Рекомбинантные геномы вакцинно-родственных штаммов полиовируса

Короткова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рекомбинантные геномы вакцинно-родственных штаммов полиовируса
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантные геномы вакцинно-родственных штаммов полиовируса"

На правах рукописи

Короткова Екатерина Александровна

РЕКОМБИНАНТНЫЕ ГЕНОМЫ ВАКЦИННО-РОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ПОЛИОВИРУСА

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в отделе взаимодействия вируса с клеткой НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ им. Ломоносова и в лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

член-корреспондент РАН и РАМН,

доктор биологических наук, профессор Агол Вадим Израилевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук,

профессор Альштейн Анатолий Давидович

доктор биологических наук,

профессор Доброе Евгений Николаевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт вирусологии имени Д. И. Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится « 14 »декабря 2006 г. в 10— часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, Лабораторный корпус «А».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 13» ноября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Н. О. Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В 1988 году Всемирная Организация Здравоохранения провозгласила Программу глобальной ликвидации полиомиелита, главная задача которой - прекратить циркуляцию диких штаммов полиовируса во всем мире. Основным оружием в борьбе с полиовирусами дикого типа является живая вакцина, содержащая ослабленные штаммы полиовирусов всех трех серотипов, которые обычно не вызывают заболевание, но способны выработать устойчивый иммунитет к полиовирусной инфекции. Применение живой вакцины позволило остановить циркуляцию диких штаммов полиовируса в большинстве регионов мира, снизить уровень заболеваемости полиомиелитом на несколько порядков. Однако, быстро эволюционируя, вакцинные цггаммы в процессе репродукции в желудочно-кишечном тракте человека зачастую приобретают нейровирулентность и способность к длительной трансмиссии, характерные для диких штаммов. Эти свойства делают их эпидемически опасными. Подтверждение тому - зафиксированные вспышки заболевания паралитическим полиомиелитом, вызванные измененными вариантами вакцины. Нельзя исключить, что в случае победы над полиовирусами дикого типа их место займут полиовирусы вакцинного происхождения. В связи с этим изучение измененных вакцинных штаммов, механизмов и закономерностей их эволюции в настоящее время является чрезвычайно важной задачей.

Существуют два основных механизма изменчивости полиовирусного генома -накопление мутаций и рекомбинация. Известно, что некоторые мутации играют адаптивную роль в эволюции полиовирусов, способствуя повышению их жизнеспособности. Биологическое значение рекомбинации неясно до сих пор. Настоящая работа посвящена изучению природы образования рекомбинантов и особенностей их распространения в человеческом сообществе.

Цели и задачи исследования

Одна из целей данной работы - с помощью анализа рекомбинантных штаммов полиовируса вакцинного происхождения ответить на ряд вопросов, имеющих эпидемиологическое значение: установить или опровергнуть родство между изолятами, определить их происхождение и «возраст».

Другая цель - ответить на вопрос о причине селективного отбора рекомбинантных штаммов (которые преобладают над нерекомбинантами среди изолятов, выделяемых от реципиентов вакцины).

В задачи работы входило:

- провести эпидемиологическое исследование случаев трансмиссии рекомбинантных штаммов полиовируса вакцинного, а также вакцинного/дикого происхождения;

- проанализировать природные изоляты полиовируса с целью выявления рекомбинантов;

- определить координаты точек перекреста рекомбинантных штаммов;

- установить закономерности организации геномов рекомбинантов трех серотипов;

- на основе полученных данных выдвинуть и проверить предположение о возможной причине селективного отбора рекомбинантных штаммов;

- на конкретном примере установить, способна ли рекомбинация без дополнительных мутаций обеспечить полиовирусу селективное преимущество.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе показано, что прекращение вакцинации от полиомиелита приводит к быстрому распространению и широкой циркуляции среди населения производных вакцинных штаммов. Выявлены сильно измененные варианты вакцины в регионе с высоким уровнем специфического иммунитета у населения. Зафиксирован начальный этап трансмиссии и изменчивости производного вакцины. Показана независимая эволюция нескольких вирусных популяций в организме иммунодефицитного ребенка. Выявлены и исследованы рекомбинанты между штаммами полиовируса вакцинного и дикого происхождения (или энтеровирусами кластера С). Полученные данные имеют важное эпидемиологическое значение для разработки стратегии завершающего этапа Программы ВОЗ глобальной ликвидации полиомиелита.

В работе проведен детальный анализ коллекции природных изолятов полиовируса. Впервые исследована возможная причина селекции вакцинно-родственных рекомбинантных штаммов полиовируса. На конкретном примере показано, что рекомбинация без дополнительных мутаций может негативно отражаться на фенотипе штамма Сэбин 3.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ. Материалы исследований были представлены на 6-ти международных конференциях. Диссертация была апробирована на объединенном семинаре отдела взаимодействия вируса с клеткой НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М. В. Ломоносова и лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 186-ти страницах машинописного текста и содержит 43 рисунка и 20 таблиц.

Список сокращений

ВАПП - вакцинно-ассоциированный паралитический полиомиелит ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

МАВР — метод анализа вирусных рекомбинантов (с помощью микрочипов)

НТР - нетранслируемый район

ОПВ - оральная полиовирусная вакцина

ПДРФ - (метод) полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для решения поставленных задач было исследовано 107 производных вакцинных штаммов полиовируса, выделенных от больных полиомиелитом и другими заболеваниями, здоровых людей и из объектов окружающей среды (все штаммы полиовируса были получены в Национальной референс-лаборатории по полиомиелиту РФ в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН и в Национальном референс-центре по полиомиелиту Республики Беларусь). При помощи ПДРФ-анализа и олигонуклеотидных микрочипов (МАВР-анализ, выполненный Е. А. Черкасовой в

Администрации по надзору за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами, США [Cherkasova et al., 2003]) у 70% изолятов была выявлена рекомбинантная организация генома. Определением нуклеотидной последовательности, осуществленным методом дидезоксинуклеотидной терминации цепи с использованием набора «fmol® DNA Cycle Sequencing System» («Promega»), было установлено местоположение 87-ми районов перекреста.

Анализ рекомбинационных изменений геномов производных вакцины (в совокупности с мутационными изменениями) позволил решить различные эпидемиологические задачи: выявить параллельную эволюцию в одном организме нескольких вирусных популяций, установить или опровергнуть родство между вариантами вакцины, циркулирующими в одном регионе, уточнить происхождение и возраст изолятов (или отдельных фрагментов их РНК).

Одновременная эволюция независимых популяций производных вакцинных штаммов в одном организме. Внутритиповая рекомбинация.

Нами был исследован случай заболевания ВАПП в детской больнице г. Саратова. От ребенка 1 г. 8 мес., не получавшего ОПВ, и имеющего отклонения в работе иммунной системы (гипогаммаглобулинемия) были выделены варианты штамма Сэбин 2 на 3-й (PV2/3d), 60-й (PV2/60d) и 78-й (PV2/78d) дни после начала заболевания. Уровень замен, накопленных первым изолятом на разных участках структурной части генома, сильно варьировал. В районе VP1 была зафиксирована единственная замена, в то время как на участке VP3 уровень мутаций соответствовал примерно 6-7-ми месяцам эволюции от вакцинного предка. Изолят PV2/60d за 2 мес. дивергенции от штамма PV2/3d приобрел только 3 дополнительные синонимические мутации на участке длиной 2430 нт., что согласуется с обычной скоростью эволюции полиовирусов. У третьего изолята (PV2/78d) на участке VP3 появились 2, а на участке VP1 - 3 дополнительные синонимические мутации, однако район генома VP2 изменился сразу по 6-ти нуклеотидным позициям, не приведшим к аминокислотным заменам (Рис. 1). Между штаммами PV2/60d и PV2/78d, выделенными с интервалом в 18 дней, было выявлено 19 нуклеотидных отличий (из них 14 синонимических) в районе VP2-VP1. Полученные данные свидетельствуют о том, что, по крайней мере, отдельные участки геномов этих двух вариантов вакцины достаточно продолжительное время эволюционировали независимо друг от друга.

Существенные различия в степени дивергенции от штамма Сэбин 2 разных фрагментов капсидной области изолятов логичнее всего объяснить внутритиповой рекомбинацией между слабо и сильно измененными вариантами вакцинных полиовирусов серотипа 2, одновременно реплицировавшимися в организме ребенка.

Рассмотренный пример также показал, что анализ лишь одного сегмента генома УР1 (по уровню дивергенции которого принято оценивать «возраст» производных вакцины) иногда может привести к неверным выводам о степени эволюции и потенциальной опасности изолята.

т.-60 — —752Г2И

1—х:- кЧЧЧЧ" чЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧ -К1

ж А ; А А А А; о 1 1 1 ' ! ; 1 1 ' ! : 1 1 1 1 : " -1000 1200 1400 1600 (ЯОО 21ХЮ 2200 2400; 2600 2800 ЗООО 3200 :

Рис. 1. Схемы фрагментов геномов изолятов РУ2/3(1, РУ2/6(М и РУ2/78(1. Темные треугольники обозначают общие для всех трех штаммов синонимические замены по сравнению со штаммом Сэбин 2, светлые треугольники - дополнительные синонимические мутации, накопленные изолятами РУ2/60(3 и РУ2/78<1. По вертикали отложены дни после начала заболевания, по горизонтали - нуклеотидные позиции. Заштрихованы отрезки, предположительно, произошедшие от сравнительно сильно измененного варианта штамма Сэбин 2.

Структура рекомбинантных геномов — показатель родства между штаммами полиовируса

Рассмотренные выше изоляты, возможно, обладали повышенной способностью к трансмиссии. Варианты штамма Сэбин 2 были выделены не только от заболевшей девочки, но и от 4-х из 5-ти контактировавших с ней здоровых детей и из больничных сточных вод.

Исследованные изоляты, как и штамм РУ2/Зс1, имели на участке VI1] единственную мутацию 112927—(адаптивной природы), что соответствовало самому раннему этапу эволюции вакцинных штаммов. Для всех изолятов была выявлена рекомбинантная структура генома (Сэбин 2-Сэбин 1). Совпадение координат точек перекреста (6271-6305 нт.), а также общие синонимические мутации в УР2 и УРЗ районах позволили подтвердить общее происхождение этих вариантов вакцины.

Проведенное исследование позволяет заключить, что одним из факторов риска распространения дериватов ОПВ являются детские дома и больницы, в которых санитарные условия зачастую далеки от требуемых, и возможен контакт между детьми разных возрастных групп, разного иммунного и вакцинного статуса. Данное наблюдение нашло подтверждение и в следующем исследовании.

В детской больнице г.Пермь осенью 1999г. от ребенка 7-ми месяцев с диагнозом ВЛПП и контактировавшей с ним здоровой девочки 4-х месяцев были выделены сильно измененные варианты вакцинных штаммов серотипов 1 (11262) и 3 (11264), соответственно. Уровень мутаций, накопленных изолятами, свидетельствовал о том, что они дивергировали от вакцинных предков на протяжении примерно двух и полутора лет. С помощью метода МЛВР и ПДРФ-анализа было установлено, что оба штамма являются рекомбинантами, структура одного из них - Сэбин 1 -Сэбин 2 -Сэбин 1, другого - Сэбин 3 -Сэбин 2 -Сэбин 3 (Рис. 2).

5'-НТР УР4 \'Р2 УРЗ УР1 2А 2В 2С ЗАВ ЗС ЗЭ З'-НТР

И262

Рис.2. Схемы геномов штаммов 11262 и 11264. Черным цветом обозначены фрагменты последовательности типа 1, серым - тииа 2, белым - типа 3. Вверху приведена схема генома полиовируса. В нижней части рисунка показано распределение замен по сравнению со штаммом Сэбин 2 на участке нт. 4567-6080 у изолятов 11262 (белые кружки), 11264 (серые кружки), черными ромбами помечены совпадающие мутации.

Принимая во внимание различия в организации геномов штаммов 11262 и 11264, несовпадение районов перекреста, а также отличия мутационных профилей произошедшей от штамма Сэбин 2 внутренней части геномов (нт. 4567-6080) (Рис. 2), был сделан вывод о длительной независимой эволюции этих изолятов.

Практически одновременное выделение двух несвязанных дериватов вакцины в одной детской больнице заставляет сделать предположение, что образование и длительная циркуляция таких измененных вариантов (даже в сообществе с достаточно высоким уровнем иммунитета) - более распространенное явление, чем считалось раньше. Благодаря массовой

вакцинации детей подобные дериваты пока не вызвали вспышки заболевания в нашей стране. Однако такое развитие событий вполне возможно для регионов с более низким уровнем специфического иммунитета у населения. Следовательно, в целях предотвращения эпидемий, вызванных дериватами вакцины (даже после элиминации диких штаммов полиовируса) вакцинацию против полиомиелита необходимо продолжать.

К такому же выводу мы пришли, проведя ретроспективный анализ вакцинно-родствекных штаммов полиовируса, выделенных в 60-х годах XX века в Белоруссии в ходе эксперимента по оценке продолжительности поствакцинального коллективного иммунитета. Начавшаяся в республике в 1959 г. вакцинация против полиомиелита была прекращена в Могилевской области в марте 1963 г. и возобновилась только в марте 1966 г. Спустя 2 года после прекращения вакцинации, в марте 1965 г. 40 детей из 6-ти детских учреждений г. Могилева были однократно привиты трехвалентной ОПВ. С мая по октябрь 1965 г. были исследованы пробы стула 392-х здоровых непривитых детей младше 3-х лет, не посещавших учреждения, где проводилась разовая вакцинация в марте 1965 г. Штаммы полиовируса серотипа 2 были выделены от 9-ти детей, 3 из них сохранились и были нами проанализированы. Кроме того, мы исследовали штамм полиовируса серотипа 2, также выделенный в Могилеве в январе 1966 г. от непривитого ребенка 1 г. 11 мес. с диагнозом «парез лицевого нерва».

ПДРФ-анализ, МАВР и секвенирование геномов показали, что три из четырех изолятов являются рекомбинантами, причем один из них имеет З'-часть генома невакцинного происхождения (Рис. 3).

Рис. 3. Схемы геномов «могилевских» штаммов. Серым цветом обозначены фрагменты последовательности типа 2, черным - фрагменты типа 1, белый соответствует участку генома невакцинного происхождения. Вверху приведена схема генома полиовируса. Указаны координаты точек перекреста.

Различия в организации геномов и несовпадение районов рекомбинации говорили о независимой эволюции данных полиовирусных изолятов. Об этом же свидетельствовали и накопленные штаммами мутации. Было сделано заключение, что в период прекращения

вакцинации на территории Могилевской области циркулировало несколько различных вариантов вакцинно-родственных штаммов полиовируса серотипа 2. Причем, наблюдаемый уровень дивергенции трех штаммов из четырех указывал на их длительную трансмиссию. Для штаммов 21120 и 21043 подсчитанное время дивергенции (6-7 мес. и 8-9 мес.) соответствовало их возможному происхождению от вакцинного вируса, внесенного в марте 1965 г. Два другие штамма 20003 и 20077, по всей видимости, были импортированы на территорию Могилевской области, причем один - до, а другой - значительно позже марта 1965 г.

Эксперимент, проведенный в Могилеве, продемонстрировал возможность быстрого возобновления трансмиссии полиовирусов, как вакцинного, так и дикого происхождения, при появлении прослойки населения, не имеющей специфического иммунитета. Поскольку один из сценариев завершающего этапа Программы ВОЗ глобальной ликвидации полиомиелита предусматривает полное прекращение использования ОПВ (без замены ее другой вакциной) вскоре после того, как во всем мире будет установлено отсутствие циркуляции диких полиовирусных штаммов, ситуацию в Могилеве можно рассматривать как модель недалекого будущего. Если произойдет случайное или умышленное внесение диких или вакцинных штаммов полиовируса в человеческую популяцию может произойти их быстрое распространение. За счет мутаций, а также с помощью рекомбинации (например, с энтеровирусами кластера С) аттенуированные вакцинные штаммы смогут приобрести нейровирулентность и способность к длительной трансмиссии, возникнет угроза новых эпидемий полиомиелита.

Дериваты вакцины, изолированные от иммунодефицитных больных

После прекращения вакцинации одним из вероятных источников полиовирусной инфекции будут больные с синдромом иммунодефицита, в организме которых несколько вирусных популяций способны репродуцироваться длительное время, рекомбинируя друг с другом [Kew et al., 1998; Martin et al., 2000 a; Yang et al., 2005].

Нами были исследованы два таких длительно эволюционировавших изолята. Один из них (5844, серотип 3) был выделен в Белоруссии, в 1960 г. от больного паралитическим полиомиелитом ребенка 2 г. 6 мес., к моменту заболевания получившим 3 дозы ОПВ. Этот штамм оказался множественным рекомбинантом, имеющим 3'-часть генома невакцинного происхождения и сегмент последовательности (район 2АС), полученной от варианта штамма

Сэбин 2. Отдельные участки генома значительно дивергировали от вакцинных предков (5 нуклеотидных замен на ~300 нт в области 2А).

Второй - дериват вакцины (19288, серотип 2) был выделен в 2002 г. от заболевшей ВАПП девочки 2-х лет, проживающей в Казахстане. В соответствии со стандартной схемой вакцинации ребенок получил 4 дозы ОПВ, последняя прививка была сделана за полтора года до начала заболевания. При этом у ребенка отсутствовали антитела к полиовирусам всех трех серотипов.

МАВР-анализ и полное секвенирование генома показали, что изолят является пятикратным рекомбинантом Сэбин 2- Сэбин 3 - Сэбин 2 - Сэбин 1 - Сэбин 2- Сэбин 3, накопившим от 1,3% до 2,9% нуклеотидных замен по сравнению с вакцинными предками на разных участках генома (Рис. 4).

_______4669-4673 6361-6386_

-1.6% ^. ...... , | -2.4% -1.3% |

3457-3497 5704-5720 6767-6776

Э'-НТР УР4 УР2 УРЗ УР1 2А 2В 2С ЗАВ ЗС ЗР З'-НТР

Рис. 4. МАВР-анализ и схема генома казахского штамма. Отсутствие или ослабление некоторых сигналов гибридизации говорит о наличии на данном участке нуклеотидных замен или точек перекреста. На схеме рекомбинантного генома серый цвет обозначает последовательность типа 2, белый — последовательность типа 3 и черный — последовательность типа 1. Для каждого фрагмента указан приблизительный процент нуклеотидных отличий от вакцинного предка. Приведены координаты точек перекреста.

Наблюдаемый уровень дивергенции согласуется с возможностью происхождения изолята или фрагментов его генома от самой первой дозы ОПВ, полученной ребенком вскоре после рождения. Хотя исключить внешний источник заражения также нельзя.

В районе рекомбинации, расположенном в области генома 2А (-30-40 нт.), было выявлено необычайно большое количество мутаций: 6, 5 и 6 по сравнению с вакцинными штаммами типов 1, 2 и 3, соответственно (Рис.5). Существует вероятность, что данный участок генома имеет невакцинное происхождение.

В настоящее время, когда Европейский регион (к которому формально относят и Казахстан) признан зоной свободной от полиовирусов дикого типа, выявление последовательностей (предположительно) невакцинного происхождения в составе

рекомбикантных геномов следует рассматривать как сигнал тревоги, требующий тщательного эпидемиологического расследования.

3457

3497

19288

Сэбин1 Сэбин2 СэбинЗ

ЛОСиСССиДСААААиииССЛАСиАССЛССиСССиЛСиСЛЛСЛЛСДиииССАААЛиОСиСиААССА

п-----и-----е—с.

о-

-и-----С---А-й—в-----А-

•иг

Рис. 5. Сравнение фрагмента нуклеотидной последовательности изолята 19288 (район рекомбинации 34573497 нт.) с аналогичными участками геномов трех вакцинных штаммов. Подчеркнут участок, относительно сильно отличающийся от штаммов Сэбина.

Среди проанализированных нами 107-ми полиовирусных изолятов вакцинного происхождения 70% имели рекомбинантную организацию геномов. Максимальный процент рекомбинантов наблюдался среди полиовирусов третьего серотипа - 86%. Несколько меньше рекомбинантов было зафиксировано среди изолятов второго серотипа - 68%. Доля рекомбинантов первого серотипа составила 35%.

С помощью секвенирования были определены координаты 87-ми районов перекреста для 47-ми межтиповых рекомбинантов. Полученная нами информация была объединена с ранее опубликованными данными о структуре геномов 73-х независимых рекомбинантных штаммов полиовируса вакцинного происхождения, для которых известны координаты 92-х точек перекреста.

Было установлено, что каждому из трех серотипов вакцинных штаммов соответствуют определенные предпочтительные схемы рекомбинации (сочетание и количество последовательностей разного типа в составе рекомбинантных геномов). Пять из семи рекомбинантов первого типа оказались двойными. Большинство рекомбинантных штаммов второго типа, напротив, имели единственную точку перекреста. Среди рекомбинантов третьего типа одинаково часто наблюдались как единичная, так и двойная схемы рекомбинации. Рекомбинанты первого серотипа, как правило, включали в свой состав фрагменты последовательности второго типа. Для изолятов второго серотипа более характерна схема Сэбин 2-Сэбин 1, вариант Сэбин 2-Сэбин 3 встречался реже. Третий серотип, напротив, чаще рекомбинировал со вторым и реже - с первым типом (Рис. 6).

Распределение мест перекреста у вакциино-родственных рекомбинаитных штаммов полиовируса

5-НТР УР4 УР2 УРЗ Ч'Р 1

2А 2В 2С ЗАВ ЗС 30 3-НТР

УРд

1 ТИП

2 ТИП

3 тип

£о|у А

Рис. 6. Схемы геномов 118-ти вакцинно-родственных рекомбинантных штаммов полиовируса. Черный цвет соответствует последовательностям Сэбин 1, серый - Сэбин 2, белый — Сэбии 3. За точки перекреста приняты середины участков гомологии между родительскими последовательностями в районе рекомбинации. Вверху приведена схема полиовирусного генома.

III I II I

Г-,;.,!

г-14 I-

1_______________. ___Э?__

С2-СЗ

.....,„1 .

т^гта-^.................|"ТиТ

I ~ 1-1

Рис. 7. Расположение точек перекреста на геноме. Каждая диаграмма соответствует рекомбинации определенного типа:

1 - Сэбин 1 - Сэбин 2,

2 - Сэбин 1 - Сэбин 3,

3 - Сэбин 2 - Сэбин 1,

4 - Сэбин 2 - Сэбин 3,

5 - Сэбин 3 - Сэбин 1,

6 - Сэбин 3 - Сэбин 2.

За точку перекреста нринята середина участка гомологии между родительскими последовательностями в районе рекомбинации. По горизонтали обозначены районы генома, по вертикали - количество выявленных природных рекомбинантов с точкой перекреста на данном участке генома. Ширина шага — 25 нт.

Районы структурных белков УР4, УР2, УРЗ, а также 5'- и З'-НТР не указаны, так как на них не было зафиксировано ни одного

ре комбинационного события.

Для рекомбинантов каждого типа также можно выделить предпочтительные районы рекомбинации. У штаммов типа 2 наиболее часто рекомбинация фиксировалась в районе 3D, на который у рекомбинантов типа 3 не попала ни одна точка перекреста; для них «горячим» районом рекомбинации является участок генома 2С (Рис. 6, 7).

Внутри «горячих» районов рекомбинации можно выделить короткие участки, на которые попали точки перекреста сразу нескольких штаммов (пики на диаграммах, Рис. 7). Так, 50% всех выявленных случаев рекомбинации Сэбин З-Сэбин 1 (8 из 16-ти штаммов) и 19% случаев рекомбинации Сэбин З-Сэбин 2 (10 из 53-х штаммов) произошли на участке генома между нуклеотидами 4921 и 4948 в области 2С. Еще 4 рекомбинационных события Сэбин З-Сэбин 1 были зафиксированы на соседнем сегменте (4950 - 4979 нт.).

Существование «горячих» точек перекреста предполагает наличие неких факторов, способствующих предпочтительной рекомбинации именно в этих районах. Одно из возможных предположений - таким фактором при репликативной рекомбинации могут служить особенности вторичной структуры матричной и/или акцепторной молекул РНК [Romanova et al., 1986].

Можно заметить, что точки перекреста располагаются в одних и тех же районах у изолятов одного серотипа (Рис. 7). Следовательно, выбор сайта для рекомбинации в большей степени определяется структурой акцепторной молекулы РНК (5'-партнера), на которую садится полимереза для продолжения синтеза дочерней цепи.

С помощью компьютерной программы «RNA structure» мы смоделировали возможную вторичную структуру различных фрагментов (+) цепей РНК штаммов Сэбина (в процессе копирования которых, вероятно, происходит рекомбинация [Kirkegaard and Baltimore, 1986]). Меняя шаг и варьируя длины складываемых участков, мы выбрали наиболее часто образующиеся структурные элементы и соотнесли с ними известные районы рекомбинации (Рис. 8).

Как правило, на участках, где рекомбинация наблюдается часто, РНК образует небольшие шпилечные структуры, с одной или с двух сторон фланкированные неспаренными фрагментами генома (однако стоит заметить, что большинству таких элементов вторичной структуры РНК не соответствует ни одна точка перекреста).

Возможно, шпилечная структура на матрице способствует приостановке элонгации дочерней цепи, в то время как шпилька на акцепторе имеет сродство к полимеразе или связанным с ней белкам/РНК, в результате чего полимераза садится именно на этот структурный элемент и с него продолжает элонгацию дочерней РНК.

Рис. 8. Расположение «горячих точек» перекреста на элементах вторичной структуры РНК вакцинных штаммов полиовируса: (А) вторичная структура фрагмента генома Сэбин 3, (Б) вторичная структура фрагмента генома Сэбин 2, (В) вторичная структура фрагмента генома Сэбин 1. Очерчены и обведены овалами «горячие» районы рекомбинации (А. - СЗ-С1 и СЗ-С2, Б. - С2-С1 и С2-СЗ, В. - С1-С2). ! - наиболее «горячая» точка перекреста.

Исследование возможной причины селекции вакцинно-родственных рекомбинантиых штаммов полиовируса типа 3

Большинство вакцинно-родственных штаммов полиовируса, выделяемых от людей, являются рекомбинантами. Причина селективного отбора рекомбинантов может быть выявлена при изучении закономерностей организации их геномов.

Более половины рекомбинантов третьего серотипа являются двойными и содержат, часто совсем небольшую, внутреннюю вставку участка генома полиовируса другого типа (Рис. 9 Б). При рассмотрении всех известных природных рекомбинантов вакцинного происхождения оказалось, что участок длиной 142 нт в районе границы областей Р2 и РЗ всегда относится либо к первому, либо ко второму типу и никогда - к третьему (Рис. 9 А). На

участке генома, всегда заменяемом у рекомбинантов типа 3, было обнаружено единственное отличие между аминокислотными последовательностями штамма Сэбин 3 и двумя другими вакцинными штаммами: в 15-м положении белка ЗА у вирусов типа 3 присутствует аргинин, а не серин. Мы предположили, что, избавляясь от Arg-15 с помощью рекомбинации, варианты штамма Сэбин 3 приобретают селективное преимущество перед нерекомбинантами.

Рис. 9. Схемы геномов рекомбинантов, имеющих в своем составе фрагменты последовательностей, произошедших от штамма Сэбин 3 (белый цвет). Черный цвет соответствует вариантам последовательности Сэбин I, серый - Сэбин 2. На левом рисунке (А) в верхней части - 5*-фрагменты, в нижней части рисунка - 3'-фрагменты геномов относятся к третьему типу. На правом рисунке (Б) приведены схемы нескольких множественных рекомбинантов типа 3. Прямоугольниками отмечен участок, заменяемый у штаммов типа 3 на последовательность другого типа.

Анализ размещенных в ОепВапк 36-ти последовательностей измененных вакцинных и диких полиовирусных штаммов (или энтеровирусов кластера С), а также частично отсеквенированных нами геномов еще 14-ти изолятов дикого типа, показал, что, за исключением штамма Ьеоп/1937 (дикого предшественника штамма Сэбин 3), ни одна последовательность не содержит аргинин в 15-м положении белка ЗА.

Для того чтобы узнать, действительно ли преобладание изолятов, имеющих рекомбинантную организацию геномов, обусловлено их селективным преимуществом по сравнению с нерекомбинантами, и достаточно ли одной только рекомбинации без дополнительных мутаций для приобретения вариантом вакцинного штамма улучшенного фенотипа, был сконструирован и исследован полиовирус С 3-1-3, точно повторяющий

структуру генома природного рекомбинанта, но не содержащий накопленных этим изолятом нуклеотидных замен (Рис. 10).

Для ответа на вопрос — может ли замена Arg-15 на Ser-15 обеспечить преимущество вакцинно-родственным штаммам полиовируса типа 3, мы сконструировали полиовирус С 3*, в последовательность которого ввели мутацию G(5178)—»U (приводящую к замене аргинина на серин в 15-м положении белка ЗА) и синонимическую маркерную мутацию С(5184)—>U (Рис.10).

Рис. 10. В верхней части рисунка схема сконструированного рекомбинанта С 3-1-3. Черный цвет соответствует последовательности штамма Сэбин 1 (указаны координаты встроенного фрагмента), белый -последовательности штамма Сэбин 3. Приведена схема генома полиовируса. В нижней части - сегменты последовательностей полиовирусов Сэбин 1, С 3-1-3, С 3*, Сэбин 3, и С 1*. Серым цветом обозначены нуклеотиды, отличающиеся у последовательностей вакцинных штаммов типов 1 и 3 на данном участке и введенные в конструкции С 1 *и С 3* мутации. Приведены номера соответствующих нуклеотидных позиций.

Чтобы проверить, как отразится присутствие Arg-15 на фенотипе штамма Сэбин 1, в норме имеющего в этой позиции серин, был сконструирован полиовирус С 1*. несущий мутацию U(5178)—>G (приводящую к замене серина на аргинин в 15-м положении белка ЗА) и синонимическую замену U(5184)—»C (Рис.10).

Для получения всех трех полиовирусов были использованы плазмиды, несущие полноразмерные ДНК-копии геномов штаммов Сэбин 1 и Сэбин 3. После внесения необходимых мутаций и рекомбинационных перестроек в плазмиды на их основе, а также на основе неизмененных последовательностей ДНК, соответствующих штаммам Сэбин 1 и

Сэбин 3, были получены РНК транскрипты, которыми трансфицировали клетки Vero.

Удельная инфекционность и размер бляшек, появившихся на клетках, трансфицированных РНК-транскриптами Сэбин 1 и С 1*, различались незначительно. Бляшки, образованные остальными тремя транскриптами имели существенно меньшие размеры.

Полученными из плазмид полиовирусами Сэбин 3, С 3*, С 3-1-3 заразили клетки Vero для оценки бляшечного фенотипа (Рис.11). Большая часть бляшек, образованных прошедшими один пассаж вирусами СЗ* и С3-1-3, имела меньший размер по сравнению с' также однократно пропассированным неизмененным вакцинным штаммом. Таким образом, ни данная схема рекомбинации, ни замена аргинина на серин в 15-м положении белка ЗА не «улучшили» штамм Сэбин 3, (выявленная in vitro жизнеспособность даже ухудшилась).

Рис. 11. Фотографии клеток Vero, зараженных вирусами Сэбин 3, С 3*, С 3-1-3, прошедшими 1 пассаж (5-й день после заражения).

Для того чтобы проследить, как со временем будет меняться фенотип исследуемых штаммов, вирусы Сэбин 3, СЗ*, С 3-1-3 были пропассированы по 5 раз в жидкой среде (каждый в 5-ти независимых параллелях). Пятыми пассажами вирусов заразили клетки Vero для анализа бляшечного фенотипа (Рис. 12).

Некоторые линии одного и того же вируса существенно отличались друг от друга фенотипически. В большинстве случаев после 5-ти пассажей размеры бляшек вирусов Сэбин 3 и С 3* превышали размеры бляшек рекомбинанта С 3-1-3. Из этого можно заключить, что рекомбинация в большей степени, чем мутация отразилась на фенотипе штамма Сэбин 3, возможно, снизив скорость его репродукции. Однако за 5 пассажей во всех-линиях появились мутанты, образующие крупные бляшки, что свидетельствует о наличии потенциала для увеличения жизнеспособности каждой из популяций.

Рис. 12. Фотографии клеток Vero, зараженных вирусами С 3-1-3 (А), С 3* (Б), Сэбин 3 (В), прошедшими но 5 независимых пассажей (4-й день после заражения). На фотографии при данном увеличении не видны очень мелкие бляшки, в большом количестве присутствующие на клетках А- III, IV, V.

По всей видимости, появление подобных вирусов обладающих повышенной жизнеспособностью - вопрос времени. А как скоро возникнет улучшающая мутация, способная обеспечить преимущество одному из вирусных вариантов, зависит от случая. Таким образом, вопрос - за счет чего природные рекомбинанты приобретают селективное преимущество перед нерекомбинантами, остается открытым.

С целью выяснить, за счет каких генетических изменений произошло улучшение фенотипа крупнобляшечных вирусов С 3-1-3, была определена полная нуклеотидная последовательность генома одного из таких вариантов. Было выявлено единственное отличие от последовательности родительской рекомбинантной плазмидной конструкции: при пассировании возникла реверсия к дикому предшественнику 2034-U—»С (меняющая фенилаланин на серин в 91-м положении белка VP3), что, как известно, повышает нейровирулентность полиовируса Сэбин 3 [Almond et al., 1987; Westrop et al., 1989]. Таким образом, в рассмотренном примере улучшение фенотипа изначально «слабой» вирусной популяции рекомбинанта С 3-1-3 произошло благодаря мутации в капсидном белке.

На предмет наличия реверсии в районе VP3 был также исследован мутировавший за 5 пассажей вирус С 3*. Частичное секвенирование геномов вирусов из двух отобранных крупных бляшек в одном случае также показало наличие мутации 2034-U—»С, в другом случае эта замена отсутствовала. Можно заключить, что вирусными вариантами даже внутри одной популяции реализуются разные способы повышения жизнеспособности.

ВЫВОДЫ

1. При помощи анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов генома, олигонуклеотидных микрочипов и определения нуклеотидной последовательности исследована рекомбинантная природа 75-ти производных вакцинных штаммов полиовируса, выделенных от больных полиомиелитом и другими заболеваниями, здоровых людей и из объектов окружающей среды.

2. Анализ генома рекомбинантов способствует эффективному выявлению родства или независимой эволюции производных вакцинных штаммов.

3. При помощи такого анализа выявлен ряд важных эпидемиологических закономерностей:

- возможность одновременной эволюции независимых линий производных вакцинных штаммов в организме человека и в человеческих популяциях,

- существование внутритиповой рекомбинации (в том числе, и в капсидной области) между вариантами штаммов Сэбина,

- быстрое распространение производных вакцинных штаммов среди неиммунной популяции, а также скрытая длительная циркуляция таких производных в популяции, считавшейся адекватно иммунизированной.

4. Два последних обстоятельства служат серьезным дополнительным аргументом в пользу вероятного возникновения вспышек полиомиелита в случае планируемого Всемирной организацией здравоохранения полного прекращения иммунизации против полиомиелита после ликвидации диких штаммов полиовируса.

5. Охарактеризовано распределение мест перекреста у межтиповьтх рекомбинантов между производными вакцинных штаммов. Показан неслучайный характер этого распределения, которое специфично для разных пар родительских штаммов. При этом более существенный вклад в характер распределения вносит донор участка генома, расположенного с 5'-стороны от места перекреста.

6. Предпринята попытка связать локализацию «горячих точек» рекомбинации с особенностями вторичной структуры соответствующих районов РНК-партнеров. Показано, что ряд таких точек располагается в предсказанных компьютерной программой шпилечных структурах РНК.

7. Показано, что в РНК природных рекомбинантов серотипа 3 участок генома на границе областей Р2 и РЗ неизменно заменяется на соответствующий участок, происходящий от полиовирусов других серотипов. Моделирование одного из таких природных рекомбинантов при помощи гетеротипичных фрагментов вирусной РНК показало, что сам по себе факт межтиповой рекомбинации может не приводить к увеличению жизнеспособности вируса, выявляемой in vitro (жизнеспособность может даже ухудшаться). Однако при дальнейших пассажах этого рекомбинанта появляются клоны с повышенной жизнеспособностью. Выяснение природы факторов, обеспечивающих быстрое накопление рекомбинантов и специфическое распределение мест перекреста, требует дальнейшего изучения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю, профессору В. И. Аголу, а также всему коллективу лаборатории биохимии ИПиВЭ им. М. П. Чумакова РАМН и сотрудникам отдела взаимодействия вируса с клеткой НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского МГУ за помощь и поддержку.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. GuillotS., Саго V., Cuervo N., Korotkova Е., CombicscuM., Persu A., Aubert-Combiescu A., Delpeyroux F., Crainic R. (2000) Natural genetic exchanges between vaccine and wild poliovirus strains in humans. J. Virol. 74: 8434-8443.

2. Ivanova О. E., Eremeeva T. P., Karganova G. G., Rumyantsev A. A., Leshinskaya E. V., Lipskaya G. Y„ Cherkasova E. A., Korotkova E. A., Grachev V. P., DrozdovS. G. (2001) Poliomyelitis in Russia in 1998-1999. In Progress in Polio Eradication: Vaccine Strategies for the End Game. Dev. Biol. Basel, Karger. 105: 17-21.

3. Cherkasova E. A., Korotkova E. A., Yakovenko M. L., Ivanova О. E., Eremeeva T. P., Chumakov К. M., Agol V. I. (2002) Long-term circulation of vaccine-derived poliovirus resulting in paralytic disease. J. Virol. 76: 6791-6799.

4. Cherkasova E., Laassri M., Chizhikov V., Korotkova E., Dragunsky E., Agol V. I., Chumakov K. (2003) Microarray analysis of evolution of RNA viruses: evidence of circulation of virulent highly divergent vaccine-derived polioviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 9398-9403.

5. Korotkova E. A., Park R., Cherkasova E. A., Lipskaya G. Y., Chumakov К. M., Feldman E. V., Kew О. M., Agol V. I. (2003) Retrospective analysis of a local cessation of vaccination against poliomyelitis: a possible scenario for the future. J. Virol. 77: 12460-12465.

6. Cherkasova E. A., Yakovenko M. L., Rezapkin G. V., Korotkova E. A., Ivanova О. E., Eremeeva T. P., Krasnoproshina L. I., Romanenkova N. I., Rozaeva N. R., Sirota L., Agol V. I., Chumakov К. M. (2005) Spread of vaccine-derived poliovirus from a paralytic case in immunodeficient child: an insight into natural evolution of oral polio vaccine. J. Virol. 79: 10621070.

7. Белецкая Т. С., Самойлович Е. О., Короткова Е. А., Счесленок Е. П., Фельдман Э. В. (2002) Мутационная и рекомбинационная изменчивость вакцинных полиовирусов, изолированных в Беларуси (1960-1999). Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 1: 24-31.

8. Иванова О. Е., Еремеева Т. П., Короткова Е. А., Яковенко М. Л., Чернявская О. П., Воронцова Т. В., Ясинский А. А. (2004) Надзор за полиомиелитом и ОВП в Российской Федерации до и после сертификации ликвидации полиомиелита в Европейском регионе, 1999-2003 годы. Эпидемиология и вакцинопрофилактика 4: 6-12.

9. Агол В. И., Гаврилин Е. В., Kew О. М., Короткова Е. А., Липская Г. Ю., Черкасова Е. А. Молекулярная эпидемиология полиомиелита. Научная конференция «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», посвященная 90-летию со дня рождения М. П. Чумакова. 23-25 ноября 1999 г. Московская обл., РФ. Стр. 12.

10. Beletskaya Т. S., Schesljenok Е. P., Samoilovich Е. О., Korotkova Е. A., Feldman Е. V. Recombination variability of vaccine polioviruses isolated in Belarus (1960-1999). International Symposium «Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology». 18-21 November 2001, Moscow, RF; 22-24 November 2001, Minsk, Belarus. P. 15.

11. Агол В. И., Короткова Е. А., Липская Г. Ю., Черкасова Е. А., Чумаков К. М., Яковенко М. JI. Проблема ликвидации полиомиелита. Ill" международная конференция, посвященная 80-летию Института имени Пастера: «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». 45 сентября 2003 г., Санкт-Петербург, РФ. Стр. 2.

12. Иванова О. Е., Еремеева Т. П., Короткова Е. А., Яковенко М. Л., Черкасова Е. А., Садовникова В. А. Случаи полиомиелита в Российской Федерации в 1998-2002 гг. III" международная конференции, посвященная 80-летию Института имени Пастера: «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». 4-5 сентября 2003 г., Санкт-Петербург, РФ. Стр. 5.

13. Иванова О. Е., Еремеева Т. П., Короткова Е. А., Яковенко М. Л., Лещинская Е. В., Карганова Г. Г., Грачёв В. П., Садовникова В. Н. Вакциноассоциированный паралитический полиомиелит в Российской Федерации в 2000-2002 гг. VIе международный форум по глобальной вакцинологии: «Вакцины и иммунизация». 25-26 сентября 2003 г., Минск, Беларусь. Стр. 31.

14. Cherkasova Е. A., Chizhikov V. Е., Laassri М., Korotkova Е. A., Yakovenko М. L., Agol V. I., Chumakov К. М. Oligonucleotide microarrays for analysis of genetic polymorphisms of RNA viruses. International Conference «Genotyping of Infectious Diseases». October 2004, Moscow, RF. PI 382.

15. Cherkasova E., Korotkova E., Agol V. I., Chumakov K. Reduced fitness of individual parts of vaccine poliovirus genomes may determine the pattern of their recombination in vivo. XIIIth Meeting of the Europ. Study Group on the Molecular Biology of Picomaviruses. 23-29 May 2005, Lunteren, Netherlands. E 09.

16. Иванова О. E., Еремеева Т. П., Короткова Е. А., Черкасова Е. А., Яковенко М. Л., Бичурина М. А., Розаева Н. Р., Романенкова П. И., Драгунская Е. М., Чернявская О. П., Ясинский А. А., Лазикова Г. Ф. Совершенствование надзора за полиомиелитом и острыми вялыми параличами в Российской Федерации после сертификации ликвидации полиомиелита. Всероссийская научная конференция «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций». 1-2 декабря 2005 г., Санкт-Петербург, РФ. Стр. 20-22.

17. Яковенко М. Л., Короткова Е. А. Эволюция вакцинных штаммов полиовируса. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАИ. 17-21 апреля 2006 г., Пущино, РФ. Стр. 222.

Заказ № 64/11/06 Подписано в печать 08.11.2006 Тираж 50 экз. Усл. пл. 1,5

Л^Л ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 УчЛуУ www.cfr.ru ; е-таН:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Короткова, Екатерина Александровна

Список сокращений

Введение

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Таксономическое положение полиовируса и краткая систематика семейства Ркогпаушс1ае

1.2. Молекулярно-биологическая характеристика полиовируса

1.2.1. Структура и состав полиовирусной частицы

1.2.2. Строение генома полиовируса

1.2.3. Жизненный цикл полиовируса

1.2 3.1 Проникновение вируса в клетку

1 2 3.2. Трансляция геномной цепи РНК

1.2 3 3. Образование зрелых вирусных белков

1 2 3.4 Переключение с трансляции на репликацию РНК

1.2.3.5 Образование нуклеотид-белковой затравки для синтеза РНК

1.2.3.6 Синтез (-) цепей РНК 18 1.2.3.7. Синтез (+) цепей РНК 18 1.2.3.8 Сборка вирусных частиц

1.2.4. Функции неструктурных вирусных белков

1.2.5. Цис-элементы РНК полиовируса

1.2.5.1. Оп

1.2.5.1. 1Ш

1.2.5 1. ОгШ

1.2.5.1. ОгИ

1.3. Основные механизмы изменчивости генома полиовируса

1.3.1. Мутационная изменчивость

1.3.2. Рекомбинационная изменчивость

1.3.2.1. Репликативная модель рекомбинации

1.3.2 2. Нерепликативная модель рекомбинации

1.4. Эволюция полиовируса

1.4.1. Гетерогенность вирусной популяции

1.4.2. Негативная и позитивная селекции

1.4.3. «Нейтральная эволюция»

1.4.4. Скорость фиксации мутаций

1.5. Паралитический полиомиелит

1.5.1. Патогенез

1.5.2. История полиомиелита

1.5.3. Создание полиовирусной вакцины

1.5.4. Вакцинно-ассоциированный паралитический полиомиелит

1.6. Вакцинно-родственные штаммы полиовируса

1.6.1. Фенотипические и генетические особенности вакцинных штаммов

1.6.2. Мутационная изменчивость вакцинных штаммов полиовируса

1.6 2.1. Накопление мутаций штаммами Сэбина in vitro

1.6 2.2. Накопление мутаций штаммами Сэбина in vivo

1.6.3. Рекомбинационная изменчивость вакцинных штаммов полиовируса

1.6 3.1. Методы выявчения рекомбинантов 53 1.6 3.2 Частота выделения межтиповых рекомбинантных штаммов

1.6 3 3. Организация геномов рекомбинантных штаммов 58 1.6 3 4. Рекомбинация между вакципно-родствеиными и дикими штаммами полиовируса (или энтеровируса кластера С)

1.6.4. Сильно измененные штаммы полиовируса вакцинного происхождения

1.6 4.1. iVDPV

1.6 4.2. cVDPV

1.7. Программа ВОЗ глобальной ликвидации полиомиелита в мире

Постановка задачи

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Штаммы полиовируса

2.2. Молекулярные методы исследования полиовирусных штаммов

2.2.1. Подтверждение вакцинного происхождения с помощью ПЦР

2.2.2. Выделение РНК

2.2.3. Обратная транскрипция

2.2.4. Полимеразная цепная реакция

2.2.5. ПДРФ анализ

2.2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.3. Методы молекулярного клонирования

2.3.1. Гидролиз ДНК эндонуклеазами

2.3.2. Аналитический и препаративный электрофорез в агарозном геле

2.3.3. Очистка фрагментов ДНК

2.3.4. Лигирование

2.3.5. Трансформация культуры клеток плазмидной ДНК

2.3.6. Размножение бактериальных колоний и выделение плазмидной ДНК

2.4. Получение рекомбинантного и мутантных полиовирусов

2.4.1. Получение рекомбинантной плазмидной конструкции

2.4.2. Внесение мутаций в плазмиду pT7Sae

2.4.3. Внесение мутаций в плазмиду pVS 1 (Т7) 1С-0(Т)

2.5. Получение полноразмерных транскриптов

2.6. Трансфекция и заражение первичной культуры клеток Vero

2.7. Использованные компьютерные программы

Глава 3. Результаты 95 3.1. Исследование эпидемиологических ситуаций, связанных с рекомбинантными штаммами полиовируса вакцинного происхождения

3.1.1. Независимая эволюция полиовирусных популяций в одном организме

3.1.2. Рекомбинация - показатель родства между штаммами полиовируса

3.1.3. Длительная циркуляция вакцинно-родственных рекомбинантных штаммов полиовируса

3.1.4. Циркуляция вакцинно-родственных штаммов полиовируса в период временного прекращения вакцинации от полиомиелита

3.1.5. Рекомбинанты между штаммами вакцинного и дикого происхождения

3.2. Анализ вакцинно-родственных рекомбинантных штаммов полиовируса, исследование причины их селекции

3.2.1. Выявление рекомбинантов среди природных изолятов полиовируса

3.2.2. Определение районов рекомбинации

3.2.3. Предпочтительные схемы рекомбинации

3.2.4. «Горячие» и «холодные» районы рекомбинации

3.2.5. Вторичная структура РНК вакцинных штаммов полиовируса в районах рекомбинации

3 2.51. Вторичная структура РНК в районах горячих точек» перекреста

3.2.5 2 Положение точно определенных точек перекреста на элементах вторичной структуры

3.2.6. Возможная причина селекции рекомбинантов

3.2.7. Проверка гипотезы о селективном преимуществе рекомбинантов и о селекции против аргинина в 15-м положении белка ЗА

Глава 4. Обсуждение результатов

4.1. Значение эпидемиологического исследования природных рекомбинантов

4.1.1. Одинаковая рекомбинантная организация геномовпоказатель родства между изолятами

4.1.2. Фрагменты разного «возраста» и происхождения в составе геномов вакцинно-родственных рекомбинантных штаммов полиовируса

4.1.3. «Неопределенные» VDPV

4.1.4. Рекомбинантная организация геномов дериватов вакцины

4.2. Частота выявления рекомбинантов среди природных вакцинно-родственных изолятов полиовирусов трех серотипов

4.3. Роль рекомбинации в эволюции полиовирусных популяций

4.3.1. Влияние рекомбинации на фенотип полиовируса

4.3.2. Возможность влияния рекомбинационных перестроек генома на скорость и точность репликации

4.3.3. Вероятность количественного преобладания рекомбинантов в популяциях полиовирусов

4.3.4. Возможное влияние особенностей механизма рекомбинации на организацию геномов рекомбинантных штаммов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рекомбинантные геномы вакцинно-родственных штаммов полиовируса"

Полиовирус является возбудителем тяжелого заболевания человека -паралитического полиомиелита. Его история насчитывает не одно тысячелетие, однако наиболее страшный удар человечеству он нанес в первой половине XX в, вызвав множество эпидемий во всем мире. Появление полиовирусных вакцин позволило начать борьбу с этим инфекционным агентом. И в настоящее время принято считать, что полиовирус почти побежден. Однако существуют факты, заставляющие в этом усомниться.

В 1988 г. Всемирная Организация Здравоохранения провозгласила Программу глобальной ликвидации полиомиелита, главная задача которой -прекратить циркуляцию диких штаммов полиовируса во всем мире. Основным оружием в борьбе с полиовирусами дикого типа являлась и является живая вакцина, содержащая ослабленные штаммы полиовирусов всех трех серотипов, не вызывающие заболевание, но способные выработать устойчивый иммунитет к полиовирусной инфекции. Ее применение позволило остановить циркуляцию диких штаммов полиовируса в большинстве регионов мира, снизить уровень заболеваемости полиомиелитом на несколько порядков. Однако, быстро эволюционируя, вакцинные штаммы, постоянно вносимые в человеческое сообщество, в процессе репродукции в желудочно-кишечном тракте человека зачастую приобретают нейровирулентность и способность к длительной трансмиссии, характерные для диких штаммов. Эти свойства делают их эпидемически опасными. Подтверждение тому - вызванные измененными вариантами вакцины вспышки заболевания паралитическим полиомиелитом. Нельзя исключить, что в случае победы над полиовирусами дикого типа их место займут полиовирусы вакцинного происхождения. В связи с этим изучение измененных вакцинных штаммов, механизмов и законов их эволюции в настоящее время является чрезвычайно важной задачей.

Существуют два основных способа изменения полиовирусного генома -накопление мутаций и рекомбинация. Известно, что некоторые мутации играют адаптивную роль в эволюции полиовирусов, способствуя повышению их жизнеспособности. Значение же рекомбинации неясно до сих пор. Понять его, а также разобраться в некоторых вопросах, касающихся биологического смысла образования рекомбинантов, и особенностей их распространения в человеческом сообществе мы попытались в нашем исследовании.

Цели и задачи исследования

Одна из целей данной работы - с помощью анализа рекомбинантных штаммов полиовируса вакцинного происхождения ответить на ряд вопросов, имеющих эпидемиологическое значение: установить или опровер!нуть родство между изолятами, определить их происхождение и «возраст».

Другая цель - исследовать причину селекции рекомбинантных штаммов (которые преобладают над нерекомбинантами среди изолятов, выделяемых от реципиентов вакцины).

В задачи работы входило: провести эпидемиологический анализ случаев трансмиссии рекомбинантных штаммов полиовируса вакцинного, а также вакцинного/дикою происхождения; проанализировать природные изоляты полиовируса, определить координаты точек перекреста выявленных рекомбинантов, установить закономерности организации геномов рекомбинантных штаммов трех серотипов. На основе полученных данных сделать предположение о причине селективно! о отбора рекомбинантов и проверить его, на конкретном примере установить, как рекомбинация без дополнительных мутаций влияет на фенотип вакцинного штамма полиовируса.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе было показано, что прекращение вакцинации от полиомиелита приводит к быстрому распространению и широкой циркуляции среди населения производных вакцинных штаммов. Данное наблюдение имеет важное эпидемиологическое значение при планировании стратегии завершающего этапа Программы ВОЗ глобальной ликвидации полиомиелита.

Установлены случаи появления сильно измененных штаммов вакцинного происхождения в регионе с высоким уровнем специфического иммунитета у населения.

Зафиксирован начальный этап трансмиссии вирулентного вирусного варианта.

Доказана независимая эволюция нескольких вирусных популяций в организме иммунодефицитного ребенка.

Выявлены и исследованы рекомбинанты между штаммами полиовируса вакцинного и дикого происхождения (или энтеровирусами кластера С).

На конкретном примере продемонстрировано, что только рекомбинация без дополнительных мутаций негативно отражается на фенотипе штамма Сэбин 3.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Короткова, Екатерина Александровна

Выводы

3. При помощи такого анализа выявлен ряд важных эпидемиологических закономерностей:

- возможность одновременной эволюции независимых линий производных вакцинных штаммов в организме человека и в человеческих популяциях, -существование внутритиповой рекомбинации (в том числе, и в капсидной области) между вариантами штаммов Сэбина,

5. Охарактеризовано распределение мест перекреста у межтиповых рекомбинантов между производными вакцинных штаммов. Показан неслучайный характер этого распределения, которое специфично для разных пар родительских штаммов. При этом более существенный вклад в характер распределения вносит донор участка генома, расположенного с 5'-стороны от места перекреста.

7. Показано, что в РНК природных рекомбинантов серотипа 3 участок генома на границе областей Р2 и РЗ неизменно заменяется на соответствующий участок, происходящий от полиовирусов других серотипов. Моделирование одного из таких природных рекомбинантов при помощи гетеротипичных фрагментов вирусной РНК и сайт-специфического мутагенеза показало, что сам по себе факт межтиповой рекомбинации может не приводить к увеличению жизнеспособности вируса, выявляемой in vitro (жизнеспособность может даже ухудшаться). Однако при дальнейших пассажах этого рекомбинанта появляются клоны с повышенной жизнеспособностью. Выяснение природы факторов, обеспечивающих быстрое накопление рекомбинантов и специфическое распределение мест перекреста, требует дальнейшего изучения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Короткова, Екатерина Александровна, Москва

1. ВОЗ Европейское региональное бюро (1998) Клиника, диагностика и лечение острого полиомиелита (методические рекомендации). ИПиВЭ им. Чумакова МП РАМН, М.

2. Ворошилова МК (1966) Иммунология, эпидемиология и профилактика полиомиелита и сходных с ним заболеваний. М., Медицина.

3. Грачев ВП (2005) Разработка и практическое применение вакцин для профилактики актуальных вирусных инфекций. Вопросы вирусологии 3: 32-36.

4. Кимура М (1985) Молекулярная эволюция: теория нейтральности. М., Мир.

5. Справочник фельдшера под редакцией А.А.Михайлова (1995) М., Медицина.

6. Четверин АБ (1999) Новый взгляд на рекомбинацию РНК. Мол Биол 33: 985996.

7. Чистенко ГН, Самойлович ЕО (2000) Полиомиелит. БелНИИЭМ -практическому здравоохранению 3:4-7.

8. Adzhubei АА, Adzhubei IA, Krasheninnikov IA, Neidle S (1996) Non-random usage of 'degenerate' codons is related to protein three-dimensional structure. FEBS Lett 399.78-82.

9. Agol VI (1997) Recombination and other genomic rearrangements in picornaviruses. Semin Virol 8:1-9.

10. Agol VI (2006) Molecular mechanisms of poliovirus variation and evolution. Curr Top Microbiol Immunol 299.211-259.

11. Agol VI, Drozdov SG, Ivannikova TA, Kolesnikova MS, Korolev MB, Tolskaya EA (1989) Restricted growth of attenuated poliovirus strains in cultured cells of a human neuroblastoma. J Virol 63:4034-4038.

12. Agol VI, Belov GA, Bienz K, Egger D, Kolesnikova MS, Raikhlin NT, Romanova LI, Smirnova EA, Tolskaya EA (1998) Two types of death of poliovirus-infected cells: caspase involvement in the apoptosis but not cytopathic effect. Virology 252: 343-353.

13. Agol VI, Belov GA, Bienz K, Egger D, Kolesnikova MS, Romanova LI, Sladkova LV, Tolskaya EA (2000) Competing death programs in poliovirus-infected cells: commitment switch in the middle of the infectious cycle. J Virol 74: 5534-5541.

14. Agol VI, Belov GA, Cherkasova EA, Gavrilin GV, Kolesnikova MS, Romanova LI, Tolskaya EA (2001) Some problems of molecular biology of poliovirus infection relevant to pathogenesis, viral spread and evolution. Dev Biol (Basel) 105.43-50.

15. Agut H, Kean KM, Fichot O, Morasco J, Flanegan JB, Girard M (1989) A point mutation in the poliovirus polymerase gene determines a complementable temperature-sensitive defect of RNA replication. Virology 168:302-311.

16. Alexander L, Lu HH, Wimmer E (1994) Polioviruses containing picornavirus type 1 and/or type 2 internal ribosomal entry site elements: genetic hybrids and the expression of a foreign gene. Proc Natl Acad Sci USA 91: 1406-1410.

17. Almond JW, Westrop GD, Evans DM, Dunn G, Minor PD, Magrath D, Schild GC (1987) Studies on the attenuation of the Sabin type 3 oral polio vaccine. J Virol Methods 17: 183-189.

18. Andino R, Rieckhof GE, Baltimore D (1990 a) A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5' end of poliovirus RNA. Cell 63: 369-380.

19. Andino R, Rieckhof GE, Trono D, Baltimore D (1990 6) Substitutions in the protease (3Cpro) gene of poliovirus can suppress a mutation in the 5' noncoding region. J Virol 64: 607-612.

20. Andino R, Rieckhof GE, Achacoso PL, Baltimore D (1993) Poliovirus RNA synthesis utilizes an RNP complex formed around the 5'-end of viral RNA. EMBO J 12: 3587-3598.

21. Ansardi DC, Porter DC, Morrow CD (1991) Coinfection with recombinant vaccinia viruses expressing poliovirus PI and P3 proteins results in polyprotein processing and formation of empty capsid structures. J Virol. Apr;65(4):2088-92.

22. Ansardi DC, Pal-Ghosh R, Porter D, Morrow CD (1995) Encapsidation and serial passage of a poliovirus replicon which expresses an inactive 2A proteinase. J Virol 69: 1359-1366.

23. Arias A, Lazaro E, Escarmis C, Domingo E (2001) Molecular intermediates of fitness gain of an RNA virus: characterization of a mutant spectrum by biological and molecular cloning. J Gen Virol 82:1049-1060.

24. Arita M, Zhu SL, Yoshida H, Yoneyama T, Miyamura T, Shimizu H (2005) A Sabin 3-derived poliovirus recombinant contained a sequence homologous with indigenous human enterovirus species C in the viral polymerase coding region. J Virol 79:12650-12657.

25. Arnold E, Luo M, Vriend G, Rossmann MG, Palmenberg AC, Parks GD, Nicklin MJ, Wimmer E (1987) Implications of the Picornavirus capsid structure for polyprotein processing. Proc Natl Acad Sei USA 84: 21-25.

26. Arnold J J, Cameron CE (1999) Poliovirus RNA-dependent RNA polymerase (3Dpol) is sufficient for template switching in vitro. J Biol Chem 274:2706-2716.

27. Aylward RB, Cochi SL (2004) Framework for evaluating the risks of paralytic poliomyelitis after global interruption of wild poliovirus transmission. Bull World Health Organ 82:40-46.

28. Back SH, Kim YK, Kim WJ, Cho S, Oh HR, Kim JE, Jang SK (2002) Translation of polioviral mRNA is inhibited by cleavage of polypyrimidine tract-binding proteins executed by polioviral 3C(pro). J Virol 76:2529-2542.

29. Balanant J, Guillot S, Candrea A, Delpeyroux F, Crainic R (1991) The natural genomic variability of poliovirus analyzed by a restriction fragment length polymorphism assay. Virology 184:645-654.

30. Banerjee R, Echeverri A, Dasgupta A (1997) Poliovirus-encoded 2C polypeptide specifically binds to the 3'-terminaI sequences of viral negative-strand RNA. J Virol 71:9570-9578.

31. Banerjee R, Tsai W, Kim W, Dasgupta A (2001) Interaction of poliovirus-encoded 2C/2BC polypeptides with the 3' terminus negative-strand cloverleaf requires an intact stem-loop b.Virology 280:41-51.

32. Barton DJ, Morasco BJ, Flanegan JB (1999) Translating ribosomes inhibit poliovirus negative-strand RNA synthesis. J Virol 73:10104-10112.

33. Basavappa R, Syed R, Flore O, Icenogle JP, Filman DJ, Hogle JM (1994) Role and mechanism of the maturation cleavage of VP0 in poliovirus assembly: structure of the empty capsid assembly intermediate at 2.9 A resolution. Protein Sci 3: 16511669.

34. Bellmunt A, May G, Zell R, Pring-Akerblom P, Verhagen W, Heim A (1999) Evolution of poliovirus type 1 during 5.5 years of prolonged enteral replication in an immunodeficient patient. Virology 265:178-184.

35. Belnap DM, McDermott BM Jr, Filman DJ, Cheng N, Trus BL, Zuccola HJ, Racaniello VR, Hogle JM, Steven AC (2000 a) Three-dimensional structure of poliovirus receptor bound to poliovirus. Proc Natl Acad Sci USA 97:73-78.

36. Belnap DM, Filman DJ, Trus BL, Cheng N, Booy FP, Conway JF, Curry S, Hiremath CN, Tsang SK, Steven AC, Hogle JM (2000 6) Molecular tectonic model of virus structural transitions: the putative cell entry states of poliovirus. J Virol 74: 1342-1354.

37. Berstein HD, Baltimore D (1988) Poliovirus mutant that contains a cold-sensitive defect in viral RNA synthesis. J Virol 62:2922-2928.

38. Bienz K, Egger D, Troxler M, Pasamontes L (1990) Structural organization of poliovirus RNA replication is mediated by viral proteins of the P2 genomic region. J Virol 64:1156-63.

39. Bienz K, Egger D, Pfister T, Troxler M (1992) Structural and functional characterization of the poliovirus replication complex. J Virol 66: 2740-2747.

40. Blomqvist S, Bruu AL, Stenvik M, Hovi T (2003) Characterization of a recombinant type 3/type 2 poliovirus isolated from a healthy vaccinee and containing a chimeric capsid protein VP1. J Gen Virol 84: 573-580.

41. Blomqvist S, Savolainen C, Laine P, Hirttio P, Lamminsalo E, Penttila E, Joks S, Roivainen M, Hovi T (2004) Characterization of a highly evolved vaccine-derived poliovirus type 3 isolated from sewage in Estonia. J Virol 78:4876-4883.

42. Blyn LB, Chen R, Semler BL, Ehrenfeld E (1995) Host cell proteins binding to domain IV of the 5' noncoding region of poliovirus RNA. J Virol 69:4381-9.

43. Blyn LB, Towner JS, Semler BL, Ehrenfeld E (1997) Requirement of poly(rC) binding protein 2 for translation of poliovirus RNA J Virol 71: 6243-6246

44. Borman AM, Deliat FG, Kean KM (1994) Sequences within the poliovirus internal ribosome entry segment control viral RNA synthesis. EMBO J 13.3149-3157.

45. Bouchard MJ, Lam DH, Racaniello VR (1995) Determinants of attenuation and temperature sensitivity in the type 1 poliovirus Sabin vaccine. J Virol 69:4972-4978.

46. Brown B, Oberste MS, Maher K, Pallansch MA (2003) Complete genomic sequencing shows that polioviruses and members of human enterovirus species C are closely related in the noncapsid coding region. J Virol 77: 8973-8984.

47. Brown DM, Kauder SE, Cornell CT, Jang GM, Racaniello VR, Semler BL (2004) Cell-dependent role for the poliovirus 3' noncoding region in positive-strand RNA synthesis. J Virol 78: 1344-1351.

48. Burns CC, Shaw J, Campagnoli R, Jorba J, Vincent A, Quay J, Kew O (2006) Modulation of poliovirus replicative fitness in HeLa cells by deoptimization of synonymous codon usage in the capsid region. J Virol 80: 3259-3272.

49. Cammack NJ, Phillips A, Dunn G, Patel V, Minor PD (1988) Intertypic genomic rearrangements of poliovirus strains in vaccines. Virology 167: 507-514.

50. Cann AJ, Stanway G, Hughes PJ, Minor PD, Evans DM, Schild GC, Almond JW (1984) Reversion to neurovirulence of the live-attenuated Sabin type 3 oral poliovirus vaccine. Nucleic Acids Res 12: 7787-7792.

51. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2005) Progress toward interruption of wild poliovirus transmission-worldwide, January 2004-March 2005. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 54:408-412.

52. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2006) Resurgence of wild poliovirus type 1 transmission and consequences of importation-^ 1 countries, 20022005. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 55: 145-150.

53. Chao L (1990) Fitness of RNA virus decreased by Muller's ratchet. Nature 348: 454455.

54. Cho MW, Richards OC, Dmitrieva TM, Agol V, Ehrenfeld E (1993) RNA duplex unwinding activity of poliovirus RNA-dependent RNA polymerase 3Dpol. J Virol 67: 3010-3018.

55. Cho MW, Teterina N, Egger D, Bienz K, Ehrenfeld E (1994) Membrane rearrangement and vesicle induction by recombinant poliovirus 2C and 2BC in human cells. Virology 202:129-145.

56. Choe SS, Kirkegaard K (2004) Intracellular topology and epitope shielding of poliovirus 3A protein. J Virol 78: 5973-5982.

57. Chumakov KM, Powers LB, Noonan KE, Roninson IB, Levenbook IS (1991) Correlation between amount of virus with altered nucleotide sequence and the monkey test for acceptability of oral poliovirus vaccine. Proc Natl Acad Sei USA 88: 199-203.

58. Chumakov KM, Norwood LP, Parker ML, Dragunsky EM, Ran YX, Levenbook IS (1992) RNA sequence variants in live poliovirus vaccine and their relation to neurovirulence. J Virol 66: 966-970.

59. Clarke DK, Duarte EA, Moya A, Elena SF, Domingo E, Holland J (1993) Genetic bottlenecks and population passages cause profound fitness differences in RNA virus. J Virol 66:966-970.

60. Colbere-Garapin F, Christodoulou C, Crainic R, Pelletier I (1989) Persistent poliovirus infection of human neuroblastoma cells. Proc Natl Acad Sci USA 86: 7590-7594.

61. Collis PS, O'Donnell BJ, Barton DJ, Rogers JA, Flanegan JB (1992) Replication of poliovirus RNA and subgenomic RNA transcripts in transfected cells. J Virol 66: 6480-6488.

62. Contreras G, Dimock K, Furesz J, Gardell C, Hazlett D, Karpinski K, McCorkle G, Wu L (1992) Genetic characterization of Sabin types 1 and 3 poliovaccine virus following serial passage in the human intestinal tract. Biologicals 20: 15-26.

63. Copper PD, Steiner-Pryor A, Scotti PD, Delong D (1974) On the nature of poliovirus genetic recombinants J Gen Virol 23:41-49.

64. Crotty S, Cameron CE, Andino R (2001) RNA virus error catastrophe: direct molecular test by using ribavirin. Proc Natl Acad Sci USA 98: 6895-6890.

65. Cuervo NS, Guillot S, Romanenkova N, Cochi SL, Combiescu M, Aubert-Combiescu A, Seghier M, Caro V, Crainic R, Delpeyroux F (2001) Genomic features of intertypic recombinant Sabin poliovirus strains excreted by primary vaccinees. J Virol 75:5740-5751.

66. Dahourou G, Guillot S, La Gall O, Crainic R (2002) Genetic recombination in wildtype poliovirus. J Gen Virol 83: 3103-3110.

67. Deitz SB, Dodd DA, Cooper S, Parham P, Kirkegaard K (2000) MHC I-dependent antigen presentation is inhibited by poliovirus protein 3A. Proc Natl Acad Sci USA 97: 13790-13795.

68. De la Torre JC, Wimmer E, Holland JJ (1990) Very high frequency of reversion to guanidine resistance in clonal pools of guanidine-dependent type 1 poliovirus. J Virol 64: 664-671.

69. Dobrikova E, Florez P, Bradrick S, Gromeier M (2003) Activity of a type 1 picomavirus internal ribosomal entry site is determined by sequences within the 3' nontranslated region. Proc Natl Acad Sci USA 100: 15125-15130.

70. Dodd DA, Giddings TH Jr, Kirkegaard K (2001) Poliovirus 3A protein limits interleukin-6 (1L-6), 1L-8, and beta interferon secretion during viral infection. J Virol 75:8158-8165.

71. Doedens JR, Kirkegaard K (1995) Inhibition of cellular protein secretion by poliovirus proteins 2B and 3A. EMBO J 14: 894-907.

72. Doedens JR, Giddings TH Jr, Kirkegaard K (1997) Inhibition of endoplasmic reticulum-to-Golgi traffic by poliovirus protein 3A: genetic and ultrastructural analysis. J Virol 71: 9054-9064.

73. Domingo E (1989) RNA virus evolution and the control of viral disease. Prog Drug Res 33: 93-133.

74. Domingo E, Escarmis C, Sevilla N, Baranowski E (1998) Population dinamics in the evolution of RNA viruses. Adv Exp Med Biol 440: 721-727.

75. Dowdle WR, De Gourville E, Kew OM, Pallansch MA, Wood DJ (2003) Polio eradication: the OPV paradox. Rev Med Virol 13:277-291.

76. Drake JW (1993) Rates of spontaneous mutation among RNA viruses. Proc Natl Acad Sci USA 90:4171-4175.

77. Driesel G, Diedrich S, Kunkel U, Schreier E (1995) Vaccine-associated cases of poliomyelitis over a 30 year period in East Germany. Eur J Epidemiol 11:647-654.

78. Duarte E, Clarke D, Moya A, Domingo E, Holland J (1992) Rapid fitness losses in mammalian RNA virus clones due to Muller's ratchet. Proc Natl Acad Sci USA 89: 6015-6019.

79. Duarte EA, Novella IS, Ledesma S, Clarke DK, Moya A, Elena SF, Domingo E, Holland JJ (1994) Subclonal components of consensus fitness in an RNA virus clone. J Virol 68:4295-4301.

80. Duggal R, Wimmer E (1999) Genetic recombination of poliovirus in vitro and in vivo: temperature-dependent alteration of crossover sites. Virology 258: 30-41.

81. Egger D, Pasamontes L, Bolten R, Boyko V, Bienz K (1996) Reversible dissociation of the poliovirus replication complex: functions and interactions of its components in viral RNA synthesis. J Virol 70: 8675-8683.

82. Egger D, Bienz K (2002) Recombination of poliovirus RNA proceeds in mixed replication complexes originating from distinct replication start sites. J Virol 76: 10960-10971.

83. Equestre M, Genovese D, Cavalieri F, Fiore L, Santoro R, Perez Bercoff R (1991) Identification of a consistent pattern of mutations in neurovirulent variants derived from the sabin vaccine strain of poliovirus type 2. J Virol 65: 2707-2710.

84. Escarmis C, Davila M, Charpentier N, Bracho A, Moya A, Domingo E (1996) Genetic lesions associated with Muller's ratchet in an RNA virus. J Mol Biol 264: 255-267.

85. Escarmis C, Davila M, Domingo E (1999) Multiple molecular pathways for fitness recovery of an RNA virus debilitated by operation of Muller's ratchet. J Mol Biol 285:495-505.

86. Escarmis C, Gomez-Mariano G, Davila M, Lazaro E, Domingo E (2002) Resistance to extinction of low fitness virus subjected to plaque-to-plaque transfers: diversification by mutation clustering. J Mol Biol 315: 647-661.

87. Evans DM, Dunn G, Minor PD, Schild GC, Cann AJ, Stanway G, Almond JW, Currey K, Maizel JV Jr (1985) Increased neurovirulence associated with a single nucleotide change in a noncoding region of the Sabin type 3 poliovaccine genome. Nature 314: 548-550.

88. Filman DJ, Syed R, Chow M, Macadam AJ, Minor PD, Hogle JM (1989) Structural factors that control conformational transitions and serotype specificity in type 3 poliovirus. EMBO J 8: 1567-1579.

89. Flanegan JB, Van Dyke TA (1979) Isolation of a soluble and template-dependent poliovirus RNA polymerase that copies virion RNA in vitro. J Virol 32: 155-161.

90. Fine PE, Oblapenko G, Sutter RW (2004) Polio control after certification: major issues outstanding. Bull WHO 82:47-52.

91. Fricks CE, Hogle JM (1990) Cell-induced conformational change in poliovirus: externalization of the amino terminus of VP1 is responsible for liposome binding. J Virol 64:1934-1945.

92. Friedrich F, Da-Silva EF, Schatzmayr HG (1996) Type 2 poliovirus recombinants isolated from vaccine-associated cases and from healthy contacts in Brazil. Acta Virol 40:27-33.

93. Furione M, Guillot S, Otelea D, Balanant J, Candrea A, Crainic R (1993) Polioviruses with natural recombinant genomes isolated from vaccine-associated paralytic poliomyelitis. Virology 196: 199-208.

94. Gamarnik AV, Andino R (1997) Two functional complexes formed by KH domain containing proteins with the 5' noncoding region of poliovirus RNA. RNA 3: 882892.

95. Gamarnik AV, Andino R (1998) Switch from translation to RNA replication in a positive-stranded RNA virus. Genes Dev 12: 2293-2304.

96. Gamarnik AV, Andino R (2000) Interactions of viral protein 3CD and poly(rC) binding protein with the 5' untranslated region of the poliovirus genome. J Virol 74: 2219-2226.

97. Gavrilin GV, Cherkasova EA, Lipskaya GY, Kew O, Agol VI (2000) Evolution of circulating wild poliovirus and of vaccine-derived poliovirus in an immunodeficient patient: a unifying model. J Virol 74: 7381-7390.

98. Georgescu MM, Delpeyroux F, Crainic R (1995) Tripartite genome organization of a natural type 2 vaccine/nonvaccine recombinant poliovirus. J Gen Virol 76: 23432348.

99. Georgescu MM, Balanant J, Ozden S, Crainic R (1997) Random selection: a model for poliovirus infection of the central nervous system. J Gen Virol 78: 1819-1828.

100. Giachetti C, Semler BL (1991) Role of a viral membrane polypeptide in strand-specific initiation of poliovirus RNA synthesis. J Virol 65:2647-2654.

101. Gmyl AP, Pilipenko EV, Maslova SV, Belov GA, Agol VI (1993) Functional and genetic plasticities of the poliovirus genome: quasi-infectious RNAs modified in the 5'-untranslated region yield a variety of pseudorevertants. J Virol 67: 6309-6316.

102. Gmyl AP, Belousov EV, Maslova SV, Chitrina EV, Chetverin AB, Agol VI (1999) Nonreplicative RNA Recombination in Polioviruses. J Virol 73: 8958-8965

103. Gmyl AP, Korshenko SA, Belousov EV, Khitrina EV, Agol VI (2003) Nonreplicative homologous RNA recombination: promiscuous joining of RNA pieces? RNA 9. 1221-1231.

104. Goodfellow I, Chaundry Y, Richardson A, Meredith J, Almond JW, Barclay W, Evans DJ (2000) Identification of a cis-acting replication element within the poliovirus coding region J Virol 74:4590-4600.

105. Gromeier M, Alexander L, Wimmer E (1996) Internal ribosomal entry site substitution eliminates neurovirulence in intergeneric poliovirus recombinants. Proc Natl Acad Sci USA 93: 2370-2375.

106. Gromeier M, Wimmer E, Gorbalelenya AE (1999 a) Genetics, pathogenesis and evolution of picornaviruses, In: Domingo E, Webster RG, Holland JJ (eds) Origin and evolution ofVViruses. Academic Press, San Diego 287-343.

107. Gromeier M, Bossert B, Arita M, Nomoto A, Wimmer E (1999 6) Dual stem loops within the poliovirus internal ribosomal entry site control neurovirulence. J Virol 73: 958-964.

108. Guillot S, Caro V, Cuervo N, Korotkova E, Combiescu M, Persu A, Combiescu AA, Delpeyroux F, Crainic R (2000) Natural genetic exchanges between vaccine and wild poliovirus strains in humans. J Virol 74: 8434-8443.

109. Haller AA, Semler BL (1995) Stem-loop structure synergy in binding cellular proteins to the 5' noncoding region of poliovirus RNA. Virology 206: 923-934.

110. Hambidge SJ, Sarnow P (1992) Translational enhancement of the poliovirus 5' noncoding region mediated by virus-encoded polypeptide 2A. Proc Natl Acad Sci USA 89:10272-10276.

111. Hanecak R, Semler BL, Anderson CW, Wimmer E (1982) Proteolytic processing of poliovirus polypeptides: antibodies to polypeptide P3-7c inhibit cleavage at glutamine-glycine pairs. Proc Natl Acad Sci USA 79: 3973-3977.

112. Harber J, Bernhardt G, Lu HH, Sgro JI, Wimmer E (1995) Canyon rim residues, including antigenic determinants, modulate serotype-specific binding to mutant of the poliovirus receptor. Virology 214: 559-570.

113. He Y, Bowman V, Mueller S, Bator C, Bella J, Peng X, Baker T, Wimmer E, Kuhn R, Rossmann M (2000) Interaction of the poliovirus receptor with poliovirus. Proc Natl Acad Sci USA 97: 79-84.

114. He Y, Mueller S, Chipman PR, Bator CM, Peng X, Bowman VD, Mukhopadhyay S, Wimmer E, Kuhn RJ, Rossmann MG (2003) Complexes of poliovirus serotypes with their common cellular receptor, CD155. J Virol 77: 4827-4835.

115. Herold J, Andino R (2001) Poliovirus RNA replication requires genome circularization through a protein-protein bridge. Molecular Cell 7: 581-591.

116. Hirst GK (1962) Genetic recombination with Newcastle disease virus, polioviruses, and influenza. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 27: 303-309.

117. Hogle JM, Chow M, Filman DJ (1985) Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 A resolution. Science 229: 1358-1365.

118. Hogle JM, Filman DJ (1989) The antigenic structure of poliovirus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 323: 467-478.

119. Holland JJ, de la Torre JC, Steinhauer DA (1992) RNA virus populations as quasispecies. CurrTop Microbiol Immunol 176: 1-20.

120. Horie H, Miyazawa M, Ota Y, Wakabayashi K, Yoshida II, Doi Y, Ilashizume S (2001) Analysis of the accumulation of mutants in Sabin attenuated polio vaccine viruses passaged in Vero cells. Vaccine 19:1456-1459.

121. Hovi T, Lindholm N, Savolainen C, Stenvik M, Burns C (2004) Evolution of wildtype 1 poliovirus in two healthy siblings excreting the virus over a period of 6 months. J Gen Virol 85: 369-377.

122. Ishii T, Shiroki K, Iwai A, Nomoto A (1999) Identification of a new element for RNA replication within the internal ribosome entry site of poliovirus RNA. J Gen Virol 80:917-920

123. Ivanova 0, Eremeeva T, Karganova G, Rumyantsev A, Leshinskaya E, Lipskaya G, Cherkasova E, Korotkova E, Grachev V, Drozdov S (2001) Poliomyelitis in Russia in 1998-1999. Dev Biol (Basel) 105:219-223.

124. Izumi RE, Valdez B, Banerjee R, Srivastava M, Dasgupta A (2001) Nucleolin stimulates viral internal ribosome entry site-mediated translation. Virus Res 76: 1729.

125. Jarvis TC, Kirkegaard K (1991) The polymerase in its labyrinth: mechanisms and implications of RNA recombination. Trends Genet 7: 186-191.

126. Jarvis TC, Kirkegaard K (1992) Poliovirus RNA recombination: mechanistic studies in the absence of selection EMBOJ 11:3135-3145.

127. Joachims M, Harris KS, Etchison D (1995) Poliovirus protease 3C mediates cleavage of microtubule-associated protein 4. Virology 211:451-461.

128. Joce R, Wood D, Brown D, Begg N (1992) Paralytic poliomyelitis in England and Wales, 1985-91. BMJ 305: 79-82.

129. Johnson KL, Sarnow P (1991) Three poliovirus 2B mutants exhibit noncomplementable defects in viral RNA amplification and display dosage-dependent dominance over wild-type poliovirus. J Virol 65: 4341-4349.

130. Jore J, De Geus B, Jackson R, Pouwels P, Enger-Valk B (1988) Poliovirus protein 3CD is the active protease for processing of the precursor protein PI in vitro. J Gen Virol 69: 1627-1636.

131. Karakasiliotis I, Markoulatos P, Katsorchis T (2004) Site analysis of recombinant and mutant poliovirus isolates of Sabin origin from patients and from vaccinees. Mol Cell Probes 18:103-109.

132. Kawamura N, Kohara M, Abe S, Komatsu T, Tago K, Arita M, Nomoto A (1989) Determinants in the 5' noncoding region of poliovirus Sabin 1 RNA that influence the attenuation phenotype. J Virol 63: 1302-1309.

133. Kew OM, Nottay BK (1984) Molecular epidemiology of polioviruses. Rev Infect Dis 6 Suppl 2:S499-504.

134. Kew OM, Mulders MN, Lipskaya GY, da Silva EE, Pallansch MA (1995) Molecular epidemiology of polioviruses. Sem Virol 6:401-414.

135. Kew OM, Sutter RW, Nottay BK, McDonough MJ, Prevots DR, Quick L, Pallansch MA (1998) Prolonged replication of a type 1 vaccine-derived poliovirus in an immunodeficient patient. J Clin Microbiol 36: 2893-2899.

136. Kew OM, Wright PF, Agol VI, Delpeyroux F, Shimizu H, Nathanson N, Pallansch MA (2004) Circulating vaccine-derived polioviruses: current state of knowledge. Bull WHO 82: 16-23.

137. Kew OM, Sutter RW, de Gourville EM, Dowdle WR, Pallansch MA (2005) Vaccine-derived polioviruses and the endgame strategy for global polio eradication. Annu Rev Microbiol 59: 587-635.

138. Khetsuriani N, Prevots DR, Quick L, Elder ME, Pallansch M, Kew O, Sutter RW (2003) Persistence of vaccine-derived polioviruses among immunodeficient persons with vaccine-associated paralytic poliomyelitis. J Infect Dis 188: 1845-1852.

139. King AM (1988 a) Genetic recombination in positive strand RNA viruses, In E Domingo, JJ Holland, P Ahlquist (ed.), RNA Genetics 149-165.

140. King AM (1988 6) Preferred sites of recombination in poliovirus RNA: an analysis of 40 intertypic cross-over sequences. Nucleic Acids Res 16: 11705-11723.

141. Kirkegaard K, Baltimore D (1986) The mechanism of RNA recombination in Poliovirus. Cell 47:433-443.

142. Kitamura N, Semler BL, Rothberg PG, Larsen GR, Adler CJ, Dorner AJ, Emini EA, Hanecak R, Lee JJ, van der Werf S, Anderson CW, Wimmer E (1981) Primary structure, gene organization and polypeptide expression of poliovirus RNA. Nature 291:547-553.

143. Koike S, Taya C, Kurata T, Abe S, Ise I, Yonekawa H, Nomoto A (1991) Transgenic mice susceptible to poliovirus. Proc Natl Acad Sei U S A 88: 951-955.

144. Kuge S, Saito I, Nomoto A (1986) Primary structure of poliovirus defective-interfering particle genomes and possible generation mechanisms of the particles J Mol Biol 192:473-487.

145. Kuge S, Nomoto A (1987) Construction of viable deletion and insertion mutants of the Sabin strain of type 1 poliovirus: function of the 5' noncoding sequence in viral replication. J Virol 61:1478-1487.

146. Kuhn RJ, Tada H, Ypma-Wong MF, Semler BL, Wimmer E (1988) Mutational analysis of the genome-linked protein VPg of poliovirus. J Virol 62: 4207-4215.

147. Kuznetsov YG, Daijogo S, Zhou J, Semler BL, McPherson A (2005) Atomic force microscopy analysis of icosahedral virus RNA. J Mol Biol 347:41-52.

148. Lama J, Sanz MA, Rodrguez PL (1995) A Role for 3AB Protein in Poliovirus Genome Replication. J Biol Chem 270: 14430-14438.

149. Lama J, Sanz MA, Carrasco L (1998) Genetic analysis of poliovirus protein 3A: characterization of a non-cytopathic mutant virus defective in killing Vero cells. J Gen Virol 79: 1911-1921.

150. La Monica N, Meriam C, Racaniello VR (1986) Mapping of sequences required for mouse neurovirulence of poliovirus type 2 Lansing. J Virol 57: 515-525.

151. La Monica N, Almond JW, Racaniello VR (1987) A mouse model for poliovirus neurovirulence identifies mutations that attenuate the virus for humans. J Virol 61: 2917-2920.

152. La Monica N, Racaniello VR (1989) Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. J Virol 63: 2357-2360.

153. Lazaro E, Escarmis C, Perez-Mercader J, Manrubia SC, Domingo E (2003) Resistance of virus to extinction on bottleneck passages: study of a decaying and fluctuating pattern of fitness loss. Proc Natl Acad Sci USA 100: 10830-10835.

154. Ledinko N (1963) Genetic recombination with poliovirus type 1. Studies of crosses between a normal horse serum-resistant mutant and several guanidine-resistant mutants of the same strain. Virology 20: 107-119.

155. Lee YF, Nomoto A, Detjen BM, Wimmer E (1977) A protein covalently linked to poliovirus genome RNA. Proc Natl Acad Sci USA 74: 59-63.

156. Lee WM, Monroe SS, Rueckert RR (1993) Role of maturation cleavage in infectivity of picornaviruses: activation of an infectosome. J Virol 67: 2110-2122.

157. Li JP, Baltimore D (1988) Isolation of poliovirus 2C mutants defective in viral RNA synthesis. J Virol 62: 4016-4021.

158. Lipskaya GY, Muzychenko AR, Kutitova OK, Maslova SV, Equestre M, Drozdov SG, Bercoff RP, Agol VI (1991) Frequent isolation of intertypic poliovirus recombinants with serotype 2 specificity from vaccine-associated polio cases. J Med Virol 35:290-296

159. Liu HM, Zheng DP, Zhang LB, Oberste MS, Pallansch MA, Kew OM (2000) Molecular evolution of a type 1 wild-vaccine poliovirus recombinant during widespread circulation in China. J Virol 74:11153-11161.

160. Liu HM, Zheng DP, Zhang LB, Oberste MS, Kew OM, Pallansch MA (2003) Serial recombination during circulation of type 1 wild-vaccine recombinant polioviruses in China. J Virol 77:10994-11005.

161. Lu HH, Wimmer E (1996) Poliovirus chimeras replicating under the translational control of genetic elements of hepatitis C virus reveal unusual properties of the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sei USA 93: 14121417.

162. Lukashev AN, Lashkevich VA, Ivanova OE, Koroleva GA, Hinkkanen AE, Ilonen J (2003) Recombination in circulating enteroviruses. J Virol 77: 10423-10431.

163. Lukashev AN, Lashkevich VA, Ivanova OE, Koroleva GA, Hinkkanen AE, Ilonen J (2005) Recombination in circulating Human enterovirus B: independent evolution of structural and non-structural genome regions.J Gen Virol 86:3281-3290.

164. Macadam AJ, Ferguson G, Arnold C, Minor PD (1991) An assembly defect as a result of an attenuating mutation in the capsid proteins of the poliovirus type 3 vaccine strain. J Virol 65: 5225-5231.

165. Macadam AJ, Ferguson G, Budison J, Stone D, Skuce R, Almond JW, Minor PD (1992) Correlation of RNA secondary structure and attenuation of Sabin vaccine strains of poliovirus in tissue culture. Virology 189:415-422.

166. Martin J, Dunn G, Hull R, Patel V, Minor P (2000 a) Evolution of the Sabin strain of type 3 poliovirus in an immunodefficient patient during the entire 637-day period of virus excretion. J Virol 74: 3001-3010.

167. Martin J, Ferguson GL, Wood DJ, Minor PD (2000 6) The vaccine origin of the 1968 epidemic of type 3 poliomyelitis in Poland. Virology 278:42-49.

168. Martin J, Odoom K, Tuite G, Dunn G, Hopewell N, Cooper G, Fitzharris C, Butler K, Hall WW, Minor PD (2004) Long-term excretion of vaccine-derived poliovirus by a healthy child. J Virol 78: 13839-13847.

169. Meerovitch K, Svitkin YV, Lee HS, Lejbkowicz F, Kenan DJ, Chan EK, Agol VI, Keene JD, Sonenberg N (1993) La autoantigen enhances and corrects aberrant translation of poliovirus RNA in reticulocyte lysate. J Virol 67: 3798-3807.

170. Mellits KH, Meredith JM, Rohll JB, Evans DJ, Almond JW (1998) Binding of a cellular factor to the 3' untranslated region of the RNA genomes of entero- and rhinoviruses plays a role in virus replication. J Gen Virol 79: 1715-1723.

171. Mendelsohn C, Wimmer E, Racaniello V (1989) Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell 56: 855-865.

172. Minor PD (1980) Comparative biochemical studies of type 3 poliovirus. J Virol 34: 73-84.

173. Minor PD (1992) The molecular biology of poliovaccines. J Gen Virol 73: 30653077.

174. Minor PD (1999) Poliovirus vaccination: current understanding of poliovirus interactions in humans and implications for the eradication of poliomyelitis. Expert Reviews in Molecular Medicine.

175. Minor PD (2004) Polio eradication, cessation of vaccination and re-emergence of disease. Nature Rev Microbiol 2:473-482.

176. Minor PD, John A, Ferguson M, Icenogle JP (1986) Antigenic and molecular evolution of the vaccine strain of type 3 poliovirus during the period of excretion by the primary vaccinee. J Gen Virol 67: 693-706.

177. Minor PD, Dunn G (1988) The effect of sequences in the 5' non-coding region on the replication of polioviruses in the human gut. J Gen Virol 69: 1091-1096.

178. Mirmomeni MH, Hughes PJ, Stanway G (1997) An RNA tertiary structure in the 3' untranslated region of enteroviruses is necessary for efficient replication. J Virol 71: 2363-2370.

179. Mirzayan C, Wimmer E (1994) Biochemical studies on poliovirus polypeptide 2C: evidence for ATPase activity. Virology 199:176-187.

180. Molla A, Paul AV, Schmid M, Jang SK, Wimmer E (1993) Studies on dicistronic polioviruses implicate viral proteinase 2Apro in RNA replication. Virology 196: 739747.

181. Molla A, Harris KS, Paul AV, Shin SH, Mugavero J, Wimmer E (1994) Stimulation of poliovirus proteinase 3Cpro-related proteolysis by the genome-linked protein VPg and its precursor ЗАВ. J Biol Chem 269:27015-27020.

182. Morasco BJ, Sharma N, Parilla J, Flanegan JB (2003) Poliovirus cre(2C)-dependent synthesis of VPgpUpU is required for positive- but not negative-strand RNA synthesis. J Virol 77:5136-5144.

183. Mueller S, Wimmer E, Cello J (2005) Pohovirus and poliomyelitis: a tale of guts, brains, and an accidental event. Virus Res 111: 175-193.

184. Murray KE, Barton DJ (2003) Poliovirus CRE-dependent VPg uridylylation is required for positive-strand RNA synthesis but not for negative-strand RNA synthesis J Virol 77:4739-4750.

185. Nagy PD, Simon AE (1997) New Insights in RNA virus recombination Virology 235: 1-9.

186. Nagy PD, Zhang C, Simon AE (1998) Dissecting RNA recombination in vitro: role of RNA sequences and the viral replicase. EMBO J 17: 2392-2403.

187. Neufeld KL, Galarza JM, Richards OC, Summers DF, Ehrenfeld E (1994) Identification of terminal adenylyl transferase activity of the poliovirus polymerase 3Dpol. J Virol 68:5811-5818.

188. Neznanov N, Kondratova A, Chumakov KM, Angres B, Zhumabayeva B, Agol VI, Gudkov AV (2001) Poliovirus protein 3A inhibits tumor necrosis factor (TNF)-induced apoptosis by eliminating the TNF receptor from the cell surface. J Virol 75: 10409-10420.

189. Nkowane BM, Wassilak SGF, Orenstein WA, Bart KJ, Schönberger LB, Hinman AR, Kew OM (1987) Vaccine-associated paralytic poliomyelitis. United States: 1973 through 1984. J Am Med Assoc 257: 1335-1340.

190. Nomoto A, Omata T, Toyoda H, Kuge S, Horie H, Kataoka Y, Genba Y, Nakano Y, Imura N (1982) Complete nucleotide sequence of the attenuated poliovirus Sabin 1 strain genome. Proc Natl Acad Sei USA 79: 5793-5797.

191. Novak J, Kirkegaard K (1991) Improved method for detecting poliovirus negative strands used to demonstrate specificity of positive-strand encapsidation and the ratio of positive to negative strands in infected cells. J Virol 65: 3384-3387.

192. Novak J, Kirkegaard K (1994) Coupling between genome translation and replication in an RNA virus. Genes Dev 8:1726-1737.

193. Novella IS, Duarte EA, Elena SF, Moya A, Domingo E, Holland JJ (1995 a) Exponential increases of RNA virus fitness during large population transmissions Proc Natl Acad Sei USA 92: 5841-5844.

194. Novella IS, Elena SF, Moya A, Domingo E, Holland JJ (1995 6) Size of genetic bottlenecks leading to virus fitness loss is determined by mean initial population fitness. J Virol 69: 2869-2872.

195. Novella IS, Quer J, Domingo E, Holland JJ (1999) Exponential fitness gains of RNA virus populations are limited by bottleneck effects. J Virol 73:1668-1671.

196. Ochs K, Saleh L, Bassiii G, Sonntag VH, Zeller A, Niepmann M (2002) Interaction of Translation Initiation Factor eIF4B with the Poliovirus Internal Ribosome Entry Site. J Virol 76:2113-2122.

197. Ochs K, Zeller A, Saleh L, Bassiii G, Song Y, Sonntag A, Niepmann M (2003) Impaired binding of standard initiation factors mediates poliovirus translation attenuation. J Virol 77: 115-122.

198. Omata T, Kohara M, Kuge S, Komatsu T, Abe S, Semler BL, Kameda A, Itoh H, Arita M, Wimmer E, Nomoto A (1986) Genetic analysis of the attenuation phenotype of poliovirus type 1. J Virol 58: 348-358.

199. Oprisan G, Combiescu M, Guillot S, Саго V, Combiescu A, Delpeyroux F, Crainic R (2002) Natural genetic recombination between co-circulating heterotypic enteroviruses. J Gen Virol 83:2193-2200.

200. Page GS, Mosser AG, Hogle JM, Filman DJ, Rueckert RR, Chow M (1988) Three-dimensional structure of poliovirus serotype 1 neutralizing determinants. J Virol 62: 1781-1794.

201. Palmenberg AC, Sgro J (1997) Topological organization of picornaviral genomes: statistical prediction of RNA structural signals. Semin Virol 8:231-241.

202. Parvin JD, Moscona A, Pan WT, Leider JM, Palese P (1986) Measurement of the mutation rates of animal viruses: influenza A virus and poliovirus type 1. J Virol 59. 377-383.

203. Paul JR (1971) A history of poliomyelitis. New Haven, CT: Yale Univ Press.

204. Paul AV, Cao X, Harris KS, Lama J, Wimmer E (1994) Studies with poliovirus polymerase 3Dpol. Stimulation of poly(U) synthesis in vitro by purified poliovirus protein ЗАВ. J Biol Chem 269: 29173-29181.

205. Paul AV, van Boom JH, Filippov D, Wimmer E (1998) Protein-primed RNA synthesis by purified poliovirus RNA polymerase. Nature 393: 280-284.

206. Paul AV, Rieder E, Kim DW, van Boom JH, Wimmer E (2000) Identification of an RNA Hairpin in Poliovirus RNA That Serves as the Primary Template in the In Vitro Uridylylation of VPg. J Virol 74: 10359-10370.

207. Paul AV, Yin J, Mugavero J, Rieder E, Liu Y, Wimmer E (2003) A "slide-back" mechanism for the initiation of protein-primed RNA synthesis by the RNA polymerase of poliovirus. J Biol Chem 278: 43951-43960.

208. Pelletier J, Kaplan G, Racaniello VR, Sonenberg N (1988) Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence element within the 5'-noncoding region. Mol Cel Biol 8: 1103-1112.

209. Pfeiffer JK, Kirkegaard K (2003) A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity. Proc Natl Acad Sei USA 100: 7289-7294.

210. Pfeiffer JK, Kirkegaard K (2005) Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice. PLoS Pathog 1: el 1.

211. Pilipenko EV, Gmyl AP, Maslova SV, Svitkin YV, Sinyakov AN, Agol VI (1992 a) A prokaryotic-like cis-element in the cap-independent internal initiation of translation on Picornavirus RNA. Cell 68: 119-131.

212. Pilipenko EV, Gmyl AP, Agol VI (1995) A model for rearrangements in RNA genomes. Nucleic Acids Res 23: 1870-1875.

213. Pollard SR, Dunn G, Cammack N, Minor PD, Almond JW (1989) Nucleotide sequence of a neurovirulent variant of the type 2 oral poliovirus vaccine. J Virol 63: 4949-4951.

214. Poyry T, Kinnunen L, Hovi T (1992) Genetic variation in vivo and proposed functional domains of the 5' noncoding region of poliovirus RNA. J Virol 66: 53135319.

215. Poyry TA, Hentze MW, Jackson RJ (2001) Construction of regulatable Picornavirus IRESes as a test of current models of the mechanism of internal translation initiation. RNA 7: 647-660.

216. Putnak JR, Phillips BA (1981) Differences between poliovirus empty capsids formed in vivo and those formed in vitro: a role for the morphopoietic factor. J Virol 40 173-183.

217. Racaniello VR (2006) One hundred years of poliovirus pathogenesis.Virology 344. 9-16.

218. Racaniello VR, Baltimore D (1981) Molecular cloning of poliovirus cDNA and determination of the complete nucleotide sequence of the viral genome. Proc Natl Acad Sci USA 78:4887-4891.

219. Racaniello VR, Meriam C (1986) Poliovirus temperature-sensitive mutant containing a single nucleotide deletion in the 5'-noncoding region of the viral RNA. Virology 155:498-507.

220. Ren RB, Costantini F, Gorgacz EJ, Lee JJ, Racaniello VR (1990) Transgenic mice expressing a human poliovirus receptor: a new model for poliomyelitis. Cell 63: 353362.

221. Ren RB, Moss EG, Racaniello VR (1991) Identification of two determinants that attenuate vaccine-related type 2 poliovirus. J Virol 65: 1377-1382.

222. Rezapkin GV, Chumakov KM, Lu Z, Ran Y, Dragunsky EM, Levenbook IS (1994) Microevolution of Sabin 1 strain in vitro and genetic stability of oral poliovirus vaccine. Virology 202: 370-378.

223. Rezapkin GV, Norwood LP, Taffs RE, Dragunsky EM, Levenbook IS, Chumakov KM (1995) Microevolution of type 3 Sabin strain of poliovirus in cell cultures and its implications for oral poliovirus vaccine quality control. Virology 211: 377-384.

224. Rezapkin GV, Alexander W, Dragunsky E, Parker M, Pomeroy K, Asher DM, Chumakov KM (1998) Genetic stability of Sabin 1 strain of poliovirus: implications for quality control of oral poliovirus vaccine. Virology 245: 183-187.

225. Rezapkin GV, Douthitt M, Dragunsky E, Chumakov KM (1999 a) Réévaluation of nucleotide sequences of wild-type and attenuated polioviruses of type 3. Virus Res 65:111-119.

226. Rezapkin GV, Fan L, Asher DM, Fibi MR, Dragunsky EM, Chumakov KM (1999 6) Mutations in Sabin 2 strain of poliovirus and stability of attenuation phenotype. Virology 258:152-160.

227. Rieder E, Paul AV, Kim DW, van Boom JH, Wimmer E (2000) Genetic and biochemical studies of poliovirus cis-acting replication element ere in relation to VPg uridylylation. J Virol 74: 10371-10380.

228. Robertson SE, Chan C, Kim-Farley R, Ward N (1990) Worldwide status of poliomyelitis in 1986,1987 and 1988, and plans for its global eradication by the year 2000. World Health Stat Q 43: 80-90.

229. Rodriguez PL, Carrasco L (1993) Poliovirus protein 2C has ATPase and GTPase activities. J Biol Chem 268: 8105-8110.

230. Rohll JB, Moon DH, Evans DJ, Almond JW (1995) The 3* untranslated region of picornavirus RNA: features required for efficient genome replication. J Virol 69: 7835-7844.

231. Romanova LI, Tolskaya EA, Kolesnikova MS, Agol VI (1980) Biochemical evidence for intertypic genetic recombination of polioviruses. FEBS Lett 118: 109112.

232. Romanova LI, Blinov VM, Tolskaya EA, Viktorova EG, Kolesnikova MS, Guseva EA, Agol VI (1986) The primary structure of crossover regions of intertypic poliovirus recombinants: a model of recombination between RNA genomes. Virology 155:202-213.

233. Rousset D, Rakoto-Andrianarivelo M, Razafindratsimandresy R, Randriamanalina B, Guillot S, Balanant J, Mauclere P, Delpeyroux F (2003) Recombinant vaccine-derived poliovirus in Madagascar. Emerg Infect Dis 9: 885-887.

234. Ruiz-Jarabo CM, Arias A, Baranowski E, Escarmis C, Domingo E (2000) Memory in viral quasispecies. J Virol 74: 3543-3547.

235. Sabin AB, Boulger LR (1973) History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains. J Biol Stand 1: 115-118.

236. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467.

237. Santti J, Hyypia T, Kinnunen L, Salminen M (1999) Evidence of Recombination among Enteroviruses. J Virol 73: 8741-8749.

238. Sedivy JM, Capone JP, RajBhandary UL, Sharp PA (1987) An inducible mammalian amber suppressor: propagation of a poliovirus mutant. Cell 50: 379-389.

239. Sevilla N, Ruiz-Jarabo CM, Gomez-Mariano G, Baranowski E, Domingo E (1998) An RNA virus can adapt to the multiplicity of infection. J Gen Virol 79: 2971-2980.

240. Slobodskaya OR, Gmyl AP, Maslova SV, Tolskaya EA, Viktorova EG, Agol VI (1996) Poliovirus neurovirulence correlates with the presence of a cryptic AUG upstream of the initiator codon. Virology 221:141-150.

241. Stanway G (1990) Structure, function and evolution of picornaviruses. J Gen Virol 71 2483-2501.

242. Stanway G, Hovi T, Knowles NJ, Hyypia T (2002) Molecular and biological basis of picornavirus taxonomy. Molecular biology of Picornaviruses: 17-24.

243. Steinhauer DA, Holland JJ (1987) Rapid evolution of RNA viruses Annu Rev Microbiol 41:409-433.

244. Steinhauer DA, de la Torre JC, Meier E, Holland JJ (1989) Extreme heterogeneity in populations of vesicular stomatitis virus. J Virol May 63: 2072-2080.

245. Sutter RW, Caceres VM, Mas Lago P (2004) The role of routine polio immunization in the post-certification era. Bull World Health Organ 82: 31-39.

246. Svitkin YV, Maslova SV, Agol VI (1985) The genomes of attenuated and virulent poliovirus strains differ in their in vitro translation efficiencies. Virology 147: 243252.

247. Svitkin YV, Pestova TV, Maslova SV, Agol VI (1988) Point mutations modify the response of poliovirus RNA to a translation initiation factor: a comparison of neurovirulent and attenuated strains. Virology 166: 394-404.

248. Svitkin YV, Cammack N, Minor PD, Almond JW (1990) Translation deficiency of the Sabin type 3 poliovirus genome: association with an attenuating mutation C472----U. Virology 175: 103-109.

249. Svitkin YV, Meerovitch K, Lee HS, Dholakia JN, Kenan DJ, Agol VI, Sonenberg N (1994) Internal translation initiation on poliovirus RNA: further characterization of La function in poliovirus translation in vitro. J Virol 68: 1544-1550.

250. Taffs RE, Chumakov KM, Rezapkin GV, Lu Z, Douthitt M, Dragunsky EM, Levenbook IS (1995) Genetic stability and mutant selection in Sabin 2 strain of oral poliovirus vaccine grown under different cell culture conditions. Virology 209: 366373.

251. Takeda N, Kuhn RJ, Yang CF, Takegami T, Wimmer E (1986) Initiation of poliovirus plus-strand RNA synthesis in a membrane complex of infected HeLa cells. J Virol 60:43-53.

252. Takegami T, Semler BL, Anderson CW, Wimmer E (1983) Membrane fractions active in poliovirus RNA replication contain VPg precursor polypeptides. Virology 128: 33-47.

253. Tatem JM, Weeks-Levy C, Georgiu A, DiMichele SJ, Gorgacz EJ, Racaniello VR, Cano FR, Mento SJ (1992) A mutation present in the amino terminus of Sabin 3 poliovirus VP1 protein is attenuating. J Virol 66: 3194-3197.

254. Teterina NL, Kean KM, Gorbalenya AE, Agol VI, Girard M (1992) Analysis of the functional significance of amino acid residues in the putative NTP-binding pattern of the poliovirus 2C protein. J Gen Virol 73: 1977-1986.

255. Teterina NL, Zhou WD, Cho MW, Ehrenfeld E (1995) Inefficient complementation activity of poliovirus 2C and 3D proteins for rescue of lethal mutations. J Virol 69: 4245-4254.

256. Teterina NL, Rinaudo MS, Ehrenfeld E (2003) Strand-specific RNA synthesis defects in a poliovirus with a mutation in protein 3A. J Virol 77: 12679-12691.

257. Todd S, Towner JS, Brown DM, Semler BL (1997) Replication-competent picornaviruses with complete genomic RNA 3' noncoding region deletions. J Virol 71:8868-8874.

258. Tolskaya EA, Romanova LI, Kolesnikova MS, Agol VI (1983) Intertypic recombination in poliovirus: genetic and biochemical studies. Virology 124: 121132.

259. Towner JS, Ho TV, Semler BL (1996) Determinants of membrane association for poliovirus protein ЗАВ. J Biol Chem 271:26810-26818.

260. Toyoda H, Nicklin M, Murray M, Anderson C, Dunn J, Studier F, Wimmer E (1986) A second virus-encoded proteinase involved in proteolytic processing of poliovirus polyprotein. Cell 45: 761-770.

261. Trono D, Andino R, Baltimore D (1988) An RNA sequence of hundreds of nucleotides at the 5' end of poliovirus RNA is involved in allowing viral protein synthesis. J Virol 62:2291-2299.

262. Van Dyke ТА, Flanegan JB (1980) Identification of poliovirus polypeptide P63 as a soluble RNA-dependent RNA polymerase. J Virol 35: 732-740.

263. Ventoso I, Barco A, Carrasco L (1998) Mutational analysis of poliovirus 2Apro. Distinct inhibitory functions of 2apro on translation and transcription. J Biol Chem 273:27960-27967.

264. Vignuzzi M, Stone JK, Arnold JJ, Cameron CE, Andino R (2006) Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature 439: 344-348.

265. Waggoner S, Sarnow P (1998) Viral ribonucleoprotein complex formation and nucleolar-cytoplasmic relocalization of nucleolin in poliovirus-infected cells. J Virol 72: 6699-6709.

266. Wang J, Bakkers JM, Galama JM, Bruins Slot HJ, Pilipenko EV, Agol VI, Melchers WJ (1999) Structural requirements of the higher order RNA kissing element in the enteroviral 3'UTR. Nucleic Acids Res 27: 485-490.

267. Ward CD, Stokes MA, Flanegan JB (1988) Direct measurement of the pohovirus RNA polymerase error frequency in vitro. J Virol 62: 558-562.

268. Ward CD, Flanegan JB (1992) Determination of the poliovirus RNA polimerase error frequency at eight sites in the viral genome. J Virol 66: 3784-3793.

269. Weeks-Levy C, Tatem JM, DiMichele SJ, Waterfield W, Georgiu AF, Mento SJ (1991) Identification and characterization of a new base substitution in the vaccine strain of Sabin 3 poliovirus. Virology 185: 934-937.

270. Wells VR, Plotch SJ, DeStefano JJ (2001) Determination of the mutation rate of poliovirus RNA-dependent RNA polymerase. Virus Res 74: 119-132.

271. Wessels E, Duijsings D, Notebaart RA, Melchers WJ, van Kuppeveld FJ (2005) A proline-nch region in the coxsackievirus 3A protein is required for the protein to inhibit endoplasmic reticulum-to-golgi transport. J Virol 79: 5163-5173.

272. Westrop GD, Wareham KA, Evans DM, Dunn G, Minor PD, Magrath DI, Taffs F, Marsden S, Skinner MA, Schild GC, Almond JW (1989) Genetic basis of attenuation of the Sabin type 3 oral poliovirus vaccine. J Virol 63:1338-1344.

273. Witwer C, Rauscher S, Hofacker IL, Stadler PF (2001) Conserved RNA secondary structures in Picornaviridae genomes. Nucleic Acids Res 29: 5079-5089.

274. Wood DJ, Sutter RW, Dowdle WR (2000) Stopping poliovirus vaccination after eradication: issues and challenges. Bull World Health Organ78: 347-357.

275. Yalamanchili P, Harris K, Wimmer E, Dasgupta A (1996) Inhibition of basal transcription by poliovirus: a virus- encoded protease (3Cpro) inhibits formation of TBP-TATA box complex in vitro. J Virol 70: 2922-2929.

276. Yalamanchili P, Banerjee R, Dasgupta A (1997) Poliovirus-encoded protease 2APro cleaves the TATA-binding protein but does not inhibit host cell RNA polymerase II transcription in vitro. J Virol 71: 6881-6886.

277. Yang CF, Naguib T, Yang SJ, Nasr E, Jorba J, Ahmed N, Campagnoli R, van der Avoort H, Shimizu H, Yoneyama T, Miyamura T, Pallansch M, Kew 0 (2003) Circulation of endemic type 2 vaccine-derived poliovirus in Egypt from 1983 to 1993. J Virol 77:366-377.

278. Yang Y, Rijnbrand R, Watowich S, Lemon SM (2004) Genetic evidence for an interaction between a picornaviral cis-acting RNA replication element and 3CD protein. J Biol Chem 279: 12659-12667.

279. Yin J, Paul AV, Wimmer E, Rieder E (2003) Functional dissection of a poliovirus cis-acting replication element PV-cre(2C).: analysis of single- and dual-cre viral genomes and proteins that bind specifically to PV-cre RNA. J Virol 77: 5152-5166.

280. Yogo Y, Wimmer E (1972) Polyadenylic acid at the 3'-terminus of poliovirus RNA. Proc Natl Acad Sci USA 69:1877-1882.

281. Ypma-Wong MF, Dewalt PG, Johnson VH, Lamb JG, Semler BL (1988) Protein 3CD is the major poliovirus proteinase responsible for cleavage of the PI capsid precursor.Virology 166: 265-270.

282. Zheng DP, Zhang LB, Fang ZY, Yang CF, Mulders M, Pallansch MA, Kew OM (1993) Distribution of wild type 1 poliovirus genotypes in China J Infect Dis 168: 1361-1367.

Информация о работе

Короткова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.06

Диссертация

Рекомбинантные геномы вакцинно-родственных штаммов полиовируса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Рекомбинантные геномы вакцинно-родственных штаммов полиовируса ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантные геномы вакцинно-родственных штаммов полиовируса"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Короткова, Екатерина Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рекомбинантные геномы вакцинно-родственных штаммов полиовируса"

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Короткова, Екатерина Александровна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Короткова, Екатерина Александровна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рекомбинантные геномы вакцинно-родственных штаммов полиовируса
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология