G8)Y(AS)W). Следовательно, мутации в гене trl снижают эффективность нейтрализации инсуляции G8 фрагментом, но не влияют на экспрессию гена mmiwhite либо в отсутствии Su(Hw) инсулятора либо в отсутствии G8 фрагмента.

Таким образом, полученные данные предполагают, что взаимодействие между белками Mod(mdg4) и GAF приводит к частичной нейтрализации активности Su(Hw) инсулятора

5. G8 фрагмент частично нейтрализует инсуляцню энхансеров гена yellow Su(Hw) инсулятором.

Ранее было показано, что при инсерции Su(Hw) инсулятора в положение -343 п н относительно начала транскрипции гена yellow происходит полное блокирование энхансеров тела и крыльев (Muravyouva et al. 2001). Инсерция двух копий Su(Hw) инсулятора между энхансерами и промотором гена yellow восстанавливает взаимодействие между энхансерами и промотором, (нейтрализация инсуляции).

Для выяснения того, насколько общей является нейтрализация активности Su(Hw) инсулятора за счет взаимодействия Mod(mdg4) и GAF белков, была создана

конструкция, Ey(G8)(S)YW (рис.ба). В этой конструкции Su(Hw) инсулятор окруженный LOX сайтами, был встроен в положение -343 п.н., a G8 фрагмент, окруженный FRT сайтами, был встроен в положение -893 п н. относительно начала транскрипции гена yellow. Таким образом, G8 фрагмент и Su(Hw) инсулятор находились между энхансерами и промотором гена yellow,

В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы линии yw были получены 26 трансгенных Ey(G8)(S)YW линий, которые содержали единичную инсерцию конструкции в геном, что было проверено с помощью Саузерн-блот анализа (рис.66). В 19 из 26 полученных трансгенных линиях мухи имели более темную пигментацию тела и крыльев, чем в трансгенных линиях, которые содержали конструкцию, где энхансеры yellow были блокированы Su(Hw) инсулятором . Делеция G8 фрагмента в 14 линиях привела к снижению пигментации до уровня характерного для трангенных линий, в которых Su(Hw) инсулятор полностью блокирует энхансеры тела и крыльев гена yellow. В большинстве трансгенных линий GAF сайты только частично супрессировали действие Su(Hw) инсулятора. Однако в 4 трангенных линиях GAF фрагмент почти полностью нейтрализовал Su(Hw) инсулятор, а в б линиях не оказывал видимого эффекта на Su(Hw) инсулятор. Отсутствие воздействия GAF фрагмента на инсулятор можно объяснить либо неактивностью энхансеров тела и крыльев в данной трансгенной линии, либо тем, что эффект нейтрализации зависит от положения конструкции в геноме (эффект положения). При делеции Su(Hw) инсулятора в производных Ey(G8)(AS)YW линиях происходило восстановление пигментации тела и крыльев независимо от того способен ли G8 фрагмент нейтрализовать инсуляцию или нет. Следовательно, эффект положения влияет на способность GAF фрагмента нейтрализовать Su(Hw) инсулятор. Можно предположить, что окружающий конструкцию хроматин может влиять на композицию белков, которые собираются на GAF фрагменте.

Рис. 6 а - Схема конструции E(G)(S)Y. Все обозначения как на рис.5, б- Экспрессия гена yellow в щетинках и волосках. Сокращения - по оси абсцисс m- mod(mdg4)ul, + - mod(mdg4)+ и указаны названия линий. Только в 10 E(G)(S)Y линиях был проанализирован эффект вырезания Su(Hw) инсулятора и GAF сайтов на mod(mdg4)ul-3aBHCHMyio репрессию гена yellow.

Su(Hw)

Вг/

5 У Е 0 "¡9

w-V 0 0 6 0

m-V 0 Ш т 0

e-V 0 5 0

1 1 У щ 52 N0 .

+ a + с. c>

__t g f

F(OXS)YW 4 si

* t(OXS)YWm/m

6. Взаимодействие между белками GAF и Mod(mdg4) не влияет на нейтрализацию активности Su(Hw) инсулятора G8 фрагментом в конструкции Ey(G8)(S)YW.

Для установления роли белков GAF и Mod(mdg4) в нейтрализации инсуляции в Ey(G8)(S)YW трансгенных линиях были использованы те же мутации, что и в п. 4. Влияние мутаций tri было проанализировано для IS Ey(G8)(S)YW линий. В результате оказалось, что tri мутации не влияли на уровень пигментации тела и крыльев во всех Ey(G8)(S)YW линиях вне зависимости от исходной степени пигментации

Ранее было продемонстрировано, что Su(Hw) инсулятор в присутствии гомозиготной мутации mod(mdg4)"' может ингибировать непосредственно промотор гена yellow (Kozycina and Georgiev 1996). Однако ингибирование и его степень зависит от места встраивания конструкции в геном дрозофилы Неожиданно оказалось, что в линиях, где G8 эффективно нейтрализует Su(Hw) инсулятор, мутация mod(mdg4)111 не изменяла степень пигментации тела и крыльев. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что в данном случае взаимодействие между белками Mod(mdg4) и GAF не способно нейтрализовать действие Su(Hw) инсулятора.. Можно предположить, что другие белки, которые связываются с GAF фрагментом и Su(Hw) инсулятором, отвечают за эффект нейтрализации инсуляции в конструкции Ey(G8)(S)YW.

Интересно, что при температуре 18 "С пигментация тела и крыльев у мух из трансгенных Ey(G8)(S)YW линий становится более светлой, чем у мух из тех же линий при температуре 25 °С. В тоже время фенотип мух из производных Ey(G8)(AS)YW с удаленным Su(Hw) инсулятором при температуре 18 "С не меняется Можно предположить, что белковый фактор, отвечающий за эффект нейтрализации Su(Hw) инсулятора в системе гена yellow, не способен эффективно связывается с фрагментом G8 при низких температурах

7. G8 фрагмент усиливает репрессию теня yellow Su(Hw) инсулятором в

Как было указано выше, инактивация белка Mod(mdg4) при введении мутации mod(mdg4)u' превращает Su(Hw) инсулятор в репрессор транскрипции гена yellow. Однако степень репрессии зависит от места встраивания конструкции в геном. Например, в присутствии мутации mod(mdg4)"' Su(Hw) инсулятор в положении -343 п.н репрессирует транскрипцию гена yellow у большей части трансгенных ES(-343)YW линий (рис 7).

Рис. 7 Схема конструкции ES(-343)YW . Все обозначения как на рис.5.

Степень репрессии варьировала от слабой (только отдельные щетинки желтые) до средней (около половины щетинок либо желтые, либо черные). Однако у части линий введение мутации mod(mdg4)"' не повлияло на транскрипцию yellow, что можно объяснить эффектом положения. Для получения статистически достоверных результатов были получены дополнительные инсершш конструкции ES(-343)YW в различные места генома с помощью индукции транспозиций конструкции с X хромосомы на аутосомы на фоне мутации mod(mdg4)"'. В результате были получены дополнительные 64 ES(-343)YW линии с единичной копией конструкции. В 19 линиях мутация mod(mdg4)"' не имела видимого эффекта, в то время как в 17 линиях приводила к полной репрессии гена yellow. В остальных 30 линиях мутация mod(mdg4)u' вызывала разную степень репрессии -от слабой до сильной. Таким образом, полную репрессию rem yellow мутация mod(mdg4)"' вызывала только в 36 %

присутствии гомозиготной мутации mod(mdg4)"'.

Su(Hw)

E(w) Е(Ь)

от общего числа трансгенных линий (47), в которых эта мутация имела эффект.

Для установления роли GAF сайтов в репрессии транскрипции гена yellow с ослабленным промотором в присутствии мутации mod(mdg4)u' были использованы трансгенные линии E(G)(S)Y, в которых место встраивания конструкции находилось на X хромосоме. Гомозиготная мутация mod(mdg4j"' была введена в 16 исходных линий. Дополнительные 61 трансгенные линии были получены с помощью индукции транспозиций конструкции с X хромосомы на аутосомы на фоне мутации mod(mdg4f>. По действию мутации mod(mdg4)"' все трансгенные линии можно разделить на два класса (рис 66). в 19 линиях mod(mdg4)"' не имела эффекта. Интересно, что именно в этих линиях G8 фрагмент эффективно подавлял активность Su(Hw) инсулятора. В 52 линиях мутация mod(mdg4)"' приводила к полной репрессии гена yellow. Только в 15 линиях степень репрессии варьировала от слабой (только отдельные щетинки желтые) до сильной (большая часть щетинок желтые). Таким образом, мутация mod(mdg4)"' полностью репрессировала транскрипцию гена yellow в 78% от общего числа трансгенных линий (67 линий).

На основании полученных данных можно сделать заключение, что GAF сайты усиливают репрессию гена yellow, вызванную Su(Hw) инсулятором в присутствии мутации mod(mdg4)"'. Для прямого доказательства этого предположения в 10 трансгенных линиях, имеющих у1 фенотип на фоне мутации mod(mdg4)"', с помощью сайг-специфических рекомбиназ, как описывалось выше, был вырезан либо Su(Hw) инсулятор либо сайты связывания для GAF. После делении GAF сайтов в 8 из 10 E(G)(S)Y линий действие mod(mdg4)"' становилось менее выраженным, в то время как делеция Su(Hw) инсулятора приводила к тому, что мутация mod(mdg4)"' переставала оказывть видимое влияние на фенотип мух (рис.бб). Таким образом, GAF сайты не способны самостоятельно репрессировать транскрипцию гена yellow на фоне мутации mod(mdg4)ul, однако они усиливают репрессию, которая вызвана Su(Hw) инсулятором. Можно предположить, что в отсутствии белка Mod(mdg4) белок GAF либо другие белки, которые связываются с G8 фрагментом, взаимодейсвуют с белками, которые связываются с Su(Hw) инсулятором Таким образом, между Su(Hw) инсулятором и G8 фрагментом осуществляются мультибелковые контакты

8. Роль G8 фрагмента в восстановлении частично иняктивированного промотора

Сайты для GAF обычно находятся в области промотора, что предполагает роль GAF в поддержании открытой структуры хроматина Ранее в нашей лаборатории была продемонстрирована способность Su(Hw) стимулировать частично инактивированный промотор гена yellow. Можно предположить, что GAF сайты могут обладать аналогичными свойствами. Ранее было показано, что делеция от -69 п.н. до -144 п.н. относительно промотора гена yellow значительно ослабляет эффективность этого промотора: экспресссия в щетинках почти полностью отсутствует, а в теле и крыльях заметно снижается (Belenkaya et al. 1998). В конструкции E(G)AY(S) в промоторной области была сделана делеция между -144 п.н. и -69 п.н. (рис. 8а). Su(Hw) инсулятор был встроен с 3' конца rem yellow и окружен LOX сайтами. Фрагмент G8 был окружен FRT сайтами и встроен в положение -893 п.н. относительно начала транскрипции гена yellow между энхансерами тела и крыльев и промотором. Маркерный ген white, определяющий цвет глаз у дрозофилы, был встроен позади гена yellow.

Рис.8 Роль сайтов связывания белка GAF и Su(Hw) инсулятора в регуляции транскрипции гена yellow, а - Схема конструкции E(G)AY(S). Скобки схематично указывают локализацию делеции размером 74 п.н. перед промотором гена yellow .Остальные обозначения как на рис 6а б -Восемь GAF сайтов не блокируют взаимодействие между энхансером и промотором тена yellow Уровень экспрессии гена yellow в последних сегментах брюшка обозначен цифрами на оси ординат: 1 - отсутствие экспрессии гена yellow (у1-фенотип); 5 - соответствует нормальному уровню экспрессии (у*-фенотип). АЬ - пигментация брюшка, в- Кооперативное взаимодействие между GAF сайтами и Su(Hw) инсулятором в активации транскрипции со слабого промотора гена yellow. Уровень экспрессии гена yellow в грудных щетинках и волосках обозначен символами на оси ординат' 1 - всс щетинки и волоски желтые (у'-фенотип); w-v, волоски и одна-две щетинки желтые; m-v, волоски и половина щетинок желтые, e-v, большая часть щетинок желтые; 5 - соответствует нормальному уровню экспрессии (у+ фенотип) Вг -пигментация грудных щетинок. На б и в- цифры внутри прямоугольников указывают число линий, соответствующих данному фенотипу. Сокращения : ASu(Hw)- делеция Su(Hw) инсулятора; AGAF - делеция GAF сайтов; ASu(Hw) + GAAF- делеция Su(Hw) инсулятора и GAF сайтов.

rtna yellow.

GAF

Su(Hw)

E(w) Е(Ь)

yellow

б в

АЬ 5 ч у' Вг< 5 у" 0

4 0 0 в 00 w-V 0

3 0 0 0 0 00 m-V 00 и 0

2 0 e-V 0 0 0 0

1 у' 0 1 ? 00 и N

+ о о £ + о ся А I + о 5 и с I + о ? 1Ï о W X Î, > со А X +

В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы было получено 19 E(G)AY(S) трансгенных линий, содержащих единичную копию конструкции, что было проверено с помощью Саузерн-блот анализа Все линии имели частично сниженную окраску тела и крыльев По окраске щетинок все линии сильно различались - от полностью пигментированных щетинок до инактивации гена yellow. Таким образом, полученные результаты предполагают, что степень репрессии гена yellow в линиях E(G)AY(S) зависит от положения конструкции в геноме Деления сайтов связывания для GAF не влияла на пигментацию тела и крыльев (рис 86), что еще раз демонстрирует неспособность GAF белка блокировать взаимодействие энхансеров тела и крыльев даже с ослабленным промотором гена yellow. В то же время деления GAF сайтов привела к резкому снижению уровня пигментации в щетинках (рис. 8в), что предполагает участие GAF сайтов в активации гена.yellow. Делеция Su(IIw) инсулятора снижала уровень пигментации кутикулы тела и крыльев в некоторых трансгенных линиях и приводила к полному обесцвечиванию щетинок (рис. 8в).

Полученные данные показывают, что GAF сайты не могут самостоятельно активировать слабый yellow промотор, находясь от него на расстоянии 800 п.н. Таким образом, активация слабого промотора гена yellow в щетинках обеспечивается кооперативным взаимодействием сайтов связывания для GAF белка и Su(Hw)

9. Мультипликация Zeste сайтов не создает функционального инсулятора.

Ранее было показано, что если два Su(Hw) инсулятора окружали либо энхансер, либо промотор какого-либо гена, то взаимодействие между энхансером и промотором было полностью блокировано. Наиболее вероятной интерпретацией таких результатов

является гипотеза, что взаимодействие между белковыми комплексами двух Su(Hw) инсуляторов приводит к стерической изоляции энхансера от промотора. Одним из следствий этой гипотезы является предположение, что и другие белки, способные эффективно взаимодействовать между собой, могут блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, подобно белковым комплексам Su(Hw) инсуляторов. Для проверки данного предположения был выбран белок Zeste, сайты связывания для которого были найдены в области энхансеров и промоторов многих генов В экспериментах in vitro была продемонстрирована способность белка Zeste образовывать мультимерные комплексы, что может иметь значение для стабилизации взаимодействия между энхансером и промотором. В некоторых случаях (Pirrotta 1990) белок Zeste необходим для транс-взаимодействия между энхансером и промотором, которые находятся на гомологичных хромосомах (трансвекция) Так трансвекция в гене white, белковый продукт которого определяет пигментацию глаз, зависит от Zeste белка Для настоящего исследования была использована часть энхансера гена white, которая содержит 5 сайтов связывания для белка Zeste. Как модель была использована регуляторная система гена yellow, белковый продукт которого определяет пигментацию кутикулы тела, крыльев и производных кутикулярных структур. Ранее было показано, что инсерция одного Su(Hw) инсулятора в положение -893 п н. относительно промотора гена yellow между энхансерами тела и крыльев и промотором, а другого - на 3' конце гена приводит к полному блокированию энхансеров тела и крыльев (Cai and Shen 2001). В конструкции Ey(Z)Y(Z)W (рис 9а) Zeste сайты были встроены также как и два Su(Hw) инсулятора в ранее описанной конструкции: в положение -893 п.н. относительно промотора и на 3' конце гена yellow Проксимальные Zeste сайты (между энхансерами и промотором гена yellow) были окружены LOX сайтами. Дистальные Zeste сайты (между генами yellow и white) были окружены FRT сайтами В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы было получено 14 Ey(Z)Y(Z)W трансгенных линий, содержащих единичную копию конструкции, что было проверено с помощью Саузерн-блот анализа. Во всех трансгенных линиях мухи имели хорошо пигментированную кутикулу тела и крылья, что предполагает эффективное взаимодействие между энхансерами и промотором гена yellow. Удаление фрагмента, заключенного между LOX сайтами, было подтверждено с помощью ПЦР анализа. Отсутствие видимого изменения экспрессии гена yellow при делеции проксимальных Zeste сайтов подтверждает отсутствие блокирования

энхансеров в Ey(Z)Y(Z)W трансгенных линиях. Удаление дистальных Zeste сайтов, а также вырезание обоих кластеров Zeste сайтов не влияло на экспрессию гена yellow в Ey(Z)Y(Z)W линиях.

Отсутствие блокирования энхансеров в Ey(Z)Y(Z)W линиях можно объяснить неспособностью кластеров сайтов связывания для белка Zeste взаимодействовать друг с другом. Для проверки такой возможности нами было проанализировано влияние делеции сайтов связывания Zeste белка на транскрипцию гена white. Удаление дистальных Zeste сайтов заметно снижало пигментацию глаз в 12 из 14 трансгенных линий (рис 96). Так как кластер Zeste сайтов содержит часть энхансера глаз, мы предположили, что дистальные Zeste сайты непосредственно активируют транскрипцию гена white. Неожиданно оказалось, что удаление проксимальных Zeste сайтов приводило к увеличению пигментации глаз в 7 из 14 трансгенных линий (рис. 96) Однако удаление всех Zeste сайтов имело такой же эффект на экспрессию гена white как и делеция только дистальных Zeste сайтов. Таким образом, полученные результаты предполагают, что взаимодействие между Zeste сайтами приводит к частичному блокированию способности дистальных Zeste сайтов активировать промотор гена white. Следовательно, Zeste сайты взаимодействуют, но при этом не могут блокировать энхансеры гена yellow.

Ранее было показано, что две точечные замены в белке Zeste - мутация z()p6 - усиливают способность Zeste образовывать мультимерные комлпексы.Также было показано, что мутация z0*6 является доминантным репрессором гена white. Другая мутация - z"™ -приводит к полной инактивации белка Zeste. Введение доминантной мутации z0*6 в восемь Ey(Z)Y(Z)W трансгенных линий не влияло на пигментацию тела и крыльев. Таким образом, более эффективная мультимеризацкя Zeste белка у z^1^ мутантов не приводит даже к слабому блокированию yellow энхансеров Как и ожидалось, мутация zvT7h также не влияла на экспрессию гена yellow, что еще раз подтверждает сделанные нами выводы.

В то же время, в 7 из 8 трансгенных линий мутация снижала пигментацию глаз (рис. 9в). Полученные результаты подтверждают, что мутантный белок z01"6 является специфичным репрессором для гена white, но не для гена yellow. Возможно, это связано с тем, что промотор гена white в отличии от промотора гена yellow содержит два функциональных сайта связывания для белка Zeste После удаления Zeste сайтов, мутация z0"6 не влияла на экспрессию гена white. Следовательно, за репрессию

отвечают Zeste сайты, которые находятся в энхансере, но не в промоторе гена white. Инактивация Zeste белка при введении мутации z*771" приводила к снижению пигментации глаз только у 3 из 8 протестированных трансгенных Ey(Z)Y(Z)W линий.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что взаимодействия между Zeste сайтами не достаточно для изоляции энхансеров гена yellow от его промотора. Следовательно, либо взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами намного более эффективно чем взаимодействие между Zeste сайтами либо только одного взаимодействия между сайтами не достаточно для блокирования энхансеров.

Рис.9 Изучение влияния сайтов связывания для Zeste белка на экспрессию генов yellow и white, а - Схема E(Z)Y(Z)W конструкции. Обозначения. Zeste, фрагмент энхансера гена white, включающий 5 сайтов связывания белка Zeste; остальные обозначения как на рис.7а. б -Экспрессия гена while в трансгенных E(Z)Y(Z)W линиях. Были использованы следующие градации пигментации глаза, которые отражают уровень экспрессии гена white белые (инактивация гена), светло желтые, желтые, темно желтые, оранжевые, темно оранжевые, коричневые, красно-коричневые, красные (дикий тип) в - Влияние z0"16 и zv77h мутаций на экспрессию гена white в Ey(Z)Y(Z)W трансгенных линиях.

Z-n

yellow

E(w) E(b)

LOX

FRT

окраска глаз

красный коричнево-красный коричневый

ш и

желтый

0 0 0 0

светло-желтый

белый

О с. ISI N

а Р

> F

окраска глаз, красный

коричнево-красный

коричневый

темно-оранжевый

оранжевый

темно-желтый

желтый

светло-желтый

белый

ни

01 @

а si

si 01 01

л Z-n

AZ-Д AZ-n+AZ-fl

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Роль GAF белка в ннсуляции.

В настоящее время известно всего несколько белков, которые участвуют в блокировании энхансеров Наиболее хорошо изучены белки, которые определяют функцию Su(Hw) инсулятора: Su(Hw) и Mod(mdg4). Из предположения о том, что инсуляция, как и ее нейтрализация, определяется взаимодействием инсуляторных элементов, вытекает, что именно эти два белка, Su(Hw) и Mod(mdg4), ответственны за взаимодействие Su(Hw) инсуляторов. Su(Hw) белок имеет ДНК-связывающий домен, состоящий из 12 цинковых пальцев, а также участок взаимодействия с С-концевым доменом белка Mod(mdg4), совпадающий по локализации с доменом, отвечающим за инсуляцию (Gause et al. 2001; Ghoush et al. 2001). В свою очередь, белок Mod(mdg4) имеет на своем N-конце BTB/POZ домен (Buchner et al 2000), отвечающий за эффективную гомополимеризацию (Gause et al 2001; Ghoush et al. 2001). Приведенные данные дают основание предполагать, что взаимодействие инсуляторов осуществляется через В ТВ домен белка Mod(mdg4).

