Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа

Штыря, Юлия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа"

Учреждение Российской академии наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

На правах рукописи

Штыря Юлия Александровна

Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа

0034628 17

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003462817

Работа выполнена в лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова (заведующий - доктор химических наук, профессор, Н.В.Бовин)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией углеводов, учреждение Российской академии наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН), Н.В.Бовин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

1. Завриев Сергей Кириякович, доктор биологических наук, учреждение Российской академии наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН)

2. Иванова Валерия Тимофеевна, доктор биологических наук, НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Москва

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, МГУ

Защита диссертации состоится 25 марта 2009 года в 10-00 на заседании диссертационного ученого совета Д 002.019.01 учреждения Российской академии наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН) по адресу: 117991 ГСП-1, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке учреждения Российской академии наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН)

Специализированного совета доктор физико-математических наук

В.А.Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Фермент нейраминидаза (ЫА) необходим вирусу гриппа на начальном этапе инфекционного цикла, а также на стадии отпочковывания созревших вирусных частиц от клеточной поверхности. ИА является одной из наиболее охарактеризованных сиалидаз: известна пространственная структура этого белка, выделенного из нескольких подтипов вирусов гриппа А и В. Предложен механизм действия фермента, выявлены общие тенденции его эволюции.

Несмотря на повышенный интерес к нейраминидазе, ее функции исследованы мало, а субстратная специфичность оставалась практически неизученной, что объясняется как несовершенством существующих методов, так и недоступностью субстратов ЫА - сиалированных олигосахаридов. Без знания субстратной специфичности ЫА по отношению к природным сиалоолигосахаридам невозможны ни определение роли отдельных участков полипептидной цепи в функционировании ИА, ни мониторинг возникновения и распространения новых штаммов вируса гриппа, в частности вирусов, устойчивых к лекарствам-ингибиторам ЫА, ни понимание механизмов лекарственной устойчивости вирусов гриппа.

Цели и задачи исследования.

Целью данной кандидатской диссертации являлась разработка нового высокочувствительного метода определения активности и исследования субстратной специфичности ЫА вируса гриппа, и его применение для изучения олигосахаридной специфичности ЫА нескольких групп вирусов, в частности:

а) природных изолятов вирусов одного подтипа, выделенных от различных хозяев;

б) искусственно полученных реассортантов вируса гриппа;

в) вирусов, устойчивых к ингибиторам ЫА;

г) КЛ в составе вирусной частицы в сравнении с тем же ферментом, находящимся в растворе.

Кроме того, на основании полученных данных об олигосахаридной специфичности ЫА предполагалось изучение влияния отдельных аминокислотных замен на функционирование фермента.

Новнзна полученных результатов.

Предложен метод определения специфичности ЫА, основанный на использовании в качестве ее субстратов набора флуоресцентно-меченых по спейсерной группе сиалоолигосахаридов.

Сокращения: NA - нейраминидаза; НА - гемагглютинин; НВ-сайт - гемадсорбционный сайт нейраминидазы; ГАЕ - гемагглютинирующая единица; Neu5Ac - N-ацетилнейраминовая кислота; а.к. - аминокислота; дт - дикий тип; Gal - галактоза; Glc - глюкоза; GlcNAc - глюкозамин; Fue - L-фукоза; BODJPY - 6-((4,4-дифторо-5,7-диметил-4-бора-Эа,4а-даиза-5-индацин-3-пропионил)амино)-гексановая кислота, сукцинимидный эфир; MU-NANA - метилубеллиферил-а-нейраминовая кислота.

С помощью семи субстратов показано, что для нейраминидаз вирусов гриппа, выделенных от различных «хозяев», характерны индивидуальные профили субстратной специфичности.

Показано, что восстановление функционального баланса гемагглютинин/нейраминидаза реассортантов вирусов гриппа человека с вирусами птиц, может происходить не только благодаря изменению активности, но также и субстратной специфичности NA.

Показано, что замена H274Y (NA), обеспечивающая устойчивость современных вирусов гриппа человека к лекарству Tamiflu, не приводит к изменению специфичности NA.

Доказано, что функционирование NA зависит от непосредственного окружения фермента, а именно, свойства индивидуального белка отличаются от таковых в составе вирусной частицы. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанный метод позволяет определять активность и субстратную специфичность NA. Используемый набор олигосахаридов-субстратов позволяет оценить вклад отдельных звеньев олигосахарида в фермент-субстратное взаимодействие. Высокая чувствительность флуоресцентного метода анализа позволяет исследовать варианты вирусов гриппа с низкой нейраминидазной активностью.

2. Специфичность NA в растворе заметно отличается от специфичности того же фермента в составе вирусной частицы.

3. Нейраминидазы разных вирусов, выделенных от одного и того же хозяина, демонстрируют высокое сходство профилей субстратной специфичности. То же самое справедливо для вирусов, выделенных от близкородственных хозяев (например, домашней и водоплавающей птицы).

4. Восстановление функционального баланса HA-NA в реассортантных вирусах гриппа возможно за счет изменения профиля субстратной специфичности NA.

5. Аминокислотные замены в положениях 79, 206 и 366 нейраминидазы N1 оказывают влияние на ее субстратную специфичность, в то время как замена в положении 274 не оказывает.

Научно-практическая ценность работы.

Разработанный метод определения специфичности NA оказался востребованным в службах эпидемиологического надзора за появлением новых разновидностей вируса гриппа, в частности, опасных для человека птичьих штаммов, а также мутантных вариантов, устойчивых к Tamiflu. Предлагаемый метод уже используется для характеризации новых сезонных штаммов вируса гриппа в центрах контроля и профилактики заболеваний: в США (Centers for Disease Control and Prevention), Атланта) и Германии (Институт им. Роберта Коха, Robert Koch-Institut, Берлин).

Кроме того, разработанный метод позволил выявить изменения, происходящие с NA вакцинного варианта вируса гриппа при его инактивации при длительном хранении, что актуально при получении нового поколения

противовирусных вакцин (Европейский исследовательский консорциум FLUVACC, FP6).

Публикации н апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 4 статьи. Основные материалы диссертации были представлены на 7-ой Школе-конференции молодых ученых, (Пущино, Россия, 2003 г.), Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, Россия, 2004 г.), XVII и XIX Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2005 и 2007 гг.), Международной конференции «3rd Orthomyxovirus research conference» (Кембридж, Великобритания, 2005 г.), ХШ Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, Россия, 2006 г.), Международной конференции «Options for the control of influenza VI» (Торонто, Канада, 2007 г.), Международной конференции по биологии и химии сиаловых кислот «Sialoglyco-2008» (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 2008 г.), Международной конференции «The third European influenza conference» (Виламура, Португалия, 2008 г.).

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора о структуре, функции, специфичности и методах исследования NA, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы; содержит ^рисунков, схем и ¿5 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ1

Материалы и методы. Использованные вирусные изопяты: MDCK-вариант вируса гриппа А/Гонконг/1143/99 (Гк/1143/99) (H3N2) был получен из Института прикладной микробиологии, Вена, Австрия (Institute of Applied Microbiology in Vienna, Austria). Вирусы А/свинья/Гонконг/9/98 (H9N2); R8/Dk-RAi (H3N2); R8/Dk-RAiXII (H3N2); R2 (H3N1); R2-XXI (H3N1); RCB1 (H4N1) и RCB-XXI (H4N1) предоставлены Н.В.Кавериным, Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Вирусы XI13; А/цыпленок/Нью-Джерси/12220/97 (H9N2); А/Гонконг/1073/97 (H9N2); А/угка/Приморье/3/82 А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1); А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); VNH5N1 -Pr8/CDC-RG; Vn-Лен

1 Автор выражает благодарность: Мочаловой JI.B. за участие в разработке метода и представление данных по субстратной специфичности NA для вирусов А/индюк/Миннесота/38391-6/1995, А/индюк/Висконсин/01/1996 и А/гусь/Миннесота/80 (подтипа H9N2); Корчагиной Е.Ю. и Пазыниной Г.В. за синтез субстратов; Кордюковой JI.B. за получение свободной NA вируса гриппа А/Пуэрто-Рико/8/34; Кузьмину Д.С. за моделирование взаимодействия активного центра NA с олигосахаридами, Куровой B.C. и Мочаловой Л.В. за обсуждение ферментативной кинетики и предоставление данных по субстратной специфичности вирусов подтипа H1N1; и Возновой Г.П. за помощь в очистке вирусного материала.

получены из лаборатории музейных штаммов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН и из коллекции Центра контроля заболеваний (Centers for Disease Control and Prevention, Атланта, США). Вирусы H5N1 подтипа VN/1204 Д5:3, VN/1204 Д5:2, НК/213 Д5:3, НК/213 Д5:2 были предоставлены компанией Greenhills Biotechnology (Вена, Австрия), данные вирусы были получены при культивировании на линии клеток Vero. Все остальные вирусы выращены в аллантоисной полости 10-дневных куриных эмбрионов. Вирусы H1N1 подтипа А/Массачусетс/06/2006 (дт); А/Массачусетс/05/2007 (H274Y); А/Гаваи/31/2007 (дт); А/Гаваи/21/2007 (H274Y); А/Нью-Джерси /115/2007 (H274Y); А/Техас/36/91 (дт); А/Техас/36/91 (H274Y) и А/Калифорния/27/2007 (дт) были предоставлены А.И.Климовым (Centers for Disease Control and Prevention, Атланта, США). Вирусы А/Мемфис/14/96 (H1N1), A/Singapore/57 и А/Гонконг/68 были предоставлены М.Н.Матросовичем (Institute of Virology, Philipps University, Марбург, Германия).

Олигосахариды. Для проведения данной работы в лаборатории углеводов ИБХ РАН были синтезированы следующие BODIPY-меченые олигосахариды (Табл. 1). Выбор данных сиалоолигосахаридов был обусловлен тем, что все они являются рецепторами для вирусов гриппа млекопитающих или птиц.

Таблица 1. Структура использованных субстратов.

Структура* Название олигосахарида

Neu5Aca2-3Galßl-4GIc-cneitcep-BODIPY 3'SL

Neu5Aca2-3Galßl-4GlcNAc-cneficep-BODIPY 3'SLN

Neu5Aca2-3Galßl-3GlcNAc-cneBcep-BODIPY SLeL

Neu5Aca2-3Galß1-3(Fucal-4)GlcNAc-cneücep-BODIPY SLeA

Neu5 Accc2 -3 Galß I -4(Fucccl -3 )GlcN Ас-спейсер-BODIPY SLe*

Neu5Aca2-6Ga!ßl-4Glc-cneücep-BODIPY 6'SL

Neu5Aca2-6Galßl-4GlcNAc-cneflcep-BODIPY 6'SLN

* спейсер = -СН2СН2СН2Ш-

1. Метод определения активности и специфичности нейраминидаз с помощью ВОШРУ-меченых олигосахаридов. Нейраминидаза - это фермент, относящийся к классу сиалидаз, гидролизующий связь между остатком нейраминовой кислоты и предыдущим остатком олигосахарида. Для изучения субстратной специфичности NA предложен метод, схема которого изображена ниже. Метод основан на флуоресцентной детекции продукта и субстрата реакции, в составе которых есть флуоресцентная метка BODIPY РЬ. Выбор данной метки обусловлен такими ее качествами как стабильность, гидрофильность и отсутствие заряда. Последнее является обязательным, так как отрицательно-заряженный субстрат отделяется от нейтрального продукта благодаря различию в заряде, с помощью ионообменной смолы (ОЕАЕ).

Незаряженный продукт реакции элюируется с колонки водой, а исходный субстрат - ацетатным буфером; их одновременное количественное определение позволяет повысить точность и надежность анализа. Модельные эксперименты показали, что разделение заряженного и нейтрального олигосахаридов проходит

количественно даже в микромасштабе (достоверность более 95%), а при анализе проб в параллелях ошибка измерения не превышает 5%.

КА

№и5Аса2-ЗСа1р1-4С1с-спейсер-ВСЖ1РУ Оа1р1-4С1с-спейсер-В(Ж1РУ + Ыеи5Ас

Gaipi-4Glc-cneflcep-BODIPY

Детекция флуоресценции

Были разработаны два варианта метода. В первом варианте, ионообменная смола (как гель) используется в виде самодельных микрокартриджей, получаемых из одноразовых «типов» с фильтрами, а во втором - в виде коммерчески доступных 96-луночных планшетов с полупроницаемым дном, сделанным из DEAE-содержащего материала. Оптимальный диапазон исследуемых концентраций субстрата составляет 10 - 500 пмоль для микрокартриджей и 5 - 40 пмоль для планшетов.

Структура субстратов такова, что метка находится заведомо далеко от остатка сиаловой кислоты и двух последующих (потенциально задействованных в каталитической реакции) моносахаридных остатков. Тем не менее, был поставлен эксперимент, демонстрирующий отсутствие влияния метки на субстратные свойства используемых олигосахаридов. На примере вируса А/Гонконг/1143/99 (H3N2) и двух пар субстратов, а именно, свободных трисахаридов 3'SL и 6'SL - с одной стороны, и соответствующих BODIPY-меченых производных - с другой (Табл. 1), были сопоставлены данные нового флуоресцентного метода и известного метода. Последний основан на гидролизе свободных олигосахаридов с последующим определением освобождающейся Neu5Ac (с помощью тиобарбитуровой кислоты). Оказалось, что различия полученных результатов не превышают 9%, то есть спейсерная группа и метка не влияют на ход реакции.

В данной работе использовался набор олигосахаридов, приведенный в Таблице 1, хотя предлагаемый подход позволяет использовать любой олигосахарид, несущий один отрицательный заряд. Выбранные олигосахариды отличаются по: 1) типу связи между остатками Neu5Ac и Gal, 2) наличию или отсутствию ацетамидной группы при С2 остатка Glc, 3) типу связи между Gal и предшествующим остатком, а именно 1-3 или 1-4, и 4) наличию или отсутствию фукозы при остатке GlcNAc.

2. Определение активности NA вирусов гриппа. Под субстратной специфичностью (профилем субстратной специфичности) мы далее будем подразумевать совокупность активностей по отношению ко всем

использованным олигосахаридам, определяемую в идентичных условиях, отвечающим линейной кинетике реакции. На практике часто оказывается необходимым определять просто активность фермента по отношению к одному субстрату. Обычно, для определения активности NA используется флуорогенный субстрат MU-NANA (Рис. 1) или аналогичные простые гликозиды, в состав которых входит моносахарид Neu5Ac, а не сиалоолигосахарид. Очевидно, что их взаимодействие с активным центром фермента отличается от такового для природных субстратов, к которым максимально приближены структуры исследуемых нами олигосахаридов, и поэтому ожидалось, что наш метод будет давать более корректные результаты. Действительно, сравнение гидролиза MU-NANA и 3 'SL-cneítcep-BODIP Y, проведенное в рамках исследования профилей субстратной специфичности реассортантов вируса гриппа при адаптации к репликации в куриных эмбрионах, а также ряд других сравнительных экспериментов, говорит об отсутствии высокой корреляции между результатами этих методов.

Рисунок 1. Структуры 3'SL-cneíícep-BODIPY (А) и MU-NANA (Б).

3. Кинетические параметры реакции десиалировапия. Разработанный метод, особенно его планшетный вариант, дающий возможность одновременно работать с десятком и более образцов, оказался удобным с практической точки зрения для изучения кинетики десиалирования. Предполагалось, что изучение кинетики десиалирования позволит:

1) правильно выбрать концентрации субстрата и вируса, и благодаря этому исследовать специфичность вирусной NA в условиях, строго соответствующих линейным участкам кинетических кривых; сравнение активности двух NA в нелинейной области является некорректным, так как может привести к нивелированию существующего различия (Рисунок 2);

2) работать, не зная точной концентрации вируса (и, соответственно, его NA); это критично, так как не всегда удается очистить вирус, более того, даже для высокоочищенных образцов до сих пор не разработан удобный метод количественного определения NA;

3) делать заключения о механизме катализа; в частности, Vmax дает информацию о сродстве фермента к продукту реакции, а Км - о сродстве субстрата к ферменту.

А)

Одним из наиболее информативных кинетических параметров является отношение V „их/Км, пропорциональное экспериментально определяемой величине \УВ0, последняя еще известна как кинетическая специфичность. Ниже приведено несколько примеров применения разработанного метода, которые, с одной стороны, являются «валидацией» метода как такового, а с другой - иллюстрируют его потенциал (эксперименты, ранее невозможные) в изучении вируса гриппа.

Первой стадией работы с любым образцом являлось определение рабочей концентрации вируса, а также диапазона концентраций каждого из субстратов, для которого соблюдается соответствие кинетике Михаэлиса-Ментен. Затем, из найденного диапазона концентраций вычленялся участок линейной функции V = ^о), из которого затем определялась величина Уо/Бо, а в определенных случаях и Утах и Км для всего набора субстратов, что позволяло проводить корректное исследование без знания точной концентрации вируса (фермента).

0,003 0,0025 0,002

| 0,0015

I 0,001

>' 0,0005 0

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

8о, мМ

Рисунок 2. Кинетические кривые зависимости V = А^о) для ИА вируса К8/Т)к-КА1ХП, полученные при гидролизе 3'8Ь-спейсер-В001РУ (обозначена серым) и 6'5ЬЫ-спейсер-В001РУ (обозначена черным). Значительное различие (более 5 раз) Уо на начальном, линейном участке кривой, нивелируется до величины ~2 раза на нелинейных участках.

4. Влияние других вирусных белков на действие нейраминидазы. а) Удаление НА с вирусной частицы; сравнение свободной и вирус-связанной нейраминидазы. В литературе можно найти многочисленные данные о взаимозависимости функционирования НА и ИА вируса гриппа (подробнее см. ниже). Реализуется ли взаимный «отбор» этих белков по чисто эволюционному механизму, или имеет место их физическое влияние друг на друга в составе вирусной частицы, до сих пор неизвестно. В данной работе сделана попытка выявить непосредственное влияние НА (а также некоторых других факторов) на субстратную специфичность ЫА; точность разработанного метода позволяла надеяться на выявление даже слабых изменений. Один из примененных экспериментальных подходов заключается в частичном удалении НА и (или) ИА с поверхности вирусных частиц с помощью протеазы бромелаина. В частности, сравнивались три образца ЫА вируса А/Пуэрто Рико/8/34: 1) в

растворе, 2) в составе вирусной частицы после ее контролируемой обработки бромелаином, что приводит к частичному удалению НА и ЫА с поверхности вирусной частицы, 3) в составе интактной вирусной частицы. Сравнение интактных вирусных частиц и частиц, обработанных бромелаином, не выявило значимых различий в профиле субстратной специфичности ЫА (данные не показаны). Это означает, что частичное удаление поверхностных белков не приводит к значимым изменениям работы ЫА. Особый интерес представляло сравнение индивидуального белка (в свободной, растворенной форме) и той же самой ЫА в составе вирусной частицы; результаты его приведены на Рисунке 3.

700

600

500

400

о се 300

200

100

З'ЭЬ З'ЭЬИ ЭЬе ЭЬе* 8Ьел б'БЬ б'БиМ Рисунок 3. Сравнение профилей субстратной специфичности 1МА в составе вируса А/Пуэрто-Рико/8/34 (серые столбцы) и растворимой формы, получаемой при обработке вируса бромелаином (черная кривая).

Очевидно, что профили специфичности заметно отличаются; данные этих экспериментов хорошо воспроизводились. Можно дать два объяснения наблюдаемому эффекту. Согласно первому, специфичность свободной формы фермента может измениться благодаря приобретению им большей подвижности по сравнению с конформационно затрудненной мембранной формой, - ЫА представляет собой тетрамер (в то время как в растворе, судя по литературным данным, в основном - димер); а кроме того, известно, что упаковка белков на вирионе довольно плотная, суммарно НА и ЫА занимают около половины всей поверхности. Согласно второму, на вирионе, благодаря пре-координации олигосахаридов-субстратов с гемагглютинином, локальная концентрация более аффинных к НА олигосахаридов должна повышаться и, соответственно, они должны гидролизоваться нейраминидазой быстрее; в растворе такой эффект исключен. Судя по тому, что профили рецепторной (НА) специфичности нативного и частично обработанного бромелаимом вирионов, не отличаются (данные не показаны), второй механизм представляется менее вероятным.

б) Вариации по гемагглютинину и М-белку. Чтобы наблюдать более тонкие эффекты влияния на нейраминидазу других белков, было проведено сравнение

полноценных натнвных вирусов, содержащих одну и ту же NA, но вариабельный (когда есть несколько известных аминокислотных замен) второй белок. В данной работе было изучено, как НА и М-белок влияют на каталитическую активность NA. Потенциальное влияние НА (подтипов HI, НЗ и Н4) на профиль субстратной специфичности NA изучалось на примере вирусов R2, RCB1 и А/СССР/90/77 (HI), то есть брались вирусы, идентичные noNA (N1, происходящую из вируса А/СССР/90/77), но отличающиеся по НА. В частности, НА вируса R2 происходит из вируса А/утка/Украина/1/63 (НЗ), а НА RCB1 - из А/утка/Чехословакия/56 (Н4), эти гемагглютинины отличаются рецептор-связывающими свойствами. Отметим, что при формировании R2 и RCB1, мутаций в гене NA не произошло. Оказалось, что субстратная специфичность NA этих трех вирусов полностью совпадает. Таким образом, рецептор-узнающие свойства НА не оказывают заметного влияния на функционирование нейраминидазы - по крайней мере в условиях нашей тест-системы, когда субстрат представляет собой моновалентное соединение; в то же время, в природных условиях, когда вирус взаимодействует с поливалентными (и, значит, гораздо более аффинными по отношению к НА) гликопротеинами, такое влияние представляется возможным.

Потенциальное влияние М-белка исследовалось на примере вирусов VN/1204 Д5:3 и VN/1204 Д5:2 (H5N1), НК/213 Д5:3 и НК/213 A5:2(H5N1). Данные пары вирусов несут М-белок из вируса-источника НА и NA (Д5:3 вирусы) или вируса-источника генов внутренних белков (Д5:2 вирусы). При сравнении профилей субстратной специфичности обеих пар, то есть вирусов Д5:2 и Д5:3, были обнаружены некоторые изменения, приведенные на Рисунке 4. Как следует из приведенных данных, наличие чужеродного М-белка в составе вируса VN/1204 приводит к снижению его активности по всем субстратам, а особенно а2-6 олигосахаридам, в то время как для вируса НК/213 наблюдается обратный эффект. Таким образом, судя по полученным ограниченным данным, М-белок может влиять на функционирование NA, хотя характер и механизм этого влияния на данном этапе представляются неясными .

5. Восстановление функционального баланса HA-NA в реассортантных вирусах. Хорошо известно, что только некоторые из комбинаций гемагглютинина с нейраминидазой реализуются в природе. In vitro можно получать «неестественные» конструкции (реассортанты), которые, однако, генетически неустойчивы, и мутируют в более устойчивые варианты, так называемые адаптанты, в которых соблюдается жизненно важный для вируса баланс активностей этих двух сиало-узнающих белков. Что при этом происходит с субстратной специфичностью NA, то есть изменяется ли вместе с активностью фермента также и его рецепторная специфичность, до настоящего исследования было неизвестно. В данном случае изучались реассортанты между вирусами человека и птицы, которые несли гемагглютинин НЗ (А/утка/Украина/1/63) или Н4 (А/утка/Чехословакия/56) вирусов птиц, наряду с нейраминидазой N1 (А/СССР/90/77) или N2 (А/Аичи/2/68) вирусов человека. Оказалось, что данные реассортанты плохо приспособлены к размножению; в

ходе лабораторной эволюции наблюдалась их адаптация за счет приобретения мутаций, причем как в НА, так и в КА. Для изучения ЫА были взяты три пары вирусов реассортант-адаптант: 1) Я8/Эк-Яа1 и Я8/Бк-ЯА1ХП (НЗШ), 2) ЯСВ1 и ЯСВ1 XXI (Н4Ш), 3) Я2 и К2 XXI (НЗШ); обязательным условием этого выбора было возникновение мутаций в ЫА в процессе адаптации.

А)

1,6 1,4

1,2

С. 0,8

I 0,6 >

0,4

0,2 О

• НК/213 Д5:3

НК/213 Д5:2

Б)

> 2 1 0

и VN/1204 Д5:3

Д I

fSL3'SLN SLe** SU" SLe* 6'SL 6'SLN 3'SL3;SLN SLec SLex" SLe* 6'SL6'SLN

Рисунок 4. Сравнение субстратной специфичности нейраминидаз в парах вирусов Д5:2 и Д5:3: а) VN/1204 Д5:3 и VN/1204 Д5:2; б) НК/213 Д5:3 и НК/213 Д5:2. Специфичность нормирована по субстрату 3'SL-cneftcep-BODlPY.

Для первой пары вирусов адаптационное изменение NA выражалось в замене Glu83Gly, которая локализуется в районе присоединения «стебля» белковой молекулы к ее «голове». Известно, что Glu83 является консервативной а.к. для N2 нейраминидаз вирусов гриппа птиц и свиней, в то время как Gly в данном положении встречается у вирусов гриппа птиц; то есть, в ходе адаптации произошла замена в «птичьем» направлении. Изменения в профиле субстратной специфичности NA, вызванные данной заменой, оказались незначительными (Рис. 5) и выражались в основном в «сглаживании» профиля субстратной специфичности.

Адаптация NA второй пары вирусов выражалась в одной замене Leu206Ile. Данная а.к. расположена в ß-слое, в зоне контакта мономеров NA, причем данный участок крайне консервативен для N1 нейраминидаз. Влияние данной замены на профиль специфичности, скорее всего, обусловлено нарушением взаимодействий в зоне контакта мономеров NA. Основным последствием данной мутации стало значимое увеличение отношения гидролитической активности по а2-3 и а2-6 сиалоолигосахаридам (Рис. 5), по сравнению с исходным реассортантом. Эффект увеличения величины а2-3/а2-6 отмечался также при сравнении профилей специфичности NA вируса А/Пуэрто-Рико/8/34 в составе вирусной частицы и в растворе (см. выше). Поэтому, наблюдаемые изменения в профилях RCB1 и RCB1 XXI мы объясняем нарушением контакта мономеров NA в составе тетрамера.

ся >

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2 4

З'ЭЬ З'ЗиЧ БЬе^ ЭЬе* БЬел 6"81. б'ЭЬЫ Рисунок 5. Профили субстратной специфичности трех пар вирусных нейраминидаз, выраженные как \У50, в пересчете на количество М белка, мл/(мин*мг); внизу — нормированный по 3'8Ь вариант.

Адаптация NA последней пары вирусов выражалась в заменах Asp79Val и Ser366Asn. Остаток Asp в позиции 79 характерен для NA вирусов человека, а Val - вирусов птиц. В NA вирусов птиц в позиции 336 обычно находится Asn, и только у 12% вирусов - Ser. У вирусов человека, наоборот, в этой позиции обычно встречается Ser, реже - Arg или Asn. А.к. последовательность в районе остатка 366 консервативна у вирусов птиц субтипа N1, но вырождена у вирусов свиней и человека. Обе наблюдаемые замены можно назвать реверсивными: от характерных для NA вирусов гриппа человека к NA вирусов гриппа птиц. Основным отличием данного адаптантного варианта является изменение субстратной специфичности NA по отношению к нефукозилированным а2-3-сиалоолигосахаридам (Рис. 5).

Для всех рассмотренных в данном разделе вирусов наблюдаются, с одной стороны, аминокислотные замены, характерные для эволюции вирусных изолятов при переходе от человека к птицам и с другой стороны, изменения в профилях олигосахаридной специфичности с тенденцией перехода от профилей характерных для вирусов человека к профилям, характерным для вирусов птиц. То есть, изменения олигосахаридной специфичности ЫА адаптантов направлены на подстройку нейраминидазы вируса человека к гемагглютинину вируса птиц.

В изученных парах реассортант-адаптант просматриваются три молекулярных пути восстановления функционального баланса между НА и ЫА. Первый представлен парой вирусов Я8/Ок-ЯА1 и 118/Ок-КА1Х11, когда ключевые изменения затрагивают НА, в то время как изменения в ЫА минимальны. Второй представлен парой ИСВ1 и ЯСВ1 XXI, в которой основные изменения происходят уже в ЫА, в то время как изменения в олигосахаридной специфичности (данные не представлены) гемагглютинина оказались минимальными. Наконец, в третьем случае, 112 и Я2 XXI, серьезные изменения затронули оба белка. Таким образом, все адаптационные изменения двух сиало-узнающих белков вируса гриппа, первоначально чужеродных друг другу (птица-человек), приводят к сбалансированности их функций, возвращающей возможность нормального размножения вируса в естественной среде обитания (эта среда моделируется куриным эмбрионом).

6. Субстратная специфичность реассортантов подтипа Н5М2. Еще одним применением разработанного метода является определение типа ЫА вируса гриппа в получаемых реассортантах на основании различия в профилях специфичности ЫА вирусов, участвующих в процессе реассортации, то есть фактически «контроль качества» процесса реассортации.

Подобное применение разработанного метода возможно, если профили субстратной специфичности ЫА родительских вирусов значимо отличаются, как, например, профили субстратной специфичности вируса УЫН5Ы1-РР8/СОС-(УЫ-РЯ8) подтипа Н5Ы1, и А/Ленинград/134/17/57 подтипа Н2Ы2. В результате реассортации данных вирусов планировалось получение реассортанта УК-Лен, несущего НА и ЫА вируса УЫН5Ы1 -РК8/СОС-ЯО (А/Вьетнам/1203/2004), а внутренние гены - от вируса А/Ленинград/134/17/57. Однако, при проведении сравнения профилей ЫА специфичности вирусов УЫН5Ы 1 -РИ8/СОС-1Ю, А/Ленинград/134/17/57 и УЫ-Лен было обнаружено, что в состав данного реассортанта входит ЫА вируса А/Ленинград/134/17/57.

Некоторые отличия в узнавании олигосахаридов, обнаруженные в профилях специфичности родительской и реассортантной нейраминидаз (данные не приведены), могут быть связаны с приспособлением этого фермента к новому окружению, в частности, к гемагглютинину вируса У1ЧН5Ы1-Р118/СОС-1Ш.

7. Субстратная специфичность NA вирусов подтипа Н9М2. Исследовались изоляты подтипа Н9Ы2, выделенные от утки, гуся, индейки, курицы, свиньи и человека. Профили субстратной специфичности для них приведены на Рисунке 6. Каждый из профилей уникален; тем не менее, можно выделить ряд общих черт: так, все исследованные ЫА более эффективно

расщепляют а2-3 олигосахариды, причем для части вирусов характерна дискриминация ацетамидной группы при С2 остатка Glc, а также типа связи между Gal и предшествующим остатком. Фукозилированные олигосахариды в общем случае расщепляются хуже, так, SLeA расщепляется в 2 - 13 раз хуже, чем SLec. Исключением является SLex, который в ряде случаев (вирусы утки и человека), наоборот является более предпочтительным субстратом, чем 3'SLN. Для всех исследованных нейраминидаз менее предпочтительными являются а2-6 олигосахариды. Эта особенность усиливается в ряду человек - домашняя птица - дикая птица.

1,40

1,20

1,00

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00

■ А/Гонконг/1073/97 □ А/утка/Приморье/3/82

1Ь

■ А/цыпленок/Нью Джерси/12220/97

□ А/свинья/Гонконг/9/98

■ А/гусь/Ми н несота/8 0

□ А/индюк/Миннесота/38391-6/95

О А/индюк/Висконсин/01/96

З'БЬ З'БЬЫ ¡ЗЬ?............""эХ'?" БЬеА б^Ь б'БЬЫ

Рисунок 6. Субстратная специфичность нейраминидаз вирусов гриппа Н9К2, нормированная по активности З'ЭЬ-спейсер-ВСЮ^У.

Так как часть вирусных изолятов, использованных в данной работе, была представлена в виде высокоочищенных концентрированных образцов, для них стало возможным определение количества вирусного М-белка и благодаря этому - измерение их удельной активности (Табл. 2), что позволило провести строгое количественное сравнение трех изолятов. Знание удельной активности позволяет ставить следующий вопрос: разница в субстратной специфичности птичьих и человеческих (млекопитающих) вирусов в пользу а2-3-рецепторов является результатом понижения активности по отношению к а2-3-рецепторам, или повышения по отношению к а2-6? Как показывают данные Таблицы 2, а2-3-гидролизующая активность свиного вируса примерно вдвое ниже, чем у птичьих. Что касается а2-6-субстратов, то серьезная разница наблюдается

между вирусами, происходящими от домашней и дикой птицы, в то время как разница между свиным и куриным вариантами мала. Таким образом, при переходе вирусов от птицы к млекопитающим, относительное повышение специфичности последних к а2-6-рецепторам достигается скорее за счет падения активности к а2-3-гликанам, чем повышения к а2-6. Безусловно, данные всего лишь по трем вирусам и отсутствие сравнения с вирусами человека позволяют считать этот вывод весьма предварительным.

Таблица 2. Удельная активность трех нейраминидаз подтипа N2 (в пересчете на М-белок).

Субстрат в виде BODIPY-производного А/утка/Приморье/3/82 V„/S0 мл/(мг*мин) А/цыпленок/Нью-Джерси/12220/97 V0/S„ мл/(мг*мин) А/свинья/Гонконг/9/98 Vo/So мл/(мг*мин)

3'SL 786 ± 16 940 ± 69 317 ± 6

3'SLN 766 ±28 1152 ± 23 305 ±17

SLec 786 ± 16 673 ±36 316 ± 6

SLex 787 ±39 849 ± 38 245 ±13

SLeA 393 ±8 120 ± 2 67,2 ± 1,6

6'SL 11,8 ±0,2 63,2 ±1,3 59,1 ± 1,2

6'SLN 14,5 ±0,3 87 ±7,0 50,6 ±3,0

8. Роль o.k. остатков 258, 275, 331, 339, 367, 370, 400 и 431 в функционировании N2 нейраминидазы. Несмотря на активное исследование NA вирусов гриппа, только в двух работах2,3 были представлены данные о роли некоторых а. к. остатков в формировании специфичности и активности NA. В частности, было установлено , что остатками, ответственными за дискриминацию субстратной специфичности N2 NA (3'SL против 6'SL), являются а.к. в позициях 258 и 275. Присутствие в них соответственно Lys и Ile увеличивает сродство NA к 6'SL. Анализ этих положений в а.к. последовательности исследованных нами изолятов совпал с литературными данными для изолята А/цыпленок/Нью-Джерси/12220/97, и привел к иным результатам для других изолятов. Несмотря на то, что NA вируса свиньи имеет в этих позициях другие а.к. остатки, а именно Arg и Val, активность по отношению к а2-6 сиалозидам сравнима с таковой для NA куриного вируса. Lys в положении 258 присутствует и в NA вируса А/гусь/Миннесота/80, но соотношение активностей по а2-3/а2-6 сиалоолигосахаридам для данного вируса равно соотношению для вирусов индюков. У вируса человека в 258 положении присутствует Arg, а в 275 Ile, но для него характерна высокая активность по сравнению с NA вирусов птиц, и низкая при сравнении с другими NA вирусов человека.

Kobasa D., Kodihalli S., Luo M., Castrucci M.R., Donatelli I., Suzuki Y., Suzuki T. and Kawaoka Y. 1999. Amino acid resides contributing to the substrate specificity of the influenza A virus neuraminidase. // J. Virol IV. 6743-6751

Этой группой авторов было также показано3, что замена любого из а.к. остатков Ser331, Asp 339, Ser367, Ser370, Asn400 и Pro431 в структуре N2 нейраминидаз приводит к потере высокой активности по отношению к 3'SL. У NA А/цыпленок/Нью- Джерси/12220/97 присутствуют все вышеприведенные а.к. остатки, и ее активность по а2-3 сиалозидам сравнима с таковой для утиного вируса. У NA вируса, выделенного от свиньи, найдены замены Ser367Lys и Asn400Ser, приводящие к снижению активности по сравнению с NA птичьих изолятов. Таким образом, полученные нами данные совпадают с результатами данной группы авторов.

9. Общие закономерности специфичности исследованных изолятов вируса гриппа. Профиль субстратной специфичности каждого из исследованных в данной работе вирусов (а в общей сложности в данной работе их было изучено 32) уникален, то есть трудно найти два вируса с идентичными профилями. В то же время, просматриваются закономерности для отдельных групп вирусов в отношении некоторых из субстратов. Одна из общих закономерностей состоит в том, что субстратная специфичность определяется в большей степени видом организма, из которого был выделен данный вирус, чем подтипом (N1, N2) нейраминидазы. Все исследованные нейраминидазы значительно эффективнее гидролизуют а2-3 связанные сиалилолигосахариды, чем соответствующие а2-6 изомеры, данное различие более выражено для птичьих, чем для человеческих изолятов, например, для вирусов диких птиц соотношение активности по а2-3/а2-6 сиалилолигосахаридам составляет величину 40 - 50. Для большей части вирусов наличие ацетамидной группы при С2 остатка Glc непринципиально, то есть они не раличают 3'SL и 3'SLN. Аналогично, за редкими исключениями, не различаются Neu5Aca2-3Gal(31-4GlcNAc (3'SLN) и Neu5Accx2-3Gaipi-3GlcNAc (SLec). Таким образом, критичным мотивом для эффективного узнавания и гидролиза нейраминидазой вируса гриппа является дисахарид Neu5Accx-Gal, в том числе природа связи (2-3 или 2-6) между моносахаридными остатками, в то время как более отдаленный участок узнается лишь некоторыми вирусами. В то же время, наличие фукозного остатка (фактически - бокового заместителя основной углеводной цепи) в положении 3 или 4 остатка GlcNAc чувствительно для NA многих вирусов. В частности, все исследованные вирусы расщепляют SLeA хуже, чем нефукозилированный трисахарид SLec, причем вирусы выделенные от водоплавающей птицы - вдвое, человеческие изоляты - втрое; вирусы, выделенные от домашней птицы и часть от свиней - впятеро, а большая часть вирусов, изолированных от домашней птицы и часть вирусов, выделенных от свиней - более чем в 10 раз. Очевидное объяснение данной закономерности -стерические препятствия со стороны бокового остатка фукозы для взаимодействия олигосахарида с активным центром фермента. Аналогично,

3 Kobasa D., Wells K., and Kawaoka Y. 2001. Amino acids responsible for the absolute sialidase activity of the influenza A virus neuraminidase: relationship to growth in the duck intestine.// J. Virol. 75: 11773117780

другой фукозилированный субстрат (SLex) с большей частью исследованных вирусов взаимодействует в несколько раз хуже, чем неразветвленный субстрат, хотя встречались штаммы, гидролизовавшие SLex и 3'SLN с одинаковой эффективностью. В то же время, один вирус гриппа подтипа H9N2 и один из изолятов подтипа H5N1 (оба человеческие) гидролизуют SLex эффективнее, чем 3'SLN, то есть в данном случае фукозный остаток не только не мешает, но даже способствует узнаванию субстрата.

Рассмотренные закономерности говорят скорее о сходстве, чем различии субстратной специфичности нейраминидазы - с одной стороны, и рецепторной специфичности гемагглютинина - с другой, на олигосахаридном уровне. Например, 1) птичьи вирусы предпочитают 2-3-сиалозиды, человеческие вирусы больше птичьих склонны к узнаванию 2-6-сиалозидов, а свиные занимают промежуточное положение; 2) дисахаридный фрагмент Neu5Ac-Gal играет ключевую роль; 3) фукозилированные варианты рецептора могут взаимодействовать (штамм-специфически) либо лучше, либо хуже нефукозилированных. Необходимо заметить, что отмеченное сходство НА и NA заранее не было очевидным, так как антагонистические свойства этих двух белков могли бы служить объяснением как экспериментально наблюдаемых в данной работе, так и прямо им противоположных закономерностей.

10. Вирусы устойчивые к Tamiflu. Исследование влияния замены H274Y на профиль специфичности фермента является крайне важным в связи с зарегистрированным недавно резким увеличением количества устойчивых к Tamiflu вирусных изолятов, в NA которых данная замена находится в непосредственной близости от активного центра фермента. По этой причине, нами были изучены четыре пары природных изолятов, отличающихся только по положению 274. Каждая из четырех пар была индивидуальна в отношении профиля олигосахаридной специфичности. В то же время, внутри каждой из них наблюдались лишь незначительные отличия вирусов H274Y от вирусов дикого типа, не превышающие 10%, что близко к величине ошибки использованного метода (Рис. 7). То есть, замена в непосредственной близости от активного центра в одной из «структурных» а.к. не вызывает изменений в профиле специфичности, и, значит, «смысл» этой мутации следует искать не в изменении субстат-узнающих свойств мутантных вирусов.

3'SL 3'SLN SLec SLe* SLe* 6'SL 6'SLN........................3'SL 3'SLN sue SLex Sie* 6'SL 6'SlN

В) Г)

3'SL 3'SLN.....SLec SLex SLeA 6'SL 6'SLN 3'SL 3'SLN Sle^ SLe* SLe* 6ÍSL 6'SLN

Рисунок 7. Субстратная специфичность нейраминидаз вирусов гриппа:

а) А/Массачусетс/06/2006 (дт) и А/ Массачусетс /05/2007 (H274Y);

б) А/Гаваи/31/2007 (дт) и А/Гаваи/21/2007 (H274Y);

в)А/Калифорния/27/2007 (дт) и А/Нью-Джерси /115/2007 (H274Y);

г) А/Техас/36/91 (дт) и А/Техас/36/91 (H274Y).

Все вирусы дикого типа показаны черным, а мутантные вирусы серым, активность нормирована по 3 'SL-cneñcep-BODIPY.

Наши данные не совпадают с данными, полученными Rameix-Welti с коллегами4 при исследовании Кт и Vmax для вирусов с такой же мутацией, когда в качестве единственного субстрата брался MU-NANA. По данным3, мутация по остатку 274 приводит к примерно двукратному увеличению константы Михаэлиса, которое не сопровождается изменением максимальной скорости реакции, то есть к увеличению значения кинетической специфичности (так как V0/S0 ~ Vmax/Km). В результате анализа четырех пар вирусных изолятов с

4 Rameix-Welti M.-A., Enouf V., Cuvelier F., Jeannin P., van der Werf S. Enzymatic Properties of the Neuraminidase of Seasonal H1N1 Influenza Viruses Provide Insights for the Emergence of Natural Resistance to Oseltamivir II PLoS Pathog. 2008 Jul ;4 (7):el000103 18654625 (P.S.G.E.B.D) (2008)

помощью семи олигосахаридов, по нашим данным, значимых изменений величин кинетической специфичности обнаружено не было. Данное расхождение неудивительно, более того, оно демонстрирует несомненно большую информативность и надежность использования субстрата, максимально приближенного к природному (и особенно - серии подобных субстратов) для корректного описания кинетических свойств нейраминдазы вируса гриппа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что предложенный флуоресцентный метод изучения нейраминидазы вируса гриппа отвечает ожиданиям - как по техническим характеристикам, так и по широте применения. Действительно, метод позволяет с высокой точностью (относительная ошибка составляет 5%) проводить одновременный анализ десятка образцов в широком диапазоне концентраций субстратов (10 - 500 пмоль), а количесво вируса, необходимое для надежных измерений, на порядок меньше, чем требует известный ранее подход к определению олигосахаридной специфичности. Применение семи субстратов (ранее - только два) оказалось оправданным, так как профиль субстратной специфичности является более ценной характеристикой вирусной ЫА (и всего вируса в целом), чем простое измерение активности по одному или двум субстратам. Благодаря использованию набора субстратов в сочетании с кинетическим измерениями открылась возможность решать такие задачи, которые ранее не ставились вовсе, или, из-за неадекватности молекулярных инструментов, решались некорректно. Данные по субстратной специфичности 32 вирусов гриппа, полученные в ходе данной работы, позволяют сделать первые обобщения относительно особенностей вирусов, происходящих от разных хозяев, а также принадлежащих к разным подтипам ЫА. Найденные для ЫА закономерности, в целом, согласуются с рецептор-узнающими свойствами другого сиало-узнающего белка вируса гриппа - гемагглютинина (эти свойства ранее были выявлены в нашей лаборатории при помощи того же набора олигосахаридов), что еще раз подтверждает синхронность эволюционных изменений ЫА и НА. Мы надеемся, что расширение и углубление одновременного исследования олигосахаридной специфичности ЫА и НА поможет объяснить причины изменений, происходящих при переходе вирусом межвидового барьера от птицы к человеку, и предсказать субстратную специфичность ожидаемого пандемического вируса. Практическая важность такого предсказания очевидна, поскольку современное поколение лекарств против вируса гриппа - это ингибиторы ИА, и резкое изменение субстратной специфичности может привести к «уходу» вируса из-под контроля этими лекарствами; иными словами, систематический мониторинг субстратной специфичности ЫА вновь возникающих вирусов гриппа открывает возможность предсказать пандемию гриппа задолго до ее начала.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод определения субстратной специфичности нейраминидаз, основанный на использовании BODIPY-меченых сиалилолигосахаридов. Метод позволяет измерять активность и определять субстратную специфичность нейраминидазы в составе вируса гриппа, а также изучать кинетику гидролиза сиалилолигосахаридов.

2. Специфичность нейраминидазы вируса гриппа определяется не антигенным подтипом (H1N1, H5N1 или H9N2), а видом организма-хозяина. Вирусы, выделенные от любого хозяина, более эффективно гидролизуют а2-3, чем а2-6 сиалилолигосахариды, но значительно отличаются между собой по скорости гидролиза а2-3 рецепторов, которая уменьшается в ряду: вирусы водоплавающей птицы^вирусы домашней птицы вирусы свиньи вирусы человека.

3. Аминокислотные замены в положениях 79, 206 и 366 нейраминидазы (N1), локализованные, соответственно, в стебле, зоне межмономерных контактов, и в районе гемоадсорбционного сайта, вызывают изменение профиля субстратной специфичности.

4. Замена в положении 274 нейраминидазы (N1), вызывающая устойчивость вирусов гриппа к ее ингибитору, противовирусному лекарству Tamiflu, не приводит к изменению профиля субстратной специфичности всех изученных нейраминидаз.

5. Реассортанты вирусов гриппа, полученные с намеренным функциональным дисбалансом гемагглютинина и нейраминидазы, в ходе лабораторной эволюции восстанавливают баланс. Один из механизмов этого восстановления включает изменение профиля специфичности нейраминидазы.

6. Комбинация различных гемагглютининов с одной и той же нейраминидазой не приводит к изменению профиля ее субстратной специфичности, в то время как М-белка - может приводить.

7. Субстратная специфичность индивидуальной нейраминидазы вируса гриппа в растворе и того же фермента в составе вирусной частицы отличаются.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Mochalova, L.V., Korchagina E.Y., Kurova V.S., Shtyrya Y.A., Gambaryan A.S., Bovin N.V. Fluorescent assay for studying the substrate specificity of neuraminidase. HAnal.Biochem, 341, 190-193(2005).

2. Mochalova L., Kurova V., Shtyrya Y., Korchagina E., Gambaryan A., Belyanchikov I., Bovin N.. Oligosaccharide specificity of influenza H1N1 virus neuraminidases. IIArch. Virol., 152, 2047-2057 (2007).

3. Shtyrya Y., Mochalova L., Voznova G., Rudneva I., Shilov A., Kaverin N., Bovin N„ Adjustment of receptor-binding and neuraminidase substrate specificities in avian-human reassortant influenza viruses.//Glycoconj J. 26, 99 -109 (2009).

4. Shtyrya Y.A., Mochalova L.V., Gambaryan A.S., Korchagina E.Y., Xu X., Klimov A.I., Bovin N.V. Neuraminidases of H9N2 influenza viruses isolated from different hosts display various substrate specificity. //Proceedings of international conference on options for the control of influenza VI held in Toronto, Ontario, Canada June 17-23 2007. Editor Jacqueline M. Katz., International Medical Press 64-65 (2008).

5. Бовин H.B., Мочалова Л.В., Штыря Ю.А.. Новый метод измерения активности нейраминидазы вируса гриппа. //Тезисы докладов 7-ой Пущинской школы-конференция молодых ученых. Пущино, Россия, ¡4-18 апреля. 311 (2003).

6. Курова B.C., Мочалова JI.B., Штыря Ю.А., Корчагина Е.Ю., Гамбарян А.С., Бовин Н.В. Изучение рецептор-связывающей и нейраминидазной специфичности вирусов гриппа A H1N1. // Тезисы докладов международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты». Санкт-Петербург, Россия, 2-5 ноября 200 4г. 30/84. (2004).

7. Штыря Ю.А., Курова B.C., Мочалова JI.B., Корчагина Е.Ю., Гамбарян А.С., Каверин Н.В., Бовин Н.В. Новый флуоресцентный метод изучения субстратной специфичности нейраминидаз вирусов гриппа. Рецептор-связывающая и нейраминидазная специфичность вирусов гриппа. // Тезисы докладов XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Россия, Москва, 7-10 февраля 2005 г. 15-16 (2005).

8. Shtyrya Y.A., Mochalova L.V., Kurova V.S., Korchagina E.Y., Bovin N.V. Substrate specificity of influenza virus neuraminidases as probed with bodipy-labeled oligosaccharides. // Тезисы докладов 3 rd Orthomyxovirus research conference Queens College, Cambridge, UK, 28-31 July 2005. Abstract 52 (2005).

9. Штыря Ю.А. Исследование субстратной специфичности вируса гриппа новым флуоресцентным методом. // Тезисы докладов XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» Москва, Россия, 12-15 апреля 2006 г.{253-254) (2006)

10. Штыря Ю.А., Мочалова J1.B., Корчагина Е.Ю., Бовин Н.В. Субстратная специфичность нейраминидаз N2 вируса гриппа H9N2 подтипа, выделенных от различных хозяев. // Тезисы докладов XIX зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Россия, Москва, 7-9 февраля 200 7г. 54 (2007).

11. Shtyrya Y.A., Mochalova L.V., Gambaryan A.S., Korchagina E.Y., Xu X., Klimov A.I., Bovin N.V. Neuraminidases of H9N2 influenza viruses isolated from different hosts display various substrate specificity. //Тезисы докладов options for the control of influenza VI, Toronto, Ontario, Canada June 17-23,

2007. Abstract 016 (2007).

12. Shtyrya Y., Mochalova L., Voznova G., Rudneva I., Shilov A., Kaverin N., Bovin N., Adjustment of receptor-binding and neuraminidase substrate specificities in avian-human reassortant influenza viruses.//Тезисы докладов international conference on biology and chemistry of sialic acids, Sialoglyco-

2008, Moscow-St.- Petersburg Jul 21-26. 57-58 (2008).

13. Shtyrya Y.A., Mochalova L.V., Voznova G.P., Rudneva I.A., Shilov A., Kaverin N.V., Bovin N.V., Neuraminidase substrate specificty in avian-human reassortants. //Тезисы докладов The third European Influenza conference Vilamoura, Portugal, 14-17 September 2008. 184 7-015 (2008).

Заказ №111 /02/09 Подписано в печать 19.02.2009 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 1,5

■■V000 "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 .: ■-:'< ivuiw.cfr.ru; e-maiLinfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Штыря, Юлия Александровна

Список использованных сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 2.1 .Вирус гриппа

2.2.Классификация нейраминидаз

2.3.Структура нейраминидаз

2.3.1. Цитоплазматический участок

2.3.2. Трансмембранный домен

2.3.3. Стебель

2.3.4. Голова

2.3.5. Гликозилирование

2.4.Строение каталитического центра

2.5.Механизм реакции

2.6.Ингибиторы нейраминидаз

2.6.1. Мутации в NA, отвечающие за устойчивость вирусов к ингибиторам NA

2.6.2. Мутации в НА, возникающие под действием ингибиторов NA

2.6.3. Современная ситуация с возникновением резистентных штаммов вируса гриппа

2.7.Определение активности и специфичности нейраминидазы вируса гриппа

2.7.1. Определение активности

2.7.2. Изучение субстратной специфичности

2.7.3. Известные литературные данные об олигосахаридной специфичности NA вирусов гриппа

2.8.Корреляция активностей гемагглютинина и нейраминидазы

2.8.1. Восстановление функционального баланса вреассортантных вариантах 53 2.9. Восстановление функционального баланса при дефектах вируса гриппа

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 70 4.1.Метод определения активности и специфичности нейраминидаз с помощью BODIPY-меченых олигосахаридов

4.2.Определение активности NA вируса гриппа

4.3.Влияние вирусных белков на действие нейраминидазы

4.3.1. Удаление NA с вирусной частицы. Сравнение свободной и вирус-связанной нейраминидазы

4.3.2. Изменние типа гемагглютинина и М-белка

4.4.Влияние хранения вакцинных штаммов вируса гриппа на профиль специфичности NA

4.5.Восстановление функционального баланса HA-NA в реассортантных вирусах

4.6. Субстратная специфичность вирусных реассортантов подтипа H5N

4.7. Субстратная специфичность NA вирусов подтипа H9N

4.8.Роль а.к. остатков 258, 275, 331, 339, 367, 370, 400 и 431 в функционировании нейраминидазы N

4.9.Специфичность исследованных вирусов гриппа: общие закономерности

4.10. Вирусы, устойчивые к тамифлю

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа"

На поверхности вируса гриппа находятся два гликопротеина, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), которые узнают сиалированные углеводные цепи клетки-мишени. Функции этих белков противоположны друг другу: НА связывается с сиалированными рецепторами, a NA отщепляет терминальную сиаловую кислоту с углеводных цепей, то есть разрушает рецептор. Важным условием эффективной репликации вируса гриппа является оптимальное соотношение активностей НА и NA.Известно, что NA необходима вирусу гриппа на стадии отпочковывания созревших вирусных частиц от клеточной поверхности (Wagner el al., 2002).Кроме того, есть экспериментальные доказательства необходимости NA на начальном этапе инфекционного цикла вируса гриппа (Matrosovich et al., 2004).Нейраминидаза вируса гриппа является одной из наиболее охарактеризованных сиалидаз: известна пространственная структура NA нескольких подтипов вируса гриппа А, а также нейраминидазы единственного подтипа вируса гриппа В. Предложен механизм действия фермента (Janakiraman et al., 1994). Много сведений накоплено о структурных особенностях и выявлены общие тенденции эволюции NA вирусов различной природы (Colman et al., 1993).Несмотря на повышенный интерес к NA, ее функциональная активность исследована мало, а специфичность остается практически неизученной. В частности, опубликовано всего несколько работ, в которых была осуществлена попытка определения олигосахаридной специфичности NA. Отсутствие данных связано как с трудоемкостью существующих методов, так и с недоступностью сиалированных олигосахаридов. Без знания субстратной специфичности NA по отношению к природным сиалоолигосахаридам невозможны ни определение роли отдельных участков полипептидной цепи в функционировании NA, ни мониторинг возникновения и распространения новых штаммов вируса гриппа, в частности вирусов, устойчивых к лекарствам-ингибиторам NA, ни понимание механизмов лекарственной устойчивости вирусов гриппа.Цели и задачи исследования.Целью данной кандидатской диссертации являлась разработка нового высокочувствительного метода определения активности и исследования субстратной специфичности NA вируса гриппа, и его применение для изучения олигосахаридной специфичности NA нескольких групп вирусов, в частности: а) природных изолятов вирусов одного подтипа, выделенных от различных хозяев; б) искусственно полученных реассортантов вируса гриппа; в) вирусов, устойчивых к ингибиторам NA; г) NA в составе вирусной частицы в сравнении с тем же ферментом, находящимся в растворе.Кроме того, на основании полученных данных об олигосахаридной специфичности NA предполагалось изучение влияния отдельных аминокислотных замен на функционирование фермента.Новизна полученных результатов.Предложен метод определения специфичности NA, основанный на использовании в качестве ее субстратов набора флуоресцентно-меченых по спейсерной группе сиалоолигосахаридов.С помощью семи субстратов показано, что для нейраминидаз вирусов гриппа, выделенных от различных «хозяев», характерны индивидуальные профили субстратной специфичности.Показано, что восстановление функционального баланса гемагглютинин/нейраминидаза реассортантов вирусов гриппа человека с вирусами птиц, может происходить не только благодаря изменению активности, но также и субстратной специфичности NA.Показано, что замена H274Y (NA), обеспечивающая устойчивость современных вирусов гриппа человека к лекарству тамифлю, не приводит к изменению специфичности NA.Доказано, что функционирование NA зависит от непосредственного окружения фермента, а именно, свойства индивидуального белка отличаются от таковых в составе вирусной частицы.Научно-практическая ценность работы.Разработанный метод определения специфичности NA оказался востребованным в службах эпидемиологического надзора за появлением новых разновидностей вируса гриппа, в частности, опасных для человека птичьих штаммов, а также мутаптных вариантов, устойчивых к тамифлю. Предлагаемый метод уже используется для характеризации новых сезонных штаммов вируса гриппа в центрах контроля и профилактики заболеваний: в США (Centers for Disease Control and Prevention), Атланта) и Германии (Институт им. Роберта Коха, Robert Koch-Institut, Берлин).Кроме того, разработанный метод позволил выявить изменения, происходящие с NA вакцинного варианта вируса гриппа при его инактивации при длительном хранении, что актуально при получении нового поколения противовирусных вакцин (Европейский исследовательский консорциум FLUVACC, FP6).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Штыря, Юлия Александровна

ВЫВОДЫ

2. Специфичность нейраминидазы вируса гриппа определяется не антигенным подтипом (H1N1, H5N1 или H9N2), а видом организма-хозяина. Вирусы, выделенные от любого хозяина, более эффективно гидролизуют а2-3, чем а2-б-сиалилолигосахариды, но значительно отличаются между собой по скорости гидролиза а2-3-рецепторов, которая уменьшается в ряду: вирусы водоплавающей птицы вирусы домашней птицы вирусы свиньи вирусы человека.

4. Замена в положении 274 нейраминидазы (N1), вызывающая устойчивость вирусов гриппа к ее ингибитору, противовирусному лекарству тамифлю, не приводит к изменению профиля субстратной специфичности всех изученных нейраминидаз.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность: Мочаловой JI.B. за участие в разработке метода и представление данных по субстратной специфичности NA для вирусов А/индюк/Миннесота/38391-6/1995, А/индюк/Висконсин/01/1996 и

А/гусь/Миннесота/80 (подтипа H9N2); Корчагиной Е.Ю. и Пазыниной Г.В. за синтез субстратов; Кордюковой JI.B. за предоставление образцов вируса гриппа А/Пуэрто-Рико/8/34 после обработки бромелаином и проназой; Кузьмину Д.С. за представление математических моделей NA (реассортанта R2 и адаптанта R2 XXI) и результаты математического моделирования взаимодействия NA с сиало- и асиалоолигосахаридами и MU-NANA; Куровой B.C. и Мочаловой JI.B. за обсуждение ферментативной кинетики и предоставление данных по субстратной специфичности вирусов подтипа H1N1; Возновой Г.П. за помощь в очистке вирусного материала и представление данных по рецепторной специфичности НА различных вариантов вируса гриппа А/Пуэрто Рико/8/34, полученных при использовании метода твердофазного анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что предложенный флуоресцентный метод изучения нейраминидазы вируса гриппа отвечает ожиданиям, — как по техническим характеристикам, так и по широте применения. Действительно, метод позволяет с высокой точностью (относительная ошибка составляет 5%) проводить одновременный анализ десятка образцов в широком диапазоне концентраций субстратов (10 — 500 пмоль). Для проведения работы требуются минимальные количества вирусного материала, причем подходят как высокоочищенные образцы, так и аллантоисная жидкость, компоненты которой не мешают проведению определения и не оказывают влияния на профиль субстратной специфичности. Данное количество вирусного материала на порядок меньше, чем требует известный ранее подход к определению олигосахаридной специфичности. Применение семи субстратов (ранее — только два) оказалось оправданным, так как профиль субстратной специфичности является более ценной характеристикой вирусной NA (и всего вируса в целом), чем простое измерение активности по одному или двум субстратам. Благодаря использованию набора субстратов в сочетании с кинетическим измерениями открылась возможность решать такие задачи, которые ранее не ставились вовсе, или, из-за неадекватности молекулярных инструментов, решались некорректно. Данные по субстратной специфичности 32 вирусов гриппа, полученные в ходе данной работы, позволяют сделать первые обобщения относительно особенностей вирусов, происходящих от разных хозяев, а также принадлежащих к разным подтипам NA. Найденные для NA закономерности, в целом, согласуются с рецептор-узнающими свойствами другого сиало-узнающего белка вируса гриппа — гемагглютинина (эти свойства ранее были выявлены в нашей лаборатории при помощи того же набора олигосахаридов), что еще раз подтверждает синхронность эволюционных изменений NA и НА. В то же время, мы осознаем, что эта синхронность не абсолютна, и именно ее нарушения могут стать индикаторами необычных путей развития вируса гриппа. Мы также надеемся, что расширение и углубление одновременного исследования олигосахаридной специфичности NA и НА поможет объяснить причины изменений, происходящих при переходе вирусом межвидового барьера от птицы к человеку, и предсказать субстратную специфичность ожидаемого пандемического вируса. Практическая важность такого предсказания очевидна, поскольку современное поколение лекарств против вируса гриппа - это ингибиторы NA, и резкое изменение субстратной специфичности может привести к «уходу» вируса из-под контроля этими лекарствами; иными словами, систематический мониторинг субстратной специфичности NA вновь возникающих вирусов гриппа открывает возможность предсказать пандемию гриппа задолго до ее начала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Штыря, Юлия Александровна, Москва

1. Арбатский Н.П., Желтова А.О., Юртов Д.В., Деревицкая В.А., Кочетков Н.К., Последовательное выделение гемагглютинина и нейраминидазы из вируса гриппа А/Краснодар/101/59 (H2N2) с помощью бромелаина. // Биохимия 306: 1490-1493 (1989).

2. Руднева И.А., Ильюшина Н.А., Шилов А.А., Варич H.JL, Синицын Б.В., Кропоткина Е.А., Каверин Н.В. Функциональное взаимодействие гликопротеинов вируса гриппа. // Мол. Биол. Ъ1\ 34-40 (2003).

3. Baigent S.J., Bethell R.C., and McCauley J.W. Genetic analysis reveals that both hemagglutinin and neuraminidase determine the sensitivity of naturally occurng avian influenza viruses to zanamivir in vitro. // Virol. 263: 323-338 (1999).

4. Baigent, S. J. & McCauley, J. W. Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture. // Virus Res. 79: 177—185 (2001).

5. Barman S., and Nayak D.P. Analysis of the transmembrane domain of influenza virus neuraminidase, a type II transmembrane glycoprotein, for apical sorting and raft association. // J. Virol. 74: 6538-6545 (2000).

6. Barros J.F. Jr., Alviano D.S., Silva M.H., Wigg M.D., Alviano C. S., Schauer R. and Couceiro J.N.S.S. Characterization of sialidase from an influenza A (H3N2) virus strain: kinetic parameters and substrate specificity. // Intervirol. 46: 199-205 (2003).

7. Baum E.Z., Wagaman P.C., Ly L., Turchi I., Le J., Bucher D., Bush K. A point mutation in influenza В neuraminidase confers resistance to peramivir and loss of slow binding. II Antiviral Res. 59: 13-22 (2003).

8. Baum L.G. and Paulson J.C. The N2 neuraminidase of human influenza virus has acquired a substrate specificity complementary to the hemagglutinin receptor specificity.// Virol 180: 10-15 (1991).

9. Berezin I.V., Martinek K. Basics of physical chemistry of enzymatic catalysis, High School, Moscow (1977).

10. Bianco A., Brufani M., Dri D.A., Melchioni C., Filocamo L. Design and synthesis of a new furanosic salylmimetic as a potential influenza neuraminidase inhibitor. // Letters in organic chemistry 2: 83-88 (2005).

11. Blok J. and Air G.M. Block deletions in the neuraminidase genes from some influenza A viruses of the N1 subtype. // Virol. 118: 229-234 (1982).

12. Bradford M.M. A rapid method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976).

13. Branden C. and Tooze J. Beta structures. In Introduction to protein structure. Corland Publishing, New York: 72 (1998).

14. Buxton R.C., Edwards В., Juo R.R., Voyta J.C., Tisdale M., and Bethell R.C. Development of a sensitive chemiluminescent neuraminidase assay for the determination of influenza virus susceptibility to zanamivir. // Anal. Biochem. 280:291-300 (2000).

15. Castrucci M.R. & Y Kawaoka. Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus. // J. Virol. 67: 759-764 (1993).

16. Choi Y.K., Seo S.H., Kim J.A., Webby R.J. and Webster R.G. Avian influenza viruses in Korean live poultry markets and their pathogenic potential. // Virol. 332: 529-537 (2005).

17. Collins P.J., Haire L.F., Lin Yi Pu, Liu J., Russell R.J., Walker P. A., Skehel J.J., Martin S.R., Hay A.J., Gamblin S.J., Crystal structures of oseltamivir-resistant influenza virus neuraminidase mutants. // Nature 453: 1258 1262 (2008).

18. Colman P.M. NA enzyme and antigen. // In The influenza viruses (R. M. Krug, ed.). Plenum Publishing Corporation, New York: 175-218 (1989).

19. Colman P.M., Hoyne P.A., and Lawrence M.C. Sequence and structure alignment of paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase with influenza virus neuraminidase. II J. Virol. 67: 2972-2980 (1993).

20. Colman P.M., Smith B.J. The trypanosomal trans-sialidase: two catalytic functions associated with one catalytic site. // Structure 10: 1466-1468 (2002).

21. Copeland R.A. Enzymes: A practical introduction to structure, mechanism, and data analysis, Wiley-VCH, Inc., New York, Chichester, Weinheim, Brisbane, Singapore, Toronto 257-258 (2000).

22. Couceiro J.N.S.S. and Baum L.J. Characterization of the hemagglutinin receptor specificity and neuraminidase substrate specificity of clinical isolates of human influenza A viruses. // Mem. Inst. Oswaldo Cruz Rio de Janeiro 89: 587-591 (1994).

23. Diaz M.O., Ziemin S., Le Beau M.M.; Pitha P., Smith S.D., Chilcote R.R., Rowley J.D. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. PNAS. 85: 5259-5260 (1988).,

24. Eisen M.B., Sabesan S., Skehel J.J., Wiely D.C. Binding of the influenza A virus to cell-surface receptors: structures of five hemagglutinin-sialyloligosacharide complexes determined by X-ray crystallography. // Virol. 232: 19-31 (1997).

25. Eschenfelder V. and Brossmer R. 5-Bromo-indol-3-yl 5-acetamido-3,5-dideoxy-a-D-glycero-D-galactononulopyranosidonic acid, a novelchromogenic substrate for the staining of sialidase activity. // Glycoconjugate J. 4: 171-178 (1987).

26. Fanning T.G., Reid A.H., Taubenberger J.K. Influenza A virus neuraminidase: regions of the protein potentially involved in virus-host interactions. // Virol. 276: 417—423 (2000).

27. Ferko В., Kittel C., Romanova J., Sereinig S., Katinger H., Egorov A. Live attenuated influenza virus expressing human interleukin-2 reveals increased immunogenic potential in young and aged hosts. // J Virol. 80: 11621-11627 (2006).

28. Ferko В., Stasakova J., Romanova J., Kittel C., Sereinig S., Katinger H., Egorov A. Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes. // J Virol. 78: 13037-13045 (2004).

29. Gambaryan A.S., Robertson J.S., Matrosovich M.N. Effects of eggadaptation on the receptor-binding properties of human influenza A and В viruses. // Virol 258: 232-239 (1999).

30. Garoff H., Hewson R., Opstelten D.-J. E. Vims Maturation by Budding. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62: 1171-1190(1998).

31. Govorkova E.A., Leneva I.A., Goloubeva O.G., Bush K., Webster R.G. Comparison of efficacies of RWJ-270201, zanamivir, and oseltamivir against H5N1, H9N2, and other avian influenza viruses. // Antimicrob Agents Chemother. 45: 2723-2732 (2001).

32. Guan Y., Shortridge K.F., Krauss S. and Webster R.G. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: where they the donors of the "internal " genes of H5N1 in Hong Kong. // PNAS. 96: 9363-9367 (1999).

33. Gubareva L.V., Bethell R.C., Hart G.J., Murti K.G., Penn C.R., and Webster R.G. Characterization of mutants of influenza A virus selected^ with the neuraminidase inhibitor 4-guanidino-Neu5Ac2en. // J. Virol. 70: 1818-1827 (1996).

34. Gubareva L.V., Matrosovich M.N., Brenner M.K., Bethell R.C., and Webster R.G. Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza В vims. II J. Infect. Dis. 178: 1257-1262 (1998).

35. Gubareva L.V., Nedyalkova M.S., Novikov D.V., Murti K.G., Hoffmann E. and Hayden F.G. A release-competent influenza A vims mutant lacking the coding capacity for the neuraminidase active site. // J. Gen. Virol. 83: 26832692 (2002).

36. Ha, Y., Stevens, D.J., Skehel, J.J., Wiley, D.C. X-ray structures of П5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human receptor analogs. // PNAS: 98: 11181-11186 (2001).

37. Harris A., Cardone G., Winkler D.C., Heymann J.B., Brecher M., White J.M., Steven A.C. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography. // PNAS. 103:19123-19127 (2006).

38. Herlocher M.L., Maassab H.F., Webster R.G. Molecular and biological changes in the cold-adapted "master strain" A/AA/6/60 (H2N2) influenza virus. // PNAS. 90: 6032-6036 (1993)

39. Hughes M., Matrosovich M., Rodges M., McGregor M., and Kawaoka Y. Influenza A viruses lacking sialidase activity can undergo multiple cycles of replication in cell culture, eggs, or mice. // J. Virol. 74: 5206-5212 (2000).

40. Hughes M.T., McGregor M., Suzuki Т., Suzuki, Y. and Kawaoka Y. Adaptation of influenza A viruses to cells expressing low levels of sialic acid leads to loss of neuraminidase activity. // J. Virol. 75: 3766-3770 (2001).

41. Hui-Ling Yen, Ilyushina N.A., Salomon R., Hoffmann E., Webster R.G., Govorkova E.A. Neuraminidase Inhibitor-Resistant Recombinant

42. Jin H., Leser G.P., Zhang J. and Lamb R.A. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase cytoplasmic tails control particle shape. // EMBO ./. 16: 12361247 (1997).

43. Jourdian G.W., Dean L., and Roselman S. A periodate-resortinol method for the quantitive estimation of five sialic acids and their glycosides. // J. Biol.Chem. 25: 430-435 (1971).

44. Kang D., Gho Y.S., Suh M., Kang C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis // Bull. Korean Chem. Soc 23: 1511-1512 (2002).

45. Karasin A.I., Olsen C.W., Anderson G.A. Genetic characterization of an H1N2 influenza vims isolated from a pig in Indiana. // J. Clin. Microbiol. 38: 24532456 (2000).

46. Katinger D., Mochalova L., Chinarev A., Bovin N., and Romanova J. Specificity of neuraminidase activity from influenza viruses isolated in different hosts tested with novel substrates. // Arch. Virol. 149: 2131-2140 (2004).

47. Kobasa D., Kodihalli S., Luo M., Castrucci M.R., Donatelli I., Suzuki Y., Suzuki T. and Kawaoka Y. Amino acid resides contributing to the substrate specificity of the influenza A virus neuraminidase. // J. Virol 1Ъ: 6743-6751 (1999).

48. Kobasa D., Wells K., and Kawaoka Y. Amino acids responsible for the absolute sialidase activity of the influenza A virus neuraminidase: relationship to growth in the duck intestine. // J. Virol. 75: 11773-11780 (2001).

49. Kundu A., Avalos R.T., Sanderson C.M., Nayak D.P. Transmembrane domain of influenza virus neuraminidase, a type II protein, possesses an apical sorting signal in polarized MDCK cells. // J Virol. 70: 6508-15 (1996).

50. Lackenby A., Hungnes O., Dudman S.G., Meijer A., Paget W.J., Hay A.J., Zambon M.C. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A (H1N1) viruses in Europe // EUROSUR VEILLANCE 13 1 -2 (2008)

51. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly at the head of bacteriophage T4. II Nature. 227: 680-685 (1970).

52. Lambre C.R., Terzidis H., Greffard A., and Webster R.G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. // J. Immunol. Meth. 135: 4957 (1990).

53. Latham Т., Galarza J.M. Formation of wild-type and chimeric influenza viruslike particles following simultaneous expression of only four structural proteins. IIJ Virol 75: 6154-65 (2001).

54. Liu, Y., Misulovin, Z., Bjorkman, P.J. The molecular mechanism of sulfated carbohydrate recognition by the cysteine-rich domain of mannose receptor. // J.Mol.Biol: 305: 481-490 (2001)

55. Lu, В., Zhou, H., Ye, D., Kemble, G. & Jin, H. Improvement of influenza A/Fujian/411/02 (H3N2) virus growth in embryonated chicken eggs by balancing the hemagglutinin and neuraminidase activities, using reverse genetics. IIJ Virol 79: 6763-6771 (2005).

56. Makarova N.V., Kaverin N.V., Krauss S., Senne D. and Webster R.G. Transmission of Eurasian avian H2 influenza virus to shorebirds in North America.11 J. Gen. Virol 80: 3167-3171 (1999).

57. Matrosovich M., Matrosovich Т.,Gray Т., Roberts N.A. and Klenk H.-D., Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epitelium.// J. Virol. 78: 12665-12667 (2004).

58. Matrosovich M.N., Krauss S., and Webster R.G. H9N2 influenza A viruses from poultry in Asia have human virus-like receptor specificity. // Virol. 281: 56-162(2001).

59. Matrosovich M.N., Zhou N., Kawaoka Y., and Webster R.G. The surface glycoproteins of H5 viruses isolated from humans, chikens, and aquatic birds have distinguishable properties. II J. Virol. 73: 1146-1155 (1999).

60. McKimm-Breschkin J.L. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors a review. // Antiviral Res. 47: 1-17 (2000).

61. Mishin V.P., Hayden F.G., Gubareva L.V. Susceptibilities of antiviral-resistant influenza viruses to novel neuraminidase inhibitors. // Antimicrob Agents Chemother. 49: 4515-20 (2005a).

62. Mishin V.P., Novikov D., Hayden F.G., Gubareva L.V. Effect of hemagglutinin glycosylation on influenza virus susceptibility to neuraminidase inhibitors. IIJ Virol. 79: 12416-24 (2005b).

63. Mitnaul J., Matrosovich M.N, Castrucci M.R., Tuzicov A.B, Bovin N.V., Kobasa D, and Kawaoka Y. Balanced hemagglutinin and neuraminidase activities are critical for efficient replication of influenza A viruses. // J. Virol. 74: 6015-6020 (2000).

64. Mochalova L., Kurova V., Shtyrya Y., Korchagina E., Gambaryan A., Belyanchikov I., Bovin N. Oligosaccharide specificity of influenza H1N1 virus neuraminidases. HArch. Virol., 152:2047-2057(2007).

65. Nayak D.P., Hui E.K., Barman S. Assembly and budding of influenza virus. // Virus Res. 106: 147-65 (2004).

66. Nicol S.T., Airkawa J., and Kawaoka Y. Emerging viral diseases. 11 PNAS 97: 12411-12412 (2000).

67. Oakley B.R., Kirsch D.R. and Morris N.R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrilamide gels. // Anal.Biochem. 105: 361363 (1980).

68. Oxford J.S., Bossuyt S., Eswarasaran R. and Lambkin R. Drugs to combat the epidemic and pandemic faces of influenza. // In Influenza (C.W. Potter ed.) Elsevier: 201-234 (2002).

69. Paulson J.C., Weinstein J., Dorland L., van Halbeek H., Viegenthart J.F.J. Newcastle disease virus contains a linkage-specific glycoprotein sialidase. // J. Biol. Chem. 257: 12734-12738 (1982).

70. Potier M., Mameli L., Belisle M., Dallaire L., and Melancon S.B. Fluorometric assay with a sodium (4-methylumbelliferyl-a-D-N-acetylneuraminate) substrate. II Anal. Biochem. 94: 287-296 (1979).

71. Rudneva I.A., Sklyanskaya E.I., Barulina O.S., Yamnikova S.S.,. Kovaleva V.P., Tsvetkova I.V. and Kaverin N.V. 1996. Phenotypic expression of HA -NA combinftions in human avian influenza A virus reassortants. // Arch. Virol. 141: 1091-1099.

72. Russell R.J., Haire L.F., Stevens D.J., Collins P.J., Lin Y.P., Blackburn G.M., Hay A.J., Gamblin S.J., Skehel J.J. The structure of H5N1 avian influenza neuraminidase suggests new opportunities for drug design. // Nature. 44: 45-49 (2006).

73. Saito Т., Kawano K. Loss of glycosylation at Asnl44 alters the substrate preference of the N8 influenza A virus neuraminidase. // J Vet Med Sci. 59: 923-926 (1997).

74. Smee D.F., Sidwell R.W., Morrison A.C., Bailey K.W., Baum E.Z., Ly L., Wagaman P.C. Characterization of an influenza A (H3N2) virus resistant tothe cyelopentane neuraminidase inhibitor RWJ-270201. // Antiv. Res. 52: 251259 (2001).

75. Smith B.J., Colman P.M., von Itzstein M., Danylec В., and Varghese J.N. Analysis of inhibitor binding in influenza virus neuraminidase. // Prot. Sci. 10: 689-696(2001).

76. Somers, W.S., Tang, J., Shaw, G.D., Camphausen, R.T. Insights into the molecular basis of leukocyte tethering and rolling revealed by structures of P-and E-selectin bound to SLe(X) and PSGL-1. // Cell 103: 467-479 (2000)

77. Staschke K.A., Colacino J.M., Baxter A.J., Air G.M., Bansal A., Hornback W.J., Munroe J.E., and Laver W.G. Molecular basis for the resistance of influenza viruses to 4-guanidino-Neu5Ac2en. // Virol. 214: 642646 (1995).

78. Strauss J.H. and Strauss E.G. Minus-strand RNA viruses. // In Viruses and human disease. Academic Press: 123-169 (2002).

79. Suzuki Т., Takahashi Т., Nishinaka D., Murakami M., Fujii S., Hidari K.I., Miyamoto D., Li Y.T., Suzuki Y. Inhibition of influenza A vims sialidase activity by sulfatide. // FEBSLett. 553: 355-359 (2003).

80. Suzuki Т., Takahashi Т., Saito Т., Hidari K.I-P.J., Miyamoto D., Suzuki Y. Evolutional analysis of human influenza A virus N2 neuraminidase gene based on the transition of the low-pH stability of sialidase activity. // FEBS

81. Lett. 557: 228-232 (2004).

82. Takahashi Т., Suzuki Т., Hidari K.I-P.J., Miyamoto D., Suzuki Y. A molecular mechanism for the low-pH stability of sialidase activity of influenza A vims N2 neuraminidases. // FEBSLett. 543: 71-75 (2003).

83. Varghese J.N. and Colman P.M. Three-dimensional structure of the neuraminidase of influenza virus A/Tokyo/3/67 at 2.2 A resolution. // J. Mol. Biol. 221:473-486 (1991).

84. Varghese J.N., Colman P.M., van Donkelaar A., Blick T.J., Sharasrabudhi A., and McKimm-Breschkin J.L. Structural evidence for a second sialic acid binding site in avian influenza virus neuraminidases. // Biochem. 94: 11808-11812 (1997).

85. Varghese J.N., Laver W.G. and Colman P.M. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9A resolution. // Nature. 303: 35-40 (1983).

86. Wagner R., Matrosovich M. and Klenk H.-D. Functional balance between hemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections. // Rev. Med. Virol. 12: 159-166(2002).

87. Wagner R., Wolf Т., Herwig A., Pleschka S., and Klenk H.-D. Interdependence of hemagglutinin glycosilation and neuraminidase as regulators of influenza growth: a study by reverse genetics. // J. Virol. 74: 6316-6323 (2000).

88. Warren L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. // J. Biol. Chem. 234: 1971-1975 (1959).

89. Watts A.G., and Withers S.G., The synthesis of some mechanistic probes for sialic acid processing enzymes and the labeling of a sialidase from Trypanosoma rangeli. // Can. J. Chem. 82: 1581-1588 (2004).

90. Watts A.G., Oppezzo P., Withers S.G., Alzari P.M., Buschiazzo A. Structural and Kinetic Analysis of Two Covalent Sialosyl-Enzyme Intermediates on Trypanosoma rangeli Sialidase // J. Biol. Chem. 281: 4149' 4155(2006).

91. Webby R.J. and Webster R.G. Emergence of influenza A viruses. // Phil. Trans. R. Soc. 356: 1817-1828 (2001).

92. Yen HL, Hoffmann E, Taylor G, Scholtissek C, Monto AS, Webster RG, Govorkova EA. Importance of neuraminidase active-site residues to the neuraminidase inhibitor resistance of influenza viruses. // J Virol. 80: 8787-95 (2006).

93. Zhang J., Pekosz A., and Lamb R.A. Influenza virus assembly and lipid raft microdomains: a role for the cytoplazmic tails of the spike glycoproteins. // J. Virol. 74: 4634-4644 (2000).

Информация о работе

Штыря, Юлия Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно