Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репликационный белок RC плазмиды pNB2 термофильных бактерий Clostridium thermosaccharolyticum

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Давыдова, Екатерина Евгеньевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Механизм репликации rolling circle.

1.2 Использование системы "стабильный токсин-лабильный антитоксин" для поддержания плазмид в клетках бактерий.

1.3 Экспрессия рекомбинантных генов в Е. coli. Особенности работы с токсичными генами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.:.

III. 1 Анализ нуклеотидной последовательности pNB2.

111.2 Измерение промоторной активности фрагментов плазмиды pNB2.

111.3 Анализ аминокислотной последовательности белка, соответствующего ОРС289.'.

111.4 Регистрация однонитевой формы плазмиды pNB2 в клетках

Clostridium thermosaccharolyticum.

111.5 Экспрессия repN гена.

III.5.1 Модификация не эффективных "не-ATG" инициирующих кодонов repN гена.

III.5.2. Экспрессия repN tqwl в бесклеточной системе трансляции транскрипции S30.

111.5.3 Создание рекомбинантной плазмиды для соэкспрессии редкой в Е. coli тРНК.

111.5.4 Трансформация клеток E.coli рекомбинантными плазмидами, содержащими repN ген.

111.5.5 Экспрессия repN гена in vivo в E.coli.

III.6. Очистка RepN белка из лизатов E.coli.

III.6.1 Модификация 5' конца repN гена последовательностью, соответствующей шести гистидинам.

111.6.2 Экспрессия гертУгена, модифицированного последовательностью соответствующей шести гистидинам.

111.6.3 Очистка His-repN белка из нерастворимой фракции.

111.6.4 Подбор условий для увеличения растворимости белка in vivo.

III.7. Изучение причин летального действия RepN белка на клетки Е. coli.

111.7.1 Сайт-направленный мутагенез аминокислот, характерных для активного центра релаксаз.

111.7.2 Делеционное картирование области RepN белка, ответственной за его летальное действие.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Репликационный белок RC плазмиды pNB2 термофильных бактерий Clostridium thermosaccharolyticum"

Бактерии Clostridium thermosaccharolyticum являются термофильными анаэробными микроорганизмами. Многие виды рода Clostridium представляют большой интерес для использования в биотехнологических целях. Среди продуктов их метаболизма имеются перспективные энергоносители (этанол, бутанол, водород), органические кислоты (уксусная, пропионовая, масляная), технологически важные ферменты (целлюлазы, гемицеллюлазы, и т.д.). Но относительно низкие скорости роста клостридий, необходимость строгого соблюдения анаэробных условий, невысокие выходы целевых продуктов сдерживают практическое применение этих бактерий. С другой стороны, некоторые представители рода Clostridium имеют большое медицинское значение, так как являются продуцентами сильнодействующих токсинов (столбнячный и ботулинический токсины).

В последние годы достигнуты впечатляющие успехи по клонированию бактериальных генов во всесторонне изученных бактериях Escherichia coli и Bacillus subtilis и адаптированных для них векторах. Несмотря на это остается весьма актуальной проблема поиска и изучения новых плазмид, которые могут быть использованы в качестве генно-инженерных векторов в специализированных группах бактерий. В связи с этим большой интерес представляет также изучение белков, участвующих в репликации исследуемых плазмид. Особенно существенным является подбор новых систем для клонирования генов из термофильных бактерий, так как многие исследователи сталкиваются с трудностями правильного фолдинга рекомбинантных белков термофильных организмов в широко используемых бактериях E.coli и В.subtilis.

Удивительной особенностью термофильных клостридий является низкое содержание «тугоплавких» GC-nap (около 38%), что не коррелирует с высокой толерантностью этих бактерий к температуре (оптимум роста 60-65°С) и отличает их от других термофильных организмов [1]. Классическая закономерность предполагает увеличение GC-состава ДНК с повышением температурного оптимума жизнедеятельности бактерий. Так некоторые представители термофильных бактерий рода Thermus имеют GC-состав свыше 70 % [2], в то время как в клетках типично мезофильных E.coli он составляет 51% [3]. В связи с этим представляет интерес изучение особенностей репликации ДНК в термофильных клостридиях.

В работе Белогуровой Н.Г. с соавторами [4] в клетках С. thermosaccarolyticum DSM571 были идентифицированы две небольшие плазмиды pNBl и pNB2 с неизвестными функциями. Анализ полной нуклеотидной последовательности pNB2 показал, что эта плазмида состоит из 1882 пар нуклеотидов и является делетированной формой плазмиды pNBl, причем содержание в ней GC пар составляет всего 27,2%. Столь низкое содержание «тугоплавких» GC пар дает возможность использовать эту плазмиду как удобную модель для изучения механизмов репликации и стабилизации АТ-богатой ДНК в бактериальной клетке.

Настоящая работа была предпринята с целью всестороннего изучения ключевого белка, инициирующего репликацию новой плазмиды pNB2 из бактерий Clostridium thermosaccharolyticum.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Давыдова, Екатерина Евгеньевна

выводы

1. Проведенный сравнительный анализ аминокислотной последовательности RepN белка выявил пять консервативных доменов, характерных для Rep белков плазмид семейства pC194/pUBl 10.

2. Зарегистрирована однонитевая форма плазмиды pNB2 в клетках Clostridium thermosaccharolyticum, что свидетельствует о ее репликации по механизму катящейся катушки.

3. Идентифицирован продукт repN гена в бесклеточной системе транскрипции-трансляции S30 E.coli in vitro.

4. Зарегистрирована экспрессия RepN белка в клетках E.coli in vivo с использованием эффективной системы РНК-полимеразы фага Т7.

5. Мутационный анализ потенциальных активных центров белка RepN (Y85F и Y211F) показал, что летальное действие не связано с его базовой топоизомеразной (релаксазной) активностью. Делеционное картирование области RepN белка, ответственной за его летальное действие, показало, что эту функцию могут независимо друг от друга осуществлять его N- и С - концевые части, каждая из которых содержит примерно 30% от общей длины молекулы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Давыдова, Екатерина Евгеньевна, Москва

1. Александрушкина Н.И., Егорова Jl.A. Нуклеотидный состав ДНК из термофильных бактерий рода Termus. Микробиология, 47, 250-252.

2. Belogurova N.G., Mosolova T.P., Kalyuzhnyi S.V., Varfolomeyev S.D. (1991) Kinetics of growth and metabolism of Clostridium thermosaccharolyticum culture: isolation and characteristics of its plasmids. Appl. Biochem. Biotechnol, 27, 1-8.

3. Baas P.D., Jansz H.S. (1988) Single-stranded DNA phage origins. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 136, 31-70.

4. Khan S.A., Novick R.P. (1983) Complete nucleotide sequence of pT181, a tetracycline-resistance plasmid from Stafliylococcus aureus. Plasmid, 10, 251-259.

5. Devine K., Hogan S., and McConnel D. (1989) Replication and segregational stability of Bacillus plasmid pBAAl. J. Bacteriol, 171, 1166-1172.

6. Galli D.M., Leblanc D.J. (1994) Characterization of pVT36-l, a rolling-circle plasmid from the gram-negative bacterium Actinobacillus actinomycetemcomitans. Plasmid, 31, 148-157.

7. King K.W., Dybvig K. (1992) Nucleotide sequence of Mycoplasma mycoides subspecies mycoides plasmid pKMK. Plasmid, 28, 86-91.

8. Somkuti G.A., Solaiman D.K., Steinberg D.H. (1998) Structural and functional properties of the hspl6.4-bearing plasmid pER341 in Streptococcus thermophilus. Plasmid, 40, 61-72.

9. Solaiman D.K., Somkuti G.A. (1998) Characterization of a novel Streptococcus thermophilus rolling-circle plasmid used for vector construction. Appl Microbiol Biotechnol, 50,174-180.

10. Yu J.S., Noll K.M. (1997) Plasmid pRQ7 from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga species strain RQ7 replicates by the rolling-circle mechanism. J. Bacteriol, 179, N22, 7161-7164.

11. Marsin S. and Forterre P. (1998) A rolling circle replication initiator protein with a nucleotidyl- transferase activity encoded by the plasmid pGT5 from thehyperthermophilic archaeron Pyrococcus abyssi. Mol. Microbiol, 27, N.6, 1183-1192.

12. Gruss A. and Ehrlich S.D. (1989) The Family of Highly Interrelated Single-Stranded Deoxyribonucleic Acid Plasmids. Microbiol. Rev., 53, N.2, 231-241.

13. Khan S.A. (1997) Rolling-circle replication of bacterial plasmid. Microbiol Mol. Biol. Rev, 61, N.4,442-455.

14. Tutino M.L., Duilio A., Moretti M.A., Sannia G., Marino G. (2000) A rolling-circle plasmid from Psychrobacter sp. TA144: evidence for a novel rep subfamily. Biochem Biophys Res Commun., 274, 488-495.

15. Jin R., Fernandez, Beros M.E., Novick R.P. (1997) Why is the initiation nick site of an AT-rich rolling circle plasmid at the tip of a GC-rich cruciform? EMBO J., 16, 4456-66

16. Yasukawa H., Hase T., Sakai A., Masamune Y. (1991) Rolling-circle replication of the plasmid pKYM isolated from a gram-negative bacterium. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88,10282-10286.

17. Losa M., Grandos G., Hernando M. A. and de la Cruz F. (1996) Functional domains in protein TrwC of plasmid R388: dissected DNA strand transferase and DNA helicase activities reconstitute protein function. J. Mol. Biol, 264, 56-67.

18. Noirot-Gros M.F., Bidnenko V. and Ehrlich S.D. (1994) Active site of the replication protein of the rolling circle plasmid pC194. EMBO, 13, 4412-4420.

19. Chang T.L., Kramer M.G., Ansari R.A., Khan S.A. (2000) Role of individual monomers of a dimeric initiator protein in the initiation and termination of plasmid rolling circle replication. J Biol Chem., 275, 13529-13534.

20. Rasool A., Projan S.J., Novick R.P. (1994) Plasmids of the pT181 Family Show Replication-Specific Initiator Protein Modification. J. Bacteriol., 176. N.8, 24502453.

21. Rasooly A., Wang Pei-Zhi and Novick R.P. (1994) Replication-specific conversion of the Staphylococcus aureus pT181 initiator protein from an active homodimer to an inactive heterodimer. EMBO, 13, N.21, 5245-5251.

22. Zhao A.C., Khan A.S. (1996) An 18-Base-Pair Sequence Is Sufficient for Termination of Rolling-Circle Replication of Plasmid pT 181. J. Bacteriol., 178, p.5222-5228.

23. Zhao A.C., Ansari R.A., Schmidt M.C., Khan S.A. (1998) An oligonucleotide inhibits oligomerization of a rolling circle initiator protein at the pTl 81 origin of replication. J Biol Chem., 273, 16082-16089

24. Moscoso M., Eritja R., Espinosa M. (1997) Initiation of replication of plasmid pMV158: mechanisms of DNA strand-transfer reactions mediated by the initiator RepB protein J. Mol. Biol.268, 840-856.

25. Koepsel R.R., Murray R.W., Rosenblum W.D., Khan S.A. (1985) The replication initiator protein of plasmid pT181 has sequence-specific endonuclease and topoisomerase-like activities. Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 6845-6849.

26. Moscoso M., del Solar G., Espinosa M. (1995) In vitro recognition of the replication origin of pLS 1 and of plasmid of the pLS 1 family by the RepB initiator protein. J. Biol. Chem., 270, 3772-3779.

27. Marsin S., Marguet E., Forterre P. (2000) Topoisomerase activity of the hyperthermophilic replication initiator protein Rep75. Nucleic Acids Res., 28, 22512255.

28. Ilyna T.V., Koonin E.V. (1992) Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria,eucaryotes and archaebacteria, Nucl. Acids Res. 20, 3279-3285.

29. Suzuki I., Kataoka M., Seki T., Yoshida Y. (1997) Three single-strand origins located on both strands of the Streptomyces rolling circle plasmid pSN22. Plasmid, 37, 51-64.

30. Novick R.P., Iordanescu S., Projan S.J., Kornblum J., Edelman I. (1989) pT181 plasmid replication is regulated by a countertranscript-driven transcriptional attenuator. Cell, 59, 395-404.

31. Nakahama K., Yasukawa H., Kimura T., Mizuno K., Hiraiwa T., Ozaki E., Masamune Y. (1997) Synthesis of RepK of rolling circle plasmid pKYM is regulated by countertranscript and HU protein. DNA Res., 4, 199-204.

32. Ogura T., Hiraga S. (1983) Mini-F plasmid genes that couple host cell division to plasmid proliferation. Proc Natl Acad Sci USA, 80, 4784-8

33. Bernard P., Couturier M. (1992) Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. J. Mol. Biol, 226, 735-745

34. Bernard P., Kezdy K.E., Van Melderen L., Steyaert J., Wyns L., Pato M.L., Higgins P.N., Couturier M. (1993) The F plasmid CcdB protein induces efficient ATP-dependent DNA cleavage by gyrase. J Mol Biol, 234, 534-541

35. Salmon M.A., Van Melderen L., Bernard P., Couturier M. (1994) The antidote and autoregulatory functions of the F plasmid CcdAprotein: a genetic and biochemical survey. Mol Gen Genet., 244, 530-538.

36. Jensen R.B., Gerdes K. (1995) Programmed cell death in bacteria: proteic plasmid stabilization systems. Mol. Microbiol., 17, 205-210.

37. Bravo A., de Torrontegui G., Diaz R. (1987) Identification of components of a new stability system of plasmid Rl, ParD, that is close to the origin of replication of this plasmid. Mol Gen Genet., 210, 101-110

38. Tsuchimoto S., Ohtsubo H., Ohtsubo E. (1988) Two genes, pemK and peml, responsible for stable maintenance of resistance plasmid R100. J Bacteriol., 170, 1461-1466.

39. Jensen R.B., Grohmann E., Schwab H., Diaz Orejas R., Gerdes K., (1995) Comparison of ccd of F, parDE of RP4, and parD of R1 using a novel conditional replication control system of plasmid Rl. Mol. Microbiol., 17, 211-220.

40. Lehnherr H., Maguin E., Jafri S., Yarmolinsky M.B. (1993) Plasmid addiction genes of bacteriophage PI: doc, which causes cell death on curing of prophage, and phd, which prevents host death when prophage is retained. J Mol. Biol., 233, 414-28

41. Masuda Y., Miyakawa K., Nishimura Y., Ohtsubo E. (1993) chpA and chpB, Escherichia coli chromosomal homologs of the pem locus responsible for stable maintenance of plasmid R100. JBacteriol., 175, 6850-6856.

42. Gronlund H., Gerdes K. (1999) Toxin-antitoxin system homologous with relBE of Escherichia coli plasmid P307 are ubiquitous in prokaryotes. J Mol.Biol., 285, 14011415.

43. Makrides S.C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev., 60, 512-538.

44. Olins P.O., and Rangwala S.H. (1990) Vector for enchanced translation of foreign genes in Escherichia coli. Methods Enzymol., 185, 115-119.

45. Skerra A. (1994) Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli. Gene, 151, 131-135.

46. Tolentino G. J., Meng S.-Y., Bennett G.N., San K.-Y. (1992) A pH-regulated promoter for the expression of recombinant protein in Escherichia coli. Biotechnol. Lett., 14, 157-162.

47. Yamada M., Kubo M., Miyake Т., Sakaguchi R., Hido Y., and Imanaka T. (1991) Promoter sequence analysis in Bacillus and Escherichia: construction of strong promoter in E.coli. Gene, 99, 109-114.

48. Mukhija R., Rupa P., Pillai D. Garg L.C. (1995) High-level production and one-step purification of biologically active human growth hormone in Escherichia coli. Gene, 165,303-306.

49. Bukrinsky M.I., Barsov E.V., Shilov A.A. (1988) Multicopy expression vector based on temperature-regulated lac repressor: expression of human immunodeficiency virus env gene in Escherichia coli.Gene, 70, 415-417.

50. Yabuta M., Onai-Miura S., Ohsuye K. (1995) Thermo-inducible expression of a recombinant fusion protein by Escherichia coli lac repressor mutants. J. Biotechnol, 39, 67-73.

51. Goldstein J., Pollitt N.S., and Inouye M. (1990) Major cold shock protein of Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sei. USA, .87, 283-287.

52. Easton A.M. Gierse J.K., Seetharam R., Klein B.K., and Kotts C.E. (1991) Production of bovine insulin-like growth factor 2 (bIGF2) in Escherichia coli. Gene, 101,291-295.

53. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorff J.W. (1991) Use of T7 RNA polimerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol., 185, 60-89.71 . pET System manual of "Novagen", США, 1997.

54. Inouye M., Arnheim N., Sternglanz R. (1973) Bacteriophage T7 lysozyme is an N-acetylmuramyl-L-alanine amidase. J Biol Chem., 248, 7247-7252

55. Studier F.W. (1991) Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J. Mol. Biol., 219, 37-44.

56. Studier F.W., Moffatt B.A. (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., 189, 113-130.

57. Gualerzi C.O., and Pon C.L. (1990) Initiation of mRNA translation in prokaryotes. Biochemistry, 29, 5881-5889.

58. Vellanoweth R.L., Rabinowitz J.C. (1992) The influence of ribosome-binding-site elements on translational efficiency in B. subtilis and E. coli in vivo. Mol. Microbiol. 6,1105-1114.

59. Olsen M.K., Rockenbach S.K., Curry K.A., Tomich C.-S.C. (1989) Enhancement of heterologus polypeptide expression by alterations in the ribosome-binding-site sequence. J. Biotechnol., 9,179-190.

60. Olins P.O., Devine C.S., Rangwala S.H., and Kavka K.S. (1988) The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhanced the expression of foreign genes in Escherichia coli. Gene, 73, 227-235.

61. Olins P.O., Rangwala S.H. (1989) A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 264, 16973-16979.

62. Sprengart M.L., Fuchs E., Porter A.G. (1996) The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in E. coli: EMBOJ., 15, 665-674.

63. Emory S.A., Bouvet P., and Belasco J.G. (1992) A 5'-terminal stem-loop structure can stabilize mRNA in Escherichia coli. Genes Dev., 6, 135-148.

64. Wong H.C., Chang S. (1986) Identification of a positive retroregulator that stabilizes mRNA in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 83, 3233-3237.

65. Karlin S., Mrasek J. and Campbell A.M. (1998) Codon usages in different gene classes of the Escherichia coli genome. J. Mol. Microbiol, 29, N.6, 1341-1355.

66. Chen G.-F. T., and Inouye M. (1990) Suppression of the negative effect of minor arginine codons on gene expression: preferential usage of minor codons within the first 25 codons of the Escherichia coli genes. Nucleic Acids. Res., 18, 1465-1473.

67. Brinkmann U., Mattes R.E., Buckel P. (1989) High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene., 85, 109-114.

68. Goldman E., Rosenberg A.H., Zubay G., and Studier F.W. (1995) Consecutive low-usage leucine codons block translation only when near the 5' end of a message in Escherichia coli. J. Mol. Biol., 245, 465-473.

69. Ivanov I., Alexandrova R., Drugulev B., Saraffova A., and AbouHaidar M.G. (1992) Effect of tandemly repeated AGG triplets on the translation of CAT-mRNA in E.coli. FEBS Lett. ,307, 173-176.

70. Hernan R.A., Hui H.L., Andracki M.E., Noble R.W., Sligar J.A., Walder J.A., Walder R.Y. (1992) Human hemoglobin expression in Escherichia coli: importance of optimal codon usage. Biochemistry, 31, 8619-8628.

71. Brinkmann U., Mattes R.E., Buckel P. (1989) High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene, 85, 109-114.

72. Kleber-Janke T., Becker W.M. (2000) Use of modified BL21(DE3) Escherichia coli cells for high-level expression of recombinant peanut allergens affected by poor codon usage. Protein Expr. Purif.,, 19, 419-424.

73. Sharp P.M., and Bulmer M. (1988) Selective differences among translation termination codons. Gene, 63, 141-14.

74. Poole E.S., Brown C.M., Tate W.P. (1995) The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo transnational termination in Escherichia coli. EMBO, 14, 151-158.

75. Gottersman S., Maurizi M.R. (1992) Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol. Rev., 56, 592-621.

76. Tobias J.W., Shrader T.E., Rocap G., Varshavsky A. (1991) The N-End Rule in Bacteria. Science. 254, 1374-1377.

77. Varshavsky A. (1992) The N-end rule. Cell, 69, 725-735.

78. Talmadge K., Gilbert W. (1982) Cellular location affects protein stability in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 1830-1833.

79. Gottesman S. (1990) Minimizing proteolysis in Escherichia coli: genetic solutions. Methods Enzymol, 185, 119-129.

80. Chesshyre J.A., Hipkiss A.R. (1989) Low temperatures stabilize interferon a-2-against proteolysis in Methylophilus methylotrophus and Escherichia coli. Appl. Microbiol Biotechnol., 31, 158-162.

81. Bowie I.U., Sauer R.T. (1989) Identification of C-terminal extensions that protect proteins from intracellular proteolysis. J. Biol. Chem., 264, 7596-7602.

82. Hellebust H., Murby M., Abrahmsen M., Uhlen M., Enfors S.O. (1989) Different approaches to stabilize a recombinant fusion protein. Bio-Technology,. 7, 165-168.

83. Wall J.G., Pluckthun A. (1995) Effects of overexpressing folding modulators on the in vivo folding of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol., 6,507-516.

84. Andersen M.D., Jensen A., Robertus J.D., Leah R., Skriver K. (1997) Heterologous expression and characterization of wild-type and mutant forms of a 26 kDa endochitinase from barley (Hordeum vulgare L.). Biochem J., 322, 815-822

85. Blackwell J.R., and Horgan R. (1991) A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form. FEBS, 295, 10-12.

86. Yasukawa T., Kanei-Ishii C., Maekawa T., Fujimoto J., Yamamoto T., Ishii S. (1995) Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J Biol Chem., 270, N43, 25328-25331.

87. Martin J.L. (1995) Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3, 245-250.

88. Krause G., Lundstrom J., Barea J.L., Pueyo de la Cuesta C., Holmgren A. (1991) Mimicking the active site of protein disulfide-isomerase by substitution of proline 34 in Escherichia coli thioredoxin. J. Biol. Chem., 266, 9494-9500.

89. Holmgren A. (1985) Thioredoxin. Annu. Rev. Biochem. 54, 237-271.

90. Prinz W.A., Aslund F., Holmgren A., and Berckwith J. (1997) The Role of the Thioredoxin and Glutaredoxin Pathways in Reducing Protein Disulfide Bonds in the Escherichia coli Cytoplasm. J. Biol. Chem. 272, N.25, 15661-15667.

91. Holmgren A. (1989) Thioredoxin and glutaredoxin systems. J. Biol. Chem., 264, 13963-13966.

92. Bardwell J.C., Lee J.O., Jander G., Martin N„ Belin D., Beckwith J. (1993) A pathway for disulfide bond formation in vivo. Proc Natl Acad Sei USA, 90, 10381042

93. Martin J.L., Bardwell J.C., Kuriyan J. (1993) Crystal structure of the DsbA protein required for disulphide bond formation in vivo. Nature, 365, 464-468.

94. Wunderlich M., Glockshuber R. (1993) Redox properties of protein disulfide isomerase (DsbA) from Escherichia coli. Protein Sei., 2, 717-726.

95. Knappik A., Krebber C., and Pluckthun A. (1993) The effect of folding catalysts on the in vivo folding process of different antibody fragments expressed in Escherichia coli. Bio/technology., 11, 77-83.

96. Ljungquist S., Lindahl Т., Howard-Flanders P. (1976) Methyl methane sulfonate-sensitive mutant of Escherichia coli deficient in an endonuclease specific for apurinic sites in deoxyribonucleic acid. J Bacteriol 126, N2, 646-653.

97. Yanisch-Perron C., Messing V.J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33, 103-119.

98. Technical manual of Promega "Altered SitesII in vitro Mutagenesis System", США, (1999).

99. Chang A.C., Cohen S.N. (1978) Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol., 134,1141-1156.

100. Laboratory manual of QIAGEN Inc., США, "The QIAexpressionist". 2nd edition, (1992).

101. Birnboim H.C., and Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523.

102. Silhavy T.J., Berman M.L., and Enquist L.W. (1984) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

103. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.

104. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. ( 1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 74, 5463-5467.

105. Краев A.C. (1988) Простая система клонирования в фаге М13 и секвенирования ДНК с терминаторами. Молекуляр. биология, 22. 1164-1196.

106. Zubay G. (1980) The isolation and properties of CAP, the catabolite gene activator. Methods Enzymol., 65, 856-877.

107. Белогурова Н.Г., Дельвер Е.П., Калюжный C.B., Варфоломеев С.Д., Родзевич О.В., Белогуров А.А. (1992) Нуклеотидная последовательность плазмиды pNB2 из термофильных бактерий Clostridium thermosaccharolyticum. Молекуляр. биология, 26,173-177.

108. Bardowski J., Ehrlich D.S., Choipin A. (1992) Tryptophan biosynthesis gene in Lactococcus lactis subsp. lactis. J. Bacteriol., 174, 6563-6570.

109. Seiki M., Ogasawara N., Yoshikawa H. (1982) Identification of a suppressor sequence for DNA replication in the replication origin region of the Bacillus subtilis chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4285-4289.

110. Shaw W.V. (1975) Chloramphenicol acetyltransferase from chloramphenicol-resistant bacteria. Methods Enzymol., 43, 737-755.

111. Muller R.E., Ano Т., Imanaka Т., Aiba S. (1986) Complete nucleotide sequences of Bacillus plasmid pUBllOdB, pRBHl and its copy mutants. Mol. Gen. Genet., 202, 169-171.

112. DeRossi E., Milano A., Brigidi D., Bini F., Riccardi G. (1992) Structural organization of pBCl, a cryptic plasmid from Bacillus coagulans. J.Bacteriol., 174, 638-642.

113. Janzen Т., Kleinschmidth J., Neve H., Geis A. (1992) Sequencing and characterization of pSTl, a criptic plasmid from Streptococcus thermophilus. FEMS Microbiol. Lett., 95, 175-180.

114. Dagert M., Jones I., Goze A., Romac S., Niaudet В., Ehrlich S.D. (1984) Replication functions of pC194 are necessary for efficient plasmid transduction by M13 phage. EMBOJ., 3,81-86.

115. Horinouchi S., Weisblum B. (1982) Nucleotide sequence and functional map of plasmid pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J.Bacteriol., 150, 815-825.

116. Southern E. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 98, 503-517.

117. Koepsel R.R., Murray R.W., Rosenblum W.D., Khan S.A. (1985) Purification of pTl 81-encoded repC protein required for the initiation of plasmid replication. J. Biol. Chem., 260, 8571-8577.

118. Muller A.K., Rojo F., Alonso J.C. (1995) The level of pUBllO replication initiator protein is autoregulated, which provides an additional control for plasmid copy number. Nucleic Acids Res., 23, N.ll, 1894-1900.

119. Рис. 24. Рестрикционные карты плазмид pBluescript II (продолжение).1. Esp3 I 4027

120. Dra I 3988 Msc I 3980 Sty I Nco I

121. Ssp I 3935. Sea I 3830 BstB I 3716 Tthlll X 3698 Drd 136951. EcoRI 1

122. BspM II 5 Dra I 83 I PuuII 103

123. Bsv36 13591 Bel I 3541 BstB I 3716 BsfY I 3440 BspM II 343 Bsg I 34231. Beg I 32961. BsaA I 310 Esp3 I 324

124. Pvu II 515 Nhel 583 Ace I 594 Xcal 594 Xmn 1635 Bsg I 665

125. HincII 321K Drd П 3175 JSco57 I 3150" BsaA 13141

126. PpuM I 2974 Msc I 2938, PpuM I 2932, Ava I 2919 Sty I 28631. Bgl I 26571. BspM I 255

127. Nru I 246„ Eag I 2433 Bgl I 24231. Beg I 2202 Hinc II 2145

128. BspH I 1983 Sph I Nsp I 20561. Sac П 8321. ТОНН II 8721. V 1679

129. Nhel 1723 BamH I BsfY I 1869 Ban II 1979,1965

130. BstB I 1318 ■Ase I 1405 Ssp I 1418 Xbal 1424 'Ear I 1446 ' Eco57 I 1463 Tthlll II 1501 Clal 1517 • Hind Ш 1523

131. Ace I 2145 IECONI2U6 Sail 2145

132. Рис. 24. Рестрикционная карта pACYC184.1. See 142991. Aatlt 47411. Siyl 1824

133. Рис. 25. Структура вектора pALTER-1.

134. EBSSmHX ? P S.P S.m Г XHSmSBE1. KIXX1. Kan'1. EBSaP1. Sm H1. PSaBE1. Е ■= EcoR 11. В = BamHI1. S = Sacl1. Sm •=Sm»l1. H «= Hind III1. X •=Xhol1. P -=Pstt1. Sp =Spft 11. Sa «Sa/11. К "Kpnl1. A = Дра1

135. Рис. 27. Рестрикдионные карты плазмид pUC4K и pUC4KIXX.

136. Т7{ TncTag WîcI Htí'Tij thnxrtxnsita S«Tag ВЫ И Kpnlenterofcinase site1. Wool1. EccRVmti\1. EecRI1. Sac I1. Sal I1. HnJII1. Wofl1. Eifl-Ixnol1. Aval1. Htj-Tag0pot1O2l1. T7lemiinalor

137. Рис.28. Рестрикционная карта плазмиды рЕТ32.