Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и свойства целлюлолитических ферментов Clostridium thermocellum F7

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и свойства целлюлолитических ферментов Clostridium thermocellum F7"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ бИОХИМШ И ФГСШЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

уда 517.124+575.1:579.842.II: 579.852.11+ +577.21.218:578.552:579.25.5

Вугптарова Карана Геннадьевна

КЛОНИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА ЦЕЛЯШШШ5ЯЕОТЯ. (ЙРШШМВ CLOSTRIDIUM TIÏERMOCELUM F7

03.00.04 - биохимия

Авторзфэрзт диссертация на соисканнэ учашзй стешнп квндидата биологических наук

Пушто, 1Э92 г.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор В.К.1ким8Нко кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Т.В.Црй

Официальные оппоненты:

доктор химических" наук, профессор В.Н.Лузиков кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

А.О.Солонин

Ведущее учреждение: Институт биохимии им.А.Н.Баха

Защита состоится ■■ м ■■ О^.&'кЛк Л 1992 года в ''чао.Пин. на заседании Снациа .газированного Совета (Д.053.05.32) при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан ■• ¡^ ■■ ¿ик&л ^ 1992 года. Ученый секретарь Спвциализиро

Актуальность проблеин. В последние года все большее внимание исследователей привлекает проблема биоконвэрсш цвллшюзного сырья. Во-первых, вследствие растущих потребностей в анергии и пищевых продуктах, что приводит к активизации усилий, направленных на разработку способов получения полезных продуктов из источников, считавшихся ранее неэкономичными. Во-вторых, с точке зрения эффективной переработки городских и сельскохозяйственных отходов, в состав которых входят целлшозосодеркащив соединения, и, в конечном итоге, защиты округа идей среды от загрязнения.

Термофильная анаэробная бактерия с. ^егтосеИшп является продуцентом высокоактивных термо- и хемостабзлышх целмшаз, что может быть использовано в биотехнологии для сахарифэкацня целлиь лозной биомассы. Следует отметить, что, в отличие от грибных целлшаз, синтез кшстрцдиальных не шдверзвн обратному ингибированш продуктами деградации цвллшозы - цвллобшзой и глзжозой. Внеклеточные целлшазы с. -шегтосоНит организованы в мультаферментннй комплекс - целлзшосому - обладащий регулярной надмолекулярной структурой я ассоциированный с клеточной поверхностью. Попытки выделения индивидуальных компонентов целлшосош биохимическими методами оказались малоэффективными из-за устойчивости комплекса к диссоциации и последущэй инактивации, ферментов (Вееи1п 0"Ь а.1. . 1937). В НаСТОЯЩОЭ ВрвМЯ НЗИбОЛВв ПврС-пективным подходом для изучения как биохшжических механизмов бшконверсии целлншозы, так и свойств индивидуальных фврлвнтов -целлилолитиков анааробной термофильной бактерии с.^еппосеНит представляется использование методологии генной инженерии.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение индивидуальных генов и их продуктов, участвующих в процессе

ДОГраДВЦЯЗ ЦЭЛШШЗН, у ШТаММа СЛПелтовЦш

В первую очередь предполагалось клонирование генов, контролирующих синтез различных взофармантов, обладащнх цвллвдолити-ческой активностью, а такае болев детальное биохимическое и '.юлекулярно-биологичвское изучение некоторых из них. Предполагалось также изучение гвтерологичной экспрессии целлхшолитических ферментов в клетках различных микроорганизмов.

В соответствии с целью, в работе последовательно ставились и решались следущие основные задачи:

1. Конструирование в клетках в. coli репрезентативной геномной библиотеки с.tKencocoiium Fr. Аналкз подученной библиотеки на наличие рекоьйинантных клонов, приобретши: целлтлолптическув активность.

2. Идентификация среди отобранных cei+ рекокбзнантов клошв, несущих различащнася eel гены. Решешш атой задачи подразумевало как фазпческоэ картировнниа рэкомбанантных плазшд, так и биохившческув характеристику рекогйЗшантшх штаымов.

3. Очистка и характеристика бяохтическнх сеойсте новой андрглззсаназы col I C.theroocelluni Р7.

4. Изучение особенностей экспрессии /?-гл£козвдазц В c.therraocoiium ti в клетках гош- и гетэрологячных хозяев.

Научная новизна работа. На челночной векторе рИК4 для euere-tai гракотрицательных - грамполозгательвых бактар^ скоиструпрова-на репрезентативная библиотека анаэробной, терг.:о(|илыюй бактерии

Clostridium tHormocolluni РТ. И КОТОРОЙ ИДВНТИЗЗЩИрОВаНЫ paKOKÖS-

нантные шгакш, приобретшие 7 различных генов авдрглшаназ. Получеш данные, указиващиэ на юноцестроннув организацию coi генов c.-thsrmocelluin. ПОКаЗЕНЛ BQ3íáOZHOCTb ЗКСПрвССЕа КЛОСТрйДИ-альных генов (coli и tgin) под контролем собственных регудятор-ных сигналов в клетках e.coií ж B.subtiiis, а такее в случав гена /з-глшозндаза В в клетках аукариот (s.cei-aviaiae).

Впврвив клонирован ген, коднрущий новую, ранее нв описаннуи в литературе, ацдогдшаназу х c.thsxsaoceiiuai эт. Показана суперэкспрессия андрглшаназы х в клетках е. сои под контролем клост-ридиального промотора и шришшзшзтическая локализация фершнта в клетках е.coli. Проведана очкетка и изучение биохимических свойств вндоглшаназы х. показана уникальная теркостабильность фермента. Из клэток е.coil наделаны 2 изофориы андоглшаназц i. незначительно различающиеся по молекулярной массе и удельной активности. Показано, что в случае всех андоглшаназ, в ннни-клвтках г.coli обнаруживается несколько полипаптидов, соотвэтствущих продуктам eel генов.

В клетках в. coli показана ion-зависимая гетерогенность продукта гена bgiB. кодирущего ^-глгкозадазу в c.thermoceiium ft. Иммуноблот - анализ позволил показать, что множественность фора /э-глшозидазы В наблвдаэтея е в исходном хозяине с. thomo-

cellum ?7.

Научно-практическая значимость работа. Сконструированные

18МЯ р8КОМ0ИНВНТНН8 ШТаММЫ И ШШЗШДЦ ЯВЛЯЮТСЯ НвобХОДИМОЙ 0ВЗОЙ

¡ум дальнейших иссходованпй, направленных на выяснение биохими-геских и шлекулярго-биологических механизмов организации, регуляции и оптимизации процесса гидролиза целлюлозы у исходной 5актерии c.-thermoceiium тт. Полученные на ми данные по особеннос-гям гетерологичной экспрессии генов цвллплолитичэскпх фэрмвнтов :. thernsoceiium в различных хозяевах являются вагным элементом tym последушцих разработок Окотехнологических процессов.

Рекомбинантные штакми и плазшда, содержащие гены эндоглша-133Ы х и /5-глшозидазы В были переданы и использованы в сов*.;ест-шх исследованиях в Института Микробной Технологии (хит. Индия). Нташз! и плазмады, содержащие ген апдоглшанвзы i coli были юрвданн для исследований во ВНИИ Генетики (г. Москва). Рекомби-гантные нлазшвдн, содержащие ген /5-глшозидазы были переданы в табораторип генной кпавнорза (КВШ РАЕ) для создания лекторов жспрессирущего типа в система в.coli - швотные клетки.

Апробация. Основные полозшния диссертационной работы были фвдставлвны на Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Пущино, 1988), на 6 международном симпозиуме но ге-ютике промышленных микроорганизмов (Страсбург, Франция, 1990). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объел диссертации. Диссертация состоит из введе-шя, обзора литературы, описания материалов и катодов исслвдова-шй, изложения экспериментальных результатов, обсуждения резуль-атов, выводов и списка литературы. Работа содержит 148 страниц шинописного текста, вклшая II таблиц и 16 рисунков. Список итературы включает 166 наименований советских и зарубежных второв.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Бактериальные штакЕга. В работе использовали слэдрщиэ актвриальныв штаммы: c.thermoceiium ft (коллекция лаборатории нааробных процессов, ИЕШ РАН), e.coii ллоэ, в.coli hbioi.

.coli СбОО. В.coll TL903. E.coli Х925, B.subtllla 168

коллекция лаборатории биологии плазвдд, ИБФМ РАН). B.subtiiis

AJ73 (коллекция ВНИИ Генетики, г.Москва). s.cerevisiae шзоз (коллекция Института Микробной Технологии, Индия).

Среда в условия культивирования. Хранвнив и культивирование

. С. thermocellum F7 ОСУЩЭСТВЛЯЛИ на СОЛ8ВОЙ СрбДЭ С ДрОЕВИВЫМ

экстрактом (Цой И др., 1987). Штаквщ В. coli И B.subtilis выращивали на полноценных питательных и минимальных средах (Миллер, 1976, Клонирование ДНК. Метода.1988). Для s.cereviaiae использовали КТО среду (Burgers and. Percival. 1987).

Трансфоршцщ) ШШЗЩДНОЙ ДНК клеток В.coli. B.subtilia и протопластов S.cerevislae проВОДШШ, СООТБвТСТВВННО, Ш (Daeert. Ehrlich. 1979, КЛОНИрОВаНЕЭ ДНК. ЦЭТОДН.1988, Burgers and Percival, 1987).

Анализ ПТВ1Ш0В на наличиэ плвзюдной ДНК, а такав обработку рестриктазами, щелочной фосфатазой, нуклвазой Ва131. кленовскшл фрагментом ДНК-полимэразы i в.сои. лигазой фага Т4, разделение фрагментов ДНК в агарозном геле проводили, как описано в (Маниатис и др., IS84).

Полупрепаративное выделение ДНК шшзкид проводили по методу (Davis et ai.. 1980). Препаративное выделение плазмидныг ДНК проводили согласно (Bimbo in. Holy. 1976). ВЫДВЛВНИВ ДНК ИЗ клеток c.thermoceiium проводили по методу, описанному ранее (Ирй И др., 1988).

Реакцию так-трансляции, перенос ДНК на нитрацеллмоаные фЗЛЬТрЫ, ГЕЕбрИДИЗафВ ДНК-ДНК ОСУЩеСТВЛЯЛИ ПО (Heinfcoth. Wahl. 1984).

При тестировании геномной библиотеки с. thormoceiium на наличие рэкомбинантов, приобретших цэллншолитичвскую активность, использовали чашечный тест (Theater, Wood. . 1982). ОПрОДЭЛВНИЭ активностей ферментов проводили согласно (Nelson, 1944, Ait et al.. 1982, Kyxiacon et al., 1987 ) .

Получение мшш-клеток б. coli и включение э=а-штшнина проводили В СООТВВТСТВИИ С реКОМВНДВЦИЯМИ (Stoker- et al.. 1984). ДНСК—ЭЛЭКТрофОрвЗ белков ПрОВОДШИМЮ (Laamll, 1970).

Кроличьи анти-тела относительно /з-глшозидазы В C.thermocellum. ОЧИЩВННОЙ ИЗ рвКОМбШаНТНОГО штамма Б.coli JU109 CpCU201 ) получали в соответствии С рашжендацшши (Chase, 1987). ИММУНОКОМПЛВКСЫ визуализировали ПО (Towbin et al., 1984).

- 5 -

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ I. Конструпроваше шижотена С. therraocellum f7 и анализ

рексжбанантаых cei+ клонов в клетках E.coii п в.subtiiis. I.I. Кокструпроввкяе клонотека С. therraocellun, идентп£икшрц1

и характеристика рексазбзншгпшх cei+ кланов. Тотальзуп ДНК c.-tharmoceiium обрабатывала рэстриктазой Ssu3i в условиях неполного гидролиза и после препаративного электрофореза в агарозном гелэ (0,8%) элвзровали фракцию (|рагкэнтов размером от 2 до 5 тпн. Полученный препарат датировали с ДНК вектора рШ4 (рис.1). Посла трансформации клеток в.сои лиют было отобрано 6000 рэкомбшантннх дра-клонов. В тестах с использованием в качестве субстратных аналогов кврбонсиггеталцвллишзн (КНЦ) и штилукбеллгфершщелшбпозцда (ИУЦ) было ндвнтгфгцпрова-но 15 клонов, приобретши целлшшнтическуо (сеи активность (табл.1). Размеры вставоп ДИК, клонированных в составе плазмид серии рСЕ, колеблются в правдах от 2,2 до 4,4 тпн (тайл.1). Рестрикционный анализ позволнл достоверно выявить 7 различащих-

BwHJSmeLBemaL деИЛеЩВайШ

Т4~латм* иатшй памш ЗЩЗА траяоъфипп тчпяа» днк ОЛМгтоСвИит

е.соп Змюз

I.tabtllh we

EC. I. Схема конструирования геномного банка с.thermocellun FT.

Таблица I. Характеристика eel Г8ШВ C.thermocelluai.

размэр активность шшзмида вставки, на КМЦ, тш Е/мг* белка

активность размэр поляпептядов на ПНФЦ, в системе ыанн-Е/иг баша клеток s.coii. нДа

рСЕ102 2,3 1.3 0,13 52; 43; 42,5

рСЕ1602 2,4 1,0 0,06 52; 43; 42

рСЕ621 3,2 0,003 о' 75; 36

рСЕ623 2,3 0,2 0,02 52; 43; 42,5

pGEI6I 3,4 0,02' 0,003 43

РСЕ1603 3,4 0,02 0,003 43

PCEI5QI 4,4 0,004 0 80; 51; 43; 42,5

PGEI502 2,0 0,008 0 51; 42; 41

pGEIOG 2,5 0,002 0 но

рОЕЗШ 4,4 0,004 0 80; 51; 43; 42,5

pCEI6GI 3,2 ОД а 46; 43; 40,5

рСЕ681 2,3 0,25 0,004 52; 43; 42,5

PCE682 2,3 0,3 0,008 52; 43; 42,5

pCÉ69I 2,3 0,1 0,002 52; 43; 42,5

pCEI22 6,0 0 0,27 85

ся мевду собой по распределен™ сайтов узнавания рвстрактвзаю генов андоглшаназ (шшзмида pGEI02, p0EI06, рСЕ161, рСЕБ21, PGEI50I, pCEI502, pOEI6QI). В экспериментах по субклошхрованш показано, что достаточно высокий уровень КМЦазяой актшшост! сохраняется независимо от ориентации вставки относительно р1<ц вектора клонирования, что указывает на наличие во всех изучо-яш: случаях собственных прошторных последовательностей ДНК, аффективно утилизируемых транскрипционным аппаратом e.coii.

1.2. Перенос рекомбанантиых шазавд рСЕ и экспрессия eel генов в клетках в. subtnis iea.

Рекомбинантныа плазмзды серии рСЕ трансформировали в клвтк в.sub-tills; подученные cm" трансформанты а случае pCEI602, pGEII и рСЕ1501 проявляли КЫЦ-азвую активность, значительно превышав-

щуп фоновую активность в.зиъ-ьшз: в 2-х случаях (рСЕ1601 и рСЕ1502) не было обнаружено превышения эндогенной активности реципиента. Только в случав рСЕ1602 частота трансформации клеток B.subtiiis била сравнима с частотой трансформации ввктором рМК4 (I03 сшя-клонов на I ккг ДНК), в случае рСЕЮ2 и pCEISOI частота трансформации была снижена на 2 порядка, а в случае рСЕ1601 и рСЕ1502 наблвдалось появление только единичных трансформантов.

Скиринг стя-трвнсформантов в. oubtiiia 168 выявил значительную структурную нестабильность рекокбинантных плазмид. Только в случае наиболее аффективно трансформирующейся я относительно стабильной рСЕ1602 удалось зафиксировать значимый уровень зндоглиь каназной активности, обусловленный экспрессией внесенного гена (0,03 ед./мг).

1.3. Анализ ta5si -г«ечешх полппептидов, синтезярупцяхся в в иани-хлвгках е. coli на патрицах рекомбанантных плазмад серии рСЕ.

Как видно из рис.2, на матрицах рекомбинантных плазмид серии рСЕ в мини-клетках в.coli помимо полппептидов, кодируемых векторной чвстьв, в большинстве случаев синтезируется три поли-

06

45

38 29

17,8-

Рис.2. Авторадиограмма ["з ] -кетиошга-меченых полипептитцдов, синте-зирунцихся в мини-клетках в.coli на матрицах рекомбинантных плазмид серии рСЕ. I-PCEI6QI, 2-рСЕ102, 3-pCEI6I, 4-рСЕ1501, 5-pCEI5D2, 6-pCEIGQ2, 7-pGE68I, 8-рСЕ621, 9-рМК4.

I 23450700

пептида, соответствующих продуктам cei-генов (Табл.1).

Однако, размеры клонированных нами вставок (от 2,2 до 4,4 тон) в общем случае не достаточны, чтобы предполагать наличие в каждом случав нескольких индивидуальных генов (подробнее п.2.1).

2. Анализ экспрессии ЭНДОГЛЕКШШ311 I С. thernsocellum F7.

2.1. ¡¿олекулярно-генетический анализ гена эндоглпканазы

ceil, клонированного в составе рекоибинантной шшз^пдш рСЕ102.

Проведенный наш гибридазационный анализ рекомбинантных шгазмад серии рСЕ методом ДНК-ДНК Слот гибридизации показал, что в случае нативного препарата тотальной ДНК с.thermocellum обнаруживается гибридизация только с хромосомной ДНК. Не были зафиксированы дополнительные сигналы, могущие свидетельствовать о наличии ГОМОЛОГИИ С природными плазмидами с. thormocellum FT. присутствующими в препарате тотальной ДНИ. В экспериментах в качестве а2Р-меченых зондов ДНК использовали последовательность ДНК, клонированную в составе pCEI02 (ceil ген). Из 12 cei генов 8 обнаруживают значительную степень гомологии с геном, клонированным в составе рСЕ102.

Необходимым представлялось провести сравнение клонированного нами cell гена с cei-генами, отобранными ранее другими исследователями. Для сравнительного анализа нам любеано была предоставлена коллекция cei генов французской группы исследователей (Beguin et ai.» 1987) из ин-та Паствра. Нами был проведен ДНК-ДНК дот-гибридизационный анализ, который показал, что коллекция cei—генов из ин-та Пастера не содержат клонированного нами ceil гена. Слабая степень гомологии была обнаружена с рекомбинантными плазмидами рСТ1202, рСТ105. рСТ802.

Т.к. рекомбинантная илазмида рСЕ102 в клетках в.оон была нестабильна, для последующего анализа клонированный в составе рСЕ102 ген андогдиканазы сен был субклонирован на векторах pucia и pKNi. 8635 андоглшаназной активности у штамма в.сои анюдсркквюг) после осматического шока обнаруживается в среде, что свидетельствует о периплазматичвекой локализации андоглша-назн I. Контролем в опыте служило параллельное определение во фракциях периплазматичвекого фергйэнта щелочной фосфатазы.

В экспериментах по опрвдвлешт активности КЩ в условиях индукции промотора р1 ае векторов клонирования било определено направление транскрипции для гена эндоглюканазы, (рис.3). О цвлью локализации структурной и регуляторной областей гона сеп была проведена серия делецноншн субклонирований (рис.3). Предполагаемая регуляторная область сен гена была локализова в пределах 400 пн Зша1-Н1л<шх фрагмента.

ПШ Пай за VI !Ш S3 2ИЕЛП п п

_1_I_LLLfi_I_I 1,1, ,1 I,

=с> ы

eel* eel"

123 =

=>И eel*

=>и eel* »И eel'

а

о

?ис. 3. Физическая карта фрагмента ДНК рэкомбинантной плазкиды рСЕЮЗ, содержащего ген эндогликаназы сен. В низшей части рисунка показаны делеционше варианты и соответствующие фвштипырекокбинантных клонов е.сс1Шeg. Обозначения: HXII-HindXII. Sml-Smol, ЫХ-MluI, AI-JLLuI.

VX-YspI. ЗЗ-ЗаиЗЛ. HXX-HlticXX. BI-EcoEI.

В шниклзтках s.coii на матрице рекомбинантной шазмяда ¡CEI02 помимо голипептидов, кодируемых векторной часты), ящтезпруится такзэ три новых полипептида с н около 52, 43 и 2,5 кДа. Для кодирования трвх полипе гггидов в составе ндивидуальных генов примерная вставка ДНК должна быть оценена рикерно в 4,5 тпн, в то время как реальный размер был определен :ar,3i в 2,3 тпн. Более того, область, необходимая для обеспечения цдоглнканазной активности, локализована в пределах 1,7 тпн РИС.3). Уч&ТЫВаЯ, ЧТО ЭНДОГЛШКанаЗЫ С.thermocollum являится ипичныш экзобелк8!.е1, возможно полагать, что первичным рансляцконшм продуктом гена ceix является обнаруживаемый наки ьини-клвтках в.coil полипептцц с массой 52 кДа, который

- IQ -

подвергается дальнейшему процессингу с образованием зрелого белка (полшвптиды в 43 и 42,5 кДа).

2.2. Очистка и характеристика эвдсгл^ишазы i c.thermoceiium.

Данная часть работы била выполнена совестно с сотрудником ИВИ1 РАН Н.П.Головченко. Был разработан эффективный способ очистки андоглшаназы х из рекомбвнантного шта&ага е.coli сьоо [pKNEi02) стабл.2), основной стадаэй которого является хрсжатография на Toyopeari НЯ-50У. После хроматографш препарат «дерзал два шлишптида с блвзктгз тлэкулярныш кассами около 41 и 42 кДа, что в пределах точности штода совпадает с результатами анализа ceil гена в систега кинз-клвток e.cgIi. Полипе птада удалось разделить хроштофокусированивм на высокоэффективной колонне иопо р не 5/го в диапазона pH 5,5-4,0. Изофораы аадрглшаназы мало отличатся друг от друга как по физико-химическим, так и по ферментативным свойствам (табл.З). Необходимо ответить шсокув у да льнул активность форг.шпта и его уникальнув. термостабальгость - время полуаизни при 65° С составляет около 100 суток, что превышает теркостабильность любых известных к настоящему враьшни зндоглшсаназ и делает ее привлекательной с точки зрения бдатехнологического использования.

Таблица 2. Очистка ацдоглзканазы i c.thermoceiium

фракция объем белок, уд. акт., выход, степень

фракции,ил кг Е/мг белка % очистки

1.Гомогвнат

клвток 225 1057

2.Термообработке 215 495 З.Осаздвнив сульфатом анмония

(45% насыщения) 20 240

4.Хроматография Toyopeai-1 HW-5QP 32 77

5,3

13,3 117 2,5

33 96

141 6,2 131 18

- II -

Таблица 3. Свойства зндоглнсапази х с.-ыюгшосеИшп

молекулярная рН- удельная активн., Е/мг

пзофор.м масса балка. опт. Р1 КЩ цэлло- аморфная ПНФЦ

кДа дэкстрины целлшюза

Энд-1 41 6,5 4,45 94 104 3,3 2,4

Энд-2 42 6,5 4,5 108 119 3,8 2,7

3. Нолекулярзю-бнологическнй анализ экспрессии /з-глпкозидазы

В С. 1Ьегшасе11иг» ¥7.

ГЭН Ъд1В. кодирующий р-ГЛГООЗПДаЗУ В СЛЬэтшосвиш. был нэзависимо клонирозан в различных группах исследователей

(СгаЪп1^г ей аХ. , 1983; Еошап1эс о1. . 1987; КасЗат et а1.,

1эеа. Пирузян и др., 1385), в том число и наш в состава рекомбинантной плазгяэды рСЕ122.

Рапе о в клетках в.соисрсиго1) -наблвдали суперпродукцию /з-глшЕсозцдазной активности под контролем собственного проштора гена ъ&ш. Наряду с сугорэкспрессией откачали гетерогенность полипвптцдеого состава в кшнп-клетках е.сои. содержащих рекокбинантннв плазшады с ъехв геном. Была получена делеция разгром 73 ак остатков с С-конца продукта гена (рсгш), приводящая к сннгенст тэгяюратурного оптимума и удельной активности /э-глпкозидазн В (Катаева и др., 1990).

3.1. Доказательство гега-спэцгфзчноста обнаруштаеных в ггазш-клетнах е.со1д "з-неченых полипептидов.

Лкзаты образцов кннн-клэток е. сои. содержащих рэкокбинантные шгазглзды рсиго1. рсл41. подвергали электрофорезу в збз-ПААГ, и белки из геля переносили па нитроцеллюлозный фильтр, который затем обрабатывали кроличьими антителами против /з-глшозцдазы (рис.4А) для визуализации гецо-спвцифичных полипептидрв. После этого фильтр авторадпографаровали для визуализации "з-шв-ь-кочвнпых полипептидов (Рис.4В). Как можно видать из рисунка, картина распределения шялунокомплэксов и "з-те-ь-белков идентична вплоть до уровня 35 кДа, т.е. обнаруживаемые в

- 12 -

шлапвптида является продуктами гена ъдхв.

12 3

94 67 43

к.

1 2 3

30

А В

Рис.4. Икауно-блот (А.) и ввторадаограша (В) ["аз-кэтионин-ыечвных полилоптидов, спнтозируицихся в шши-клетках в.сои. 1~рсиго1 №е1В). 2-рсплг съехоч. З-ристэ.

3.2. Участие протеаштичекюго аппарата клетки в образовании тожественных форы продукта гена Ьд1в.

Рекомбинантные плазкида рсиго1 и рмва1 с с?л. раздал 3.3) были трансформированы в хоп-ыутант б.сои ухэоз и мутантннй штакгз в.виышв АЛ73. характеризущиеся сниманием протеолЕГической активности (сьипе et а1..1983; Еонантас и др.,1388). В случав рекомбинантннх штамков ть903 (рсиго1) и алз Срша1) ннблвдаетсп как возрастание ^-глшозидазной активности в сравнении с обычными штаммами е.сои ж в.симшв стабл.4), так и существенное снижение количества обнаруживаемых икнунокошлексов в случае шташа тшоз [рсиго!) в сравнении с ллоэ (рсиго1) с Рис.5). Т.е. наблвдаемая наш в гетерологичжш хозяина е.сои гетерогенность продукта гена ъеш. по крайней кера частично, является результатом ограниченного протеолиза. Следует откатить, что атот протеолпз шгет являться ответом клэтки-хозяша на нежелательно высокий уровень синтеза чужеродного балка, тегл

- 13 -

Таблица 4. Уровня /?-глшозидазных активностей

ятя'.п (плазкцда)

активность

С. 41шппосв11иш ЭТ з.сон ¿ию9Срсиго1) 71903 срсиго1) НВЮ1 (рсий2)

оНЮ9СрСБ41 ) Л£Ю9СрСВ411 ) в.виьгша 1бесрнво1)

АЛ73 [рыва1 )

1бвсркваг) 1бв

3. сот©тг1а1ав Ср^-Ш5-Ъд1В • ) З.сегелг1а1ав

0,0? ОД/МЗН/МГ 2,30 ед/гаш/ря1 4,30 ед/кан/мг 0,40 8Д/КИН/ИГ 0,60 ед/шн/нг 0,25 вд/ивн/нг 0,09 вд/кзн/шг 0,13 8Д/К2Е/МЛ 0,15 вд/гош/кл 0,02 ВД/Г.ЯНЛш 0,01 8Д/Т.ВШ/МЛ 0,006 ОД/РЛИН/МЛ

12 3 4

94' 674330-

в*5-?

Рис.5. йкцуно-блот клеточных

лкзатов: 1-Е.со11 ¿Ш09СрПС19)

2-в.соИ лыю9Срсиго1).

3-В.соИ "7X903 (рсиг01 ).

4-С. «шгтосе11ит "37.

Золве, что уровень ^-глжозцдазной активности в рэкокбзнантных

ПТвКЛНХ З.соН ПОЧТИ ИЭ дез ПОрЯДКЯ ЕШ9, ч6н В ЕСЗОДЕОМ ШТа!.".® 3.1;1гвгпюс011ит Р7.

Однако, при обработке образцов рекоргбшантных штагязов з.соИ. содвргвцих шшзкяду Рсиго1 (Ьззв гэн) и оттзя с.ашппо-;в1Хига РТ аНТЛТЭЛа'га против /Э-ГЛВЯОЗДДЕЗЫ В, В метках С.-ЬЬеггао-;опиа гокеш Егдуиоко'лшгекса, соогв8 тствупцего по голвкулярной

масса белку, очищенному из ракоибинатшго штамма E.coiicpcu201). обнаруживается полосы связывания с антителами меньшей молекулярной массы (рис.5). Отсутствие полос связывания в контроле (E.coii jMio9(pMK4)) свидетельствует о спэцЕфнчгостп антител. Таким образом, гетерогенность продукта гена наблвдается не только в гетерологичном, но и в гомологичном хозяине.

3.3. Сравнительный анализ экспрессии генов bgiB и ьдхв* в клетках в. subtnis.

Для дальнейшего анализа экспрессии /э-глшозцдазн В ген ъе1в был клонирован в клетки B.subtnis с использованием мультикопийного вектора ривпо свгоп. ьихеи, isas). В случае обоих рекоггбшшнтных штаммов E.aubtiiis 168срЦво1), где влазмпда pubgi содержит последовательность bgiB гена, и 168(рмшг) (bgiB-ген) откачено повышенна /э-гликозндазшй активности по сравнения) с раципиэнтным штаммом (табл. 4).

Как шшо видеть на рис. 6, гз-глвказцдззная активность в рекокбинантных штаммах B.subtiiis сопровождает клеточный рост, максимальный уровень достигается в начале стационарной фазы.

А R .

А 690 >* -ГЛЮЖОаНД4ва В В ^

speia ч

Рис.6. Изменение локализации внутри- и внеклеточной ^-глшози-дазной активности в процесса роста рэкомбинантныг штакмов B.subtiiis 16SCPUBQ1) (Д) и 16B(pKBG2) (В). Обозначения: ■ - оптическая плотность со=4Ю, * - внутриклеточная /5-глшозидазная активность, + - внеклеточная /з-глтозидазная активность.

я

5атем наблюдается уменьшение уровня внутриклеточной активности I, соответственно, увеличение внеклеточной активности. Наблцда-этся некоторые различия в характере экспрессии мезду дикого типа [pHBGi) и мутэнтпой (рмваг) ^-глшозидазами. В случае pMBG2 >ткзчено 2-кратное увеличение общей /з-глшозидазной активности, 'лавнш! образом за счет повышения внутриклеточного содержания. 5нзкл8точЕне количества /з-глшозидазной активности в B.subtiiia :68(PHBG1) и I68(piiBG2) сравнимы.

3.4. Клонирование п анализ зкспрсссш bgiB п ьд1В' генов в клетках s. cerevisiae.

Данная часть работа выполнялась в раглках совместного проекта :езду J2JT (Чандигарх, Индия) и ИБН (РАН). Для работы нам был гредоставлен челночный (S.cerevisiaa-B.coli) ЭКСПрвССИруЩИЙ ;эктор рААН5 (Vectors. 1985), ВОЗЯЩИЙ КОНСТИТУТИВНЫЙ ПрОШТОр 1adc1 алкогольдагпдрогвназы. Схема конструирования и стратегия

EcoSV

ScoRV

BctjRV

bs!B: Srnal+Sell, Ь^Ш': Веой,

в«дел. 57 о фц ъьщвп ев

сбрей. !Отз:;ова cipafl, фр. Клгпога

ГооЛ

рвстршщи ЕПпсЩ обработка ¿рвгиввхо* Кленова

Тралсфоркацш Е.соЦ Театародоше Ар*трляо^<зрыантов р ~'ГТВОДООНДШЯ^^Ю взспЕвтсть

Выделяли ДШС нсР^клокоа Рвстрггцгоннкй анализ структуры ДПК Трыгсфсртцяг асеиягЫм Тестхрсгазх» трвнс$орн&ягов йа ^Л-глюгоэздазЕу» аЕксвгость

нс. 7. Схема конструирования рекоггбинантных нлазкад, содержащих ген гэ-глЕгсозвдазы В, на основе вектора рдднб.

- 16 -

тестирования рекомбинантных клонов представлена на рис.7.

Рестрикционный анализ рекомбинантных ДНК в отобранных BgiB+ клонах показал, что только в 2-х случаях из 12 ген /з-глхкозидазп клонирован в прямой относительно pjujci ориентации. При трансформации клэткок з.cerevisiae в случав плазмида, содержащей bgiB* ген в прямой ориентации, не удалось обнаружить превышения /?-глтозидазной активности над фоновой. При дальнейшем анализе ВЫЯСНИЛОСЬ, ЧТО В клетках 3.cerevisiae ПРОИСХОДИТ ДВЛВЦИЯ рекомбинантной плазмиды с потерей вставки.

Конструкции, содеркащив bgiB' ген в противоположной относительно pADC1 ориентации, были стабильны как в e.coii. так и в s.cex-evisias. При трансформации данными конструкциями з.cerevisiae было зафиксировано превышение уровня фоновой /з-глшозидазной активности в 1,5 раза (табл.4), то есть бактериальный промотор bgiB гена способен утилизироваться PHK-Полимеразным аппаратом S. cerevisiae.

ВЫВОДИ

1. Сконструирована библиотека генов анаэробной, термофильной, целшшюлитической бактерии Clostridium thermocellum Р7. Идентифицированы 7 cei генов, кодирующих различающиеся андоглю-каназы, и I ген, кодирующий /s-глшозидазу В.

2. Показано, что cei х ган кодирует новую, ранее не описанную андоглхканазу i. Подучен рекомбинантный штамм супер-продуцент В.coll СбООСрКНЕ—102 ) андоглшаназы Х C.thennocellum FT.

3. Из ракомбинантного штамма e.coii сьоо cpknb-ios) очищена и охарактеризована андоглшканаза х с.thermoceiium Р7. Выделены 2 изоформы форманта и продемонстрирована его уникальная термостабильность.

4. Показано, что экспрессия ^-глюкозвдазы В с.«шгпюсеххиш Р7 характеризуется гетерогенностью продукта гена в клвтках гомо-и гетерологичных бактерий-хозяев. Показан xon-зависнкый характер гетерогенности в клетках s.ooii.

5. Показано, что собственные регуляторные сигналы гена /э-глнкозидазы В с. thexmocexxum Р7 обеспечивают экспрессии ^з-глшкозидазы в клетках не только прокариот (e.coxi. B.subtills). НО И В клетках a. cerevisiae.

Основные работы по теие диссертации:

1. Головченко Н.П., Катаева И.А., Еухтиярова М.Г., Амшов '.И., Цой Т.В., Акименко В.К., Воронин A.M. Выделение и вкоторыэ свойства тврмостабильной андоглшаназы из E.coii сьоо pKNE-102). кодируемой ГЭНОМ Clostridium thermocellum. БИОХИМИЯ, 991, т.56, вып.1, с.49-54.

2. Цой Т.В., Еухтиярова М.Г., Амшов Р.И., Головченко Н.П., :атаэва И.А., Кошелева И.А., Акименко В.К., Воронин. A.M. .локирование И вкспрессия генов целлншаз Clostridium hermocellum Р7 В КЛеТКЭХ Escherichia coli И Bacillus ubtiiis. Генетика, 1990, т.26, н.8, с.1348-1360.

3. Аминов Р.И., Еухтиярова М.Г., Грибанова Л.К., Головченко :. П., Катаева И.А., Цой Т.В., Акименко В.К., Воронин A.M. зонирование, аКСПреССИЯ Гвна ЭНДОГЛШанаЗЫ Clostridium hsrmoceiium в гвтерологичных системах. В сб. тезисов ковф. НоВ:J о направления биотехнологии", Пущино, 1988, с.15-16.

4. Головченко Н.П., Катаева И.А., Аминов Р.И., Даавахишвили ;. Д., Еухтиярова М.Г., Цой Т.В., Акименко В.К., Воронин A.M. чистка и характеристика цэллюлолитических ферментов .thermocellum ИЗ рВКОМбИНЗНТНЫХ ШТВММОВ E.coii И B.subtllis.

сб. тезисов конф. "Ноше направления биотехнологии", Пущино, 988, с.16-17.

5. Tsoi Т.Т.. DJhavakhishvili Ts.D., Bukhtiyarova M.G.. cnashevslty A.U. . Katayeva I.Д., Golovchenko N.P. . Kuzmin N.P.. iiimanlco Т.К.. Boronin A.M. Stractural and functional analysis I the Clostridium thsrmocellum P7 gene Ьд1В encoding —glucosidase. 6th International Symposium on Genetics of ndustrial Hicroorganisms GUI 90. Abstract book. p.98.

II.XI.92r. Зак.5200Р Тир. 125 экз. Уч.-изд.л.-I.O

Отпечатано на ротапргите в ОНТИ ШЦ РАН