Белки, имеющие ВТВ домен, были найдены у всех хорошо изученных высших эукариот и составляют многочисленный класс транскрипционных факторов. Так, секвенирование генома Caenorhabditis elegans выявило более 100 генов, которые кодировали белки, содержащие ВТВ домены (Chervitz et al. 1998) Известно, что ВТВ домен, как правило, является доменом эффективной гомополимеризации, и реже -гетерополимеризации. Наиболее хорошо исследованным ВТВ-содержащим белком

является GAGA фактор, который получил название благодаря своей способности связываться с GAGAG последовательностью (Katsani et al. 1999). Сайты связывания для GAGA фактора были найдены рядом с промоторами многих генов, в частности, в промоторной области генов теплового шока. На примере последних было показано, что GAGA фактор может вытеснять нуклеосомы из промоторной области, тем самым способствуя связыванию с промотором основных факторов транскрипционного комплекса. GAGA фактор содержит на N-конце ВТВ домен, имеющий высокую степень гомологии с ВТВ доменом белка Mod(mdg4), на С-конце белка находится ДНК-связывающий домен "цинковые пальцы" (Katsani et al. 1999). Недавно было продемонстрировано, что шесть молекул GAGA фактора взаимодействуют между собой посредством ВТВ доменов, после чего образовавшийся комплекс эффективно связывается с GAGA-сайтами, которые могут находиться на расстоянии 1-2 т.п.н. друг от друга (Mahmoudi et al. 2001). В результате этого происходит сближение удаленных сайтов связывания и выпетливание ДНК между ними, что можно наблюдать экспериментально. Для промотора гена engrailed было продемонстрировано, что GAGA сайты, расположенные рядом с энхансером и с промотором, необходимы и достаточны для их взаимодействия (Orihara et al. 1999). Более того, в некоторых случаях GAGA сайты могут выполнять инсуляторную функцию (Ohtsuki and Levine 1998). Косвенным подтверждением роли GAGA фактора в инсуляции является присутствие GAGA сайтов в последовательностях пограничных элементов Abd-B гена (Mihali et al 1998) и гене Antennapedia (Belozerov et al. 2003).

В настоящем исследование было продемонстрировано, что мультипликация GAF сайтов не создает эффективного инсулятора, как в случае Su(Hw) инсулятора, у которого эффективность блокирования энхансеров непосредственно зависела от количества сайтов связывания белка Su(Hw) (Scott et al. 1999). Можно предположить, что GAF белок способствует инсуляции в комбинации с другими белками, либо GAF белок может блокировать только определенные энхансеры. Полученные данные говорят в пользу предположения, что только ВТВ-содержащего белка, способного образовывать мультимерные комплексы, не достаточно для формирования эффективного инсулятора Следовательно, существует возможность, что другие белки, которые связываются с Su(Hw) инсулятором, могут участвовать в блокировании энхансеров

2. Нейтрализация Su(Hw) инсулятора G8 фрагментов может происходить по нескольким механизмам.

Ранее было продемонстрировано, что два Su(Hw) инсулятора, расположенные между энхансером и промотором, способны нейтрализовать действие друг друга. Данное явление было показано для регуляторных систем двух генов - yellow и mimwhite, которые экспрессируются на стадии поздней личинки - средней куколки, и на нескольких генах, которые экспрессируются на эмбриональной стадии (Cai and Shen 2001). Таким образом, нейтрализация инсуляции при увеличении числа инсуляторов между энхансером и промотором является универсальной для Su(Hw) инсулятора. Нейтрализацию инсуляции легче всего объяснить, предположив непосредственное взаимодействие между несколькими ближайшими инсуляторами с образованием петель ДНК между ними. Было предложено исследовать способность взаимодействия между инсуляторами с помощью открытого феномена «нейтрализации» инсуляции. Если два инсулятора, находящиеся между энхансером и промотором, взаимодействуют, то происходит нейтрализация блокирования энхансера. Таким способом на регуляторной системе гена yellow (Kuhn et al. 2003) и на эмбриональных энхансерах (Majumber and Cai 2003)были протестированы все хорошо известные инсуляторы дрозофилы. Неожиданно оказалось, что все исследованные пары энхансеров не взаимодействуют ни между собой ни с Su(Hw) инсулятором. На основе этого было выдвинуто предположение, что либо существуют различные механизмы действия инсуляторов либо взаимодействия между инсуляторами крайне специфичны. Однако также возможно, что использованные модельные системы не выявили взаимодействия между инсуляторами. Так было показано, что in vitro белки, связанные с ses и ses' инсуляторами, взаимодействуют между собой (Branton et al. 2003) В то время функциональный тест (Kuhn et al. 2003) не выявил этого взаимодействия

В настоящем исследовании было продемонстрировано, что GAF может взаимодействовать с Mod(mdg4) и таким образом частично инактивировать блокирование энхансера глаз Su(Hw) инсулятором. Одновременно взаимодействие между GAF и Mod(mdg4) не влияет на нейтрализацию Su(Hw) инсулятора, блокирующего энхансеры тела и крыльев гена yellow. Однако другой белок, который связывается с G8 фрагментом, индуцирует нейтрализацию Su(Hw) инсулятора в данном случае. Кроме того, эффективность действия этого белка резко уменьшается при температуре 18°С. Так как G8 фрагмент является GAF связывающим участком из

промотора hsp70, который разделяет два участка связывания активатора теплового шока, то можно предположить, что ранее неидентифицированный фактор связывается с G8 фрагментом при нормальной или повышенной температуре. Следовательно, этот транскрипционный фактор может бьггь вовлечен в регуляцию экспрессии hsp70 гена.

Если два разных белка отвечают за нейтрализацию инсулятора Su(Hw) в разных регуляторных системах - генов yellow и white, то можно предположить, что Su(Hw) инсулятор может блокировать энахнсеры с помощью как минимум двух механизмов: mod(mdg4)-3aBHCHMbift (энхансер гена white) и то()(т(^4)-независимый (энхансеры гена yellow). Для установления белков, которые связываются с Su(Hw) и участвуют в инсуляции, необходим дальнейший молекулярный анализ. Возможно, отсутствие функционального взаимодействия между различными инсуляторами в исследованиях Kuhn et al. 2003 и Majumber and Cai 2003 объясняется существованием нескольких механизмов инсуляции.

3 Роль взаимодействия между мультимерными белковыми комплексами в инсуляции на примере взаимодейстия между Zeste сайтами.

Белок Zeste, который был найден только у дрозофилы, часто имеет множественные сайты связывания в области энхансеров и промоторов. В случае гена white в области энхансера глаз находится пять, а в области промотора - два сайта связывания для белка Zeste (Quin and Pirrotta 1992). На основе этого была выдвинута гипотеза, что Zeste отвечает за коммуникацию между энхансером и промотором гена white. В некоторых случаях Zeste белок необходим для эффекта трансвекции, т.е. для взаимодействия между энхансером и промотором, которые находятся на разных хромосомах В экспериментах in vitro было показано, что белок Zeste образует мультимерные комплексы, что может способствовать взаимодействию между энхансером и промотором (Dorsett 1999). Таким образом, существующие экспериментальные данные предполагают, что мультимерные комплексы, образуемые Zeste белками, способны эффективно сближать удаленные участки ДНК, расположенные даже на гомологичных хромосомах. С другой стороны, взаимодействие между Zeste сайтами, которые окружают ген yellow и изолируют энхансеры тела и крыльев от промотора, не способны блокировать изолированные энхансеры Как известно, Su(Hw) инсуляторы, расположенные в тех же районах гена yellow, полностью блокируют энхансеры. Следовательно, либо взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами намного более эффективно, чем взаимодействие между Zeste

сайтами либо только одного взаимодействия между сайтами не достаточно для блокирования энхансеров. Для прояснения данной ситуации требуются дальнейшие молекулярно-генетические исследования.

4. Анализ существующих моделей действия инсуляторов с точки зрения полученных результатов.

Явление нейтрализации Su(Hw) инсулятора в присутствии сайтов связывания для белка GAF, продемонстрированное в данной работе, позволяет пересмотреть существующие модели действия инсуляторов

Согласно структурным моделям инсуляторы участвуют в образовании независимых доменов транскрипции, при этом регуляторные элементы, находящиеся в соседних транскрипционных доменах, не могут взаимодействовать (Udvardy 1999, Mongelard and Corees 2001). Исходя из данных о локализации Su(Hw) инсуляторов группами в определенных районах ядра, одна из структурных моделей допускает прямое или опосредованное взаимодействие между инсуляторами. Однако, согласно данной модели, такое взаимодействие приводит к выпетливанию ДНК и образованию независимых доменов транскрипции (Gerasimova et al 2000) Полученные в нашей лаборатории результаты (Muraveva et al. 2001) демонстрируют обратный эффект взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами - в определенных условиях возможна активация промотора энхансером, даже если между ними расположено несколько инсуляторов, что противоречит понятию о существовании независимых доменов транскрипции.

Группа транскрипционных моделей постулирует локальное взаимодействие между белками инсулятора и белками, участвующими в активации транскрипции: либо с белками, связывающимися с энхансером, либо с белками, отвечающими за взаимодействие между энхансером и промотором. Следствием этих моделей является то, что увеличение количества инсуляторов должно приводить к усилению способности блокировать энхансер (Parnell and Geyer 2000). Ранее в нашей лаборатории было показано, что дупликация Su(Hw) инсулятора приводит к нейтрализации его блокирующей активности, что не согласуется с представлениями транскрипционных моделей( Muraveva et al. 2001).

Таким образом, ни одна из существующих моделей не объясняет, как GAF сайты способны нейтрализовать Su(Hw) инсулятор. Исходя из полученных данных

можно предложить комбинированную модель механизма действия инсуляторов, которая содержит элементы как структурных так и транскрипционных моделей.

Локальное взаимодействие между соседними Su(Hw) инсуляторами может либо способствовать активации промотора энхансером либо блокировать ее, что зависит от взаимного расположения взаимодействующих инсуляторов и регуляторных элементов. С инсуляторами одновременно могут взаимодействовать различные белки, одним из них может являться GAF. Это позволят в некоторых случаях нейтрализовать взаимодействие между двумя инсуляторами и приводит к восстановлению взаимодействия между энхансером и промотором. Таким образом, взаимодействие менаду инсуляторами происходит в соответствии со структурными моделями.

Однако взаимодействие между инсуляторами носит локальный характер Одновременно с инсуляторами могут взаимодействовать различные регуляторные последовательности, что может приводить либо к блокированию, либо к усилению взаимодействий между ближайшими инсуляторами. Представления о локальных взаимодействиях между регуляторными элементами и инсуляторами соответствуют транскрипционным моделям.

ВЫВОДЫ.

1. Создана модельная система для изучения явления нейтрализации Su(Hw) инсулятора в присутствии сайтов связывания для белка GAF у Drosophila melanogaster на основе регуляторных систем генов yellow и miniwhite.

2. Впервые продемонстрировано, что взаимодействие между белками GAF и Mod(mdg4) приводит к нейтрализации блокирования Su(Hw) инсулятором взаимодействия между энхансером глаз и промотором гена white.

3. Показано, что в нейтрализации Su(Hw) инсулятора, встроенного между энхансерами и промотором тепа, yellow, участвуют белки отличные от Mod(mdg4) и GAF.

4. Показано, что взаимодействие между мультиплицированными сайгами для белка Zeste не способно блокировать взаимодействие между энхансером и промотором гена yellow.

5. Впервые продемонстрировано, что GAF фрагмент усиливает репрессию гена yellow Su(Hw) инсулятором в отсутствии белка Mod(mdg4).

Список работ, опубликованных по теме диссертации: /. Зобачева П Ю., Куллыев А П., член-корр. РАН Георгиев П.Г., Мельникова JÏ.C. Изучение взаимодействия между Su(Hw) инсулятором и сайтами связывания для белка GAF на регуляторной системе гена yellow у Drosophila melanogaster. ДАН, т.391(5), с.692-695 2. Зобачева П Ю., Куллыев А П, член-корр. РАН Георгиев П.Г., Мельникова JI.C.

Взаимодействие меязду сайтами связывания для белка Zeste не блокирует активацию гена yellow изолированными энхансерами у Drosophila melanogaster.

ДАН, т.391(6), с.825-827.

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. wvvw.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 394 тираж 100 экз. Подписано в печать 13.10. 2003 г.

\6?sy

» 16 955 /

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зобачева, Полина Юрьевна

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ОБЩИЕ СВОЙСТВА ИНСУЛЯТОРОВ

2.2. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ИНСУЛЯТОРОВ 4 2.2.1.8и(Н\у)-ИНСУЛЯТОР.

2.2.2. ИНСУЛЯТОРЫ ЛОКУСА ТЕПЛОВОГО ШОКА hsp70-scJ.

2.2.3. ИНСУЛЯТОРЫ РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ Abd-B ГЕНА

2.2.4. КУРИНЫЙ Р-ГЛОБИНОВЫЙ ИНСУЛЯТОР.

2.3. МОДЕЛИ ДЕЙСТВИЯ ИНСУЛЯТОРОВ:

2.3.1.СТРУКТУРНЫЕ МОДЕЛИ.

2.3.3. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ МОДЕЛИ.

З.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

3.1.1. ЛИНИИ И МУТАЦИИDrosophila melanogaster,

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ДАННОЙ РАБОТЕ

3.1.2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СКРЕЩИВАНИЯ

3.1.3. ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭМБРИОНОВ Drosophila melanogaster

И ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЙ.

3.1.4.ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ yellow И miniwhite В ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЯХ.

3.2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. 27 3.2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ДРОЗОФИЛЫ. 27 3.2.2 САУЗЕРН-БЛОТ АНАЛИЗ.

3.2.3. МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР).

3.2.4. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПЛАЗМИД И ПЦР ПРОДУКТОВ.

3.2.5. МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.

3.2.6. ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЛАЗМИДАМИ.

3.2.7. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ПЛАЗМИД МЕТОДОМ ЩЕЛОЧНОГО ЛИЗИСА.

3.2.8. СОЗДАНИЕ КОНСТРУКЦИЙ. 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. МОДЕЛЬНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ АНАЛИЗА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ БЕЛКАМИ ИНСУЛЯТОРОВ.

4.2. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ БЕЛКАМИ. Su(Hw) ИНСУЛЯТОРА И САЙТАМИ СВЯЗЫВАНИЯ ДЛЯ GAF БЕЛКА.

4.3. САЙТЫ СВЯЗЫВАНИЯ ДЛЯ БЕЖА GAF ЧАСТИЧНО НЕЙТРАЛИЗУЮТ БЛОКИРОВАНИЕ ГЛАЗНОГО ЭНХАНСЕРА Su(Hw) ИНСУЛЯТОРОМ.

4.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ БЕЛКАМИ GAF И Mod(mdg4) ПРИВОДИТ К НЕЙТРАЛИЗАЦИИ Su(Hw) ИНСУЛЯТОРА В КОНСТРУКЦИИ Eye(G8)Y(S)W.

4.5. G8 ФРАГМЕНТ ЧАСТИЧНО НЕЙТРАЛИЗУЕТ ИНСУЛЯЦИЮ ЭНХАНСЕРОВ ГЕНА yellow Su(Hw) ИНСУЛЯТОРОМ.

4.6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ БЕЛКАМИ GAF И Mod(mdg4) НЕ ВЛИЯЕТ НА НЕЙТРАЛИЗАЦИЮ АКТИВНОСТИ Su(Hw) ИНСУЛЯТОРА G8 ФРАГМЕНТОМ В КОНСТРУКЦИИ Ey(G8)(S)YW.

4.7. G8 ФРАГМЕНТ УСИЛИВАЕТ РЕПРЕССИЮ ГЕНА>>е//ои> Su(Hw) ИНСУЛЯТОРОМ В ПРИСУТСТВИИ ГОМОЗИГОТНОЙ МУТАЦИИ Mod(mdg4)ul.

4.8. РОЛЬ G8 ФРАГМЕНТА В ВОССТАНОВЛЕНИИ ЧАСТИЧНО ИНАКТИВИРОВАННОГО ПРОМОТОРА ГЕНА yellow

4.9. МУЛЬТИПЛИКАЦИЯ Zeste САЙТОВ НЕ СОЗДАЕТ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ИНСУЛЯТОРА.

5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ:

5.1. РОЛЬ GAF БЕЛКА В ИНСУЛЯЦИИ

5.2. НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ Su(Hw) ИНСУЛЯТОРА G8 ФРАГМЕНТОВ МОЖЕТ ПРОИСХОДИТЬ ПО НЕСКОЛЬКИМ МЕХАНИЗМАМ.

5.3. РОЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ МУЛЬТИМЕРНЫМИ БЕЛКОВЫМИ КОМПЛЕКСАМИ В ИНСУЛЯЦИИ НА ПРИМЕРЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ Zeste САЙТАМИ.

5.4. АНАЛИЗ СУЩЕСТВУЮЩИХ МОДЕЛЕЙ ДЕЙСТВИЯ ИНСУЛЯТОРОВ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль белков GAF и Zeste в активации транскрипции и нейтрализации инсуляторов у Drosophila melanogaster"

Геном высших эукариот содержит огромное количество генов и элементов их регуляции, таких как энхансеры и сайленсеры. Энхансеры могут активировать транскрипцию гена независимо от ориентации и, находясь от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов (Богве« 1999). Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию целого ряда генов. Так как в геноме гены часто располагаются достаточно близко друг к другу, существуют механизмы, обеспечивающие взаимодействие энхансера с промотором только своего гена и предотвращающие активацию других промоторов. В предотвращении взаимодействий между нежелательными энхансерами и промоторами важную роль могут играть инсуляторные элементы.

В настоящее время наиболее изученным инсулятором является 8и(Н\у) инсулятор, входящий в состав ретротранспозона МДГ4 у ВгоэорИИа те1сто%а$1ег. В работе инсулятора участвуют два белка 8и(Н\у) и Мос1(тё§4). Хотя оба белка клонированы и определена их структура, единого мнения о механизме действия инсулятора не существует.

Недавно было показано, что если два Би(Н\у) инсулятора находятся между энхансером и промотором, то происходит нейтрализация их активности. Более того, взаимодействие между двумя инсуляторами может способствовать более эффективной активации промотора энхансером. Целью настоящего исследования явилось дальнейшее исследование механизмов, которые лежат в основе феномена нейтрализации Su(Hw) инсулятора.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ИНСУЛЯТОРЫ - НОВЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ВЫСШИХ

ЭУКАРИОТ

Энхансерами принято называть последовательности ДНК, которые способны активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Ярким примером может служить энхансер wing margin локуса cut дрозофилы, который активирует транскрипцию находясь на расстоянии 85 т.п.н. от промотора (Jack et al. 1991; Dorsett 1999). Несмотря на то, что к настоящему времени описано большое количество энхансеров и промоторов, остается много вопросов относительно механизмов их взаимодействия. В частности неизвестно, каким образом белки, связывающиеся с энхансером, взаимодействуют с транскрипционным комплексом, собранным на промоторе, минуя большие расстояния, и каким образом происходит взаимодействие между "правильными" энхансером и промотором. Многие из существующих экспериментальных данных косвенно согласуются с тем, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками основного транскрипционного комплекса или вспомогательными белками, собранными на промоторе, при этом ДНК между ними образует петлю (Blackwood and Kadonaga 1998; West et al. 2002). Существуют также другие модели взаимодействия между энхансером и промотором. Например, одна из моделей предполагает существование белков посредников, которые способны кооперативно взаимодействовать между собой, а также с большим количеством сайтов на ДНК, что приводит к притягиванию, собранных на энхансере и промоторе белковых комплексов друг к другу (Dorsett 1999).

В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль могут сыграть инсуляторы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Зобачева, Полина Юрьевна

6.ВЫВОДЫ.

3. Показано, что в нейтрализации Su(Hw) инсулятора, встроенного между энхансерами и промотором тени yellow, участвуют белки отличные от Mod(mdg4) и GAF.

4. Показано, что взаимодействие между мультиплицированными сайтами для белка Zeste не способно блокировать взаимодействие между энхансером и промотором гена yellow.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зобачева, Полина Юрьевна, Москва

1. Barges S., Mihaly J., Galloni M. et al. The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-1 domain and insulated iab-1 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain // Development. 2000. V.127. P.779-790.

2. Bell A. C., West A. G., Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators // Cell. 1999. V. 98. P. 387-396.

3. Bell A.C., Felsenfeld G. Stopped at the border: boundaries and insulators // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. V. 9. P.191-198.

4. Bell A.C., Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene // Nature. 2000. V.405. P.482-485.

5. Bell A., West G., Felsenfeld G. Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome // Science. 2001. V.291. P.447-450.

6. Belozerov VE, Majumder P, P. Chen, HN Cai. A novel boundary element may facilitate independnet gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila // EMBO. 2003. V.22. P.3113-3121.

7. Bi X., Broach J. UAS rpg can function as a heterochromatin boundary element in yeast //Genes Dev. 1999. V. 13. P.1089-1101.

8. Bi X., Broach J. Chromosomal boundaries in S. cerevisiae II Curr. Opin. Gen. Dev. 2001. V.l 1. P. 199-204.

9. Blackwood E., Kadonaga J. Going the distance: a current view of the enhancer action // Science. 2001. V.281. P.60-63.

10. Breiling A., Bonte S., Ferrari P. et al. The Drosophila polycomb protein interacts with nucleosomal core particles in vitro via its repression domain // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P.8451-8460.

11. Buchner K., Roth P., Schotta G., Krauss V., Saumweber H., Reuter G., Dorn R. Geneticand molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila H Genetics. 2000. V.155. P. 141-157.

12. Byrd K, Corces. VG. Visualization of chromatin domains created by the gypsy insulator of Drosophila.//J Cell Biol. 2003. V.162(4).P. 565-74.

13. Cai H., Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo // Nature. 1995. V. 376. P. 533-536.

14. Cai H., Levine M. The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embrio //EMBO J. 1997. V.16. P. 1732-1741.

15. Cai H., Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity // Science. 2001. V.291. P.293-295.

16. Chen S, Corces V.G. The gypsy insulator of Drosophila affects chromatin structure in a directional manner// Genetics 2001.V.159.P. 1649-1658.

17. Chervitz S., Aravind L., Sherlock et al. Composition of the complete protein sets of worm and yeast: orthology and divergence // Science. 1998. V.282. P.2022-2028.

18. Chung J., Bell A., Felsenfeld G. Characterization of the chicken beta-globin insulator // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.94. P.575-580.

19. Chung J., Whitely M., Felsenfeld G. A 5' element of the chicken D-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila II Cell. 1993. V. 74. P. 505-514.

20. Cuvier O., Hart C., Laemmli U. Identification of a class of chromatin boundary elements // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 7478-7486.

21. Dhillon N, Kamakaka R. Breaking through to the other side: silencers and barriers// Cur. Opin. Genet. Dev. 2002.V.12.P.188-192.

22. Donze D., Adams C.R., Rine J. et al. The boundaries of the silenced HMR domain in Saccharomyces cerevisiae II Genes Dev. 1999. V. 13. P.698-708.

23. Donze D, Kamakaka RT. KNA polymerase III and RNA polymerase II promoter complexes are heterochromatin barriers in Saccharomyces cerevisiae// EMBO J. 2001 .V. 20.P.520-531.

24. Dorsett D. Distant liaisons: long range enhancer-promoter interactions in Drosophila II Curr. Opin.Genet. Dev. 1999. V. 9. P. 505-514.

25. Dunaway M., Hwang J., Xiong M., Yuen H. The activity of the scs and scs' insulator elements is not dependent on chromosomal context //Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.182-189.

26. Farkas G., Leibovitch B., Elgin S. Chromatin organization and transcriptional control of gene expression in Drosophila II Gene. 2000. V.253.P. 117-136.

27. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 2098-2107.

28. Gdula D., Corces V. Characterization of functional domains of the Su(Hw) protein that mediate the silencing effect oimod(mdg4) mutations// Genetics. 1997. V.145. P.153-161.

29. Georgiev P., Corces V. The Su(Hw) protein bound to gypsy sequences in one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in the paired gene located in the other homolog // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. P.5184-5188.

30. Georgiev P., Kozycina M. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations // Genetics. 1996. V. 142. P. 425-436.

31. Gerasimova T., Corces V. Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator // Cell. 1998. V. 92. P.511-521.

32. Gerasimova, T. I, Corces, V. G. Chromatin insulators and boundaries: effects on transcription and nuclear organization//Annu. Rev. Genet.2001.V. 35.P. 193-208.

33. Gerasimova T., Gdula D., Gerasimov D., Simonova O., Corces V. A Drosophila protein that impacts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation // Cell. 1995. V. 82. P.587-597.

34. Gerasimova T., Kyrd K., Corces V. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA// Mol.Cell. V.6. P. 1025-1035.

35. Geyer P. The role of insulator elements in defining domains of gene expression // Curr. Opia Genet. Dev. 1997. V. 7. P. 242-248.

36. Geyer PK, Clark I. Protecting against promiscuity: the regulatory role of insulators// Cell Mol Life Sci. 2002.V.12.P.2112-27.

37. Geyer P., Corces V. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster // Genes Dev. 1987. V.l. P.996-1004.

38. Geyer P., Corces V. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zincfinger protein // Genes Dev. 1992. V.6. P. 1865-1873.

39. Chen S, Corces VG. The gypsy insulator of Drosophila affects chromatin structure in a directional manner//Genetics. 2001.P. 159(4). V. 1649-58.

40. Chen JL, Huisinga KL, Viering MM, Ou SA, Wu CT, Geyer PK. Enhancer action in trans is permitted throughout the Drosophila genome// Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V.99(6).P.3723-3728.

41. Ghosh D., Gerasimova T., Corces V. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function // EMBO J. 2001. V.20. P.2518-2527.

42. Golic K., Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome // Cell. 1989. V.59. P.499-509.

43. Gorczyca M., Popova X., Budnik V. The gene mod(mdg4) affects synapse specificity and structure in Drosophila II J.Neurobiol. 1999. V.39. P.447-460.

44. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex // Genes Dev. 1996. V.10. P.3202-3215.

45. Hark A., Schoenherr C., Katz D. et al. CTCF mediates methilation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus // Nature. 2000. V.405. P.486-489.

46. Harrison D., Gdula D., Coyne R, Corces V. A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function // Genes Dev. 1993. V.7. P. 1966-1978.

47. Hart C., Zhao K., Laemmli U. The scs' boundary element: characterization of boundary element-assaciated factors//Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.999-1009.

48. Holdridge C., Dorsett D. Repression of hsp70 heat shock gene transcription by the suppressor of Hairy-wing protein of Drosophila melanogaster//Mol. Cell. Biol. V.ll. P.1894-1900.

49. Jack J., Dorsett D., DeLotto Y. et al. Expression of the cut locus in the Drosophila wingmargin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer // Development. 1991. V.113. P.735-747.

50. Katsani K., Hajibagheri M., Verrijzer C. Cooperative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology // EMBO J. 1999. V.18. P.698-708.

51. Kares R., Rubin G. Analysis of P transposable element functions in Drosophila II Cell. 1984. V.38. P.135-146.

52. Kellum R., Schedl P. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains // Cell. 1991. V. 64. P.941-950.

53. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay //MoL Cel. Biol. 1992. V. 12. P. 2424-2431.

54. Kim J., Shen B., Rosen G, Dorsett D. The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P.3381-3392.

55. Kirpatrick, D. T., Q. Fan and T. D. Petes. Maximal stimulation of meiotic recombination by a yeast transcription factor requires the transcription activator domain and DNA-binding domain.// Genetics.l999.V.152.P.101-l 15.

56. Krebs J. E., Dunaway M. Insulator elements impart a cis requirement on enhancer-promoter interactions//Mol. Cell. 1998. V. 1. P. 301-308.

57. Kuhn EJ, Geyer PK.Genomic insulators: connecting properties to mechanism//Curr Opin Cell Biol. 2003V. 15(3)P.259-65.

58. Kuhn EJ, Viering MM, Rhodes KM, Geyer P.K. A test of insulator interactions in Drosophila/ZEMBO J. 2003. V.22(10)P.2463-71.

59. Labrador M, Corces VG. Protein determinants of insertional specificity for the Drosophila gypsy retrovirus//Genetics. 2001.V.158(3).P. 1101-10.

60. Labrador M. and Corces V.G. Setting the boundaries of chromatin domains and nuclearorganization.//Cell. 2002.V.111P. 151-154.

61. Litt MD, Simpson M, Recillas-Targa F, Prioleau MN, Felsenfeld G. Transitions in histoneacetylation.//EMBO J.2001 ,V20(9).P.2224-2235.

62. Lu L., Tower J. A transcriptional insulator element, the su(Hw) binding site, protects a chromosomal DNA replication origin from position effects // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P.2202-2206.

63. Mahmoudi T., Katsani KR, Verrijzer PC. GAGA can mediate enhancer function in trans by linking two separate DNA molecules// EMBO J.2002. V.21.P. 1775-1781.

64. Mallin D., Myung J., Patton J. et al. Polycomb group gene repression is blocked by the Drosophila suppressor of Hairy-wing Su(Hw. insulator // Genetics. 1998. V.148. P.331-339.

65. Marlor, R. L., S. M. Parkhurst and V. G. Corces. The Drosophila melanogaster gypsy transposable element encodes putative gene products homologous to retroviral proteins//Mol. Cell. Biol. 1986.V.6.P. 1129-1134.

66. Mazo A., Mizrokhi L., Karavanov A. et al. Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of mdg4 (gypsy) regulating its transcriptional activity // EMBO J. 1989. V.8. P.903-911.

67. Mihaly J., Hogga L, Barges S., Gallon M., Mishra R., Hagstrom K., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex//Cell. Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 60-70.

68. Mongelard F., Corces V. Two insulators are not better than one // Nat. Struct, biol. 2001. V.8.P.192-194.

69. Morcillo P., Rosen G, Dorsett D. Genes regulating the remote wing margin enhancer in the Drosophila cut locus // Genetics. 1996. V. 144. P. 1143-1154

70. Morcillo P., Rosen G, Baylies M, Dorsett D. Chip, a widely expressed chromosomal protein required for segmentation and activity of a remote wing margin enhancer in Drosophila II Genes

71. Dev. 1997. V.ll. P.2729-2740.

72. Muller M., Hangstrom K., Gyurkovics H., Pirrotta V., Schedl P. The Mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions // Genetics. 1999. V.153. P.1333-1356.

73. Muravyova, E., Golovnin, A., Gracheva, E., Parshikov, P., Belenkaya, T., Pirrotta, V. and Georgiev, P. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators// Science 2001.V.291.P.495-497.

74. Mutskov VJ, Farrell CM, Wade PA, Wolffe AP, Felsenfeld G. The barrier function of an insulator couples high histone acetylation levels with specific protection of promoter DNA from methylation. //Genes Dev.2002.V. 16P. 1540-1554.

75. Nabirochkin S., Ossokina M., Heidmann T. A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence // J.Biol.Chem. 1998. V.273. P.2473-2479.

76. Ohtsuki S., Levine M. GAGA mediates the enhancer blocking activity of the eve promoter in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1998. V. 12. P.3325-3330

77. Oki, M., R. T. Kamakaka . Blockers and barriers to transcription: competing activities? //Curr. Opin. Cell Biol.2002.V. 14 P.299-304.

78. Orihara M., Hosono C., Kojima T., Saigo K. Identification of engrailed promoter elements essential for interactions with a stripe enhancer in Drosophila embryos // Genes Cells. 1999. V. 4. P.205-218.

79. Pai CY, Corces VG. The nuclear pore complex and chromatin boundaries// Trends Cell Biol. 2002.V.12(10).P.452-5.

80. Palla F., Melfi R., Anello L., Di Bernardo M., Spinelli G. Enhancer blocking activity located near the 3' end of the sea urchin early H2A histone gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.2272-2277.

81. Parnell T., Geyer P. Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes//EMBO J. 2000. V.19. P.5864-5874.

82. Pikaart M., Recillas-targa F., Felsenfeld G. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methilation and histone deacetylation and is prevented by insulators // Genes Dev. 1998. V.12. P.2852-2862.

83. Pirrotta V., Steller H., Bozzetti M. Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene // EMBO J. 1985. V.4. P.3501-3508.

84. Pirrotta V., Manrt E., Hardon E., Bickel S., Benson M. Structure and sequence of the Drosophila zeste gene // EMBO J. 1987. V.6. P.791-799.

85. Pirrotta V. PcG complexes and chromatin silencing // Curr.Opin.Gen.Dev. 1997. V.7. P.249-258.

86. Pirrotta V. Polycomb silencing and the maintenance of stable chromatin states // Results Probl. Cell Differ. 1999. V.25. P.205-228.

87. Qian S., Varjavand B., Pirrotta V. Molecular analysis of the zeste-white interaction reveals a promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication // Genetics. 1992. V. 13l.P.79-90.

88. Recillas-Targa F., Bell A., Felsenfeld G. Positional enhancer-blocking activity of the chicken (3 -globin insulator in transiently transfected cells // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1999. V.96. P. 1435414359.

89. Robertson, H. M., C R Prestson, R M. Phillips, D. Johnson-Schlitz, W. K Benz and W.REngels. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. //Genetics. 1988. V. 118.P.461-470.

90. Robinett C., O'Connor A., Dunaway M. The repeat organizer, a specialized insulator element within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.2866-2875.

91. Rollins S., Morsillo P., Dorsett D. Nipped-B, a Drosophila homologue of chromosomal adherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes // Genetics. 1999. V.152. P.577-593.

92. Roseman R, Pirrotta V., Geyer P. The Su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects // EMBO J. 1993. V. 12. P.435-442.

93. Rubin G., Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors // Science. 1982. V.218. P.348-353.

94. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed. 2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY // 1989

95. Sanger F., Nicken S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P.5463-5487.

96. Scott K., Geyer P. Effects of the Su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes // EMBO J. 1995. V. 14. P.6258-6279.

97. Scott K., Taubman A., Geyer P. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength // Genetics. 1999. V.153. P.787-798.

98. Shao Z., Raible R, Mollaaghababa R. et al. Stabilization of chromatin structure by PRCl, a polycomb complex// Cell. 1999. V.98. P.37-46.

99. Siegal, M. L. and Hartl, D. L. Application of Cre/loxP in Drosophila. Site-specific recombination and transgene coplacement // Methods Mol. Biol. 2000.V.136P. 487-495.

100. Sigrist C, Pirrotta V. Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila Polycomb Response Element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes//Genetics. 1997. V.147. P.209-221.

101. Smith P., Corces V. The suppressor of Hairy-wing binding region is required for gypsy mutagenesis // Mol.Gen.Genet. 1992. V.233. P.65-70.

102. Spana C., Harrison D., Corces V. The Drosophila melanogaster supressor of Hairy wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon // Genes Dev. 1988. V.2. P. 14141423.

103. Spana C., Corces V. DNA bending is a determinant of binding specificity for a Drosophila zink finger protein // Genes Dev. 1990. V.4. P. 1505-1515.

104. Sun F.-L., Elgin S. Putting boundaries on silence // Cell. 1999. V.99. P.459-462.

105. Udvardy A., Maine E., Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains // J. Mol. Biol. 1985. V.185. P.341-358.

106. Udvardy A. Dividing the empire: boundary chromatin elements delimit the territory of enhancers//EMBO J. 1999. V.18. P.l-8.

107. Van der Vlag J., Otte A. Transcriptional repression mediated by the human polycomb-group protein EED involves histone deacetylation//Nat. Genet. 1999. V.23. P.474-478.

108. Vazquez J., Schedl P. Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster II Genetics. 2000. V. 155. P. 1297-1311.

109. Webber A., Ingrain R., Levorse J. et al. Location of enhancers is essential for imprinting of H19 and lgf2 II Nature. 1998. V.391. P.711-715.

110. West, A.G., Gaszner, M. and Felsenfeld, G. Insulators: many functions, many mechanisms//Genes Dev.2002.V. 16.P.271-288.

111. Yoshida C., Tokumasu F., Hohmura K. et al. Long range interaction of cis-DNA elements mediated by architectural transcription factor Bachl // Genes Cells. 1999. V. 4 P.643-655

112. Zhao K., Hart C M, Laemmli U. Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32//Cell. 1995. V. 81. P. 879-889.

113. Zhong X., Krangel M. An enhancer-blocking element between alpha and delta gene segments within the human T cell receptor alpha/delta locus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.5219-5224.

114. Zhou J., Barolo S., Szymanski P. et al. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1996. V. 10. P.3195-3201.

115. Zhou J., Ashe H., Burks C. et al. Characterization of the transvection mediating region of the Abdominal-B locus in Drosophila II Development. 1999. V. 126. P.3057-3065.

116. Zhou J., Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo // Cell. 1999. V. 99. P.567-575.

Информация о работе

Зобачева, Полина Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.26

Диссертация

Роль белков GAF и Zeste в активации транскрипции и нейтрализации инсуляторов у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы