Рибосомные белки S13 и S16 человека

Парахневич, Наталья Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рибосомные белки S13 и S16 человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рибосомные белки S13 и S16 человека"

На правах рукописи

ио3450818

ПАРАХНЕВИЧ НАТАЛЬЯ МИХАИЛОВНА

РИБОСОМНЫЕ БЕЛКИ 813 И в16 ЧЕЛОВЕКА: ВЛИЯНИЕ НА СПЛАЙСИНГ СОБСТВЕННЫХ пре-мРНК

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

3 о опт 2008

Новосибирск - 2008

003450818

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научные руководители: д.х.н., профессор Карпова Галина Георгиевна

к.х.н. Малыгин Алексей Аркадьевич

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор Карпов Вадим Львович

к.б.н. Жарков Дмитрий Олегович

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита состоится » 20£<Рг. в ^ ~часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01

при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru Автореферат разослан « » С^иС^с? 20 С/г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Рибосомные белки являются структурными элементами рибосомы - многокомпонентной клеточной органеллы, осуществляющей биосинтез белков. Известно, что наряду с функциями, связанными со сборкой рибосомы и трансляцией мРНК, многие из этих белков обладают так называемыми «внерибосомными» функциями (Wool et al., 1996), иначе говоря, они участвуют в различных клеточных процессах, находясь в свободном состоянии, т.е. вне рибосомы. Точная регуляция биосинтеза рибосомных белков является необходимым условием для полноценной жизнедеятельности как отдельной клетки, так и целого организма, а нарушение этой регуляции может приводить к различным критическим изменениям. Согласно современным представлениям регуляция экспрессии генов рибосомных белков эукариот происходит на стадиях транскрипции, сплайсинга и трансляции, а также за счет изменения скорости деградации вновь синтезированных белков. Регуляция экспрессии генов рибосомных белков эукариот на стадиях транскрипции и трансляции происходит координировано, по принципу «все сразу». Такая регуляция достигается благодаря наличию общих регуляторных элементов как в генах рибосомных белков, так и в мРНК, кодирующих эти белки. Регуляция экспрессии генов рибосомных белков на уровне сплайсинга изучена хуже, но в большинстве известных случаев показано, что регуляция на этой стадии осуществляется по принципу «обратной связи», т.е. через взаимодействие рибосомного белка с кодирующей его пре-мРНК (Иванов и др., 2006). Такой механизм регуляции обеспечивает необходимый уровень каждого рибосомного белка в клетке, независимо от количества остальных рибосомных белков, что может являться исключительно важным для выполнения рибосомными белками функций, не связанных с процессом трансляции. Таким образом, изучение роли рибосомных белков в регуляции сплайсинга кодирующих их пре-мРНК и особенностей РНК-белковых взаимодействий, лежащих в основе этого процесса, имеет важное значение для понимания молекулярных механизмов регуляции биосинтеза рибосомных белков.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение регуляции экспрессии генов рибосомных белков S13 и S16 человека на стадии сплайсинга. Внерибосомные функции этих белков пока не известны, однако имеются данные о возможном участии rpS13 в подавлении апоптоза, индуцированного лекарствами против рака желудка. Основными задачами являлись:

• создание экспрессирующих плазмидных конструкций, несущих кДНК рибосомных белков S13 и S16 человека, и получение препаратов рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16, пригодных для использования в структурно-функциональных тестах;

• вьивление с помощью компьютерного анализа наиболее консервативных интронов в составе пре-мРНК, кодирующих рибосомные белки S13 и S16;

• изучение связывания рибосомных белков S13 и S16 с фрагментами их пре-мРНК, содержащими наиболее консервативные интроны, и исследование влияния данных белков на сплайсинг этих фрагментов;

• определение нуклеотидов фрагмента пре-мРНК рибосомного белка S13, меняющих свою доступность действию ферментов в присутствии кодируемого белка, и выявление их роли в регуляции сплайсинга этого фрагмента.

Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе представлены результаты исследования, направленного на изучение регуляции экспрессии генов рибосомных белков S13 и S16 человека на стадии сплайсинга. В рамках настоящей работы впервые получены рекомбинантные рибосомные белки S13 и S16 человека, описаны процедуры их выделения, очистки и ренатурации и охарактеризована их вторичная структура. Показано, что рибосомные белки S13 и S16 человека способны специфично связываться с фрагментами своих пре-мРНК, содержащими первый интрон, фланкированный экзонами, и ингибировать сплайсинг этих фрагментов in vitro. Выявлены нуклеотидные остатки фрагмента пре-мРНК rpS13, меняющие свою доступность действию РНКаз в присутствии кодируемого белка. Установлено, что большинство этих остатков расположено вблизи 5'- и З'-сайтов сплайсинга. Показано, что мутации в районах, содержащих эти остатки, уменьшают ингибирующий эффект rpS 13 на сплайсинг фрагмента его пре-мРНК, содержащего первый интрон. Предложен механизм регуляции экспрессии генов рибосомных белков S13 и S16 на уровне сплайсинга, основанный на принципе «обратной связи». Полученные в настоящей работе данные имеют принципиальное значение для понимания молекулярных механизмов не только регуляции сплайсинга пре-мРНК рибосомных белков, но и других процессов, в основе которых лежат РНК-белковые взаимодействия.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «Chemical & Biological problems of proteomics», Новосибирск, 2004; «International Conference on Chemical Biology», Новосибирск, 2005; «Biosphere Origin and Evolution», Новосибирск, 2005; «30л FEBS Congress and 9lh IUBMB Conference», Венгрия, 2005; «FEBS Forum for Young Scientists», Венгрия, 2005; «8th International Engelhardt Conference on RNA-protein interactions», Сергиев Посад, 2006; на конференции «Физико-химическая биология», посвящённой 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, 2006; XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Москва, 2007; III Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Пущино, 2007; IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008.

Личный вклад автора. В диссертационную работу включены материалы исследований, выполненных автором лично.

Структура работы. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы и содержит 2 таблицы и 47 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение и характернзация рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16 1.1. Создание штаммов-суперпродуцентов рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16 человека

В настоящее время существует много способов получения рекомбинантных белков. В зависимости от свойств белка для его получения применяют различные системы на основе прокариотических и эукариотических клеток. В настоящей работе для получения рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16 человека использовали вектор рЕТ-15Ь и клеточный штамм Е. coli BL21(DE3), поскольку данные белки не несут постгрансляционных модификаций. кДНК рибосомных белков S13 и S16 человека получали на основе РНК, выделенной из послеродовой плаценты человека. С помощью хроматографии на oligo(dT) целлюлозе из суммарной РНК выделяли фракцию, содержащую poly(A)+-PHK, из которой с помощью обратной транскрипции с использованием oligo(dT) праймера синтезировали суммарную кДНК. кДНК рибосомных белков S13 и S16 получали ПЦР-амплификацией суммарной кДНК с использованием пар специфичных праймеров, которые содержали на 5'- концах последовательности для создания сайтов рестрикции Ndel и BamHI в ПЦР-продукте. В результате были получены продукты ожидаемой длины - 481 п.о. для кДНК rpS13 и 466 п.о. для кДНК rpS16 соответственно. Эти кДНК клонировали в экспрессионный вектор рЕТ-15Ь и получали плазмиды pET-rpS13 и pET-rpS16. Эти плазмиды содержали кодирующие части кДНК рибосомных белков S13 и S16, вставленные с сохранением рамки считывания после (His)6-tag последовательности. Соответствие между нуклеотидными последовательностями кДНК рибосомных белков в полученных плазмидах и последовательностями кДНК этих белков, представленными в GenBank (Асс. № NM_001017 для rpS13 и Асс. № NM_001020 для rpS16), было подтверждено секвенированием. Клетки Е. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидами pET-rpS13 и pET-rpS16 и получали штаммы-суперпродуценты соответствующих рибосомных белков.

1.2. Синтез рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16, их очистка и рефолдинг

Синтез рекомбинантных белков в клетках Е. coli, трансформированных плазмидой pET-rpS13 или pET-rpS16, активировали добавлением ИПТГ к клеточной культуре. Электрофоретический анализ в ПААГ общего клеточного белка через 3 ч после индукции ИПТГ показал, что в обоих случаях в клетках присутствует рекомбинантный белок ожидаемого размера (19 кДа для rpS13 и 18 кДа для rpS16). Количество рекомбинантного белка в клетках составляло 5-10% от общего количества белка и при дальнейшей инкубации культуры клеток не увеличивалось. Анализ субклеточной локализации рекомбинантных белков показал, что оба белка присутствуют в клетках преимущественно в тельцах включения, и поэтому дальнейшие процедуры выделения и очистки белков включали стадии выделения телец включения, их солюбилизации в денатуранте (гуанидин-HCl) и аффинной

хроматографии на №-КГА агарозе. В результате были получены практически гомогенные препараты белков (более чем 98%-ной чистоты) (рис. 1). Идентичность между полученными рекомбинантными белками и соответствующими им рибосомными белками была подтверждена с помощью иммуноблотинга с использованием антисыворотки против рибосомных белков 813 и Б16

Рис. 1. Анализ препаратов рекомбинантных рибосомных белков Б13 и 816. А - электрофоретическое разделение белков в 14%-ном ПААГ в присутствии 805. Дорожка 1 -суммарный белок, выделенный из 408 субчастиц рибосом человека (слева стрелками указано расположение белков 813 и в 16 согласно (Ма^т е1 а1., 2000)); 2 и 3 -рекомбинантные белки 813 и 816 соответственно; 4 -белки-маркеры (справа указана их молекулярная масса). Б, В - иммуноблотинг рекомбинантных белков 813 (дорожка 2) и Б16 (дорожка 3) человека с использованием специфичных антисывороток против рибосомных белков 813 (Б) и 813/816 (В) млекопитающих (дорожка 1 -суммарный 408 рибосомный белок).

Рефолдинг рекомбинантных белков проводили либо методом ступенчатого диализа против буферного раствора с высокой ионной силой (1 М КС1), либо методом быстрого разбавления. В случае ступенчатого диализа растворы рекомбинантных белков в 6 М гуанидин-НС1 диализовали против буферных растворов с понижающейся концентрацией гуанидин-НС1 от 2 до 0.1 М с использованием на последней стадии раствора, не содержащего денатуранта. В случае рефолдинга рекомбинантных белков методом быстрого разбавления аликвоты растворов белков в 8 М мочевине быстро смешивали со 100-кратным объемом буфера, не содержащего мочевины.

1.3. Анализ вторичной структуры рибосомных белков Б13 и Б16 Чтобы получить представление о вторичной структуре белков и ее стабильности при разных значениях рН и концентрации мочевины, регистрировали спектры кругового дихроизма (КД) растворов белков в различных условиях. Спектр КД отражает способность белка вращать плоскополяризованный свет в зависимости от длины волны и позволяет оценивать количество а-спиральных и Р-структурных участков в белке. Спектры КД рекомбинантных рибосомных белков Б13 и 816 представлены на рис. 2. Можно видеть, что спектры ренатурированных белков в отличие от денатурированных имеют характерные пики (более интенсивные на 208 нм и менее выраженные на 222 нм), что указывает на присутствие элементов | вторичной структуры в молекулярных структурах соответствующих ренатурированных рекомбинантых белков. Данные о структурированности белков получали из анализа КД-спектров с помощью программы 8ЕЬСОМ. Оценка | количества аминокислотных остатков, участвующих в формировании а-спиралей и

млекопитающих (рис. 1).

12 3 4

Э16

«4

с* 50

ш» 37

«В 25

т 20

т 15

1 2

1 2 3

р-структур в ренатурированном белке, показала, что в случае грБ13 43±5% аминокислотных остатков образуют а-спирали, а 11±3% - р-структуры, тогда как в случае грБ16 а-спирали формирует 21±4% аминокислотных остатков белка, а Р-структуры - 24±3%. В целом, данные КД-спектров свидетельствуют о том, что полученные рекомбинантные белки 813 и Б16 обладают выраженной вторичной структурой.

Рис. 2. Спектры КД в дальней УФ-обласш денатурированных (кривая 1) и ренатурированных (кривая 2) рекомбинантных рибосомных белков S13 (А) и S16 (Б) человека. Денатурацию белков проводили в 8 М мочевине, а ренатурацию - в 10 мМ буфере К2НР04/КН2Р04.

Одним из свидетельств соответствия вторичной структуры рекомбинантного белка структуре нативного белка является сравнение данных об их структурированности, рассчитанных из их КД-спектров. Однако следует отметить, что получение отдельных нативных рибосомных белков является крайне сложной и трудоемкой задачей, а экспериментальные данные о третичной структуре рибосомных белков S13 и S16 человека к настоящему моменту отсутствуют. Поэтому рассчитанные из КД-спектров данные о вторичной структуре рибосомных белков S13 и S16 сравнивали с данными о структуре этих белков, полученными при изучении рибосом дрожжей (Spahn et al., 2004, Halic et al., 2005) и собаки (Chandramouli et al., 2008) с помощью крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ). Для получения информации о структурированности рибосомных белков S13 и S16 человека использовали также компьютерные программы GOR, PSIpred и SSpro, которые предсказывают расположение элементов вторичной структуры в полипептидах, используя различные алгоритмы. Результаты представлены в табл. 1 и на рис. 3. Как видно из таблицы, для rpS16 доля аминокислотных остатков, участвующих в формировании а-спирапей, рассчитаная из КД-спектров, совпадает с соответствующей величиной, полученной на основе данных крио-ЭМ, в то время как доля остатков, вовлечённых в формирование p-структур, рассчитанная из КД-спектров, оказывается несколько выше, чем величина, найденная из данных крио-ЭМ. Последнее может быть обусловлено как изменениями в структуре белка при формировании рибосомы, так и несовершенством программы обсчёта КД-спектров. Аналогичное сравнение данных для rpS13 не представляется возможным, поскольку

к настоящему времени имеются данные только о структуре С-концевого фрагмента белка. Анализ данных, полученных с помощью программ GOR, PSIpred и SSpro, показал, что для rpS13 доля аминокислотных остатков, вовлечённых в формирование а-спиралей, предсказанная с помощью программ PSIpred и Sspro, несколько выше, а количество ß-структур - ниже, чем соответствующие величины, рассчитанные из КД-спектров. При этом предсказания, сделанные с помощью программы GOR, оказались наиболее приближены к экспериментальным данным. Однако для rpS16 предсказания, сделанные с помощью этой же программы, отличаются как от данных, рассчитанных из КД спектров, так и от данных крио-ЭМ; тогда как количество а-спиралей и ß-структур, предсказанное с помощью программ Sspro и PSIpred соответственно, хорошо коррелирует с данными КД и крио-ЭМ величинами.

Источник rpS13 rpS16

данных а-спирапи ß-структуры а-спирали ß-структуры

КД-спектры 43±5% 11±3% 21±4% 24±3%

крио-ЭМ 21% 14%

- - 25% 17%

GOR 40% 16% 46% 14%

PSIpred 55% 2% 36% 23%

SSpro 52% 5% 23% 35%

Таблица 1. Количество аминокислотных остатков, участвующих в формировании элементов вторичной структуры рибосомных белков 813 и 816.

Использованные программы дают информацию не только об общем количестве структурных элементов в белке, но и об их расположении в его вторичной структуре. Представляло интерес сравнить информацию о расположении а-спиралей и p-структур в белках S13 и S16 человека с данными крио-ЭМ рибосомных белков S13 и SI6 дрожжей и собаки, а также с данными РСА их прокариотических гомологов - рибосомных белков S15 и S9 соответственно. Структурные данные для рибосомных белков S13 и S16 дрожжей и собаки взяты из трехмерных моделей 80S рибосом или фрагмента 40S субчастицы, полученных с помощью крио-ЭМ, а данные для их гомологов - из модели 30S субчастицы рибосомы T. thermophilus, полученной с помощью РСА (Brodersen et al., 2002). Из данных, представленных на рис. 3 видно, что расположение а-спиралей и р-структур во вторичной структуре рибосомных белков S13 и S16 эукариот согласуется с расположением этих элементов в структуре гомологичных им белков

515 и S9 прокариот, несмотря на достаточно низкую степень идентичности первичных структур гомологичных белков (17% для гомологичной пары белков S13 человека-SI 5 T. thermophilus и 30% для пары S16 человека — S9 T. thermophilus). В целом, предсказанное количество структурных элементов в рибосомных белках S13 и S16 человека хорошо коррелирует с данными, рассчитанными из КД-спектров рекомбинантных белков, а также с известными данными о структуре белков S13 и

516 эукариот; некоторые расхождения, вероятно, обусловлены слабостью алгоритмов предсказания вторичной структуры белков. Таким образом, можно

заключить, что структура полученных рекомбинантных белков соответствует структуре нативных рибосомных белков S13 и S16 человека.

А РСЛ данные ^■ ««»«»м

S15 T. thermophilus м-----Р--------------------ITKEEKQKVIQEFAR---FPGDTG-----STEV-QVALLT----

S13 человека MGRMHAPGKGLSQSALPYRRSVPTWLKLTSDDVKEQIYKLAKKGLTPSQIGVILRDSHGVAQVRFVTGNKI

S13 (2004) «—" S13 < 2005) ■ GOR4 -^> -—

Sbpro 1 ■

LRINR---------------------LSEHLKVHKKDHHSHRGLLMMVGQRRRLLRYLQRE---DPE-RYRALIEKLGIRG

LRILKSKGLAPDLPEDLYHLIKKAVAVRKHLERNRKDKDAKFRLILIESRIHRLARYYKTKRVLPPNWKYESSTAS-ALVA

РСА данные • --Г- —> *•

S9 T. thermophilus ------MEQYYGTGRRKEAVARVFLRPGNGKVTVNGQDFNEYFQGLVRAVAALEP—LRAV

S16 человека MPS KG PLQSVQVFGRKKTATAVAHCKRGNGLIKVN GRPL-EMIEPRTLQYKLLEPVLLLGK

S16(2004) _*». )»- -te. —4». Ь

SI6I2008) - >► -V —>- >

GOR4 PSIprcd

DALGRFDAYITVRGGGKSGQIDAIKLGIABALVQYNPDY-----RAKLKPL------GFLTRDARWERKKYGKHKARRAPQYSKR

ERFAGVDIRVRVKGGGHVAQIYAIRQSISKALVAYYQKYVDEASKKEIKDILIQYDRTLLVADPRRCESKKFGGPGARARYQKSYR

Рис. 3. Расположение элементов вторичной структуры в рибосомных белках S15 Т. thermophilus и S13 человека и дрожжей (А) и рибосомных белках S9 T. thermophilus и S16 человека, собаки и дрожжей (Б) после выравнивания их аминокислотных последовательностей. Сверху от аминокислотных последовательностей белков указано расположение а-спиралей (прямоугольники) и Р-структур (стрелки) во вторичной структуре белков S15 и S 9 T. thermophilus согласно данным рентгеноструктурного анализа. Снизу приведено расположение а-спиралей и Р-структур для аминокислотных последовательностей белков S13 и S16 собаки и дрожжей согласно данным крио-ЭМ, а также белков S13 и S16 человека согласно данным, полученным с помощью компьютерного анализа с использованием программ GOR, PSIpred и SSpro.

Стабильность вторичной структуры рекомбинантных белков при различных значениях рН и концентрации денатуранта (мочевины) изучали, измеряя величину эллиптичности растворов белков при 222 нм (рис. 4). Видно, что в случае rpS13 эта величина практически не изменяется в области значений рН 4.0-8.0, а при повышении или понижении рН медленно возрастает. По-видимому, вторичная структура белка стабильна в области рН 4.0-8.0, а за пределами этих значений происходит денатурация белка. Измерение эллиптичности растворов ipS13, содержащих различные концентрации мочевины, показало, что при низких концентрациях мочевины (до 3 М) вторичная структура rpS13 стабильна, тогда как при повышении концентрации мочевины белок денатурирует (рис. 4). Значение эллиптичности раствора rpS16 оставалось стабильным в области рН 2.0-8.0, а при

дальнейшем повышении рН раствора резко увеличивалось. Эти данные свидетельствует о том, что диапазон рН, при котором гр816 обладает устойчивой конформацией, довольно широк - от рН 2 до рН 8, однако при рН выше 8 происходит, вероятно, нарушение вторичной структуры белка. При увеличении концентрации мочевины от 0 до 8 М значения эллиптичности раствора гр816 медленно возрастает, что, по-видимому, указывает на постепенное «разворачивание» белка при увеличении концентрации денатуранта (рис. 4). Результаты по денатурации белка в мочевине, полученные с помощью КД, хорошо коррелируют с соответствующими данными, полученными с помощью электрофореза в градиенте мочевины (рис. 4). Для грБП электрофоретическая подвижность белка постоянна при концентрации мочевины от 0 до 2.5 М и при дальнейшем увеличении концентрации мочевины медленно уменьшается, тогда как электрофоретическая подвижность грБ16 плавно снижается при повышении концентрации мочевины от 1 до 8 М, что свидетельствует о денатурации белков в этих условиях.

н [Мочевина], M

р" [Мочевина], M

Рис. 4. Стабильность вторичной структуры рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16 при различных рН и концентрации мочевины. А, В - зависимость значений эллиптичности для ренатурированного rpS13 (С=9-10"7) от рН (А) и концентрации мочевины (В). Б и Г - то же для rpS16 (С=1.3-10"7). Д и Е - электрофорез ренатурированных белков S13 и S16 соответственно в 12% ПААГ, содержащем градиент концентрации мочевины. Относительная ошибка эксперимента составляла не более 10%.

Таким образом, можно заключить, что полученные рекомбинантные рибосомные белки S13 и S16 человека обладают выраженной вторичной структурой, которая стабильна при средних значениях рН, и пригодны для использования в структурно-функциональных тестах. Можно также отметить, что

предсказанное расположение элементов вторичной структуры у обоих рибосомных белков человека во многом совпадает с расположением элементов вторичной структуры у их прокариотических и эукариотических гомологов, что говорит о высокой структурной консервативности этих белков.

2. Влияние рибосомных белков S13 и S16 на сплайсинг собственных пре-мРНК

2.1. Анализ степени идентичности нуклеотидных последовательностей генов рибосомных белков S13 и S16 млекопитающих Пре-мРНК рибосомных белков млекопитающих обладают значительной протяжённостью (несколько тысяч нуклеотидных остатков). Известно, что синтез РНК-транскриптов такой длины является трудоемкой и малоэффективной задачей, поэтому были предприняты попытки определить функционально значимые участки пре-мРНК рибосомных белков S13 и S16 с помощью компьютерного анализа, чтобы ограничить длину соответствующих синтезируемых транскриптов этими участками. Выравнивание нуклеотидных последовательностей генов рибосомных белков S13 и S16 человека и некоторых млекопитающих (Canis familiaris, Rattus norvégiens, Mus musculus) с помощью программы ECR (Evolutionary Conserved Regions) Browser (http://ecrbrowser.dcode.org) показало, что первые интроны этих генов более консервативны, чем остальные интроны, что, по-видимому, свидетельствует о функциональной значимости этих участков при сплайсинге пре-мРНК (рис. 5).

s it !__.__~ 1 ■ i,. - J

m g im ■

1 ! i l I_m. A c

FtuKin_

ko* U

I kA _____j&UkJkm

s 100% g

11 1 _É___È-i.M^

IWX

InI^wa_ л

Рис. 5. Выравнивание нуклеотидных последовательностей генов рибосомных белков S13 (А) и S16 (Б) человека и некоторых млекопитающих (Canis familiaris, Rattus norvegicus, Mus musculus) с помощью ECR Browser, синим выделена кодирующая часть экзонов, желтым - 5'-и З'-нетранслируемые области, розовым - интроны, зеленым - транспозоны и простые повторы.

2.2. Связывание рекомбинантныхрибосомных белков 313 и 816 с фрагментами собственных пре-мРНК и мРНК Чтобы проверить, способны ли рибосомные белки 813 и 816 связываться со своими пре-мРНК в области первых интронов, изучали связывание этих белков с РНК-транскриптами, моделирующими различные фрагменты их пре-мРНК. ДНК-матрицы для синтеза этих транскриптов получали с помощью ПЦР-амплификации соответствующих участков генов рибосомных белков 813 и 816. Прямые праймеры с 5'-стороны содержали последовательность, соответствующую последовательности промотора Т7 РНК-полимеразы, что позволяло использовать полученные ПЦР-продукты в реакции Т7 транскрипции. Общая схема получения РНК-транскриптов представлена на рис. 6.

ч™

_ *

Г|-——Ч Т]——| Г|У

плыб Ш11 13й?г 1зш-г

13-1 13-2 13-3 13-5 13-4

16-1 16-2

ИЛЬ

м1>НКгр?1>

мРНКгрШ

Рис. 6. Схема получения 1<нш 2 РНК-транскриптов, ^ 1| соответствующих

-1 различным фрагментам пре-мРНК рибосомных белков 813 (А) и 516 (Б) человека.

Для

изучения связывания гр813 с собственной пре-мРНК несколько [32Р]-меченых РНК-транскриптов, соответствующих

использовали различным

фрагментам пре-мРНК или мРНК грБ13 (транскрипты 13-1, 13-2, 13-3 и 13-4). Связывание транскриптов с рекомбинантным белком проводили при 0°С в буфере,

содержащем 200 мМ КС1, и анализировали с помощью фильтрования на нитроцеллюлозных фильтрах (рис. 7). Кажущаяся константа ассоциации (Ка) грвХЗ с транскриптом 13-4, соответствующим мРНК этого белка (Ка = 8.3-106 М"1), оказалась примерно на порядок ниже, чем с транскриптами 13-1 (Ка = ЬЗ-^М"1), 13-2 (Ка = 1.4-108 М"1) и 13-3 (Ка = 1.0-108 М"1), соответствующими различным фрагментам его пре-мРНК, содержащим первый интрон. Это свидетельствует о том, что гр813 обладает повышенным сродством к первому интрону своей пре-мРНК. Следует отметать, что транскрипт 13-3, содержащий только первый интрон связывался с белком несколько слабее, чем транскрипты 13-1 и 13-2, общей

х а.

к л 3

О го

Концентрация 513, *10 М

Рис. 7. Анализ связывания 32Р-меченых транскриптов 13-1, 13-2, 13-3, 13-4 с рекомбинантным гр813 человека с помощью фильтрования на

нитроцеллюлозных фильтрах.

Относительная ошибка измерений составляла не более 10%.

характеристикой которых является наличие первого интрона и первого экзона. На основании этих данных можно предположить, что участок связывания грБП расположен в области границы первого экзона и первого интрона, поэтому в дальнейших экспериментах стали использовать транскрипт 13-5, содержащий первый интрон, фланкированный последовательностями экзонов. Для изучения связывания грБ 1 б со своей пре-мРНК использовали аналогичный транскрипт 16-1 (рис. 6), соответствующий фрагменту пре-мРНК, содержащему первый интрон, фланкированный последовательностями экзонов.

Специфичность взаимодействия рибосомных белков Б13 и Б16 с фрагментами собственных пре-мРНК, содержащими первый экзон, первый интрон и второй экзон, устанавливали несколькими способами. Для выяснения их сродства к фрагментам собственных пре-мРНК изучали связывание соответствующих рекомбинантных белков с [32Р]-мечеными транскриптами 13-5 и 16-1 и транскриптом, соответствующим фрагменту пре-мРНК фБ2б (рис. 8). Связывание проводили в буфере с высокой ионной силой (содержащем 300 мМ КС1) для уменьшения возможного неспецифического связывания, обусловленного электростатическими взаимодействиями между положительно заряженными рибосомными белками и отрицательно заряженными РНК. Оказалось, что сродство гр813 (Ка = 2.3-107 М"1) и грБ16 (Ка = 1.0-107 М"1) к фрагментам своих пре-мРНК было заметно выше, чем их сродство к фрагментам пре-мРНК других белков (рис. 8А, Б).

В экспериментах по конкурентному связыванию белков 813 и Б16 с [32Р]-мечеными фрагментами своих пре-мРНК в реакционную смесь добавляли различные немеченые РНК (транскрипты 13-5 и 16-1, 13-4 и 16-2, фрагмент аденовирусной пре-мРНК, содержащий первый и второй экзоны и укороченный первый интрон, и поли(Аи) РНК) (рис. 8В, Г). Можно видеть, что немеченый транскрипт 13-5 значительно ингибирует связывание меченого транскрипта 13-5 с гр813, а немеченый транскрипт 16-1 понижает уровень связывания меченого транскрипта 16-1 с гр816. Другие немеченые РНК, такие как фрагмент собственной мРНК, фрагмент аденовирусной пре-мРНК или поли(Аи) РНК, взятые в таких же концентрациях, влияли на связывание 13-5 с грБ13 или 16-1 с грБ16 в значительно меньшей степени.

Чтобы показать, насколько сродство рибосомных белков 813 и Б16 к транскриптам 13-5 и 16-1 соответственно отличается от сродства других рибосомных белков к этим же транскриптам, проводили связывание каждого из транскриптов с белками БЮ, Б13 и Б16 (рис. 8Д, Е). Оказалось, что Ка транскрипта 13-5 с фБ13 и Ка транскрипта 16-1 с гр816 заметно выше, чем с белками Б16 и 813 соответственно, при этом связывания данных транскриптов с грБЮ практически не наблюдали.

Таким образом, можно заключить, что рибосомные белки 813 проявляют высокую специфичность к фрагментам кодирующих

содержащих первый экзон, первый интрон и второй экзон.

и 816 т VI (го их пре-мРНК,

100 2! 80

•Б13 • 516 ■ЭМ

0 001

0 01

Концентрация белка, -10 М

0 001 0.01 0.1 Концентрация 516, -10

• 516 813

• БЮ

0 001

/ / //

.-Л

2 4 в 8 10 0001 0 01 0.1 1 Концентрация конкур. РНК, -10® М Концентрация белка, ■10'® М

Рис. 8. Анализ связывания [32Р]-меченых транскриптов 13-5 (А, В, Д) и 16-1 (Б, Г, Е) с рекомбинантными рибосомными белками 813, 816 и БЮ человека с помощью фильтрования на нитроцеллюлозных фильтрах. А, Б - изотермы связывания фрагментов пре-мРНК различных рибосомных белков (813, 816 и 826) с белками 813 и 816 соответственно. В, Г -изотермы связывания транскриптов 13-5 (В) и 16-1 (Г) с белками в 13 и Э16 соответственно в присутствии различных немеченых РНК (13-5,13-4,16-1,16-2, фрагмент аденовирусной пре-мРНК и поли(АЦ) РНК). Д, Е - изотермы связывания транскриптов 13-5 (В) и 16-1 (Г) с белками 813, 816 и 810. Относительная ошибка измерений составляла не более 10%.

2.3. Связывание грБ13 с фрагментом своей пре-мРНК в составе ядерного экстракта клеток НеЬа Чтобы выяснить, возможно ли специфичное связывание рибосомных белков с фрагментами своих пре-мРНК в условиях клеточного ядра, т. е. в окружении множества различных белков, проявляющих РНК-связывающую активность, проводили связывание гр813 с различными РНК в ядерном экстракте клеток НеЬа с последующим анализом связавшихся компонентов с помощью иммунопреципитации. Меченые РНК-транскрипты (фрагменты пре-мРНК рибосомных белков 813 (13-5), 817 и Б26) инкубировали в ядерном экстракте клеток НеЬа в присутствии рекомбинантного гр813. Далее добавляли протеин-в сефарозу с предварительно иммобилизованными специфичными антителами против фБ13 и дополнительно инкубировали в течение 1 ч. РНК-белковые комплексы, связавшиеся с сорбентом, выделяли центрифугированием и разрушали добавлением БОБ, после чего РНК выделяли фенольной депротеинизацией смеси и анализировали гель-электрофорезом в денатурирующих условиях (рис. 9). Можно

видеть, что после проведенной иммуноселекции доля транскрипта 13-5 значительно увеличилась (примерно с 40% до 70% от общего количества РНК). Таким образом, на основании представленных выше данных можно заключить, что рибосомные белки 813 и Б]6 способны специфично связываться с фрагментами кодирующих их пре-мРНК, содержащими первый интрон, фланкированный соседними экзонами. А Б Рис. 9. Связывание грЭИ в ядерном экстракте клеток НеЬа

с фрагментами различных пре-мРНК. А - анализ РНК,

................связавшейся с белком электрофорезом в ПААГ в

присутствии 8 М мочевины, радиоавтограф. Дорожки 1 и „пре^рнк. ^ 2 - РНК, связавшаяся с протеин-й сефарозой с

иммобилизованными антителами против гр813 и без антител соответственно. Дорожка 3 - аликвота первоначальной реакционной смеси, дорожка 4 - РНК, не связавшаяся со смолой с иммобилизованными антителами. Б - диаграмма, иллюстрирующая соотношение количеств РНК-транскриптов в первоначальной реакционной смеси (5) и в смеси после проведенной иммуноселекции (6).

пре-мРНК

13-5

2.4. Влияние рибосомных белков S13 и S16 на сплайсинг фрагментов собственных пре-мРНК in vitro Для определения функциональной значимости связывания рибосомных белков S13 и S16 с кодирующими их пре-мРНК изучали влияние этих белков на сплайсинг in vitro фрагментов их пре-мРНК. В опытах использовали транскрипты 13-5 и 16-1, поскольку они содержали все структурные элементы (канонические сайты сплайсинга и регуляторные последовательности), обеспечивающие протекание сплайсинга при их инкубации в ядерном экстракте. Действительно, при инкубации транскриптов 13-5 и 16-1 в ядерном экстракте HeLa в условиях сплайсинга in vitro наблюдали образование продуктов дискретной длины, соответствующих лигированным экзонам и интермедиатам сплайсинга (рис. 10). В случае транскрипта 13-5, продукт II соответствует имеющему форму петли интермедиату, содержащему интрон и второй экзон, продукт III - первому интрону, имеющему форму петли (этот продукт образует несколько полос, поскольку является нестабильным и деградирует в условиях сплайсинга in vitro), а продукт IV - лигированным экзонам, (рис. 10, дорожка 1). В случае транскрипта 16-1 образовывались аналогичные продукты, при этом продукт V соответствует первому экзону. Как видно из данных, представленных на рис. 10А, при добавлении в реакционную смесь, содержащую транскрипт 13-5, рекомбинантного rpS 13 до 1.0 и 2.0 мкМ концентрации (дорожки 2 и 3, соответственно) эффективность сплайсинга значительно понижается (ср. дорожку 1 и дорожки 2 и 3). Увеличение концентрации белка до 3.0 мкМ приводило к практически полному подавлению сплайсинга (рис. 10А, дорожка 4). Рекомбинантные белки S10 и S16, взятые в тех же концентрациях, не влияли на эффективность сплайсинга (рис. 10А, дорожки 5-10). В случае транскрипта 16-1 наблюдали аналогичную картину (рис. 10Б) - добавление в реакционную смесь,

содержащую этот транскрипт, рекомбинантного фБ16 до 0.3, 1.0 и 2.0 мкМ концентрации (дорожки 2-4 соответственно) приводило к значительному понижению эффективности сплайсинга (ср. дорожку 1 и дорожки 2-4), а увеличение концентрации белка до 8.0 мкМ - к практически полному подавлению сплайсинга (рис. 10Б, дорожка 5). С другой стороны, рибосомные белки 810 и 813, взятые в концентрациях 0.3-2 мкМ, практически не влияли на эффективность сплайсинга, а при увеличении их концентрации в реакционной смеси до 8 мкМ происходило лишь незначительное ингибирование реакции сплайсинга (рис. 10Б, дорожки 6-13).

Д 13-5 Б 16-1

123456789 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рис. 10. Сплайсинг in vitro транскриптов 13-5 и 16-1. Радиоавтограф. А - транскрипт 13-5. Дорожка 1 — анализ с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях продуктов сплайсинга [32Р]-меченого транскрипта 13-5 в отсутствие рибосомных белков, дорожки 2-10 -тот же анализ, что и на дорожке 1, но в присутствии 1, 2 и 3 мкМ rpS13 (2-4 соответственно), rpS16 (5-7 соответственно) или rpSlO (8-10 соответственно). Б - транскрипт 16-1. Дорожка 1 - анализ продуктов сплайсинга [32Р]-меченого транскрипта 16-5 в отсутствие рибосомных белков, дорожки 2-13 - тот же анализ, что и на дорожке 1, но в присутствии 0.3 1, 3 и 8 мкМ rpS16 (2-5 соответственно), rpS13 (6-9 соответственно) или rpSlO (10-13 соответственно). Слева от панелей указаны положения и размер исходных РНК-транскриптов и продуктов их сплайсинга (I - исходный транскрипт, II - интермедиат, содержащий интрон и второй экзон, III - первый интрон, IV - дотированные экзоны, V - первый экзон).

Чтобы убедиться в специфичности ингибирования рибосомными белками S13 и S16 сплайсинга фрагментов их пре-мРНК in vitro, был поставлен более строгий контрольный опыт, в котором использовали два транскрипта - 13-5 и 16-1 в одной реакционной смеси. Добавление в такую реакционную смесь рекомбинантного rpSl 3 вызывало полное ингибирование сплайсинга транскрипта 13-5 при концентрации белка 8 мкМ, и существенно не влияло на сплайсинг транскрипта 161 (рис. 11А). В случае добавления rpS16, наоборот, наблюдали значительное понижение эффективности сплайсинга только у транскрипта 16-1 и менее выраженное - у транскрипта 13-5 (рис. 11Б).

Таким образом, опыты по сплайсингу in vitro показали, что рибосомные белки S13 и S16 человека, подобно rpS26 (Ivanov et al., 2005), способны специфично

ингибировать выщепление первого интрона из фрагмента собственной пре-мРНК. Учитывая, что эти же рибосомные белки специфично связываются с фрагментами своих пре-мРНК, содержащими первый интрон, можно предположить, что именно это связывание каким-то образом препятствует сплайсингу фрагментов пре-мРНК. Возможно, что рибосомные белки связываются с пре-мРНК в районе сайтов сплайсинга первого интрона и, таким образом, препятствуют связыванию с ней ¡некоторых канонических факторов сплайсинга.

А «-5 .......................«И_____________________________________Б ,6., 13.5

t?ft tiff!

*»*" к

I II

i » * I t » f I

lllll •»'

Рис. 11. Сплайсинг in vitro транскриптов 13-5 и 16-1. Радиоавтограф. Анализ с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях продуктов сплайсинга [32Р]-меченых транскриптов 13-5 (А, дорожки 1-4 и Б, дорожки 9-11) или 16-1 (А, 10-13 и Б, 1-3) в отсутствие рибосомных белков. Сверху указано время (ч) инкубации РНК-транскриптов в условиях сплайсинга in vitro. Анализ продуктов сплайсинга транскриптов 13-5 и 16-1 в одной реакционной смеси в отсутствие рибосомных белков (А, дорожка 5; Б, дорожка 4) и в присутствии 0.3, 1, 3 и 8 мкМ rpS13 (А, дорожки 5-8 соответственно) или rpS16 (Б, дорожки 6-9 соответственно). Слева и справа указаны положения и размеры исходных транскриптов и продуктов их сплайсинга по аналогии с рис. 10.

2.5. Ферментативный футпринтинг фрагмента пре-мРНК rpS13 в комплексе с rpS13

Чтобы получить представление об участках связывания обсуждаемых рибосомных белков на своих пре-мРНК, мы, используя метод ферментативного футпринтинга, определили нуклеотиды фрагмента пре-мРНК rpS13, меняющие свою доступность действию РНКаз в присутствии соответствующего ей белка. Этот метод основан на изменении доступности фосфодиэфирных связей РНК гидролизу РНКазами в присутствии белка. Понижение доступности, как правило, связано с участием соответствующих нуклеотидов в комплексообразовании с белком, а повышение - со структурной реорганизацией молекулы РНК, индуцируемой этим комплексообразованием. В качестве зондов использовали РНКазы Tl, Т2 и VI. Ферментативный гидролиз РНК проводили в условиях, когда 90% РНК находилось в комплексе с белком. Нуклеотидные остатки, расположенные с 3'-стороны от

разрыва фосфодиэфирных связей, определяли с помощью удлинения олигонуклеотида-праймера в реакции обратной транскрипции. Поскольку реакция останавливается в участке разрыва РНК, то в реакционной смеси накапливаются продукты определённой длины, соответствующей положению участка разрыва. Результаты представлены на рис. 12. Видно, что остановки обратной транскрипции на нуклеотидах G53, А192 и G193 (дорожки Т2), на С46, А160 и С162 (дорожки VI) и нуклеотиде С76 (дорожки Т1) происходили только в отсутствие рибосомного белка. Следовательно, можно предположить, что rpS 13 защищает от гидролиза РНКазой Т2 фосфодиэфирные связи с 3'-стороны от нуклеотидных остатков А52, А191 и А192, от гидролиза РНКазой VI - 3'-стороны от остатков С45, С159 и С161 и от гидролиза РНКазой Т1 - фосфодиэфирную связь между G75 и С76. Можно видеть, что указанные нуклеотидные остатки располагаются в различных участках первичной структуры транскрипта 13-5, однако эти участки вполне могут оказаться сближены в пространственной структуре этой РНК. Чтобы проверить это предположение, было выполнено компьютерное предсказание вторичной структуры транскрипта 13-5 с использованием программы Sfold 2.0 (http://sfold.wadsworth.org/index.pl). На рис. 13 представлена рассчитанная модель вторичной структуры транскрипта 13-5 с минимальной Л037 = -88.5 kcal/mol. Эта модель, как можно видеть, в основном соответствует данным, полученным с помощью ферментативного футпринтинга (рис. 12). Благодаря высокому содержанию G'C пар (около 65%) в транскрипте 13-5 можно ожидать, что такая структура будет стабильной и может формироваться в клетке в процессе синтеза пре-мРНК rpSl 3 в ядре. При анализе расположения на предсказанной вторичной

Рис. 12. Анализ продуктов

А 12 vi T1

АСОТ+-+-+-III II Jipi) g

В VI

+ -TGCA

WS+

. М

А160 _ C1S2-

А192-*. GW-»-

— * .

обратной транскрипции

фрагментов, образующихся в результате ферментативного футпринтинга использованного в работе транскрипта 13-5 с помощью РНКаз Т1, Т2 и VI. Радиоавтографы. Футпринтинг в отсутствие (-) или присутствии (+) гр813. Обратная транскрипция в присутствии [32Р]-меченого

праймеров 13111-16 (А) и 131Ш-2 (Б, В) (см. рис. 6). Стрелками указаны те нуклеотиды, на которых происходили остановки обратной транскрипции только в случае ферментативного гидролиза РНК в отсутствие грБИ. Дорожки А, С, в и Т - продукты секвенирования, образованные в присутствии ёёТТР, сИОТР, аёСТР и &1АТР, соответственно.

I включает две связи с 3'-стороны от нуклеотидных остатков С45, А52, вторая - три I связи с З'-стороны от G75, А191 и А192, и третья - две связи между нуклеотидами С159-А160 и С161-С162. Первые две группы находятся достаточно структуре I фосфодиэфирных связей, которые rpS13 защищает от гидролиза РНКазами, можно I выделить три группы. Первая группа близко друг от друга во вторичной структуре и, кроме того, расположены вблизи 5'- и З'-сайтов сплайсинга соответственно; возможно, в третичной структуре они оказываются сближенными с третьей группой | нуклеотидных остатков, формируя, таким образом, участок связывания rpS13. [ Суммируя вышесказанное, можно заключить, что участок связывания rpS13 во I фрагменте его пре-мРНК, содержащем первый интрон, фланкированный экзонами, | расположен вблизи 5'- и З'-сайтов сплайсинга, которые, вероятно, сближены в пространстве.

Известно, что регуляция экспрессии генов рибосомных белков прокариот осуществляется по принципу обратной связи на уровне трансляции. Участок мРНК, содержащий сайт связывания rpS15, прокариотического гомолога rpS13 человека, по своей пространственной структуре похож на участок 16S рРНК, где расположен сайт связывания этого белка. Этот сайт в 16S рРНК формируют несовершенная спираль Н22,

находящийся в ее основании тройной узел и две пары оснований (G-U и G-C), расположенные на расстоянии примерно десяти нуклеотидных пар от этого тройного узла. Транскрипт 13-5 также имеет подобный мотив, а именно, спираль (формируемую нуклеотидами с 39 по 64) с тройным узлом в основании и парами оснований G48-U55 и G49-C54, расположенными на расстоянии примерно десяти нуклеотидных пар от тройного узла (рис. 13). В этой области расположены две связи, защищаемые rpS13 от гидролиза РНК (между

I)?

V '7

BZ,

1Г< . и „

/ im

G53

9fb

т Г

Hi ¡■7

C4S

Рис. 13. Модель вторичной структуры транскрипта 13-5, полученная с помощью программы Sfold 2.0. Стрелками указаны 5' и 3' сайты сплайсинга, треугольниками указаны нуклеотидные остатки, после которых происходит остановка обратной транскрипции в присутствии rpS 13.

нуклеотидами С45-С46, A52-G53) и 5'-сайт сплайсинга. Таким образом, это наблюдение подтверждает сделанное выше заключение о том, что район транскрипта 13-5, содержащий 5'-сайт сплайсинга, участвует в формировании участка связывания rpS13.

2.6. Влияние rpS13 на сплайсинг фрагмента его пре-мРНК, несущего мутации

вблизи сайтов сплайсинга

Для определения роли нуклеотидов С46, G53, А192 и G193 и содержащих их элементов пространственной структуры транскрипта 13-5 в связывании rpS13 синтезировали транскрипт 13-5 с заменами нуклеотидов в положениях 44-46 (фрагмент ССС заменен на AGA) и 191-193 (фрагмент AAG заменен на ССС) (транскрипт 13-5-mut). В результате первой замены происходило разрушение вторичной структуры шпильки, формируемой нуклеотидами 39-64, содержащей 5'-сайт сплайсинга. Вторая замена вызывала изменения во вторичной структуре транскрипта в районе 3'-сайта сплайсинга. Связывание РНК-транскрипта 13-5-mut с rpS13 изучали с помощью фильтрования на нитроцеллюлозных фильтрах (рис. 8). Из представленных результатов видно, что Ка мутантного транскрипта с rpS 13 (Ка = 1-Ю7 М'1) заметно ниже Ка транскрипта 13-5 (Ка= 2.3-107 М"1), что подтверждает сделанное выше заключение о расположении участка связывания rpS13 в РНК-транскрипте 13-5 вблизи сайтов сплайсинга.

При инкубации мутантного транскрипта 13-5-mut в условиях сплайсинга in vitro наблюдали образование таких же продуктов, как и в случае транскрипта 13-5, эффективность сплайсинга также не изменялась (рис. 14). Однако ингибирование сплайсинга транскрипта 13-5-mut в присутствии rpS13 происходило в меньшей степени, по сравнению с ингибированием сплайсинга 13-5 (рис. 14), по-видимому, из-за меньшего сродства rpS13 к мутантному транскрипту. Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что rpS 13 ингибирует сплайсинг собственной пре-мРНК благодаря его связыванию вблизи сайтов сплайсинга первого интрона.

Эти результаты нашли подтверждение в опытах in vivo, выполненных A.A. Малыгиным (ИХБФМ СО РАН) на базе University of Leicester (Великобритания). В этих опытах, с использованием различных плазмидных конструкций, кодирующих rpS13 человека, было показано, что избыточная продукция rpS 13 в клетке препятствует выщеплению первого интрона из его пре-мРНК. Так, уровень мРНК rpS13 в клетках, трансфицированных плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую rpS13, вставленную с сохранением рамки считывания, был в четыре раза выше, чем в клетках, трансфицированных плазмидой, дополнительно содержавшей первый интрон гена rpS13, вставленный между первым и вторым экзонами. При этом уровень других мРНК значительно не изменялся.

1S.5.ml!t

13-5-mut

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 14. Сплайсинг in vitro транскриптов 13-5 и 13-5-mut. A - анализ с помощью гель-I электрофореза в денатурирующих условиях продуктов сплайсинга [32Р]-меченого 13-5 (дорожки 1-3) или 13-5-mut (дорожки 10-12) в отсутствие рибосомных белков. Сверху указано время (ч) инкубации транскриптов в условиях сплайсинга. Тот же анализ, но в I присутствии 0.3, 1, 3 мкМ rpS13 (дорожки 4-6 и 7-9 для 13-5 и 13-5-mut соответственно), j Радиоавтограф. Слева указаны положения трансктиптов 13-5 и 13-5-mut (I) и продуктов сплайсинга (обозначения аналогично рис. 9). Б - диаграмма, представляющая эффективность сплайсинга транскриптов 13-5 (белые колонки) и 13-5-mut (серые колонки). Высота колонок соответствует отношениям количеств продукта сплайсинга IV и исходного транскрипта 13-5 (13-5-mut) I в соответствующих дорожках на радиоавтографе, выраженным в относительных единицах.

2.7. Предлагаемый механизм регуляции сплайсинга пре-мРНКрибосомных

белков S13 и S16

На основании полученных данных можно заключить, что rpS 13 способен связываться со своей пре-мРНК вблизи сайтов сплайсинга первого интрона и ингибировать выщепление этого интрона из пре-мРНК. Аналогичный вывод можно сделать и для rpS16, учитывая его высокое сродство к фрагменту своей пре-мРНК, содержащему первый интрон, фланкированный экзонами, и способность ингибировать сплайсинг этого фрагмента. Таким образом, регуляция экспрессии генов рибосомных белков S13 и S16 человека на стадии сплайсинга происходит по принципу обратной связи, как и регуляция экспрессии генов rpL3 и rpS26 человека и генов некоторых других рибосомных белков высших и низших эукариот (Иванов 1 и др., 2006). По-видимому, увеличение в клеточном ядре концентрации рибосомных белков S13 и S16 приводит к ингибированию вырезания первого интрона из их пре-мРНК за счет связывания с кодируемыми белками. Образующаяся при этом незрелая мРНК, содержащая первый интрон, благодаря наличию в ней преждевременного терминирующего кодона является субстратом аппарата деградации бессмысленных мРНК.

выводы

1. Получены и охарактеризованы рекомбинантные рибосомные белки S13 и S16 человека. Показано, что вторичная структура этих белков соответствует структуре нативных рибосомных белков S13 и S16, при этом структура белка S13 стабильна при pH 4-8 и концентрации мочевины, не превышающей 3 M, а белка S16 - при pH 2-8 и концентрации мочевины до 2 М.

2. С помощью компьютерного анализа установлено, что в генах рибосомных белков S13 и S16 первый интрон наиболее консервативен по сравнению с другими интронами этих генов, что указывает на его регуляторную роль.

3. Показано, что рибосомные белки S13 и S16 способны специфично связываться с фрагментами кодирующих их пре-мРНК, содержащими первый интрон, и ингибировать сплайсинг этих фрагментов в ядерном экстракте клеток HeLa по принципу «обратной связи».

4. Определены нуклеотидные остатки фрагмента пре-мРНК рибосомного белка S13, изменяющие свою доступность РНКазам Т1, Т2 и VI в присутствии данного белка. Установлено, что большинство из этих остатков расположено вблизи 5'- и 3'-сайтов сплайсинга первого интрона. Показано, что мутации в районах, содержащих эти остатки, уменьшают ингибирующий эффект рибосомного белка S13 на сплайсинг фрагмента его пре-мРНК, содержащего первый интрон.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Парахневич Н.М., Малыгин A.A., Карпова Г.Г. Рекомбинантный рибосомный белок S16 человека: получение, очистка, рефолдинг и стабильность // Биохимия. -2005. - Т. 70. - С. 941-946.

2. Malygin A.A., Parakhnevitch N.M., Karpova G.G. Human ribosomal protein S13: cloning, expression, refolding, and structural stability // Biochim Biophys. Acta. -2005. - Vol. 1747. - P. 93-97.

3. Парахневич H.M., Иванов A.B., Малыгин A.A., Карпова Г.Г. Рибосомный белок S13 человека ингибирует сплайсинг собственной пре-мРНК // Молекуляр. биология. - 2007. - Т. 41. - С. 51-58.

4. Malygin A.A., Parakhnevitch N.M., Ivanov A.V., Eperon I.C., Karpova G.G. Human ribosomal protein S13 regulates expression of its own gene at the splicing step by a feedback mechanism // Nucleic Acids Res. - 2007. - Vol. 35. - P. 64146423.

Подписано в печать 24.09.2008г. Формат 60x84 1/16

Объем 1.2 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ №162

Отпечатано в ООО «Омега Принт» 630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 6

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Парахневич, Наталья Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Регуляция экспрессии генов на уровне сплайсинга (Обзор литературы).

1.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белков, участвующих в метаболизме РНК.

1.1.1. Регуляция стайсинга пре-мРНК SR-белков.

1.1.1.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка SRp20.

1.1.1.2. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка SC35.

1.1.1.3. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка 9G8.

1.1.1.4. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка tra-2.

1.1.1.5. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка tra2-betal.

1.1.1.6. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка atRSZ33.

1.1.1.7. Регуляция сплайсинга пре-мРПК белка RSZ36.

1.1.2. Регуляция стайсинга пре-мРНК белков hnRNP.

1.1.2.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка РТВ.

1.1.2.2. Регуляция сплайсинга пре-мРНК hnRNP А1.

1.1.2.3. Регуляция сплайсинга пре-мРПК белка HRP59.

1.1.3. Регуляция сплайсинга пре-мРНК других белков.

1.1.3.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка Yralp.

1.1.3.2. Регуляция сплайсинга пре-мРНК Nova.

1.1.3.3. Регуляция сплайсинга пре-мРНК SWAP.

1.1.3.4. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белков Т1А-1 и T1AR.

1.1.3.5. Регуляция сплайсинга пре-мРНК Sex-lethal.

1.2. Участие рибосомных белков в регуляции сплайсинга своих пре-мРНК.

1.2.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК грЬЗО.

1.2.2. Регуляция стайсинга пре-мРНК rpS 14.

1.2.3. Регуляция сплайсинга пре-мРНКrpLl.

1.2.4. Регуляция стайсинга пре-мРНК rpLl2.

1.2.5. Регуляция стайсинга пре-мРНК rpS28.

1.2.6. Регуляция стайсинга npe-.uPHKrpL3.

1.2.7. Регуляция стайсинга пре-мРНК rpS26.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рибосомные белки S13 и S16 человека"

Рибосомные белки являются структурными элементами рибосомы -многокомпонентной клеточной органеллы, осуществляющей биосинтез белков. Известно, что наряду с функциями, связанными со сборкой рибосомы и трансляцией мРНК [1], многие из этих белков обладают так называемыми «внерибосомными» функциями [2], иначе говоря, они участвуют в различных клеточных процессах, находясь в свободном состоянии, т.е. вне рибосомы. Точная регуляция биосинтеза рибосомных белков является необходимым условием для полноценной жизнедеятельности как отдельной клетки, так и целого организма, а нарушение этой регуляции может приводить к различным критическим изменениям [3, 4]. Согласно современным представлениям регуляция экспрессии генов рибосомных белков эукариот происходит на стадиях транскрипции, сплайсинга и трансляции [5]. Кроме того, регуляция количества рибосомных белков в эукариотических клетках может осуществляться за счет изменения скорости деградации вновь синтезированных белков [6]. Согласно данным [5, 7] регуляция экспрессии генов рибосомных белков эукариот на стадиях транскрипции и трансляции происходит координировано, по принципу «все сразу». Такая регуляция достигается благодаря наличию общих регуляторных элементов как в генах рибосомных белков [8, 9], так и в мРНК, кодирующих эти белки [10, 11]. Регуляция экспрессии генов рибосомных белков на уровне сплайсинга изучена хуже, но в большинстве известных случаев показано, что регуляция на этой стадии осуществляется по принципу «обратной связи», т.е. через взаимодействие рибосомного белка с кодирующей его пре-мРНК [12]. Такой механизм регуляции обеспечивает необходимый уровень каждого рибосомного белка в клетке, независимо от количества остальных рибосомных белков, что может являться исключительно важным для выполнения рибосомными белками функций, не связанных с процессом трансляции. К моменту начала настоящей работы практически отсутствовала информация о механизмах регуляции экспрессии генов рибосомных белков человека на уровне сплайсинга, за исключением того, что к тому времени было известно, что рибосомный белок S26 (гр от англ. ribosomal protein) человека обладает высоким сродством к фрагменту кодирующей его пре-мРНК, содержащему первый интрон [13, 14]. Таким образом, изучение роли рибосомных белков в регуляции сплайсинга кодирующих их пре-мРНК и особенностей РНК-белковых взаимодействий, лежащих в основе этого процесса, имеет важное значение для понимания молекулярных механизмов регуляции биосинтеза рибосомных белков.

Целью настоящей работы являлось изучение регуляции экспрессии генов рибосомных белков Б13 и 816 человека на стадии сплайсинга. Внерибосомные функции этих белков пока не известны, однако имеются данные о возможном участии гр813 в подавлении апоптоза, индуцированного лекарствами против рака желудка [15].

Основными задачами являлись:

• создание экспрессирующих плазмидных конструкций, несущих кДНК рибосомных белков 813 и 816 человека, и получение препаратов рекомбинантных рибосомных белков 813 и 816, пригодных для использования в структурно-функциональных тестах;

• выявление с помощью компьютерного анализа наиболее консервативных интронов в составе пре-мРНК, кодирующих рибосомные белки 813 и 816;

• изучение связывания рибосомных белков 813 и 816 с фрагментами их пре-мРНК, содержащими наиболее консервативные интроны, и исследование влияния данных белков на сплайсинг этих фрагментов;

• определение нуклеотидов фрагмента пре-мРНК рибосомного белка 813, меняющих свою доступность действию ферментов в присутствии кодируемого белка, и выявление их роли в регуляции сплайсинга этого фрагмента.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Парахневич, Наталья Михайловна

выводы

1. Получены и охарактеризованы рекомбинаптные рибосомные белки 813 и 816 человека. Показано, что вторичная структура этих белков соответствует структуре нативных рибосомных белков 813 и 816, при этом структура белка 813 стабильна при рН 4 — 8 и концентрации мочевины, не превышающей 3 М, а белка Б16 — при рН 2 — 8 и концентрации мочевины до 2 М.

2. С помощью компьютерного анализа установлено, что в генах рибосомных белков 813 и 816 первый интрон наиболее консервативен по сравнению с другими интронами этих генов, что указывает на его регуляторную роль.

3. Показано, что рибосомные белки 813 и 816 способны специфично связываться с фрагментами кодирующих их пре-мРНК, содержащими первый интрон, и ингибировать сплайсинг этих фрагментов в ядерном экстракте клеток НеЬа по принципу «обратной связи».

4. Определены нуклеотидные остатки фрагмента пре-мРНК рибосомного белка 813, изменяющие свою доступность РНКазам Т1, Т2 и VI в присутствии данного белка. Установлено, что большинство из этих остатков расположено вблизи 5'- и З'-сайтов сплайсинга первого интрона. Показано, что мутации в районах, содержащих эти остатки, уменьшают ингибирующий эффект рибосомного белка 813 на сплайсинг фрагмента его пре-мРНК, содержащего первый интрон.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа является важным этапом исследования, направленного на изучение регуляции экспрессии генов рибосомных белков человека на уровне сплайсинга. Предположение о роли первых интронов в авторегуляции сплайсинга их пре-мРНК, сделанное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов рибосомных белков S13 и S16 человека и других млекопитающих, нашло подтверждение в опытах in vitro, где показано, что эти белки, специфично связываясь с фрагментами своих пре-мРНК, содержащими первый интрон, ингибируют их сплайсинг в ядерном экстракте клеток HeLa. Результаты экспериментов по определению структурных элементов фрагмента пре-мРНК rpS13, принимающих участие в связывании с rpS13, показали, что этот белок связывается с кодирующей его пре-мРНК в районе сайтов сплайсинга первого интрона, причем специфичность этого взаимодействия определяет как первичная, так и вторичная структура участка связывания.

Анализ литературных источников, представленный в Главе 1, показал, что участки связывания эукариотических рибосомных белков на кодирующих их пре-мРНК, как правило, имеют общие структурные черты с участками связывания этих белков на рРНК и мРНК. Сравнение участка связывания rpS13 в области 5'-сайта сплайсинга первого интрона действительно выявило сходство его структуры со структурой участка связывания его прокариотического гомолога — rpS 15 Т. thermophilus на 16S рРНК. Сродство рибосомных белков к кодирующим их мРНК значительно ниже, чем к пре-мРНК. Вероятно, появление у эукариот экзон-интронного строения генов позволило клетке перенести регуляцию экспрессии генов многих рибосомных белков с уровня трансляции (как это происходит у прокариот) на уровень сплайсинга, используя для этого некодируюгцие последовательности в пре-мРНК — интроны, и тем самым выйти на новый, более высокий уровень регуляции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Парахневич, Наталья Михайловна, Новосибирск

1. Ferreira-Cerca S., Poell G., Gleizes P.-E., Tschochner H., Milkereit P. Roles of eukaryotic ribosomal proteins in maturation and transport of pre-18S rRNA and ribosome function // Mol. Cell. 2005. V. 20. P. 263-275.

2. Wool I.G., Chan Y.-L., GluecfcA. Mammalian ribosomes: the structure and the evolution of the proteins // Translational control / Eds. Hershey J.W.B., Mathews M.B., Sonenberg N. New-York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1996. P. 685-732.

3. Campagnoli M.F., Ramenghi U., Armiraglio M., Quarello P., Garelli E., Carando A., Avondo F., Pavesi E., Fribourg S., Gleizes P.E., Loreni F., Dianzani I. RPS19 mutations in patients with Diamond-Blackfan anemia // Hum. Mutat. 2008. V. 29. P. 911-920.

4. Lindstrom M.S., Zhang Y. Ribosomal protein S9 is a novel B23/NPM binding protein required for normal cell proliferation // J Biol Chem. 2008. V. 283. P. 15568-15576.

5. Zhao Y., Sohn J.H., Warner J.R. Autoregulation in the biosynthesis of ribosomes // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 699-707.

6. Perry R.P. Balanced production of ribosomal proteins // Gene. 2007. V.401. P. 1-3.

7. Wyrwicz L.S., Gaj P., Hoffmann M., Rychlewski L., Ostrowski J. A common cis-element in promoters of protein synthesis and cell cycle genes // Acta Biochim. Pol. 2007. V. 54. P. 89-98.

8. Zhao Y., Mcintosh K.B., Rudra D., Schawalder S., Shore D., Warner J.R. Fine-structure analysis of ribosomal protein gene transcription // Mol. Cell Biol. 2006. V. 26. P. 48534862.

9. Hamilton T.L., Stoneley M., Spriggs K.A., Bushell M. TOPs and their regulation // Biochem. Soc. Trans. 2006. V. 34. P. 12-26.

10. Иванов A.B., Малыгин A.A., Карпова Г.Г. Рибосомные белки эукариот: взаимодействие с собственными пре-мРНК и участие в регуляции их сплайсинга // Молекуляр. биология. 2006. Т. 40. С. 640-649.

11. Иванов А.В., Малыгин А.А., Карпова Г.Г. Рибосомные белки, связывающиеся с первым интроном пре-мРНК рибосомного белка S26 человека, стимулируют взаимодействие белков экстракта клеток HeLa с этим интроном // Молекуляр. биология. 2002. Т. 36. С. 503-510.

12. Иванов А.В., Малыгин А.А., Карпова Г.Г. Взаимодействие рибосомного белка S26 человека с фрагментами мРНК и пре-мРНК этого белка в ядерном экстракте клеток HeLa//Молекуляр. биология. 2003. Т. 37. С. 900-905.

13. Shi Y., Zhai К, WangX., Han Z„ Liu С., Lan M„ Du J., Guo C., Zhang Y. Wu K, Fan D. Ribosomal proteins S13 and L23 promote multidrug resistance in gastric cancer cells by suppressing druginduced apoptosis // Exp. Cell Res. 2004. V. 296. P. 337-346.

14. Moore M.J., Query C.C., Sharp P. A. Splicing of precursors to messenger RNAs by the spliceosome // The RNA world / Eds. Gesteland R.F. Atkins J.F. New-York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1993. P. 303-358.

15. Rio D.C. Splicing of pre-mRNA: Mechanism, regulation and role in development // Cuir. Opin. Genet. Dev. 1993. V. 3. P. 574-584.

16. Sharp P.A. Split genes and RNA splicing // Cell. 1994. V. 77. P. 805-815.

17. Jurica M.S., Moore M.J. Pre-mRNA splicing: awash in sea of proteins // Mol. Cell. 2003. V. 12. P. 5-14.

18. Graveley B.R. Sorting out the complexity of SR protein functions // RNA. .2000. V. 6. P. 1197-1211.

19. Manley J.R., Tacke R. SR proteins and splicing control //Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1569-1579.

20. Wang Z., Hoffman H.M., Grabowski P.J. Intrinsic U2AF binding is modulated by exon enhancer signals in parallel with changes in splicing activity // RNA. 1995. V. 1. P. 2135.

21. Zahler A.M., Neugenbauer K.M., Lane W.S., Roth M.B. Distinct functions of SR proteins in alternative premRNA splicing // Science. 1993. V. 260. P. 219-222.

22. Caceres J.F., Screaton G.R., Krainer A.R. A specific subset of SR proteins shuttles continuously between the nucleus and the cytoplasm // Genes Dev. 1998. V.12. P. 5566.

23. Wu I.Y., Maniatis T. Specific interactions between proteins implicated in splice site selection and regulated alternative splicing // Cell. 1993. V. 75. P. 1061-1070.

24. KohtzJ.D., Jamison S.F., Will C.L., Zuo P., Liihrmann R., Garcia-Blanco M.A., Manley J.L. Protein-protein interactions and 5'-splice site recognition in mammalian mRNA precursors//Nature. 1994. V. 368. P. 119-124.

25. Prasad J., Colwill K, Pawson T., Manley J.L. The protein kinase Clk/Sty directly modulates SR protein activity: Both hyper- and hypophosphorylation inhibit splicing // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P. 6991-7000.

26. Misteli T., Caceres J.F., Clement J.Q., Krainer A.R., Wilkinson M.F., Spector D.L. Serine phosphorylation of SR proteins is required for their recruitment to sites of transcription in vivo // J. Cell. Biol. 1998. V. 143. P. 297-307.

27. Jumaa H., Nielsen P.J. The splicing factor SRp20 modifies splicing of its own mRNA and ASF/SF2 antagonizes this regulation // EMBO J. 1997. V. 16. P. 5077-5085.

28. Jumaa H., Guenet J.L., Nielsen P.J. Regulated expression and RNA-processing of transcripts from the Srp20 splicing factor gene during the cell cycle // Mol. Cell. Biol. 1997 V. 17. P. 3116-3124.

29. Jumaa H., Nielsen P.J. Regulation of SRp20 exon 4 splicing // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1494. P. 137-143.

30. Kumar S., Lopez A. J. Negative feedback regulation among SR splicing factors encoded by Rbpl and Rbpl-like in Drosophila// EMBO J. 2005 V. 24. P. 2646-2655.

31. Sureau A., Perbal B. Several mRNAs with variable 3' untranslated regions and different stability encode the human PR264/SC35 splicing factor // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 932-936.

32. SureauA., Gattoni R., Dooghe Y, Stevenin J., SoretJ. SC35 autoregulates its expression by promoting splicing events that destabilize its mRNAs // EMBO J. 2001. V. 20. P. 1785-1796.

33. Popielarz M., Cavaloc Y., Mattei M.G., Gattoni R., Stevenin J. The gene encoding human splicing factor 9G8. Structure, chromosomal localization, and expression of alternatively processed transcripts // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 17830-17835.

34. Lejeune R, Cavaloc Y., Stevenin J. Alternative Splicing of Intron 3 of the Serine/Arginine-rich Protein 9G8 Gene // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 7850-7858.

35. Baker B.S. Sex in flies: the splice of life // Nature. 1989. V. 340. P. 521-524.

36. Nagoshi R.N., Baker B.S. Regulation of sex-specific RNA splicing at the Drosophila doublesex gene: cis-acting mutations in exon sequences alter sex-specific RNA splicing patterns // Genes Dev. 1990. V. 4. P. 89-97.

37. Chandler D., McGuffin M.E., Piskur J., Yao J., Baker B.S Mattox W. Evolutionary conservation of regulatory strategies for the sex determination factor transformer-2 // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 2908-2919.

38. Mattox W., Baker B.S. Autoregulation of the splicing of transcripts from the transformer-2 gene of Drosophila // Genes Dev. 1991. V. 5. P. 786-796.

39. Amrein H., Maniatis T., Nothiger R. Alternatively spliced transcripts of the sex-determining gene tra-2 of Drosophila encode functional proteins of different size // EMBO J. 1990. V. 9. P. 3619-3629.

40. Mattox W., McGuffin M.E., Baker B.S. A negative feedback mechanism revealed by functional analysis of the alternative isoforms of the Drosophila splicing regulator Transformer-2//Genetics. 1996. V. 143. P. 303-314.

41. McGuffin M.E., Chandler D„ Somaiya D., Dauwalder B., Mattox W. Autoregulation of transformer-2 alternative splicing is necessary for normal male fertility in Drosophila // Genetics. 1998. V. 149. P. 1477-1486.

42. Chandler D.S., McGuffin M.E, Mattox W. Functionally antagonistic sequences are required for normal autoregulation of Drosophila tra-2 pre-mRNA splicing // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 3012-3019.

43. Chandler D.S., Qi J., Mattox W. Direct Repression of Splicing by transformer-2 // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 5174-5185.

44. Qi J., Su S., Mattox W. The doublesex splicing enhancer components Tra2 and Rbpl also repress splicing through an intronic silencer // Mol. Cell. Biol. 2007. V. 27. P. 699708.

45. Lynch K.W., Maniatis T. Synergistic interactions between two distinct elements of a regulated splicing enhancer // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 284-293.

46. Lynch K.W., Maniatis T. Assembly Of specific SR protein complexes on distinct regulatory elements of the Drosophila Doublesex splicing enhancer // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 2089-2101.

47. Beil B., Screaton G., Stamm S. Molecular cloning of htra2-beta-l and htra2-beta-2, two human homologs of tra-2 generated by alternative splicing // DNA Cell. Biol. 1997. V. 16. P. 679-690.

48. Cowper A.E., Caceres J.F., Mayeda A., Screaton G.R. Serine-arginine (SR) protein-like factors that antagonize authentic SR proteins and regulate alternative splicing // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 48908-48914.

49. Stoilov P., Daoud R., Nayler O., Stamm S. Human tra2-betal autoregulates its protein concentration by influencing alternative splicing of its pre-mRNA // Hum. Mol. Genet. 2004. V. 13. P. 509-524.

50. Lopato S., Kalyna M., Dorner S., Kobayashi R., Krainer A.R., Barta A. atSRp30, one of two SF2/ASF-like proteins from Arabidopsis thaliana, regulates splicing of specific plant genes//Genes Dev. 1999. V. 13. P. 987-1001.

51. Kalyna M., Lopato S., Barta A. Ectopic expression of atRSZ33 reveals its function in splicing and causes pleiotropic changes in development // Mol. Biol. Cell. 2003. V. 14. P. 3565-3577.

52. Isshiki M., Tsumoto A., Shimamoto K The Serine/Arginine-Rich Protein Family in Rice Plays Important Roles in Constitutive and Alternative Splicing of Pre-mRNA // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 146-158.

53. Michelotti E.F., Michelotti G.A., Aronsohn A.I., Levens D. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K is a transcription factor // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 23502360.

54. Ostareck D.H., Ostareck-Lederer A., Wilm M., Thiele B.J., Mann M., Hentze M.W. mRNA silencing in erythroid differentiation: hnRNP K and hnRNP El regulate 15-lipoxygenase translation from the 3' end // Cell. 1997. V. 89. P. 597-606.

55. Valcarcel J., Gebauer F. Post-transcriptional regulation:the dawn of PTB // Curr. Biol. 1997. V. 7. P. 705-708.

56. Wagner E.J., Garcia-Blanco M.A. Polypyrimidine tract binding protein antagonizes exon definition // Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P. 3281-3288.

57. Shen J., Zu K, Cass C.L., Beyer A.L., Hirsh J. Exon skipping by overexpression of a Drosophila heterogeneous nuclear ribonucleoprotein in vivo// Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1995. V. 92. P. 1822-1825.

58. Zu K, Sikes M.L., Haynes S.R., Beyer A.L. Altered levels of the Drosophila HRB87F/hrp36 hnRNP protein have limited effects on alternative splicing in vivo // Mol. Biol. Cell. 1996. V. 7. P. 1059-1073.

59. Siebel C.W., Fresco L.D., Rio D.C. The mechanism of somatic inhibition of Drosophila P-element pre-mRNA splicing: multiprotein complexes at an exon pseudo-5' splice site control U1 snRNP binding // Genes Dev. 1992. V. 6. P. 1386-1401.

60. Siebel C.W., Kanaar R., Rio D.C. Regulation of tissue-specific P-element pre-mRNA splicing requires the RNA-binding protein PSI// Genes Dev. 1994. V. 8. P. 1713-1725.

61. Spelltnan R., Rideau A., Matlin A., Gooding C., Robinson F., McGlincy N., Grellscheid S.N., Southby J., Wollerton M., Smith C. Regulation of alternative splicing by PTB and associated factors // Biochem. Soc. T. 2005. V. 33. P. 457-460.

62. Burd C.G., Dreyfuss G. RNA binding specificity of hnRNP Al: significance of hnRNP Al high-affinity binding sites in pre-mRNA splicing // EMBO J. 1994. V.13. P. 11971204.

63. Oh Y.L., Hahm B„ Kim Y.K., Lee H.K, Lee J.W., Song 0., Tsukiyama Kohara K„ Kohara M., Nomoto A., Jang S.K. Determination of functional domains in polypyrimidine-tract-binding protein // Biochem. J. 1998. V. 331. P. 169-175.

64. Ghetti A., Pinol Roma S„ Michael W.M., Morandi C., Dreyfuss G. hnRNP I, the polypyrimidine tract-binding protein: distinct nuclear localization and association with hnRNAs // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 3671-3678.

65. Patton J.G., Mayer S.A., Tempst P., Nadal Ginard B. Characterization and molecular cloning of polypyrimidine tract- binding protein: a component of a complex necessary for pre-mRNA splicing // Genes Dev. 1991. V. 5. P. 1237-1251.

66. Perez I, McAfee J.G., Patton J.G. Multiple RRMs contribute to RNA binding specificity and affinity for polypyrimidine tract binding protein // Biochemistry. 1997. V.36. P. 11881-11890.

67. Perez I., Lin C.-H., McAfee J.G., Patton J.G. Mutation of PTB binding sites causes misregulation of alternative 3' splice site selection in vivo // RNA. 1997. V. 3. P. 764778.

68. Wollerton M., Gooding C., Robinson F., Brown E., Jackson R, Smith C. Differential alternative splicing activity of isoforms of polypyrimidine tract binding protein // RNA. 2001. V. 7. P. 819-832.

69. Wollerton M.C., Gooding C., Wagner E.J., Garcia-Blanco M.A., Smith C. Autoregulation of Polypyrimidine Tract Binding Protein by Alternative Splicing Leading to Nonsense-Mediated Decay // Mol. Cell. 2004. V. 13. P. 91-100.

70. Mayeda A., Krainer A. R. Regulation of alternative pre-mRNA splicing by hnRNP A1 and splicing factor SF2 // Cell. 1992. V. 68. P. 365-375.

71. Mayeda A., Helfman D. M., Krainer A. R. Modulation of exon skipping and inclusion by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 and pre-mRNA splicing factor SF2/ASF // Mol. Cell. Biol. 1993. V. 13. P. 2993-3001.

72. Mayeda A., Munroe S. M., Caceres J. F„ Krainer A. R. Function of conserved domains of hnRNP A1 and other hnRNP A/B proteins // EMBO J. 1994. V. 13. P. 5483-5495.

73. Chabot B., Blanchette M., Lapierre I., La Branche H. An intron element modulating 5' splice site selection in the hnRNP A1 pre-mRNA interacts with hnRNP A1 // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 1776-1786.

74. Eperon I.C., Ireland D.C., Smith R.A., Mayeda A., Krainer A.R. Pathways for selection of 59 splice sites by U1 snRNPs and SF2/ASF // EMBO J. 1993. V. 12. P. 3607-3617.

75. Kiesler E., Hase M.E., Brodin D., Visa N. Hrp59, an hnRNP M protein in Chironomus and Drosophila, binds to exonic splicing enhancers and is required for expression of a subset of mRNAs // J. Cell. Biol. 2005. V. 168. P. 1013-1025.

76. Datar K. V, Dreyfuss G., Swanson M.S. The human hnRNP M proteins: identification of a methionine/arginine-rich repeat motif in ribonucleoproteins // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 439-446.

77. Kafasla P., Patrinou-Georgoula M., Guialis A. The 72/74-kDa polypeptides of the 70110 S large heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex (LH-nRNP) represent a discrete subset of the hnRNP M protein family // Biochem. J. 2000. V. 350. P. 495-503.

78. Blencowe B.J. Exonic splicing enhancers: mechanism of action, diversity and role in human genetic diseases // Trends Biochem. Sci. 2000. V. 25. P. 106-110.

79. Kiesler E, Hase M.E., Brodin D., Visa N. Hrp59, an hnRNP M protein in Chironomus and Drosophila, binds to exonic splicing enhancers and is required for expression of a subset of mRNAs // J. Cell. Biol. 2005. V. 168. P. 1013-1025.

80. Strafier K, Hurt E. Yralp, a conserved nuclear RNAbinding protein, interacts directly with Mex67p and is required for mRNA export // EMBO J. 2000. V. 19. P. 410-420.

81. Lei E.P., Krebber H., Silver P.A. Messenger RNAs are recruited for nuclear export during transcription // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 1771-1782.

82. Lei E.P. Silver P.A. Intron status and 39-end formation control cotranscriptional export of mRNA // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 2761-2766.

83. Kim M., Ahn S.H., Krogan N.J., Greenblatt J.F., Buratowski, S. Transitions in RNA polymerase II elongation complexes at the 39 ends of genes // EMBO J. 2004. V. 23. P. 354-364.

84. Abruzzi K.C., Lacadie S., Rosbash M. Biochemical analysis of TREX complex recruitment to intronless and intron-containing yeast genes // EMBO J. 2004. V. 23. P. 2620-2631.

85. Rodríguez-Navarro S., Stráfier K., Hurt E. An intron in the YRA1 gene is required to control Yral protein expression and mRNA export in yeast // EMBO Rep. 2002. V. 3. P. 438-442.

86. Preker P.J., Kim K.S., Guthrie C. Expression of the essential mRNA export factor Yralp is autoregulated by a splicing-dependent mechanism // RNA. 2002. V. 8. P. 969980.

87. Preker P. J., Guthrie C. Autoregulation of the mRNA export factor Yralp requires inefficient splicing of its pre-mRNA // RNA. 2006. V. 12. P. 994-1006.

88. Spingola M, Ares Jr.M. A yeast intronic splicing enhancer and Nam8p are required for Merlp-activated splicing // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 329-338.

89. Libri D., Stutz F., McCarthy T., Rosbash M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNAbased enhancer // RNA. 1995. V. 1. P. 425-436.

90. Newman A. Specific accessory sequences in Saccharomyces cerevisiae introns control assembly of pre-mRNAs into spliceosomes // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3833-3839.

91. Buckanovich R.J., Yang Y.Y., Darnell R.B. The onconeural antigen Nova-1 is a neuron-specific RNA-binding protein, the activity of which is inhibited by paraneoplastic antibodies // J. Neurosci. 1996. V. 16. P. 1114-1122.

92. Yang Y.Y., Yin G.L., Darnell R.B. The neuronal RNA-binding protein Nova-2 is implicated as the autoantigen targeted in POMA patients with dementia // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 13254-13259.

93. Buckanovich R.J., Darnell R.B. The neuronal RNA binding protein Nova-1 recognizes specific RNA targets in vitro and in vivo // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 3194-3201.

94. Dredge K.B., Stefani G., Engelhard C.C., Darnell R.B. Nova autoregulation reveals dual functions in neuronal splicing // EMBO J. 2005. V. 24. P. 1608-1620.

95. Dredge B.K., Darnell R.B. Nova regulates GABA(A) receptor gamma2 alternative splicing via a distal downstream UCAU-rich intronic splicing enhancer // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 4687-4700.

96. Chou T.B., Zachar Z, Bingham P.M. Developmental expression of a regulatory gene is programmed at the level of splicing // EMBO J. 1987. V. 6. P. 4095-4104.

97. Denhez F., Lafyatis R. Conservation of regulated alternative splicing and identification of functional domains in vertebrate homologs to the Drosophila splicing regulator, suppressor-of-white-apricot//J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 16170-16179.

98. Zachar Z., Tze-Bin G, and Bingham P.M. Evidence that a regulatory gene autoregulates splicing of its transcript // EMBO J. 1987. V. 6. P. 4105-4111.

99. Zachar Z., Chou T.B., Kramer J., Mims I.P., Bingham P.M. Analysis of Autoregulation at the Level of Pre-mRNA Splicing of the suppressor-of-white-apricot Gene in Drosophila// Genetics. 1994. V. 137. P. 139-150.

100. Sarhissian M., WinneA., Lafyatis R. The Mammalian Homolog of Suppressor-of-white-apricot Regulates Alternative mRNA Splicing of CD45 Exon 4 and Fibronectin IIICS // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 31106-31114.

101. Tian Q., Taupin J., Elledge S., Robertson M., Anderson P. Fas-activated serine/threonine kinase (FAST) phosphorylates TIA-1 during Fas-mediated apoptosis // J. Exp. Med. 1995. V. 182. P. 865-874.

102. Taupin J. L., Tian Q., Kedersha N., Robertson M., Anderson P. The RNA-binding protein TIAR is translocated from the nucleus to the cytoplasm during Fas-mediated apoptotic cell death // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. V. 92. P. 1629-1633.

103. Gueydan C., Droogmans L., Chalon P., Huez G., Caput D., Kruys V. Identification of TIAR as a protein binding to the translational regulatory AU-rich element of tumor necrosis factor alpha mRNA // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 2322-2326.

104. Piecyk M., Wax S., Beck A.R., Kedersha N., Gupta M., Maritim B., Chen S., Gueydan C., Kruys V., Streuli M., Anderson P. TIA-1 is a translational silencer that selectively regulates the expression of TNF-alpha // EMBO J. 2000. V. 19. P. 4154-4163.

105. Kedersha N. Cho M.R., Li W., Yacono P.W., Chen S., Gilks N., Golan D.E., Anderson P. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules // J. Cell Biol. 2000. V. 151. P. 1257-1268.

106. Kedersha N„ Gupta M., Li W., Miller /., Anderson P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules //J. Cell. Biol. 1999. V. 147. P. 1431-1442.

107. Forch P., Puig O., Kedersha N. Martinez C., Granneman S., Seraphin B., Anderson P., Valcarcel J. The apoptosis-promoting factor TIA-1 is a regulator of alternative pre-mRNA splicing // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 1089-1098.

108. Bandziulis R.J., Swanson M.S., Dreyfuss G. RNA-binding proteins as developmental regulators // Genes and Dev. 1989. V. 3. P. 431-437.

109. Bell L.R., Maine E.M., Schedl P., Cline T.W. Sexlethal, a Drosophila sex determination switch gene, exhibits sex-specific RNA splicing and sequence similarity to RNA binding proteins // Cell. 1988. V. 55. P. 1037-1046.

110. Sosnowski B.A., Belote J.M. McKeown M. Sex-specific alternative splicing of RNA from he transformer gene results from sequence-dependent splice site blockage // Cell.1989. V. 3.P. 449-459.

111. Inoue K, Hoshijima K, Sakamoto H. Shimura Y. Binding of the Drosophila Sex-lethal gene product to the alternative splice site of transformer primary transcript // Nature.1990. V. 344. P. 461-463.

112. Sakamoto H., Inoue K, Higuchi I., Ono Y., Shimura Y. Control of Drosophila Sex-lethal pre-mRNA splicing by its own female-specific product // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5533-5540.

113. Wang J., Bell L.R. The Sex-lethal amino terminus mediates cooperative interactions in RNA binding and is essential for splicind regulation // Genes Dev. 1994. V. 8. P. 20722085.

114. Deshpande G., Samuels M.E., Schedl P.D. Sex-lethal interacts with splicing factors injvitro and in vivo // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 5036-5047.

115. Lallena M.J., Chalmers K.J., Llamazares S., Lamond A.I., Valcarcel J. Splicing regulation at the second catalytic step' by SEXLETHAL involves 3' splice site recognition by SPF45 // Cell. 2002. V. 109. P. 285-296.

116. Penalva L.O., Lallena M.J., Valcarcel J. Switch in 3' splice site recognition between exon definition and splicing catalysis is important for Sex-lethal autoregulation // Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P. 1986-1996.

117. Nagengast A.A., Stitzinger S.M., Tseng C.H., Mount S.M., Salz H.K. Sex-lethal splicing autoregulation in vivo: interactions between SEX-LETHAL, the U1 snRNP and U2AF underlie male exon skipping // Development. 2003. V. 130. P. 463-471.

118. Mager W.H., Planta R.J., Ballesta J.-P.G., Lee J.C., Mizuta K., Suzuki K„ Warner J.R., Woolford J. A new nomenclature for the cytoplasmic ribosomal proteins of Saccharomyces cerevisiae // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4872-4875.

119. Dabeva M.D., Post-Beittenmiller M.A., Warner J.R. Autogenous regulation of splicing of the transcript of a yeast ribosomal protein gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986. V. 83. P. 5854-5857.

120. EngF.J., Warner J.R. Structural basis for the regulation of splicing of a yeast messenger RNA // Cell. 1991. V. 65. P. 797-804.

121. Woolford J.L. Nuclear pre-mRNA splicing in yeast // Yeast. 1989. V. 5. P. 439-457.

122. Dabeva M.D., Warner J.R. Ribosomal protein L32 of Saccharomyces cerevisiae regulates both splicing and translation of its own transcript // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 19669-19674.

123. Vilardell J., Warner JR. Regulation of splicing at an intermediate step in the formation of the spliceosome // Genes Dev. 1994. V. 8. P. 211-220.

124. Li H., Dalai S., Kohler J„ Vilardell J., White S.A. Characterization of the pre-mRNA binding site for yeast ribosomal protein L32: the importance of a purine-rich internal loop // J. Mol. Biol. 1995. V. 250. P. 447-459.

125. White S.A., Li H. Yeast ribosomal protein L32 recognizes an RNA G*U juxtaposition // RNA. 1996. V. 2. P. 226-234.

126. Li B., Vilardell J., Warner J.R. An RNA structure involved in feedback regulation of splicing and of translation is critical for biological fitness // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. P. 1596-1600.

127. Li H., While S.A. RNA apatamers for yeast ribosomal protein L32 have a conserved purine-rich internal loop // RNA. 1997. V. 3. P. 245-254.

128. Vilardell J., Warner J.R. Ribosomal protein L32 of Saccharomyces cerevisiae influences both the splicing of its own transcript and the processing of rRNA // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 1959-1965.

129. Mao H., Williamson JR. Local folding coupled to RNA binding in the yeast ribosomal protein L30 // J. Mol. Biol. 1999. V. 292. P. 345-359.

130. Mao H., Williamson JR. Assignment of the L30-mRNA complex using selective isotopic labeling and RNA mutants // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4059-4070.

131. Mao H., While S.A., Williamson J.R. A novel loop-loop recognition motif in the yeast ribosomal protein L30 autoregulatory RNA complex // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 1139-1147.

132. Chao J.A., Prasad G.S., White S.A., Stout C.D., Williamson JR. Inherent protein structural flexibility at the RNA-binding interface of L30e // J. Mol. Biol. 2003. V. 326. P. 999-1004.

133. Chao J.A., Williamson J.R. Joint X-ray and NMR refinement of the yeast L30e-mRNA complex // Structure. 2004. V. 12. P. 1165-1176.

134. Vilardell J, Yu S.J., Warner J.R. Multiple functions of an evolutionarily conserved RNA binding domain // Mol. Cell. 2000. V. 5. P. 761-766.

135. Halic M, Becker T., Frank J., Spahn C.M., Beckmann R. Localization and dynamic behavior of ribosomal protein L30e //Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. V. 12. P. 467-468.

136. Vilardell J., Chartrand P., Singer R.H., Warner J.R. The odyssey of a regulated transcript //RNA. 2000. V. 6. P. 1773-1780.

137. Nomura M. Regulation of ribosome biosynthesis in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae: diversity and common principles // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 6857-6864.

138. Li Z, Paulovich A.G., Woolford J.L. Feedback inhibition of the yeast ribosomal protein gene CRY2 is mediated by the nucleotide sequence and secondary structure of CRY2 pre-mRNA // Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 6454-6464.

139. Fewell S.W. Woolford J.L. Ribosomal protein S14 of Saccharomyces cerevisiae regulates its expression by binding to RPS14B pre-mRNA and to 18S rRNA // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P. 826-834.

140. Antunez de Mayolo P., Woolford J.L. Interactions of yeast ribosomal protein rpS14 with RNA // J. Mol. Biol. V. 333. P. 697-709.

141. Pierandrei-Amaldi P., Amaldi F., Bozzoni I., Fragapane P. Regulation of ribosomal protein genes during Xenopus development // Molecular approaches to developmental biology / Eds. Firtel R.A., Davidson E.H. New York: Alan R. Liss, Inc. 1987. P. 267278.

142. Caffarelli E., Fragapane P., Gehring I., Bozzoni I. The accumulation of mature RNA for the Xenopus laevis ribosomal protein LI is controlled at the level of splicing and turnover of the precursor RNA // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3493-3498.

143. Gultyaev A.P., Shestopalov B.V. Structural basis for autogenous regulation of Xenopus laevis ribosomal protein LI synthesis at the splicing level // FEBS Lett. 1988. V. 232. P. 9-11.

144. Fragapane P., Prislei S., Michienzi A., Caffarelli E., Bozzoni I. A novel small nucleolar RNA (U16) is encoded inside a ribosomal protein intron and originates by processing of the pre-mRNA // EMBO J. 1993. V. 12. P. 2921-2928.

145. Caffarelli E., Arese M., Santoro B., Fragapane P., Bozzoni I. In vitro study of processing of the intron-encoded U16 small nucleolar RNA in Xenopus laevis // Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 2966-2974.

146. Presutti С., Ciafre S.A., Bozzoni I. The ribosomal protein L2 in S. cerevisiae controls the level of accumulation of its own mRNA // EMBO J. 1991. V. 10. P. 2215-2221.

147. Presutti C., Villa Т., Hall D., Pertica C., Bozzoni I. Identification of the cis-elements mediating the autogenous control of ribosomal protein L2 mRNA stability in yeast // EMBO J. 1995. V. 14. P. 4022-4030.

148. Mitrovich Q.M., Anderson P. Unproductively spliced ribosomal protein mRNAs are natural targets of mRNA surveillance in C. elegans II Genes Dev. 2000. V. 14. P. 21732184.

149. Cuccurese M., Russo G., Russo A., Pietropaolo C. Alternative splicing and nonsensemediated mRNA decay regulate mammalian ribosomal gene expression // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 5965-5977.

150. Иванов А.В., Малыгин А.А., Карпова Г.Г. Рибосомный белок S26 человека ингибирует сплайсинг собственной пре-мРНК // Молекуляр. биология. 2004. Т. 38. С. 676-683.

151. Ivanov А. V., Malygin A.A., Karpova G.G. Human ribosomal protein S26 suppresses the splicing of its pre-mRNA // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1727. P. 134-140.

152. Бабкина Г.Т., Владимиров С.H., Грайфер Д.М., Матасова Н.Б., Смоленская И.А., Карпова Г.Г. Выделение рибосом и субчастиц из плаценты человека и определение их функциональной активности // Изв. Сиб. Отд. АН СССР. 1989. Вып. 2. С. 92-98.

153. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 277. P. 680-685.

154. Madjar J.-J., Arpin M., Buisson M., Reboud J.-P. Spot position of rat liver ribosomal proteins by four different two-dimentional electrophoresis in polyacrylamide gel // Mol. Gen. Genet. 1979. V. 171. P. 121-134.

155. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. V. 162. P. 156-159.

156. Sambrook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

157. Кислых В.И., Рамазанов Ю.А., Майстренко В.Ф., Мертвецов Н.П. Вихревой биореактор «БИОК». I. Опыт культивирования штамма E.coli BL21 (DE3) pZZSA, продуцирующего рекомбинантный ангиогенин человека // Биотехнология. 2001. № 3. С. 72-79.

158. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.175. http://molbiout.narod.ru/extinction.htm, 25.08.2005.

159. Tsumoto K, Ejima D., Kumagai I., Arakawa T. Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies // Protein Expr. Purif. 2003. V. 28. P. 1-8.

160. Sreerama N., Venyaminov S.Y., Woody R.W. Estimation of the number of alpha-helical and beta-strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy // Protein Science. 1999. V. 8. P. 370-380.

161. Малыгин А.А., Грайфер Д.М., Лалетина E.C., Шатский КН., Карпова Г.Г. Подход к выявлению функционально важных участков РНК, основанный на комплементарно-адресованной модификации // Молекуляр. биология. 2003. Т. 37. С. 1027-1034.

162. Clarke Р.А. RNA Footprinting and modification interference analysis // RNA-protein interaction protocols / Eds S.R. Haynes. Totowa, New Jersey: Humana Press, 1999. P. 73-91.

163. Wollenzien P. Isolation and identification of RNA cross-links // Methods Enzymol. 1988. V. 164. P. 319-329.

164. Brunei С., Romby P. Probing RNA structure and RNA-ligand complexes with chemical probes // Methods Enzymol. 2000. V. 318. P. 3-21.

165. Chan C.Y., Lawrence C.E., Ding Y. Structure clustering features on the Sfold Web server// Bioinformatics. 2005. V. 21. P. 3926-3928.

166. Gamier J., Gibrat J.-F., Robson B. GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence // Methods Enzymology. 1996. V. 266. P. 540-553.

167. Jones D.T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices //J. Mol. Biol. 1999. V. 292. P. 195-202.

168. Pollastri G., Przybylski D., Rost В., Baldi P. Improving the prediction of protein secondary structure in three and eight classes using recurrent neural networks and profiles // Proteins. 2002. V. 47. P. 228-235.

169. Ovcharenko I., Nobrega M.A., Loots G.G. Stubbs L. ECR Browser: a tool for visualizing and accessing data from comparisons of multiple vertebrate genomes // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 280-286.188. http://www.ebi.ac.uk/emboss/align, 25.01.2006.

170. Щелкунов C.H. Генетическая инженерия: Учебное пособие // Н.: Сибирское университетское издательство. 2004. 459 с.

171. Cabrita L.D., Dai W„ Bottomley S.P. A family of E. coli expression vectors for laboratory scale and high throughput soluble protein production // BMC Biotechnol. 2006. V. 6:12.

172. Carson M., Johnson D.H., McDonald H., Brouillette C., Delucas L.J. His-tag impact on structure //Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2007. V. 63. P. 295-301.

173. Malygin A. A., Shaulo D.D., Karpova G.G. Proteins S7, S10, SI 6 and S19 of the human 40S ribosomal subunit are most resistant to dissociation by salt // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1494. P. 213-216.

174. Malygin A.A., Baranovskaya O.I., Ivanov A.V., Karpova G.G. Expression and Purification of Human Ribosomal Proteins S3, S5, S10, S19, and S26 // Protein Express. Purif. 2003. V. 28. P. 57-62.

175. Chandramouli P., TopfM., Menetret J.F., Eswar N. Cannone J.J., Guteil R.R., Sali A., Akey C. W. Structure of the Mammalian 80S Ribosome at 8.7 A Resolution // Structure. 2008. V. 16. P. 535-548.

176. Portier C„ Dondon L., Grunberg-Manago M. Translational autocontrol of the Escherichia coli ribosomal protein S15 // J. Mol. Biol. 1990. V. 211. P. 407-414.

177. Robert F., Brakier-Gingras L. Ribosomal protein S7 from Escherichia coli uses the same determinants to bind 16S ribosomal RNA and its messenger RNA // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 677-682.

178. Stelzl U., Zengel J.M., Tovbina M., Walker M., Nierhaus K.H., Lindahl L., Patel D.J. RNA-structural mimicry in Escherichia coli ribosomal protein L4-dependent regulation of the S10 operon // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 28237-22845.

179. Serganov A., Polonskaia A., Ehresmann B., Ehresmann C., Patel D.J. Ribosomal protein S15 represses its own translation via adaptation of an rRNA-like fold within its mRNA // EMBO J. 2003. V. 22. P. 1898-908.

Информация о работе

Парахневич, Наталья Михайловна
кандидата химических наук
Новосибирск, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Рибосомные белки S13 и S16 человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы