Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев

Гамбарян, Александра Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев"

ГАМБАРЯН АЛЕКСАНДРА СЕРГЕЕВНА

Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев

03 00 06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой ШШ07 доктора биологических наук

003177317

ГАМЕАРЯН АЛЕКСАНДРА СЕРГЕЕВНА

Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев

03 00 06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им М П Чумакова

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор,

Альтштейн Анатолий Давидович

Доктор биологических наук, профессор,

Народицкий Борис Савельевич

Доктор биологических наук, с н с

Новиков Борис Валентинович

Ведущая организация.

ГУ Институт вирусологии им Д И Ивановского РАМН

Защита состоится 21 декабря 2007г в 10™ на заседании диссертационного совета Д 001 026 01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М П Чумакова РАМН (142782, Московская обл, Ленинский р-н, п/о Институт полиомиелита)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им М П Чумакова РАМН

Автореферат разослан ноября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук О А Медведкияа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Природным резервуаром вирусов гриппа (ВГ) являются дикие утки, у которых ВГ вызывают бессимптомную инфекцию в нижнем отделе кишечника Эпизодически вирусы уток могут инфицировать других хозяев и иногда дают начало новым эволюционным ветвям ВГ Важнейшим элементом адаптации вируса к новому хозяину является настройка на новые рецепторные детерминанты в новом хозяине и, возможно, на новых клетках мишенях Инфицирование вирусом гриппа начинается с прикрепления вириона к сиалосодержащим рецепторам на поверхности клетки Вирусы адаптированы к рецепторам на клетках мишенях своего хозяина, следовательно, вирусы разных хозяев могут иметь разную рецепторную специфичность

В работе была поставлена задача углубления существующих представлений о зависимости рецепторной специфичности вирусов гриппа от хозяйской принадлежности Для оценки потенциальной опасности вирусов гриппа птиц с точки зрения возможности их перехода к человеку сравнивались вирусы гриппа разных хозяев птиц, человека и домашних животных Актуальность проблемы

Проблемы, связанные со сменой хозяев вирусами гриппа в настоящее время особенно актуальны учитывая риск возникновения нового пандемического варианта из высокопатогенного птичьего вируса гриппа Во всем мире очень интенсивно ведется изучение птичьих вирусов гриппа и разработка вакцин против них Реальная угроза новой пандемии вывела проблему на государственный уровень

Во многих лабораториях проводятся испытания эффективности известных лекарственных препаратов Большую проблему составляет появление штаммов вируса, устойчивых к классическим антивирусным препаратам — ремантадину и амантадину Широко исследуется и применяется новые препараты,

действующие как ингибиторы нейраминидазы Однако появляются штаммы устойчивые и к этим препаратам Поэтому идет интенсивная разработка новых препаратов, в том числе - ингибиторов связывания вируса с клеткой

Параллельно ведутся фундаментальные исследования птичьих вирусов гриппа, для лучшего понимания механизма возникновения пандемических вариантов

Цели и задачи исследования

1) Выяснение детальной молекулярной структуры рецепторов вирусов гриппа.

2) Сравнение рецепторной специфичности вирусов гриппа разных хозяев, с целью выявления круга вирусов с наибольшим потенциалом перехода к людям

3) Изучение состава сиалосахаров — рецепторов вируса гриппа на клетках мишенях разных хозяев

Научная новизна

Впервые показано, что рецепторная специфичность вирусов гриппа разных птиц различна.

Для изучения различий в рецепторной специфичности мы использовали панель синтетических сиалогликополимеров на основе полиакриламида с терминальным Ыеи5Аса2-3/60а1 фрагментом, синтезированных нашими коллегами из лаборатории химии углеводов Института биоорганической химии Показали, что Н5№ вирусы кур, (включая выделенные от людей штаммы) обладают исключительно высоким сродством к Ыеи5 Аса2-3 ва1р 1 -4(6-Ш03)01сМАсР (б-Зи-З'БЬИ) группировке Связывание вирусов кур и млекопитающих с клетками трахеи зеленой мартышки ослабевает, после обработки последней глюкозамин-6-сульфатазой, что указывает на наличие 6-Би-З^ЬЫ групп на соответствующем субстрате Высказано предположение, что наличие таких группировок на клетках дыхательного эпителия человека способствует заражению людей Н5Ш вирусами

Показано, что один из человеческих изолятов Н5Ш вирусов, распознает человеческий рецептор Это лишний раз напоминает о риске возникновения пандемического варианта этих вирусов

Показано, что адаптация исходных вирусов гриппа самых разных эволюционных линий к курам приводит к изменению рецепторной специфичности вируса Вирусы перенацеливаются на рецепторы с лакгозаминовым кором (Таким же как у человеческого рецептора -6' сиалилактозамина) У Н5№, Н9Ы2 и Н7Ы7 вирусов повышено сродство к сульфатированному рецептору с лакгозаминовым кором Многие из этих вирусов приобретают также частичное сродство к человеческому рецептору

Впервые показано, что эволюция вирусов гриппа в свиньях идет в том же направлении с теми же самыми аминокислотными заменами, что и эволюция вирусов в людях Вирусы гриппа, лишь недавно перешедшие от птиц к свиньям (так называемые аутп-Ьке), адаптированы к таким же рецепторам, что и куриные вирусы Однако вирусы специализированной «свиной» линии - Н1Ш адаптированы строго к 6' сиалилактозамину, так же как и человеческие вирусы. Высказана гипотеза, что адаптация к 6' сиалилактозамину у вирусов гриппа свиней, также как и у человеческих вирусов, обеспечивает более эффективный механизм воздушно-капельной передачи вируса

Впервые в мире изучали способность вирусов гриппа разных хозяев связываться с клетками кишечного эпителия птиц, принадлежащих к отрядам Атеп/огтея (Утиные), Galliform.es (Куриные,), СкагаЛгп/огтех (Кулики и чайки), Сюопи/огтея (Листообразные), РоскареЖ/огтез (Поганкообразные) и Огш/огтех (Журавлеобразные). Состав сиалосодержащих рецепторов на этих же клетках изучали с помощью лектинов

Полученные результаты указывают на то, что состав природных сиалозидов у разных птиц различен Рецепторная специфичность ВГ разных хозяев отражает эти отличия Можно предположить, что вследствие этого ВГ разных птиц могут отличагься по способности преодолевать межвидовой барьер, и в частности, заражать млекопитающих и человека

Практическая значимость

В настоящее время для оценки опасности вирусов все чаще пользуются молекулярными маркерами Для таких оценок нужно точное знание о

зависимости какого-то свойства вируса от наличия той или другой аминокислоты в определенной позиции вирусного белка В частности, до начала наших исследований было обнаружено две (226 и 228) аминокислотных замены, ответственные за способность вируса гриппа вызвать пандемию среди людей Наши исследования выявили дополнительные замены, приводящие к такому же результату (190, 225 и 227)

Исследование рецепторной специфичности вирусов гриппа разных хозяев, в частности разных птиц, показало, что вирусы гриппа кур обладают резко повышенным, по сравнению с исходными утиными вирусами, потенциалом перехода к людям

Обнаружение полной аналогии эволюции вирусов гриппа в свиньях и в людях позволяет рассматривать грипп свиней как модельную систему для изучения человеческого гриппа

Апробация работы

Материалы работы были представлены на:

1. Пятом интернациональном симпозиуме по птичьему гриппу США, Джорджия, апрель 2002

2 Первой Европейской конференции по гриппу Мальта, Октябрь, 2002

3 12-ой международной конференции по вирусам с негативным геномом Италия, Пиза, июнь 2003.

4 Второй Европейской конференции по гриппу. Мальта, 11-14 сентября, 2005

5 Восьмом съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.

6 Девятом съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение рецепторной специфичности вирусов гриппа с помощью полимеров, несущих реценторные аналоги.

Изучение рецепторной специфичности вирусов гриппа (ВГ) до недавнего времени рассматривалось в основном в свете распознавания разных производных нейраминовой кислоты и типа связи между сиаловой кислотой и галактозой (Paulson, 1985, Suzuki, 1994, Connor et al, 1994, Naeve et al, 1984, Matrosovich et al ,1991, 1992, 1993, 1998, Tuzikov et al, 1997) Роль сахаридных звеньев, последующих за галактозой, была исследована только в одном случае -а именно для человеческих вирусов, распознающих 6'SLN лучше, чем 6'SL (Matrosovich et al, 1993, 1997, 2000, Gambaryan et al, 1995, 1997, 1999, Mochalova et al, 2003) Для сиалил2-Згалактозных рецепторов таких исследований вообще не проводилось

Изучение вирусов разных хозяев

Первоначальной целью исследования была детализация рецепторной специфичности вирусов гриппа разных хозяев Для этого мы исследовали связывание вирусов с 17 типами соединений с идентичной концевой Siaa2-3-сахаридной группировкой, но отличающихся строением последующих сахаридных звеньев, а так же с оптимальным «человеческим» рецептором 6'SLN Полимер, несущий асиаловый сульфосахарид 3'-0-Su-Galal-3G]cNAcf3 использовали как контрольный Сахаридная группировка всех тестированных соединений была присоединена к полиакриловому полимеру через одинаковый спейсер Структуры использованных Сахаров и их краткие обозначения приведены в таблице 1 Они отличаются типом связи (1-3 или 1-4) между галактозой и последующим звеном, типом третьего звена (глюкозар, глюкозаминр либо галактозамина), наличием или отсутствием фукозного заместителя, сульфогруппировки или второй сиаловой кислоты при третьем звене

Таблица 1 Структуры использованных в данной работе сиалосахаридов и их условные обозначения

Сахариды Усл. обозначение

Биотииилированные полимеры (1000 к!))

Иеи5 Аса2-3(3а1р 1 -401ф (ЫоО З'БЬ

№и5Ас<х2-б0а1Р1-401сР (ЬюО

Ыеи5Аса2-60а1р1-401сЫАс|3 (ЬюО 6 БЬЫ

Неи50са2-б0а([! 1 -401сКАсР (ЬюО б'ЗЬМССо)

Немеченные полимеры (30 Ы))

3'-0-8и-0а1р 1 -ЗвкКАсР-зр З'-Би-Ье0

Неи5Аса2-60а13 МвШАс 6 БЬИ

Кеи5Аса2-60а1р 1 -4-(6-8и)ОШАс Зи-б'БЬЫ

Кеи50са-8р Кеи50с

Кеи5Аса2-30а1 Р-яр вв

№и5Аса2-30аМАса-5р ЭТп

Кеа5Аса2-30а1р1-401сР-зр ЭЬ

Неи50са2-30а1р1-4С1сКАс 3 ВЬЩСе)

№и5Аса2-30а1р 1 -401сНАср 3 ЭЬИ

Неи5 Аса2-30а1р 1 -4-(6-Зи)01сЫАсР Эи-З^ЬЫ

(Ыеи5 Аса2-30а1р 1 -4)(Риса1-3)01сКАср БЬе*

(Ыеи5Аса2-30а1р1-4)(Риса1-3)(6-0-8и)01сЫАср Зи-ЭЬе*

Кеи5Аса2-ЗОаф1-ЗОШАсР БЬе0

Кеи5Аса2-ЗОа1р 1 -3-(6-8и)С(сКАср Эи-БЬе0

Кеи5Аса2-ЗОа1Р 1 -ЗОа1МАса БТР

Неи5Аса2-30а1 р 1 -3-(6-8и)ОаШАса-зр Ви-ЭТТ

(ЪГеи5Аса2-30а1р1-3)(Риса1-4)01сМАсР 8Ье"

Иеи5Аса2-30а1р1-3

ОаЖАса-зр З.б-ЭТР

Ыеи5Аса2-б

Иеи5Аса2-3

ОаЖАса-эр 3,6-8Тп

№и5Аса2-6

(Ыеи5Аса2-8)-зрЗ (вюЬ

Ганглиозиды

Оа1р 1 -ЗС)а1ЫАсР 1 -4 ОМ1а

ОаЩМас-сег

Ыеи5Аса2-3

№и5Аса2-30а1р 1-ЗОаШАсР 1-40а1р1-401с-ссг вМ1Ь

Меи5Аса2-ЗОа1р1 -ЗСаШАср1-4 вШа

Оа1р1-4®с-сег

№и5Аса2-3

Оа1р 1 -ЗваМАср 1 -4 в01Ь

0а1р1-401с-сег

№и5Аса2-8 №и5Аса2-3

№и5 Аса2-3 ва1 р 1 -3 ваМ Аср I -4 СТ1Ь

в^рЫвк-сег

Иеи5 Аса2-8 Ыси5Аса2-3 |

Все исследованные сахара, кроме БТп и 3,6-8Тп - природные соединения.

Контрольный асиаловый полимер, а так же полимеры, несущие группировки №и5Сса, 3,6-8Тп и (81а), пе связывались пи с какими из вирусов Сродство к З^ЬЫ- и З'ЭЬ-группировкам было, в пределах точности измерения, равным для всех испытанных вирусов

Проведенное исследование показало, что рецепторная специфичность разных вирусов гриппа птиц не совпадает Общность птичьих вирусов ограничивается только распознаванием 2-3 связи между сиаловой кислотой и последующей галактозой Разные вирусы нацелены на разные природные сиалосодержащие группировки Причем можно отметить как отличия, связанные с хозяйской принадлежностью вируса, так и особенности, присущие субтипам

Способность вирусов связывать гликолильную форму сиаловой кислоты изучали с помощью полимеров З'БЬЫ и 3'8ЬЫ(Ос) Все исследованные НЗ и Н7 вирусы связываются с З'ЗЬЫ(Ос) почти так же хорошо, как и с З^ЬМ Это свойство не коррелирует с хозяйской принадлежностью вирусов, так 3' 8ЬМ(Сс)-группировку хорошо связывают вирусы уток, свиней, лошади, кур и тюленя НЗ и Н7 субтипов В то же время вирусы других субтипов 3'81Л<Г(Ос) не связывали

Ни один из вирусов не связывался с р(81а)3, в котором сиаловая кислота присоединена не к галактозе, а к восьмому кислороду другой СК. Этот результат лишний раз доказывают, что минимальной рецепторной группировкой вирусов гриппа птиц является не просто сиаловая кислота, а сиалил2-3 галактоза

Роль третьего сахаридного звена в связывании рецептора с вирусом видна из сравнения сродства к Бв, З'БЬ.З'БЬК, БЬе0 и ЙТР Большинство вирусов примерно одинаково хорошо связывается с Бй, З'БЬ и 81Л\Г Это свидетельствует о том, что сахаридное кольцо, присоединенное к (3 галактозе 1-4 связью, направлено в раствор и не принимает активного участия в связывании В 8Ьес и БТР третье звено присоединено к галактозе 1-3 связью Сродство к

этим группировкам у всех вирусов близкое, следовательно, направление гидроксильного остатка при четвертом углероде третьего сахаридного звена не принципиально для связывания.

Сродство к БТБ у вирусов уток, как правило, выше чем к Б1ЛЯ, то есть эти вирусы адаптированы к 1-3 связи между вторым и третьим звеном сахаридной цепочки Вирусы цыплят, напротив, лучше связывают З'БЬЫ чем ЭТИ, то есть они адаптированы к 1-4 связи между галактозой и последующим звеном

У вирусов чаек соотношение сродства к З'БЬИ и БТР' зависит от субтипа У ВГ субтипа Н13 выше сродство к З'ЗЬЫ, а у Н4, Н6 и Н14 вирусов, которые недолго циркулировали в чайках, как и у близкородственных вирусов уток, выше сродство к йТТ

Заместители при третьем звене сахаридной цепочки влияют на связывание разных вирусов по разному, и могут как понижать, так и повышать сродство к рецептору

Фукозилирование третьего от конца глюкозамина резко понижает сродство рецептора к большинству утиных вирусов. В отличие от вирусов уток, у всех исследованных нами вирусов чаек, относящихся к пяти субтипам, сродство к фукозилированному 8Ье* не ниже, чем к исходному З'БЬМ Для специализированных к чайкам вирусов субтипа Н13 БЬе" является одной из оптимальных рецепторных группировок

Столь же резкие отличия, связанные с хозяйской принадлежностью вирусов, наблюдаются и в отношении к сульфатированным по шестому положению третьего звена рецепторам Для большинства тестированных нами утиных вирусов наличие этой группировки не сказывается на связывании Но для вирусов цыплят, свиней, вируса лошади и вируса тюленя сульфатирование повышает сродство к определенным типам рецепторов Так, резко повышено сродство к Би-З'БЬН у Н5 вирусов кур и у НЗ вируса лошади, а у всех свиных вирусов и у Н7 вирусов кур и тюленя резко повышено сродство к Би-БЬе*

Полученные результаты свидетельствуют, что, несмотря на то, что птичьи вирусы гриппа, как правило, распознают 81а2-ЗОа1, они могут отличаться по

способности распознавать последующие сахаридные звенья рецептора Из этого следует, что разные виды птиц могут отличаться по способности генерировать вирусы, потенциально опасные для человека

Рецеиторная специфичность вирусов гриппа чаек

До наших исследований вирусы гриппа уток и чаек характеризовались как единая группа, которую было принято называть вирусами диких водоплавающих птиц (wild aquatic birds) (Alexander, 2000, Webster and Bean, 1998) В 1997 году было показано, что Н13 вирусы чаек отличаются от вирусов уток других субтипов тем, что их сродство к З'сиалиллактозе не выше, чем сродство к свободной к а-нейраминовой кислоте (aNeu5Ac) Иными словами, если для утиных вирусов минимальной рецепторной детерминантой является Sia2-3Gal, то для Н13 вирусов вклад галактозы в связывание не существенен (Matrosovich et al., 1997) Для более детального сравнения вирусов чаек с типичными представителями вирусов уток мы определили сродство этих вирусов к aNeu5Ac, к З'сиалиллактозе, и к полимерным гликоконьюгатам, несущим группировки. 6'SLN, 3'SLN, SLex, SLea и SLec

Все исследованные вирусы гриппа чаек, так же как и вирусы уток, адаптированы к а2-3-связанной сиаловой кислоте Однако структура оптимального рецептора для вирусов уток и чаек различается Общим свойством всех тестированных вирусов чаек, с гемагглютининами Н4, Н5, Н6, Н13, Н14 и Н16 субтипов является высокое сродство к фукозилированным рецепторам

Для вирусов чаек 4, 5, 6 и 14 субтипа оптимальным рецептором является SLea, то есть у них сохраняется характерное для утиных вирусов предпочтение рецепторов, основанных на дисахариде Gall-3GlcNAc У вирусов субтипов Н13 и Н16 сродство к 3'SLN выше чем к Sle°, а сродство к Sie" выше чем к Slea Т е они лучше распознают рецепторы, основанные на дисахариде второго типа (Gall-4GlcNAc)

Повышенное сродство к фукозилированным рецепторам у вирусов чаек

сопровождается перестройкой 222-228 петли гемагглютинина (Табл 2) У Н13

вирусов заменены консервативные Уа1223 и 01у228, крупная аминокислота в

222 позиции заменена на мелкую, и мелкая в 227 позиции - на крупную.

Таблица 2. Сравнение строения 222-228 петли гемагглютинина утиных вирусов и вирусов чаек субтипов Н13, Н16, Н6 вирусов и вируса А/Чайка/ Москва/3100/2006 (Ч/Москва) (1Ш2)

№ аминокислот 222 223 224 225 226 227 228

Консенсус НА вирусов уток Lys, Pro, Arg, Leu, Gin, Trp Val Asn Arg Gly Gln Ala, Gly, Ser Gly

НАН13 Gly Туг Asp Gly Gln Arg, Lys Ser

НА Н16 Gly - Asp Gly Gln Arg Ser

Консенсус НА Н6 Ala Val Asn Gly Gln Arg Gly

НА Ч/Москва Ala Val Ser Gly Gln Arg Gly

Гемагглютинин 16 субтипа без сомнения происходит от 13 субтипа, так как в нем сохранены все замены, характерные для 13 субтипа Однако там возникли новые, еще более «радикальные» замены (Tyr98/Phe, Alal38/Ser, Glul90/Tre и делеция 223 аминокислоты) В результате рецепторный фенотип вирусов 16 субтипа оказался совершенно необычным. Интересно, что к ним вернулась утраченная у Н13 вирусов способность связывать 3'SL с более высоким сродством, чем aNeu5Ac что указывает на существенный вклад галактозы в связывание Сродство к мономерной 3'SL высокое, но при этом сродство к заякоренным на полимере рецепторам низкое Максимальное сродство - к SLex Возможно оптимальная рецепторная группировка для Н16 вирусов в ее природном «контексте» нами еще не найдена

H6N2 вирус А/Чайка/ Москва/3100/2006, выделенный нами из фекалий чайки осенью 2006 на Московском пруду в Тропарево, связывает фукозилированные Sie* и Sie" значительно лучше, чем исходные соединения

По сравнению с «консенсусом» утиных вирусов, у Чайка/ Москва/3100, как и у всех Н6 вирусов в 222 позиции вместо массивной аминокислоты стоит Ala,

помимо этого по сравнению с консенсусом Н6 вирусов имеется еще одна замена Asn224/Ser (табл 2) Сочетание этих замен как раз там, куда направлена группа фукозы, создает, вероятно, особо благоприятные условия для связывания фукозилированных рецепторов

На примере Н4 вирусов видно, что характерная способность распознавать SLe* не хуже, чем 3'SLN появляется немедленно после переход утиных вирусов к чайкам Так, в верхушечной части гемагглютинин вируса Крачка/Бурятия/1901/00 (H4N6) отличается от вируса Утка/Бурятия /1905/00 (H4N6) единственной аминокислотной заменой Ser205/Pro, однако измененный «чаячий» рецепторный фенотип у него уже сформирован. Ser205 тесно зажат между несколькими участками цепей гемагглютинина. С одной стороны он прижимается к гидрофобному "узлу" составленному из Val204, Leu243,11е245 и Тгр180 Тгр Важно подчеркнуть, что 204 и 180 аминокислоты константны для всех субтипов, а в 204 и 243 позиции постоянна гидрофобная аминокислота.

С другой стороны Ser205 вклинивается между Arg220 и Рго221 соседней субъединицы гемагглютинина. Обе эти аминокислоты константны для всех субтипов Это позволяет нам утверждать, что структура данного участка консервативна. Замена маленького серина на более крупный пролин, который, к тому же, вносит излом в белковую цепь, должна сильно нарушить локальную структуру гемагглютинина Подвижки 220 и 221 аминокислот неизбежно вызовут смещения контактирующих с ними 222, 229, 228 и 226 аминокислот 222 аминокислота, как следует из данных приведенных ниже, играет ключевую роль во взаимодействии с фукозой Очевидно, именно вследствие этой перестройки фукоза в группировках Sie* и Sie3 перестает препятствовать связыванию

Вирусы чаек 14-го субтипа по рецепторным свойствам напоминают вирусы чаек четвертого и шестого субтипов - максимальное, причем высокое сродство к SLe". Этот рецепторный фенотип характерен для ВГ чаек тех эволюционных ветвей, которые совсем недавно отделились от утиных вирусов и, возможно, сохраняющих способность инфицировать уток Имеются и утиные изоляты с

таким же рецепторным фенотипом - Шилохвость/Приморье/695/76 (Н2№), КрякваЯурьев/244/82 (ННИб) Возможно - это вирусы «смешанных» очагов, где утки и чайки живут в близком соседстве и обмениваются вирусами.

Подводя итог, можно сказать, что самым общим и самым постоянным свойством вирусов чаек является их способность связывать фукозилированные рецепторы Такое свойство не могло возникнуть случайно и независимо в большом числе эволюционных линий, и оно явно свидетельствует о том, что при переходе от уток к чайкам вирус адаптируется к новому, фукозилированному рецептору

Рецепторная специфичность вирусов гриппа свиней Сравнительное сродство вирусов свиней к клеткам мишеням утки, свиньи и мартышки

Изменение рецепторной специфичности вирусов гриппа при смене хозяина по всей вероятности должна повышать сродство вирионов к новой хозяйской клетке, то есть при переходах вируса от уток к свиньям и к людям можно ожидать соответствующих изменений рецепторных фенотипов Для проверки этого положения, мы сравнили способность вирусов связываться с плазматическими мембранами эпителиальных клеток кишечника утки, трахеи свиньи и трахеи зеленой мартышки Вирусы уток хорошо связываются со всеми тремя субстратами Вирусы свиней связываются с мембранами клеток кишечника утки хуже, чем утиные вирусы Для них падает доля подходящих рецепторов на клетках кишечника утки НШ1 вирусы человека практически перестают связываться с клетками кишечника утки Вирусы свиней лучше всего связываются с мембранами из трахеи свиньи, а вирусы человека - с мембранами из трахеи мартышки Это указывает на то, что состав сиалосахаридов на этих трех типах клеток не совпадает и вирусы приспособлены к рецепторам своих хозяйских клеток Для детализации рецепторного фенотипа ВГ свиней мы воспользовались полимерами, несущими разные рецепторные аналоги

Распознавание типа связи между сиаловой кислотой и галактозой(а2-3 го. а2-6).

Исследование проводили с помощью рецепторных аналогов З'БЪ, б'БЪ, б'БЬМ и 6'8ЬК(Ос), пришитых к полимеру, меченному биотином На рис.1 представлен пример подобного опыта. Полученные данные представлены в виде графиков Скетчарда Вирус А/8\у/8азка1с11е\уап/18789/02 (НШ1) по всем генам соответствует птичьим вирусам гриппа ("аутп-Ысе" вирус), хотя и выделен из свиньи (Кагаэт е! а!, 2004) А/Зхм^зсошт/НОЗШМ/ОЗ (НШ2) несет гемагглютинин классических свиных вирусов, ведущих свое начало со времен пандемии «Испанки» в 1918 году, а А/8\у/№15соттЛ17С/01 несет поверхностные белки от современных человеческих НЗШ вирусов

Рис 1 Графики Скетчарда связывания биотинилированных полимеров, несущих группировки б'БЫчГ-, б'БЬ- и З'БЬ- со свиными вирусами- с «классическим свиным» гемагглютинином, с « человеческим» НЗ гемагглютинином и с «ауюп-Ике» гемагглютинином

Из рисунка видно, что "аУшп-Ьке" вирус связьшает все три типа рецепторов (З'БЬ, 6'БЬ, б'БЬИ), причем лучше всего - первый из них, отличаясь от птичьих вирусов только принципиальной возможностью связывать б'БЬ и рецепторы. Два других вируса связывают только рецепторы с сиалил2-бгалактозной связью, причем б'БЬЫ существенно лучше, чем б'БЬ

Такой характер связывания типичен для современных ВГ человека (Gambaryan et al, 1997 and 1999, Mochalova et al, 2003), но до сих пор не был описан для свиных вирусов Во всех предыдущих исследованиях у свиных вирусов регистрировали «двойную» редепторная специфичность (Rogers and D'Souza, 1989; Gambaryan et al, 1997, Matrosovich et al, 1997,2000, Маринина и др, 2004). Однако во всех этих исследованиях работали со свиными вирусами, изолированными на куриных эмбрионах, в отличие от вирусов, использованных в этом исследовании

Для прояснения картины мы протестировали с помощью пяти вышеупомянутых меченных рецепторных аналогов четыре группы свиных вирусов, а именно

1) Изолированные на клетках МДСК вирусы с «классическим» свиным ГА

2) Изолированные в куриных эмбрионах вирусы с «классическим» свиным ГА

3) Изолированные на клетках МДСК вирусы с НЗ ГА человека

4) Изолированные на клетках МДСК "avian-like" вирусы с HI и Ю ГА Для сравнения использовали два типичных птичьих вируса A/Duck/Hong

Kong/717/79 (H1N3) и A/Duck/Alberta/35/76 (H1NI) Из таблицы 3 видно, что

• Никакие из вирусов, кроме "avian-like" НЗ, не распознают 6'SLN(Gc) -рецептор Это противоречит гипотезе Ito (1998), что свиные вирусы адаптируются в гликолильной форме сиаловой кислоты - доминирующей на сиалохаридах дыхательного тракта свиньи.

• Утиные вирусы распознают только 3'SL рецепторы - в составе фетуина и полимера.

• Вирусы, выделенные на куриных эмбрионах, хорошо связываются с фетуияом и распознают как «человеческий» так и «птичий» рецепторы, в полном согласии с ранее опубликованными данными (Rogers and D'Souza, 1989, Gambaryan et al, 1997, Matrosovich et al, 1997, 2000, Маринина и др, 2004)

• Такой же рецепторной специфичностью обладают и "avian-like" вирусы с HI и НЗ ГА изолированные на клетках МДСК.

Таблица 3 Константы диссоциации комплексов вирусов с фетуин-пероксидазой и с биотинилированными полимерами (1000 Ш), несущими сиалосахаридные остатки

Вирусы Субти п Фету ин Сахаридные остатки

3'SL 6'SL 16'SLN j6'(Neu5Gc)LN

С «классическим свиным» НА, изолированные на МДЦК

Sw/Wisconsm/H03HS5/03 II1N1 05 >5 0 03 0 01 >5

Sw/Wisconsin/H03G 1 /03 H1N1 05 >5 0 1 0 05 >5

Sw/Wisconsin/R33F/01 H1N2 05 >5 02 0 04 >5

S w/W isconsin/R3 6C/01 H1N2 1 >5 02 0 02 >5

Sw/Wisconsin/R46F/01 H1N2 05 >5 02 0 05 >5

Sw/North Carolina/93 523/01 H1N2 1 >5 0.05 0.01 >5

Sw/North CaroIina/98225/01 H1N2 1 >5 02 0 05 >5

SwAVisconsin/H03H04/03 H1N2 1 >5 0 06 0 01 >5

Sw/Iowa/930/01 H1N2 1 >5 0.1 0 05 >5

С «классическим свиным» НА, изолированные на куриных эмбрионах

Sw/Iowa/1976/31 H1N1 1 0 03 0 03 02 0 05 >5

Sw/Indiana/1726/88 H1N1 0 05 0 05 0 15 0 05 >5

Turkey/Kansas/4880/80 H1N1 1 0 03 0 1 04 02 >5

«человеческие», выделенные от свиней, изолированные на МДЦК

Sw/Wisconsin/H03HB4/03 II3N2 >1 >5 0 04 001 >5

S w/Wisconsin/R5E/01 roN2 >1 >5 0.1 0 02 >5

Sw/Wisconsin/R5I/01 H3N2 >1 >5 03 0 04 >5

Sw/Wisconsin/R6H/01 H3N2 >1 >5 05 0.1 >5

Sw/Wisconsin/R7C/01 H3N2 >1 >5 03 0 03 >5

Sw/Wisconsin/RP5G/01 H3N2 >1 >5 05 0.1 >5

«Avian-Iike», выделенные от свиней, изолированные на МДЦК

Sw/Saskatchewan/18789/02 H1N1 1 0.01 0 02 0 1 0 05 >5

Sw/Ontario/K0477/01 H3N3 0 03 0 01 0 1 0 1 1

Sw/Ontario/42729/01 H3N3 0 03 0 01 0 1 0 1 1

Утиные вирусы, изолированные на куриных эмбрионах

Dk/Hong Kong/717/79 H1N3 0 03 0 02 >1 >1 >5

Dk/Alberta/35/76 H1N1 0 05 0 03 >1 >1 >5

*Для вирусов гриппа А обозначение А/ в названии опущено. Sw - swme, Dk - duck, Ch - Chicken

** мкМ по сиаловой кислоте

Приводятся усредненные данные трех опытов, стандартная ошибка не превышает 50% от представленных величин

• Все вирусы первой и третьей группы, обладают рецепторной специфичностью, типичной для человеческих ВГ Они совершенно не распознают З'БЬ рецептор НЗШ вирусы, как и современные человеческие НЗИ2, не связывают фетуин; НШ1 и НШ2 сохранили небольшую способность связывать фетуин, что, опять же, характерно для человеческих НШ1 вирусов

Чтобы понять, с чем связано расхождение результатов данного исследования, проведенного в основном на вирусах, изолированных на культуре клеток МДСК, от результатов полученных ранее на свиных вирусах, выделенных на куриных эмбрионах, мы проанализировали последовательности Н1 НА депонированные в Лос-Аламосовской базе данных Все Н1 вирусы, выделенные от свиней и индюшек имеют замену 01и190/Азр(Азп) по сравнению с консенсусом вирусов уток У вирусов выделенных позднее 2000 года, как правило, заменена также 225 аминокислота: 01у225/Азр. Отметим, что именно эти две замены ответственны за рецепторный фенотип человеческих НШ1 вирусов Причем, при адаптации человеческих ВГ к куриным эмбрионам очень часто возникает реверсия Азр225/С1у, возвращающая вирусу способность связывать «птичий» сиалил2-Згалактозный рецептор (ОатЬагуап е! а1, 1999, Май-озоуюЬ е1 а1,2000)

Мы предполагаем, что наличие Авр225 в свиных ВГ после 2000 года связано не с реальным изменением вирусов, а с изменением способа выделения После того, как были открыты «вторичные» линии свиных вирусов, происходящие из человеческих ВГ, стал практиковаться метод выделения свиных вирусов на клеточной культуре, так как современные человеческие вирусы плохо выделяются в куриных эмбрионах.

При выделен™ на культуре, содержащей сиалил2-6галактозные рецепторы, вирусу нет необходимости настраиваться на «птичий» рецептор и он сохраняет свой исходный генотип и фенотип Таким образом, мы наблюдаем глубокий параллелизм в формировании рецепторной специфичности человеческих и свиных НШ1 вирусов

Распознавание Sia2-3Gal рецепторов с разным сахарндным кором.

Первичная замена Glul90/Asp дает вирусу возможность связывать 6'SLN -рецепторы, однако сохраняет возможность связывать и З'ЗЬ-рецепторы Такой двойной рецепторной специфичностью обладали некоторые изоляты вируса «испанки» и "avian-like" вирусы свиней, недавно перешедшие от птиц к свиньям

Мы исследовали рецепторную специфичность ряда ВГ H1N1, изолированных от свиней и индеек с сочетанием Asp 190 и Gly225 с помощью полимеров, несущих группировки 6'SLN, SLec, Su-SLec, 3'SLN, Su-3'SLN, SLex и Su-SLex Все вирусы связывали 6'SLN, однако все они с максимальным сродством связывали Su-SLex

Поводя итог, можно сказать, что адаптация птичьего вируса к свиньям проходит через две фазы Вирусы, попавшие в свиней недавно ("avian-like") обладают смешанным рецепторным фенотипом, распознавая как 2-3, так и 2-6 связь между сиаловой кислотой и галактозой, и с тенденцией к увеличению сродства к сульфатированным рецепторам. Однако специализированные к свиньям вирусы, так же как и человеческие, перестают распознавать Sia2-3Gal рецепторы, и настроены на 6'SLN.

Для "avian-like" вирусов оптимальными являются сульфатированные формы Sia2-3Gal рецепторов, в первую очередь Su-SLex Как было показано выше, именно к этой форме рецептора адаптируются ВГ домашней птицы Вирусы, «классической» линии начинают с высоким сродством распознавать этот же рецептор в результате одной реверсии Asp/Gly225, при этом вирус сохраняет способность инфицировать свиней

Многие исследователи (Lipkind et al, 1984, Altmuller et al, 1992, Wright et al 1992, Suarez et al, 2002, Choi et al, 2004) описывали межвидовую трансмиссию ВГ между свиньями и индейками. Можно высказать гипотезу, что способность распознавать «куриный» рецептор облегчает такую трансмиссию Регулярная трансмиссия между свиньями и птицами (в особенности, если в ней

участвуют и дикие синантропные птицы, например голуби и воробьи) может давать эволюционные преимущества вирусу, облегчая его распространение

Рецепторная специфичность Н5 вирусов

Повышенный интерес к H5N1 вирусам и необычная рецепторная специфичность тех образцов, который были тестированы в первоначальном исследовании стимулировали нас обследовать рецепторную специфичность широкого набора Н5 вирусов из коллекций США (Department of Virology and Molecular Biology, St Jude Children's Research Hospital, Memphis, Tennessee, и CDC, Atlanta, Georgia) Непатогенные утиные вирусы использовались для сравнения Мы обследовали представителей нескольких эволюционных ветвей, включавших непатогенные утиные евроазиатские вирусы, американскую линию, включающую вирусы как диких уток так и домашней птицы, и высоко патогенную южноазиатскую линию H5N1 вирусов. Для сравнения, в этих же опытах проставляли ряд других вирусов ВГ диких уток и человека Использовали 9 типов полимеров Асиаловый З'-O-Su-Lec, - для контроля, 6'SLN, SLec, Su-SLec, 3'SLN, Su-3'SLN, SLe", Su-SLex и Slea Ни один из испытанных вирусов не связывал асиаловый сахарид З'-O-Su-Lec, что доказывает адекватность использованной методики. Как и следовало ожидать, два, взятых для сравнения, человеческих вируса, не связывали ни один из 3'-сиалозидов и хорошо связывали 6'SLN

Рецепторные фенотипы «первичных» утиных вирусов американской, дальневосточной и юговосточной линий близок к типичному рецепторному фенотипу утиных вирусов прочих субтипов, а именно сульфатирование не сказывается на связывании рецептора с вирусом, а фукозилирование резко понижает сродство В эволюционных линиях, адаптирующихся к домашней птице, рецепторная специфичность меняется - возрастает сродство к сульфатированному 3'SLN Это свойство независимо появляется как в американской, так и Южно-азиатской линии вирусов, и особенно ярко выражено у высоко патогенных H5N1 вирусов

Вирусы линии, доминирующей в Индонезии, Камбоджи, по-прежнему циркулируют среди домашних птиц Они приобрели особо высокую патогенность как для кур, так и для млекопитающих, включая человека У этих вирусов продолжается возрастание сродства к сульфатированным рецепторам, в частности выросло сродство к сульфатированному и фукозилированному рецептору Su-SLe" Напомним, что это же соединение является оптимальным рецептором «вируса куриной чумы» - FPV/Rostok/34 (H7N1) Другая, «китайская» линия H5N1 вирусов характеризуется активным возвратом к диким природным хозяевам - уткам, гусям и т д В этой группе наблюдаются возврат рецепторного фенотипа к исходному У ряда вирусов сульфатирование не повышает, а понижает сродство к рецептору

К этой же группе относятся весьма интересные изоляты Hong Kong/212/2003 и Hong Kong/213/2003 Эти вирусы были выделены от отца и сына, входящих в семейную группу заболевших людей (От других заболевших и умерших не было взято материала для исследования) (Guan et al, 2004) У обоих изолятов резко сдвинутая рецепторная специфичность — они приобрели способность распознавать человеческий рецептор 6'SLN, в то время как сродство к «птичьим» рецепторам у них упало (Shinya et al, 2005, Gambaryan et al, 2006) Сравнение аминокислотных последовательностей рецепторного участка Н5 вирусов выявляет у изолятов Hong Kong/212/2003 и Hong Kong/213/2003, замену Ser227/Asn по сравнению с близкородственными вирусами. Важно отметить, что замена Ser227/Asn не встречается в вирусах, выделеных от птиц, и ее наличие в обоих человеческих изолятах резко усиливает подозрение, что эта мутация произошла в больном человеке, и что дальнейшая передача вируса уже происходила внутри данной семейной группы, от человека к человеку Такая «сцепка» между сдвигом рецепторной специфичности в сторону распознавания человеческого рецептора и способностью вируса передаваться от человека к человеку может быть рассмотрена как модель формирования пандемического штамма

Молекулярные механизмы распознавания Би-З^УЧ у Н5 вирусов.

Анализ аминокислотных замен у Н5 вирусов помогает понять механизм повышенного сродства к сульфатированным рецепторам Большинство Н5 вирусов в 193 позиции несут лизин или аргинин - то есть положительно заряженные аминокислоты Исключейиями являются ТигкеуЛМЪсопзт/бй и СоозеЛ/Чейгат/113/2001, у которых лизин заменен на отрицательно заряженную глютаминовую кислоту В обоих случаях сродство к сульфатированному рецептору резко падает и становится существенно ниже, чем у несульфатированного аналога (Табл 4)

Таблица. 4 Константы диссоциации Н5 вирусов отличающихся по 193

аминокислоте к сульфатированным и исходным рецепторам

193 а о 3'SLN Su-3'SLN SLex Su-SLex SLec Su-SLec

Turkey/Cahfornia/6878/79 H5N3 Lys 5* 1 >50 10 4 4

Turkey/Wisconsin/ 6 8 H5N8 Asp 5 50 >50 >100 3 10

Goose/Vietnam/324/2001 H5N1 Lys 5 5 50 30 5 5

Goose/Vietnam/113/2001 H5N1 Asp 5 40 40 >100 3 5

*См подпись под табл. 3

Повышенным сродством к Su-3'SLN обладают также H3N8 вирусы лошадей с Lys 193 в НА (Gambaryan et al, 2004, 2005, 2007). Н7 вирусы, которые также обладают повышенным сродством к сульфатированным рецепторам, тоже содержат Lys в 193 позиции гемагглютинина

Все эти данные согласуются с нашей гипотезой, что электростатические взаимодействия положительно заряженной аминогруппы лизина или аргинина 193 с отрицательно заряженной сульфогруппой обеспечивают высокое сродство вирусов с Su-3'SLN. (Gambaryan и др , 2004)

Молекулярное моделирование вмещения рецепторов в рецептор-связывающий участок (РСУ) иллюстрирует, почему повышено сродство именно к Su-3'SLN а не к Su-SLec (Рис 2). Сульфа-группа Su -3'SLN направлена в сторону лизина 193, а у Su-SLe° она направлена в свободное пространство

Su-SLec Su-3'SLN

Рис. 2. Расположение сульфатированных рецепторов Su-SLe° и Su-3'SLN в РСУ Н5 вируса. Рецептор вмещен в РСУ гемагглютинина закристализованного в присутствии рецептора LSTa (1JSN, Brookhaven Protein Databank, Ба et al, 2001) путем наложения галактозы Su-SLec или Su-3'SLN на галактозу LSTa. Основная часть рецептора представлена в формате "stick", за исключением сульфа-группы. Лизин 193 помечен.

Рецеторная специфичность вирусов друшх субгинов, адаптирующихся к домашней птице.

Сходство рецепторной специфичности высокопатагенных H5.N1 вирусов и куриного вируса РРУ/Ш^ок^ стимулировали нас обследовать рецепторнуго специфичность вирусов других субтшгов, адаптирующихся к домашней птице, в первую очередь тех, среди которых отмечались случаи инфицирования людей Результаты анализа вирусов разных хозяев других субтипов представлены в таблице 5,

Из таблицы видно, что разнообразие рецепторных фенотипов у разных птичьих вирусов крайне велико, начиная от типично «утиных» фенотипов, и кончая способностью связывать человеческий рецептор, не хуже, чем птичий Видно, также, что рецепторные фенотипы зависят скорее от хозяйской принадлежности, чем от субтипа вирусов Вирусы диких уток 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го, 9-го и 10-го субгипов как и утиные вирусы описанные выше, лучше всего связывают нефукозилированные рецепторы с 1-3 связью между галактозой и последующим звеном БЬес и ЗТТ, не реагируют на сульфатирование рецептора, а фукозилированные рецепторы 8Ье" и БЬе4 связывают значительно хуже, чем исходные сахариды Сродство к человеческому рецептору б'ЗЬК у них исключительно низко

Близким рецепторным фенотипом обладают вирусы С1искеп/14/76, Тигкеу/Епв1апсЗ/69, Соозе/У№324/01. СоозеЛ-ЪШЗ/О], ТигкеуЛИ/01/199б В случае СЫскеп/14/76, Тигкеу/Еп£1апс1/69 и ТигкеуЛУ1/01/1996 это может объясняться эволюционной близостью с утиными вирусами Н5№ вирусы воо=е/¥N/324/01и Соозс/УКг/113/01 относятся к труппе, безусловно отошедшей от эволюционной ветви, предварительно глубоко адаптированной к курам Их рецепторный фенотип иллюстрирует повторную адаптацию к гггицам отряда Атегфугтез Вирусы шестого субтипа отличаются от утиных вирусов толерантностью к фукозилироваюпо рецептора - сродство к ЙЬе" у них не ниже, чем к 3 В этом отношении они напоминают вирусы чаек разных субтипов (Н4, Н5, Н6, Н13 иН14)

Таблица 5 Рсцепторная специфичность вирусов гриппа домашней птицы

вирусы Субтяп 6 SLN 3 SLN Su-3'SLN Sl.c': Su-SLe" SLc1- Su- SLec STF SLe"

Duck/Hong Kong/193/77 HI N2 >5000 10 10 >100 >100 10 10 10 >100

Duck/Hong Kong/717/79 Hllsl3 >5000 10 10 >100 >100 10 10 10 >100

Duck/lions KotigG7B/78 H2N9 >5000 20 10 >50 >50 10 10 10 >50

Duck/Nanchaiig/2-0485/00 H2N9 >5000 20 10 >50 >50 10 10 10 >50

Duck/BuryatW652/88 H3N8 >5000 10 10 50 50 5 5 5 50

Mallard/New York/670/78 H4N6 >5000 4 8 100 >200 2 4 8 100

Duck/Primorie/3/82 H9N2 >5000 10 8 100 30 8 5 5 100

Mallard/Netherlandb/02/00 HI0N4 >5000 20 7 >50 30 5 5 - -

Chicken/Hong Kong/14/76 HIN1 >5000 10 10 >100 >100 20 20 5 >100

Turkey/Engiand/69 H3N2 >5000 2 8 40 50 3 5 5 so

Goose/V ietnam/324/01 H5N1 >5000 5 5 50 30 5 5 - -

Goose/Vietnam/113/01 1I5N1 >5000 5 40 40 >100 3 5 - -

Snearwater/Austrai ia/1/72 H6N5 >5000 20 30 10 30 15 15 15 10

Teal/Hong Kong/W312/97 H6N1 >5000 50 >50 20 >50 20 >50

Turkey/Mas sachnssetts/6 5 нам 2 >5000 20 30 20 30 10 20 20 50

Chicken/New York/13237-Й/98 H6N8 >5000 7 10 7 20 5 10 5 10

A/Turkey/V irgima/4529/02 H7N2 200 2 1 20 4 10 10 5 >100

Avian/New York /273874/03 H7N2 500 10 2 30 8 20 15 -

Ch/New Jersey/2945 98-12/04 H7N2 200 5 1 20 5 5 2 - -

Chicken/Delaware/296763-2/04 H7N2 200 15 5 30 15 20 15 - -

New York/107/03 H7N2 200 10 2 >100 15 20 >100 - -

Netherlands/219/03 H7N7 500 4 1 5 05 5 5 5 50

¡STeth erl and s/230/03 H7N7 500 4 1 5 0 5 5 5 5 50

Netherlandb/231/03 H7N7 500 4 1 5 05 5 5 5 50

Gaose/Mmnesota/5773/80 H9N2 >5000 20 10 50 20 10 10 20 50

Turkey/Wisconsin/I/96 H9N2 >5000 5 5 20 30 2 2 20 10

Turkey/Mmuesota/38391-6/9S H9N2 >5000 10 10 10 20 5 5 10 5

Chicken/New Jersey/12220/97 H9N2 >5000 5 5 05 05 5 5 7 2

Pheasant/Wisconsin/17S0/88 H9N2 >5000 10 3 2 1 10 10 - -

Ciicken/Korea/96323/96 H9N2 >5000 10 3 30 10 10 3 - -

riiikey/K.andei/oni/73 H9N2 200 20 s 20 3 20 5 - -

thicken /Hong Kong/i-Y20/99 H9N2 50 >100 3 >100 5 >100 >100 - -

Chicken /Hong Kong/G9/97 H9N2 50 >100 5 >100 10 >100 >100 - -

Chicken /Hong Kong /SF3/99 H9N2 50 >100 3 >100 5 >100 >100 - -

Hong Kong/2/08/03 I19N2 50 >100 10 >100 10 >100 >100 - -

Clncken/Pakistan/02/99 H9N2 10 >100 0 I >100 1 >100 >100 - -

Ouail/Hong Kong/SSP 10/99 H9N2 50 >100 5 >100 10 >100 >100 - -

t>uail/Hong Kong/GI/97 H9N2 10 >100 >100 20 20 >100 >100 - -

Hong Kong/1073/99 H9N2 5 >100 >100 >100 >100 >100 >100 - -

Swme/Hong Kong/9/98 H9N2 50 >100 I >100 г >100 >100 - -

Equine/Kentucky/5/02 H3N8 >5000 3 I 10 i 4 2 - -

Equine/Ohio/1/03 H3N8 >5000 3 05 5 04 4 15 - -

panine/Flonda/43/04 H3NS >5000 3 05 5 04 4 i 5 - -

*См подпись под табл 3

Н7 вирусы можно квалифицировать, как вирусы, адаптированные к курам Наподобие куриных Н5 они адаптированы к сульфатированным рецепторам на базе дисахарида второго типа Gaipi-4GlcNAc(J Американсткие изоляты, включая человеческий A/New York/107/03 (H7N2) с максимальным сродством связываются с Su-3'SLN, a H7N7 вирусы, изолированные от людей в 2003 в Нидерландах - с Su-SLe* Отличительной чертой этих вирусов является умеренная способность связывать 6'SLN-penenTop

Среди Н9 вирусов встречается все мыслимое разнообразие рецепторных фенотипов Некоторые из Американских вирусов (Goose/Minnesota/73, Turkey/WI/01/l 996, Turkey/MN38391-6/1995) как и российские Н9 вирусы уток, обладают типичным «утиным» рецепторным фенотипом.

Вирусы Chicken/NJ/12220/97 и Pheasant/Wisc/1780/88 лучше всего связываются с фукозилированными сиалосахарами Slex and Su-Slex Вирус Ck/Korea/96323/96 предпочитает сульфатированные рецепторы, к фукозилированным сахарам - сродство понижено Эти вирусы, как и все американские Н9 совершенно не связывают 6'SLN

Все исследованные южноазиатские H9N2 вирусы, как и было показано ранее М Н.Матросовичем, (Matrosovtch et al, 2001) утратили способность связывать рецепторы 3'SLN, SLec, Su-SLec , SLe" Все они, в той, или другой степени, связывают 6'SLN Однако для большинства из них сродство к сульфатированным Sia2-3Gal рецепторам на базе дисахарида второго типа Gaipi-4GlcNAcP (Su-3'SLN и Su-Slex) выше, чем к 6'SLN Важно подчеркнуть, что к сульфатированному Slec сродство совершенно не повышено - это указывает на то, что позиция сульфогруппы, приводящая к резкому (более чем в 100 раз) повышению сродства строго определена

Вирусы лошадей (H3N8), включая родственный им вирус, выделенный от собаки (Crawford et al, 2005), строго адаптированы к Sia2-3Gal - рецепторам и предпочитают сульфатированные формы Su-3'SLN или Su-SLex

Механизм распознавания фукозилироваиного и сульфатированного рецептора Su-SLe*.

Рис.3 Расположение фукозилированного рецептора Su-SLex в РСУ утиного НЗ вируса. Рецептор вмещен в РСУ гемагппотинипа закристализованиого в присутствии рецептора LSTa (1MQM, Brookhaven Protein Databank, На и др., 2003) путем наложения галактозы Su-SLex (2КМВ, Brookhaven Protein Databank, Ng and Weis 1997) на галактозу LSTa. Основная часть рецептора представлена в формате "stick", за исключением фукозы и сульфогруппы (формат СРК), 222, 190 и 193 аминокислоты помечены.

Молекулярный механизм распознавания рецептора у вирусов гриппа уток разных субтипов одинаков. Их рецептор-связывающий участок эволюционно крайне стабилен и формируется рядом консервативных аминокислот (97, 98, 99, 134, 138, 139, 153, 183, 184, 190, 194, 195, 225, 226 и 228; нумерация по НЗ здесь и далее). На рисунке 3 показано вмещение рецептора Su-SLe" в РСУ утиного НЗ вируса. Видно, что фукоза рецептора Su-SLex перекрывается с крупной 222 аминокислотой

(Тгр222) гемагглютинина Сульфагруппа, напротив, отдалена от поверхности гемагглютиниа и направлена в раствор (На рисунке - вперед)

Высокое сродство к Su-SLe" у вирусов субтипов HI и Н9 сопровождается реконструкцией 222-228 петли и 190-194 а-спиралького участка гемагглютинина.

У всех H1N1 вирусов свиней, которые хорошо связывают Su-SLex заменена 190 аминокислота.

H9N2 вирусы Юговосточной Азии связывают Su-3'SLN и Su-SLe* с равным сродством, что указывает на то, что перекрывание фукозы с кромкой РСУ, характерное для большинства утиных вирусов, отсутствует Связывание с сульфатированными рецепторами Su-3'SLN и Su-SLex более чем в 100 раз сильнее, чем с исходными 3'SLN и SLex В то же время сродство к Su-Slec остается очень низким Это указывает на то, что сульфогруппа рецептора, расположенная в конкретном положении, вступает в выгодные энергетические взаимодействия с гемагглютинином. У данных вирусов Gln226 заменен на Leu, a Glul90 на Ala, Тге или Val. На рис 4 приведена модель расположения Su-SLex в РСУ H9N2 вируса A/Swine/Hong Kong/9/98, полученная путем наложения галактозы Su-SLex на галактозу рецептора LSTa, в составе комплекса с данным гемагглютинином (структура 1MQM, Brookhaven Protein Databank, На и др., 2001)

У данного вируса вследствие замены Gln226/Leu торсионный угол между сиаловой кислотой и галактозой отличается от этого угла в комплексах рецептора с гемагглютининами НЗ и Н5 птичьих вирусов, (На и др , 2001)

Вследствие этого изменения угла расположение фукозы и сульфо-группы меняется. Фукоза рецептора свободно возвышается над 222 и 227 аминокислотами, а сульфо-группа идеально входит в углубление между аминокислотами 186, 187 и 190, появившееся в этом месте гемагглютинина в результате замены Glul90 на Val Таким образом замена Gln226/Leu,

ответственная за повышение сродства к Siaa2-6Gal рецепторам (Vines и др, 1998), в случае H9N2 обеспечивает, помимо этого, еще более высокое сродство к сульфатированным Siaa2-3Gal рецепторам (Gambaryan и др., 2007).

Рис. 4 Расположение сульфатированного и фукозилироваиного рецептора Su-Slex в РСУ вируса A/Swine/Hong Kong/9/98, полученная путем наложения галактозы Su-SLe* на галактозу рецептора LSTa, в составе комплекса с данным гемагглютинином (структура 1JSD, Brookhaven Protein Databank, На и др., 2001). Основная часть рецептора представлена в формате "stick", за исключением сульфа-групны и фукозы (формат СРК). Помечены ключевые аминокислоты.

Связь между изменениями рецепторной специфичности вирусов гриппа при переходе к новым хозяевам и составом рецепторов на клетках мишенях разных хозяев.

Связывание вирусов с ганглиозидами, отличающимися длиной сахаридной ножки

В 1999 г. М.Н.Матросовичем было отмечено, что в разных эволюционных ветвях ВГ кур регулярно возникают такие признаки, как делеция в стеблевом участке нейраминидазы и появление дополнительных сайтов гликозилирования

в области рецепторного кармана гемагглютинина (Matrosovich et al, 1999) Поскольку эти изменения заглубляют активные центры обоих оболочечных белков относительно внешней поверхности вириона, можно предположить, что вирус приспосабливается к рецепторам с более длинной углеводной цепью

Для изучения влияния дополнительных сайтов гликозилирования на способность связываться с рецепторами мы исследовали связывание вирусов с ганглиозидными препаратами, различающимися числом сахаридных звеньев Для получения таких препаратов мы проводили двуступенчатую элюцию ганглиозидов из клеточных мембран и получали «легкую» фракцию, с 3-7 звенными ганглиозидами, и «тяжелую» фракцию, содержащую ганглиозиды с более длиной ножкой

В таблице 6 приводятся значения относительного сродства ряда вирусов к двум препаратам "легких" ганглиозидов из мозга быка и из эпителиальных клеток кишечника утки и к трем препаратам "тяжелых" ганглиозидов из эпителиальных клеток кишечников утки, кишечника курицы и легких мартышки (С "легкими" фракциями ганглиозидов из кишечника цыпленка и из легких мартышки ни один из испытанных вирусов гриппа не связывался) Из таблицы видно, что вирусы уток примерно с равным сродством связываются со всеми препаратами ганглиозидов Из этого следует, что ганглиозиды с короткой ножкой (легкая фракция) являются для них вполне хорошими субстратами

ВГ человека совершенно не связываются с легкими фракциями ганглиозидов, кроме того, они не связываются и с тяжелыми ганглиозидами из кишечника утки. Эти результаты хорошо согласуются с данными Miller-Podraza et al, (2000)

Связывание вирусов кур с легкими фракциями ганглиозидов строго коррелирует с отсутствием сайта гликозилирования 158 аминокислоты Ни один из вирусов с этим сайтом не связывается с легкими фракциями, в то время, как вирусы без сайта (включая вирус Тюленя Seal/Massachuset/1/80, родственный вирусу FPV/Rostok/34) - связывают Однако картина связывания не так

однородна, как для утиных вирусов Вирусы кур связывают тяжелые фракции ганглиозидов кишечника курицы и трахеи мартышки с большим сродством, чем ганглиозиды кишечника утки Очевидно, в этих препаратах есть более подходящая рецепторная детерминанта для этих вирусов

Табл. 6 Относительное сродство вирусов гриппа уток, кур и людей к легкой (л) и тяжелой (т) фракциям ганглиозидов из мозга быка (ГМБл), кишечника утки (ГКУл и ГКУт), кишечника курицы (ГККт) и трахеи мартышки

(ГТМт)

ГМБл ГКУл ГКУт ГККт ГТМт

Вирусы уток

Duck/France/46/82 H1N1 20 20 20 20 20

Duck/Alberta/3 5 H1N1 20 20 20 20 20

Duck/New Jersey/1580/78 H2N3 30 30 30 30 30

PmtaiI/Primone/695/76 H2N2 30 30 30 30 30

Duck/Buryatia/652/88 H3N8 30 30 30 30 30

Duck/Buryati a/664/88 H3N8 30 30 30 30 30

Duck/Czechoslovakia/56 H4N6 40 40 40 40 40

Duck/Hong Kong/205/77 H5N3 40 40 40 40 40

Duck/ Minnesota /1525/81 H5N1 30 30 30 30 30

Duck/Hong Kong/308/78 H5N3 40 40 40 40 40

Duck/Alberta/60/76 H12N5 20 20 20 20 20

Вирусы кур

Ch/Hong Kong/728/97 H5N1 30 30 40 60 60

Ch/Hong Kong/220/97 * H5N1 <5 <5 40 50 60

Ch/Hong Kong/786/97 * H5N1 <5 <5 40 50 60

FPV/Rostok/34 * H7N1 <5 <5 30 50 50

Вирус тюленя

Seal/Massachuset/1 /80 H7N7 40 40 40 40 50

Изоляты HSN1 от людей

Hong Kong/156/97 H5N1 30 30 40 60 60

Hong Kong/481/97 H5N1 30 30 40 50 60

Hong Kong/485/97 * H5N1 <5 <5 50 60 70

Вирусы гриппа человека

A/Chr/157/83 M * H1N1 <2 <2 <5 80 80

A/Smgapore/1/57 H2N2 <2 <2 <5 50 80

A/NIB/26/90 M H3N2 <2 <2 <5 70 70

B/NIB/48/90 M Type В <2 <2 <5 80 80

- * Наличие сайта гликозилирования 158 аминокислоты Относительное сродство - выраженное в процентах отношение сродства данного вируса к субстрату в условиях эксперимента и «сродства» в условиях максимально благоприятствующих связыванию (Отсутсвие всех блокаторов в реакционной смеси) Чем выше цифра в таблице - тем выше сродство вируса к субстрату

Сравнение состава гаиглиозидов в кишечниках курицы и утки

Полученные результаты побудили нас сравнить состав ганглиозидов на эпителиальных клетках кишечников курицы и утки (ЭККК и ЭККУ) На рис 5 приведена хроматограмма разделения тотальных ганглиозидов из этих двух источпиков Для сравнения использованы ГМБ. Видны существенные отличия в составе ганглиозидов ЭККК и ЭККУ Доминирующий ганглиозид ЭККК совпадает по подвижности с GMla. В ЭККУ соответствующего ганглиозида нет, а есть другой, с меньшей хроматографической подвижностью, и еще один, близкий по подвижности с GDI а На дорожке 2 внизу хорошо заметно пятно, соответствующее примерно 10-15-звенному ганглиозиду кишечника курицы, а в кишечнике утки в этой зоне материала так мало, что он не виден на хроматограмме Для анализа фракций ганглиозиды элюировали с хроматограммы и исследовали их способность связывать разные ВГ

Результаты связывания ВГ с фракциями ГМБ соответствуют литературным данным. Как было показано Suzuki (1994) вирусы связываются с концевой СК, поэтому GMla, несущий сиаповую кислоту при третьем от конца звене, не является рецептором ВГ Хорошими рецепторами для вируса утки являются GDla и GTlb с концевой структурой Neu5Aca2-3Gaip 1 -3GalNAc[3

Ганглиозид кишечника утки близкий, но не совпадающей по подвижности с GMla хорошо связывает утиный вирус, следовательно содержат концевую СК Весьма вероятно, что это GMlb с сиаловой кислотой при концевой галактозе Следующий ганглиозид ЭККУ совпадает по подвижности и по способности связывать вирусы с GDla В кишечнике курицы ганглиозид, совпадающий по подвижности с GMla не связывает вирусы, что наводит на мысль, что это и есть GMla На уровне GDla и GTlb в кишечнике курицы материала мало, поэтому эти зоны тоже плохо связывают вирусы Зато зона, соответствующая 10-15-звенным ганглиозидам связывает вирусы утки, курицы и человека

Как мы показали выше, многие вирусы кур, с сайтом гликозилирования 158 аминокислоты, утратили способность связываться с легкими фракциями ганглиозидов Отсутствие на клетках мишенях кур малозвенных ганглиозидов,

поддерживающих связывание вирусов гриппа, вероятно способствовало эволюции вирусов в сторону распознавания рецепторов с длиной ножкой.

СМ!

СВ1а

Рис. 5. Тонкослойная хроматография ганглиозидов эпителиальных клеток кишечника утки и курицы. Ганглиозиды: 1 - кишечника утки, 2 - кишечника курицы, 3 - мозга быка (указаны справа). Цифрами вдоль хроматограммы указаны номера фракций, использованных для изучения связывания вирусов.

Связывание вирусов с клеточными мембранами ряда клеток мишеней

Далее, мы исследовали связывание вирусов разных хозяев с мембранами эпителиальных клеток кишечников утки и курицы, трахеи курицы и трахеи мартышки (рис. 6 ). ВГ птиц связываются со всеми четырьмя представленными субстратами, но картина связывания для вирусов разных хозяев различается. Все утиные вирусы связываются с клетками кишечника утки сильнее, чем с остальными субстратами. Для вирусов чаек и кур оптимальным субстратом являются клетки кишечника курицы. Этот же субстрат оптимален для вирусов человека, но, в отличие от птичьих вирусов, вирусы человека практически совсем не связываются с клетками кишечника утки.

Связывание вирусов с клеточными мембранами

ео

50 40 30 21 10 0

5 | 12 | 13

ВИРУСЫ УТОК

аз | 2?

ВИРУСЫ ЧАЕК

40 | 41 | 43

ВИРУСЫ ЧЕЛОВЕКА

Ш Кишечник утки ■ Кишечник курицы 0 Трахея курицы § Трахея мартышки

Рис. 6. Связывание вирусов гриппа разных хозяев с плазматическими мембранами эпителиальных клеток кишечника утки, кишечника курицы, трахеи курицы и трахеи мартышки.

Далее, мы исследовали состав рецепторов для вирусов гриппа на плазматических мембранах вышеупомянутых эпителиальных клеток

Для этого мы воспользовались четырьмя вирусами с ярко выраженной рецепторной специфичностью- А/Оиск/Вигуайа/1905/00 (ак/Виг), А/ОискепЛЛеишт/МСУБ] 1/2003 (сЬ/УМ), А/С1искеп/Ш/12220/97 (сШ1), и вирус человека А/Ы1В/23/89М (МВ/23М)

В таблице 7 приводятся значения констант диссоциации этих вирусов к полимерам несущим ряд ключевых сиалосахаридпых детерминант

Табл 7 Константы диссоциации вирусов к различным рецепторным детерминантам

Сахаридные Вирусы

Группировки ёк/Виг сЬ/Ш с11/УМ МВ/23М

Н4Ы6 Н9Ш Н5Ш НШ1

Кеи5Аса2-60а1р1-4аШАс(3 (б^ЬЫ) >200 >200 >200 5

№и5Аса2-30а1р 1-Ю1сЫАср (З^ЬЫ) 20 10 5 >200

Ыеи5 Аса2-3 ва! р 1 -4<Тиссс 1 -3)01сЫАср (БЬе* ) 200 0.5 50 >200

Меи5Аса2-30а1р1-4(68и)01сНАсР (Би-З' БШ) 20 10 0.3 >200

№и5Аса2-ЗСа1р1-ЗОШАср (8Ьес) 10 10 10 >200

*См подпись под табл 3

Из таблицы видно, что только вирус человека связывает б'ЭЫЧ, с сиаловой кислотой присоединенной к галактозе 2-3 связью этот вирус не связывается

Утиный вирус ёк/Виг хорошо связывается со БЬе0 - сахаром с 1-3 связью между галактозой и глюкозамином. Добавление сульфогруппы к рецептору безразлично для связывания, а фукозилирование резко снижает сродство к рецептору

Непатогенный куриный вирус сЬ/Ш связывается с З'БЬЫ, БЬе0 и их сульфатированными производными примерно так же как и вирус <Зк/Виг,

но максимальное сродство проявляет к фукозилированым сиалосахарам Сродство к ЭЬе* у сМ\У в 400 раз выше чем у dk/Buг, что позволяет выявлять наличие фукозилированных рецепторов с помощью этой пары вирусов

Высоко патогенный Н5№ вирус сЬ/УЫ с максимальным сродством связывается с сульфатированным Би-БЫМ.

Далее мы провели количественный анализ сродства этих вирусов к клеточным мембранам Для этого данные по связыванию вирусов с субстратами представляли в виде графиков Скетчарда, наклон которых отражает сродство ВГ к субстрату, а точка пересечения графика с осью X — относительное число рецепторов для исследуемого вируса в данном препарате (Рис 7) Вирус утки (Зк/Виг лучше всего связывается с клетками кишечника утки - ход графика Скетчарда указывает на максимальное число рецепторов для вируса и на высокое сродство вируса к этим рецепторам Вирус утки так же неплохо связывается с клетками куриной трахеи и трахеи зеленой мартышки Связывание с клетками кишечника курицы слабое - ход графика указывает на низкое сродство к соответствующим рецепторам

У вируса курицы сЬ/Ы1 соотношение сродства к клеткам кишечника утки и клеткам кишечника курицы противоположное - минимальное сродство к клеТкам кишечника утки и максимальное - к клеткам куриного кишечника С клетками трахеи курицы и мартышки вирус связывается с меньшим сродством, хотя число мест связывания на этих субстратах для вируса достаточно велико

Другой куриный вирус, сй/УЯ также лучше связывается с клетками кур, чем с клетками утки, но, в отличие от вируса СИ/Ш, с клетками трахеи связывается с большим сродством, чем с клетками кишечника Сильнее всего данный вирус связывается с клетками трахеи мартышки.

Рис 7 Графики Скетчарда связывания вирусов A/Duck/Buryatiya /1905/00 (dk/Bur), A/Chicken/NJ/12220/97 (ch/NJ), A/Chicken /Vietnam/NCVD-11/2003 (ch/VN) и вируса человека A/NIB/23/89M (NIB/23M) с плазматическими мембранами эпителиальных клеток кишечника утки (КУ), кишечника и трахеи курицы (КК и ТК) и трахеи зеленой мартышки (ТМ).

И, наконец, вирус человека A/NIB/23/89M совсем не связывается с клетками кишечника утки, а с клетками кишечника и трахеи курицы связывается очень хорошо С клетками трахеи мартышки вирус связывается с максимальным сродством, хотя число мест связывания (точка пересечения с осью X) меньше, чем на куриных клетках

Исходя из рецепторной специфичности этих вирусов можно трактовать данные по их связыванию с различными клетками

Способность вируса человека NIB/23M связываться с клетками кишечника курицы и трахеи курицы и мартышки указывает на наличие 6'SLN рецепторов на этих клетках

Резкие отличия в связывании вирусов dk/Bur и ch/NJ к клеткам кишечников утки и курицы вероятно объясняются доминированием фукозилированных рецепторов в кишечнике курицы

Высокое сродство вируса ch/VN к клеткам трахеи мартышки и курицы, возможно обусловлено наличием сульфатированных рецепторов

Выявление сульфатированных рецепторов на клетках мишенях

Выявление сиалосодержащих рецепторов сульфатированных по шестому положению глюкозамина мы проводили с помощью фермента 6-глюкозамин сульфатазы

Препарат клеточных мембран обрабатывали ферментом до полного удаления всех 6-сульфогрупп с глюкозамина, являющегося третьим звеном сиалосахаридного рецептора Далее сравнивали сродство вирусов к исходному и обработанному препарату

Для вирусов Duck /Pensylvania/84 и Duck/Minessota/1525/81 обработка субстратов 6-глюкозамин сульфатазой не влияет на сродство к клеткам Для вирусов Chicken /НК/786/97 и Equine/Maiamy/1/63, обладающих повышенным сродством к сульфатированным рецепторам, сульфатазная обработка резко понижает сродство к клеткам трахеи мартышки Такой результат доказывает, что высокое сродство вирусов H5N1 к клеткам трахеи мартышки связано с тем, что на этих клетках присутствуют сульфатированные по глюкозамину сиалосодержащие группировки, скорее всего Su-3'SLN, к которому у данных вирусов особо высокое сродство

Адаптация вирусов гриппа кур к сульфатировашшм рецепторам видимо отражает наличие таких рецепторов на ьслетках мишенях кур По случайному совпадению, эти же сиалосахаридные группировки, очевидно, присутствуют на клетках дыхательного эпителия зеленой мартышки, и, вполне вероятно, человека Второй тип рецептора, присутствующий как в клетках дыхательного эпителия человека, так и на клетках эпителия кур это 6'SLN - «человеческий» рецептор. Напомним, что и Su-3'SLN и 6'SLN- это рецепторы на базе одного и того же сахарида второго типа Gaipi-4GlcNac

Наличие рецепторов для человеческих вирусов на эпителиальных клетках кур поставило перед нами задачу провести более широкое исследование птиц из разных систематических групп

Состав рецепторов для вирусов гриппа на клетках различных птиц.

Изучались птицы, принадлежащие к отрядам

1) Гусеобразные - Anseriformes

2) Курообразные - Galhformes

3) Журавлиные Charadrnformes

Семейство Бекасовые Scolopacidae Семейство Чайковые Laridae

4) Листообразные Ciconuformes

5) Поганкообразные Podicipediformes

6) Журавлеобразные Gruiformes

О составе сиалосодержащих рецепторов на клетках судили по способности этих клеток связывать лектины SNA и МАА, специфически распознающими Neu5Aca2-6Gaip и Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNAc группировки, а также вирусы dk/Bur, ch/NJ, ch/VN и NIB/23M с хорошо охарактеризованной рецепторной специфичностью

На рис. 8 приведены профили связывания вирусов и лектинов с эпителиальными клетками кишечников ряда птиц.

Связывание лектинов и вирусов с эпителиальными клетками кишечников

птиц

Рис. 8. Связывание Maackia amurensis agglutinin (МАА), Sambucus nigra agglutinin (SNA), а так же вирусов утки dk/Bur, курицы ch/NJ и человека N1B/23/89M с клетками кишечников разных птиц.

Клетки уток плохо связывают ВГ курицы и практически не связывают ВГ человека, но очень хорошо связывают утиный вирус. В полном соответствии с работой Ito et al., (1998) клетки уток практически не связывают лектин SNA. Интересно то, что лектин МАА тоже плохо связываются с этими клетками. Очевидно, на клетках уток преобладают такие сиалил2-Згалактозные рецепторы, которые не связывают этот лектин. Это могут быть Siaa2-3Gal|31-3Glc/GalNAc - группировки которые хорошо связывают утиные вирусы, но не связывают МАА

(Knibbs и др, 1991). Кишечные эпителии куриных птиц хорошо связывают вирус ch/NJ, что указывает на наличие фукозилированных рецепторов Лектин МАА связывается с клетками куриных птиц существенно лучше, чем с клетками утиных, что указывает на наличие Siaa2-3Gaipi-4GIcNAc группировок.

Клетки куриных птиц, а так же куликов и цапли неплохо связывают лектин SNA и человеческий вирус гриппа

Таким образом, характерные отличия между клетками кишечников утки и курицы, описанные выше, повторяются на изученных нами представителях утиных и куриных птиц

Клетки кишечника чаек хорошо связывают как утиный вирус так и вирус ch/NJ; очень хорошо связывает лектин МАЛ и практически не связывают лектин SNA и ВГ человека Следовательно там обильно представлены 3'SLN и SiaLe* группировки, a 6'SLN группировки, по-видимому отсутствуют

Клетки лысухи, чемги и цапли очень хорошо связывают лектин МАЛ и очень плохо связывают ВГ В работе Knibbs (1991) показано, что лектин МАА неплохо связывается с Siaa2-3Gal(31-4GlcNAc/Glc -группировками, в которых сиаловая кислота модифицирована в области глицеринового остатка, либо присутствует в гликолильной форме Нельзя исключить, что на клетках вышеупомянутых птиц присутствуют подобные модифицированные по сиаловой кислоте формы 3'-сиалиллактозы

Лектины МАА и SNA часто используют как инструмент для исследования наличия рецепторов для вирусов гриппа на различных клетках мишенях (Couceiro и др, 1993, Ito и др., 1998, Feldmann и др, 2000) Наши данные свидетельствуют, что трактовать результаты, полученные с лектинами, надо с осторожностью, так как рецепторные детерминанты для лектина МАА и для птичьих вирусов могут не совпадать, хотя обе включают сиалил 2-Згалактозный остаток

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что различной рецепторной специфичностью обладают не только ВГ человека и ВГ птиц, но что вирусы разных птиц также могут иметь различный рецепторный фенотип. Можно описать несколько типов рецепторов вирусов гриппа Перед терминальной сиаловой кислотой могут находиться либо дисахариды Gaipi-3GalNAc, Galpl-3GicNAc (дисахариды первого типа), либо Gal(31-4GlcNAc (дисихарид второго типа) На базе дисахаридов первого типа построены ганглиозиды ганглио-ряда, дисахариды второго типа более характерны для гликопротеинов, хотя встречаются и в ганглиозидах Терминированные З'сиаловой кислотой дисахариды первого типа без дополнительных заместителей при третьем от конца звене (как в STF, SLec и ганглиозидах GMlb и GDla) лучше всего распознаются утиными вирусами гриппа (Рис 9)

Дисахарид второго типа входит в состав рецептора человеческих вирусов 6'SLN и ряда рецепторов птичьих вирусов на базе 3'SLN Многие птичьи вирусы адаптированы к 3'SLN с заместителями при глюкозаминовом кольце Все исследованные нами вирусы чаек адаптированы к фукозилированному 3 SLN - SLe* H5N1 вирусы кур обладают максимальным сродством к сульфатированному 3'SLN - Su-3'SLN Н7 вирусы кур, а так же «avian like» свиные вирусы адаптированы к 3'SLN с обоими заместителями - Su-SLex К этим же рецепторам адаптированы и лошадиные вирусы Все вышеупомянутые сиалосахаридные остатки широко представлены в живой природе

Изменение рецепторной специфичности вирусов гриппа при переходе от уток к новым хозяевам, очевидно, отражает состав сиалозидов на новых клетках мишенях По нашим данным клетки кишечников кур обогащены фукозилированными рецепторами, а куриной трахеи сульфатированными сиалосахарами Возможно не случайно то, что непатогенный куриный вирус ch/NJ адаптирован к фукозилированному SLex, а высокопатогенные H5N1

вирусы кур, которые поражают в первую очередь дыхательные пуги птицы, сульфатированному Зи-З'БЬЫ.

дисахарид 1 типа

люди, свиньи

чаики

дисахарид 2 типа

куры, свиньи, лошади

Рис 9 Оптимальные рецепторы для вирусов гриппа разных хозяев -сиалосахара на базе дисахарида первого типа (БЬе0) и дисахарида второго типа (б'БЬЫ, З^ЬЫ, БЬе*, Зи-З'БЬЫ)

Побочным следствием адаптации вируса к новому хозяину может быть повышение сродства к рецепторам, присутствующим в дыхательных путях млекопитающих и, в частности, человека ВГ таких хозяев могут иметь повышенный потенциал перехода к людям и должны быть предметом постоянного наблюдения.

ВЫВОДЫ

1) Впервые в мире показано, что рецепторная специфичность вирусов гриппа разных птиц различна.

2) Впервые в мире показано, что адаптация вирусов гриппа разных эволюционных линий к курам приводит к изменению рецепторной специфичности вируса У них повышается сродство к сульфатированным и фукозилированным рецепторам, в частности к Зи-З^ЬИ и к 8и-8Ьсх Многие из этих вирусов приобретают также частичное сродство к человеческому рецептору

3) Показано, что рецептор Би-З^ЬИ присутствует в дыхательном эпителии мартышки и, вполне вероятно, в дыхательном эпителии человека Адаптация к Би-З'БГЛЧ возможно способствует заражению человека

4) Показано, что человеческие изоляты Н5№ вирусов, несущие мутацию 227 аминокислоты в гемагглютинине, распознает человеческий рецептор Это лишний раз напоминает о риске возникновения пандемического варианта этих вирусов

5) Впервые в мире показано, что эволюция рецепторной специфичность вирусов гриппа в людях и в свиньях идет

параллельно - поначалу вирусы распознают как Siaa2-3Gal, так Siaa2-6Gal рецепторы, а затем только 6'SLN

6) Впервые в мире показано, что состав сиалосахаридных рецепторов на клетках мишенях разных птиц существенно отличается и вследствие этого рецепторная специфичность вирусов при переходе от первичных хозяев (диких уток) к чайкам и к курам меняется

7) Впервые в мире показано, что 6'SLN-ocTaTKH присутствуют на эпителиальных клетках не только у млекопитающих, но также и многих птиц, в частности куриных

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Гамбарян А.С , Ямникова С.С , Львов Д.К,, Робертсон Дж , Вебстер Р , Матросович М Н. (2002) Сравнение рецепторной специфичности вирусов гриппа А, выделенных от уток, кур и человека Молекулярная Биология, 36, 542-549

2 Маринина В П, А С Гамбарян, Н В Бовин, А Б Тузиков, А А Шилов, Б В Синицын, М Н. Матросович (2003), Влияние утраты сайтов гликозилирования, расположенных вблизи рецептор-связывающего участка, на рецепторные характеристики вируса гриппа человека субтипа H1N1 Молекулярнаяя биология, 37,1-6

3 Маринина В П, А С Гамбарян, А Б Тузиков, Г В Позынина, Н В Бовин, И Т Федякина, С С Ямникова, Д К Львов, М Н Матросович (2004) Эволюция рецепторной специфичности гемагглютинина вирусов гриппа при переходе от уток к свиньям и к людям Вопросы вирусологии 4, 25-30

4 Гамбарян А С, Маринина В П, Солодарь Т А , Бовин Н В , Тузиков А Б , Ямникова С С , Львов Д К , Климов А И, Матросович М Н (2006) Различная рецепторная специфичность вирусов гриппа уток и кур отражает отличия в составе сиалозидов на хозяйских клетках и муцинах Вопросы вирусологии 6, 135-143

5. Gambaryan, A S. and Matrosovich M.N., 1992 A solid-phase enzyme-hnked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virology Methods 39, 111-123

6 Gambaryan, A S., Piskarev, V E., Yamskov, I A., Tuzikov, A B., Bovm, N V , Nifant'ev, N.E , and M.N Matrosovich (1995) Human influenza virus recognition of sialyloligosaccharides. FEBS Letters 366, 57-60

7. Gambaryan, A S , Tuzikov, A B , Piskarev, V E, Yamnikova, S S., Lvov, D K, Robertson, J S , Bovm, N V, Matrosovich, M N. (1997) Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers non-egg-adapted human HI and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine) Virology 232,345-350.

8. Gambaryan A S , M N Matrosovich, C A Bender, and E D.Kilbourne (1998) Differences in the biological phenotype of low-yieldmg (L) and high-yielding (H) variants of swine influenza virus A/NJ/11/76 are associated with their different receptor-binding activity Virology 247, 223-231

9 Gambaryan, A S , Robertson, J S , and Matrosovich, M N (1999) Effects of egg-adaptation on the receptor-bmding properties of human influenza A and B viruses Virology 258, 232-239

10 Gambaryan, A., Webster, R , and Matrosovich, M (2002) Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken Arch Virol 147,1197-2008

11 Gambaryan, A.S, Tuzikov, A B, Bovm, N V, Yamnikova, S S, Lvov, D K, Webster, RG and Matrosovich, M N (2003) Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken and receptor specificity of the 1997 H5N1 chicken and human influenza viruses from Hong Kong Avian Dis. 47 (3 Suppl), 1154-1160

12 Gambaryan, A S, Tuzikov, A B, Pazynina, G V, Webster, R G, Matrosovich M N and Bovm N.V, 2004 H5N1 chicken influenza viruses display a high

binding affinity for Neu5Aca2-3Gaipi-4(6-HS03)GlcNAc -containing receptors Virology 326, 310-316

13 Gambaryan AS, Karasin AI, Tuzikov AB, Chmarev AA, Pazynina GV, Bovin NV, Matrosovich MN, Olsen CW, Klimov AI. (2005). Receptor-binding properties of swine influenza viruses isolated and propagated in MDCK cells Virus Res. 114 15-22

14 Gambaryan, A, Yamnikova, S , Lvov, D, Tuzikov, A, Chinarev, A, Pazynina, G, Webster, R, Matrosovich, M and Bovin, N (2005) Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain Virology 334, 276-283

15 Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, Bovin N, Balish A, Klimov A (2006) Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses Virology, 344,432-448

16. Yamnikova, S S., Gambaryan, A.S , Tuzikov, A B , Bovin, N.V , Matrosovich, M.N, Fedyakina, IT, Grmev, A A, Blinov, V M, Lvov, D K , Suarez, D L and Swayne, D E (2003) Differences between HA Receptor-Binding Sites of Avian Influenza Viruses Isolated from Landae and Anatidae Avian Diseases 47, (3 suppl ), 1164-116

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гамбарян, Александра Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна.

Практическая значимость.

Апробация работы.

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Строение вириона.

Патогенез.-.

Круг хозяев.

Вирусные рецепторы.

Сиаловая кислота.

Асналовая часть рецептора.

Ганглиозиды или сиалогликопротеины?.

Строение рецептор связывающего участка гемагглютиниа вирусов гриппа.

Рецепторные фенотипы вирусов гриппа птиц, свиней и людей.

Состав сиалосодержащих рецепторов на клетках мишенях птиц, свиней и человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Реактивы.

Вирусы.

Ткани.

Получение муцинов и эпителиальных клеток.

Выделение клеточных мембран.

Выделение ганглиозидов.

Тонкослойная хроматография ганглиозидов.

Определение сродства вирусов к рецепторным аналогам в растворе путем прямого связывания меченого аналога рецептора к иммобилизованным вирусам.

Определение рецепторной специфичности методом конкурентного ингибирования.

Определение сродства вирусов к тотальным сиалогликоконьюгатам клеточных мембран и к ганглиозидам.

Обработка сорбированных субстратов трипсином и нейраминидазой холерных вирионов.

Обработка клеточных мембран глюкозамин-6-О-сульфатазой.

Изучение связывания лектинов с клеточными мембранами и муцинами.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Изучение рецепторной специфичности вирусов гриппа с помощью полимеров, несущих рецепторные аналоги.

Изучение вирусов разных хозяев.

Рецепторная специфичность вирусов гриппа чаек.

Рецепторная специфичность вирусов гриппа свиней.

Сравнительное сродство вирусов свиней к клеткам мишеням утки, свиньи и мартышки.

Распознавание типа связи между сиаловой кислотой и галактозой(а2-3 vs. а2-6).

Распознавание Sia2-3Gal рецепторов с разным сахаридным кором.

Рецепторная специфичность Н5 вирусов.

Рецепторная специфичность вирусов других субтипов, адаптирующихся к домашней птице.

Рецепторная специфичность современных человеческих H3N2 вирусов.

Разработка метода оценки сродства вирусов к клеточным сиалозидам.

Связывание вирусов с ганглиозидами, отличающимися длиной сахаридной ножки.

Сравнение состава ганглиозидов в кишечниках курицы и утки.

Связывание вирусов с клеточными мембранами ряда клеток мишеней.

Выявление сульфатированных рецепторов на клетках мишенях.

Состав рецепторов для вирусов гриппа на клетках различных птиц.

Роль муцинов в формировании рецепторной специфичности вирусов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев.

Вирусы уток.

Вирусы чаек.

Вирусы кур.

Вирусы свиней.

Вирусы человека.

Молекулярные механизмы изменения рецепторной специфичности вирусов гриппа.

Первичный механизм - распознавание рецептора вирусами гриппа уток.

Реконструкция рецептор связывающего участка вирусов чаек и механизм распознавания SLex.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Природным резервуаром вирусов гриппа А являются дикие утки, у которых вирусы гриппа вызывают бессимптомную инфекцию в нижнем отделе кишечника. Эпизодически вирусы уток могут инфицировать других хозяев и иногда дают начало новым эволюционным ветвям вируса. Важнейшим элементом адаптации вируса к новому хозяину является настройка на новые рецепторные детерминанты в новом хозяине и, возможно, на новых клетках мишенях. Инфицирование вирусом гриппа начинается с прикрепления вириона к сиалосодержащим рецепторам на поверхности клетки. Вирусы адаптированы к рецепторам на клетках мишенях своего хозяина, следовательно, вирусы разных хозяев могут иметь разную рецепторную специфичность.

В работе была поставлена задача углубления существующих представлений о зависимости рецепторной специфичности вирусов гриппа от хозяйской принадлежности. Для оценки потенциальной опасности вирусов гриппа птиц с точки зрения возможности их перехода к человеку сравнивались вирусы гриппа разных хозяев: птиц, человека и домашних животных.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гамбарян, Александра Сергеевна

ВЫВОДЫ

1) Впервые в мире показано, что рецепторная специфичность вирусов гриппа разных птиц различна.

2) Впервые в мире- показано, что адаптация вирусов гриппа разных эволюционных линий к курам приводит к изменению рецепторной специфичности вируса. У них повышается сродство к сульфатированным и фукозилированным рецепторам, в частности к Su-3'SLN и к Su-SLex. Многие из этих вирусов приобретают также частичное сродство к человеческому рецептору.

3) Показано, что рецептор Su-3'SLN присутствует в дыхательном эпителии мартышки и, вполне вероятно, в дыхательном эпителии человека. Адаптация к Su-3'SLN, " возможно способствует заражению человека.

4) Показано, что человеческие изоляты H5N1 вирусов, несущие мутацию 227 аминокислоты в гемагглютинине, распознает человеческий рецептор. Это лишний раз напоминает о риске возникновения пандемического варианта этих вирусов

5) Впервые вмире показано, что эволюция рецепторной специфичность вирусов гриппа в людях и в свиньях идет параллельно - поначалу вирусы распознают как Siaa2-3Gal, так и Siaa2-6Gal рецепторы, а затем только 6Л SLN.

6) Впервые в мире, показано, что состав сиалосахаридных рецепторов на клетках-мишенях разных птиц существенно отличается и вследствие этого рецепторная специфичность вирусов при переходе от первичных хозяев (диких уток) к чайкам и к курам меняется

7) Впервые в мире показано, что 6"SLN-ocTaTKH присутствуют на эпителиальных клетках не только у млекопитающих, но также и многих птиц, в частности куриных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что различной рецепторной специфичностью обладают не только ВГ человека и ВГ птиц, но что вирусы разных птиц также могут иметь различный рецепторный фенотип. Можно описать несколько типов рецепторов вирусов гриппа. Перед терминальной сиаловой кислотой могут находиться либо дисахариды Gaipi-3GalNAc, Gal|31-3GlcNAc (дисахариды первого типа), либо Galpl-4GlcNAc (дис|гхарид второго типа). На базе дисахаридов первого типа построены ганглиозиды ганглио-ряда, дисахариды второго типа более характерны для гликопротеинов, хотя встречаются и в ганглиозидах. Терминированные 3'сиаловой кислотой дисахариды первого типа без дополнительных заместителей при третьем от конца звене (как в STF, SLec и ганглиозидах GMlb и GDI а) лучше всего распознаются утиными вирусами гриппа (Gambaryan at al., 2003, 2004) (Рис 25).

Дисахарид второго типа входит в состав рецептора человеческих вирусов 6"SLN и ряда рецепторов птичьих вирусов на базе 3'SLN. Многие птичьи вирусы адаптированы к 3'SLN с заместителями при глюкозаминовом кольце. Все исследованные нами вирусы чаек адаптированы к фукозилированному 3'SLN - SLex . H5N1 вирусы кур обладают максимальным сродством к сульфатированному 3"SLN - Su-3'SLN. Н7 вирусы кур, а так же «avian like» свиные вирусы адаптированы к 3"SLN с обоими заместителями - Su-SLex. К этим же рецепторам адаптированы и лошадиные вирусы. Все вышеупомянутые сиалосахаридные остатки широко представлены в живой природе.

Изменение рецепторной специфичности вирусов гриппа при переходе от уток к новым хозяевам, очевидно, отражает состав сиалозидов на новых клетках мишенях. По нашим данным клетки кишечников кур обогащены фукозилированными рецепторами, а куриной трахеи сульфатированными сиалосахарами. Возможно не случайно то, что непатогенный куриный вирус ch/NJ адаптирован к фукозилированному SLex, а высокопатогенные H5N1 вирусы кур, которые поражают в первую очередь дыхательные пути птицы, к сульфатированному Su-3,SLN. Побочным следствием адаптации вируса к новому хозяину может быть повышение сродства к рецепторам, присутствующим в дыхательных путях млекопитающих и, в частности, человека. ВГ таких хозяев могут иметь повышенный потенциал перехода к людям и должны быть предметом постоянного наблюдения. дисахарид 1 типа люди, свиньи JLJW чайки дисахарид 2типа

Su-3'SLN куры, свиньи, лошади

Рис. 25. Оптимальные рецепторы для вирусов гриппа разных хозяев -сиалосахара на базе дисахарида первого типа (SLec) и дисахарида второго типа(6SLN, 3"SLN, SLex, Su-3'SLN).

Исследования последних лет вынудили подвергнуть ревизии некоторые положения, сформулированные ранее и выдвинуть новую парадигму:

• Птицы не являются единообразными хозяевами вирусов гриппа. Составы сиалосахаридных рецепторов на клетках мишенях разных птиц существенно различаются и вследствие этого рецепторная специфичность вирусов при переходе от первичных хозяев (диких уток) к чайкам и к курам меняется (Yamnikova et al., 2003; Gambaryan et ah, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007).

• Siaa2-6Gal-ocraTKH присутствуют на эпителиальных клетках не только у млекопитающих, но также и у многих птиц, в частности куриных. (Gambaryan et al., 2002, 2003, Гамбарян и др 2002, 2006; Wan and Perez, 2006; Guo и др, 2007).

• При адаптации вирусов гриппа к домашней птице у них повышается сродство к фукозилированным и сульфатированным рецепторам, в частности к Su-SLex. Адаптация к Su-SLex сопряжена с заменами в области 190 и 222 - 228 аминокислот гемагглютинина. Такие замены могут повышать сродство вирусов не только к Su-SLex, но и к человеческому рецептору 6"SLN (Gambaryan et al., 2005a, б, 2007).

• Нет принципиальной разиицы в содержании Siaa2-3Gal и Siaa2-6Gal рецепторов в дыхательных путях человека и свиней. Как у свиней, так и у людей содержаться оба типа рецепторов «^рецепторо^ (Ito и др 1998b; Matrosovich и др. 2004; Thompson et al., 2006; Kogure et al., 2006; Ibricevic et al., 2006). И в людях и в свиньях успешно размножаются как вирусы со строгой 6"SLN специфичностью, так и H5N1 вирусы со строгой Siaa2-3Gal специфичностью (Choi и др. 2005). Эволюция рецепторной специфичности вирусов гриппа в людях и в свиньях идет параллельно - поначалу вирусы распознают оба типа рецепторов, а затем только 6XSLN (Gambaryan et al., 2005b). В свете современных представлений трансмиссия птичьих вирусов к людям может произойти без участия свиньи, как промежуточного хозяина. Реассортация вирусного генома возможна в людях, так же как и в свиньях (Kristen, 2007).

• 6" SLN-рецепторная специфичность вирусов резко повышает их урожайность в дыхательных путях человека. Возможно, поражение клеток верхних дыхательных путей провоцирует чихание, которое обеспечивает наиболее эффективную воздушно-капельную передачу вируса (Nishimura et al., 2007).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гамбарян, Александра Сергеевна, Москва

1. Alexander, D.J. (1986). Avian Influenza Historical Aspects. Paper presented at: Second International Symposium on Avian Influenza (Georgia Center for Continuing Education, The University of Georgia, Athens, Georgia, USA).

2. Alexander, D. J. (2000). A review of avian influenza in different bird species. Vet.Microbiol. 74, 3-13.

3. Altmuller A., Kunerl M., Muller K., Hinshaw V.S., Fitch W.M. and Scholtissek C., 1992. Genetic relatedness of the nucleoprotein (NP) of recent swine, turkey, and human influenza A virus (H1N1) isolates. Virus Res. 22, 79-87.

4. Anders, E.M., Scalzo, A.A., Rogers, G.N., and White, D.O. (1986) Relationship between mitogenic activity of influenza viruses and the receptor-binding specificity of their hemagglutinin molecules. J Virol. 60. 476-482.

5. Atanasova K, A De Vleeschauwer, F ВагЬй, К Van Reeth (2007) Detailed Pathogenesis of Swine Influenza Virus in the Natural Host. Options for the Control of Influenza VI, Toronto, Ontario Canada. Abstract 096

6. Azzeh, M., Flick, R., and Hobom, G. (2001). Functional analysis of the influenza A virus cRNA promoter and construction of an ambisense transcription system. Virology 289, 400-410.

7. Baum, L.G. and Paulson J.C., 1990. Sialyloligosaccharides of the respiratory epithelium in the selection of human influenza virus receptor specificity. Acta Histochem. Suppl. 40, 35-38.

8. Beare AS, Kendal AP, Craig JW. (1980) Further studies in man of HswlNl influenza viruses. J Med Virol 5, 33-38.

9. Bergelson, L.D., Bukrinskaya, A.G., Prokazova, N.V., Shaposhnikova, G.I., Kocharov, S.L., Shevchenko, V.P., Kornilaeva, G.V., and Fomina-Ageeva, E.V. (1982). Role of gangliosides in reception of influenza virus. EurJBiochem 128, 467-474.

10. Bikour, M.H., Frost, E.H., Deslandes,S., Talbot, R., Weber J.M., Elazhary Y. (1995) Recent H3N2 swine influenza virus with haemagglutinin and nucleoprotein genes similar to 1975 human strains. J.Gen.Virol.,, 76, 697703

11. Bovin N.V, M.N.Matrosovich, A.B.Tuzikov, A.A.Chinarev, A.S.Gambaryan, and J.S.Robertson. Glycoconjugates as inhibitors of virus attachment to cells. German patent No 19640791.5 (1996).

12. Bovin N.V, N.E.Byramova, A.B.Tuzikov, M.N.Matrosovich, L.V.Mochalova, and A.S.Gambaryan. Viral attachment inhibitors. US Patent No 5,571,836 (1996)

13. Bovin, N.V., Korchagina, E.Yu., Zemlyanukhina, T.V., Byramova, N.E., Galanina, O.E., Zemlyakov, A.E., Ivanov, A.E., Zubov, V.P., and

14. Mochalova, L.V. (1993). Synthesis of polymeric neoglycoconjugates based on N-substituted polyacrylamides. Glycoconj. J. 10, 142-151.

15. Brown I.H. (2000) The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs. Vet Microbiol, 74, 29-46

16. Byramova N.E., L.V.Mochalova, I.M.Belyanchikov, M.N.Matrosovich, and N.V.Bovin. (1991). Synthesis of sialic acid pseudopolysaccharides by coupling of spacer-connected Neu5Ac with activated polymer. Journal of Carbohydrate Chemistry 10, 691-700.

17. Carroll, S.M., Higa, H.H, and Paulson, J.C. (1981). Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J.Biol.Chem. 256, 8357-8363.

18. Chambers, T.M., Yamnikova, S.S., Kawaoka, Y., Lvov, D.K., and Webster, R.G. (1989). Antigenic and molecular characterization of subtype H13 hemagglutinin of influenza virus. Virology 172, 180-188.

19. Chen J, Anderson JB, DeWeese-Scott C, Fedorova ND, Geer LY, He S, Hurwitz DI , Jackson JD, Jacobs AR, Lanczycki CJ, Liebert CA, Liu C, Madej T, Marchler-Baue r A, Marchler GH, Mazumder R, Nikolskaya AN,

20. Rao BS, Panchenko AR, Shoemaker BA, Simonyan V, Song JS, Thiessen PA, Vasudevan S, Wang Y, Yamashita RA, Yin JJ, Biyant SH, (2003) "MMDB: Entrez's 3D-structure database", Nucleic Acids Res. 31 474-477.

21. Choi, Y. К., H. Ozaki, R. J. Webby, R. G. Webster, J. S. Peiris, L. Poon, C. Butt, Y. H. Leung, and Y. Guan. (2004 a). Continuing evolution of H9N2 influenza viruses in southeastern China. J. Virol. 78. 8609-8614.

22. Choi, Y.K., Lee, J.H., Erickson, G., Goyal, S.M., Joo, H.S., Webster, R.G. and Webby R.J., (2004 b). H3N2 influenza vims transmission from swine to turkeys, United States. Emerging Infectious Diseases. 10,2156-2160.

23. Claas, E. C. J., Y. Kawaoka, J. C. De Jong, N. Masurel, and R. G. Webster. (1994). Infection of children with avian-human reassortant influenza virus from pigs in Europe. Virology , 204, 453-457

24. Clavijo, A., Tresnan, D.B., Jolie, R. and Zhou E-M., (2002). Comparison of embryonated chicken eggs with MDCK cell culture for the isolation of swine influenza virus. Can J Vet Res. 66, 117-121

25. Connor, R.J., Kawaoka, Y., Webster, R.G., and Paulson, J.C. (1994). Receptor specificity in human, avian, and equine H2 and H3 influenza virus isolates. Virology 205, 17-23

26. Cox, N.J., and Subbarao, K. (2000). Global epidemiology of influenza: past and present. AnnuRevMed 51, 407-421.

27. Eisen, M.B., Sabesan, S., Skehel,J.J., Wiley, D.C. (1997). Binding of the influenza A virusto cell-surface receptors: structures of five hemagglutinin-sialyloligosacchride complexes determined by X-ray crystallography. Virology 232,19-31.

28. Fechter, P., Mingay, L., Sharps, J., Chambers, A., Fodor, E., and Brownlee, G.G. (2003). Two aromatic residues in the PB2 subunit of influenza A RNA polymerase are crucial for cap binding. JBiolChem 278, 20381-20388

29. Feldmann A, Schafer MK, Garten W, Klenk H-D (2000) Targeted infection of endothelial cells by avian influenza virus A/FPV/Rostock/34 (H7N1) in chicken embiyos. J Virol 74: 8018-8027.

30. Folch, J., Lees, M. and Sloane-Stanley, G.H. (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry 226, 497-509

31. Gambaryan, A.S. and Matrosovich M.N., 1992. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J. Virology. Methods 39, 111-123.

32. Gambaryan, A.S., Piskarev, V.E., Yamskov, I.A., Tuzikov, A.B., Bovin, N.V., Nifanf ev, N.E., and M.N.Matrosovich. (1995). Human influenza virus recognition of sialyloligosaccharides. FEBS Letters 366, 57-60

33. Gambaryan, A. S., Robertson, J. S., and Matrosovich, M. N. (1999) Effects of egg-adaptation on the receptor-binding properties of human influenza A and В viruses. Virology 258, 232-239.

34. Gambaryan, A., Webster, R., and Matrosovich, M. (2002). Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken. Arch. Virol. 147, 1197-208.

35. Gambaryan AS, Tuzikov AB, Chinarev AA, Juneja LR, Bovin NV, Matrosovich MN. (2002). Polymeric inhibitor of influenza virus attachment protects mice from experimental influenza infection. Antiviral Res 55, 201-205

36. Gambaryan, A.S, Tuzikov, A.B, Pazynina , G.V, Webster, R.G, Matrosovich M.N and Bovin N.V., 2004. H5N1 chicken influenza viruses display a high binding affinity for Neu5Aca2-3Gal(31-4(6-HS03)GlcNAc -containing receptors. Virology 326, 310-316.

37. Gambaryan AS, Karasin Al, Tuzikov AB, Chinarev AA, Pazynina GV, Bovin NV, Matrosovich MN, Olsen CW, Klimov Al. (2005b). Receptor-binding properties of swine influenza viruses isolated and propagated in MDCK cells. Virus Res. 114. 15-22.

38. Gambaryan AS, Boravleva EY, Matrosovich TY, Matrosovich MN, Klenk HD, Moiseeva EV, Tuzikov AB, Chinarev AA, Pazynina GV, Bovin NV. (2005c). Polymer-bound 6' sialyl-N-acetyllactosamine protects mice infected by influenza virus. Antiviral Res. 68,116-123

39. Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, Bovin N, Balish A, Klimov A.2006) Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology, 344, 432-448.

40. Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G., Bovin N., Desheva J. Klimov A.2007). Receptor binding phenotypes of nonhuman influenza viruses from different hosts. In press

41. Garcia-Sastre A., Egorov A., Matassov D. et al. (1998) Influenza A virus lacking the NSI gene replicates in interferon-deficient systems Virology. 252. 324-330.

42. Gordeeva E. A., Tuzikov А. В., Galanina О. E., Pochechueva Т. V., Bovin N. V. (2000). Microscale synthesis of glycoconjugate series and libraries. Analyt. Biochem., 278, 230-232/

43. Guan Y, Shortridge KF, Krauss S, Li PH, Kawaoka Y, Webster RG. (1996). Emergence of avian H1N1 influenza viruses in pigs in China. J. Virol. 70 8041-8046.

44. Guan, Y., Poon, L.L., Cheung, C.Y., Ellis, T.M., Lim, W., Lipatov, A.S., Chan, K.H., Sturm-Ramirez, K.M., Cheung, C.L., Leung, Y.H., Yuen, K.Y.,

45. Webster, R.G., Peiris, J.S., (2004). H5N1 influenza: a protean pandemic threat. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8156-8161.

46. Ha, Y., Stevens, D.I., Skehel, J.J. and Wiley, D.C. (2001). X-ray structures of H5 Avian and H9 swine hemagglutinins biund to avian and human receptor analogs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11181-11186.

47. На, Y., Stevens, D.I., Skehel, J.J., Wiley. D.C. (2003). X-ray structure of the hemagglutinin of a potential H3 avian progenitor of the 1968 Hong Kong pandemic influenza virus. Virology. 309,209-224.

48. Hakomory S. Chemistry of glycosphingolipids. In "Sphingolipid Biochemistry" Eds. Kanfer J.N., Hakomory S., New York; Plenum, 1983. V. 3. P. 1-165.

49. Herrler, G., and Klenk, H.D. (1987). The surface receptor is a major determinant of the cell tropism of influenza С virus. Virology 159, 102-108

50. Herrler, G., Hausmann, J., and Klenk, H.D. (1995). Sialic acid as receptor determinant of ortho- and paramyxoviruses. In: "Biology of the sialic acids" (A.Rosenberg, Ed.), p.315-336, Plenum Press, New York,

51. Ito, T. and Kawaoka, Y. (1998a). Avian influenza. In, Textbook of influenza. K. G. Nicholson, R. G. Webster, and A. J. Hay, eds. Blackwell Science, London, pp. 126-136.

52. Kanegae Y, Sugita S, Shortridge KF, Yoshioka Y, Nerome K. (1994) Origin and evolutionary pathways of the HI hemagglutinin gene of avian, swine and human influenza viruses: cocirculation of two distinct lineages of swine virus. Arch Virol, 134, 17-28.

53. Karasin Al, Brown IH, Carman S, Olsen CW. (2000c) Isolation and characterization of H4N6 avian influenza viruses from pigs with pneumonia in Canada. J. Virol. 74 9322-9327

54. Karasin, A. I., West, K., Carman, S. and Olsen, C. W., (2004). Characterization of avian H3N3 and HlNl influenza A viruses isolated from pigs in Canada. J. Clin. Microbiol. 42,4349-4354.

55. Karasin, A.I., Anderson, G. and Olsen C.W., (2000a). Genetic characterization of an HIN2 influenza virus isolated from a pig in Indiana. J. Clin. Microbiol. 38,2453-2456.

56. Kida H, Ito T, Yasuda J, Shimizu Y, Itakura C, Shortridge KF, Kawaoka Y, Webster RG. (1994) Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs. J Gen Virol., 75, 2183-2188.

57. Kida H, Shortridge KF, Webster RG. (1988) Origin of the hemagglutinin gene of H3N2 influenza viruses from pigs in China Virology, 162, 160166.

58. Kimura K, Adlakha A, Simon PM. (1998) Fatal case of swine influenza virus in an immunocompetent host. Mayo Clin Proc, 73, 243-245.

59. Klenk HD, Matrosovich M, Stech J. (2007) Avian Influenza Molecular Mechanisms of Pathogenesis and Host Range. In "Molecular Biology of Animal Viruses" (T. Mettenleiter and F. Sabrino, Eds.)

60. Koscielak J. (1963) Blood group A specific glycolipids from human erythrocytes Biochem. Biophys. Acta. 78. 313-328.

61. Kristen V. R. (2007) Avian and swine influenza viruses: our current understanding of the zoonotic risk. Vet. Res. 38, 243-260.

62. Lee M.S., Chang P.C., Shien J.H., Cheng M.C., Chen C.L., Shieh H.K. (2006). Genetic and pathogenic characterization of H6N1 avian influenza viruses isolated in Taiwan between 1972 and 2005. Avian Dis. 50. 561571.

63. Li, С., K. Yu, G. Tian, D. Yu, L. Liu, B. Jing, J. Ping, and H. Chen. (2005). Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China. Virology 340:70-83

64. Lipkind, M, Weisman, Y. and Shihmanter E., (1984). Isolation of viruses antigenically related to the swine influenza virus from an outbreak of respiratory disease in turkey farms in Israel. Vet Rec. 28, 426-428.

65. Ludwig, S., L. Stitz, O. Planz, H. Van, W. M. Fitch, and C. Scholtissek. (1995) European swine virus as a possible source for the next influenza pandemic? Virology. 212, 555-561

66. Lupita Т., Roberts K., Shelton H.,Thompson C., Hennessey M., Pickles R., Jones la., Barclay W. (2007) The Genetic and Cellular Basis of Host Range Restriction Due to HA Receptor Binding. Options for the Control of Influenza VI,Toronto. Abstract P1224

67. Matrosovich M.N., Gambaryan A.S., Reizin F.N., Chumakov M.P.(1991) Recognition by human A and В influenza viruses of 8- and 7-carbon analogs of sialic acid modified in the polyhydroxyl side chain. Virology, 182, 879-882.

68. Matrosovich M.N., Gambaryan A.S., Chumakov M.P. (1992) Influenza viruses differ in recognition of 4-O-acetyl substitution of sialic acid receptor determinant. Virology, 188, 854-858.

69. Matrosovich, M., Gao, P. and Kawaoka, Y. (1998). Molecular mechanisms of serum resistance of human influenza H3N2 virus and their involvement in virus adaptation in a new host. J. Virol. 72, 6373-6380

70. Matrosovich, M.N., Zhau, N., Kawaoka, Y. and Webster, R. (1999). The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans,chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties. J. Virol. 73, 1146-1155.

71. Matrosovich, M., Krauss, S. and Webster R. (2001) H9N2 influenza A viruses from poultry in Asia have human-virus-like receptor specificity. Virology 281, 156-162.

72. Matrosovich, M., Matrosovich, Т., Carr, J., Roberts, N. A., and Klenk, H. -D. (2003). Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425.

73. Matrosovich, M.N., Matrosovich, T.Y., Gray Т., Roberts N.A., Klenk H.D. (2004a) Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 4620-4624.

74. Matrosovich MN, Matrosovich TY, Gray T, Roberts NA, Klenk HD. (2004b) Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epithelium. J Virol. 78, 12665-12667.

75. Matrosovich M.N., Klenk H-D, Kawaoka Y. 2005. Receptor specificity, host-range, and pathogenicity of influenza viruses. In Kawaoka, Y. (Ed.), Influenza virology. Current topics. Caister Academic Press.

76. Matrosovich M, Suzuki T, Hirabayashi Y, Garten W, Webster RG, Klenk HD. (2006) Gangliosides are not essential for influenza virus infection. Glycoconj J. 23, 107-113.

77. Matrosovich M, Matrosovich T, Uhlendorff J, Garten W, Klenk HD. (2007). Avian-virus-like receptor specificity of the hemagglutinin impedesinfluenza virus replication in cultures of human airway epithelium Virology. 361. 384-390

78. Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J.-C., and van der Werf , S. (2001). Hemagglutinin residues of recent human A (H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology 289, 74-85

79. Medeiros, R., Naffakh, N., Manuguerra J.C. and van der Werf S. (2004) Binding of the hemagglutinin from human or equine influenza H3 viruses to the receptor is altered by substitutions at residue 193. Arch Virol., 149, 1663-1671.

80. Muller I, Jaureguiberry B, Valenzuela PD. (2005) Isolation, sequencing and phylogenetic analysis of the hemagglutinin, neuraminidase and nucleoprotein genes of the Chilean equine influenza virus subtypes H7N7 and H3N8. Biol Res., 38. 55-67

81. Naeve, C. W., Hinshaw, V. S., and Webster, R. G. (1984). Mutations in the hemagglutinin receptor-binding site can change the biological properties of an influenza virus. Journal of Virology 51, 567-569.

82. Narayan, O., Thorsen, J., Hulland, T.J., Ankeli, G., and Joseph, P.G. (1972). Pathogenesis of lethal influenza virus infection in turkeys. I. Extraneural phase of infection. J Comp Pathol 82, 129-137.

83. Neumann G, Hughes MT, Kawaoka Y. (2000). Influenza A virus NS2 protein mediates vRNP nuclear export through NES-independent interaction with hCRMl. EMBO J. 19. 6751 -6758

84. Neumann G, Kawaoka Y. (2006) Host range restriction and pathogenicity in the context of influenza pandemic. Emerg Infect Dis. 12, 881-886.

85. Newby CM, Rowe RK, Pekosz A. (2006). Influenza A virus infection of primary differentiated airway epithelial cell cultures derived from Syrian golden hamsters. Virology. 354. 80-90

86. Ng, К. K. and Weis, W. I. (1997). Structure of a selectin-like mutant of mannose-binding protein complexed with sialylated and sulfated Lewisx oligosaccharides. Biochemistry 36, 979-988

87. Nicholls J., Chan W.Y., Chan M.C.W., Peiris J.S.M. (2007) The Use of ex-vivo Tissues for Infection by Pathogenic and Non-pathogenic Influenza Viruses. Options for the Control of Influenza VI,Toronto. Abstract PI 205

88. Nishimura H, Omiya S, Yamada K, Kamimura Y, Sakata S (2007) Analyses on Aerosol Particles From Sneezing and the Viability of Influenza Virus in the Air-Born Particles. Options for the Control of Influenza VI,Toronto. Abstract PI223

89. Noah, D.L., and Krug, R.M. (2005). Influenza virus virulence and its molecular determinants. Adv Virus Res 65, 121-145.

90. Nobusawa, E., Aoyama, Т., Kato, H., Suzuki, Y., Tateno, Y. and Nakajima, K., (1991). Comparison of complete amino acid sequences and receptor-binding properties among 13 serotypes of hemagglutinins of influenza A viruses. Virology 182,475-485.

91. O'Brien, T.C., and Tauraso, N.M. (1973). Antibodies to type A influenza viruses in sera from nonhuman primates. Archiv fur die gesamte Virusforschung 40, 359-365.

92. OIE (2003). Manual standards for diagnostic tests and vaccines, 2000. (Paris, Office International de Epizooties.)

93. Olsen, C. W. (1997). Influenza in pigs and their role as the intermediate host. (In K. G. Nicholoson, R. G. Webster, A. J. Hay, and N. C. Cox ed.), Textbook of influenza, 2nd ed., in press. Blackwell Science, Oxford, United Kingdom.

94. Olsen, C. W., (2002). The emergence of novel swine influenza viruses in North America. Virus Res. 85, 199-210.

95. Olsen, C. W., Carey, S., Hinshaw, L. and Karasin, A. I., (2000). Virologic and serologic surveillance for human, swine and avian influenza virus infections among pigs in the north-central United States. Arch. Virol. 145, 1399-1419.

96. Ovchinnikova T.V., Shipova E.V., Sablina M.A., Pazynina G.A., Popova I.S., Tuzikov A.B., Bovin N.V. (2002). Synthesis of monosulfated saccharides in the spacered form. Mendeleev Communs., 12, 213-215.

97. Paulson, J.C., (1985). Interaction of animal viruses with cell surface receptors. In: Corn, M. (Ed.), The Receptors, Academic Press, Orlando, vol.2, 131-219.

98. Pazynina, G.V., Sablina, M.A., Tuzikov, A.B., Chinarev, A.A. and Bovin, N.V. (2003). Synthesis of complex a2-3 sialooligosaccharides, including sulfated and fucosylated ones, using Neu5Aca2-3Gal as a building block. Mendeleev Communs. 13,245-248.

99. Peiris, M., Yuen, K.Y., Leung, C.W., Chan, K.H., Ip, P.L., Lai, R.W., Orr, W.K., and Shortridge, K.F. (1999). Human infection with influenza H9N2. Lancet 354, 916-917.

100. Pritchett, T.J., Brossmer, R, Rose, U., Paulson, J.C. (1987). Recognition of monovalent sialosides by influenza virus H3 hemagglutinin. Virology 160, 502-506.

101. Raymond, F.L., Caton, A.J., Cox, N.J., Kendal, A.P., and Brownlee (1986). The antigenicity and evolution of influenza HI hemagglutinin from 1950-1957 and 1977-1983. Two pathways from one gene. Virology 148, 275-287.

102. Reid, A. H. (2003). 1918 influenza pandemic caused by highly conserved viruses with two receptor-binding variants. Emerg. Infect. Dis. 9, 12491253.

103. Reid, A.H., Fanning, T.G., Hultin, J.V. and Taubenberger, J.K., (1999). Origin and evolution of the 1918 "Spanish" influenza virus hemagglutinin gene. Proc Natl Acad Sci U S A 96,1651-1656.

104. Rimmelzwaan GF, de Jong JC, Bestebroer TM, van Loon AM, Claas EC, Fouchier RA, Osterhaus AD. (2001) Antigenic and genetic characterization of swine influenza A (H1N1) viruses isolated from pneumonia patients in The Netherlands. Virology, 282, 301-306

105. Roehm, C., Horimoto, Т., Kawaoka, Y., Suss, J., and Webster, R.G. (1995). Do hemagglutinin genes of highly pathogenic avian influenza viruses constitute unique phylogenetic lineages? Virology 209, 664-670.

106. Rogers, G.N. and D'Souza, B.L., (1989). Receptor-binding properties of human and animal HI influenza virus isolates. Virology 173, 317-322.

107. Rogers, G.N. and Paulson, J.C., (1983). Receptor determinants of human and animal influenza vims isolates: defferences in receptor specificity of the H3 hamagglutinin based on species of origin. Virology, 127, 361-373.

108. Russell RJ, Gamblin SJ, Haire LF, Stevens DJ, Xiao В, Ha Y, Skehel JJ. (2004) HI and H7 influenza haemagglutinin structures extend a structural classification of haemagglutinin subtypes. Virology. 325. 287-296

109. Saito T, Lim W, Suzuki T, Suzuki Y, Kida H, Nishimura SI, Tashiro M. (2001) Characterization of a human H9N2 influenza virus isolated in Hong Kong.1. Vaccine. 20, 125-133.

110. Schaefer, J.R., Kawaoka, Y., Bean, W.J., Suss, J., Senne, D., and Webster, R. (1993). Origin of the pandemic 1957 H2 influenza virus and the persistence of its possible progenitors in the avian reservoir. Virology 194, 781-788.

111. Scholtissek C. (1994) Source for influenza pandemics. Eur J Epidemiol, 10,455-458.

112. Scholtissek C., Hinshaw V., Olsen C.W. (1997) Influenza in Pigs and their role as the intermediate host. In: Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ (eds) Textbook of Influenza. Blackwell Science, London,, pp 137-145

113. Schultz, U., Fitch, W.M., Ludwig, S., Mandler, J., and Scholtissek, C. (1991). Evolution of pig influenza viruses. Virology 183, 61-73.

114. Shilova, N.V., Galanina, O.E., Pochechueva, T.V., Chinarev A.A., Kadykov V.A., Tuzikov A.B., Bovin N.V., (2005). High molecular weight neoglycoconjugates for solid phase assays. Glycoconj. J. 22, 43-51.

115. Shinya K., Ebina M., Yamada S., Ono M., Kasai N., Kawaoka Y. (2006). Influenza virus receptors in the human airway. Nature 440. 435

116. Skehel, J.J. (1971). RNA-dependent RNA polymerase activity of the influenza virus. Virology 45, 793-796.

117. Skehel, J.J., and Hay, A.J. (1978). Nucleotide sequences at the 5' termini of influenza virus RNAs and their transcripts. Nucleic Acids Res 5, 12071219.

118. Skehel, J.J., and Wiley, D.C. (2000). Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual Review of Biochemistry 69, 531 -569.

119. Stech J., Xiong X., Scholtissek C., Webster R.G. (1999) Independence of Evolutionary and Mutational Rates after Transmission of Avian Influenza Viruses to Swine. Journal of Virology, 73, 1878-1884.

120. Steinhauer, D.A. (1999). Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology 258, 1-20.

121. Stevens J, Blixt O, Glaser L, Taubenberger JK, Palese P, Paulson JC, Wilson IA. (2006). Glycan microarray analysis of the hemagglutinins from modern and pandemic influenza viruses reveals different receptor specificities. J Mol Biol. 355,1143-1155.

122. Stieneke-Groeber, A., Vey, M., Angliker, H., Shaw, E., Thomas, G., Roberts, C., Klenk, H.D., and Garten, W. (1992). Influenza virus

123. Suarez, D.L. (2000). Evolution of avian influenza viruses. Vet. Microbiol. 74, 15-27.

124. Suarez, D.L., M.L. Perdue, N. Cox, T. Rowe, C. Bender, J. Huang, and D.E. Swayne. (1998) Comparison of highly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong Kong. J. Virol. 72, 6678-6688.

125. Suarez, D.L., Woolcock, P.R., Bermudez, A.J. and Senne D.A., (2002). Isolation from turkey breeder hens of a reassortant H1N2 influenza virus with swine, human, and avian lineage genes. Avian Dis. 46,111-121.

126. Subbarao, K., Swayne, D.E., and Olsen, C.W. (2006). Epidemiology and control of human and animal viruses. In Influenza Virology, Current Topics, Y. Kawaoka, ed. (Norfolk, UK, Caister Academic Press), pp. 229279.

127. Suzuki Y. 2001. Host mediated variation and receptor binding specificity of influenza viruses. Adv Exp Med Biol. 491, 445-451.

128. Suzuki, Y. (1994). Gangliosides as influenza virus receptors. Variation of influenza viruses and their recognition of the receptor sialo-sugar chains. ProgrLipid Res 33, 429-457.

129. Suzuki, Y., Ito, Т., Suzuki, Т., Holland, R.E., Jr., Chambers, T.M., Kiso, M., Ishida, H., and Kawaoka, Y. (2000). Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses. JVirol 74, 1182511831.

130. Svennerholm L. (1957). Quantitative estimation of sialic acids II. A calorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochimica et Biophisica Acta 24, 604-611

131. Tamura S., Tanimoto T. and Kurata T. (2005) Mechanisms of Broad Cross-Protection Provided by Influenza Virus Infection and Their Application to Vaccines. Jpn. J. Infect. Dis., 58,195-207.

132. Taubenberger, J.K., Reid, A.H., Krafft, A.E., Bijwaard, K.E., and Fanning, T.G. (1997). Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus. Science 275,1793-1796.

133. Taylor, J.M., Illmensee, R., Litwin, S., Herring, L., Broni, В., and Krug, R.M. (1977). Use of specific radioactive probes to study transcription and replication of the influenza virus genome. J Virol 21, 530-540.

134. Thompson CI, Barclay WS, Zambon MC, Pickles RJ.( 2006) Infection of human airway epithelium by human and avian strains of influenza a virus. J Virol. 80, 8060-806

135. Tuzikov A.B., N.E.Byramova, N.V.Bovin, A.S.Gambaryan, and M.N.Matrosovich. (1997) Monovalent and polymeric 5N-thioacetamido sialosides as tightly-bound receptor analogs of influenza virus. Antiviral Research 33, 129-134

136. Uiprasertkul M., Puthavathana P., SangsiriwutK., PoorukP., Srisook K., Peiris M., Nicholls J.M., Chokephaibulkit K., Vanprapar N., Auewarakul P. (2005) Influenza A H5N1 Replication Sites in Humans. Emerging Infectious Diseases 11,1036-1041.

137. Ulmanen, I., Broni, B.A., and Krug, R.M. (1981). Role of two of the influenza vims core P proteins in recognizing cap 1 structures (m7GpppNm) on RNAs and in initiating viral RNA transcription. Proc Natl Acad Sci USA 78, 7355-7359.

138. Van Campen, H., Easterday, B.C., and Hinshaw, V.S. (1989a). Destruction of lymphocytes by a virulent avian influenza A virus. J Gen Virol 70 (Pt 2), 467-472.

139. Van Campen, H., Easterday, B.C., and Hinshaw, V.S. (1989b). Virulent avian influenza A viruses: their effect on avian lymphocytes and macrophages in vivo and in vitro. J Gen Virol 70 ( Pt 11), 2887-2895.

140. Van Reeth К, Van Gucht S, Pensaert M. (2003) Investigations of the efficacy of European H1N1- and H3N2-based swine influenza vaccines against the novel H1N2 subtype. Vet Rec. 153. 9-13

141. Varki, A. (1997). Sialic acids as ligands in recognition phenomena. FASEB Journal 11, 248-255.

142. Vines, A., Wells, K., Matrosovich, M., Castrucci, M. R., Ito, Т., and Kawaoka, Y. (1998). The role of influenza A virus hemagglutinin residues 226 and 228 in receptor specificity and host range restriction. J.Virology 72,7626-7631.

143. Wan H, Perez DR. (2006) Quail carry sialic acid receptors compatible with binding of avian and human influenza viruses. Virology. 346, 278286.

144. Wan H., Chen L-M., Donis R., Perez D.R. (2007) Amino Acid 226 in the Hemagglutinin of H9N2 Influenza Viruses Determines Cell Tropism and Replication in Human Airway Epithelial Cells. Options for the Control of Influenza VI,Toronto. Abstract 094

145. Webster, R. G. and Bean, W. J. (1998). Evolution and ecology of influenza viruses: interspecies transmission. In Textbook of Influenza, pp. 109-119. Edited by K. G. Nicholson, R. G. Webster, and A. J. Hay. Blackwell Science, London

146. Webster, R.G., Bean, W.J., Gorman, O.T., Chambers, T.M. and Kawaoka, Y. (1992). Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiological Reviews 56, 152-179.

147. Webster, R.G., Yakhno, M., Hinshaw, V.S., Bean, W.J., and Murti, K.G. (1978). Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks. Virology 84, 268-278.

148. Weis,W., Brown,J.H., Cusack,S., Paulson,J.C., Skehel,J.J., and Wiley,D.C. (1988) Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid. Natur. 333, 426-431.

149. Wiley, D.C. and Skehel, J.J. (1987). The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Ann.Rev.Biochem. 56, 365-394.

150. Wright, S.M., Kawaoka, Y., Sharp, G.B., Senne ,D.A. and Webster, R.G. (1992). Interspecies transmission and reassortment of influenza A viruses in pigs and turkeys in the United States. Am J Epidemiol. 136, 488-497.

151. Yao, K., Ubuka, Т., Masuoka, N., Kinuta, M., Ikeda, Т., (1989). Direct determination of bound sialic acids in sialoglycoproteins by acidic ninhidrin reaction. Anal. Biochem. 179, 332-335.

152. Yu H., Zhang G.H., Hua R.H., Zhang Q., Liu T.Q., Liao M., Tong G.Z. 2007. Isolation and genetic analysis of human origin H1N1 and H3N2 influenza viruses from pigs in China. Biophys Res Commun. 356. 91-96

153. Zhang, J., Zhang Z, Fang X, Huang K, Rayner JM, Ng WF, Li KS, Guan Y, Chen H., (2007) Expression of Avian Influenza Virus Receptors and H5N1 Virus Infection in Human Respiratory Tract. Options for the Control of Influenza VI,Toronto. Abstract 09

154. Zhou, N.N., Senne, D.A., Landgraf, J.S., Swenson, S.L., Ericson, G., Rossow, K., Iiu, L., Yoon, K.J., Rraus, S., and Webster R.G. (1999). Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. J.Virol. 73,8851-8856

155. Гамбарян A.C., Ямникова C.C., Львов Д.К., Робертсон Дж., Вебстер Р., Матросович М.Н. (2002) Сравнение рецепторной специфичности вирусов гриппа А, выделенных от уток, кур и человека. Молекулярная Биология, 36, 542-549.

156. Каверин Н.В., Смирнов Ю.А. (2004), Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и пандемии гриппа. Вопросы Вирусологии, 48, 410.

Информация о работе

Гамбарян, Александра Сергеевна
доктора биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.06

Диссертация

Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гамбарян, Александра Сергеевна

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гамбарян, Александра Сергеевна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гамбарян, Александра Сергеевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология