Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo

Мальцева, Валентина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo"

На правах рукописи

МАЛЬЦЕВА ВАЛЕНТИНА НИКОЛАЕВНА

Респираторный взрыв и особенности его регуляции в

периферических нейтрофилах при росте опухоли IN VIVO

03 00 02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

PV0

Пущино - 2007

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель - кандидат биологических наук

Сафронова Валентина Григорьевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Новоселова Елена Григорьевна

доктор биологических наук Новиков Кирилл Николаевич

Ведущая организация

Российский государственный медицинский университет, Москва

Защита состоится /¿¿¡^¿^¿Р 2007 г в часов на заседании Диссертационного совета Д 002 038 01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН, г Пущино Автореферат разослан 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

ТИ Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Взаимоотношения между иммунной системой и развивающейся в организме опухолью является актуальной и волнующей проблемой современной биологии клетки и онкоиммунологии Иммунная система играет важную роль в задержке роста и регрессии опухолей [O'Beirne, Harrison, 2004, Mocellin, 2005] Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) вовлечены в развитие противоопухолевого иммунного ответа [Di Carlo et al, 2001, Jablonska et al, 2005] Они считаются важными при определенных видах противоопухолевой терапии [Chassemg et al, 1993, Castaño et al, 2006] Нейтрофилы подавляют рост экспериментальных опухолей in vivo [Fujii et al, 1987, Wang et al, 1989] Прямое цитостатическое и цитотоксическое действие нейтрофилов на опухолевые клетки подтверждено in vitro [Pencle et al, 1996, Igney et al, 2004] Нейтрофилы первыми мигрируют к опухоли на ранних стадиях ее формирования [Stoppacciaro et al, 1993, Nakao et al, 2005] и являются активными компонентами стромы [Mueller, Fusemg, 2004] Однако роль нейтрофилов, как и других клеток врожденного иммунитета, в возникновении и развитии опухолей неоднозначна [de Visser et al, 2006] Показано, что на поздних стадиях инфильтрация опухоли нейтрофилами способствует прогрессу опухоли, усиливая ангиогенез и метастазирование с помощью селектинов [Borsig et al, 2002], цитокинов и ферментов [Nielsen et al, 1996, Wu et al, 2001, Sun, Yang, 2004]

Рост большинства злокачественных новообразований сопровождается изменениями основных звеньев иммунного ответа [Chen et al, 2003, Motta et al, 2003, Chang et al, 2004] Имеются сведения о модуляции функций нейтрофилов при развитии опухоли уменьшение хемотаксической активности, стимулированной формилированным пептидом [Ueta et al, 1994], возрастание либо понижение уровня продукции АФК [Чердынцева и др , 1992, Asian et al, 1998, Szuster-Ciesielska et al, 2004] Однако сведения о влиянии опухоли на функциональную активность нейтрофилов противоречивы Изменения зависят от типа, локализации и стадии онкологического заболевания [Kasimir-Bauer et al, 1994, Мальцева и др , 2005]

Цитотоксическая активность нейтрофилов опосредована протеолитическими ферментами гранул и активными формами кислорода (АФК) АФК продуцируются в респираторном взрыве, который инициируется активацией NADPH оксидазы [Babior, 2002, Segal, 2005] Хемотаксический пептид N-формил-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ) активирует респираторный взрыв, связываясь со специфическим рецептором [Thelen, 1993] Показано, что в трансдукции сигнала с рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу участвуют гетеротримерный Огбелок, малые ГТФазы, протеинкиназа С (ПКС), каскад митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК), фосфатидилинозит 3-киназа (ФИ-3-К) [Thelen, 1993, Hallett, Lloyds, 1997, Kyriakis, Avruch, 2001]

На данный момент остается малоизученным влияние опухоли и ее продуктов на активность и регуляцию NADPH оксидазы, ответственной за продукцию АФК Этот вопрос является важным из-за двойственной роли АФК в организме Они обеспечивают защиту от патогенов и трансформированных клеток, но и участвуют в мутагенезе, повреждая белки и нуклеиновые кислоты, и содействуют пролиферации опухолевых клеток [Zhang et al, 1998, Sapone et al, 2003, De Larco et al, 2004] Для нормального функционирования организма важно поддержание оптимального уровня генерации АФК нейтрофилами, что обеспечивается координированным взаимодействием компонентов внутриклеточных сигнальных систем Исследования

î\ \

внутриклеточной сигнализации широко проводятся на линиях культур клеток и на опухолевых клетках [Alessi et al, 1995, Droge et al, 2001, Dong-Yun et al, 2003, Patz et al, 2007] Внутриклеточная сигнализация в периферических по отношению к опухоли клетках с высоким цитотоксическим потенциалом - участниках врожденного иммунитета, в том числе в нейтрофилах, при росте опухоли в организме остается не исследованной Возможно, именно на уровне передачи сигнала происходит модификация функционального поведения нейтрофилов таким образом, что они начинают способствовать росту опухоли В целом участие нейтрофилов в процессах канцерогенеза на сегодняшний день мало изучено Полученные в ходе данного исследования результаты помогут прояснить механизмы модификации клеток и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний

Цели и основные задачи исследования Цель данной работы состояла в выявлении особенностей в генерации активных форм кислорода и ее регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли т vivo

Были поставлены следующие задачи

1) разработать экспериментальные модели солидных опухолей из клеток карциномы Льюиса (LLC) на мышах линии C57BL/6, асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) на мышах линии MNRI и культур J 774, WEHI 164, NS0 на мышах линии BALB/c,

2) оценить параметры воспалительной реакции, такие как попуяяционный состав и количество перитонеальных воспалительных клеток,

3) охарактеризовать морфологические и функциональные свойства периферических нейтрофилов на разных сроках роста опухоли,

4) оценить спонтанную и вызванную продукцию АФК нейтрофилами животных с солидной опухолью на разных стадиях ее роста,

5) изучить роль рецепторов хемотаксического пептида ФМЛФ с высоким и низким сродством в инициации респираторного взрыва нейтрофилов мышей при росте опухоли,

6) исследовать внутриклеточную сигнализацию от рецепторов ФМЛФ на NADPH оксидазу, с участием р38 МАРК, ПКС и ФИ-З-К нейтрофилов мышей в динамике росга опухоли

Научная новизна работы. Впервые установлено, что развитие опухоли в организме животного сопровождается последовательным изменением морфологии и функциональной активности периферических нейтрофилов Получены однозначные новые данные, свидетельствующие о том, что интенсивность респираторного взрыва периферических нейтрофилов и его регуляция меняется в динамике опухолевого процесса Впервые показаны участие рецепторов ФМЛФ с разной аффинностью в инициации респираторного взрыва нейтрофилов на разных стадиях роста опухоли и модификация роли тирозиновых протеинкиназ, ПКС, р38 МАРК, ФИ-З-К в его регуляции Впервые установлены общие закономерности изменения параметров воспалительной реакции при развитии солидных опухолей разной этиологии Получены новые факты о характерных особенностях изменений продукции АФК и роли киназ в зависимости от типа опухоли и фазы ее развития Результаты работы свидетельствуют о модификации периферических иммунных клеток во время роста опухоли

Научно-практическая ценность Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе модификации функциональной активности клеток иммунной системы, включая

нейтрофилы, относится к фундаментальным проблемам биологии клетки и онкоиммунологии Полученные результаты существенно расширяют представление о взаимоотношениях между клетками иммунной системы и растущей в организме опухолью Считается, что важнейшей задачей современных исследователей в области онкологии является поиск новой стратегии в лечении онкологических заболеваний, которая будет основана в значительной степени на иммунотерапии, усиливающей противоопухолевый иммунитет и подавляющий процессы, которые способствуют развитию опухоли Полученные в ходе данного исследования результаты помогают понять механизмы модификации клеток иммунной системы и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях и школах 7-9 Пущинская конференция молодых ученых (Пущино, 2003-2005), XV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2003), FEBS Special Meeting on Signal Transduction (Бельгия, 2003), отчетная годичная научная конференция ИБК РАН (Пущино, 2003), Physiological Society spring Workshop "Receptors and Cell Signalling m Oxidative Stress" (Венгрия, 2003), Международный междисциплинарный Конгресс «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Украина, 2004), III съезд биофизиков России (Воронеж, 2004), IX-XI Всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005-2007), 49th Annual Meeting of Biophysical Society (USA, 2005), 2-ая Международная конференция «Наука - бизнес -образование» (Пущино, 2005), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), Научная школа-конференция «Сигнальные системы клетки рецепторы, ионные каналы, вторичные мессенджеры -физиологические функции и роль в онтогенезе» (биостанция Кропотово, Московская область, 2005), 2nd World Conference of Stress (Венгрия, 2007), The EMBO/FEBS Advanced Lecture Course "Molecular mechanisms m signal transduction and cancer" (Греция, 2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 3 статьи (1 статья в печати)

Структура и объем диссертации Диссертация включает в себя введение, обзор литературы, описания материалов и методов, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий 230 ссылок Работа изложена на 138 страницах и содержит 30 рисунков и 4 таблицы

Список сокращений АФК - активные формы кислорода, ПКС - протеинкиназа С, р38 МАРК - р38 митоген-активируемая протеинкиназа, ФИ-З-К - фосфатидилинозит-3-киназа, ФМЛФ - N-формил-Мет-Лей-Фен, t-boc-МЛФ - iV-терт-бутоксикарбонил-Мет-Лей-Фен, LLC - карцинома Льюиса (Lewis Lung Carcinoma), АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха, ФНО - фактор некроза опухоли

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на перитонеальных вызванных нейтрофилах половозрелых мышей-самцов аутбредной линии NMRI (N=240) и инбредных линий C57BL/6 (№=180), BALB/c (N=100) Солидные опухоли формировали внутримышечной трансплантацией в бедренную часть задней лапы клеток карциномы Льюиса (Lewis Lung Carcinoma - LLC) мышам линии C57BL/6, асцитной

карциномы Эрлиха (АКЭ) мышам линии NMRI и клеток культур J774 (макрофагоподобные клетки, саркома), WEHI 164 (фибробласты, фибросаркома), NS0 (лимфобласты, миелома) мышам линии BALB/c Клетки были любезно предоставлены О С Моренковым, руководителем лаборатории культур клеток и клеточной инженерии ЙБК РАН Животным контрольных групп инъецировали физиологический раствор или обработанные митомицином С (100 мг/мл) опухолевые клетки Нейтрофилы изолировали из брюшной полости через 5 ч после инъекции 150 мкл суспензии зимозана (5 мг/мл), как это описано ранее (Сафронова и др , 2001) Нейтрофилы контрольных животных и животных с опухолью исследовали на разных стадиях роста опухоли в параллельных экспериментах Фракцию нейтрофилов (98% по окрашиванию акридиновым оранжевым) выделяли из суспензии перитонеальных клеток центрифугированием в растворе фиколл-урографин с плотностью 1 077 г/мл Продукцию АФК оценивали по люминол-зависимой хемилюминесценции при плотности клеток в рабочей ячейке 10б клеток/мл Параллельно регистрировали сигнал от проб с интактными и обработанными ингибитором клетками Физиологический раствор для измерений имел состав, мМ NaCl 138, КС1 6, СаС12 1, MgS04 1, NaHC03 5, Na2HP04 1, глюкоза 5 5, HEPES 10, люминол 0 35, NaNj 0 1, 3 ед/мл пероксидаза, рН 7 4 Влияние ингибиторов оценивали по отношению параметра, полученного от клеток, обработанных ингибитором, к параметру интактных клеток, принятому за 100 % (относительная продукция АФК, %) Каждый независимый эксперимент выполнен на клетках одного животного с параллельной регистрацией ответов Статистический анализ результатов проводили с использованием ¿-критерия Стьюдента по указанному в каждом случае числу независимых измерений, каждое из которых было проведено на клетках отдельного животного На рисунках указан уровень статистической значимости отличий среднего значения параметра от контрольного значения

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Модель экспериментальной опухоли

Карцинома Льюиса (LLC) является неиммунногенной, сингенной опухолью в отношении мышей линии C57BL/6 При постановке модели экспериментальной гетеротопической опухоли LLC мы подобрали оптимальное количество инъецируемых опухолевых клеток для формирования устойчивой, контролируемой, растущей солидной опухоли На основе концентрационной зависимости роста опухоли далее во всех экспериментах животным инъецировали 106 клеток (Рис 1 А) Средняя продолжительность жизни животных с LLC составляла 31±5 дней (п=20) На 28-е сутки наблюдалась гибель 50 % животных Все исследования проводили в период роста опухоли до 25-го дня Все контрольные животные, получившие инъекцию физиологического раствора или обработанных митомицином С (100 мг/мл) клеток LLC, оставались живыми в течение периода наблюдений, достоверного увеличения размера лапы не происходило (Рис 1 Б)

0421 -7366 -631В -5263 -

¿' 4211 -

о> £

§ 3158 -2105 -1053 -О -

• Ъ« н:

О ФИИ)Ч.Ц>ГИЧ«ГЧШ (ИНГ I юр т I1n.it: ||*Н]>чиикис «пупмсн^к

/ I -

/ У

Время, сутки

0 10

Время, сутки

Рис. !. Зависимость размера лапы животного от времени после инъекции опухолевых клеток. Л - динамика увеличения объема бедра при инъекции 3* I О5 (2). 3х I О4 (3), Ю5 (4), ] О6 клеток (5) и без инъекции (I). Объем рассчитывали как \'=(1 /6)л-'-1|]где с); и являются тремя взаимно перпендикулярными измерениями бедра задней ноги. В - показано отсутствие значимых изменений объема лапы у животных с инъекцией физиологического раствора или обработанных митомпцпном С опухолевых клеток; $=30.

Гистологический анализ срезов задней конечности п легких н динамике роста опухоли был

проведен совместно с Амелиной С.Е., научным сотрудником лаборатории механизмов клеточной рецепции И Б К РАН. Гистологические срезы лапы ж и потного, сделанные в разные сроки после инокуляции в лапу опухолевых клеток, демонстрируют постепенное разрушение мышечной ткани и замещение се клетками опухоли (Рис. 2).

-' 1. —, * ' _ «

Рис. 2. Гистологические срезы лапы: А — контроль; Б - 7-е сутки после инъекции опухолевых клеток; В — 15-е сутки после инъекции опухолевых клеток; Г - 25-е сутки после инъекции опухолевых клеток. Стрелки указывают на опухолевые клетки.

Модель карциномы Льюиса дает возможность использовать еще один параметр - масса легких - для оценки роста опухоли, так как опухоль дает метастазы в ткани легкого. Масса легких

постепенно увеличивалась и достоверно отличалась от контрольного параметра на 12-е су тки (Рис. 3). Позже наблюдалось более б и строе увеличение массы легких, что характеризует стадию активной метастазиро в а н ия опухоли Это подтверждает гнетоло! ическое исследование.

Рис. 3. Изменение массы легкий но мере роста опухоли. *-р<0.001; п=30.

Контрольный ере) легкого характеризуется четкими альвеолами (Рис, 4 А), По мере роста опухоли нормальная альвеолярная структура ткани легких нарушается: на 7-е сутки альвеолярный рисунок становится нечетким (Рис. 4 Б), появляются очаги опухолевых клеток, на 15-е сутки четко видны разрастающиеся метастазы (Рис. 4 В), на 25-е сутки наблюдается разрушение легочной ткани, место которой занимают опухолевые клетки (Рис. 4 Г).

• ■ >

■У ,г"'

Рис. 4. Гистологические срезы легкого контрольного животного (А) и животных после инокуляции опухолевых «леток через 7 (Б), 15 (С) и 25 (Г) суток. Стрелки указывают на зоны м етастаз и ро ва I и I я.

2. Популяцнонный состав клеток периферической кропи мышей изменялся по мере роста опухоли: увеличивалось содержание нейтрофилов и моноцитов в крови, в то время как количество лимфоцитов и гИэинофилов снижалось (Таблица 1).

Таблица I. Лейкоцитарная формула крови мышеи но мерс рос та опухоли.

Тип клеток (%) Время, сутки

0 7 12 14 23

Базофилы 2.0±0,2 1,0±0,1 !,0±0,2 2,0±0,1 2,0±0, ]

Эозннофилы 8,0±2,0 7,012,0 7,0±1,5 5,0±! ,0 5,0±0.5

Нейтрофилы 34,0±3,0 40,0±5,0 43,0±3,0* 52,0±4,0' 57,0±7,0"

Лимфоциты 52,0±б,0 47АЫ.О 43,0=5,0" 3 5.0*3,0" 26,0±3,0"

Моноциты 4,0±0,5 5,0±2.0 6,0± 1,0 6.0±0,5 7,0± 1,0

Примечание; * - р<0.001\п=5.

Данные, приведенные в таблице, демонстрируют, что через 12 и более дней после инокуляции опухолевых клеток в крови значительно возрастает количество нейтрофилов н уменьшается количество лимфоцитов. При раковых заболеваниях у людей также были выявлены вариации в соотношении субнопуляций клеток в крови, например, иммунорегуляторных субпопуляшш Т-

лимфоцитов [Shiku, 2003] Общее число нейтрофилов и количественная пропорция между гранулоцитами и лимфоцитами в крови используются как важные диагностические и прогностические показатели [Fetterly et al, 2001, Walsh et al, 2005]

3. Популяционный состав клеток-, изолированных из очага острого воспаления в перитонеальной полости

Свою функциональную активность нейтрофилы наиболее ярко проявляют при воспалительной реакции, они являются ее главными участниками Поэтому на наш взгляд представляло интерес выявить изменения функциональной активности нейтрофилов в воспалительном процессе при развитии опухоли

У мышей с опухолью острая воспалительная реакция имела некоторые особенности в брюшную поступало значительно большее количество вызванных нейтрофилов, которое возрастало и достоверно отличалось от контроля на 12-й, 19-й и 23-й день после инъекции клеток LLC (Рис 5)

В суспензии изолированных перитонеальных клеток контрольных мышей, кроме гранулоцитов, присутствовали большие зернистые лимфоциты (около 3,6%), тучные клетки (1,4%) и небольшое количество дендритных клеток (0,2%), тогда как в популяции перитонеальных клеток мышей с опухолью (12-е сутки) обнаруживались большие зернистые лимфоциты (около 0,7%), тучные клетки (0,75%) и дендритные клетки (примерно 3%)

Рис 5 Количество нейтрофилов, выделенных из очага острого воспаления, контрольных

животных и животных с солидной опухолью * - р<0,001, п=20

Изменение популяционного состава клеток в очаге вызванного зимозаном воспаления очевидно связано с жизнедеятельностью опухоли Увеличение относительного количества дендритных клеток в воспалительном экссудате может быть объяснено тем, что ускоряется их созревание и усиливается миграция при наличии в организме опухоли [Mushiake et а, 2005] Увеличение количества мигрировавших в перитонеальную полость нейтрофилов может быть вызвано несколькими причинами возрастанием общего числа нейтрофилов в крови [Asian et al, 1998], усилением способности клеток к адгезии и миграции [Chuluyan et al, 2000], увеличением продолжительности их жизни из-за подавления процесса апоптоза [Wislez et al, 2001, Ishikawa, Miyazaki, 2005] Повышение количества нейтрофилов в крови при опухолях считается следствием увеличения количества клеток-предшественников гранулоцит-макрофагального ряда в костном мозге [Watari et al, 2000]

3 Морфологические изменения нейтрофилов

Во всех моделях, использованных нами, нейтрофилы животных с опухолью имели больший размер, увеличенное ядро с повышенной сегментацией и более выраженную зернистость цитоплазмы (Рис 6, 7)

Рис. 6 Нейтрофнды контрольных мышеи (!) и Мышей ; опухо.чыо на 12-й день после трансплантации клеток 1.LC (2). Показаны ядра клеток. Краситель -акридиновым оранжевый. Масштаб - 2,2 мкм.

Как- определено ь модели LLC диаметр клеток возрастал от 7,4±0,й мкм (контрольны! животные) до 13,1 ±0,9 мкм на 23-е сутки после инъекции опухолевых клеток (р<0,001; п=30)

Рис, 7. Изменение диаметра перитонеальных вызванных

нейтрофилов у животных но мере роста L LC.

*-р<П,0Щ. **-р<0.05: п=30

Врс.чя. сутки

До настоящего времени не имелось сведений об изменении морфологи» нейтрофилов при развитии опухоли в организме. Однако большой интерес в этом аспекте представляет работа, выполненная японскими учеными [Araki ct а)., 2004], в которой показано репрОТраммироЩние нейтрофилов в макрофагоподобные клетки иод действием факторов роста. Мы допускаем, что при повышенном уровне факторов роста в- организме-опухоленосителе также может происходить репрограмиирование иммунных клеток.

4. Изменение функций нейтрофилов

Экспрессия адгезивных белков (селектинов, интегрниов) па поверхности нейтрофила обеспечивает его взаимодействие с окружающими клетками (клетками эндотелия сосудов. Клетками межклеточного матрикса) и определяет способность к миграции в омаг not на лени я, где нейтрофилы реализуют свой цитотоксический потенциал.

Мы оценили адгезивные свойства нейтрофилов по их способности прилипать к культуральному пластику. Обнаружили, что на ранних этапах роста опухоли (3-9-с сутки) наблюдалось уменьшение адгезии, затем происходило усиление адгезивных свойств (Рис. 10).

Наблюдаемое памп усиление адгезивной активности нейтрофилов при развитии опухоли согласуется с литературными данными. Выло показано, что у больных с хронической лейкемией показано увеличение экспрессии L-селектина на нейтрофилах, что может быть следствием высокого уровня ФПО-а в сыворотке крови [ К tersnows ka-Rogo wska el al.. 2006]. Прайм про ванне нейтрофилов цитоккиами приводит к усиленной экспрессии на щпзрплазматической мембране адгезивных молекул, участвующих во взаимодействии с эндотелием сосудов и межтканевым матриксом, что повышает способность нейтрофилов к миграции н очаг воспаления [Chuluyart et al., 2000; Jadhav etal, 2007|.

5 200

Рис 10 Изменение адгезивных свойств перитонеальных нейтрофилов мышей при росте опухоли Рассчитано количество клеток, прилипших к пластику, животных с опухолью, по отношению к таковому контрольных животных, принятому за 100%

Время супси

6, Продукция АФКпериферическими нейтрофилами мыши

В литературе имеются довольно многочисленные данные об изменении способности нейтрофилов продуцировать АФК при развитии опухоли [например, Asian et al, 1998, Szuster-Ciesielska et al, 2004] Однако, эти сведения противоречивы в одних случаях авторы описывают усиление активности нейтрофилов, а в других - подавление Вероятно, влияние опухоли зависит от комплекса факторов, включающего локализацию исследуемых клеток (клетки стромы, периферические или ассоциированные с опухолью клетки), тип и локализацию опухоли, продолжительность ее роста Согласно нашим результатам, уровень спонтанной продукции АФК был существенно повышен в нейтрофилах животных с опухолью, в то время как, в нейтрофилах животных с инъекцией физиологического раствора или клеток LLC, обработанных митомицином С, он практически не изменялся Можно видеть, что этот параметр возрастал по мере развития опухоли до 19-го дня и достоверно отличался от контрольного уровня уже на седьмой день после трансплантации опухолевых клеток (Рис 11) Повышение спонтанной продукции АФК нейтрофилами по мере роста опухоли наблюдалось на других моделях опухоли

Рис 11 Изменение уровня спонтанной продукции АФК в нейтрофилах животных с инъекцией клеток LLC (1), физиологического раствора (2), обработанных митомицином С опухолевых клеток (3) *-р<0,001, п=15

Время сутки

Нейтрофилы реализуют свою функциональную активность, мигрируя в очаг воспаления по градиенту хемотаксических факторов Наиболее сильным активатором функций нейтрофила, в том числе и респираторного взрыва, является хемотаксический пептид 1Ч-формил-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ) Зависимость интенсивности респираторного взрыва от концентрации ФМЛФ представляет собой кривую с насыщением На 7-е сутки во всем диапазоне концентраций ФМЛФ (0,1 - 50 мкМ) амплитуда ответа нейтрофилов мышей с опухолью была значительно ниже, чем контрольных (Рис 12) Полумаксимальная доза (ЕС50) составляла 7,5±1,4 мкМ у контрольных животных и 6,23±0,35 у животных с опухолью (р <0,05, п=20)

Рис 12 Концентрационная зависимость максимальной амплитуды ответа на ФМЛФ нейтрофилов контрольных мышей (1) и мышей с солидной опухолью на 7-й день после инъекции опухолевых клеток (2) *-р<0,001, ** - р<0,05, п =20

Концентрация ФМЛФ мкМ

Для дальнейших исследований были выбраны две концентрации ФМЛФ 5 мкМ -концентрация близкая к ЕС50, и 25 мкМ - концентрация, близкая к насыщению

При оценке изменений интенсивности респираторного взрыва, активированного 5 и 25 мкМ ФМЛФ, в нейтрофилах можно выделить на три этапа на 3-6-е сутки наблюдалось снижение, затем усиление (8-12-е сутки), на поздних сроках роста опухоли (13-27-е сутки) наблюдалось значительное снижение (Рис 13) Ответ нейтрофилов мышей с опухолью на поздних сроках характеризовался более медленной скоростью нарастания и спада (Рис 13 Б)

В нейтрофилах мышей с инъекцией физиологического раствора и инактивированных митомицином С опухолевых клеток значительных изменений в интенсивности респираторного взрыва не наблюдалось (Рис 13 А) Поэтому дальнейшие исследования механизмов регуляции респираторного взрыва нейтрофилов проводились только на экспериментальной группе животных с инъекцией клеток LLC

Время сутки

I Контроль 1 LLC 7-е сутки I LLC 12-бсужи ] LLC 19-е сутеи I LLC 23-и сутки

1 Контроль

2 LLC 19-е супм

3 LLC 23-и сутки

S Ц№ ФМЛФ

Рис 13 Продукция АФК нейтрофилами при росте опухоли А - зависимость от времени максимальной амплитуды ответа на 5 мкМ ФМЛФ нейтрофилов мышей с инъекцией опухолевых клеток (1), обработанных митомицином С клеток (2) и физиологического раствора (3) * - р<0,001, п=10 Б - продукция АФК нейтрофилами контрольных животных (1) и животных на 19-е (2) и 23-е (3) сутки после инъекции клеток опухоли Стрелки показывают момент добавления 5 мкМ ФМЛФ В - изменение амплитуды респираторного взрыва, индуцированного 5 (1) и 25 (2) мкМ ФМЛФ * -р<0,001, п=20

Таким образом, наблюдается три фазы изменения интенсивности респираторного взрыва при развитии опухоли понижение на ранних этапах, затем ее увеличение и снова понижение Усиление респираторного взрыва с 12-е по 19-е сутки после инъекции опухолевых клеток может быть связано с процессами активации и перестройки иммунной системы организма, направленными на активацию всех ресурсов организма для борьбы с растущей опухолью Возможно, эта реорганизация является переломным моментом во взаимоотношениях «иммунная система -опухоль» Общая тенденция состоит в том, что при наличии опухоли в организме генерация АФК перитонеальными нейтрофилами характеризуется повышенным спонтанным уровнем и пониженной интенсивностью ответа на стимул, что является характерным признаком ослабления цитотоксичности клеток Это типичная картина отмечаемого при многих заболеваниях «гиперактивированного» состояния, при котором нарушается баланс между системами, продуцирующими и инактивирующими АФК Нейтрофилы становятся источником поврезвдения клеток организма, не обеспечивают полноценную защиту от патогенов и не способны тормозить опухолевый рост, а содействуют прогрессу опухоли [De Larco et al, 2004, Zivkovic et al, 2005] Динамическое изменение продукции АФК нейтрофилами и дисбаланс в регуляции уровня АФК может быть следствием изменения характеристик рецепторов ФМЛФ и сигнализации с рецептора на NADPH оксидазу Далее мы оценили возможную реорганизацию передачи сигнала с рецептора ФМЛФ на эффекторные молекулы во время роста опухоли

7 Ингибиторный анализ регуляции респираторного взрыва нейтрофилов Оценка вклада peifenmopoe ФМЛФ с разным сродством в инициацию респираторного взрыва

Активация нейтрофилов хемотаксическими агентами, включая формилированные пептиды, представляет собой загадочный феномен, когда один лиганд регулирует не только степень активации клетки, но и запускает несколько функциональных ответов [Hallett, Lloyds, 1997, Witko-Sarsat et al, 2000] Принципиально важным для функционирования нейтрофила в градиенте концентраций хемотаксического пептида считается то, что при низких концентрациях запускаются двигательные функции клеток, а по мере продвижения к очагу воспаления с ростом концентрации активируются секреторная дегрануляция и инициируется респираторный взрыв Вероятно, присутствие на нейтрофилах рецепторов с высоким и низким сродством к хемотаксическому пептиду значимо для обеспечения иерархии функциональных реакций Этот вопрос в настоящее время остается без ответа, хотя в литературе существуют отдельные указания на такую возможность

В нейтрофилах мыши экспрессируется два типа рецепторов ФМЛФ, характеризуемых высоким (FPR) и низким (FPR2) сродством к пептиду Мы использовали антагонист рецепторов с высоким сродством N- терт-бутоксикарбонил-Мет-Лей-Фен (t-boc-МЛФ) для того чтобы исключить вклад высокоаффинных рецепторов ФМЛФ в продукцию АФК Было обнаружено дозо-зависимое ингибирование респираторного взрыва, вызванного 5 и 25 мкМ ФМЛФ, в присутствие t-boc-МЛФ (Рис 14 А) У контрольных животных 5 мкМ t-boc-МЛФ подавлял респираторный взрыв, вызванный 5 мкМ ФМЛФ примерно на 70%, тогда как при активации клеток 25 мкМ ФМЛФ -примерно на 5% (п=8) На основании ингибиторного анализа можно заключить, что с ростом опухоли наблюдается снижение вклада высокоафинных рецепторов в генерацию продукции АФК, на поздних этапах роста опухоли их вклад возрастает, но остается меньше, чем в нейтрофилах

контрольных животных Активация респираторного взрыва ФМЛФ в высокой концентрации, осуществляется преимущественно через низкоаффинные рецепторы, вклад высокоаффинных рецепторов незначителен, но также зависит от динамики роста опухоли (Рис 14 Б) А Б

120 1100

§ 80 |

о, 60 с

I 40

¡20 <5

Рис 14 Действие t-boc-МЛФ на респираторный взрыв нейтрофилов, активированный ФМЛФ А - концентрационная зависимость влияния антагониста на максимальную амплитуду ответа на 5 (1) и 25 (2) мкМ ФМЛФ нейтрофилов контрольных мышей Б - влияние 5 мкМ t-boc-МЛФ на нейтрофилы мышей с растущей опухолью * - р<0,001, п=8

Вероятно, что с развитием опухоли изменяется функциональная значимость рецепторов с

разным сродством в инициации респираторного взрыва Это может быть следствием нарушения

экспрессии высокоаффинных рецепторов или их инактивация

Фосфорилирование является основным механизмом регуляции активности NADPH оксидазы

[El Benna et al, 1994] Считается, что в нейтрофилах рецепторы ФМЛФ обоих субтипов сопряжены

с Огбелком и действуют через сигнальный путь фосфолипазы С с последующей активацией ПКС,

фосфорилирующей субъединицу p47pho!t NADPH оксидазы [Hallett, Lloyds, 1997, Lavigne et al,

2002] Кроме того, ФМЛФ запускает сигнальные пути с участием каскада МАРК [Krump et al,

1997, Brown et al, 2004], ФИ-3-К [Kodama et al, 1999, Ellson et al, 2001, Cadwallader et al, 2002]

Тирозиновые протеинкиназы и протеинфосфатазы также вовлечены в опосредованную рецептором

ФМЛФ регуляцию активности NADPH оксидазы [Hallett, Lloyds, 1997, Zhan et al, 2003]

Рецепторы с высоким и низким сродством к ФМЛФ могут использовать разные сигнальные пути

для осуществления одной и той же функции [Paclet et al, 2004] Однако до сих пор нет четкого

представления об участии сигнальных систем в рецептор-зависимой регуляции генерации АФК

при активации высоко- или низко-аффинных рецепторов Мы показали ранее, что характер

регуляции NADPH оксидазы сигнальными компонентами зависит от концентрации ФМЛФ

[Сафронова и др , 2005], поэтому интерес представляло исследование роли киназ в респираторном

взрыве, активируемом ФМЛФ в низкой и высокой концентрации

Действие тирфостина 51, ингибитора тирозиновых протеинкиназ

Тирфостин 51 ингибировал как спонтанную продукцию АФК, так и респираторный взрыв нейтрофилов контрольных животных и животных с опухолью Действие 5 мкМ тирфостина 51 на уровень спонтанной продукции АФК практически не изменялось в нейтрофилах мышей на 3-12-е сутки после инъекции опухолевых клеток, на 19-е сутки - ослаблялось, а на более поздних этапах роста опухоли - 23-е сутки, значительно усиливалось (Рис 15 А - В) Изменение действия

t Boc-MLF мкМ

тирфостина 51 на активированную 5 и 25 мкМ ФМЛФ продукцию АФК по мере роста опухоли имело двухфазный характер ослабление ингибирующего влияния на ранних этапах роста опухоли (7-19-й день), причем на 19-й день влияние ингибитора отсутствовало, и усиление на поздних - 23-й день (Рис 15 А, Б, Г)

25 мкМ ФМЛФ

в <

Контро1Ь

Время с

I1!

7 12

Время сутки

Время, с

в <

Контроль 7 сутки

| - I 19 сутки 23 сутки

______j

5 мкМ ФМЛФ

25 мкМ ФМЛФ

Рис 15 Действие тирфостина 51, ингибитора тирозиновых протеинкиназ, на продукцию АФК при росте опухоли А, Б - экспериментальные записи действия 5 мкМ тирфостина 51 на продукцию АФК нейтрофилами контрольных животных и животных на 19-е сутки, соответственно интактные клетки (1) и клетки, обработанные тирфостином 51 (2) Стрелка указывает момент добавления 25 мкМ ФМЛФ В -действие ингибитора на уровень спонтанной продукции АФК Г - действие тирфостина 51 на активированную 5 и 25 мкМ ФМЛФ продукцию АФК * - р<0,00, п=20

Таким образом, роль тирозиновых протеин киназ становится менее значимой при передаче сигнала на КАБРН оксидазу по мере роста опухоли На поздних этапах роста опухоли (после 23-го дня), вероятно, происходят значительные изменения на уровне организма Действие СУ7 109203Х, ингибитора протиенкиназы С

вР 109203Х повышал уровень спонтанной продукции АФК в нейтрофилах контрольных животных У животных-опухоленосителей на 7-й и 10-й день наблюдалось ингибирование спонтанной продукции АФК, на поздних этапах роста опухоли ингибитор не оказывал влияния (Рис 16 В) Ингибирование протеинкиназы С уменьшало продукцию АФК более чем на 70% в случае 5 мкМ ФМЛФ, при активации респираторного взрыва 25 мкМ ФМЛФ ингибирование составляло около 50 % в нейтрофилах контрольных животных Действие 1 мкМ вР ослаблялось в клетках мышей с опухолью по мере ее роста, как при активации респираторного взрыва 5 мкМ, так и 25 мкМ ФМЛФ На 19-е сутки роста опухоли ингибитор не влиял на респираторный взрыв,

Инициированный 5 мкМ, и усиливал продукцию ЛФК при активации клеток 25 мкМ ФМЛФ (Рис. 16 А, Б, Г).

Колггропь

Т 10 Времч, суткн

5 ыкМ ФМЛ<Л 2; мкМ ФМЛФ

Рис. 16, Действий 01: 109203Х, ингибитора протеинккйазы С, на продукцию ЛФК при росте опухоли. А, Б - экспериментальные 'записи действия 1мкМ 01' 109203X на продукцию ЛФК нейтрофилами контрольных животных и животных на 19-е сутки; соответственно: интактные клетки (I) и клетки, обработанные С Г' 109203Х (2), Стрелка указывает момент добавления 25 мкМ ФМЛФ В - действие ингибитора на уровень спонтанной продукции ЛФК. Г - Действие С Г 109203Х на активированную 5 и 25 мкМ ФМЛФ продукцию АФК. * -р<0,00; п=20.

Результаты демонстрируют; изменение регулятор йог и влияния ИКС на спонтанный и активированный уровень генерации ЛФК при развитии опухоли. В передаче сигнала на КАЩШ оксидазу в инициации респираторного взрыва нейтрофилов контрольных животных ПКС оказывает потенцирующее влияние, тогда как при росте Опухали ее влияние ослабляется и становится штюнруюшкм на 19-е сутки.

Действие $В 201580, ингибиторар38 МАРК

Показано, что 5В 203580 понижал уровень спонтанной продукции АФК в нейтрофилй* контрольных животных. По мере роста опухоли наблюдалось усиление действия ингибитора на уровень спонтанной продукции АФК (Рис. 17 8). Действие ингибитора рЗ8МАРК на активированную ФМЛФ продукцию ЛФК также изменялось по мерс роста опухоли (Рис 17 А, Б, Г): в контрольных клетках 1 мкМ 5В 203580 слабо ингибировал респираторный взрыв, вызванный 5 мкМ ФМЛФ, п незначительно усиливал продукцию АФК, вызванную 25 мкМ ФМЛФ На 7-й день сто ингнбирующее действие усилилось в случае активации 5 мкМ ФМЛФ, при актива кии 25 мкМ ФМЛФ он практически не влиял на продукцию АФК. На 12-й день ингибитор усиливал

продукцию ЛФК, на более поздних сроках (19-14 день) значительно подпил ял ответ в обоих случаях.

Полученные результаты Ёвидетельййуют о том. что р38 МАРК повышает активность Ь1Л№1( океидазы при развитии респираторного взрыва яейтрофклов, вызванного 5 мкМ ФМЛФ до 10-го дня роста опухоли, на 12-11 же день ее регулирующая роль изменяется на противоположную - р38 МАРК понижает активность, на поздних этапах снова происходит смена регулятор но» роли протеинкиназь^ причем усиливается ее потенцирующее влияние.

г. 160

= !40

Й 1го

а 100

£ 90

I го

а 0

Время, £

Время с

Контроль

Время. сутки

I Коитропь

1 ? «учм* I 10 сутки

3 12 еут*и

I 1 9 Су1*н

|||

25 мкМ ФМЛФ

Рис. 17. Действие ЯВ 203580, ингибитора рЗ8 МАРК, на продукцию АФК при росте опухоли А, Б - экспериментальные записи действия 1мкМ КВ 203580 иа продукцию АФК нейтрофиламн контрольных животных и животных на 12-е сутки, соответственно; интактные клетки (/} и клетки, обработанные 203580 (2). Стрелка указывает момент добавления 25 мкМ ФМЛФ. 13 - действие ингибитора на уровень спонтанной продукции АФК. Г - действие ЙВ 203580 на активированную 5 и 25 мкМ ФМЛФ продукцию АФК. * - р<0,0()1; п=20.

Действие вортманнина и IУ 294002, ингибиторов ФИ-З-К

Ингибиторы ФИ-З-К 0,1 мкМ вортманнин и 50 мкМ ЬУ 294002 существенно подавляли спонтанную и активированную продукцию АФК в ответ на 5 и 25 мкМ ФМЛФ в пеитрофилах контрольных животных Действие ингибиторов было близким но значению (Рис. 18) Влияние ингибиторов па базовый уровень продукции ЛФК ослаблялось иа ранних папах роста опухоли, далее наблюдалось динамическое усиление действия ингибиторов по мере роста опухоли (Рис. 18 А), Действие как вортманнина, так и ЬУ 294002 на активированную ФМЛФ продукцию АФК на 7-е сутки после инъекции опухолевых клеток усиливалось^ затем на 12-19-е сутки ипгибирующее влияние ослаблялось, при этом ЬУ 294002 даже усиливал продукцию ЛФК, на 23-е сутки

ингибирующий действие снова усиливалось (Рис. 18 Б, В).

KdHipMh -1

I 5,1 kviU 3 Z'; кнМ LV

5 мкМ ФМЛФ

a. »

JLá

Вречя. сутки

Время.сутки

íA 120

к 100

% SO

j «0

5 4Ü

§ »

■ íi.im^ikctuj 25 мкМ ФМЛФ

. —>■ '.г

Рис. 18. Действие вортмаппина и I.Y 394002, ингибиторов ФИ-З-К, на продукцию ЛФК' А -влияние на спонтанньЩ уронеиъ. Б и В - действие на респираторный взрыв, активированный 5 и 25 мкМ ФМЛФ, соответственно.

*-р<0.001; аЙЖ

üptllH, СуТКЕ!

Таким образом, рост опухоли сопровождался постепенным ослаблением действий вортманнина и LY 294002. Это свидетельствует о том, что регулирующая роль ФИ-З-К в передаче сигнала с рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу динамически ос.чаблялется по мере роста опухоли: на ранних сроках роста опухоли ФИ-З-К участвует в передаче сигнала с рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу с подавлением ее активности, а затем, па поздних стадиях, с усилением активности. Роль ФИ-З-К в регуляции респираторного взрыва на 12-19-е сутки значительно ослабляется, но вновь усиливается после 19-и суток.

Полученные результаты демонстрируют, что по мере роста опухоли ~ра ¡сформировалось действие ингибиторов кипаз, участвующих в регуляции активности NADPH оксидазы и Проведении сигнала с рецептора ФМЛФ: ИКС, р38 МАРК, ФИ-З-К. Это свидетельствует об изменении регуляторной роли этих ферментов в активации и развитии респираторного взрыва периферических нейтрофилов при росте опухоли.

В. Другие модели росши солидных onyXQjféñ

Нами были разработаны к исследованы пять моделей опухолевого роста: карцинома Льюиса (мыши линии С57ВЬ'й), карцинома Эрлиха (мыши линии NMRJ) и, опухоли, полученные путем Инъекции клеток линии WEHI 164, NSO, J774 (мыши линии BALB). Солидная опухоль, полученная из клеток АКЭ, была первой, освоенной нами, моделью роста опухоли in vivo. Строго говоря, АКЭ нельзя рассматривать как адекватную модель, так как по отношению к мышам липни NMR! она иммуногенна и пелиниеепеинфмчпа. При исследованиях с инокуляцией АКЭ и лапу животного для

формирования солидной опухоли были получены результаты, которые мы расцениваем как предварительные, однако выявленные закономерности в той или иной форме позднее повторились на других моделях роста опухоли Воспалительная реакция у мышей с опухолью (во всех моделях) имела общие закономерности по мере роста опухоли количество нейтрофилов, привлекаемых в очаг воспаления, возрастало, размер клеток, их ядра и количество гранул было увеличено Общей закономерностью является повышение спонтанной продукции АФК нейтрофилами по мере роста опухоли и понижение активированной на поздних этапах роста опухоли, что наблюдалось на четырех моделях Исключение составляла модель NS0, что объясняется ее иммуногенностью [материалы с сайта HyperCLDB, Version 4 200201], по сравнению с другими моделями опухолей Для разных типов солидных опухолей, исследованных нами, наблюдается следующая закономерность ослабление роли киназ в регуляции респираторного взрыва на 12-19-е сутки и ее частичное восстановление на более поздних сроках

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами были установлены корреляции между объемом лапы и количеством клеток (г=0,99), объемом лапы и диаметром нейтрофилов (г=0,95), массой легких и количеством клеток (г=0,97), массой легких и диаметром нейтрофилов (г=0,90), уровнем спонтанной продукции АФК и объемом лапы (г=0,51), уровнем спонтанной продукции АФК и массой легких (г=0,68), уровнем активированной ФМЛФ продукции АФК и объемом лапы (г=0,60), уровнем активированной продукции АФК и массой легких (г=0,54) Таким образом, корреляции между динамикой опухолевого роста и варьированием количества клеток, их размера, продукции АФК, говорят о взаимосвязи между этими процессами и дают возможность установить однозначность влияния развивающейся опухоли на нейтрофилы

Наблюдаемый нами характер изменений интенсивности респираторного взрыва и действия ингибиторов киназ соответствует современной теории взаимоотношений растущей опухоли и иммунной системы - теории «иммуноредактирования» (Рис 19) Предполагается, что процесс иммуноредактирования состоит из трех стадий элиминации, равновесия и избегания [Zitvogel et al, 2006, Swann, Smyth, 2007] Возможно, что первой стадии, «элиминации» соответствует наблюдаемая нами фаза изменений на ранних сроках роста опухоли, когда иммунные клетки распознают и удаляют трансформированные клетки На этом этапе нейтрофилы находятся в состоянии гиперактивности, что характеризуется повышенным уровнем спонтанной продукции АФК и понижением ответа на активацию Во второй, теоретической фазе «равновесия», иммунные и опухолевые клетки сосуществуют в равновесных отношениях, при этом опухолевым клеткам свойственна повышенная генетическая нестабильность Иммунные клетки в свою очередь «пытаются» распознать и удалить постоянно мутирующие опухолевые клетки, что, возможно, отражается в наблюдаемой нами повышенной активности нейтрофилов (усиление адгезивных свойств, повышение продукции АФК) Но в этот же период, вероятно, агенты, продуцируемые раковыми клетками, необратимо модифицируют нейтрофилы и другие иммунные клетки, что мы отслеживаем по изменению их морфологии, функциональной активности и ее регуляции, синтеза белка, а также модификации регуляторной роли киназ Складывается впечатление, что клетки опухоли таким образом воздействуют на иммунные клетки, что подавляют и подстраивают их под себя Можно предположить, что именно эти изменения приводят к третьей фазе, когда иммунные

клетки не способны «бороться» с опухолевыми клетками, а, наоборот, способствуют развитию опухоли. И, наконец, во время третьей фазы иммунные клетки становятся некомпетентными но отношению к опухолевым и опухолевые клетки активно распространяются. На поздних стадиях развития LLC, когда резко увеличивается масса легких Й гистологически выявляются метастазы, периферические; нейтрофилы характеризуются снижением всех наблюдаемых нами параметров. Огромный интерес представляет дальнейшее исследование «второй фазы» и понимание механизмов перехода периферической по отношению к опухоли клетки от «нормальной» к модифицированной и разработка мероприятий по предотвращению этого процесса.

Иммунная система

Элиминация

Awтиопуы&квая активность

Гш?р «личность А

■Спонт. продукщи АФК J • npo^K^yt АФКт

Опухоль

Равновесие

рышвннбя

прздукщи АФК генетическая

шмуно-

неком^егп фнтность

Проопухолглая актианость

еания

С понт гтродупш АФк*: «

■ АЛГНЬ продукция АФУ-11

Рис. 19. Гипотетическая схема участия нейтрофилов во взаимоотношениях иммунной системы и растущей опухоли. Показаны возможные этапы модификации их функционального состояния и смены противоопухолевой активности на проопудолевую (схема составлена по Zitvogei et al., 2006).

Представляется перспективным развитие представлений о роли нейтрофилов и защите организма от раковой агрессии [Wafumoto et al. 2003¡, С осторожностью надо относиться к предложению стимуляции нейтрофилов при противораковой терапии [Александровский, 2002]. Эффективность противоопухолевого действия нейтрофилов будет определяться этнологией опухоли и стадией опухолевого процесса [de Visser et al., 2006].

выводы

1 Развитие солидной опухоли в организме животного сопровождается изменением параметров воспалительной реакции (популяционного состава клеток воспалительного экссудата и количества нейтрофилов, мигрировавших в центр воспаления), морфологических и функциональных свойств периферических нейтрофилов

2 Повышается уровень спонтанной продукции АФК нейтрофилами при росте опухоли в организме

3 Изменение интенсивности респираторного взрыва имеет трехфазный характер понижается на ранних этапах, затем повышается и снова понижается на поздних

4 С ростом опухоли вклад низкоаффинных рецепторов ФМЛФ в инициацию и развитие респираторного взрыва нейтрофилов возрастает

5 Изменяется регуляторная роль ПКС, р38 МАРК, ФИ-З-К, тирозиновых протеинкиназ в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов при росте опухоли

6 Характер изменений функциональной активности нейтрофилов имеет общие закономерности при развитии солидных опухолей из клеток LLC, АКЭ, WEHI 164, J 774, NS0 Наблюдаемая трансформация активности определяется стадией опухолевого роста

Список основных публикаций по теме диссертации:

1. Мальцева В Н . Авхачева Н В , Санталов Б Ф , Сафронова В Г Наблюдение в динамике модификации функциональной активности периферических нейтрофилов и ее регуляции при росте опухоли in vivo Цитология 2006 48(12) 1000-1009

2. Сафронова В Г , Габдулхакова А Г, Мальцева В Н , Миллер А В , Санталов В Ф Проявления дивергенции сигнальных путей рецептора хемотаксического пептида М-формил-Ме1-Leu-Phe при праймировании инсулином респираторного взрыва нейтрофилов Биол Мембраны 2006 23(2) 171-181

3. Мальцева В Н . Авхачева Н В , Миллер А В , Габдулхакова А Г Функциональная активность нейтрофилов мышей с экспериментальной опухолью 7 Пущинская конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века» Пущино 2003 С 30

4. Maltseva V N . Avkhacheva N V , Miller А V , Gabdoulkhakova A G, Safronova V G Tumor process tangling signaling systems m neutrophils from inflammatory center FEBS Special Meeting on Signal Transduction Brussels, Belgium 2003 P 192 (PS01-0976)

5. Мальцева В H, Авхачева Н В, Сафронова В Г Динамика изменений функционального состояния и внутриклеточной сигнализации в периферических нейтрофилах при росте опухоли Отчетная конференция ИБК РАН, Сессия Ученого совета 2003

6. Мальцева В Н Роль PI3K в действии инсулина на периферические нейтрофилы при росте опухоли 8 Пущинская конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века» Пущино 2004 С 87

7. Мальцева В Н , Сафронова В Г , Авхачева Н В , Садовников В Б Изменения функционального состояния и внутриклеточной сигнализации в периферических нейтрофилах при росте опухоли III съезд биофизиков России Воронеж 2004 С 251

8 Мальцева В Н . Сафронова В Г , Арапов Н А Сравнение продукции активных форм кислорода клетками крови и ее регуляции в группах пациентов с онкологическими заболеваниями

IX Всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» Мед Иммунол 2005 7 (2-3) 204

9. Safronova V G, Maltseva V N. Lenoir А, Avhacheva N Reorganization of insulin signaling m peripheral neutrophils during in vivo growth of Lewis lung carcinoma Biophysical Society, 49th Annual Meeting, USA 2005 1253-Pos

10 Мальцева В H. Авхачева НВ Действие ингибитора р38 МАРК на продукцию активных форм кислорода периферическими нейтрофилами мыши на ранних стадиях роста карциномы Льюиса XI Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века», Пущино 2005 С 85

11. Мальцева В Н . Сафронова В Г , Санталов Б Ф , Арапов Н А Оксидазная активность клеток крови пациентов с онкологическими заболеваниями и корректирующее действие фитопрепаратов I Съезд физиологов СНГ, Сочи 2005 С 183

12. Мальцева В Н Изменение в регуляции инсулином спонтанной и вызванной продукции АФК нейтрофилами при развитии опухоли Научная школа-конференция «Сигнальные системы клетки рецепторы, ионные каналы, вторичные мессенджеры - физиологические функции и роль в онтогенезе» Биостанция Кропотово (Каширский район, Московская область) 2005

13. Мальцева В Н, Авхачева Н В , Сафронова В Г Нейро-иммунное взаимодействие роль нейтрофила в норме и при патологии Международный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» Судак Украина 2006 С 124-126

14. Мальцева В Н . Сафронова В Г Сравнение функциональной активности нейтрофилов при росте опухоли in vivo на трех экспериментальных моделях XI Всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» Мед Иммунол 2007 9 (2-3) 153

15. Maltseva V N . Vrublevskaya V V, Morenkov О S , Safronova V G Effects of hsc70/hsp70 on immunogenicity of mitomycin C-treated Lewis lung carcinoma cells and on the neutrophil ROS production 2nd World Conference of Stress Budapest, Hungary 2007 P 323

16 Maltseva V N. Avkhacheva N V and Safronova V G Cancer and immune cells modification of activity and signal transduction in peripheral neutrophils The EMBO / FEBS Advanced Lecture Course on the Island of Spetses Greece 2007

Заказ № 258/09/07 Подписано в печать 26 09 2007 Тираж 100 зкз Уел п л 1,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 '^гг^ уму*/ с/г ги, е-та и т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мальцева, Валентина Николаевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы Иммунная система и опухоль

1.1.1. Общая характеристика опухолевых клеток, их особенности

1.1.2. Классификация опухолей

1.1.3. Компетентность иммунной системы в отношении опухолей

1.1.4. Способы избегания клетками опухоли надзора иммунной системы

1.1.5. Влияние опухоли на компоненты иммунной системы

1.1.6. Теории взаимодействия опухоли и иммунной системы. Роль стромы опухоли

1.2. Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) 37 1.2:1. Общая характеристика

1.2.2. Мембранные рецепторы нейтрофилов

1.2.3. Респираторный взрыв и его регуляция

1.2.3.1. Структура NADPH оксидазы

1.2.3.2. Активация NADPHоксидазы, сигнализация

1.3. Двойственное поведение активных форм кислорода (АФК)

1.3.1. Характеристика АФК

1.3.2. Системы генерации и инактивации активных форм кислорода

1.3.3. А ФК - польза или вред?

1.3.4. Участие АФК в процессах канцерогенеза

1.3.5. Влияние активных форм кислорода на сигнальные системы

1.4. Неоднозначность роли нейтрофила в канцерогенезе

1.4.1. Антиопухолевая активность

1.4.2. Проопухолевая активность

Глава 2. Материалы и методы исследования 64 2.1. Материалы

2.2. Биологический объект

2.2.1. Изоляция перитонеальных нейтрофилов мыши

2.2.2. Подготовка проб крови

2.3. Модель экспериментальной опухоли

2.3.1. Линии клеток

2.3.2. Формирование солидной формы опухоли

2.4. Регистрация хемилюминесценции

2.4.1. Хемилюминометр, программы и режим измерения

2.4.2. Измерение хемилюминесценции цельной крови

2.4.3. Измерение хемилюминесценции изолированных клеток

2.5. Микроскопия клеток

2.6. Гистологический анализ тканей

2.7. Анализ спектра белков методом электрофореза

2.8. Обработка результатов

Глава 3. Результаты

3.1. Модель экспериментальной опухоли на мышах

3.2. Оценка статуса лейкоцитов периферической крови

3.2.1. Популяционный состав клеток крови

3.2.2. Продукция АФК клетками крови

3.3. Анализ клеток, изолированных из очага острого воспаления

3.4. Морфологические изменения нейтрофилов

3.5. Функциональные изменения нейтрофилов

3.5.1. Оценка адгезивных свойств

3.5.2. Продукция АФК периферическими нейтрофилами мыши

3.5.2.1. Спонтанная продукция АФК

3.5.2.2. Активированная ФМЛФ продукция А ФК

3.5.2.3. Оценка вклада отдельных активных форм кислорода в спонтанную и активированную продукцию АФК

3.6. Ингибиторный анализ регуляции респираторного взрыва нейтрофилов

3.6.1. Оценка вклада рецепторов ФМЛФ с разным сродством в инициацию респираторного взрыва

3.6.2. Ингибирование киназ

3.6.2.1.Действие тирфостина 51, ингибитора тирозиновых 86 протеинкиназ

3.6.2.2. Влияние GF109203Х, ингибитора протеинкиназы С

3.6.2.3. Действие SB 203508, ингибитора р38 МАРК

3.6.2.4. Действие вортманнина и LY294002, ингибиторов фосфатидилинозит-3-киназы

3.6.2.5. Влияние ортованадата натрия, ингибитора тирозиновых протеинфосфатаз

3.7. Оценка количества и спектра белков периферических нейтрофилов

3.7.1. Роль синтеза белка в способности нейтрофилов продуцировать АФК

3.7.2. Количество и спектр белков в цитоплазматической и ядерной фракциях

3.8. Сравнение функциональной активности нейтрофилов на моделях солидных опухолей

Глава 4. Обсуяедение результатов 102 Выводы 113 Список литературы

Благодарности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo"

Актуальность проблемы. Выяснение взаимоотношений между иммунной системой и развивающейся в организме опухолью является актуальной и волнующей проблемой современной биологии клетки и онкоиммунологии. Иммунная система играет важную роль в задержке роста и регрессии опухолей [O'Beirne, Harrison, 2004; Mocellin, 2005]. Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) вовлечены в развитие противоопухолевого иммунного ответа [Di Carlo et al., 2001; Jablonska et al., 2005]. Они считаются важными при определенных видах противоопухолевой терапии [Chasseing et al., 1993; Castano et al., 2006]. Нейтрофилы подавляют рост экспериментальных опухолей in vivo [Fujii et al.,1987; Wang et al., 1989]. Прямое цитостатическое и цитотоксическое действие нейтрофилов на опухолевые клетки подтверждено in vitro [Pericle et al., 1996; Igney et al., 2004]. Нейтрофилы первыми мигрируют к опухоли на ранних стадиях ее формирования [Stoppacciaro et al., 1993; Nakao et al., 2005] и являются активными компонентами стромы [Mueller, Fusenig, 2004]. Однако роль нейтрофилов, как и других клеток врожденного иммунитета, в возникновении и развитии опухолей неоднозначна [de Visser et al., 2006]. Показано, что на поздних стадиях инфильтрация опухоли нейтрофилами способствует прогрессу опухоли, усиливая ангиогенез и метастазирование с помощью селектинов [Borsig et al., 2002], цитокинов и ферментов [Nielsen et al., 1996; Wu et al., 2001; Sun, Yang, 2004].

Рост большинства злокачественных новообразований сопровождается изменениями основных звеньев иммунного ответа [Chen et al., 2003; Motta et al., 2003; Chang et al., 2004]. Имеются сведения о модуляции функций нейтрофилов при развитии опухоли: уменьшение хемотаксической активности, стимулированной формилированным пептидом [Ueta et al., 1994], возрастание либо понижение уровня продукции АФК [Чердынцева и др., 1992; Asian et al., 1998; Szuster-Ciesielska et al., 2004]. Однако сведения о влиянии опухоли на функциональную активность нейтрофилов противоречивы. Изменения зависят от типа, локализации и стадии онкологического заболевания [Kasimir-Bauer et al., 1994; Мальцева и др., 2005].

Цитотоксическая активность нейтрофилов опосредована протеолитическими ферментами гранул и активными формами кислорода (АФК). АФК продуцируются в респираторном взрыве, который инициируется активацией NADPH оксидазы [Babior, 2002; Segal, 2005]. Хемотаксический пептид N-формил-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ) активирует респираторный взрыв, связываясь со специфическим рецептором [Thelen, 1993]. Показано, что в трансдукции сигнала с рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу участвуют гетеротримерный Gj-белок, малые ГТФазы, протеинкиназа С (ПКС), каскад митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК), фосфатидилинозит 3-киназа (ФИ-З-К) [Thelen, 1993; Hallett, Lloyds, 1997; Kyriakis, Avruch, 2001].

На данный момент остается малоизученным влияние опухоли и ее продуктов на активность и регуляцию NADPH оксидазы, ответственной за продукцию АФК. Этот вопрос является важным из-за двойственной роли АФК в организме. Они обеспечивают защиту от патогенов и трансформированных клеток, но и участвуют в мутагенезе, повреждая белки и нуклеиновые кислоты, и содействуют пролиферации опухолевых клеток [Zhang et al., 1998; Sapone et al., 2003; De Larco et al., 2004]. Для нормального функционирования организма важно поддержание оптимального уровня генерации АФК нейтрофилами, что обеспечивается координированным взаимодействием компонентов внутриклеточных сигнальных систем. Исследования внутриклеточной сигнализации широко проводятся на линиях культур клеток и на опухолевых клетках [Alessi et al., 1995; Droge et al., 2001; Dong-Yun et al., 2003; Patz et al., 2007]. Внутриклеточная сигнализация в периферических по отношению к опухоли клетках с высоким цитотоксическим потенциалом - участниках врожденного иммунитета, в том числе в нейтрофилах, при росте опухоли в организме остается не исследованной. Возможно, именно на уровне передачи сигнала происходит модификация функционального поведения нейтрофилов таким образом, что они начинают способствовать росту опухоли. В целом участие нейтрофилов в процессах канцерогенеза на сегодняшний день мало изучено. Полученные в ходе данного исследования результаты помогут прояснить механизмы модификации клеток и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний.

Цели и основные задачи исследования. Цель данной работы состояла в выявлении особенностей в генерации активных форм кислорода и ее регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo.

Были поставлены следующие задачи:

1) разработать экспериментальные модели солидных опухолей из клеток карциномы Льюиса (LLC) на мышах линии C57BL/6; асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) на мышах линии MNRI и культур J 774, WEHI 164, NS0 на мышах линии BALB/c;

2) оценить параметры воспалительной реакции, такие как популяционный состав и количество перитонеальных воспалительных клеток;

3) охарактеризовать морфологические и функциональные свойства периферических нейтрофилов на разных сроках роста опухоли;

4) оценить спонтанную и вызванную продукцию АФК нейтрофилами животных с солидной опухолью на разных стадиях ее роста;

5) изучить роль рецепторов хемотаксического пептида ФМЛФ с высоким и низким сродством в инициации респираторного взрыва нейтрофилов мышей при росте опухоли;

6) исследовать внутриклеточную сигнализацию от рецепторов ФМЛФ на NADPH оксидазу с участием р38 МАРК, ПКС и ФИ-З-К нейтрофилов мышей в динамике роста опухоли;

7) оценить спектр цитоплазматических и ядерных белков нейтрофилов при развитии опухоли в организме животного.

Научная новизна.

Впервые установлено, что развитие опухоли в организме животного сопровождается последовательным изменением морфологии и функциональной активности периферических нейтрофилов. Получены однозначные новые данные, свидетельствующие о том, что интенсивность респираторного взрыва периферических нейтрофилов и его регуляция меняется в динамике опухолевого процесса. Впервые показаны участие рецепторов ФМЛФ с разной аффинностью в инициации респираторного взрыва нейтрофилов на разных стадиях роста опухоли и модификация роли тирозиновых протеинкиназ, ПКС, р38 МАРК, ФИ-З-К в его регуляции. Впервые установлены общие закономерности изменения параметров воспалительной реакции при развитии солидных опухолей разной этиологии. Получены новые факты о характерных особенностях изменений продукции АФК и роли киназ в зависимости от типа опухоли и фазы ее развития. Результаты работы свидетельствуют о модификации периферических иммунных клеток во время роста опухоли.

Научно-практическая ценность. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе модификации функциональной активности клеток иммунной системы, включая нейтрофилы, относится к фундаментальным проблемам биологии клетки и онкоиммунологии. Полученные результаты существенно расширяют представление о взаимоотношениях между клетками иммунной системы и растущей в организме опухолью. Считается, что важнейшей задачей современных исследователей в области онкологии является поиск новой стратегии в лечении онкологических заболеваний, которая будет основана в значительной степени на иммунотерапии, усиливающей противоопухолевый иммунитет и подавляющей процессы, которые способствуют развитию опухоли. Полученные в ходе данного исследования результаты помогают понять механизмы модификации клеток иммунной системы и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях и школах: 7-9 Пущинская конференция молодых ученых (Пущино, 2003-2005); XV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2003); FEBS Special

Meeting on Signal Transduction (Бельгия, 2003); отчетная годичная научная конференция ИБК РАН (Пущино, 2003); Physiological Society spring Workshop "Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress" (Венгрия, 2003); Международный междисциплинарный Конгресс «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Украина, 2004); III съезд биофизиков России (Воронеж, 2004); IX-XI Всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005-2007); 49th Annual Meeting of Biophysical Society (USA, 2005); 2-ая Международная конференция «Наука - бизнес - образование» (Пущино, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); Научная школа-конференция «Сигнальные системы клетки: рецепторы, ионные каналы, вторичные мессенджеры - физиологические функции и роль в онтогенезе» (биостанция Кропотово, Московская область, 2005); 2nd World Conference of Stress (Венгрия, 2007); The EMBO/FEBS Advanced Lecture Course "Molecular mechanisms in signal transduction and cancer" (Греция, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 3 статьи (1 статья в печати).

Список сокращений:

АГ - антиген;

АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха; АО - акридиновый оранжевый; АФК - активные формы кислорода; АФП - а-фетопротеин; ИЛ - интерлейкины; ИНФ - интерфероны;

МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы (mitogen-activated protein kinases);

МИФ - макрофаг-ингибирующий фактор; МНС - главный комплекс гистосовместимости; ОАА - опухоль-ассоциированные антигены; 03 - опсонизированный зимозан; ОС - окислительный стресс; ПКС - протеинкиназа С; СОД - супероксиддисмутаза; ФИ-З-К - фосфатидил инозит 3-киназа; ФЛС - фосфолипаза С;

ФМЛФ - N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; ФНО - фактор некроза опухоли; ХЛ - хемилюминесценция;

ERK - киназы регулируемые внеклеточными сигналами (extracelluler signal-regulated kinases);

HLA - антигены лейкоцитов человека (human-leucocyte-associated antigens); JNK - c-Jun киназа;

LLC - карцинома Льюиса (Lewis Lung Carcinoma);

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный;

NK - натуральные киллерные клетки; t-boc-МЛФ - vV-терт-бутоксикарбонил-Мет-Лей-Фен;

TCR - Т-клеточный рецептор;

TGF - фактор роста тромбоцитов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Мальцева, Валентина Николаевна

Выводы:

1. Развитие солидной опухоли в организме животного сопровождается изменением параметров воспалительной реакции (популяционного состава клеток воспалительного экссудата и количества нейтрофилов, мигрировавших в центр воспаления), морфологических и функциональных свойств периферических нейтрофилов.

2. Повышается уровень спонтанной продукции АФК нейтрофилами при росте опухоли в организме.

3. Изменение интенсивности респираторного взрыва имеет трехфазный характер: понижается на ранних этапах, затем повышается и снова понижается на поздних.

4. С ростом опухоли вклад низкоаффинных рецепторов ФМЛФ в инициацию и развитие респираторного взрыва нейтрофилов возрастает.

5. Изменяется регуляторная роль ПКС, р38 МАРК, ФИ-З-К, тирозиновых протеинкиназ в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов при росте опухоли.

6. Характер изменений функциональной активности нейтрофилов имеет общие закономерности при развитии солидных опухолей из клеток LLC, АКЭ, WEHI 164, J 774, NS0. Наблюдаемая трансформация активности определяется стадией опухолевого роста.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мальцева, Валентина Николаевна, Пущино

1. Александровский Я.А. Молекулярные механизмы взаимовлияния патологических процессов при совместном протекании сахарного диабета и рака. Научные и клинические аспекты // Биохимия. 2002. №67.-С. 1611-1631.

2. Антонов В.Г., Козлов В.К. Патогенез онкологических заболеваний. Цитологические и молекулярно-генетические механизмы иммунной резистентности малигнизированных клеток // Цитокины и воспаление. 2004. № 2. - С. 25-31.

3. Василенко И.В., Кондратюк З.Б. Паренхиматозно-стромальные взаимоотношения в опухолях и их особенности при раке желудка кишечного и диффузного типа // Онкология. 2006. Т.8. № 1. - С. 712.

4. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. -М.: Мир, 1991.-232 с.

5. Извекова В.А. Липиды мембран и функции иммунокомпетентных клеток в норме и патологии // Успехи современной биологии. -1991. № 111.-С. 577-587.

6. Катанаев В.Л. Внутриклеточная передача сигнала при хемотаксисе нейтрофилов // Биохимия. 2001. - Т. 66. - С. 437-456.

7. Коган Е. А. Автономный рост и прогрессия опухолей // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2002. Т. 12. №4. - С. 87-90.

8. Копнин Б.П. Мишени действия онкагенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2000. - Т.65. - С.5- 33.

9. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 5. - С. 17-26.

10. Куспаев Е.Н., Поляков В.И., Баспаева М.Б., Тулеуов А.Е., Медеубаев Р.К., Засорин Б.В., Талаева Ш.Ж. Динамикаиммунологических показателей у онкологических больных // Онкология и гематология. 2006. - С. 26-34.

11. Лакота Я., Врановски А., Ладицка М. Спонтанная регрессия опухолей после высокодозовой химиотерапии и аутологической трансплантации стволовых клеток и ее возможная связь с апластической анимией // Экспериментальная онкология. 2003. № 25.-С. 17-25.

12. Лю Б.Н. Кислородно-перекисная концепция апоптоза и возможные варианты его механизма // Усп. совр. биологии. 2001. № 121. - С. 488-501.

13. Лю М. Б., Подобед И. С., Лю Б. Н. Роль пероксигенации в инвазивном росте и метастазировании неоплазм // Современные аспекты онкологии и радиологии. 2002. - С. 39-42.

14. Мальцева В.Н., Сафронова В.Г., Арапов Н.А. Сравнение продукции активных форм кислорода клетками крови и ее регуляции в группах пациентов с онкологическими заболеваниями // Мед. Иммунол. -2005. № 7. С. 204.

15. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. -Новосибирск: Наука, 1989. 341 с.

16. Налескина П.А. Современные классификации солидных опухолей // Интернет-журнал "DOCTOR". 2003. №4.

17. Попова Н.А. Иммунитет против опухолей. Миф или реальность? // СОЖ. 2001. Т.7. № 3. - С. 12-17.

18. Сафронова В.Г., Габдулхакова А.Г., Миллер А.В., Косарев И.В., Василенко Р.Н. Вариабельность действия инсулина на респираторный взрыв в нейтрофилах. Роль тирозиновых киназ и фосфатаз // Биохимия. 2001. № 66. - С. 1036-1047.

19. Чердынцева Н.В., Наумов С.А., Удут В.В., Пешкова О.А., Шепеткин И.А. Окислительный метаболизм нейтрофильных гранулоцитов крови при предраке и раке желудка // Биохимия. -1992. №7.-С. 182-187.

20. Ярилин А.А. Иммунология. М.: Мир, 1999. - 123 с.

21. Abelson H.T. and Stossel T.P. Neutrophil/tumour-cell rosettes in ascitic fluid of patient with lymphoma // Lancet. 1978. - Vol. 1. - P. 1217.

22. Adam J.K., Odhav В., Bhoola K.D. Immune responses in cancer // Pharmacol Ther. 2003. - Vol. 99. - P. 113-132.

23. Ado A.D. Uber den Verlauf der oxydativen und glykolytischen Prozesse in der Leukocyten des entzundeten Gewebes wahrend der Phagocytise // Z. Gen. Exp. Med. 1933. - Vol. 87. - P. 473-481.

24. Alessi D., Cuenda A., Cohen P., Dudley D., and Saltiel A. PD098059 is a specific inhibitor of the mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo // J. Biol. Chem. 1995. № 46. - P. 27489-27494.

25. Babior B.M. NADPH oxidase: an update // Blood. 1999. - Vol. 93. - P. 1464-1476.

26. Babior B.M. The leukocyte NADPH oxidase // Isr. Med. Assoc. J. -2002.-Vol. 4.-P. 1023-4.

27. Вас Y. S., Kang S.W., Seo M.S. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen // J. Bid. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 217— 221.

28. Banchere J., M Steinman R. Dendritic cells and the control of immunity // Nature. 1998. - Vol. 392. - P. 245-252.

29. Barzilai A., Rotman G., Shiloh Y. ATM deficiency and oxidative stress: a new dimension of defective response to DNA damage // DNA repair. -2002.-Vol. l.-P. 3-25.

30. Berman J.J. Tumor classification: molecular analysis meets Aristotle BMC // Cancer. 2004. - Vol. 4. - P. 1-9.

31. BhowmickN.A., Moses H.L. Tumor-stroma interactions // Curr. Opin. Genet Dev. 2005. - Vol. 15. - P. 97-101.

32. Bingle, L., Brown, N.J., Lewis, C.E. The role of tumor-associated macrophages in tumor progression: implications for new anticancer therapies // J. Pathol. 2002. - Vol. 196. - P. 254-265.

33. Bokoch G.M., Diebold B.A. Current molecular models for NADPH oxidase regulation by Rac GTPase // Blood. 2002. - Vol. 100. - P. 2692-2696.

34. Boon Th., van Baren N. Immunosurveillance against Cancer and immunotherapy synergy or antagonism? // N. Engl. J. Med. - 2003. -Vol. 346.-P. 252-254.

35. Brar S.S., Kennedy T.P., Whorton A.R. Requirement for reactive oxigen . species in serum-induced and platelet-derived growth factor-inducedgrowth of airway smooth muscle // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. -P. 20017—20026.

36. Brown G.E., Stewart M.Q., Bissonnette S.A., Elia A.E., Wilker E., Yaffe M.B. Distinct ligand-dependent roles for p38 МАРК in priming and activation of the neutrophil NADPH oxidase // J. Biol. Chem. 2004. -Vol. 279. - P. 27059-27068.

37. Brown GE, Silver GM, Reiff J, Allen RC, and Fink MP. Polymorphonuclear neutrophil chemiluminescence in whole blood from blunt trauma patients with multiple injuries // J Trauma Injury Infect Crit Care. 1999. - Vol. 46. - P. 297- 305.

38. Bru A., Albertos S., Lopez Garcia-Asenjo J. A., Bru I. Pinning of tumoral growth by enhancement of the immune response // Phys. Rev. Lett. -2004.-Vol. 92.-P. 238101-1-4.

39. Carmody R.J., Cotter T.G. Signalling apoptosis a radical approach // Redox Rep. 2001. - Vol. 6. - P. 77—90.

40. Caruso R.A., Bellocco .R., Pagano M., Bertoli G., Rigoli L., Inferrera C. Prognostic value of intratumoral neutrophils in advanced gastric carcinoma in a high-risk area in northern Italy // Mod. Pathol. 2002. -Vol. 15.-P. 831-837.

41. Castano A.P., Mroz P., Hambin M.R. Photodynamic therapy and antitumor immunity // Nature reviews. Cancer. 2006. - Vol. 6. - P. 535545.

42. Chang W.C., Sheu B.C., Chen R.C., Chow S.N., Huang S.C. Depressed host immunity in a case of metachronous primary uterine papillary serous carcinoma and non-Hodgkin's lymphoma // Int. J. Gynecol. Cancer. 2004. - Vol. 14. -P. 1030-1032.

43. Chasseing N.A., Baranao R.I., Fernandez O., Bordenave H., Rumi L.S. Chemiluminescence production by neutrophils and immune complex levels in cancer patients // Cancer Invest. 1993. - Vol. 11. - P. 517522.

44. Chen Y.L., Chen S.H., Wang J.Y., Yang B.C. Fas ligand on tumor cells mediates inactivation of neutrophils // J. Immunol. 2003. - Vol. 171. -P. 1183-1191.

45. Cheng J.Q., Lindsley C.W., Cheng G.Z., Yang H., Nicosia S.V. The Akt/PKB pathway: molecular target for cancer drug discovery // Oncogene. 2005. - Vol. 24. - P. 7482-7492.

46. Chiplunkar S.V. The immune system and cancer // Current Science. -2001.-Vol. 81.-P. 542-548.

47. Condliffe A.M., Kitchen E., Chilvers E.R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms // Clin. Sci. (Lond). 1998. - Vol. 94. - P. 461-471.

48. Cormary C., Gonzalez R., Faye J.C., Favre G., Tilkin-Mariame A.F./ Induction of T-cell antitumor immunity and protection against tumor growth by secretion of soluble human CD70 molecules // Cancer. Gene Ther. 2004. - Vol. 21. - P. 234-245.

49. Coussens L.M., Werb Z. Inflammatory cells and cancer: think different! // J. Experimental medicine. 2001. - Vol.193. - P. 23-26.

50. Cross AR, Parkinson JF, Jones ОТ. Mechanism of the superoxide-producing oxidase of neutrophils. 02 is necessary for the fast reduction of cytochrome b-245 by NADPH // Biochem J. 1985. - Vol. 226. - P. 881-4.

51. Davies S.P., Raddy H., Caivano M. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors // J. Biochem. 2000. -Vol. 351.-P. 95-105.

52. De Wever O, Mareel M. Role of tissue stroma in cancer cell invasion // J Pathol. 2003. - Vol. 200. - P. 429-47.

53. DeLeo F.R., Quinn M.T. Assembly of the phagocyte NADPH oxidase: molecular interaction of oxidase proteins // J Leukoc Biol. 1996. - Vol. 60.-P. 677-91.

54. Di Carlo E., Forni G., Lollini P. The intriguing role of polymorphorphonucler neutrophils in antitumor reactions // Rev. Am. Soc. Hematol. 2001. - Vol. 97. - P. 339-345.

55. Diebold BA, Bokoch GM. Molecular basis for Rac2 regulation of phagocyte NADPH oxidase // Nat Immunol. 2001. - Vol. 2. - P. 211-5.

56. Dong-Yun S., Yu-Ru D., Shan-Lin L., Ya-Dong Z., and Lian W. Redox stress regulates cell proliferation and apoptosis of human hepatomathrough Akt protein phosphorylation // FEBS Lett. 2003. № 542. - P. 60-64.

57. Downey G.P., Fukushima Т., Fialkow L., Waddell Т.К. Intracellular signaling in neutrophil priming and activation // Cell Biology. 1995. -Vol. 6. - P. 345-356.

58. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function // Physiol Rev. 2002. - Vol. 82. - P. 47-95.

59. Dunn G.P., Old L.J. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting // Immunity. 2004. - Vol. 21. - P. 137-146.

60. Dusi S., Donini M., Rossi F. / Mechanisms of NADPH oxidase activation: translocation of p40phox, Racl and Rac2 from the cytosol to the membranes in human neutrophils lacking p47phox or p67phox. // Biochem. J. 1996. V. 314. P. 409-412.

61. Dvorak A.M., Connell A.B., Proppe K. and Dvorak H.F. // J. Immunol. -1978.-Vol. 120.-P. 1240-1248.

62. Dworakowski R., Anilkumar N., Zhang M., Shah A.M. Redox signalling involving NADPH oxidase-derived reactive oxygen species // Biochemical Society Transactions. 2006. - Vol. 34. - P. 960-964.

63. Edwards S.W. / Biochemistry and Physiology of the Neutrophil. // New York, NY: Cambridge University Press. 1994.

64. Eggleton P., Wang L., Penhallow J., Crawford N., Brown K.A. / Differences in oxidative response of subpopulations of neutrophils from healthy subjects and patients with rheumatoid arthritis. // Ann. Rheum. Dis. 1995. V. 54. P. 916-923.

65. Eichhorn J., Kayali A.G., Resor L., Austin D.A., Rose D.W., Webster N.J. / PLC-gammal enzyme activity is required for insulin-induced DNA synthesis. // Endocrinology. 2002. V. 143. P. 655-664.

66. El-Benna J., Dang Ph. M., Gougerot-Pocidalo M., Elbim C. Phagocyte NADPH oxidase: a multicomponent enzyme essential for host defenses // Arch. Immunol. Ther. Exp. 2005. - Vol. 53. - P. 199-206.

67. Emmendoerffer A., Hecht M., Boeker Т., Mueller M., Heinrich U. Role of inflammation in chemical-induced lung cancer // Toxicol. Lett. 2000. -Vol. 112-113.-P. 185-191.

68. Faenza I., Bavelloni A., Fiume R., Lattanzi G., Maraldi N.M., Gilmour R.S., Martelli A.M., Suh P.G., Billi A.M., Cocco L. / Up-regulation of nuclear PLCbetal in myogenic differentiation. // J. Cell Physiol. 2003. V. 195. P. 446-52.

69. Feng H., Zeng Y.Z., Graner M.W., Likhacheva A., Katsanis E. Exogenous stress proteins enhance the immunogenicity of apoptotic tumor cells and stimulate antitumor immunity // Blood. 2003. - V. 101. -P. 245-252.

70. Fernandez R., Suchard S.J. Syk activation is required for spreading and H2O2 release in adherent human neutrophils // J. Immunol. 1998. - Vol. 160.-P. 5154-5162.

71. Fetterly G.J., Tamburlin J.M., Straubinger R.M. Paclitaxel pharmacodynamics: application of a mechanism-based neutropenia model // Biopharm. Drug Dispos. 2001. - Vol. 22. - P. 251-261.

72. Finkel T. Redox-dependent signal transduction // FEBS Lett. 2000. -Vol. 476.-P. 52-54.

73. Forsberg M., Lofgren R., Zheng L., Stendahl O.Tumour necrosis factor-a potentiates CR3-induced respiratory burst by activating p38 MAP kinase in human neutrophils // Immunology. 2001. - Vol. 103. - P. 465-472.

74. Freeman J.L., Lambeth J.D. NADPH oxidase activity is independent of p47phox in vitro // J Biol Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 22578-82.

75. Fuchs A., Dagher M.C. Activation of the 02-generating NADPH oxidase in a semi recombinant cell-free system, assessment of the function of Rac in the activation process // Eur. J. Biochem. 1994. - Vol. 224. - P. 587595.

76. Fujii Y., Kimura S., Arai S., and Sendo F. In vivo antitumor effect of lymphokine-activated rodent polymorphonuclear leukocytes // Cancer Res. 1987. - Vol. 47. - P. 6000-6005.

77. Gabdoulkhakova A.G, Safronova V.G., Miller A.V., Sadovnikov V.B. Expression of genotypic and phenotypic features in animals during activation and priming of the neutrophil respiratory burst // Baltic J. Lab. Annim. Sci. 2003. - Vol. 4. - P. 29-34.

78. Gamaley I.A., Klyubin I.V. Roles of reactive oxygen species: signaling and regulation of cellular function // Int. Rev. Cytol. 1999. - Vol. 188. -P. 203—255.

79. Garcia-Lora A., Algarra I., Garrido F. MHC class I antigens, immune surveillance, and tumor immune escape // J. Cellular physiology. 2003. -Vol. 195.-P. 346-355.

80. Geijsen N., van Delft S., Raaijmakers J.A., Lammers J.W., Collard J.G., Coffer P.G. Regulation of p21rac activation in human neutrophils // Blood. 1999. - Vol. 94. -P. 1121-1130.

81. Germenis A.E., Karanikas V. Immunoepigenetics: the unseen side of cancer immunoediting // Immunology and cell biology. 2007. - Vol. 85.-P. 55-59.

82. Girardi M. Immimosurveillance and immunoregulation by y6T cells // Journal of Investigative Dermatology. 2006. - Vol. 126. - P. 25-31.

83. Gopalakrishna R., Jaken S. Protein kinase С signaling and oxidative stress // Free Radic. Biol. Med. 2000. - Vol. 28. - P. 1349—1361.

84. Gougerot-Pocidalo M.A., el Benna J., Elbim C., Chollet-Martin S., Dang M.C. Regulation of human neutrophil oxidative burst by pro- and antiinflammatory cytokines // Soc. Biol. 2002. - Vol. 196. - P. 37-46.

85. Graf M., Prins R. and Merchant R. J. 11-6 secretion by a rat T9 glioma clone induces a neutrophil-dependent antitumor response with resultant cellular, antiglioma immunity // Immunol. 2001. - Vol. 166. - P. 121129.

86. Groemping Y., Rittinger K. Activation and assembly of the NADPH oxidase: a structural perspective // Biochem. J. 2005. - Vol. 386. - P. 401—416.

87. Gu Y., Souza R.F., Wu R.F., Xu Y.C. and Terada L.S. Induction of colonic epithelial cell apoptosis by p47-dependent oxidants // FEBS Lett. 2003. - Vol. 540. - P. 195-200.

88. Hallett M.B., Lloyds D. The Molecular and Ionic Signalling of Neutrophils // Landes Bioscience. Austin, Texas. USA. 1997. - P. 211.

89. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. Inside the neutrophils phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing // Blood. -1998.-Vol. 92.-P. 3007-3017.

90. Harvath L., Leonard E.J. Two neutrophil populations in human blood with different chemotactic activity: separation and chemotactic binding // Infect. Immun. 1982. - Vol. 36. - P. 443-448.

91. Hawkins P.T., Anderson K.E., Davidson K., Stephens L.R. Signalling through Class I PI3Ks in mammalian cells // Biochem. Soc. Trans. -2006. Vol. 34. - P. 647-662.

92. Heyworth P.G., Cross A.R., Curnutte J.T. Chronic granulomatous disease // Curr. Opin. Immunol. 2003. - Vol. 15. - P. 578-84.

93. Igney F.H., Behrens C.K., Krammer P.H. CD95L mediates tumor counterattack in vitro but induces neutrophil-independent tumor rejection in vivo // Int J Cancer. 2004. - Vol. 113. - P. 78-87.

94. Ishikawa F., Miyazaki S. New biodefense strategies by neutrophils // Arch. Immunol. Ther. Exp. 2005. - Vol. 53. - P. 226-233.

95. Jablonska E., Puzewska W., Marcinczyk M., Grabowska Z., Jablonski J. iNOS expression and NO production by neutrophils in cancer patients // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 2005. - Vol. 53. - P. 175-179.

96. Jadhav S., Eggleton C.D., Konstantopoulos K. Mathematical modeling of cell adhesion in shear flow: application to targeted drug delivery ininflammation and cancer metastasis // Curr Pharm Des. 2007. - Vol. 13.-P. 1511-26.

97. Jakobisiak M., Lasek W., Golab J. Nature mechanisms protecting against cancer // Immunology letters. 2003. - Vol. 90. - P. 103-122.

98. Jiang Y., Pjesivag-Grbovic J., Cantrell Ch., Fleyer P.J. A multiscale model for avascular tumor growth // J. Biophysical. 2005. - Vol. 89. -P. 3884-3894.

99. Kage K., Fujita N., Ohhara Т., Ogata, E., Fujita T. and Tsuruo T. Basic fibroblast growth factor induces cyclooxygenase-2 expression in endothelial cells derived from bone // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999.-Vol. 254.-P. 259-263.

100. Katano M. and Tosiru M. Neutrophil-mediated tumor cell, destruction in cancer ascites // Cancer. 1982. - Vol. 50. - P. 62-68.

101. Kato T. and Kitagawa S. Regulation of neutrophil functions by proinflammatory cytokines // Int J Hematol. 2006. - Vol. 84. - P. 205209.

102. Kilpatrick L.E., Shuang Sun, DeMauri Mackie, Fred Baik, Haiying Li, and Helen M. Korchak Regulation of TNF mediated antiapoptotic signaling in human

103. Kim В., Han M., Chung A.S. Effects of reactive oxygen species on proliferation of Chinese hamster lung fibroblast (V 79) cells // Free Radic. Biol. Med. 2001. - Vol. 30. - P. 686—698.

104. Klyubin I.V., Kirpichnikova K.M., Gamaley I.A. Hydrogen peroxide-induced chemotaxis of mouse peritoneal neutrophils // Eur. J. Cell. Biol. -1996.-Vol. 70.-P. 347-351.

105. Kulbe H., Levinson N.R., Balkwill F., Wilson J.L. The chemokine network in cancer much more than directing cell movement // Int.J. Dev. Biol. - 2004. - Vol. 48. - P. 489-496.

106. Kyriakis J.M., Avruch J. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal Transduction pathways activated by stress and inflammation // Physiol. Rev. 2001. № 81. - P. 870-879.

107. Lamagna Ch., Aurrand-Lions M., Imhof B.A. Dual role of macrophages in tumor growth and angiogenesis // J. Leukocyte Biology. 2006. - Vol. 80.-P. 1-9.

108. Lambeth J.D., Cheng G., Arnold R.S., Edens W.A. Novel homologs of gp91phox // Trends Biochem Sci. 2000. - Vol. 25. - P. 459-61.

109. Lavigne M.C., Murphy P.C., Leto T.L., Gao J.-L. The N-formylpeptide receptor (FPR) and a second Gj-coupled receptor mediate fMet-Leu-Phe-stimulated activation of NADPH oxidase in murine neutrophils // Cell. Immunol. 2002. - Vol. 218. - P. 7-12.

110. Lechtermann A., Pospiech S., Fromme A., Thorwesten L., Volker К Decoupling of intracellular calcium signaling in granulocytes after exhaustive exercise // Int. J. Sports Med. 2001. - Vol. 34. - P. 323-28.

111. Levitzki A. and Gazit A. Tyrosine kinase inhibition: an approach to drug development // Science. 1995. - Vol. 267. - P. 1782-1788.

112. Lichtenstein A. and Kahle J. The role of polymorphonuclear leukocytes (PMN) on the growth and metastatic potential of 13762nf mammary adenocarcinoma cells // Inl. J. Cancer. 1985. - Vol. 35. - P. 121-127.

113. Liu Y. Tumor Antigen-Specific Cytotoxic T Lymphocytes and Cancer Immuno-therapy Review // Cancer. - 2004. - Vol. 12. - P. 244-8.

114. Lo Y.Y., Cruz T.F. Involvement of reactive oxygen species in cytokine and growth factor induction of C-fos expression of chondrocytes // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 2. - P. 270.

115. Luczynsk W., Stasiak-Barmuta A., Muszynska-Roslan K. and Kasprzycka E. T-lymphocyte and monocyte activation in the course of infection in children with neoplastic disease // Med. Wieku. Rozwoj. -2002.-Vol. 6.-P. 31-41.

116. Maki A., Berezesky I.K., Fargnoli J. Role of Ca . in induction of c-fos, c-jin, and c-misc m RNA in the rat PTF after oxidative stress // FASEB J. 1992. - Vol. 6. - P. 919—924.

117. Martindale J.L., Holbrook N.J. Cellular response to oxidative stress: signalling for suicide and survival // J. Cel. Physiol. 2002. - Vol. 192. -P. 1-15.

118. Masuda K., Kobayashi Y., Kinoshita Y. Heterogeneity of Fc receptor expressoin in chemotaxis and adherence of neonatal neutrophils // Pediatric Research. 1989. - Vol. 25. - P. 6-10.

119. Mazengera R.L., Kerr M.A. The specificity of the IgA receptor purified from human neutrophils // Biochem. J. 1990. - Vol. 272. - P. 159-165.

120. McCourt M., Wang J. H., Sookhai S., Redmond H.P. Proinflammatory mediators stimulate neutrophil-directed angiogenesis // Arch Surg. -1999.-Vol. 134.-P. 1325-31.

121. Miyake Y., Ajitsu S., Yamashita T. and Sendo F. Enhancement by recombinant interferon-g of spontaneous tumor cytostasis by human neutrophils.// Mol. Biotherapy. 1998. - Vol. 1. - P. 37-42.

122. Mocellin S. Cancer vaccines: the challenge of developing an ideal tumor killing system // Front Biosci. 2005. - Vol. 10. - P. 2285-2305.

123. Motta M., Ferlito L., Malaguarnera L., Vinci E., Bosco S., Maugeri D., Malaguarnera M. Alterations of the lymphocytic set-up in elderly patients with cancer // Arch. Gerontol. Geriatr. 2003. - Vol. 36. - P. 714.

124. Mueller M.M., Fusenig N.F. Friends or foes bipolar effects of the tumor stroma in cancer // Nature Rev. Cancer. - 2004. - Vol. 4. - P. 839-849.

125. Murphy P.M., Tiffany H.L., McDermott D., Ahuja S.K. Sequence and organization of the human N-formyl peptide receptor-encoding gene // Gene. 1993. - Vol. 15. - P. 285-290.

126. Mushiake H., Tsunoda Т., Nukatsuka M., Shimao K., Fukushima M., Tahara H. Dendritic cells might be one of key factors for eliciting antitumor effect by chemoimmunotherapy in vivo // Cancer Immunol. Immunother. 2005. - Vol. 54. - P. 120-128.

127. Nanda A., Romanek R., Curnutte J.T., Grinstein S. Assessment of the contribution of the cytochrome b moiety of the NADPH oxidase to thetransmembrane H+ conductance of leukocytes // J Biol Chem. 1994. -Vol. 269. - P. 27280-5.

128. Nathan C. Specificity of a third kind: reactive oxygen and nitrogen intermediates in cell signaling // J. Clin. Invest. 2003. - Vol. 111. - P. 769-778.

129. Nauseef W.M. Assembly of the neutrophil respuratory burst oxidase // J.Biol. Chem. -1991.-Vol. 266.-P. 5911-5917.

130. Nelson D., Ganss R. Tumor growth and regression: powered by inflammation // J. Leukoc. Biol. 2006. - Vol. 80. - P. 685-690.160. neutrophils: role of-PKC and ERK1/2 Journal of Leukocyte Biology Volume 80, December 2006 1

131. Nisimoto Y., Motalebi S., Han C.H., Lambeth J.D. The p67(phox) activation domain regulates electron flow from NADPH to flavin in flavocytochrome b(558) // J Biol Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 229993005.

132. Nozawa H., Chiu Ch., Hanahan D. Infiltrating neutrophils mediate the initial angiogenic switch in a mouse model of multistage carcinogenesis // PNAS. 2006. - Vol. 103. - P. 12493-12498.

133. Nunoi H., Rotrosen D., Gallin J.I., Malech H.L. Two forms of autosomal chronic granulomatous disease lack distinct neutrophil cytosol factors // Science. 1988. - Vol. 242. - P. 1298-301.

134. O'Beirne J.P., Harrison P.M. The role of the immune system in the control of hepatocellular carcinoma // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. -2004.-Vol. 16. P. 1257-1260.

135. Ohira Т., Zhan Q., Ge Q., VanDyke Т., Badwey J.A. Protein phosphorylation in neutrophils monitored with phosphospecific antibodies // J. Immunol. Methods. 2003. - Vol. 281. - P. 79-94.

136. Ottonelo L., Morone P., Amelotti M., Dapino P., Dallegri F. FMLP- and TNF-stimulated monoclonal Lym-1 antibody-dependent lysis of В lymphoblastoid tumour targets by neutrophils // J. Cancer. 1999. - Vol. 80.-P. 331-337.

137. Paclet M.-H., Davis C., Kotsonis P. N-Formyl peptide receptor subtypes in human neutrophils activate L-plastin phosphorylation through different signal transduction intermediates // Biochem. J. 2004. - Vol. 377. - P. 469-477.

138. Patz M., Veldurthy A., Hallek M., Krause G. Role of CD5 in signal transduction of leukemic B-cells // Molecular mechanisms in signal transduction and cancer. FEBS-EMBO advanced lecture course. 2007.

139. Pember S.O., Barnes K.C., Brandt S.J., Kinkade J.M. Density and heterogenity of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes: gradient action and relationship to chemotactic stimulation // Blood. 1983. -Vol. 61.-P. 1105-1110.

140. Pericle F., Kirken R.A., Epling-Burnette P.K., Blanchard D.K., Djeu J.Y. Direct killing of interleukin-2-transfected tumor cells by human neutrophils // Int. J.Cancer. 1996. - Vol. 66. - P. 367-373.

141. Ponting C.P. Novel domains in NADPH oxidase subunits, sorting nexins, and Ptdlns 3-kinases: binding partners of SH3 domains? // Protein Sci. -1996.-Vol. 5.-P. 2353-7.

142. Queen M.M., Ryan R.E., Holzer R.G., Keller-Peck C.R. Breast cancer cells stimulate neutrophils to produce oncostatin M: potential implications for tumor progression // Cancer. Res. 2005. - Vol. 65. -P. 8896-904.

143. Quinn M.T., Ammons M.C.B., Deleo F.R. The expanding role of NADPH oxidases in health and disease: no longer just agents of death and destruction // Clinical Science. 2006. - Vol. 111. - P. 1-20.

144. Reeves J.P., Bailey C.A., Hale C.C. Redox modification of sodium-calcium exchange activity in cardiac sarcolemmal vesicles // J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261. - P. 4948-4955.

145. Reiland J., Furcht L.T., McCarthy J.B. CXC-chemokines stimulate invasion and chemotaxis in prostate carcinoma cells through the CXCR2 receptor // Prostate. 1999. - Vol. 41. - P. 78-88.

146. Rhee S.G. Redox signalling: hydrogen peroxide as intracellular messenger // Exp. Mol. Med. 1999. - Vol. 31. - P. 53-59.

147. Rincon V., Flavell R.A., Davis R.A. The JNK and P 38 MAP kinase signaling pathways in cell-mediated immune responses // Free Radic. Biol. Med. 2000. - Vol. 28. - P. 1328—1337.

148. Rodeberg D.A., Nuss R.A., Elsawa S.F., Celis E. Recognition of six-transmembrane epithelial antigen of the prostate-expressing tumor cells by peptide antigen-induced cytotoxic T lymphocytes // Clin. Cancer Res. 2005. - Vol. 11. - P. 4545-4552.

149. Roitt I., Brostoff J. and Male D. Immunology. Mosby. London, 2001. -243 S.

150. Rommel C., Camps M., Ji H. PI3K5 and PI3Ky: partners in crime in inflammation in rheumatoid arthritis and beyond? // Nature Reviews Immunology. 2007. - Vol. 7. - P. 191-201.

151. Rosen D., Li J.-H., Keidar S., Markon I., Orda R., Berke G. Tumor immunity in perforin-deficient mice: a role for CD95 (Fas/APO-1) // J. Immunol. 2000. - Vol. 164. - P. 3229-3235.

152. Roveri A., Coassin M., Maiorino M. Effect of hydrogen peroxide on calcium homeostasis in smooth muscle cells // Arch. Biochem. Biophys. 1992. - Vol. 297. - P. 265—270.

153. Ruegg C. Leukocytes, inflammation, and angiogenesis in cancer: fatal attraction // J. Leukoc. 2006. - Vol. 80. - P. 682-684.

154. Sandhu J.K., Privora H.F., Wenckebach G., Birn,oim H.Ch. Neutrophils, nitric oxide synthase, and mutations in the mutatect murine tumor model //Am. J. Patbol. 2000. - Vol. 156. - P. 509-518.

155. Sauer H., Wartenberg M., Hescheler J. Reactive oxygen species as intracellular messengers during cell growth and differentiation // Cell. Physiol. Biochem.-2001.-Vol. 11.-P. 173-186.

156. Schmielau J., Finn J. O. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of T-cell function in advanced // Cancer research. 2002. - Vol. 61. - P. 4756-4760.

157. Sebolt-Leopold J.S., Herrera R. Targeting the mitogen-activated protein kinase cascade thtreat cancer // Nature Rev. Cancer. 2004. - Vol. 4. -P. 937-947.

158. Seely A J., Pascual J.L., Christou N.V. Cell membrane expression (connectivity) regulates neutrophil delivery, function and clearance // Critical Care. 2003. - Vol. 7. - P. 291-307.

159. Segal A. How neutrophils kill microbes // Annu. Rev. Immunol. 2005. -Vol. 23.-P. 197-223.

160. Sfondrini L., Balsari A., Menard S. Innate immunity in breast carcinoma // Endocr. Relat. Cancer. 2003. - Vol. 10. - P. 301-8.

161. Shankar A. Association between circulating white blood cell count and cancer mortality // Arch Intern Med. 2006. - Vol. 166. - P. 188-194.

162. Shiku H. Importance of CD4+ helper T-cells in antitumor immunity // Int. J. Hematol. 2003. - Vol. 77. - P. 435-438.

163. Snyderman R., Pike M.C. Chemmoattrectant receptors on phagocytic cells // Ann.Rev.Immunol. 1984. - Vol. 2. - P. 257-281.

164. Sorescu D., Somers M.J., Lassegne B. Electron spin reconance characterization of the NAD (P) H oxidase in vascular smooth muscle cells // Free Radic. Biol. Med. 2001. - Vol. 30. - P. 1603—1612.

165. Sun Z, Yang P. Role of imbalance between neutrophil elastase and alpha 1-antitrypsin in cancer development and progression // Lancet Oncol. -2004.-Vol. 5.-P. 182-190.

166. Sunderson M., Yu Z.X., Ferrans V.J. Requirement for generation of H О for platelet-derived growth factor signal transduction // Science. 1995. -Vol. 270.-P. 296—299.

167. Suzuki Y.I., Forman H.J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction 11 Free Radic. Biol. Med. 1997. - Vol. 22. - P. 269.

168. Swann J.B., Smyth M.J. Immune surveillance of tumor // The Journal of Clinical Investigation. 2007. - Vol. 117. - P. 1137-1146.

169. Takeya R., Sumimoto H. Molecular mechanism for activation of superoxide-producing NADPH oxidases // Mol. Cells. 2003. - Vol. 16. -P. 271-277.

170. Thannical V.J., Fanburg B.L. Activation of an H О -generating NADH oxidase in human fibroblast by transforting growth factor —beta 1 // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 30334—30338.

171. Thelen M., Dewald В., Baggiolini M. Neutrophil signal transduction and activation of the respiratory burst // Physiol. Rev. 1993. - Vol. 73. -P.797-821.

172. Ueta E., Osaki Т., Yoneda K., Yamamoto Т., and Umazume M. Influence of inductive chemoradiotherapy on salivary polymorphonuclear leukocyte (SPMN) functions in oral cancer // J. Oral. Pathol. Med. 1994. - Vol. 23. - P. 418-422.

173. Van Eedan S.F., Klut M.E., Walker B.A.M., Hogg J.C. The use of flow cytometry to measure neutrophil function // J. Immunol. Methods. -1999.-Vol. 232.-P. 23-43.

174. Van Egmond, van Spriel A., Vermeulen H., Huls G. and Van Garderen E. Enhancement of polymorphonuclear cell-mediated tumor cell killingon simultaneous engagement of fcgammaRI (CD64) and fcalphaRI (CD89) // Cancer Res. 2001. - Vol. 61. - P. 4055-4060.

175. Vignasis P.V. The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism // Cell. Mol. Life Sci. 2002. - Vol. 59.-P. 1428-1459.

176. Wakimoto H., Johnson P., Knipe D. and Chiocca E. Effects of innate immunity on herpes simplex virus and its ability to kill tumor cells // Gene Ther. 2003. - Vol. 10. - P. 983-990.

177. Walsh S.R., Cook E.J., Goulder F., Justin T.A., Keeling N.J. Neutrophil-lymphocyte ratio as a prognostic factor in colorectal cancer // J. Surg. Oncol.-2005.-Vol. 91.-P. 181-184.

178. Wang Y.L., Kaplan S., Whiteside Т., Herberman R.B. In vitro effects of an acyltripeptide, FK565, on antitumor effector activities and on metabolic activities of human monocytes and granulocytes // Immunopharmacol. 1989. - Vol. 18. - P. 213-222.

179. Werner E. GTPases and reactive oxygen species: switches for killing and signaling // J. Cell Science. 2004. - Vol. 117. - P. 143-153.

180. Wientjes. NADPH oxidase and the respiratory burst // Semin. Cell Biol. -1995.-Vol.6.-P. 357-65.

181. Wilkinson B. L., Landreth G.E. The microglial NADPH oxidase complex as a source of oxidative stress in Alzheimer's disease // Journal of Neuroinflammation. 2006. - Vol. 3. - P. 30-42.

182. Witko-Sarsat V., Rieu P., Descamps-Latscha В., Lesavre P., Halbwachs-Mecarelli L. Neutrophils: molecules, functions and pathophysiological aspects // Lab. Invest. 2000. - Vol. 80. - P. 617-653.

183. Wu Q.D., Wang J.H., Condron C., Bouchier-Hayes D., Redmond H.P. Human neutrophils facilitate tumor cell transendothelial migration // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. -2001. Vol. 280. -P. 814-822.

184. Wymann M.P. and Marone R. Phosphoinositide 3-kinase in disease: Timing, location, and scaffolding // Curr. Opin. Cell Biol. 2005. - Vol. 17.-P. 141-149.

185. Yamashita S., Suzuki A., Yanagita Т., Hirohata S., Kamada M., Toyoshima S. Analysis of neutrophil proteins of patients with Behcet's disease by two-dimensional gel electrophoresis // Biol. Pharm. Bull. -2000.-Vol. 23.-P. 519-22.

186. Zhang H., Garlichs C.D., Mugge A., Daniel W.G. Involvement of tyrosine kinases, Ca2+ and PKC in activation of mitogen-activatedprotein (MAP) kinase in human polymorphonuclear neutrophils // J. Physiol. 1998. - Vol. 513. - P. 359-367.

187. Zhao Т., Benard V., Bohl B.P, Bokoch G.M. The molecular basis for adhesion-mediated suppression of reactive oxygen species generation by human neutrophils // J. Clin. Invest. 2003. - Vol. 112. - P. 1732-1740.

188. Zitvogel L., Tesniere A., Kroemer G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosuversion // Nature reviews immunology. 2006. - P. 1-13.

189. Zivkovic M., Poljak-Blazi M., Egger G., Sunjic S.B., Schaur R.J., Zarkovic N. Oxidative burst and anticancer activities of rat neutrophils // Biofactors. 2005. - Vol. 24. - P. 305-312.

190. Zou W. Immunosupressive networks in the tumor environment and their therapeutic relevance // Nature Rev. Cancer. 2005. - Vol. 5. - P. 263274.1. БЛАГОДАРНОСТИ

191. Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Валентине Григорьевне Сафроновой за чуткое руководство и внимание к моей работе, а так же за ценные советы и рекомендации, сделанные в процессе подготовки диссертации.

Информация о работе

Мальцева, Валентина Николаевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы