Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазмиды из Clostridium thermosaccharolyticum: молекулярно-биологически, кинетические и биотехнологические аспекты

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Плазмиды из Clostridium thermosaccharolyticum: молекулярно-биологически, кинетические и биотехнологические аспекты"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА Химический факультет

На пробах рукописи БЕЛОГУРОВА НАТАЛЬЯ ГЕОРГИЕВНА

УЖ 579.252.5

"Елазшда из С1ов*г1с11та ХЬепв>вассЬаго1^1сш: ыачекуяярвснзаолсгаческие, кинетические а биотехЕологячэсмгв аспекты". (03.00.23 - ахотэшоюгш)

АВТОгЕЕЕРА'Г диссертации на соисканиэ учэной степа та кандидата хшдагасках наук

Иосхва 1Э92

Работа выполнена на кафзцре химической энзвдологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: o.e.с., к.х.н. Калшньй С.В. Научный консультант: проф., д.х.н. Варфэлоыеев С.д. а&ациальшв оппоненты: доктор биологических наук, р.ж.с.

Захарьэв кандидат химических наук, с.н.с. Тшков В.И.

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики АН СССР

Защита состоится 1992 года на заседании

специализированного Ученого совета J6 Д.053.05.76 при Московском государствэннолм университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, ТОМ, Москва, Ленинские горы, Химический факультет МГУ, аудитория 202 корп. кафедрк хшичесхгай энзимологии. С диссертацией кожяо ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ, им. М.В.Ломоносова.

//У J ' ß/ Автореферат разослан: »_£_" j 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

O.A. кост

СЩДЯ ХАРА1СТЕРЙСГШКА РАБОШ.

Актуальность проблема. Термофильные бактерии рода стаяг-г1£11ига представляют значительный интерес для современной биотехнологии: среда продуктов их метаболизма имеются перспективные энергоносители (этанол, бутанол, водород), органические кислота (уксусная, прошоновая, масляная), технологически важные ферменты (целизлазы, гемицеллвлазы, и т.д.)- Особое значение уделяется термофильным хгрэдотанатэлям отах бактерий, так как при термофильных условиях облегчается реализация технологических процессов (менее строгие мер! по соблюдения стерильности, балээ низкая растворимость кислорода, боле» высокие скорости ферментации); кроме того, многие фермента, выделенные из термофильных штаммов, характеризуются значительной термоо-табальностью. Вместе с тем, клостридиальннэ бактерии обладают и рядом недостатков, препятствущих ах широкому использованию в технологии: относительно низкие'скорости роста, необходимость. строгого соблюдения анаэробных условий, невысокие выхода целевых продуктов. Применение методов генетической инженерии монет оказаться весьма перспективным подходом к улучшению природных штаммов терлофальных бактерий рода сгавмыит. До последнего времени работы з втом направлении сдерживались отсутствием подходящих генетических векторов и неразработанностью удобных систем для генно-инненерных манипуляций в обсуядаемой груше бактерий. В качестве основы для создания векторов могут рассматриваться природные критические шгазьшды термофильных клостридкев. Таким образом, изучение свойств плазмид этого класса бактерий является важной и актуальной задачей.

Дель и задачи исследования. Настоящая работа была предпринята с целью детально® характеристики плазмид рыв1 н рывг

ИЗ Cloetrid.tu.vi гКегкоа<юсНаго1уао\ж, ЯВЛЯЩИХСЯ ПерСПбКТИВ-

ными кандидатами для конструирования на их основе векторов

ДЛЯ С1авЬг1сИс.. В СВЯЗИ С ЭТШ бШШ ПОСТВВЛвШ СЛЭДУЩЕЭ

задачи:

1. СкрзЕинг анзаробннх термофильных бактерий на предает обнаружения в них криптичеишх шазмвд.

2. Клонирование обнаруженных плазмид в вектора ваеют«-

ühia. ooll.

3. Детальная характеристика клострЕДиальных илазмид.

Научная новизна. На основе скрининга 20 штаммов термофильных анагробны! (Зактэрий В клетках. С. thermoeaccharalytl-сша dsî£ 571 обнаружены две ранее веизвестше цдазмида, названные рНВ1 и рЯВ2- Для обеих плазмид определена молекулярная масса (5.15 и 1.88 т.п.н. соответственно), построены подробные рэстрикционные карты ж обнаружены области значительной ГОМОЛС; ШВДУ НИМИ. ЕлазМИДЫ pNB1 и pNB2 клонированы в ряд векторов £. «ou: püci2(i8), pBR322, piCYO 177. На основе рквг сконструирован ряд гибридных плазмид, которые могут рассматриваться как потенциальные шаттл-вектора для гедао-инжанэрЕЫХ манипуляций с термофильными клостридиями. Установлено два тзпз кинетического поведения плазмид в растущих клеточных популяциях. Цредаохена математическая модель, адекватно списнващая обнаруженные явления. Определена полная нуклэ-отидная последовательность плазмида р!Ш2 (1882 п.н. ) по обеим нитям и проведан ее компьютерный, анализ. Идентифицированы четыре открытые рамки считывания (ОРС). Показано, что с третьей и четвертой 0PG вкспрессируются белковые продукты в системе макси-клеток s. оои.

Практическая ценность работы. Данные результаты позволяют существенно расширить фундаментальные представления о свойствах плазмид из термофильных анаэробных бактерий. Исследования по измонешю копиЕности илазмид в растущих клеточных популяциях дают возможность оптимизировать эксцрессию реком-бинантннх белков в биотехнологичоских процессах с участием генно-инженерных штаммов. На основе pîŒ2 сконструирован' ряд гибридных плазмид, которые могут рассматриваться как потенциальные шаттл-вектора для. генно-инкенерных манипуляций с термофильными клосзридаями.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Ш и Zill Симпозиумах по биотехнологии получения топлив и химикатов (Гетлинбург, 1990 и Колорадо-Спрингс, 1991), 7 Европейском конгрессе по биотехнологии (Копенгаген, 1990) и yii Всесоюзном симпозиуме "йшэверная этимология" (Москва; 1991).

Публикации. По матьриалам диссертации опубликовано^ печатных работ.

Структура и обьем диссертация. Диссертация состоит из введения, обзора литература (2 главы), экспериментальной части, списывающей материалы а метода исследования. результатов и их обсуздэния (5 глав).выводов и списка цитируемой литературы. Работа излохена на 11S страницах, содержит 26 рисунков и. 7 таблиц. Список литературы включает 126 ссылок.

■ ишвдг и иегодд.

В работе нспальзоввян: анаэробные термофильные микроорганизмы: с. thensoeaoetaroiyti-etiai DSM 571. C.-thsnzahydroBiilfurlcusri DSI£ 567, С. thorv-ocel Хит. bQRX, С. tfternoeiutotrophtouBi z99, С. sfercorartusi K0I3 11754, Clo3irlä.lum вр, 1б11. Cloetrl&lun вр. 1501/60, Thsmoanaerobi-Ш1 I aa tc-eth;/ И ottm ZE-1, Г. brobit ¿.TOS 33075 г Thermocmaerob tum ар. 803, Theracarjaarobfiw» ар. 1504« ИгагяеажюгаЫют ар. 1501/70, rftemobíMterotdss aaatoetb-ylictis ATOO 332Ó5. Thematoga maritima DSM 3109, jtoetoeentum fetvuC И рЯД ДРУГИХ ТОЧНО

неклассифицированных штаммов, вмэициэся в коллекциях кафедры химической эезйшлогеи химического факультета ¡¿ГУ, кафэдры мккробиологзз биологического факультета МРУ и Института микробиологии АН СССР;

штаммы Е. ooliZ JM109 (гео.А1 oruSJA syr¿9S thl hedStf ачр£44 r&lAl }~L (lac-pro .¿BWtralSS ргоАЗ* lad'1 ZÁX15), 0600 i?~ th.l-1 thr-1 T.3UB6 laaTl torU21 supS44

вектора и -ышзмида: puci2 (ipr, baoZ, CoiEi), pUC18 (Арг, LaoZ, Co 131), püGt 9 Up1*, J.soZ, 0olE1), pBR322 (Apr, 2or, ColE1 (pKB1)>, pöemini2 Upr, LaoZ, ColEt), pACY0177 (Apr, Km1", p15A), pBluasoriptll £S(4- % Я SX(+- И -) (Apr, LaoZ, ColSI, ort 11), M13mptS (IaoZ, ort K13), Ш3шр19 (JGaoZ, ort Й13), pAE52 (Apr, Mb", InoN)

Методы исследования. Культивирование еяавробвых микроорганизмов проводила с применением анаЕробкой техники Хангейта. Бактегяш я. о.ои варапщвалп на хвдких и атаризированвых X® средах. Выделение ДНК плазкид и другие генна-ИЕЕЗнврныэ манипуляции проводила по методике Маниатиса с соазт., а обработку рэстрштазаня - согласно рекомендации ¡few England Biolabs. Гибридизацию ДКК проводили го Саузерну, а секвенированиэ - по методу Сэнтера. Серив однонаправленных дзлеций фрагментов

pNB2, клонировавши, в pBluesoript, получали при помощи обработки ЕаоШ к liung Beau нукаэазами в соответствии с рекомендациями фирмы-поставщика ("stratagene"). Процедуру приготовления макси-клеток е. сои проводили по Оанкару.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Скрининг бактерий на предает обнарузення в них влазыид.

Проведенный нами скрининг 20 культур термофильных анаэробных бактерий показал наличие нлазмидной ДНЕ только в 5 из них (табл. 1}. Основы- Таблица 1 ваясь на результа- Результаты скрининга плэзмид в клет-тах скрининга, мы ках термофильных анаэробных бактерий остановили свой Бактерий Примерный размер выбор на плазмиде__шгезмиды, т.п.н.

ИЗ С. thamoeao- С. thermoeaoahar-olt/Houia 5

oharoïliUoum, КО— С. thaT-mohydrceulfurlоит 5

торая наиболее С. thermooeîlum . 30

стабильно ВНДЭЛЯ- T. ïaotoethyïioum 10

ЛОСЬ ИЗ клеток И ТНегтвапавгоЫит ар. 1501/70_25

имела подходящие размеры с точка зрения создания будущего вэктора.

2. Предварительная характеристика плазынд из С. thermosaooarolytioum.

На рис.1 представлена электрофореграмма препарата плазмидной ДНК ИЗ С.th,srmaeaaaharaïytlaum (1»-Й ТрвК), На Которой ВИДНЫ 5 основных полос. Для идентификации этих полос ш провели обработку плазмидной ДНК набором рэдкощепящих рестриктаз с последующим электрофоре тичэским разделением фрагментов рестрикции (треки 4-11). ¿нзлиз элекгрофореграмш позволил сделать вывод о наличии, по крайней.мере, двух плазмид в клетках с. thervœÎBaooharaïytlcum". HB ПерВОК ТрЭКв рИС. 1 ШрВВЯ ПОДОС8 сверху отвечаэт линейной форме первой плезмида, вторая - кольцевой сверхскручэнной форме этой ке шгазмиды; третья - денатурированной форш ДНК (на нее не действуют рэстриктазн) и, наконец, четвертая и пятая полосы принадлежат второй шгазмидэ. Обнаруженные ллазмида мы назвали рНВ1 и рквг. Обе плазмида имеют уникальный сайт Psti, а р.чв1 - еще и уникальшй сайт EaoRI. »

Копийность плазмида pNBi при культивировании бактерий на

1 23456789 10 II iz ?ИС. ГвЛЬ-

элэктрофорэз плазмидной ДНК Е3 С. thspsosa-оcharalytlouml

1 - без обработки рестрик-твзаш; 4-11 -обработанная рэстриктазаг.ш: 4 - Hindlll, 5 - Hindlll + EooRI, 6

HiadXXX + J-etr,

7 -JS0 S8, ЧТО

и на полосе 4,

8 - EooEI; 9 -EooRI + Pstl; 10 - EooRI + Bglll; 11 Pstl. Данные по маркерной ДНК:

2 - pBR322 (0.162, 0,465, 0.570); 3,12 - фЗГ X + EooRI + Hindlll + Pstl (0.564, 1.11В, 1.56В, 2.027, 2.322, 2.686, 3-530 , 4.361, 4.378 , 5.643 , 5.804, 6.557,- 7-421, 9-416).

•обычной среде (без добавления антибиотика) составляет 1-2 копии на клетку. На селективных средах, содержащих каначипин (Km) шш стрептомицин (Str) до 100 ыкг/мл, устойчивость к которым штамма DSií 571 наш была показана в отдельном эксперименте, копийность увеличивается до 5-10 копий на клетку.

3. Клонирование плвзнид рНВ1 и рнвг я их детальная характеристика

Обе ллазмиды были клонированы в в. coït (штамм да 109, плазьгада piro 18): ркзг - по Peti сайту, pïfBi - как по Pstl, так и по 3ooRl сайтам (рис. 2). В результате были: получены ГЕбрЕДЕЫВ шгазмвдн рИВЗ, рКВ4 и рКВ5, хорошо рвШШЦИрУЕЩЕЭСЯ в Е. ooM JM109.

Ка попытались установить связь между обнзрукенной нами УСТОЙЧИВОСТЬ» культуры О, ihamooaaoharalyt Ccurs. К Km И Str В' НЭ-личиэм з ней плазкид. Для si-oro глош я. сои даюэ, содержание гибридные шшзкида рнвз, рНВ4 и рКВ5, высевались на селективные среда как с Km, так и со str. Однако, мы не наблюдали роста этих кловоз декэ при минимальной концентрации антибиотиков (10 мкг/мл). Полученные результаты ев позволяют сделать заключение о том, что гены, ответственные за устойчивость к Km

он О

Рис. 2. Клонирование плазмзды pîŒKa) и pîiB2(6) в puci8.

и str, не связаны с шазмидаш pNBl и рнвг. Дзло в том, что даке при налагай такой связи эти геш могут не экспрессиро-ваться в системе в. coi f. Окончательный вывод относительно локализации генов резистентности можно будет сделать только- после получения вектора, способного к экспрессии генов з клетках клостридаев.

Ка рис. За представлены. рестрикционнкэ карта плазмид pHBi и ркв2. Помимо отмеченного вше Psti сайта, обе плэзмида содержат таюка уникальный сайт Hinoix. Кроме того, з плэзмидэ • pNBl содержится еще 2 уникзльных сайта (EocRi h AooI). Ожогам, что обе плазмида на содерхат сайты следущих редкощепящих рестриктазг ВашЯГ, Bgll, Bgiri, EcoRT, Epnl, Saal, Sali, Smal, хъаг я Xhol. Был такие определен размер плазмвд, который составил 5.15 и 1.88 т.п.н. для pNBl и рквг, соответственно.

При сопоставлении рестрикциовннх карт (рис. За) у нас возникло прэдшлоЕешю о существовании родственной связи ыезду обеими плазмидаш, а именно, что шгазмида рявг является производной большей плнзкида ркв11 Чтобы проверить эту гипотезу, мы гибридизовзли различные фрагменты рКВ1 с линеаразованной и меченой рнва (Рас. -Зв).. Данные контрольного эксперимента по идентификации рвстрикционных фрагментов pNBl приведены на рис. 36 (в качестве зонда использовалась линеаризованная и меченая полноразмерная рКБ1). При гибридизации пяти фрагментов pNBl (полученных после обработки ев я in diu 4- EooRi : нем, ЗЕ-2, н-2, н-з, н-4) (рис. Зв) с этим зондом на авторадиографэ (трек 1) четко еидны только четыре полосы. Это связано о плохим разделением н-з и üS-2 фрагментов, якещих близкие размеры (=« о.э т.н.п.). Для их раздельного анализа была проведена гибридизация двух Pati-EooBi фрагментов, обработанных Hindill, с тем se зондом (трек 2 соответствует фрагменту длиной 1.4S т.п.н., содержащему фрагмент ЕЕ-2, трек 3 - фрагменту длиной 3.69 т.п.н., содержащему фрагмент н-з). Аналогичные эксперименты были проведены с использованием в качестве зонда линеаризованной и меченой полноразмерной рквг (рис. Зв).

Результаты габрздизационЕнх экспериментов показывает, что pNB2 уверенно гибрадизуется с полоса?,га, соответствующими Е-2 и Я-3 фрагментам рКВ1. Более слабая, но четко регистрируемая габрвдизация наолэдэется з с КЕ-2 фрагментом рЯБ1. Таким обра-

p«tl

t

Patl

б в

1 г з i 2 з

Рис. 3. схема генетической перестройки рИ31 в рКВ2:—- про-секввнированшб гомологичные участки ДНК (а). Гибридизация рзстршшионнкх фрагментов плазмиди pNBi с полноразмэршши рНВ1 (б) и рЫБ2 (в): треки 1 (б и в) - рмш, обработанная Hindin + EooRI; в качестве источников ЕЕ-2 и н-3 фрагментов (греки 2 и 3) использовали EooKi-Psti фрагменты рнвг (размером 1,46 и 3,69 т.п.н. соответственно), обработанные, Hlndlll. Слева указана локализация рэстрикцконшх фрагментов рШ1.

зом, плазмида pNB2 имеет протяженную гомологию с рКВ1 и, по-видимому, действительно является ее частью (на рис. За показана предполагаемая ее локализация в плазмвде рНВ1). Этот вывод был подтвержден при помощи определения частичной нуклеотидной последовательности фрагментов ркВ1 и pN32 в местах, указанных пунктиром на Рас. За. Результаты секвашрования показали полную идентичность (10QX гомология) соответствующих областей pnbi и рив2. Мы предполагаем, что рквг закономерно и с высокой частотой Образуется в клетках с. thermoeaooharoWtloum в результате рекомбгнационной перестройки в молекуле pNBi.

4. Кинетические закономерности решшкацаи гибридных плазшд на основа Бектороз я. ooit и рЫБ2.

При опрвделеник когшйности гибридной шшзмиды рШ5 в растущей популяции в. сои юэ мы обнаругшга, что Gsa проходит через минимум в период наиболее интенсивного роста клеток штамма-хозяина ж достигает исходного уровня в стационарной фазе роста (рис. 4а). Аналогичные эксперименты с тем ш штаммом-хозяином и с гибридной плазмидой pKB7t полученной путем субклонирования шшзмиды рива по Psfcl сайту в вектор picïci77, показали другой тип поведения - кривая копийности этой плазми-ды имеет два экстремума:.за уменьшением кошйеости плазмиды на начальном этапе процосса следует довольно резкое ее увеличение (рис. 46).

Причин такого различного поведения системы "хозяин-Евктор" могет бнть несколько: воздействие штамма-хозяина, влияние генотипа репликона взктора, црирода исследуемой вставки (в данном случае ДНК плазмиды рквг). Для проверки первого и второго прэдаолоазний нн провели дополнительную серпа экспериментов с широко используемыми в генетической инженерии векто-рама (не содержащими вставки ДНК плазмиды рквг) и штаммами е. ooii. Няазмидами с различным рзилнкоЕсм трансформировали один и тот гэ бактериальный штамм (рис. 5а и 0) :

рЮ£24 ^ BGEM2 .call JH103 «-рАВ52

PACYC177

И наоборот, одной и той se плазмидий трансформировали различные бактериальные штамма (рис. 5в и г):

Рис. 4. Кинетика изменения числа клеток (1) и копийности плаз-мида рив5 (2) в процессе роста е. сон даюэ (а). Кинетика изменения числа клеток (1) и копийности плазыида рИБ7 (2) в процессе роста Е. ооН Сбоо (0).

В.оогс «Ш109 *■ рШС4 + Е.ооН рИ13 г.ООН Сбоо «■ рАСУС177 * £.ооИ Л£109.

Из рис. 5 четко видно, что в общем случае плазмиды, нмепцие один и тот же репаикон, например, СоГЕ1 (рЫМ24, рис1 г, рйигг, рВН322), вне зависимости от штамма-хозяина демонстрируют одинаковый тип кинетического поведения. С другой стороны, плазмиды с различным решшконом, например, рйсчг, рАСУС177 и рАВ52 (репликоны Со1Е1, р151 и 1поН, соответственно), введенные в сдан и тот же бактериальный штамм (ДО 09), проявляют различные типы поведения. Таким образом, не природа клетки-хозяина;1 а природа рашгакояа плазмиды определяет 'тип кинетического поведения.

Эксперименты по исследованию влияния природы вставки (в нашем случае ДНК плазмиды рЦЕ2) па тип поведения системы "хозяин-вектор" с точки зрения копийности плазмид суммированы на рис. 6. Так как по нашим данным, клострядиальная плазмзда ривг не способна к репликации в в. ооН, поэтому, неудивительно, что. инсерция клострндаальной плазмиды в рис18 и рАСУС177 качественно не изменяет кинетику репликации исходных плазмид (рис. ба и в). Исклйздше составляет поведение гибридной плазмиды ривб (Рис. 66), на кривой копийности которой появляется

Рис.5. Кинетика кошйности различных плазмид, введенных в е.

(а) рис12 Р^124 <б> РАСУС17Т (1),

рОЕЫ2-(2); (В) РММ24 1), рШ24 В ШТаММ рШЗ (2); (Г) рАСУС177 (1), РАСУС177 в штамм С600 (2).

максимум в конце экспоненциальной фазы роста, который не наблюдался для исходной рВН322. Одно из возможных объяснений этого феномена состоит в следующем. Анализ нуклеотидной последовательности плазмида Ркв2 (см. раздел 5) выявил наличие нескольких потенциально сильных промоторов, один из которых 'Р0Р0-3,4^ ~ Функционален и контролирует экспрессию оперона, кодирующего два шзкомолекулярных белка ОРС-3 и ОРС-4. Как по-

G/N 20

1<И

i 124

Рис.'6. Сравнение кинетики копийности различных векторных и гибридных плазмид: (а) - рШ18 (1) И рНВ5 (г); (б) - PACYC177 (1) И рКВ? (2); (В) - рВЮ22 (1) И рЫВб (2).

12 Ч

казал рострикцйонЕБй анализ, вставка рЫВ2 располокзна в .гибридной пяазмвда рнвз таким образом,'что этот промотор ыокбт воздействовать на эффективность инициации рэнликацих и тем самим оказывать влияние на контроль копийности гибридной плазмиды pUBS.

Итак, в процессе рвплжацик плазмид при росте популяции е. сан наблвдаися, по крайней мерз, два типа кинетического поведения* нри этом теп поведения регулируется природой решшко-на. ГТлазиады, содерааащэ реплккон CoiEi и/ели Inoií, как правило, характеризуются квиетическим поведением первого типа (один экстремум (минимум) на кривой копийности), в то время как пдазмида, содержавшие репликон р15к обнаруживают второй тип ки-

нетическсго поведения (два экстремума (минимум и максимум) на кривой нопкйности).

Исходя из экспериментально полученных наш интегральных характеристиках исследуемого процесса - кривых изменения ко-шйности плазмид в процессе росте популяции клеток-хозяев, было предложено кшэтичзсксэ описание поведения плазмид обоих типов, оно основано на предположении, что существует различие в величинах кинетических параметров, характеризующих рост клетки и репликацию плазмид. ч

Зависимость числа клеток (И) от времени монет быть представлена уравнением:

И(Ю - Н0ехр((Цс/Л.)(1-ехр(-Н)), (1)

где - начальная концентрация способных к делении клеток; - удельная скорость роста; X - удельная скорость инактивации клеток (потеря способности к делению).

Зависимость числа плазмид (в), содержащихся во всей клеточной популяции, может быть описана следующим общим уравнением независимо от типа их поведения:

0(1;) = G0exp{м^[exp(ap-p)t)-1]/(p-<^^)+^p[1-esp(-apt)]/ap} (2) где а0 - начальное число плазмид в клеточной популяции; и.р - удельная скорость репликации плазмид; Ор - удельная скорость деградации плазмид; р - удельная скорость образования активного репликациок-ного комплекса (по физическому смыслу актиБируш^ий процесс можно рассматривать как адаптации системы к юным условиям среды (концентрация углеродного источника, внутриклеточное соотноиениэ АДФ/А2Ф), синтез белка-активатора рвшшкациш плазкид и т.д. или элиминирование (во Бремени) из системы репрессора репликации) .

По определению копийность плазмид как функция времени имеет вид:

п = 0(Ю/Ж1;) (3)

что с учетом уравнений (1) и (2) приводит к вырвхэншо

ш = noexp{цp[ezp(C(p-p)t)-1 ]/(p-ap)+Цp[1-esp(-apt)JVap+

+!1о[езф(-Ш-1 ' (4)

Сопоставление уравнения (4) с экспериментальными данными

Ig(n/no)

Рис. 7. Сравнение экспериментальных данных, (точке) по ко-ппйности. плзгшда рАСУС177 в

рЭСТуЩвЙ ПОПУЛЯЦИИ В. со и

JM1Q9 и теоретической кривой, полученной по уравнении (4).

показывает, что оно описывает двухэкстремумннй характер кинетического поведения копийносте плазщц, т.е. второй теп их поведения. На рис. 7 представлены экспериментальные данные по кинетике кошйности плазмиды pAGYd 77 в двух различных штаммах 2. aaii и теоретическая кривая, рассчитанная по уравнению (4). Оценки значений кинетических параметров, полученные путем решения обратной задачи, дазт следупциэ величины: к = 0.5 ч"1, aip = 0.5 ч~1, т = (S- №109); А. = 0.9 ч~1, ctp = =

0.6 ч~1, 7 = 0.5 чГ1 (е. call сооо).

Следует заметить, что при относительно быезром протекании актнвирущих рэшгикацию процессов ф » о^) уравнение (4) трансформируется к виду:

и = a03xp[^p(1-ezp(-apt)/ctp-|i0(l-szp(-?.t)/M (5)

и описывает одноекстремумный характер кинетического поведения копийности плазмид, т.е. первый тип их поведения.

Таким образом, качественные различия в'поведении плазмид первого и второго типа связаны с различным кинетическим законом репликации, а именно для шшзмид второго типз на интегральной кравой общего количества плазмид э популяции долеэн наблюдаться внрэзаннкй период индукции. Молекулярная природа ' этого процесса (синтез дополнительного фактора репликации или аиикинацая рвпрессора) трэбует дальнейшего изучения.

. 5. Секзакфоваки плагьгада рнвг г анализ ее кукла&ТЯДН0Й последовательности.

Нуклеотиднув последовательность плазмиды рнвг (после пре-

H ΠI I

Не

->J

Рис. 8. Стратегия секвенирования плазмида ривг, линеаризованной по patl сайту: толстые стрелки показывает локализацию и ориентацию ОРС, потенциально способных к экспрессии белковых продуктов; тонкие - направление и протяженность каждого из прогонов црн секвенирования. Сокращения: H Hindlllî Но -'KinoII; Р - Pstl; R - Esal; В-- Taql.

дваритэлыюго субклонирования по Psti сайту в Еектор pBiusso-ript ) определяли по обеим нитям. Стратегия секвенирования приведена на рис.8. Анализ нуклэотидной.последовательности ривг (Рис. 9) показал, что она состоит из 1882 п.н., причем, содержание G+c (гуанин + цитозин) составляет 27,2%. Были идентифицированы четыре ОРС, размер которых превышает 170 п.н. (Рис. 9), причем все они находятся в одной кодирующей нити плаздаде. ОРС-1 содержит четыре потенциальных инициирующих кодона: тто (позиция 300), gtg (позиция 342 и S73) и А53 (позиция С63). Двум иницирувдим gib кодонвм предшествуют последовательности, напоминающие сайты связывания с рибосомами (последовательность Shine-Balgamo), в то время как в непосредственной близости, от кодона AUG такой последовательности не наблюдается. Таким образом, теоретически ОРС-1 монет кодировать полипешвды с молекулярной массой 32 705 , 23 500 и 19 972 Да. Однако экспрессия последнего белка маловероятна, ввиду отсутствия участка связывания с рибосомами, который, особенно в случае грамположитель-ных бактерий, имеет решающее значение для инициации синтеза белка. Отметим, чТо в случае ОРС-1 имеется принципиальная воз-монность инициации с кодона TTG (позиция 300) вследствие наличия сильного участка связывания с рибосомами AaAAAGGtGGï (позиция 282).

Через 138 нуклеотидов после стоп-кодона ОРС-1 расположен богатый GC обратный повтор, который заканчивается блоком з и, следовательно, макет служить р-нвзависимим терминатором транскрипции. Мозно предположить, что этот обратный повтор играет и другую более значительную роль (например, в репликации плазми-ды) посколъко такая богатая GC структура (=« 57%) на фоне яиз-

Pili . . .......::■»

:i£ií^iMT^ni«jbiTiiniiutt»tti;iisnii;cici!i:í:i!íni5iii№ii»CA«íc«iiMiin5TiiicKc:ti'tóTi»siiinA5csTii6iTi

-35 -10

M

......Hind Ш . . . m

. ТЦ!. . . . . . »01

;iMTnsnssHm:tcsc:;usMST!Kn;sicrants't;isn6!rii«ciEu

•SHjjfspViJClíhtSrrfes^UTSÍK^^nííyvleuVilCviAsíbrValftrj^rVílLrslfrlleUblYn'iíLeuSU'.'íISfrfiitLíufcspVtlísiiftMiIvrr'

SD

ra

. R&t......... 8»

í9?f.*lWé¡vSly^ruAr9Ser1hrElMlllLyiArs&líLy^LtulysTríHt^

Ш

№l>Cfl 1090

а:5А1ти;4»зи!ИАт«ш'8АМАЕВГббг.5тАЕтатгаБ51«ттвсгда^

i:AíBLtutlM5:lHtyrt»*Swv»ILyifisnAf9ArjL(uVaSWsírl«íE]rnflewArjEb>'i]A5?LyUysVii6luSerSWh«AssSpfVilVilAípA«Aipl

1M

i'Aíí?Ml¡ítyiLíS'.,ilCysSUbrAsr1t.íSlrrLyíP!ieeluIWisuLwlyrSl(fi(sVilAi((Tv'NitC«AiClwi:l

. ^ .... НЫШ . lia

. ....... 1'íO

ата&авчжгйаи^гкгадгакшьпшттпв«^

-35 -i O

. . . . . !5i»

F.{lllEA:nTrrlyst,yVilUrlr3fiíaT»f¡!iAf9aifTyrBetSlníJ«ftiíiFRtLw£írPheVíl5wíípíin;erUíS#r?lieLfi(trlVi

l'K

:r.tlKrflljAr9ll4Tii.rííiifr;.uifi[ftl.n!yrSsp¥¿lIfrfí'r.eIbfIyrAíSfctpLe4fiíI!Lyii.y5Aipt.eliVllUe6¡ftSlyyiílííihr9LíUlll

SC RftLyiAísAspLyfcV.

&M.SI .......... 1!»

ЕПтсто^ттЕАжтатси'.сбтьткиаамсткгаАам^^^

......Ddel

i'!SaETT"««TIt««aCt!rS(tK¡»r!CTA!SSriTIAASrTSaSCE£5;K:«S5!a!eCrc£!$«HS«CC

fec. 9. Нуклеотаднзя последовательность шгазмиды pNB2. Начало нумерации нуклэотидоз с йерво£ю нуклготада ístl сайта. Под нуклеотидпой по еледозательностьв приведены аминокислотные последовательности, соответсгвужщие открытым рамкам считывания ОРС-1, 2, 3 и 4. Предположительные квициирувдив кодоны отмечены рамкой. Предполсгигельнке последовательности, соответствующие последовательности Shine-Dalgarao, -10 и -35 областям промоторов, подчеркнуты. Стрелками обозначен обратный повтои.

кого в среднем содержания ос-пар в ДНК pNE2 О 27%) выглядит необычно. На Рис. 9 указан также предполагаемый промотор для ОРС-1. Следует отметить, что богатые лт-парами последовательности, способные потенциально служить в качестве промотора, встречаются в шшзмиде pNB2 довольно часто и, по-видимому, именно это обстоятельство затрудняло иногда в наших опытах клонирование некоторых ее фрагментов. ОРС-2 (координаты 12381430) имеет три потенциальных инициирущих кодека атг>. однако ни одному из них не предаествуэт последовательность, которая .могла бы служить в качестве "участка связывания с рибосомами. Поэтому кодирование это! ОРС какого-либо белка маловероятно.

ОРС-3 и 4 организованы в оперон с сильным потенцинльним промотором ж соответствуицими участками связывания с рибосомами и способны кодировать полшгептида с молекулярной массой 8 116 и 7 10G Да соответственно. Представляет интерес сопряжение стоп-кодона - (тги) ОРС-3 с шшширушш кодовом (Ато) оро-4, которое могот иметь регуляторное значение.

Цринцишальная возможность экспрессии белков, кодируемых ОРС-3 и 4, бала продемонстрирована в экспериментах с макси-клетками е. coi с, содержащими гибридннэ плазмвды (фрагменты рнв2, клонированные в pHiuecoript (Рас. 10). Анализ гшаэмздных белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата

К Da 94 -67

3 4

- Ф&.

43 -

30

¡P!

20.1 -i:

jV

(ЙЭ:

14.4 -¡;

"Г»?

я

¿íd

gP

IIй

el

ч-ы

т

Я

ж

é '«zk*

SS

Щ.

ш f

щ

Ш т

hí»

ш ш

-"с

щ

Е

BIJA,

Щ

•РА ■tgsíj

Sí®

Mi

Í'ÍS Щ

т

ш

Рис. 10. радиоавтограф белков, экспрессируемых плазмидей р!Ш2 и ее фрагментами, в максйгДслетках 2. оок ДО09, меченных б: 1 -рВ1шзвог1р1И кз(+) без инсерции; 2-5 - рВ1иевог!р4 с кнсррциэй ршг: 2 - полкоразмэрной вставки по Рв«С сайту; 3 - Рз«-Я1п(1111 Фрагмента (координаты 1277-1832, Рас.9); 4 - Е±я11Х1-н1пй1хХ фрагмента; 5 - Рз-ы-ЕНаШ! Фрагмента (координаты 1-428, Рис.9)". Стрелки указывают на предполагаемые продукты ОРС-3 и СРС-4. Слева приведены размера стандартных белков.

1

натрия показал, что плазшды с полаоразмерной ркзг и ее Рзи-н1пй1И фрагментом, кодируют* ОРС-3 н 4, индуцируют сш-тез двух низкоыолокулярных полипептидов с молекулярной массой 7000 и 8000 Да (треки 2 и 3). Эти сежи отсутствуют в препаратах макси-клеток, содержащих вектор рвхиезо:^^ (трек 1) или гибридные шгазмады, кодирувдие другие области рЫВ2 (траки 4 и 5). Полученные в этих опытах значения молекулярных масс для продуктов ОРС-3 и 4', находятся в хорошем соответствии с величинами, расчитанным на основании нуклботидной последовательности. Отметш также, что нам не удалось зарегистрировать в системе макси-клеток е. сои продукт ОРО-1 (траки 2 и 4), хотя нельзя исключить вариант, при котором продукт ОРС-1 (=* 33 ООО Да) кокет быть акраанрован р-лактшазой вектора, имеющей близкий молекулярный вас (=« 30 ООО Да). Бозыогво также, что вксп-россия продукта СРО-1 шхет осуществиться только в клетках с1авгг1<И1ж или других грачполохитэльных бактерий.

Компьютерный ааелгз (программа уабед.) Еуклеотидной последовательности р'гаг против банков данных ааазЪгШс/жвь и соот-ветствущих аминокислотных последовательностей, против__ банка

р^ьгт

Рис. 11. Схема конструирования потенциальных шаттл-векторов на основе плазкида рнвг.

данных NBRF-proteixi не обнаружил существенных гомологий, которые могли ба дать ключ к пониманию функционального значения обнаруженных нами белков и некодирущих областей плазмиды. Возможно, это связано со слабой изученностью плазмид из термофильных грамполохитеЛЬНЫХ бектергй, В особенности ИЗ Clostridia.

В заключение отметим, что на основании информации о предполагаемой локализации pN32 ort мы сконструировали (рис. 11) ряд гибридных плазмид о использованием стандартных элементов '(CoiEi ort, гены устойчивости для- в. ооН и грампологательных бактерий), которые могут рассматриваться как потенциальные шаттл-вектора для гэпно-инженершх манипуляций с термофильными клострздиями.

ШВОДЫ

1. На основе скрининга 20 штаммов термофильных анаэробных бактерий В клетках Clostridium thermoaaooharoli/tloim DSM 571 обнаружены две ранее неизвестные плазмиды, названные рнв1 и рнвг.

2. Для обеих плазмид определена молекулярная масса (5.15 и 1.88 т.п.н. соответственно) и построены подробные рестрик-ционные карты. Обнаружены области значительной гомологии между плазмидами рыв1 и рквг.

3. Шшзшща рнвг и рнвг клонированы в ряд векторов s. coli: PUC12(18), pBR322, рАСУС 177. На их основе сконструирован ряд гибридных плазмид, которые могут рассматриваться как потенциальные шаттл-вектора для генно-инженерных манипуляций с термофильными клостридиями.

4. Установлено два типа кинетического поведения плазмид в растущих клеточных популяциях. Предложена математическая модель, адекватно описывающая обнаруженные явления.

5. Оцределена полная нуклеотидная последовательность плазмиды pNB2 (1882 п.н.) по обеим нитям и проведен ее компьютерный анализ. Идентифицированы три открытые рачки считывания. Показано, что со второй и третьей открытых рамок считывания экспрессируются белковые продукты в системе макси-клеток а.

coli.

Список работ, опубликованных по теив диссертация: 1. Belogurova N.G., Mosolova Г.Р., Kalyuzfanyi 3.Y., Varfolo-

meyav S.D. Kinetios of growth and metabolism of Clostridium thermoeacoharoXvtiowa. culture. Isolation and. characteristics of its plasmids.//Appl. Bicoiiem. Bioteohnol. 1990. Y.27. P.1-8.

2. Yarfolomeyev S.D., Belogurova N.G., Kalyuzhnyi S.V. Dynamics of gene expression. 1.Two.typas of plasmid replication kinetios in growing Eeoherlchla, ooll population.//Bio-chem. Bioteohnol. Elootron. Express. ,1991 • Y.1, P.25-35.

3. Вадачкощя P.M., Кривенхо в.В., Белогурова Н.Г., Варфоломеев С.Д., Кириллова Е.В. Плазмиды алааробшх тешо$ильных хвмооргаюгрофшп: бактерий.// йпсрзбиологня. ¡539. Т.58. N6. С.1045-1047.

4. Кутузова Г.Д., Сотишаш-Е.А.-, ' Белогурова Н.Г., Скрябин-Г.А., Угарова Н.Н., Варфоломеев С.Д. Новый тип индукции синтеза рбкомбинаатных белков."Низкотемпературная индукция" при экспрессии гена лвдифэразы светляков в е.

■ ооХ{.//ДАН СССР. 1ЭЭ1. Т.314. НЗ. СЛ57-761

5. Белогурова Н.Г., Мосолова Т.Е., Калтаннй С.В., Варфоломеев С.Д. Кинетические закономерноо-ти роста и метаболизма культуры Clostridium, thamaaacoharaivt <оша. Выделение и характеристика ее плаамид.//Микробиология. 193!. Т.60. Н2. С.2*5-252 ~

6. Мосолова Т.П., Квлшкннй С.В., Белогурова Н.Г., Варфоломеез С.Д.Влияние антибиотиков, температуры и рЕ на рост и метаболизм КУЛЬТУРЫ Clostridium thsrmaeaoohar-olf/tioum.. //МИКробиология. 1991. Т.60. N3. С.485-493

7. Калшный С.В., Мосолова Т.П., Белогурова Е.Г., Варфоломеев с.д. Плазмиды термофильных бактерий рода Clostridia» и ме-танобразухдйх бактерий.//Усл. совр. биол. 1991. Т.111. N6, С.873-881.

8. Белогурова Н.Г., Дельвер Е.П., Калюжный С.В., Варфоломеев С.Д., Родзэвич О.В., Бэлогуров А.А. Нуклоотидная последовательность плазмиды рНВ2 из. термофильных бактерий cioat-

ridlun 1!гаг1ЯОваосЛаго1у11ошл.//МОЛекуЛЯрнаЯ бИОЛОГИЯ. 1332. T.2S. N1. С.

9. Belogurova К., Kalyuzhnyi S., Jiosolova t., Yarfolomeyev S. Isolation and characteristics of plasmids from Clostridium thormoeaooharo¡i/iCouc..//Abstr. book 12th Int. Symp. "Biotechnology for iuale and Chemicals", Catlinburg, USA, 1990. P.50

10. Kalyuzhnyi S., Belogurova N., Kobo1ov3 Т., Yarfolomeyev S. Clostridium tharrnoaaAoharalyt loum: antibiotic—dependent hydrogen uuBerproduotion, isolation and oharaoteristioo of its plasaids.//АЬstr. book 5th Eur. Congr. Bioteohnol., Copenhagen, 1990. P.174

11. Belogurova N.. Delver E., Kalyuzhnyi S., Yarfolomeyev S., Balogurov A. Nucleotide sequsnoe of plasmids pUB1 and pNB2 from Cloetrldlim tharmoaa0oharo'lytloia».//AbBtr. book 13th Int. Synp. "Biotechnology for Fuels end Chemioals", Colorado Springs, USA, 1991. У-69

12. Belogurova n., Delver E. , Kalyuzhnyi S., Yarfolomeyev S., Belogurov A, Plaemids pNBI and рЫВ2 from Clostridium ther-maaaa charo lyti aim.: cloning and ?3quanoing.//AbBtr. book 15th. Int. Congr. Bioohea., Jerusalem, Israel, 1991. P.143