Нейраминидазная специфичность штаммов вирусов гриппа A и B, циркулировавших в России в эпидсезоны 2006-2010 гг.

Белякова, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нейраминидазная специфичность штаммов вирусов гриппа A и B, циркулировавших в России в эпидсезоны 2006-2010 гг.
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Нейраминидазная специфичность штаммов вирусов гриппа A и B, циркулировавших в России в эпидсезоны 2006-2010 гг."

На правах рукописи

БЕЛЯКОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

НЕЙРАМИНИДАЗНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ШТАММОВ ВИРУСОВ ГРИППА А и В, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ в РОССИИ в ЭПИДСЕЗОНЫ 2006-2010 гг.

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9

Москва-2010

004616220

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Галегов Георгий Артемьевич доктор медицинских наук, профессор Селькова Евгения Петровна

Ведущая организация:

ФГУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, г. Санкт-Петербург

сс

Защита состоится « /Л декабря 2010 года в ¿г часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 в ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан « УЗ » ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Е.И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Актуальность проблемы. Особенности структурной организации вирусов гриппа (наличие поверхностных белков - гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), их подверженность к изменениям с формированием новых дрейф-вариантов; сегментированность генома, определяющая возможность реассортации и приводящая к возникновению новых штаммов с пандемическим потенциалом), способность к преодолению межвидового барьера и инфицированию людей некоторыми подтипами вируса гриппа А птиц и млекопитающих (A(H5N1), A(H7N7), A(H7N2), A(H7N3), A(H9N2) и др.) определяют актуальность исследований по поиску средств и методов, позволяющих снизить ущерб, наносимый этой инфекцией (Слепушкин А.Н., 2003; Каверин Н.В., 2003). Одним из таких направлений является разработка и внедрение химиопрепаратов, проявляющих активность в отношении определенной специфической мишени в цикле вирусной репродукции.

Спектр этиотропных противогриппозных препаратов наиболее широко представлен в России и включает в себя ремантадин, арбидол, ингавирин и рибавирин (Прокудина E.H., 2003; Галегов ГЛ., 2009; Hay А., 1996; Leneva I. et al., 2009; McCoy D. et a!., 2010). Кроме того, основываясь на знаниях третичной структуры одного из поверхностных белков вируса гриппа - NA, были созданы препараты «нового поколения» - озельтамивир (Tamiflu™) и занамивир (Relenza™), действие которых основано на блокировании активного центра NA вирусов гриппа А и В, что препятствует высвобождению вновь сформированных вирионов и распространению вирусов от клетки к клетке (Colman Р. et al., 1983; Calfee D. & Hayden F., 1998). Первые официальные сообщения о препаратах с антинейраминидазной активностью были сделаны Von Itzstem М. et.al. в 1993 г. (занамивир) и Kim C.U. в 1997 г. (озельтамивир). Эти препараты эффективны против большинства подтипов NA, что является ключевым моментом в предупреждении развития эпидемий, вызванных новыми дрейф-вариантами вирусов гриппа, и обеспечении готовности к пандемии (Roberts N. & Govorkova Е., 2009). Их практическое применение было начато с 1999 г., при этом, озельтамивир был рекомендован не только для лечения и профилактики инфекции, вызванной сезонными вирусами гриппа и штаммами высокопатогенного вируса гриппа птиц A(H5N1), но и для создания государственных стоковых запасов на случай возникновения пандемии (Hayden F., 2002; Moscona А., 2005). С появлением с 2007 г. резистентных к озельтамивиру штаммов A(H1N1) в популяции вирусов гриппа эксперты ВОЗ включили занамивир в список рекомендаций Планов подготовки к пандемии (Roberts N. & Govorkova Е., 2009).

озельтамивиром (WHO, 2008). В 2001 г. авторы ряда исследований выявляли около 1% таких мутантов у взрослых и 5% - у детей, а в 2004-2005 гг. в Японии - у 18% детей, инфицированных вирусами гриппа А и прошедших курс лечения озельтамивиром (McKimm-Breschkin J. et al., 2003; Kiso M et al., 2004). В ноябре 2007 г. норвежскими учеными, а несколько позже и специалистами других стран мира было отмечено появление и широкое распространение штаммов вируса гриппа A(H1N1), несущих специфическую мутацию H274Y в белке NA, ответственную за резистентность к озельтамивиру (Moscona А., 2005; WHO, 2007).

В России озельтамивир разрешен с 2001 г.: для лечения гриппа у людей с 1 года и для профилактики - с 12 лет, а с 2005 г. расширены его показания по применению для лечения и профилактики гриппа с 1 года. Занамивир рекомендован для лечения и профилактики гриппозной инфекции с 5 лет (2007 г.). К началу выполнения настоящей работы, совместно с коллегами Отдела гриппа Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (CDC&P), Атланта, США были проведены исследования чувствительности циркулировавших в РФ 75 эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В (1990-2007 гг.) к антинейраминидазным препаратам, результаты которых не выявили среди них резистентных мутантов, что отражало мировые тенденции в целом (Shevchenko Е. et al., 2009). Однако, учитывая вышесказанное, проведение расширенных исследований чувствительности штаммов к ингибиторам NA с включением результатов в надзор за циркуляцией вирусов гриппа на регулярной основе было затруднено отсутствием необходимого оборудования и субстанций препаратов для постановки классических вирусологических методов оценки подавления нейраминидазной активности - флуоресцентного и хемилюминесцентного, а также молекулярно-генетических методов (RT-PCR/RFLP, ОТ-ПЦР-РВ), детектирующих маркерные мутации, ответственные за устойчивость к препаратам (Mungall В. et al., 2003; Lizheng G. et al., 2009).

Субстратная специфичность NA вирусов гриппа остается практически не изученной областью, что объясняется как несовершенством и трудоемкостью существующих методов, так и недоступностью субстратов для вирусной NA - сиалированных олигосахаридов, входящих в состав клеточных рецепторов для вирусов гриппа (Штыря Ю.А., 2009; Mochalova L. et al., 2005). Нейраминидаза, являясь ферментом на поверхности вируса гриппа, выполняет рецептор-разрушаюшие функции, то есть отщепляет а2-3 или а2-6 связанные сиаловые кислоты от сиапилолигосахаридов, выстилающих поверхность клетки-хозяина (Matrosovich М. et al., 2004). Именно поэтому вторым направлением исследований стало изучение субстратной специфичности NA. Без таких знаний невозможно определить роль отдельных участков полипептидной цепи в функционировании NA, отследить возникновение и распространение новых штаммов вирусов гриппа, в частности вирусов, резистентных к ингибиторам NA, а также понять механизмы устойчивости вирусов гриппа к лекарственным средствам.

Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований, представленных в настоящей работе.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в определении специфичности нейраминидаз штаммов вирусов гриппа А и В к аналогам природных субстратов. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Применить классический флуоресцентный метод для определения значений минимальной ингибирующей концентрации (1С50) озельтамивира карбоксилата и занамивира в отношении штаммов вирусов гриппа А и В, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в РФ.

2. Оценить специфичность клеточного иммуноферментного анализа (ИФА) и возможность его применения в мониторинге противовирусной активности ингибиторов ЫА.

3. Провести сравнительный анализ различных молекулярно-генетических методов для возможного их применения в целях изучения чувствительности вирусов гриппа к антинейраминидазным химиопрепаратам на территории РФ.

4. Изучить чувствительность циркулировавших в РФ в период 2006-2010 гг. штаммов вирусов гриппа А и В к озельтамивиру и занамивиру.

5. Оценить риск формирования резистентных к озельтамивиру штаммов вирусов гриппа на фоне приема препарата пациентами в период заболевания.

6. Исследовать и сравнить олигосахаридную специфичность ИА эпидемических штаммов вируса гриппа А(НШ1), чувствительных и устойчивых к озельтамивиру, а также пандемических штаммов вируса гриппа А(НШ1)у, изолированных от инфицированных людей с различным исходом заболевания.

Научная новнзна исследования

1. Впервые в России были отработаны и применены различные вирусологические (флуоресцентный метод, клеточный ИФА) и молекулярно-генетические (ЯТ-РСКУКРЬР, ОТ-ПЦР-РВ) методы для изучения чувствительности вирусов гриппа к антинейраминидазным препаратам.

2. Установлен факт появления в РФ в конце 2007 г. резистентных к озельтамивиру штаммов в популяции вируса гриппа А(НШ1) и последующий рост их числа, достигший 92,0% в сезоне 2008-2009 гг. Циркуляция резистентных мутантов не была связана с приемом этого препарата.

3. Показано, что популяция циркулирующих штаммов вирусов гриппа гетерогенна по чувствительности к антинейраминидазным препаратам: эпидемические штаммы вируса гриппа А(НШ1) - резистентны к озельтамивиру и чувствительны к занамивиру; штаммы вирусов гриппа А(НЗ№), В и А(НШ1)у - чувствительны к обоим препаратам.

4. Впервые в России проведено изучение риска формирования резистентных к озельтамивиру штаммов вирусов гриппа А и В при его приеме пациентами в период заболевания. В клинических наблюдениях 2007-2008 гг. и 2009-2010 гг. выявлено формирование устойчивых к озельтамивиру штаммов сезонного вируса гриппа А(НШ1) - на 3-ий день лечения и пандемического вируса гриппа А(НШ1)у - на 5-ый день лечения препаратом.

5. Показано, что профиль олигосахаридной специфичности ЫА пандемического штамма вируса гриппа АЛ1У-Мо8со\\'/01/09 (Н1Ы1)з\¥1 имеет особенности, свойственные для вирусов, выделенных от свиней, птиц и человека. В тоже время профиль субстратной специфичности ЫА вируса гриппа А/ПУ-Моэсош/ОЗ/ОЭ (Н1Ы1)з;у1 характерен для вирусов, выделенных от свиней.

6. Установлено, что профиль субстратной специфичности ЫА пандемического штамма вируса гриппа А/ПУ-ОгепЬиг^93/09 (Н1Ы1)з\у1, изолированного от пациента с летальным исходом, демонстрирует двойственную аффинность к <х2-3 и а2-6 сиалозидам. Способность ЫА этого вируса расщеплять фукозилированные (8Ьех) и линейные (З'ЗЬЫ) структуры субстратов с одинаковой эффективностью характерна для высокопатогенных вирусов гриппа А.

Научно-практическая значимость исследования. Вирусы гриппа А и В могут проявлять разные уровни чувствительности к антинейраминидазным препаратам в клетках культуры ткани МБСК, и этот факт зависит от различной эффективности связывания вируса с клеточными сиаловыми рецепторами. Вышесказанное определяет необходимость комплексного подхода для подтверждения случаев резистентности к химиопрепаратам, что также будет способствовать оптимизации методов для изучения чувствительности вирусов гриппа к ингибиторам ЫА в РФ.

Апробация четырех новых тест-систем на основе ОТ-ПЦР позволила усилить надзор и определить их как наиболее эффективные для мониторинга чувствительности штаммов вирусов гриппа к ингибиторам ЫА. Три отечественные ОТ-ПЦР-РВ тест-системы для детекции маркерных мутаций устойчивости к озельтамивиру (Шз274Туг и Н1з275Туг) в белке ЫА вирусов гриппа А(Н1М1) и А(Н1Ы1)у соответственно были разработаны совместно с сотрудниками лаборатории экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и ЗАО «НПФ ДНК-Технология». В настоящее время данные тест-системы находятся на стадии сертификации и лицензирования и используются в работе Центра экологии и эпидемиологии гриппа (ЦЭЭГ) при ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России.

В связи с увеличением числа озельтамивир-резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А(НШ1), а также с появлением устойчивых к озельтамивиру пандемических штаммов А(ШЫ 1)у существует необходимость в усилении надзора за чувствительностью вирусов гриппа А и В к обоим антинейраминидазным препаратам и разработке рекомендаций по целесообразности их применения для лечения и профилактики гриппа в РФ. Следует отметить, что все исследованные вирусы гриппа А и В, включая пандемические штаммы А(Н1Ы1)у, оставались чувствительными к занамивиру.

В рамках проведенных исследований по изучению профилей субстратной специфичности ЫА вирусов гриппа было выявлено, что замена Шз274Туг в активном центре ЫА сезонного вируса гриппа А(Н1Ы1), обеспечивающая устойчивость к озельтамивиру, не приводит к изменению профиля кинетической субстратной специфичности ЫА, и поэтому «обоснование» этой мутации, вероятно, следует искать не в изменении «субстрат-узнающих» свойств мутантных вирусов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Детекцию специфических маркеров устойчивости к ингибиторам NA можно осуществлять с помощью методов на основе ОТ-ПЦР, которые должны быть внедрены в надзор за чувствительностью циркулирующих вирусов гриппа к этим препаратам в РФ на регулярной основе.

2. Популяция современных штаммов вирусов гриппа А и В в РФ гетерогенна по чувствительности к ингибиторам NA: эпидемические штаммы вируса гриппа A(H1N1) в подавляющем большинстве резистентны к озельтамивиру, но чувствительны к занамивиру; штаммы вирусов гриппа A(H3N2), В и A(HlNl)v чувствительны к обоим антинейраминидазным препаратам.

3. Штаммы вирусов гриппа А(НШ1) и A(HlNl)v наиболее высоко подвержены риску формирования резистентности к озельтамивиру. Одним из факторов риска является курс лечения этим препаратом в период заболевания.

4. Мутация His274Tyr в активном центре NA сезонного вируса гриппа A(H1N1), обеспечивающая устойчивость к озельтамивиру, не приводит к изменению профиля кинетической субстратной специфичности NA.

5. Профиль олигосахаридной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl имеет особенности, свойственные для вирусов, выделенных от свиней, птиц и человека. Профиль субстратной специфичности NA вируса гриппа A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl характерен для вирусов, выделенных от свиней.

6. Профиль субстратной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Orenburg/93/09 (HlNl)swl, изолированного от пациента с летальным исходом, демонстрирует одинаковое сродство к сс2-3 и а2-6 сиапозидам.

Апробация результатов исследования. Результаты работы были представлены на международных симпозиумах, съездах, конгрессах и конференциях: IX Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 26-27 апреля 2007; VII Конгресс детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 3-5 декабря 2008; I Ежегодная Конференция молодых ученых, Москва, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, апрель 2008; XVI Интернациональная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 14-18 апреля 2009; II Ежегодная Конференция молодых ученых, Москва, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, 23 апреля 2009; BIT's 7th Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology 2009 (IDDST-2009) «Milestones of Innovative Therapeutics», Shanghai, China, 22-25 October 2009; Всероссийская Научная Конференция «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций», Санкт-Петербург, 19-20 ноября 2009; VIII Конгресс детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 2009; XVII Международная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», Москва, 12-15 апреля 2010; III Ежегодная Конференция молодых

ученых, Москва, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, 20 апреля 2010; International Conference «Options for the control influenza VII», Hong Kong SAR, China, 3-7 September 2010.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе б - в реферируемых журналах, материалах докладов на Международных и Всероссийских конгрессах, съездах, симпозиумах, конференциях и проблемных комиссиях, а также 3 удостоверения (депонента) в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского на два сезонных штамма вируса гриппа A(H1N1) и один пандемический штамм вируса гриппа A(HlNl)v с различной чувствительностью к озельтамивиру.

Помимо вышеперечисленного является соавтором депонирования в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского 81 штамма пандемического вируса гриппа A(HlNl)v.

По материалам диссертации подана заявка на изобретение №2009129374/10 «Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl для разработки средств и методов биологической защиты», дата подачи 30.07.2009 г. Решение о выдаче патента РФ на изобретение получено 15.09.2010 г.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 37 работ отечественных и 191 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста и включает 17 таблиц, 2 схемы и 34 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.1. Вирусы и клинический материал. В период 2006-2010 гг. изучено 217 эпидемических штаммов вирусов гриппа А, 31 штамм вируса гриппа В и 50 пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)v (табл.1). В клиническое исследование было включено 290 носоглоточных смывов от пациентов, поступивших в ИКБ № 1 г. Москвы с диагнозом «грипп» и прошедших 5-ти дневные курсы лечения озельтамивиром (Tamiflu™), включая носоглоточные смывы от пациентов контрольных групп, получавших курс симптоматической терапии.

Таблица 1

Общий объем исследований и антигенная характеристика изученных штаммов вирусов гриппа А и В

Эпидсезон, гг. Число смывов Штаммы вирусов гриппа Ли В

A(HIN1) A(HlNl)v A (H3N2) В Референс-штаммы

2006-2007 85 1 Н.Ц.** 1 2 А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) А/Соломоновы острова/03/06 (Н INI) А/Висконсин/67/05 (H3N2) В/Малайзия/2506/04

2007-2008 130 43 Н.Ц. 13 5 А/Соломоновы острова/03/06 (H1N1) А/Брисбен/59/07 (H1N1) А/Висконсин/67/05 (H3N2) А/Брисбен/10/07 (H3N2) В/Флорид а/04/06

2008-2009 Н.И.* 130 Н.Ц. 17 2 А/Брисбен/59/07 (H1N1) А/Брисбен/10/07 (H3N2) В/Малайзия/2506/04

2009-2010 75 Н.Ц. 50 Н.Ц. 22 A/California/07/09 (HlNl)v В/Брисбен/60/08

Всего: 290 180 50 37 31

* - не изучали; ** - не циркулировали

1.2. Изоляция и идентификация эпидемических штаммов вирусов гриппа А н В.

Изоляцию штаммов вирусов гриппа А и В проводили заражением носоглоточными смывами монослоя клеток культуры ткани MDCK по методу Davies H.W. et al. (1978) с добавлением в поддерживающую среду ТРСК- treated trypsin, XIII fraction (Sigma, США) в конечной концентрации 2 мкг/мл. Идентификацию гемагглютинирующих изолятов осуществляли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) согласно рекомендациям ВОЗ и Методическим указаниям (2005) с использованием эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, изолированных в РФ, и приготовленных к ним специфических поликлональных сывороток (крысы, хорька). В ряде случаев типирование изолятов проводили постановкой ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени, позволяющей субтипировать вирусы гриппа А и дифференцировать вирус гриппа A(HlNl)v, подобный свиному, с использованием следующих коммерческих тест-систем на основе обратной транскрипции (ОТ): «Influenza virus A H5N1-FL», «Influenza virus A/B-FL», «Influenza virus A-FL», «Influenza virus A/Hl-swine-FL» (АмплиСенс, Россия); «CDC kit»

(CDC&P, Атланта, CULA); «Influenza A virus», «Influenza В virus» и «Пан H1N1» (ДНК-технология, Россия).

1.3. Химиопрепараты, ингибиторы нейраминидазной активности (NA) вирусов гриппа. Субстанции озелътамивира карбоксшата ((311,411,58)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота) и занамивира ((4S,5R,6R)-5-ацетиламино-4-гуанидино-6-(18,2К,3-тригидроксипропил)-5,6-дигидро-4Н-пиран-2-карбоксиловая кислота) были любезно предоставлены компаниями F.-Hoffman-La-Roche Ltd., Швейцария г-жой Dr.Eva Maria Gutknecht и г-жой Angela Perrin и ЗАО «ГлаксоСмитКпяйнТрейдинг», Англия. При постановке флуоресцентного метода использовали концентрации препаратов 0,1-200 нМ и клеточного ИФА - 0,3-10,0 мкМ.

1.4. Вирусологические методы определения активности ингибиторов NA. Подавление нейраминидазной активности штаммов вирусов гриппа А и В озельтамивиром и занамивиром изучали с помощью флуоресцентного метода, принцип которого основан на измерении уровня флуоресценции как показателя активности вирусной NA при расщеплении специфичного для нее субстрата MU-NANA в присутствии ингибиторов NA (Potier M. et al., 1979). В 96-луночных планшетах с плоским дном (Nunc, Costar, Fisher, США) смешивали предварительно подобранные рабочие разведения вирусов гриппа А и В с изучаемыми препаратами, определенной концентрации. После инкубации планшета при 37° в течение 30 минут к каждой лунке добавляли субстратный буфер, содержащий MU-NANA, и инкубировали при 37° в течение 1 часа. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку стоп реагента (глицин (NaOH) в этаноле, рН=10,7). Измерение флуоресценции, реализуемой освободившемся во время реакции флуоресцирующим соединением 4-метилумбеллиферилом (MU), проводили на спектрофотометре «Varioskan Flash» (Thermo Scientific, США) при длине волны возбуждения флуоресценции Хех=355 нм и длине волны эмиссии флуоресценции >.ет=460 нм. Процент ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа вычисляли по формуле: процент ингибирования = 100 - (УЕФ опыта - УЕФ контроля / УЕФ вирусного контроля в отсутствии соединения - УЕФ контроля) х 100. Концентрацию препарата, уменьшающую значение величины УЕФ на 50%, принимали за 50% ингибирующую концентрацию (ICso).

Изучение противовирусной активности озельтамивира и занамивира проводили методом клеточного ИФА на 96-луночных панелях при заражении монослоя клеток культуры ткани MDCK штаммами вирусов гриппа А и В в присутствии различных концентраций соединений по методике, описанной ранее (Шевченко Е.С., 2006; Leneva I. et al., 2000). Оптическую плотность (ОП) измеряли на автоматическом спектрофотометре «Униплан» (Биоком, Россия) при длине волны 492 нм. Процент ингибирования вирусной репродукции определяли по формуле: процент ингибирования = 100 - (ОП опыта - ОП клеточного контроля / ОП вирусного контроля в отсутствии соединения - ОП клеточного контроля) х 100. Концентрацию препарата, уменьшающую значение величины ОП на 50%, принимали за минимальную ингибирующую концентрацию (IC50).

1.5. Молекулярно-генетические методы изучения чувствительности штаммов вирусов гриппа А и В к ингибиторам NA. Для индикации маркеров резистентности к озельтамивиру - His274Tyr и His275Tyr в белке N1 вирусов гриппа A(HINI) и A(HlNl)v

соответственно, использовали методы на основе ОТ-ПЦР: RT-PCR/RFLP с электрофоретической детекцией продуктов рестрикции (CDC&P, Атланта, США) по методике, описанной Lizheng G. et al. (2009), a также системы, основанные на измерении уровня флуоресценции в режиме реального времени - тест-система с использованием аллель-специфических H274Y TaqMan зондов, меченных красителями Су5 (Н274-дикий тип) и TAMRA (У274-резистентный тип), разработанная в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва (к.б.н. С.В.Альховский) и модифицированный метод «примыкающих проб» (kissing probes) для эпидемического вируса гриппа A(H1N1) и пандемического вируса гриппа A(HlNl)v, разработанный в ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва (к.б.н. Д.Д. Абрамов). Системы находятся на стадии лицензирования и сертификации.

Частичное секвенирование генов NA вирусов гриппа А и В с целью индикации известных маркерных мутаций, ответственных за резистентность к ингибиторам NA (в белке N1 -H274Y (H275Y), N294S, Q136K; в белке N2 - N294S, R292K, E119A/D/V/G, R118K, R152K, D151E и Q136K; в белке NA вируса гриппа В - R152K, D198N (McKimm-Breschkin J. et al., 2003), выполнено совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики (к.б.н. А.Г. Прилипов) НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, ЗАО «НПФ ДНК-Технология» и CDC&P, Атланта, США. Все стадии, включая экстракцию РНК из вируссодержащего материала, обратную транскрипцию и ПЦР проводили по методикам, описанным ранее (Ротанов М. с соавт., 2007,2008). Первичную нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи прямого секвенирования ПЦР-продукта с использованием «BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit» согласно инструкции изготовителя на автоматическом секвенаторе «ABI Prism 3100» (Applied Biosystems, США). Анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей проводили с использованием пакета прикладных программ «DNASTAR V.3.12» (Lasergen, США).

1.6. Активность и субстратную специфичность NA определяли с помощью флуоресцентно-меченных сиалнлолигосахаридов (OS-BODIPY) (табл.2). Исследования проводили совместно с сотрудниками лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по методике, описанной ранее (Штыря Ю.А., 2009). Предложенный метод состоит из следующих стадий: инкубация OS-BODIPY с вирусом гриппа; связывание непрореагировавшего субстрата с анионообменной смолой; детекция BODIPY-меченого продукта реакции в водном элюате. Электронейтральный продуют энзиматической реакции и отрицательно-заряженный нерасщепленный субстрат количественно разделяли с помощью анионообменной смолы DEAE-Toyopearl 650S (Tosoh, Япония) с использованием микрокартриджного варианта метода. На влажную поверхность DEAE-Toyopearl 650S наносили реакционную смесь и продавливали жидкость в лунку 96-луночного полистирольного черного планшета для флуориметрии (Nunc, США). Продукт реакции элюировался водой, а связанный со смолой субстрат - ацетаным буфером. Флуоресценцию в лунках измеряли на микропланшетном фотометре-флуориметре ФФМ-01 (Кортэк, Россия) при /W^em =485/538 нм. Суммарное значение интенсивности флуоресценции водного элюата (ХПводы) прямо пропорционально количеству образовавшегося продукта реакции, а суммарное значение интенсивности флуоресценции буферного элюата (ХР'буфера) - количеству нерасщепленного субстрата.

Выход ферментативной реакции определяли из выражения: выход реакции = ХИводы /

(ЦР1воды + ^буфера) х 100%.

Таблица 2

Структура использованных субстратов (08-В001РУ)

Структура* Краткое название олигосахарида

Кеи5Аса2-30а1р1-401с-спейсер-В0В1РУ З'БЬ

Кеи5Аса2-ЗСа1р1-401сКАс-спейсер-В0В1РУ З'БЬК

№и5Аса2-ЗСа1р1-ЗОШАс-спейсер-В001РУ

№и5Асо2-30а1р1-3(Риса1-4)С1сНАс-спейсер-В001РУ БЬе*

№и5Аса2-ЗСа1р1-4(Риса1-3)С!сКАс-спейсер-В001Р¥ БЬе*

Кеи5Аса2-60а1р1-401с-спейсер-ВСЮ1РУ б'БЬ

№и5Аса2-60а1р 1 -4С1сНЛс-спсйсер-ВОБ1РУ б'БЬК

* спейсер = -СН2СН2СН2Ш-

1.7. Методы статистической обработки результатов. Для обработки результатов и оценки достоверности различий использовали методы математической статистики (Сергиенко В.И. с соавт., 2000; Гмурман В.Е., 2002). Расчет инфекционных титров вирусов проводили по методу Рида и Менча. Обработку данных по кинетической специфичности ИА проводили с использованием модели Михаэлиса-Метнен на начальном линейном участке кинетической кривой, где соблюдается условие: начальная концентрация субстрата 8о«Км (константа Михаэлиса), и, следовательно, кинетическая субстратная специфичность \VSci = Утах/Км (Всгсгт I. & МаПтск К., 1977; Соре1ап(1 Я., 2000). Начальная скорость реакции (У0) измерялась как угол наклона начального участка кривой зависимости накопления продукта от времени.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Оценка специфичности методов изучения чувствительности вирусов гриппа А и В к ингибиторам КА.

Задача данного раздела заключалась в апробации и сравнении различных вирусологических и молекулярно-генетических методов в целях выбора оптимальной методологии для мониторинга чувствительности вирусов гриппа к озельтамивиру и занамивиру и научного обоснования целесообразности применения этих препаратов для лечения и профилактики гриппозной инфекции.

2.1.1. Изучение подавления нейраминидазной активности штаммов вирусов гриппа А и В в присутствии ингибиторов ОД флуоресцентным методом.

В исследование было включено 10 эпидемических штаммов вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗ№) и В, изолированных в сезоне 2008-2009 гг., которые отличались по чувствительности к озельтамивиру и ремантадину, установленной ранее с помощью частичного секвенирования генов вирусных белков М2 и ИА. В качестве контрольного образца использовали вирус гриппа А/Аичи/02/69 (Н3№). На основании кривых «доза-ответ» определены значения ГС50 для каждого штамма (табл.3).

Таблица 3

Изучение противовирусной активности ингибиторов ОД флуоресцентным методом

Штаммы вирусов 1Сю, нМ (нМоль/литр) Мутации в белках

гриппа Ли В Озельтамивира карбоксилат Занамивир М2 N1 и N2

Штаммы вируса гриппа А(Н11У1), резистентные к озельтамивиру

А/Влади во сто к/04/09 (Н1N1) >200 1,00 ±0,10 нет* Н274У

А/Владивосток/08/09 (Н Ш1) >200 0,75 ±0,10 нет Н274У

А/Владивосток/11/09 (НШ1) >200 5,00 ± 0,50 нет Н274У

А/Владивосток/16/09 (НШ1) >200 3,00 ± 0,50 нет Н274У

Штаммы вирусов гриппа А(Н1[\'1) и А(Н31Ч2), резистентные к ремантадину

А/Владивосток/24/09 (НШ1) 7,00 ± 0,50 0,75 ±0,10 взш нет

А/Владивосток/25/09 (НШ1) 4,00 ±0,50 0,75 ±0,10 83 Ш нет

А/Москва/24/09 (НЗШ) 5,00 ± 0,50 2,50 ± 0,50 53Ш нет

А/Москва/28/09(НЗК2) _ 2,50 ± 0,50 1,00 ±0,50 83 Ш нет

Штаммы вируса гриппа В

В/Москва/05/09 11,0 ±0,60 7,50 ± 0,60 н.и** н.и.

В/Москва/06/09 10,0 ±0,60 10,0 ±0,60 н.и. н.и.

Контрольный образец

А/Аичи/02/69 (НЗШ) 1,00 ±0,50 0,60 ±0,10 - -

Значения 1С50 указаны в формате: среднее арифметическое из 3-х независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение; * - мутации не обнаружены; ** - не исследованы, т.к. вирусы гриппа В имеют отличную структуру белков

Значения ГС50 озельтамивира карбоксилата составили от 2,5 до 7,0 нМ для всех устойчивых к ремантадину вирусов гриппа А и 10,0-11,0 нМ - для штаммов вируса гриппа В. В то же время, нейраминидазная активность четырех вирусов гриппа А(НШ1), в гене ЫА которых была обнаружена мутация Н274У, ответственная за резистентность к озельтамивиру, значительно не подавлялась даже при концентрациях препарата выше 100 нМ. Все изученные штаммы вирусов гриппа А и В, включая штаммы резистентные к озельтамивиру и ремантадину, проявляли высокую чувствительность к занамивиру, однако значения 1С50 для вирусов гриппа В (7,50-10,0 нМ) оказались также несколько выше, чем для вирусов гриппа А (0,75-5,00 нМ). Настоящие результаты сравнимы с данными для эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, полученных ранее другими группами исследователей (МсИтт-ВгевсЫап Д. й а1., 2003; БЬеи Т.О. е1 а1.,2008).

Таким образом, в данном исследовании было установлено отсутствие перекрестной резистентности к этиотропным химиопрепаратам: вирусы гриппа А(НМ1), устойчивые к озельтамивиру, оказались чувствительными к занамивиру и ремантадину, в тоже время вирусы гриппа А, устойчивые к ремантадину, проявляли чувствительность к обоим ингибиторам ЫА. Результаты изучения чувствительности вирусов гриппа А и В к ингибиторам ЫА, полученные флуоресцентным методом, полностью совпадали с данными частичного секвенирования генов ЫА.

2.1.2. Изучение подавления репродукции штаммов вирусов гриппа А и В в клетках культуры ткани ЛШСК в присутствии ингибиторов ЫА методом ИФА.

Учитывая простоту постановки клеточного ИФА и его широкие возможности для скрининга чувствительности вирусов гриппа к химиопрепаратам, в настоящей работе этот метод был апробирован для оценки чувствительности штаммов вирусов гриппа А и В к

ингибиторам ЫА. В исследование было включено 69 штаммов вирусов гриппа А и В сезонов 2007-2010 гг., включая 21 штамм пандемического вируса гриппа А(НШ1)у. На основании полученных кривых «доза-ответ» были определены значения ГС50 для каждой группы штаммов (табл.4).

Таблица 4

Значения 1С;оДля озельтамивира карбоксилата и занамивира в отношении штаммов вирусов гриппа А и В с разной чувствительностью к этиотропным препаратам, полученные клеточным ИФА

Вирусы гриппа Число штаммов Чувствительность к этиотропным химиопрепаратам 1С;о, МКМ (мкМоЛь/л)

Озельтамивира карбоксилат Занамивир

А(Н1Ш) 14 Озельтамивир-резистентные 0,8-3,6 0,3-8,6

2 Чувствительные к ингибиторам ЫА и ремантадину <0,8 н.и.**

7 Ремантадин-резистентные <0,8 <0,3

А(НЗ№) 7

7* <0,8 >8,6

В 11 Чувствительные к ингибиторам КА 1,6 ±0,5 2,6-8,6

А(НШ1)у 20 Ремантадин-резистентные 0,5-5,2 <0,3

1 Озельтамивир-резистентный 0,5 ±0,10 н.и.

Всего: 69

* - в отношении этих штаммов были проведены дополнительные исследования на выявление специфических мутаций в гене N2; **- не изучали

Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии противовирусной активности субстанций озельтамивира карбоксилата и занамивира в нетоксичных для клеток культуры ткани МОСК концентрациях. Значения ГС50 озельтамивира карбоксилата в отношении чувствительных к ингибиторам NA, но резистентных к ремантадину эпидемических штаммов вирусов гриппа А составили менее 0,8 мкМ; для устойчивых к озельтамивиру штаммов вируса гриппа А(НШ1) и штаммов вируса гриппа В значения Ю50 были несколько выше - 0,8-3,6 мкМ и 1,6 мкМ соответственно; а для пандемических штаммов А(НШ1)у составили 0,5-5,2 мкМ, причем для одного штамма пандемического вируса гриппа А(НШ1)у, резистентного к озельтамивиру, данный показатель был 0,5 мкМ, что сравнимо с показателями ГС50 для чувствительных вариантов.

Сравнительно более высокая чувствительность к занамивиру (1С5о < 0,3 мкМ) была выявлена у чувствительных к ингибиторам ЫА, но резистентных к ремантадину эпидемических штаммов вируса гриппа А(Н1Ш), штаммов пандемического вируса гриппа А(НШ1)у и 7 штаммов вируса гриппа А(НЗ№). В тоже время 1С50 для резистентных к озельтамивиру штаммов вируса гриппа А(НШ1) и штаммов вируса гриппа В были несколько выше и составили 0,3-8,6 мкМ и 2,6-8,6 мкМ соответственно. Интересные результаты получили в отношении 7 устойчивых к ремантадину штаммов вируса гриппа А(НЗ№), репродукция которых не подавлялась занамивиром в клетках культуры ткани МОСК. Данные штаммы были изучены на наличие мутации (2136К в белке N2, сопутствующей мутации 83Ш в белке М2 (Оара1 е1 а1., 2010), а также других мутаций, отвечающих резистентность к занамивиру. Ни один из известных маркеров резистентности обнаружен не был.

Представляло определенный интерес изучить влияние различных концентраций озельтамивира карбоксилата на репродукцию изолятов вируса гриппа А/Москва/37/08 (НШ1), выделенных из назальных смывов от пациента в течение 4 дней приема препарата (табл.5). Не было выявлено значительных различий между значениями Ю50 для изолятов, выделенных в первые два дня (чувствительные к озельтамивиру) и на третий день лечения (резистентный к озельтамивиру) - 1С<о < 0,8 мкМ. В тоже время, значение Ю50 для резистентного к озельтамивиру изолята вируса гриппа А(НШ1), выделенного на 4-ый день лечения, оказалось значительно выше и составило 3,6 мкМ.

Таблица 5

Значения 1С50 для озельтамивира карбоксилата по отношению к изолятам штамма вируса гриппа А/Москва/37/08 (НШ1), выделенных от пациента в течение 4-х дней приема препарата

Дни выделения Инфекционный титр, 1яТЦИД50 Чувствительность к озельтамивиру 1С ¡о, мкМ

1 день 4,4 OsS <0,8

2 день 4,6 OsS 0,8 ± 0,5

3 день 3,6 OsR (H274Y) 0,8 ± 0,5

4 день 4,4 OsR (H274Y) 3,6 ± 0,5

Значения Ю50 указаны в формате: среднее арифметическое из 3-х независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение

Таким образом, полученные результаты еще раз подтверждают то, что в клетках культуры ткани MDCK популяция вирусов гриппа может быть гетерогенна по чувствительности к ингибиторам NA, и этот факт зависит от различной эффективности связывания вируса с клеточными сиаловыми рецепторами (Calfee D. & Hayden F., 1998; Gubareva L., 2004). Учет таких относительных данных может привести к ложной окончательной оценке противовирусной активности конкретного препарата. Сравнение значений IC50 для ингибиторов NA, полученных разными методами, показало, что данные клеточного ИФА должны быть подтверждены другими методами анализа, в частности, молекулярно-генетическими. Вышесказанное определяет необходимость комплексного подхода для подтверждения случаев резистентности к ингибиторам NA.

2.1.3. Изучение чувствительности эпидемических штаммов вируса гриппа A(H1N1) к озельтамивиру методами на основе ПЦР.

Цель данного раздела заключалась в апробации новых методов на основе ПЦР для изучения чувствительности эпидемических штаммов A(H1N1) к озельтамивиру. Исследования были проведены совместно с сотрудниками ЦЭЭГ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (к.б.н. С.В. Альховский и к.б.н. А.Г. Прилипов), ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (к.б.н. Д.Д. Абрамов) и CDC&P (Атланта, США). Использовали следующие методы: RT-PCR/RFLP и две отечественные тест-системы на основе ОТ-ПЦР-РВ, детектирующих 274 (His—<Туг) мутацию белка N1 (табл.6). В качестве контрольного метода использовали частичное секвенирование гена N1. В исследование было включено 7 эпидемических штаммов вируса гриппа A(H1N1) сезона 2006-2007 гг., 43 штамма A(H1N1) эпидсезона 20072008 гг. и 130 штаммов вируса гриппа A(HINI) сезона 2008-2009 гг.

Таблица 6

Корреляция результатов, полученная при изучении чувствительности к озельтамивиру штаммов вируса гриппа А(НШ1) разными молекулярно-генетическими методами

Количество вирусов гриппа A(H1N1), исследованных методами

Эпидемический RT-PCR/RFLP ОТ-ПЦР-РВ ОТ-ПЦР-РВ Частичное

сезон (H274Y TaqMan probes) (H274Y Kissing probes) секвенирование гена NI Корреляция

OsS* OsR OsS OsR OsS OsR OsS OsR

2006-2007 гг. 6/6 (100%) 0/6 (0%) He изучали He изучали 3/3 (100%) 0/3 (0%) 100%

2007-2008 гг. 21/42 21/42 20/34 14/34 17/23 6/23 22/43 21/43 100%

(50%) (50%) (59%) (41%) (74%) (26%) (51%) (49%)

2008-2009 гг. 10/128 118/128 8/47 39/47 10/48 38/48 4/13 9/13 100%

(8%) (92%) (17%) (83%) (21%) (79%) (31%) (69%)

OsS (OsR)* - озельтамивир чувствительный (резистентный) вариант

Выявлена 100% корреляция данных, полученных разными молекулярно-генетическими методами. Достоверность результатов была подтверждена молекулярно-генетическим анализом последовательностей нуклеотидов в генах N1 эпидемических вирусов гриппа A(H1N1).

Таким образом, в результате апробации трех новых тест-систем было установлено, что рестрикционный метод RT-PCR/RFLP с электрофорезной детекцией конечных результатов специфичен и чувствителен, но достаточно трудоемок и сравним по количеству этапов и продолжительности постановки с методом частичного секвенирования. Две тест-системы на основе ОТ-ПЦР-РВ (H274Y TaqMan probes; H274Y Kissing probes) оказались высокоспецифичными и эффективными и могут успешно применяться в эпидемиологических службах для мониторинга чувствительности вирусов гриппа A(H1N1) к озельтамивиру. В дальнейшем тест-система с использованием H274Y Kissing probes была модифицирована для детекции маркерной мутации H275Y в NA пандемических вирусов гриппа A(HlNl)v, отвечающей за резистентность к озельтамивиру.

Следует подчеркнуть необходимость разработки тестов на основе ОТ-ПЦР для оперативной диагностики резистентных к ингибиторам NA вариантов в популяции вирусов гриппа A(H3N2) и В, так как основными методами, используемыми в этих целях на сегодняшний момент, являются частичное секвенирование генов NA и флуоресцентный (хемилюминесцентный) методы.

2.2. Оценка чувствительности эпидемических и пандемических штаммов вирусов гриппа А и В сезонов 2006-2010 гг. к антинейраминидазным препаратам.

В настоящее время изучение противовирусной активности химиопрепаратов остается приоритетным направлением исследований во многих странах мира (WHO, 2009). В связи с вышесказанным, наряду с оценкой специфичности новых методов на протяжении всего периода исследований в настоящей работе предполагалось решение следующих задач: оценка частоты возникновения естественно циркулирующих на территории РФ, резистентных к ингибиторам NA вирусов гриппа А и В, вызвавших эпидемии последних лет,

а также оценка риска формирования резистентных к озельтамивиру штаммов вирусов гриппа на фоне приема препарата пациентами в период заболевания.

2.2.1. Чувствительность эпидемических штаммов вируса гриппа A(H1N1) к озельтамивиру.

Учитывая возникновение с ноября 2007 г. резистентных к озельтамивиру вирусов гриппа A(H1N1), исследования по изучению чувствительности к этому препарату штаммов, циркулировавших на территории РФ, были расширены применением вышеперечисленных молекулярно-генетических методов (табл.6).

В исследование было включено 180 штаммов вируса гриппа A(H1N1), изолированных на территории РФ в период 2006-2009 гг. В эпидемическом сезоне 2007-2008 гг. из 43 изученных штаммов вируса гриппа A(H1N1) двадцать один (49%) имел генетическую мутацию H274Y в белке N1, что свидетельствовало о резистентности к озельтамивиру (рис.1). В сезоне 2008-2009 гг. уже 120 (92%) из 130 исследованных эпидемических штаммов вируса гриппа А(НШ1) содержали маркер устойчивости H274Y. В тоже время 14 изученных в этом же сезоне штаммов вируса гриппа A(H1N1) были чувствительны к занамивиру. Полученные результаты соответствовали актуальной информации ВОЗ об увеличении числа резистентных к озельтамивиру естественно циркулирующих вирусов гриппа A(H1N1) во всем мире (WHO, 2008, 2009).

Таким образом, в период 2007-2009 гг. впервые был установлен факт циркуляции и распространения на территории РФ штаммов вируса гриппа А(НШ1), несущих мутацию, ответственную за резистентность к озельтамивиру.

1 ч

(и

I я

I I

е р.

110% ■ 100%' 90% ■ 80%-70%-60% 50% 40% 30% 20%-10%-0%-

A(H3N2) В

В A(H1N1)v

□ А(Н1 N1) D A(H3N2)

□ В

■ A(H1N1)v

2007-2008 2008-2009 2009-2010

Эпидемические сезоны, гг

Рис.1. Чувствительность к озельтамивиру штаммов вирусов гриппа А и В в период 2007-2010 гг.

2.2.2. Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H3N2) и В к ингибиторам NA.

Исследование было проведено совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (к.б.н. А.Г. Прилипов), ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (к.б.н. Д.Д. Абрамов) и CDC&P (Атланта, США). В исследование было включено 37 штаммов вируса гриппа A(H3N2) и 31 штамм вируса гриппа В, изолированных на территории РФ в период 2006-2010 гг. В качестве основного метода изучения чувствительности вирусов гриппа A(H3N2) и В к ингибиторам NA использовали метод частичного секвенирования генов NA для обнаружения известных маркерных мутаций, ответственных за резистентность.

Все изученные вирусы гриппа A(H3N2) и В оказались чувствительными к озельтамивиру и занамивиру, что в целом коррелировало с данными, полученными другими исследователями, по низкой частоте (<1%) выявления устойчивых к ингибиторам NA вирусов гриппа этих подтипов (Monto A.et al.,2006; Lackenby A.et al.,2007) (рис.1).

2.2.3. Чувствительность пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)v к ингибиторам NA.

Конец эпидемического сезона 2008-2009 гг. был связан с появлением нового пандемического штамма вируса гриппа A(HlNl)v, подобного свиному. Первый случай инфицирования в РФ был выявлен 21.05.09 методом ОТ-ПЦР-РВ, а штамм A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl выделен 24.05.09 в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва (акад. РАМН, проф. Д.К. Львов с соавт., 2009). Исследование чувствительности к ингибиторам NA штаммов A(HlNl)v было проведено совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (к.б.н. А.Г. Прилипов) и ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (к.б.н. Д.Д. Абрамов). В исследование было включено 49 пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)v, выделенных в период 20092010 гг. из носоглоточных смывов и секционного материала. Для определения чувствительности вирусов гриппа A(HlNl)v к озельтамивиру использовали ОТ-ПЦР-РВ тест-систему (H275Y Kissing probes) и частичное секвенирование гена NA с целью индикации маркерной мутации, ответственной за резистентность к озельтамивиру: H275Y (Harvala H. et al., 2009; WHO WER, 2010).

Все изученные пандемические штаммы вируса гриппа A(HlNl)v оказались чувствительными к озельтамивиру (рис.1). Однако следует отметить, что к 16 июня 2010 г. было выявлено более чем 300 озельтамивир-устойчивых пандемических штаммов по всему миру, включая такие регионы как Китай, Шотландию, США, Вьетнам и Канаду, что в целом не превышало 1,0% от общего количества исследованных вирусов гриппа, при этом они сохранили чувствительность к занамивиру (WHO WER, 2010). Результаты метода клеточного ИФА в отношении 20 пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)v, выделенных в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, выявили их высокую чувствительность к занамивиру, при этом значения IC50 составляли менее 0,3 мкМ.

2.2.4. Изучение частоты возникновения резистентных к озельтамивиру мутантов на фоне приема препарата у больных гриппом.

Поскольку ингибиторы NA представляют собой лекарственные средства последнего поколения, рекомендованные экспертами ВОЗ для лечения и профилактики гриппа, исследования по изучению риска формирования резистентности на фоне курса лечения проводятся во всем мире с большим интересом. Учитывая изложенное, в настоящей работе исследовали назальные смывы, взятые от пациентов с диагнозом «грипп», госпитализированных в ИКБ № 1 г. Москва и прошедших 5-ти дневные курсы лечения озельтамивиром в эпидемические сезоны 2006-2010 гг. Исследования проведены совместно с сотрудниками лаборатории респираторных вирусных инфекций с апробацией лекарственных средств (д.м.н., проф. Колобухина Л.В., к.м.н. Меркулова Л.Н.) и лаборатории молекулярной диагностики (д.б.н. Т.В. Гребенникова, к.б.н. М. Ротанов) НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Диагноз подтверждали выделением вируса на клетках культуры ткани МОСК с последующим типированием изолятов в РТГА и коммерческих тест-системах на основе ОТ-ПЦР-РВ. Чувствительность изолятов вирусов гриппа А и В к озельтамивиру оценивали методом частичного секвенирования генов ИА и с помощью тест-систем на основе ОТ-ПЦР.

В эпидемическом сезоне 2006-2007 гг. в группе из 10 пациентов, принимавших курс лечения озельтамивиром, удалось изолировать вирусы гриппа у 10 человек на 1-ый день, у 4 пациентов - на 2-ой день и у 2 пациентов - на 3-ий день лечения. В контрольной группе из 7 пациентов, у которых на 1-ый день были выделены вирусы гриппа, у 5 пациентов вирусы изолировали на 2-ой день и у 2 пациентов - до 3-его дня. Частота изоляции вирусов гриппа по дням распределилась одинаково в обеих группах (табл.7). Инфекционные титры штаммов, выделенных от пациентов контрольной группы, были достоверно выше аналогичных показателей для штаммов, выделенных от больных, принимавших озельтамивир. У 2 из 5 вирусов гриппа отмечено статистически достоверное увеличение показателей инфекционных титров в динамике (на 2 ^ТЦИДзо), что не обнаруживалось в группе вирусов от пациентов, принимавших озельтамивир. Проведен анализ аминокислотных последовательностей ИА штаммов вирусов гриппа А и В, выделенных в динамике лечения от пациентов обеих групп исследования, результаты которого выявили отсутствие маркерных мутаций, ответственных за резистентность к озельтамивиру.

В клиническом исследовании 2007-2008 гг. в группе пациентов, принимавших курс лечения озельтамивиром, удалось изолировать вирусы гриппа у 6 (50%) из 12 человек на 1-ый день, у 5 пациентов - на 2-ой и 3-ий дни, у 4 - на 4-ий день и у 1 пациента - на 5-ый день лечения. В контрольной группе из 14 пациентов, у 13 человек были выделены вирусы гриппа на 1-ый день, у 9 пациентов вирусы изолировали на 2-ой день, у 7 - на 3-ий день, у 5 пациентов - на 4-ый день, у 2 - на 5-ый день лечения.

При молекулярно-генетическом анализе изолятов, выделенных в динамике у двоих пациентов основной группы, исходно, до начала приема препарата были обнаружены резистентные к озельтамивиру штаммы вируса гриппа А(НШ1), а у пациента, с исходно чувствительными вариантами вируса гриппа А(НШ1), озельтамивир-резистентные варианты сформировались на 3-ий и 4-ый дни лечения. Для изолятов этих вирусов не было отмечено статистически достоверного изменения показателей инфекционных титров в динамике, что

указывает на то, что вирусная репродукция была стабилизирована под воздействием препарата. В тоже время, для изолята вируса гриппа, выделенного на 4-ый день лечения, отмечено некоторое увеличение значения инфекционного титра с 3,6 lg до 4,4 Ig - что может быть следствием формирования резистентности в результате курса лечения.

Независимо от группы исследования, у 6 (55%) из 11 пациентов, инфицированных штаммами A(H1N1), были обнаружены озельтамивир-устойчивые варианты вируса гриппа уже в первые дни лечения, что свидетельствует об изначальном инфицировании людей резистентными мутантами. Все штаммы вирусов гриппа A(H3N2) и В, изолированные от пациентов обеих групп, оказались чувствительными к озельтамивиру.

В клиническом исследовании в период пандемии 2009-2010 гг. удалось изолировать вирусы гриппа A(HlNl)v у 11 (73%) из 15 человек, прошедших курс лечения озельтамивиром, причем у 10 пациентов - на 1-ый день лечения и у 1 пациента - только на 5-ый день. В клинических образцах от этого пациента на 3-ий и 4-ый дни лечения были обнаружены чувствительные к озельтамивиру варианты вируса гриппа A(HlNl)v, а на 5-ый день в носоглоточном смыве была идентифицирована смесь как чувствительного, так и резистентного к озельтамивиру варианта. Результаты секвенирования гена NA вируса гриппа A/IIV-Moscow/] 7/10 (HlNl)swl, изолированного из данного смыва, показали наличие мутации H275Y в этом белке, что указывало на формирование устойчивого к озельтамивиру варианта. Штаммы вируса гриппа A(HlNl)v, выделенные из остальных клинических образцов, были чувствительны к озельтамивиру.

Таким образом, результаты клинического исследования в 2006-2007 гг. свидетельствуют о том, что озельтамивир эффективно подавлял репродукцию вирусов гриппа. Лечение, начатое в первые 24-36 ч. после начала заболевания, приводило к стабилизации инфекционного титра вирусов, выделенных в динамике лечения. Однако, в клиническом исследовании 2007-2008 гг. впервые был установлен факт формирования резистентного к озельтамивиру штамма вируса гриппа A(H1N1) на 3-ий день лечения препаратом, что совпадает с данными литературных источников о том, что резистентность чаще всего формировалась к 4 дню лечения (Roberts N. & Govorkova Е., 2009; Dutkowski R., 2010). В результате клинического исследования 2009-2010 гг. удалось выявить формирование резистентного к озельтамивиру варианта пандемического вируса гриппа A(HlNl)v на 5-ый день лечения препаратом, что свидетельствует о необходимости дальнейших исследований по оптимизации противовирусной терапии у людей, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом. Актуальная на тот период времени информация ВОЗ указывала на то, что уже в ноябре-декабре 2009 г. в Шотландии и в Австралии от пациентов с нарушениями иммунного статуса были изолированы устойчивые к озельтамивиру штаммы вируса гриппа A(HlNl)v (WHO, 2009; Tramontana et al., 2010).

Сезонные штаммы вирусов гриппа А/Москва/37/08 (H1N1) и А/Москва/118/08 (H1N1), изолированные на 1-ый и 3-ий дни курса лечения озельтамивиром соответственно, и пандемический штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/17/10 (HlNl)swl, изолированный на 5-ый день лечения, были депонированы в Государственную Коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (№ депонентов 2478, 2477 и 2609 соответственно).

Таблица 7

Результаты обследования пациентов с гриппозной инфекцией в клинических наблюдениях, проведенных в сезонах 2006-2010 гг.

Эпидемический сезон 2006-07 гг. Эпидемический сезон 2007-08 гг. Пандемия 2009-10 гг.

Дни изоляции штаммов Вирусы гриппа А и В, (7g ТЦИД;о в динамике лечения) Чувст -ность к озельта мивиру Дни изоляции штаммов Вирусы гриппа А и В, (1ц ТЦИД50 в динамике лечения) Чувст -ность к озельта мивиру Дни изоляции штаммов Вирус гриппа А(НШ1> Чувст -ность к озельта мивиру

Основная группа (озельтамивир) - 10 пациентов (указаны 5 вирусов, изолированных в динамике лечения) Основная группа (озельтамивир) - 12 пациентов (6 вирусов удалось изолировать) Основная группа (озельтамивир) - 15 пациентов (11 вирусов удалось изолировать)

1,2 дни А/Москва/22/07 (НЗК2) (4,5-4,5 1й) ОБЭ 1 день А/Москва/43/08 (НЗЮ) 1,2 дни А/П У-Мозсоху/О1 /09

1 -3 дни А/Москва/26/07 (НЗЫ2) (4,5-4,5-4,5 1В) 1-4 дни В/Москва/30/08 1 день А/ПУ-Мо5Сош/12/09

1,2 дни А/Москва/13/07 (Н1М1) (5,3-5,3 18) ОэБ 1 день 2 день 3 день 4 день А/Москва/37/08 (НШ1) (4,4-4,6 А/Москва/118/08 <НШ1) (3,6-4,418) ОьЯ ОьЯ 1 день А/ПУ-Мобсоху/10/09

1,3 дни А/Москва/14/07 (НШ1) (4,5-3,5 1В) ОзЭ 1-3 дни А/Москва/36/08 (/ИМ) ОхЯ 1 день А/ПУ-Мозсо\у/07/09

1,2 дни А/Москва/27/07 (НШ1) (4,5-4,5 1В> ОбЭ 1-4 дни А/Москва/38/08 (НШ1) О.чЯ 1 день А/НУ-Мо5со\\г/08/09

Контрольная группа - 7 пациентов (указаны 5 вирусов, изолированных в динамике лечения) 1-5 дни В/Москва/16/08 ОзБ 1,2 дни AЛIV-Moscow/03/09 058

1-3 дни В/Москша/18/07 (2.0-5.0-5.81е) № Контрольная группа — 14 пациентов (14 вирусов удалось изолировать) 1 день А/ПУ-Мовсош/11/09 ОББ

1 -3 дни В/Москва/16/07 (2,5-2,5-1,5 ОзБ 1 -5 дни 4 штамма вируса гриппа А(НШ1) ОэБ 5 день А/11У-Мо5соп>/17/10

и дни А/Москяа/111/07 (НЗЮ) f3.S-5.3le) оьу 1-4 дни 4 штамма вируса гриппа А(НШ1) 1 день А/НУ-Мозсои//15/09 ОзБ

1,2 дни А/Москва/67/07 (НЗШ) (4,5-3,7 1й) 058 1-3 дни 2 штамма вируса гриппа А(НЗ№) ОэЗ 1 день А/ИУ-Мо5сош/05/09

1,2 дни А/Москва/37/07 (НШ1) (6,3-6,0 1й) - 1-5 дни 4 штамма вируса гриппа В ОБЗ 1 день А/НУ-Moscow/09/09 ОБЭ

(ОвВД* - озельтамивир чувствительный (резистентный) вариант

2.3. Изучение олигосахаридной специфичности ^ штаммов эпидемического и пандемического вирусов гриппа А.

Одним из параметров, анализируемых в настоящей работе, является субстратная специфичность вирусов гриппа А - совокупность активностей ЫА по отношению ко всем использованным 08-В001РУ, определяемая в идентичных условиях, отвечающих линейной кинетике реакции десиалирования (табл.2). Выбор данных сиалилолигосахаридов был обусловлен тем, что все они входят в состав клеточных рецепторов, к которым чувствительны вирусы гриппа млекопитающих и птиц (МосЬа1оуа Ь. е1 а1., 2007). Исследования проводили совместно с сотрудниками лаборатории углеводов ИБХ РАН.

■ А/Москва/37/08 (H1N1) OsS □ А/Москва/118/08 (H1N1) OsR

Б)

A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl

A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl

3'SLN SLec SLex SLeA 6'SLN

3'SLN SLeL SLex SLeA 6'SLN

, 1 pb А

- - SU - BLt' - SU

Рис. 2. Профили субстратной специфичности NA А) пары сезонных вирусов гриппа А/Москва/37/08 (H1N1) и А/Москва/118/08 (H1N1), чувствительного и резистентного к озельтамивиру соответственно, нормированные по субстрату 3'SL; Б) пандемических вирусов гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl и A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl в пересчете на 1 ГАЕ; В) пандемического вируса гриппа A/IIV-Orenburg/93/09 (HlNl)swl (D222G и D222E в Hl), выделенного от пациента с летальным исходом. По оси абсцисс отмечены субстраты NA, по оси ординат значения кинетической специфичности

2.3.1. Субстратная специфичность нейраминндазы эпидемических штаммов вируса гриппа A(H1N1), чувствительного и резистентного к озельтамивиру.

Исследование влияния мутации H274Y в активном центре NA на профиль субстратной специфичности фермента является крайне актуальной задачей в связи с зарегистрированным с конца 2007 г. увеличением количества устойчивых к озельтамивиру эпидемических вирусов гриппа A(H1N1) (WHO, 2008). Таким образом, целью данного исследования являлась оценка и сравнение профилей субстратной специфичности NA вирусов гриппа А/Москва/37/08 (H1N1) (OsS - Н274) и А/Москва/118/08 (H1N1) (OsR - Y274), выделенных от одного пациента на 1-ый и на 3-ий дни лечения. При сравнении профилей кинетической субстратной специфичности NA каждого из вирусов, наблюдались лишь незначительные различия, не превышающие 10%, что близко к величине ошибки использованного флуоресцентного метода (рис.2А). Результаты по кинетике гидролиза не совпадали с данными, полученными другими исследователями, по отношению к единственному субстрату MU-NANA (Rameix-Welti М. et al., 2008; Wu W. et al, 2010): для вирусов гриппа A(H1N1) с H274Y мутацией в белке N1 значения кинетической субстратной специфичности были значительно ниже по сравнению с чувствительными к озельтамивиру вирусами гриппа A(H1N1), что указывало на различное сродство NA диких и мутантных вирусов гриппа A(H1N1) к субстрату.

Исследованные NA штаммов вируса гриппа A(H1N1) более эффективно расщепляют а2-3 сиалозиды, причем для данных вирусов характерна дискриминация ацетамидной группы при остатке галактозы (различие между 3'SL и 3'SLN), а также типа связи между галактозой и предшествующим остатком (1-4 в случае 3'SLN или 1-3 в случае SLec). Соотношение активностей расщепления 3'SL/6'SL сиалозидов нейраминидазами вирусов гриппа А/Москва/37/08 (H1N1) и А/Москва/118/08 (H1N1) равное 5 характеризует эти вирусы, как вирусы гриппа А, изолированные от человека. Фукозилированные олигосахариды (SLex и SLeA) расщеплялись менее эффективно, что соответствует данным в отношении NA вирусов гриппа А человека в ранее опубликованных работах (Katinger D. et al., 2004; Kobasa D. et al., 2001; Shtyrya U. etal, 2009).

2.3.2. Субстратная специфичность нейраминндазы пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)v, изолированных от инфицированных людей с различным исходом заболевания.

В связи с появлением с 2009 г. новых штаммов вирусов гриппа A(HlNl)v, подобных свиным, с рецепторной специфичностью НА как к а2-6, так и к а2-3 сиалозидам, которые выстилают клетки верхних и нижних отделов респираторного тракта соответственно (Gambaryan A. et al., 2005; Львов Д.К. с соавт., 2010), целью настоящего раздела являлось изучение их нейраминидазной специфичности. Анализировали следующие пандемические штаммы: A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl, A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl, изолированные от людей с благоприятным исходом, и A/IIV-Orenburg/93/09 (HlNl)swl, выделенный от пациента с летальным исходом.

NA пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl оказалась активнее по сравнению с NA штамма A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl (рис.2Б).

Нейраминидазы обоих исследованных вирусов гриппа A/HV-Moscow/01/09 (HlNl)swl и A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl расщепляют субстрат, содержащий остаток фукозы - SLex, в 3 раза менее эффективно, чем аналогичную линейную структуру (3'SLN), что говорит о том, что NA этих вирусов не обладают чертами, характерными для высокопатогенных вирусов гриппа А. Соотношение кинетической специфичности расщепления линейного и фукозилированного субстратов SLec/SLeA для вируса гриппа A/IlV-Moscow/01/09 (HlNl)swl составило 2,4 - что характерно для вирусов гриппа А птиц; а для вируса гриппа A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl это соотношение составило 8, что более характерно для вирусов гриппа, выделенных от свиней. Соотношение активностей расщепления связей а2-3/а2-6 в сиапозидах для NA вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl составило 6, что соответствует значениям для вирусов гриппа А, изолированным от человека; а для NA вируса гриппа A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl - 16, что указывает на свойства вирусов гриппа, выделенных от свиней. Полученные данные коррелируют с молекулярно-генетическим анализом генома вирусов A(HlNl)v, который является результатом тройной реассортации вирусов гриппа А свиньи, человека и птиц (WHO,2009).

Профиль субстратной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Orenburg/93/09 (HlNl)swI неоднозначен и демонстрирует сродство ко всем изученным сиалозидам, видимо, из-за содержания в изучаемом образце обоих мутантных вариантов -(D—>G и D—>Е) в 222 позиции HI вируса гриппа, поэтому сложно охарактеризовать вклад каждого из них в общий профиль (Львов Д.К. с соавт., 2010) (рис.2В). Следует также отметить, что NA данного вируса различает тип связи (1-4 в случае 3'SLN или 1-3 в случае SLec) между галактозой и последующим остатком N-ацетилглюкозамина. NA вируса гриппа A/IIV-Orenburg/93/09 (HlNl)swl способна расщеплять субстрат, содержащий остаток фукозы (SLex), с такими же кинетическими параметрами, как и аналогичную линейную структуру (3'SLN), что характерно для NA высокопатогенных вирусов гриппа А. В тоже время приблизительное равенство двух соотношений по кинетической специфичности (SLec/SLeA ~ 3'SLN/6'SLN = 1) характерно для NA вирусов гриппа А человека. По сравнению с ранее изученными не мутантными вариантами пандемических вирусов гриппа A/IIV-Moscow/01 /09 (HlNl)swl и A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl (D222 в HI), изолированными от вылечившихся пациентов, вирус A/IIV-Orenburg/93/09 (HlNl)swl приобретает двойственную аффинность к обоим типам ковалентных связей в сиалозидах между N-ацетилнейраминовой кислотой и последующим остатком галактозы (а2-3/а2-6). Полученные результаты коррелируют с данными по рецепторной специфичности НА таких мутантных вирусов гриппа A(HlNl)v и объясняют их тропность к рецепторам клеток верхних (преимущественно а2-6 рецепторы) и нижних (преимущественно а2-3 рецепторы) отделов респираторного тракта, что приводит к утяжелению течения инфекции (Stevens Y., 2004; WHO, 2009; Львов Д.К. с соавт., 2010).

выводы

1. Результаты проведенных исследований выявили различную специфичность методов оценки подавления нейраминидазной активности вирусов гриппа, возможность детекции маркерных мутаций методами на основе ОТ-ПЦР, а также гетерогенность популяции штаммов вирусов гриппа по чувствительности к аналогам природных субстратов.

2. Флуоресцентным методом определены значения минимальной ингибирующей концентрации (IC50) озельтамивира карбоксилата и занамивира, которые составили 2,5-11,0 нМ 0,75-10,0 нМ соответственно, для российских штаммов вирусов гриппа А и В, чувствительных к ингибиторам нейраминидазы (2008-2009 гг.).

3. Показаны различия по активности подавления репродукции штаммов вирусов гриппа А и В субстанциями озельтамивира карбоксилата (ICso< 0,8-5,2 мкМ) и занамивира (IC50 < 0,3-8,6 мкМ) в клетках культуры ткани MDCK. У 7 штаммов вируса гриппа A(H3N2) с пониженной чувствительностью к занамивиру, выявленной клеточным ИФА, маркерных мутаций устойчивости к этому препарату обнаружено не было, что указывает на ограниченность широкого применения этого метода.

4. Установлено, что изученные ОТ-ПЦР тест-системы (RT-PCR/RFLP, 1 - на основе TaqMan probes и 2 - на основе Kissing probes) являются высокоспецифичными для детекции маркерных мутаций устойчивости к озельтамивиру в гене NA штаммов A(H1N1) и A(HlNl)v и могут быть использованы для мониторинга чувствительности вирусов гриппа к этому препарату.

5. Выявлен факт появления в РФ в конце 2007 г. резистентных к озельтамивиру штаммов в популяции вируса гриппа A(H1N1) и последующий рост их числа, достигший 92,0% в сезоне 2008-2009 гг., при этом циркуляция резистентных мутантов не была связана с приемом этого препарата. Показано, что все исследованные штаммы вирусов гриппа A(H3N2), В и A(HlNl)v оказались чувствительными к озельтамивиру и занамивиру.

6. Установлено отсутствие у штаммов вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и A(HlNl)v перекрестной резистентности к этиотропным химиопрепаратам с разным механизмом действия.

7. Впервые в РФ выделены резистентные к озельтамивиру штаммы вирусов гриппа А (А/Москва/118/2008 (H1N1) и A/IIV-Moscow/17/2010 (HlNl)swl) от пациентов на фоне приема препарата (3-ий и 5-ый день соответственно), что определяет актуальность применения комбинированных схем лечения противовирусными лекарственными средствами.

8. Показано, что замена His274Tyr в активном центре NA эпидемического штамма вируса гриппа А/Москва/118/2008 (H1N1), обеспечивающая устойчивость к озельтамивиру, не привела к изменению профиля кинетической субстратной специфичности NA, который был сравним с профилем чувствительного к озельтамивиру штамма вируса гриппа А/Москва/37/2008 (H1N1).

9. Определено, что профиль олигосахаридной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl имеет особенности, свойственные для вирусов, выделенных от свиней, птиц и человека. Профиль субстратной специфичности NA

вируса гриппа A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl характерен для вирусов, выделенных от свиней.

10. Установлено, что профиль субстратной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/I I V-Orenburg/93/09 (HlNl)swl, изолированного от пациента с летальным исходом, демонстрирует двойственную аффинность к а2-3 и а2-6 сиалозидам. Способность NA этого вируса расщеплять фукозилированные (SLex) и линейные (3'SLN) структуры субстратов с одинаковой эффективностью характерна для высокопатогенных вирусов гриппа А.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Белякова Н.В. и др. Спектр чувствительности эпидемических штаммов вирусов гриппа к ремантадину и арбидолу.// Материалы IX Съезда Всероссийского науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва.- 2007.-Т.1.-С. 235-236.

2. Колобухина Л.В., Меркулова Л.Н., Бурцева Е.И., Исаева Е.И., Щелканов М.Ю., Белякова Н.В. и др. Эффективность озельтамивира (Tamiflu™) при гриппе у взрослых во время эпидемического подъема заболеваемости в России в сезоне 2006-2007 гг.// Вопр. вирусол,- 2008,- № 4.-С. 23-26.

3. Шевченко Е.С., Бурцева Е.И., Белякова Н.В. Чувствительность вирусов гриппа к химиопрепаратам в России.//Материалы VII Конгресса детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва.-2008.-№ 260.-С. 170-171.

4. Белякова Н.В., Шевченко Е.С., Ротанов М. Методы детекции чувствительности эпидемических штаммов вирусов гриппа к озельтамивиру (ТашШи™).//Тезисы XVI интернациональной конференции «Ломоносов-2009», Москва.-2009.-С. 4 (№ тезиса 27_474_3187).

5. Shevchenko E.S., Burtseva E.I., Beliakova N.V. et al. Drug susceptibility of Influenza Viruses Circulating in Russia.// In Abstract Book of BIT's 7th Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology 2009 (IDDST-2009) «Milestones of Innovative Therapeutics», Shanghai, China.- 2009,- P.586.

6. Beliakova N.V., Alkhovskiy S.V., Shevchenko E.S., Burtseva E.I. Methods of Detection the Oseltamivir-Resistant Mutants among Influenza A Viruses.//In Abstract Book of BIT's 7th Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology 2009 (IDDST-2009) «Milestones of Innovative Therapeutics», Shanghai, China.- 2009.- P.609.

7. Иванова B.T., Трушакова C.B., Оскерко T.A., Шевченко Е.С., Колобухина Л.В., Вартанян Р.В., Белякова Н.В. и др. Характеристика циркулировавших в России в сезоне 2007-2008 гг. эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В.// Вопр. внрусол.-2009.-№ 5.-С. 28-33.

8. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов А.Г., Базарова М.В., Колобухина Л.В., Меркулова Л.Н., Малышев Н.А., Дерябин П.Г., Федякина И.Т., Садыкова Т.К., Усачев Е.В., Щелканов М.Ю., Шевченко Е.С., Трушакова С.В., Иванова В.Т., Белякова Н.В. и др. Изоляция

24.05.2009 и депонирование в Государственную Коллекцию вирусов (ГКВ № 2452 от 24.05.2009) первого штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl, подобного свиному вирусу A(H1N1) от первого выявленного 21.05.2009 больного в Москве.// Вопр. випусол. -2009.-№ 5.-С. 10-14.

9. Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Белякова Н.В. и др. Мониторинг чувствительности выделенных в России эпидемических штаммов вирусов гриппа к этиотропным химиопрепаратам.// Вопр. вирусол.-2009.-№ 5.-С. 24-28.

10. Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Трушакова C.B., Прилипов А.Г., Щелканов М.Ю., Шевченко Е.С., Колобухина Л.В., Меркулова Л.Н., Оскерко Т.А., Белякова Н.В. и др. Особенности этиологии эпидемии гриппа 2008-2009 гг. в России, начало новой пандемии.// Тезисы Всероссийской Научной Конф. «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций», Санкт-Петербург.-2009.-С. 157-158.

11. Белякова Н.В., Шевченко Е.С., Бурцева Е.И. и др. Чувствительность вирусов гриппа к этиотропным препаратам, обоснование тактики лечения и профилактики.//Материалы VIII Конгресса детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва.- 2009.-№ 31.-С. 17-18.

12. Бурцева Е.И., Иванова В.Т., Шевченко Е.С., Белякова Н.В. и др. К-проблемам специфической профилактики гриппа в последние годы.//Бюллетень проблемной комиссии «Грипп и гриппоподобные инфекции (включая особо опасные формы гриппозной инфекции). Фундаментальные и прикладные аспекты изучения», Санкт-Петербург.-2009,- С.13-15.

13. Белякова Н.В., Шевченко Е.С. Чувствительность пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)swl к специфическим химиопрепаратам в России./АГезисы XVII международной конференции «Ломоносов-2010», Москва.-2010.-№ тезиса 58_980_3187.

14. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г., Колобухина Л.В., Малышев H.A., Базарова М.В., Меркулова Л.Н., Дерябин П.Г., Кузьмичев А.Г., Федякина И.Т., Гребенникова Т.В., Усачев Е.В., Садыкова Г.К., Шевченко Е.С., Трушакова C.B., Лаврищева В.В., Альховский C.B., Самохвалов Е.И., Белякова Н.В. и др. Распространение нового пандемического вируса гриппа A(HlNl)v в России. // Вопр. вирусол. -20Ю.-№ З.-С. 4-9.

15. Белякова Н.В., Альховский C.B., Шевченко Е.С. и др. Изучение чувствительности эпидемических штаммов вируса гриппа A(H1N1), изолированных в России в сезоны 20062009 гг., к озельтамивиру (Tamiflu™) с помощью молекулярно-генетических методов.// Вопр. вирусол.-2010.-№ 5.-С. 10-13.

16. Burtseva Е., Shevchenko Е.,.1., Belyakova N. et al. Survelliance of the Antiviral Susceptibility of Seasonal and Pandemic Influenza Viruses in Russia.// In Abstract Book of «Options for the control influenza VII», Hong Kong SAR, China.- 2010,- № P-165.-P.142-143.

17. Удостоверение № 2478 выдано в том, что в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского 12 декабря 2009 г. депонирован авторский штамм вируса гриппа А/Москва/37/2008 (H1N1). Авторами штамма являются Белякова Н.В., Бурцева Е.И., Шевченко Е.С. и др.

18. Удостоверение № 2477 выдано в том, что в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского 12 декабря 2009 г. депонирован авторский штамм вируса гриппа А/Москва/118/2008 (H1N1). Авторами штамма являются Белякова Н.В., Бурцева Е.И., Шевченко Е.С. и др.

19. Удостоверение № 2609 выдано в том, что в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского 1 июля 2010 г. депонирован авторский штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/17/2010 (HlNl)swl. Авторами штамма являются Львов Д.К., Белякова Н.В., Бурцева Е.И. и др.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность и глубокую признательность своему научному руководителю заведующей лабораторией этиологии и эпидемиологии гриппа НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, доктору медицинских наук Е.И. Бурцевой за предоставленную возможность проведения исследований, за научное руководство и ценные рекомендации, высказанные в ходе обсуждения результатов диссертации;

к.м.н. А.Л. Беляеву, к.м.н. Е.С. Шевченко, д.б.н. В.Т. Ивановой и всему коллективу лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского за участие и помощь при проведении лабораторных исследований и научных дискуссий;

сотрудникам Лаборатории экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского к.б.н. И.Т. Федякиной и к.б.н. Е.И. Самохвалову (зав. лаб., академик РАМН, д.м.н., проф. Д.К. Львов), зав. лаб. физиологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, академику РАМН, д.м.н., проф. Н.В. Каверину за консультативную помощь при обсуждении результатов диссертации;

зав. лаб. структуры и морфогенеза вирусов, академику РАМН, д.м.н., проф. С.М. Клименко, д.м.н., проф., Л.Л. Фадеевой, к.б.н. И.А. Киселевой, В.П. Лапшиной, И.В. Галкиной за помощь и ценные советы при оформлении диссертации и необходимых сопроводительных документов;

сотрудникам НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского: зав. лаб. биотехнологии, к.б.н. C.B. Альховскому, Лаборатории молекулярной генетики (зав. лаб., к.б.н. А.Г. Прилипов), Лаборатории молекулярной диагностики (зав. лаб., д.б.н. Т.В. Гребенникова, к.б.н. М. Ротанов), Лаборатории Государственной Коллекции вирусов (зав. лаб., д.м.н., проф. П.Г. Дерябин, А.Г. Ботиков, Д.В. Мишин), Лаборатории химиотерапии вирусных инфекций (зав. лаб., д.б.н., проф. Г.А. Галегов), Клинического отдела (зав. отделом, д.м.н., проф. Л.В. Колобухина, к.м.н. Л.Н. Меркулова); сотрудникам Лаборатории углеводов ИБХ РАН, Москва (зав. лаб., д.х.н., нроф. Н.В. Бовин, к.б.н. Ю.А. Штыря); сотрудникам ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва (к.б.н. Д.Д. Абрамов); д.б.н. И.А. Леневой (ЦХЛС-ВНИХФИ, Москва); сотрудникам ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва (зав. лаб., к.б.н. С.Б. Яцышина, к.б.н. А.Н. Миненко); д.б.н. А.И. Климову (CDC&P, Атланта, США) за помощь и активное сотрудничество при проведении исследований ряда разделов.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

НА. HI. НЗ - гемагглютинин первого третьего типов

NA. N1. N2 - нейраминидаза первого, второго типов

ICjo - минимальная ингибирующая концентрация препарата

OS-BODIPY - флуоресцентно-меченный олигосахарид

OsS (OsR) - озельтамивир чувствительный (резистентный) образец

So - начальная концентрация субстрата

Уо(та\)~ начальная (максимальная) скорость реакции

RFLP - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

qRT-PCR (ОТ-ПЦР-РВ) - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени

ВОЗ (WHO) - Всемирная Организация Здравоохранения ИФА - иммуноферментный анализ Км - константа Михаэлиса

РТГА - реакция торможения гемагглютинирующей активности УЕФ (П Л - условные единицы флуоресценции ЦЭЭГ - Центр Экологии и Эпидемиологии Гриппа

Заказ№ 89-а/11/2010 Подписано в печать 03.11.2010 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 1,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 Ц www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белякова, Наталья Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Структура и свойства нейраминидазы вируса гриппа.

1.1. Строение вируса гриппа.

1.2. Классификация вирусов гриппа. История основных пандемий.

1.3. Нейраминидаза вируса гриппа.

1.3.1. Структура нейраминидазы.

1.3.2. Структурно-функциональные домены нейраминидазы.

1.3.3. Строение активного центра нейраминидазы.

1.3.4. Механизм действия нейраминидазы вируса гриппа.

Реакция десиалирования.

1.3.5. Функциональная активность нейраминидазы.

1.3.6. Ферментативная активность нейраминидазы.

Методы ее детекции.

1.3.7. Субстратная специфичность нейраминидаз вирусов гриппа.

Методы ее детекции.

1.4. Антигенные свойства и олигосахаридная специфичность нейраминидаз вирусов гриппа А.

ГЛАВА 2. Ингибиторы нейраминидазы вирусов гриппа А и В.

2.1. Спектр специфических противогриппозных препаратов в РФ.

2.2. История создания химиопрепаратов с антинейраминидазной активностью.

2.3. Механизм действия ингибиторов нейраминидазы.

2.4. Клинические испытания ингибиторов нейраминидазы.

2.4.1. Фармакокинетика и фармакодинамика ингибиторов нейраминидазы.

2.4.2. Переносимость и безопасность ингибиторов нейраминидазы.

ГЛАВА 3. Противовирусная активность антинвйраминидазных химиопрепаратов.

3.1. Чувствительность вирусов гриппа к ингибиторам нейраминидазы.

3.2. Молекулярные механизмы возникновения резистентных к ингибиторам нейраминидазы вирусов гриппа.

3.2.1. КА-зависимая резистентность.

Маркерные мутации МА вирусов гриппа.

3.2.2. NA-нeзaвиcимaя резистентность. Мутации НА, которые селекционируются под воздействием ингибиторов нейраминидазы.

3.2.3. Методы определения чувствительности вирусов гриппа к ингибиторам нейраминидазы.

3.3. Антинейраминидазные химиопрепараты и их применение во время пандемии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нейраминидазная специфичность штаммов вирусов гриппа A и B, циркулировавших в России в эпидсезоны 2006-2010 гг."

Актуальность проблемы

Особенности структурной организации вирусов гриппа (наличие поверхностных белков

- гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), их подверженность к изменениям с формированием новых дрейф-вариантов; сегментированность генома, определяющая возможность реассортации и приводящая к возникновению новых штаммов с пандемическим потенциалом), способность к преодолению межвидового барьера и инфицированию людей некоторыми подтипами вируса гриппа А птиц и млекопитающих

A(H5N1), A(H7N7), A(H7N2), A(H7N3), A(H9N2) и др.) определяют актуальность исследований по поиску средств и методов, позволяющих снизить ущерб, наносимый этой инфекцией (Слепушкин А.Н., 2003; Каверин Н.В., 2003). Одним из таких направлений является разработка и внедрение химиопрепаратов, проявляющих активность в отношении определенной специфической мишени в цикле вирусной репродукции.

Спектр этиотропных противогриппозных препаратов наиболее широко представлен в

России и включает в себя ремантадин, арбидол, ингавирин и рибавирин (Прокудина E.H.,

2003; Галегов Г.А., 2009; Hay А., 1996; Leneva I. et al., 2009; McCoy D. et al., 2010). Кроме того, основываясь на знаниях третичной структуры одного из поверхностных белков вируса гриппа - NA, были созданы препараты «нового поколения» - озельтамивир (Tamiflu™) и занамивир (Relenza™), действие которых основано на блокировании активного центра NA вирусов гриппа А и В, что препятствует высвобождению вновь сформированных вирионов и распространению вирусов от клетки к клетке (Colman Р. et al., 1983; Calfee D. & Hayden F.,

1998). Первые официальные сообщения о препаратах с антинейраминидазной активностью были сделаны Von Itzstein М. et.al. в 1993 г. (занамивир) и Kim C.U. в 1997 г. (озельтамивир).

Эти препараты эффективны против большинства подтипов NA, что является ключевым моментом в предупреждении развития эпидемий, вызванных новыми дрейф-вариантами вирусов гриппа, и обеспечении готовности к пандемии (Roberts N. & Govorkova Е., 2009). Их практическое применение было начато с 1999 г., при этом, озельтамивир был рекомендован не только для лечения и профилактики инфекции, вызванной сезонными вирусами гриппа и штаммами высокопатогенного вируса гриппа птиц A(H5N1), но и для создания государственных стоковых запасов на случай возникновения пандемии (Hayden F., 2002;

Moscona А., 2005). С появлением с 2007 г. резистентных к озельтамивиру штаммов A(H1N1) в популяции вирусов гриппа эксперты ВОЗ включили занамивир в список рекомендаций

Планов подготовки к пандемии (Roberts N. & Govorkova Е., 2009).

В связи с началом широкого практического применения антинейраминидазных препаратов в 1999 г. была создана Международная Сеть по Надзору за чувствительностью к ингибиторам NA (NISN) для информирования экспертов ВОЗ о частоте побочных эффектов, терапевтической и профилактической эффективности, чувствительности циркулирующих 7 штаммов и факторов, определяющих риск формирования резистентных мутантов. До 2007 г. многие исследователи отмечали редкие случаи детекции резистентных к антинеГфаминидазным препаратам вирусов гриппа (менее 1%), причем чаще всего такие штаммы выделяли от пациентов, принимавших курс лечения или профилактики озельтамивиром (WHO, 2008). В 2001 г. авторы ряда исследований выявляли около 1% таких мутантов у взрослых и 5% - у детей, а в 2004-2005 гт. в Японии - у 18% детей, инфицированных вирусами гриппа А и прошедших курс лечения озельтамивиром (McKimm-Breschkin J. et al., 2003; Kiso M et al., 2004). В ноябре 2007 г. норвежскими учеными, а несколько позже и специалистами других стран мира было отмечено появление и широкое распространение штаммов вируса гриппа A(H1N1), несущих специфическую мутацию H274Y в белке NA, ответственную за резистентность к озельтамивиру (Moscona А., 2005; WHO, 2007).

В России озельтамивир разрешен с 2001 г.: для лечения гриппа у людей с 1 года и для профилактики - с 12 лет, а с 2005 г. расширены его показания по применению для лечения и профилактики гриппа с 1 года. Занамивир рекомендован для лечения и профилактики гриппозной инфекции с 5 лет (2007 г.). К началу выполнения настоящей работы, совместно с коллегами Отдела гриппа Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (CDC&P), Атланта, США были проведены исследования! чувствительности циркулировавших в РФ 75 эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В (1990-2007 гг.) к антинейраминидазным препаратам, результаты которых не выявили среди них резистентных мутантов, что отражало мировые тенденции в целом (Shevchenko Е. et al., 2009). Однако, учитывая, вышесказанное, проведение расширенных исследований чувствительности штаммов к ингибиторам NA с включением результатов в надзор за циркуляцией вирусов гриппа на регулярной основе было затруднено отсутствием необходимого оборудования и субстанций препаратов для постановки классических вирусологических методов оценки подавления нейраминидазной активности — флуоресцентного и хемилюминесцентного, а также молекулярно-генетических методов (RT-PCR/RFLP, ОТ-ПЦР-РВ), детектирующих маркерные мутации, ответственные за устойчивость к препаратам (Mungall В. et al., 2003; Lizheng G. et al., 2009).

Субстратная специфичность NA вирусов гриппа остается практически не изученной областью, что объясняется как несовершенством и трудоемкостью существующих методов, так и недоступностью субстратов для вирусной NA — сиалированных олигосахаридов, входящих в состав клеточных рецепторов для вирусов гриппа (Штыря Ю.А., 2009; Mochalova L. et al., 2005). Нейраминидаза, являясь ферментом на поверхности вируса гриппа, выполняет рецептор-разрушаюшие функции, то есть отщепляет а2-3 или а2-6 связанные сиаловые кислоты от сиалилолигосахаридов, выстилающих поверхность клетки-хозяина (Matrosovich М. et al., 2004). Именно поэтому вторым направлением исследований стало изучение субстратной специфичности NA. Без таких знаний невозможно определить роль отдельных участков полипептидной цепи в функционировании NA, отследить возникновение и распространение новых штаммов вирусов гриппа, в частности вирусов, резистентных к ингибиторам NA, а также понять механизмы устойчивости вирусов гриппа к лекарственным средствам.

Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований, представленных в настоящей работе.

Цель и задачи исследования

1. Применить классический флуоресцентный метод для определения значений минимальной ингибирующей концентрации (IC50) озельтамивира карбоксилата и занамивира в отношении штаммов вирусов гриппа А и В, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в РФ.

2. Оценить специфичность клеточного иммуноферментного анализа (ИФА) и возможность его применения в мониторинге противовирусной активности ингибиторов NA.

6. Исследовать и сравнить олигосахаридную специфичность NA эпидемических штаммов вируса гриппа A(IIINI), чувствительных и устойчивых к озельтамивиру, а также пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)v, изолированных от инфицированных людей с различным исходом заболевания.

Все исследования соответствуют плановой научной тематике ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России: тема № 8 «Фундаментальные исследования-лекарственных средств для лечения распространенных и социально значимых вирусных инфекций человека» и тема № 9 «Новые и возвращающиеся вирусные инфекции в системе биобезопастности государства».

Научная новизна исследования

1. Впервые в России были отработаны и применены различные вирусологические (флуоресцентный метод, клеточный ИФА) и молекулярно-генетические (ЯТ-РСК/КРЬР, ОТ-ПЦР-РВ) методы для изучения чувствительности вирусов гриппа к антинейраминидазным препаратам.

3. Показано, что популяция циркулирующих штаммов вирусов гриппа гетерогенна по чувствительности к антинейраминидазным препаратам: эпидемические штаммы вируса гриппа А(НШ1) - резистентны к озельтамивиру и чувствительны к занамивиру; штаммы вирусов гриппа А(НЗШ), В и А(НШ1)у —чувствительны к обоим препаратам.

5. Показано, что профиль олигосахаридной специфичности ИА пандемического штамма вируса гриппа АЛ1У-Мозсо\у/01/09 (НШ1)з\у1 имеет особенности, свойственные для вирусов, выделенных от свиней, птиц и человека. В тоже время профиль .субстратной специфичности ИА вируса гриппа А/ПУ-Мо8со\у/03/09 (НШ1)з\у1 характерен для вирусов, выделенных от свиней.

6. Установлено, что профиль субстратной специфичности ЫА пандемического штамма вируса гриппа АШУ-ОгепЬгщ*/93/09 (Н1Ш)з\у1, изолированного от пациента с летальным исходом, демонстрирует двойственную аффинность к а2-3 и а2-6 сиалозидам. Способность ИА этого вируса расщеплять фукозилированные (8Ьех) и линейные (З'БЬМ) структуры субстратов с одинаковой эффективностью характерна для высокопатогенных вирусов гриппа А.

Научно-практическая значимость исследования Вирусы гриппа А и В могут проявлять разные уровни чувствительности к антинейраминидазным препаратам в клетках культуры ткани МБСК, и этот факт зависит от различной эффективности связывания вируса с клеточными сиаловыми рецепторами. Вышесказанное определяет необходимость комплексного подхода для подтверждения случаев резистентности к химиопрепаратам, что также будет способствовать оптимизации методов для изучения чувствительности вирусов гриппа к ингибиторам NA в РФ.

Апробация четырех новых тест-систем на основе ОТ-ПЦР позволила усилить надзор и определить их как наиболее эффективные для мониторинга чувствительности штаммов вирусов гриппа к ингибиторам КА. Три отечественные ОТ-ПЦР-РВ тест-системы для детекции маркерных мутаций устойчивости к озельтамивиру (Шз274Туг и ГПз275Туг) в белке КА вирусов гриппа А(НШ1) и А(НШ1)у соответственно были разработаны совместно с сотрудниками лаборатории экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и ЗАО «НПФ ДНК-Технология». В настоящее время данные тест-системы находятся на стадии сертификации и лицензирования и используются в работе Центра экологии и эпидемиологии гриппа (ЦЭЭГ) при ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России.

В связи с увеличением числа озельтамивир-резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А(НШ1), а также с появлением устойчивых к озельтамивиру пандемических штаммов А(НШ1)у существует необходимость в усилении надзора за чувствительностью вирусов гриппа А и В к обоим антинейраминидазным препаратам и разработке рекомендаций по целесообразности их применения для лечения и профилактики гриппа в РФ. Следует отметить, что все исследованные вирусы гриппа А и В, включая пандемические штаммы А(НШ1)у, оставались чувствительными к занамивиру.

В рамках проведенных исследований по изучению профилей субстратной специфичности ЫА вирусов гриппа было выявлено, что замена Шя274Туг в активном центре МА сезонного вируса гриппа А(НШ1), обеспечивающая устойчивость к озельтамивиру, не приводит к изменению профиля кинетической субстратной специфичности ЫА, и поэтому «обоснование» этой мутации, вероятно, следует искать не в изменении «субстрат-узнающих» свойств мутантных вирусов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Детекцию специфических маркеров устойчивости к ингибиторам ЫА можно осуществлять с помощью методов на основе ОТ-ПЦР, которые должны быть внедрены в надзор за чувствительностью циркулирующих вирусов гриппа к этим препаратам в РФ на регулярной основе.

2. Популяция современных штаммов вирусов гриппа А и В в РФ гетерогенна по чувствительности к ингибиторам МА: эпидемические штаммы вируса гриппа А(Н1Ш) в подавляющем большинстве резистентны к озельтамивиру, но чувствительны к занамивиру; штаммы вирусов гриппа А(НЗШ), В и А(НШ1)у чувствительны к обоим антинейраминидазным препаратам.

3. Штаммы вирусов гриппа A(H1N1) и A(HlNl)v наиболее высоко подвержены риску формирования резистентности к озельтамивиру. Одним из факторов риска является курс лечения этим препаратом в период заболевания.

5. Профиль олигосахаридной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/ïïV-Moscow/01/09 (HlNl)swl имеет особенности, свойственные для вирусов, выделенных от свиней, птиц и человека. Профиль субстратной специфичности NA вируса гриппа A/nV-Moscow/03/09 (HlNl)swl характерен для вирусов, выделенных от свиней.

6. Профиль субстратной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/nV-Orenburg/93/09 (HlNl)swl, изолированного от пациента с летальным исходом, демонстрирует одинаковое сродство к а2-3 и а2-6 сиалозидам.

Апробация результатов исследования

Результаты работы были представлены на международных симпозиумах, съездах, конгрессах и конференциях: IX Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 26-27 апреля 2007; VII Конгресс детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 3-5 декабря 2008; I Ежегодная Конференция молодых ученых, Москва, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, апрель 2008; XVI Интернациональная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 14-18 апреля 2009; II Ежегодная Конференция молодых ученых, Москва, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, 23 апреля 2009; BIT's 7th Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology 2009 (IDDST-2009) «Milestones of Innovative Therapeutics», Shanghai, China, 22-25 October 2009; Всероссийская Научная Конференция «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций», Санкт-Петербург, 19-20 ноября 2009; VIII Конгресс детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 2009; XVII Международная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», Москва, 12-15 апреля 2010; III Ежегодная Конференция молодых ученых, Москва, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, 20 апреля 2010; International Conference «Options for the control influenza VII», Hong Kong SAR, China, 3-7 September 2010.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе б — в реферируемых журналах, материалах докладов на Международных и Всероссийских конгрессах, съездах, симпозиумах, конференциях и проблемных комиссиях, а также 3 удостоверения (депонента) в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского на два сезонных штамма вируса гриппа A(H1N1) и один пандемический штамм вируса гриппа A(HlNl)v с различной чувствительностью к озельтамивиру. Помимо вышеперечисленного является соавтором депонирования в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского 81 штамма пандемического вируса гриппа A(HlNl)v.

Соавторами научных трудов являются: Львов Д.К., Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Альховский С.В., Прилипов А.Г., Колобухина Л.В., Меркулова Л.Н., Оскерко Т.А., Ротанов М. (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва), Абрамов Д.Д. (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва), Ленева И.А. (ЦХЛС-ВНИХФИ, Москва). Автор глубоко благодарен и признателен всем своим соавторам.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 37 работ отечественных и 191 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста и включает 17 таблиц, 2 схемы и 34 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Белякова, Наталья Владимировна

выводы

2. Флуоресцентным методом определены значения минимальной ингибирующей концентрации (1С5о) озельтамивира карбоксилата и занамивира, которые составили 2,5-11,0 нМ 0,75-10,0 нМ соответственно, для российских штаммов вирусов гриппа А и В, чувствительных к ингибиторам нейраминидазы (2008-2009 гг.).

8. Показано, что замена №5274Туг в активном центре КА эпидемического штамма вируса гриппа А/Москва/118/2008 (НШ1), обеспечивающая устойчивость к озельтамивиру, не привела к изменению профиля кинетической субстратной специфичности ИА, который был сравним с профилем чувствительного к озельтамивиру штамма вируса гриппа А/Москва/37/2008 (НШ1).

9. Определено, что профиль олигосахаридной специфичности ЫА пандемического штамма вируса гриппа АЛГУ-Мозсо\гу/01/09 (HlNl)swl имеет особенности, свойственные для вирусов, выделенных от свиней, птиц и человека. Профиль субстратной специфичности КА вируса гриппа А/ПУ-Мо8со\у/03/09 (Н1Ш)з\у1 характерен для вирусов, выделенных от свиней.

10. Установлено, что профиль субстратной специфичности КА пандемического штамма вируса гриппа А/ПУ-ОгепЬиг^93/09 (НШ1)з\у1, изолированного от пациента с летальным исходом, демонстрирует двойственную аффинность к ос2-3 и а2-6 сиалозидам. Способность ЫА этого вируса расщеплять фукозилированные (БЬе*) и линейные (З'БЬК) структуры субстратов с одинаковой эффективностью характерна для высокопатогенных вирусов гриппа А.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокая изменчивость поверхностных белков вируса гриппа приводит к тому, что в человеческой популяции циркулируют различные штаммы при постоянном появлении новых. В начале пандемии, до тех пор, пока новая вакцина к новому вирусу станет доступной для широкого использования в клинической практике, этиотропные специфические противогриппозные химиопрепараты остаются единственным средством для эффективной борьбы с распространением вируса, а в случае заболевания — единственным средством для лечения инфекции. К настоящему времени в мировой клинической практике для лечения и профилактики гриппа широко применяются ингибиторы нейраминидазы вирусов гриппа А и В: озельтамивир (Tamiflu™) и занамивир (Relenza™).

В условиях отсутствия возможности проведения клинических испытаний в отношении каждого из возникающих штаммов вирусов гриппа только экспериментальное изучение активности специфического противогриппозного препарата может дать ответ о его эффективности при гриппозной инфекции. При этом первые рекомендации для лечения и профилактики гриппа, вызванного новым вирусом гриппа A(HlNl)v, были даны на основе экспериментального изучения его чувствительности к химиопрепаратам (WHO, 2009).

В заключение необходимо еще раз отметить важное значение проведения расширенного и систематического мониторинга чувствительности циркулирующих вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам со специфической активностью и субстратной специфичности NA вновь возникающих вирусов гриппа не только на региональном, но и на международном уровнях. Наряду с традиционными подходами особую актуальность приобретают новые методы исследования, которые позволяют установить причину формирования мутантов, упростить процедуру проведения такого мониторинга, унифицировать оценку полученных результатов и разработать единые критерии резистентности. Довольно относительные результаты, доказывающие важность комплексного методологического подхода в диагностике-чувствительности вирусов гриппа А и В к антинейраминидазным химиопрепаратам, были получены в клеточном ИФА. В современных лабораториях выявление резистентных к ингибиторам NA вирусов гриппа проводится с помощью флуоресцентного или хемилюминесцентного методов, а также молекулярно-генетическими методами на основе ПЦР и секвенированием гена NA на предмет обнаружения известных маркерных мутаций.

В результате проведенных в настоящей работе исследований в эпидсезоны 2007-2008 гг. и 2008-2009 гг. впервые был установлен факт циркуляции и распространения (49%—>92%) на территории РФ эпидемических штаммов вируса гриппа A(H1N1), несущих мутацию, ответственную за резистентность к озельтамивиру, со 100% корреляцией данных, полученных разными молекулярно-генетическими методами на основе ПЦР. В популяции естественно-циркулирующих пандемических вирусов гриппа A(HlNl)v не было выявлено штаммов, устойчивых к озельтамивиру. В тоже время в клинических исследованиях 2007149

2008 гг. и 2009-2010 гг. эпидсезонов на фоне проводимого курса лечения озельтамивиром среди пациентов, инфицированных эпидемическими и пандемическими штаммами вирусов гриппа, было выявлено формирование резистентных вариантов на 3-ий и 5-ый дни лечения соответственно. Все изученные в период 2006-2010 гг. эпидемические штаммы вирусов гриппа А(НЗШ) и В оказались чувствительными к обоим ингибиторам ЫА. Также в настоящем исследовании не было определено ни одного штамма с перекрестной резистентностью, который был бы устойчив сразу ко всем противогриппозным химиопрепаратам со специфической активностью (ремантадин, арбидол и ингибиторы ЫА). Увеличение числа резистентных к озельтамивиру штаммов вирусов гриппа А в связи с его широким применением диктует необходимость своевременной замены лекарственных средств на другие, эффективные в отношении таких штаммов.

Данные по субстратной специфичности ЫА сезонных и пандемических штаммов вирусов гриппа А, полученные в ходе выполнения настоящей работы, позволяют сделать некоторые выводы относительно особенностей вирусов, вызвавших подъемы заболеваемости последних лет. Найденные закономерности для ИА этих вирусов, в целом, согласуются с «рецептор-узнающими» свойствами другого белка вируса гриппа — гемагглютинина, что еще раз подтверждает синхронность эволюционных изменений в ЫА и НА вирусов гриппа А (ватЬагуап А. а1., 2005; МосЬа1оуа Ь. й а1., 2007; Львов Д.К. с соавт., 2010). Одновременное исследование олигосахаридной специфичности ИА и НА современных циркулирующих вирусов гриппа поможет объяснить причины изменений, происходящих при переходе вируса гриппа через межвидовой барьер, и предсказать субстратную специфичность очередного возможного штамма пандемического вируса гриппа А. Именно такие знания открывают возможность прогнозировать новую пандемию гриппа задолго до ее начала. В тоже время практическая значимость таких исследований очевидна, поскольку современное поколение лекарственных средств, рекомендованных для лечения гриппа - это ингибиторы ИА, и резкое изменение субстратной специфичности может привести к «уходу» вируса гриппа из-под контроля этими лекарствами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белякова, Наталья Владимировна, Москва

1. Бектимиров Т.А. Рекомендации ВОЗ и международных форумов по тактике борьбы с гриппом в связи с возможной пандемией.// Бюллетень «Вакцинация». 3(27); 1-5 (2003).

2. Беляев A.JL, Бурцева Е.И., Слепушкин А.Н. и др. Арбидол новое средство для профилактики гриппа и ОРЗ у детей.//Вестник РАМН. 8: 34-37 (1996).

3. Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Ленева И.А. и др. Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004-2005 гг. ПВопр.вирусол. 2: 24-29 (2007).

4. ВОЗ. Глобальный план ВОЗ по подготовке к борьбе с гриппом. 2005 http://www. who, int/csr/disease/avian influenza/Preparedness plan R US. pdf

5. Галегов Г. А., Андронова В. Л., Леонтьева Н. А., Львов Н. Д., Петрова И. Г. Этиотропная лекарственная терапия вирусных инфекций.//Вопр.вирусол. 3: 35-40 (2004).

6. Галегов Г.А., Андронова В.Л., Небольсин В.Е. Изучение противовирусной активности Ингавирина в отношении сезонного вируса гриппа A(H1N1) в культуре клеток MDCK.// АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ. 54: 9 10 (2009).

7. Гайдамович С.Я. Классификация вирусов.// В кн.: Общая и частная вирусология. М: Медицина:26-60 (1982).

8. Гендон Ю.З. Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа.// Вопр.вирусол. 1: 4-10 (2007).

9. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика. // Москва: Высшая школа.: 479 (2002).

10. Заплатников А.Л., Коровина Н.А., Бурцева Е.И. и др. Совпеменные препараты, содержащие сверхмалые дозы действующего вещества, и традиционные гомеопатические средства в профилактике и лечении ОРВИ и гриппа у детей.//Педиатрия. 88(1): 95-100 (2009).

11. Каверин Н.В., Смирнов Ю.А. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий.// Вопр. вирусол. 3: 4-10 (2003).

12. Кофиади И.А., Ребриков Д.В. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой J/Генетика. 42(1): 22-32 (2006).

13. Ленева И.А., Глушков Р.Г., Гуськова Т.А. Лекарственные средства для химиотерапии и химиопрофилактики гриппа: особенности механизма действия, эффективность и безопасность (обзор)ЛХФЖ. 38(11): 8-14 (2004).

14. Ленева И. А., Федякина И. Т., Еропкин М. Ю и др. Изучение противовирусной активности отечественных противогриппозных химиопрепаратов в культуре клеток и на модели животных.// Вопр. вирусол. 3: 19-27 (2010).

15. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Прилипов А.Г. и др. Возможная связь летальной пневмонии с мутациями пандемического вируса гриппа А/ H1N1 swl в рецепторсвязывающем сайте субъединицы НА1 гемагглютинина.// Вопр. вирусол. 4: 4-9 (2010).

16. Львов Д. К., Слепушкин А. Н., Ямникова С. С., Бурцева Е. И. Грипп остается непредсказуемой инфекцией.// Вопр. вирусол. 3: 141—144 (1998).

17. Львов Д-К., Ямникова С. С., Забережный А. Д., Гребенникова Т. В. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А—животные— человек Л Вопр. вирусол. 4: 4-11 (2005).

18. Любовцева О.В., Закстельская Л.Я. Методические рекомендации по применению современных методов исследований в общей и медицинской вирусологии.//М: (1984).

19. Любовцева О.В., Закстельская Л.Я., Иванова В.Т. и др. Определение специфичности нейраминидазы вирусов гриппа А и В с помощью модифицированного лектин-теста.// Вопр. вирусол. 6: 663-668 (1983).

20. Масалова О.В. Сравнительные исследования естественной изменчивости нейраминидаз вирусов гриппа А и В.//Канд. диссертация. М: (1988).

21. Методические указания к работе опорных баз Всесоюзного центра по гриппу и ОРЗ.// 986: 40-42.

22. Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа.// Методические указания МУ 3.3.2.1758-03. (2005).

23. Прокудина Е. Н., Семенова Н. П., Чумаков В. M и др. Различия в олигомеризации нуклеокапсидного белка эпидемических вирусов гриппа человека A(H1N1), A(H3N2) и В.// Вопр. вирусол. 3: 27-31 (2003).

24. Руднева И.А., Ильюшина Н.А., Шилов А.А. и др. Функциональное взаимодействие гликопротеинов вируса гриппа. II Мол. Биол. 37: 34-40 (2003).

25. Сергеев И.В., Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю. Разработка методов для проведения широкомасштабных исследований полиморфизма генов, регулирующих различные компоненты иммунного ответа.// Физиология и патология иммунной системы. 4: 21-26 (2009).

26. Слепушкин А. Н. Всемирная программа ВОЗ по эпидемиологическому надзору и борьбе с гриппом (Global Agenda on Influenza Surveillance and Control) // Bonp. вирусол. 1: 46 (2003).

27. Слепушкин A.H. Грипп и другие ОРВИ.// под ред. В.И Покровского, Г.Г. Онищенко, Б.П. Черкасского Эволюция инфекционных болезней в России в XXвеке : 184-214 (2003).

28. Соколов Б.П., Руднева И.А. Изучение изменчивости белков вируса гриппа А. ПВопр.вирусол. 4: 471-477 (1981).

29. Шаханина И.Л. Грипп и острые респираторные заболевания приоритетная социально-экономическая проблема здравоохранения.// В сб. Вакцинопрофилактика гриппа : 10-16(1998).

30. Штыря Ю.А. Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа.//Канд. диссертация. М: (2009).

31. Штыря Ю.А., Мочалова Л.В., Бовин Н.В. Нейраминидаза вируса гриппа: структура и функция. // Acta nature. 2: 28-35 (2009).

32. Яцышина С.Б., Миненко А.Н., Прадед М.Н. и др. Диагностика гриппа: новый вариант A/H1N1 в России.//Эиндел*. и инфекц. болезни. 5: 56-62 (2009).

33. Abed Y., Goyette N., Boivin G. A reverse genetics study of resistance to neuraminidase inhibitors in an influenza A/H1N1 virus. И Antivir. Ther. 9: 577-581 (2004).

34. Aymard-Henry M., Coleman M.T., Dowdle W.R. et al. Influenzavirus neuraminidase and neuraminidase-inhibition test procedures. И Bull World Health Organ. 48(2): 199-202 (1973).

35. Assay Guidance Manual. http://www/ncgc.nih.gov/guidance/section2.html.

36. Babu Y.S., Chad P., Bantia S. et al. BCX-1812 (RWJ-270201): discovery of a novel highly potent, orally active, and selective influenza neuraminidase inhibitor through structure-based drug design. II J. Med. Chem. 43: 3482-3486 (2000).

37. Baigent S.J., Bethell R.C., and McCauley J.W. Genetic analysis reveals that both hemagglutinin and neuraminidase determine the sensitivity of naturally occurng avian influenza viruses to zanamivir in vitro. // Virol. 263: 323-338 (1999).

38. Barman S., Adhikary L., Chakrabarti A.K. et al. Role of transmembrane domain and cytoplasmic tail amino acid sequences of influenza A virus neuraminidase in raft association and virus budding. II J. Virol. 78: 5258-5269 (2004).

39. Barman S., Adhikary L., Chakrabarti A.K. et al. Role of transmembrane domain and cytoplasmic tail amino acid sequences of influenza A virus neuraminidase in raft association and virus budding. II J. Virol. 78: 5258-5269 (2004).

40. Barman S., and Nayak D.P. Analysis of the transmembrane domain of influenza virus neuraminidase, a type II transmembrane glycoprotein, for apical sorting and raft association.// J. Virol. 74: 6538-6545 (2000).

41. Baum L.G. and Paulson J.C. The N2 neuraminidase of human influenza virus has acquired a substrate specificity complementary to the hemagglutinin receptor specificity. // Virol. 180: 10-15 (1991).

42. Berezin I.V., Martinek K. Basics of physical chemistry of enzymatic catalysis, High School, Moscow (1977).

43. Blick T.J., Sahasrabudhe A., McDonald M. et al. The interaction of hemagglutinin and neuraminidase mutations in influenza virus in resistance to 4-guanidino-Neu5Ac2en. // J. Virol. 246: 95-103 (1998).

44. Blok J. and Air G.M. Block deletions in the neuraminidase genes from some influenza A viruses of the N1 subtype. // Virol. 118: 229-234 (1982).

45. Boom R, Sol CJ, Schuurman T, et al. Human cytomegalovirus DNA in plasma and serum specimens of renal transplant recipients is highly fragmented.// J Clin Microbiol. 40(11): 4105-13 (2002).

46. Bossart-Whitaker P., Carson M., Babu Y.S. et al. Three-dimensional structure of influenza A N9 neuraminidase and its complex with the inhibitor 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetyl neuraminic acid. II J. Mol. Biol. 232: 1069-1083 (1993).

47. Branden C. and Tooze J. Beta structures. In Introduction to protein structure.// Corland Publishing, New York: 72 (1998).

48. Buxton R.C., Edwards B., Juo R.R. et al. Development of a sensitive chemiluminescent neuraminidase assay for the determination of influenza virus susceptibility to zanamivir. // Anal. Biochem. 280: 291-300 (2000).

49. Calfee D.P., Hayden F.G. New approaches to influenza chemotherapy. // Drugs. 56(4): 537553 (1998).

50. Cass L.M., Brown J., Pickford M. et al. Pharmacoscintigraphic evaluation of lung deposition of inhaled zanamivir in healthy volunteers. // Clin. Pharmacok. 36(1): 21-31 (1999).

51. CDC. FluView. 2008-2009 Influenza Season Week 12 ending March 28, 2009. // httv://www.cdc.gov/flu/weeklv/weeklvarchives2008-2009/weeklvl2.html (2009).

52. Cheam A.L., Barr I.G., Hampson A.W. et al. In vitro generation and characterisation of an influenza B variant with reduced sensitivity to neuraminidase inhibitors. // Antiviral Res. 63: 177— 81 (2004).

53. Choppin P.W., Schild A. The role of viral glycoproteine in adsorption, penetration and pathogenicity of viruses.// Rev.Infect.Diseases. 2(1): 40-61 (1980).

54. Collins P.J., Haire L.F., Lin Yi Pu et al. Crystal structures of oseltamivir-resistant influenza virus neuraminidase mutants. // Nature 453: 1258 1262 (2008).

55. Colman P.M. NA enzyme and antigen. // In The influenza viruses (R. M. Krug, ed.). Plenum Publishing Corporation, New York: 175-218 (1989).

56. Colman P.M., Smith B.J. The trypanosomal trans-sialidase: two catalytic, functions associated with one catalytic site. // Structure. 10: 1466-1468 (2002).

57. Colman P.M., Varghese J.N., Laver W.C. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase II Nature. 303: 41-44 (1983).

58. Copeland R.A. Enzymes: A practical introduction to structure, mechanism, and data analysis, Wiley-VCH, Inc., New York, Chichester, Weinheim, Brisbane, Singapore, Toronto 257258 (2000).

59. Couceiro J.N.S.S. and Baum L.J. Characterization of the hemagglutinin receptor specificity and neuraminidase substrate specificity of clinical isolates of human influenza A viruses. // Mem. Inst. Oswaldo Cruz Rio de Janeiro 89: 587-591 (1994).

60. Dapat C., Saito R., Kyaw Y. et al. Epidemiology of human influenza A and B viruses in Myanmar from 2005 to 2007. II Intervirology. 52: 310-20 (2009).

61. Dapat C., Suzuki Y., Saito R. et al. Rare influenza A (H3N2) variants with reduced sensitivity to antiviral drugs.// Emerg. Infect. Dis. 16(3): 493-6 (2010).

62. Davies H.W., Appleyard G., Cunnighan P. and Pereira M.S. The use of continuous cell line for the isolation of influenza virus.// Bull. WHO. 56: 1991-1993 (1978).

63. Deyde V. M., Sheu T. G., Trujillo A. A. et al. Detection of molecular markers of drug resistance in 2009 pandemic influenza A (H1N1) viruses by using pyrosequencing.// Antimicrob. Agents Chemother. 54: 1102-1110 (2009).

64. Dutkowski R. Oseltamivir in seasonal influenza: cumulative experience in low- and high-risk patients. // J. Antimicrob. Chemother. 65(2): 11-24(2010).

65. Eisen M.B., Sabesan S., Skehel J.J. et al. Binding of the influenza A virus to cell-surface receptors: structures of five hemagglutinin-sialyloligosacharide complexes determined by X-ray crystallography. // J. Virol. 232: 19-31 (1997).

66. Eschenfelder V. and Brossmer R. 5-Bromo-indol-3-yl 5-acetamido-3,5-dideoxy-a-D-glycero-D-galactononulopyranosidonic acid, a novel chromogenic substrate for the staining of sialidase activity. // Glycoconjugate J. 4: 171-178 (1987).

67. Fouchier R.A.M., Munster V. J., Wallensten A. et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. // J. Virol. 79: 2814-2822 (2005).

68. Freund B., Gravenstein S., Elliot M. et al. Zanamivir a review of clinical safety.// Drug Suf. 21: 267-281 (1999).

69. Fritz R.S., Hayden F.G., Calfee D.P. et al. Nasal cytokine and chemokine responses in experimental influenza A virus infection: results of a placebo-controlled trial of intravenous zanamivir treatment. IIJ Infect Dis. 180(3): 586-93 (1999).

70. Gambaryan A.S., Matrosovich M.N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. 11 Journal of Virological Methods. 39: 111—123 (1992).

71. Gambaryan A, Yamnikova S, Lvov D. et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. // Virology. 334(2): 276-83 (2005).

72. Govorkova E.A., Ilyushina N.A., McClaren J.L. et al. Susceptibility of highly pathogenic H5N1 influenza viruses to the neuraminidase inhibitor oseltamivir differs in vitro and in a mouse model. // Antimicrob. Agents Chemother. 53(7): 3088-96 (2009).

73. Govorkova E.A., Leneva I.A., Goloubeva O.G. et al. Comparison of efficacies of RWJ-270201, zanamivir, and oseltamivir against H5N1, H9N2, and other avian influenza viruses. // Antimicrob Agents Chemother. 45: 2723-2732 (2001).

74. Gubareva L.V. Molecular mechanisms of influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors.// Virus Res. 103(1-2): 199-203 (2004).

75. Gubareva L.V., Bethell R.C., Hart GJ. et al. Characterization of mutants of influenza A virus selected with the neuraminidase inhibitor 4-guanidino-Neu5Ac2en. // J. Virol. 70: 1818-1827 (1996).

76. Gubareva L.V., Kaiser L., Haiden F.G. Influenza virus neuraminidase inhibitors. // The Lanset. 355: 827-35 (2000).

77. Gubareva L.V., Matrosovich M.N., Brenner M.K. et al. Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza B virus. // J. Infect. Dis. 178: 1257-1262 (1998).

78. Gubareva L.V., Nedyalkova M.S., Novikov D.V. et al. A release-competent influenza A virus mutant lacking the coding capacity for the neuraminidase active site. // J. Gen. Virol. 83: 2683-2692 (2002).

79. Gubareva L.V., Webster R.G., Hayden F.G. Detection of influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors by an enzyme inhibition assay. // Antiviral Res. 53: 47-61 (2002).

80. Guo C.-T., Sun X.-L., Kanie O. et al. An O-glycoside of sialic acid derivative that inhibits both hemagglutinin and sialidase activities of influenza viruses // Glycobiology 12: 183-190 (2002).

81. Hanessian S., Wang J., Montgomery D., et al. Design, synthesis, and neuraminidase inhibitory activity of GS-4071 analogues that utilize a novel hydrophobic paradigm. // Bioorg Med Chem Lett. 12: 3425-3429 (2002).

82. Harris A., Cardone G., Winkler D.C. et al. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography. // PNAS. 103:19123-19127 (2006).

83. Harvala H., Gunson R., Simmonds P. et al. The emergence of oseltamivir-resistant pandemic influenza A(H1N1) 2009 virus amongst hospitalised immunocompromised patients in Scotland, November-December, 2009. // Euro Surveill. 15(14) (2010).

84. Hay A.J. Amantadine and rimantadine mechanisms.// In book: Antiviral Drug Resistance, RichmanD. (ed), WilleyJ. and Sons Ltd, Chichester, UK: 43-58 (1996).

85. Hayden F. WHO Guidelines on the Use of Vaccines and Antivirals during Influenza. // Annex 5-Considerations for the Use of Antivirals during an Influenza pandemic. Geneva, 2-4 October. (2002).

86. He G., Massarella J., Ward P. Clinical pharmacokinetics of the prodrug oseltamivir and its active metabolite Ro 64-0802.// Clin Pharmacokinet. 37(6): 471-84 (1999).

87. Sheu T.G., Deyde V.M., Okomo-Adhiambo M. et al. Surveillance for neuraminidase inhibitor resuistance among human influenza A and B viruses circulating worldwide from 2004-2008J IAntimic. Agents and Chemother. 52(9): 3284-3292 (2008).

88. Hindiyeh M., Ram D., Mandelboim M. et al. Rapid detection of influenza A pandemic (H1N1) 2009 virus neuraminidase resistance mutation H275Y by real-time reverse transcriptase PCR. HJ. Clin. Microbiol. 48(5): 1884-7 (2010).

89. Hughes M.T., McGregor M., Suzuki T. et al. Adaptation of influenza A viruses to cells expressing low levels of sialic acid leads to loss of neuraminidase activity. // J. Virol. 75: 37663770 (2001).

90. Hurt A.C., Barr I., Härtel G. et al. Susceptibility of human influenza viruses from Australasia and South East Asia to the neuraminidase inhibitors zanamivir and oseltamivir. // Antiviral Res. 62: 37-45 (2004).

91. Hurt A.C., Hohen J.K., Barr I.G. In vitro generation of neuraminidase inhibitor resistance in A(H5N1) influenza viruses. // Antimicrob. Agents Chemother. 53(10): 4433-40 (2009).

92. Hurt A.C., Hohen J.K., Parker M. et al. Zanamivir-resistant influenza viruses with a novel neuraminidase mutation. // J Virol. 83(20): 10366-73 (2009).

93. Hurt A.C., Holien J.K., Parker M.W. et al. Oseltamivir resistance and the H274Y neuraminidase mutation in seasonal, pandemic and highly pathogenic influenza viruses. // Drugs. 69(18): 2523-31 (2009).

94. Hurt A.C., McKimm-Breschkin J.L., McDonald M. et al. Identification of a human influenza type B strain with reduced sensitivity to neuraminidase inhibitor drugs. // Virus Res. 103(1-2): 205-11 (2004).

95. Jackson D., Barclay W., Zürcher T. Characterization of recombinant influenza B viruses with key neuraminidase inhibitor resistance mutations. J Antimicrob Chemother 55: 162-9 (2005).

96. Janakiraman M.N., White C.L., Laver W.G. et al. Structure of influenza virus neuraminidase B/Lee/40 complexed vith sialitic acid and dehydro analog at 1.8-Ao resolution: implications for the catalytic mechanism. //Biochem. 33: 8172-8179 (1994).

97. Janakiraman M.N., White C.L., Laver W.G. et al. Structure of influenza virus neuraminidase B/Lee/40 complexed vith sialitic acid and dehydro analog at 1.8-Ao resolution: implications for the catalytic mechanism. //Biochem. 33: 8172-8179 (1994).

98. Jin H., Leser G.P., Zhang J. et al. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase cytoplasmic tails control particle shape. UEMBOJ. 16: 1236-1247 (1997).

99. Katinger D., Mochalova L., Chinarev A. et al. Specificity of neuraminidase activity from influenza viruses isolated in different hosts tested with novel substrates. II Arch. Virol. 149: 21312140 (2004).

100. Kaverin N.V., Gambaryan A.S., Bovin N.V. et al. Postreassortment changes in influenza A virus hemagglutinin restoring HA — NA functional match. // Virol. 244: 315-321 (1998).

101. Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G. Avian to human transmission of the PB1 gene of influenza A virus in the 1957 and 1968 pandemics.// J. Virol. 63: 4603-4608 (1989).

102. Kilander A., Rykkvin R., Dudman S.G. et al. Observed association between the HA1 mutation D222G in the 2009 pandemic influenza A(H1N1) virus and severe clinical outcome Norway 2009-2010.I/Euro Survell. 15(9): (2010).

103. Kim C.U., Lew M., Williams H. et al. Structure activity relationship studies of novel carbocyclic influenza neuraminidase inhibitors. // J. Med. Chem. 41: 2451-2460 (1998).

104. Kiso M., Mitamura K., Sakai-Tagawa Y. et al. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. II Lancet 364:759-65 (2004).

105. Kobasa D., Kodihalli S., Luo M. et al. Amino acid resides contributing to the substrate specificity of the influenza A virus neuraminidase. // J. Virol 73: 6743-6751 (1999).

106. Kobasa D., Wells K., and Kawaoka Y. Amino acids responsible for the absolute sialidase activity of the influenza A virus neuraminidase: relationship to growth in the duck intestine. // J. Virol. 75: 11773-11780 (2001).

107. Kundu A., Avalos R.T., Sanderson C.M. et al. Transmembrane domain of influenza virus neuraminidase, a type II protein, possesses an apical sorting signal in polarized MDCK cells.// J Virol. 70: 6508-15 (1996).

108. Lambre C.R., Terzidis II., Greffard A. et al. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. // J. Immunol. Meth. 135: 49-57 (1990).

109. Le Q.M., Kiso M., Someya K. et al. Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus. // Nature 437: 1108 (2005).

110. Leneva I.A., Roberts N., Govorkova E.A. et al. The neuraminidase inhibitor GS4104 (oseltamivir phosphate) is efficacious against A/Hong Kong/156/97 (H5N1) and A/Hong Kong/1074/99 (H9N2) influenza viruses.// Antiviral Res. 48(2): 101-15 (2000).

111. Leneva I.A., Russell R.J., Boriskin Y.S. et al. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: Implications for mechanism of anti-influenza action of arbidol.// Antivir. Res. 81: 132-140 (2009).

112. Li W., Escarpe P.A., Eisenberg EJ. et al. Identification of GS 4104 as an orally bioavailable prodrug of the influenza virus neuraminidase inhibitor GS 4071. // Antimicrob. Agents Chemother. 42(3): 647-53 (1998).

113. Liu Y., Misulovin, Z., Bjorkman, P.J. The molecular mechanism of sulfated carbohydrate recognition by the cysteine-rich domain of mannose receptor. // J.Mol.Biol.: 305: 481-490 (2001).

114. Lizheng G., Garten R.J., Foust. A.S. et al. Rapid Identification of Oseltamivir-Resistant Influenza A(H1N1) Viruses with H274Y Mutation by RT-PCR/Restriction Fragment Length Polymorphism Assay. //Antivir. Res. 82(1): 29-33 (2009).

115. Luther P, Adamczyk B, Bergmann KC. Simple test for detection of virus neuraminidase and antineuraminidase using lectins (lectin-neuraminidase test system).// Zentralbl Bakteriol A. 248(3):281-5 (1980).

116. Lyon E. Mutation detection using fluorescent hybridization probes and melting curve analysis//Expert. Rev. Mol. Diagn. 1: 92-101 (2001).

117. Matrosovich M., Matrosovich T.,Gray T. et al. Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epitelium.// J.Virol. 78: 12665-12667 (2004).

118. Matrosovich M.N., Krauss S., and Webster R.G. II9N2 influenza A viruses from poultry in Asia have human virus-like receptor specificity. // J. Virol. 281: 56-162 (2001).

119. Matrosovich M.N., Zhou N., Kawaoka Y. et al. The surface glycoproteins of H5 viruses isolated from humans, chikens, and aquatic birds have distinguishable properties.// J. Virol. 73: 1146-1155(1999).

120. McCoy D, Wong E, Kuyumjian AG, et al. Treatment of respiratory syncytial virus infection in adult patients with hematologic malignancies based on an institution-specific guideline. // Transpl Infect Dis. (2010).

121. McKimm-Breschkin J.L. Management of influenza virus infections with neuraminidase inhibitors: Detection, incidence, and implications of drug resistance.// Treat.Respir.MedA: 107-116 (2005).

122. McKimm-Breschkin J., Trivedi Т., Hampson A. et al. Neuraminidase sequence analysis and susceptibilities of influenza virus clinical isolates to zanamivir and oseltamivir. // J. Antimicrob. Chemother. 47: 2264-72 (2003).

123. McKimm-Breschkin J.L. Resistanse of influenza viruses to neuraminidase inhibitors-a review. И Antiviral Res. 47: 1-17 (2000).

124. McKimm-Breschkin J.L., Selleck P., Usman T. et al. Reduced sensitivity of influenza A (H5N1) to oseltamivir. Emerg. IIInfect. Dis. 13: 1354-1357 (2007).

125. Meijer A., Lackenby A., Hungnes O. et al. Oseltamivir-resistant influenza virus A (H1N1), Europe, 2007-08 season. II Emerg Infect Dis. 15: 552-60 (2009).

126. Meijer, A., Lackenby A., Hay A. et al. Influenza antiviral susceptibility monitoring activities in relation to national antiviral stockpiles in Europe during the winter 2006/2007 season. // Euro Surveill. 12: E3-E4 (2007).

127. Meindl P., Bodo G., Palese P., et al. Inhibition of neuraminidase activity by derivatives of 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminic acid. II J. Virol. 58(2): 457-63 (1974).

128. Mishin V.P., Hayden F.G., Gubareva L.V. Susceptibilities of antiviral-resistant influenza viruses to novel neuraminidase inhibitors.// J. Antimicrobal Agents and Chemoterapy. 11: 45154520 (2005).

129. Mitnaul J., Matrosovich M.N, Castrucci M.R. et al. Balanced hemagglutinin and neuraminidase activities are critical for efficient replication of influenza A viruses. // J. Virol. 74: 6015-6020 (2000).

130. Mitnaul J., Matrosovich M.N, Castrucci M.R. et al. Balanced hemagglutinin and neuraminidase activities are critical for efficient replication of influenza A viruses. // J. Virol. 74: 6015-6020 (2000).

131. MMWR. Update: Drug Susceptibility of Swine-Origin Influenza A(H1N1) Viruses, April 2009. // http://www.cdc.sov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm581баб.htm 58(16): 433-435 (2009).

132. MMWR. Update: Novel influenza A(H1N1) virus infections worldwide, May 6, 2009. // http://www.cdc.sov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5817al.htm 58(17): 453-458 (2009).

133. MMWR. Swine origin influenza A(H1N1) virus infection in a school New York City, April 2009. // http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5817a6.htm 58(17): 470-472 (2009).

134. Mochalova L., Gambaryan A., Romanova J. et al. Receptor-binding properties of modern human influenza viruses primarily isolated in Vero and MDCK cells and chicken embryonated eggs. // Virol. 313: 473-480 (2003).

135. Mochalova L., Kurova V., Shtyrya Y. et al. Oligosaccharide specificity of influenza H1N1 virus neuraminidases. IIArch. Virol. 152: 2047-2057(2007).

136. Mochalova L.V., Korchagina E.Y., Kurova V.S. et al. Fluorescent assay for studying the substrate specificity of neuraminidase. И Anal. Biochem. 341: 190-193 (2005).

137. Monto A.S., Kimm-Breschkin J.L., Macken C. et al. Detection of influenza viruses resistant to neuraminidase inhibitors in global surveillance during the first 3 years of their use. II J. Antimicrob. Chemother. 50: 2395-402 (2006).

138. Moscona A. Neuraminidase Inhibitors for Influenza.// NEJM. 353(13): 1363-1373 (2005).

139. Moscona A. Oseltamivir Resistance — Disabling Our Influenza Defenses.// NEJM. 353(25): 2633-2636 (2005).

140. Mossad S. B. The resurgence of swine-origin influenza A (H1N1). HCleve Clin J Med. 76(6): 337-43 (2009).

141. Mungall B.A., Xu X., Klimov A. Assaying susceptibility of avian and other influenza A viruses to zanamivir: comparison of fluorescent and chemiluminescent neuraminidase assays. // Avian Dis. 47(3): 1141-4 (2003).

142. Neumann G., Noda T., Kawaoka Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. II Nature. 459(7249): 931-9 (2009).

143. Nicholson K.G., Aoki F.Y., Osterhaus A.D. et al. Efficacy and safety of oseltamivir in treatment of acute influenza: a randomised controlled trial. II Lancet. 356(9244): 1845-50 (2000).

144. Nicol S.T., Airkawa J., and Kawaoka Y. Emerging viral diseases. // PNAS. 97: 1241112412 (2000).

145. Ohuchi M., Feldmann A., Ohuchi R. et al. Neuraminidase is essential for fowl plague virus hemagglutinin to show hemagglutinating activity. II J. Virol. 212(1): 77-83 (1995).

146. Okomo-Adhiambo M., Nguyen H.T., Sleeman K. et al. Host cell selection of influenza neuraminidase variants: implications for drug resistance monitoring in A(H1N1) viruses.// Antiviral Res. 85(2): 381-8 (2010).

147. Oxford J.S., Bossuyt S., Eswarasaran R. et al. Drugs to combat the epidemic and pandemic faces of influenza. II In Influenza (C.W. Potter ed.) Elsevier: 201-234 (2002).

148. Oxford J.S., Bossuyt S., Eswarasaran R.et al. Drugs to combat the epidemic and pandemic faces of influenza. // In Influenza (C. W. Potter ed.) Elsevier: 201-234 (2002).

149. Palmer S., Boltz V., Maldarelli F. et al. Selection and persistence of non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor-resistant HTV-1 in patients starting and stopping non-nucleoside therapy. // AIDS 20: 701-710(2006).

150. Paulson J.C., Weinstein J., Dorland L. et al. Newcastle disease virus contains a linkage-specific glycoprotein sialidase. II J. Biol. Chem. 257: 12734-12738 (1982).

151. Peiris J.S.M., de Jong M.D., and Guan Y. Avian influenza virus (H5N1): a threat to human health. II J. Microb. Rev. 20:243-267 (2007).

152. Pont-Kingdon G., Lyon E. Direct molecular haplotyping by melting curve analysis of hybridization probes: beta 2-adrenergic receptor haplotypes as an exampldINucleic Acids Res. 33(10): 89 (2005).

153. Potier M., Mameli L., Belisle M. et al. Fluororaetric assay with a sodium (4-methylumbelliferyl-a-D-N-acetylneuraminate) substrate. Il Anal. Biochem. 94: 287-296 (1979).

154. Rameix-Welti M.-A., Enouf V., Cuvelier F. et al. Enzymatic Properties of the Neuraminidase of Seasonal H1N1 Influenza Viruses Provide Insights for the Emergence of Natural Resistance to Oseltamivir//PathogA (7):e 1000103 18654625 (2008).

155. Reece P.A. Neuraminidase inhibitor resistance in influenza viruses. // J. Medical Virology. 79: 1577-1586 (2007).

156. Richardson J.C.W., Scolera V. et Simmonds N.L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments.// Biophys. Acta. 673: 26-36 (1981).

157. Roberts N.A. and Govorkova E.A. The activity of neuraminidase inhibitor oseltamivir against all subtypes of influenza viruses.// Nova Science Publ. 7: 93-118 (2009).

158. Rudneva I.A., Kovaleva V.P., Varich N.L. et al. Influenza A virus reassortants with surface glycoprotein genes of avian parent viruses: effects of HA and NA gene combinations on virus aggregation. // Arch. Virol. 133:437-450(1993).

159. Rudneva I.A., Sklyanskaya E.I., Barulina O.S. et al. Phenotypic expression of HA NA combinftions in human - avian influenza A virus reassortants. // Arch. Virol. 141: 1091-1099 (1996).

160. Rudneva I.A., Sklyanskaya E.I., Barulina O.S. et al. Phenotypic expression of HA NA combinftions in human - avian influenza A virus reassortants. // Arch. Virol. 141: 1091-1099 (1996).

161. Russell R.J., Haire L.F., Stevens D.J. et al. The structure of H5N1 avian influenza neuraminidase suggests new opportunities for drug design. II Nature. 44: 45-49 (2006).

162. Russell R.J., Haire L.F., Stevens DJ. et al. The structure of H5N1 avian influenza neuraminidase suggests new opportunities for drug design. // Nature. 44: 45-49 (2006).

163. Ryan D.M., Ticehurst J., Dempsey M.H. GG167 (4-guanidino-2,4-dideoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminic acid) is a potent inhibitor of influenza virus in ferrets. HAntimicrob. Agents Chemother. 39(11): 2583-4 (1995).

164. Shevchenko E.S., Burtseva E.I., Beliakova N.V., et al. Drug susceptibility of Influenza Viruses circulating in Russia.// Milestones of Innovative Therapeutics. Materials of IDDST-2009. Shanghai, China: 586 (2009).

165. Shinde V., Bridges C.B., Uyeki T.M. et al. Triple reassortants swine influenza A(H1) in humans in the United States, 2005-2001 IN.Engl J.Med. 360(25): 2616-2625 (2009).

166. Shtyrya Y, Mochalova L, Voznova G et al. Adjustment of receptor-binding and neuraminidase substrate specificities in avian-human reassortant influenza viruses.// Glycoconj J. 26(1): 99-109 (2009).

167. Smee D.F., Sidwell R.W., Morrison A.C. et al. Characterization of an influenza A (H3N2) virus resistant to the cyclopentane neuraminidase inhibitor RWJ-270201. // Antiv. Res. 52: 251-259 (2001).

168. Staschke K.A., Colacino J.M., Baxter A.J. et al. Molecular basis for the resistance of influenza viruses to 4-guanidino-Neu5Ac2en. // Virol. 214: 642-646 (1995).

169. Stevens J, Corper AL, Basler CF, et al. Structure of the uncleaved human HI hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. II Science. 303(5665): 1866-70 (2004).

170. Straub J.O. An environmental risk assessment for oseltamivir (Tamiflu) for sewage works and surface waters under seasonal-influenza- and pandemic-use conditions. // Ecotoxicol. Environ. Saf. 72(6): 1625-34 (2009).

171. Subbaro K., Klimov A., Katz J. et al. Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness. //Science. 279: 393-396 (1998).

172. Sugaya N, Ohashi Y. Long-acting neuraminidase inhibitor laninamivir octanoate (CS-8958) versus oseltamivir as treatment for children with influenza virus infection. Antimicrob Agents Chemother. 54(6): 2575-82 (2010).

173. Suzuki T., Takahashi T., Nishinaka D. et al. Inhibition of influenza A virus sialidase activity by sulfatide. // FEBSLett. 553: 355-359 (2003).

174. Tai C.Y., Escarpe P.A., Sidwell R.W. et al. Characterization of Human Influenza Virus Variants Selected In Vitro in the Presence of the Neuraminidase Inhibitor GS 4071. // Antimicrob. Agents andChemoter. 42: 3234-3241 (1998).

175. Takahashi T., Suzuki T., Hidari K.I-PJ. et al. A molecular mechanism for the low-pH stability of sialidase activity of influenza A virus N2 neuraminidases. // FEBS Lett. 543: 71-75 (2003).

176. Taubenberger J.K., Reid A.H., Kraft A.E. et al. Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish influenza virus".// Science. 275: 1793-1796 (1997).

177. Taylor G., Crennell S., Thompson C. et al. The sialidase superfamily: structural theme and variations. // In Sialobiology and other novel forms of glycosylation. (Inoue J., Lee Y.C., and Troy F.A., ed) GakushinPub. Co. Osaka-. 187-195 (1999).

178. Taylor N.R., von Itzstein M. Molecular modeling studies on ligand binding to sialidase from influenza virus and the mechanism of catalysis.// J Med Chem. 37(5): 616-24 (1994).

179. Varghese J.N. and Colman P.M. Three-dimensional structure of the neuraminidase of influenza virus A/Tokyo/3/67 at 2.2 A resolution. II J. Mol. Biol. 221: 473-486 (1991).

180. Varghese J.N., Colman P.M., van Donkelaar A. et al. Structural evidence for a second sialic acid binding site in avian influenza virus neuraminidases. II Biochem. 94: 11808-11812 (1997).

181. Wagner R., Wolf Т., Herwig A. et al. Interdependence of hemagglutinin glycosilation and neuraminidase as regulators of influenza growth: a study by reverse genetics. // J. Virol. 74: 63166323 (2000).

182. Watts A.G., and Withers S.G., The synthesis of some mechanistic probes for sialic acid processing enzymes and the labeling of a sialidase from Trypanosoma rangeli. // Can. J. Chem. 82: 1581-1588 (2004).

183. Watts A.G., Oppezzo P., Withers S.G. et al. Structural and Kinetic Analysis of Two Covalent Sialosyl-Enzyme Intermediates on Trypanosoma rangeli Sialidase II J. Biol. Chem. 281: 4149-4155 (2006).

184. Warren L. The thiobarbituric acid assay of sialic acid.IIJ.Biol.Chem.234: 1971-1975 (1959).

185. Webby R.J. and Webster R.G. Emergence of influenza A viruses. II Phil. Trans. R. Soc. 356: 1817-1828 (2001).

186. Webster R.G., Bean W.J., Corman O.T. et al. Evolution and ecology of influenza A viruses.11 MicrobioLRev. 56: 152-179(1992).

187. Webster R.G., Kawaoka Y. Influenza an emerging and re-emerging disease.// Seminar in Virology. 5: 103-111 (1994).

188. WHO. Influenza virus neuraminidase and neuraminidase inhibition test procedures.//48: 199-202 (1973).

189. WHO. CDC protocol of real-time RTPCR for swine influenza A(H1N1). // (28 April 2009).

190. WHO. Influenza A(H1N1) NA-H274 detailed pyrosequencing protocol for antiviral susceptibility testing. // (13 May 2009).

191. WHO (EuroFlu.org). Еженедельный электронный бюллетень ЕРБ ВОЗ. // http://www. euro flu, ons/czi-files/bulletin v2. cgi 353 (09 апреля 2010).

192. WHO WER. Update on oseltamivir resistant pandemic A (H1N1) 2009 influenza virus: January 2010. // http://www.who.int/wer 85(6): 37-48 (2010).

193. WHO, http://www.who. int/csr/disease/swineflu/en/index.html

194. WHO. Influenza A Virus Resistance to Oseltamivir and Other Antiviral Medicines. // http://www. who. int/csr/disease/influenza/2008-9nhemisummaryreport/en/index. html (2009).

195. WHO. Influenza A(H1N1) Virus Resistance to Oseltamivir: 2008 Southern HemisphereInfluenzaSeason.///2rt'p.y7www. who.int/csr/disease/influenza/oseltamivir summarysouth 2008/en/index.html (2008).

196. WHO. H5N1 avian influenza: timeline of major events.// http://www.who.int/csr/disease/ avian influenza/ai timeline/en/index.html (2010).

197. Wu W.L., Wang G., Chen Y. et al. Mechanism for the emergence and prevalence of H1N1 influenza virus carrying H275Y oseltamivir resistance mutation.// Materials of «Options for the control influenza VII» P-156: 137 (2010).

198. Qi L., Kash J.C., Dugan V.G. et al. Rule of sialic acid binding specifiti of the 1918 influenza virus hemagglutinin protein in virulence and pathogenesis sor mice.///. Virol. 83(8): 3754-61 (2009).

199. Yen H.L., Hoffmann E., Taylor G. et al. Importance of neuraminidase active-site residues to the neuraminidase inhibitor resistance of influenza viruses.// J Virol. 80(17): 8787-95 (2006).

200. Yen H.L., Ilyushina N.A., Salomon R. et al. Neuraminidase Inhibitor-Resistant Recombinant A/Vietnam/1203/04 (H5N1) Influenza Viruses Retain Their Replication Efficiency and Pathogenicity In Vitro and In Vivo II J. Virol. 81: 12418 12426 (2007).

201. Zhang J., Pekosz A., and Lamb R.A. Influenza virus assembly and lipid raft microdomains: a role for the cytoplazmic tails of the spike glycoproteins. // J. Virol. 74: 4634-4644 (2000).

202. Ztlrcher T., Yates P.J., Daly J. et al. Mutations conferring zanamivir resistance in human influenza virus N2 neuraminidases compromise virus fitness and are not stably maintained in vitro. U JAntimicrob. Chemother. 58(4): 723-32 (2006).

Информация о работе

Белякова, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Нейраминидазная специфичность штаммов вирусов гриппа A и B, циркулировавших в России в эпидсезоны 2006-2010 гг. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы