Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Географическое распределение генотипов полиовируса на территории бывшего СССР

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Географическое распределение генотипов полиовируса на территории бывшего СССР"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

РГ8 11

ГЕОГРАФИЧЕСКОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОТИПОВ ПОЛИОВИРУСА НА ТЕРРИТОРИИ БЫВШЕГО СССР

03.00.03 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996 г.

^ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

НОЯ 1998

На нравах рукописи ЧЕРКАСОВА Елена Алексеевна

Работа выполнена в отделе взаимодействия вируса с клеткой НИИ физик химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М. В. Ломоносова.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, член-корр. РАМН В. И. Агол кандидат биологических наук Г. Ю. Липская

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук А. Д. Альтштейн доктор биологических наук В. П. Грачев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского

Защита состоится « » 199 г. в часов на заседании Специализированно совета Д.053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносо по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ, корпус "А".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГ

Автореферат разослан« » 199 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Со времени создания эффективных вакцин против полиомиелита - сначала инактивироваиной вакцины (Salk et al., 1954), а затем живой аттенуированной вакцины (Sabin et al., 1959) - полиомиелит стал контролируемым заболеванием в большинстве стран мира (Kim-Farley et al., 1984; Varughese et al., 1989; Strebel et al., 1992). Тем не менее, несмотря на явные успехи в борьбе с полиомиелитом, достигнутые в развитых странах мира путем проведения программ иммунизации, паралитический полиомиелит продолжает оставаться серьезной проблемой для развивающихся стран Азии и Африки, а также некоторых стран Европы. В связи с этим на Ассамблее Всемирной Организации Здравоохранения, проходившей в 1988 г., была поставлена за/дача полной ликвидации полиомиелита на Земном шаре к 2000 г. (WHA, 1988; WHO, 1992). Результатом усилий, предпринимаемых для достижения поставленной задачи, явилось искоренение полиомиелита в Америке, где с 1991 г. не было зарегистрировано ни одного случая этого заболевания (de Quadros et al., 1992; Tambini et al., 1993; Pari American Health Organization, 1995). Основные трудности на пути глобального искоренения полиомиелита связаны, в первую очередь, с социальной и политической нестабильностью во многих странах, в том числе в некоторых республиках бывшего СССР, влекущей за собой серьезные дефекты в программах иммунизации населения. Для борьбы с паралитическим полиомиелитом важно своевременное выявление случаев заболевания, выделение и идентификация штаммов полиовируса, вызвавших эти заболевания, а также мониторинг

штаммов, циркулирующих среди здорового населения и выделяемых и: объектов окружающей среды.

Для анализа нолиовирусного генома, быстро эволюционирующего npi репликации в человеческом организме, применяются молекулярно-генетические методы, позволяющие проводить оценку эпидемиологическю связей между выявляемыми полиовирусными штаммами и изучать пути ш трансмиссии. Для установления происхождения штаммов полиовируса i выявления родственных связей между ними успешно применяется метод частичного секвенирования вирусного генома (Rico-Hesse et al„ 1987; Kew e al., 1990, 1993; Zheng et al., 1993). Информация о первичной структуре участков РНК генома, полученная с помощью этого метода, может быть зате\ использована для синтеза олигонуклеотидных праймеров, позволяющие проводить рутинную диагностику штаммов полиовируса в клинически) образцах и объектах окружающей среды с помощью методов подимеразпо! цепной реакции (ПЦР) и молекулярной гибридизации (Schweiger et. al., 1994 da Silva et al., 1991; Yang et al., 1991, 1992).

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение штаммо] вируса полиомиелита (пикорнавируса, относящегося к роду Enterovirus) выделенных от больных паралитическим полиомиелитом на территорш бывшего СССР в период с 1982 по 1991 гт., а также установлени родственных связей между дикими штаммами, послужившим] этиологическими агентами заболеваний, и создание молекулярных реагента для их быстрой детекции методом ПЦР.

Научная новизна. Выяснено происхождение штаммов вируса полиомиелита, послуживших этиологическими агентами заболеваний паралитическим полиомиелитом в разных регионах бывшего СССР в период с 1982 по 1991 гг. Показано, что крайне редкие случаи заболевания паралитическим полиомиелитом были вызваны вакцинородственными штаммами полиовируса преимущественно типа 2. В то же время, вспышки и отдельные случаи заболевания паралитическим полиомиелитом были ассоциированы с дикими штаммами полиовируса типа 1 и типа 3. Молекулярно-эпидемиологический анализ позволил классифицировать дикие штаммы типа 1 на различные геотипы - географические генотипы - А, Т, в, а штаммы типа 3 - объединить в один геотшх С. В работе были сконструированы и использованы праймеры для детекции и идентификации диких штаммов полиовируса типа 1 и типа 3 методом ПЦР.

Практическая ценность работы. Выяснено происхождение штаммов вируса полиомиелита, послуживших этиологическими агентами заболеваний паралитическим полиомиелитом в разных регионах бывшего СССР в период с 1982 по 1991 гг. Показана широкая циркуляция диких штаммов полиовируса типа 1 и типа 3 на территории Кавказа и Средней Азии. Молекулярно-эпидемиологический подход позволил определить родственные связи между дикими штаммами полиовируса и возможные пути их распространения. Создание набора праймеров, специфически узнающих геотипы полиовируса, циркулирующие в данном регионе, открывает перспективы создания системы надзора за распространением диких штаммов полиовируса путем мониторинга объектов окружающей среды и штаммов, выделенных от здоровых людей.

Апробация работы. Материалы исследований были представлены на пяти международных конференциях. Результаты работы изложены в 2 публикациях и 5 сообщениях. Диссертация была апробирована нг объединенном семинаре отдела взаимодействия вируса с клеткой НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского и кафедры вирусолопп Биологического факультета МГУ 10 октября 1995 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страница? машинописною текста и состоит из введения, обзора литературы, описанш материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Рабогг иллюстрирована 14 рисунками и 7 таблицами. Библиография включает 15( ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирусы. Штаммы полиовируса получены из коллекции Институт; полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН. Штаммь выделяли и размножали на культурах клеток почек африканской зелено! мартышки, RD или Нер2. Типирование проводилось методе» микронейтрализации с типоспецифическими сыворотками. Вьщеление РНК. РНК выделяли из очищенных вирионов фенолыю) депротеинизацией в присутствии 1 % додецилсульфата Na. Секвенирование РНК. Частичное секвенироваиие полиовирусной PHI проводили методом дидезоксинуклеотидной терминации цепи с некоторым: модификациями (Sanger et al., 1977; Zimmern and Kaesberg, 1978).

Праймсры. Синтетические олигодезоксинуклеотиды были синтезированы с помощью автоматического синтезатора (Модель 380А; Applied Biosystems, Foster City, CA). Нами использовались описанные в литературе праймеры: 1) универсальный ираймер для частичного секвенироваши полиовирусных РНК (Rico-Hesse et al., 1987); 2) пара праймеров, специфически узнающая в ПЦР все энтеровирусы (da Silva et al., 1991); 3) пары праймеров, специфичные для вакцинных штаммов Сэбина первого, второго и третьего типов (Yang et al., 1991). В работе использовались также праймеры, сконструированные нами для анализа диких штаммов полиовируса (Lipskaya et al., 1995). Амплификация в ПИР и анализ продуктов амплификации проводились как описано в статье Yang et al. (1991).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Определение природы штаммов полиовируса методом ПИР В нашем распоряжении находилось 84 штамма полиовируса (43 типа 1, 10 типа 2 и 31 типа 3), выделенных от болевших полиомиелитом людей в разных регионах бывшего СССР в период с 1982 по 1991 гт. С целью выяснения природы исследуемых штаммов был проведен их анализ методом ПЦР с праймерами, специфическими для штаммов Сэбина. Из 84 штаммов 18 давали положительный сигнал. Один штамм, выделенный в Киргизии, оказался родственным вакцинному штамму Сэбина типа 1. 10 штаммов, выделенных на территории Молдавии, Украины и России, давали положительный сигаал в ПЦР с праймерами, специфическими для штамма Сэбина типа 2. 7 штаммов, выделенных на территории Грузии, Латвии, России

и Узбекистана, были охарактеризованы как родственные вакцинному штамм> типа 3. Следует отметить, что, как и в предыдущие годы (Кутитова и др. 1990; Липская и др., 1987), дериваты штамма Сэбина типа 2 чаще других вызывали в целом крайне редкие случаи вакциноассоциированногс полиомиелита.

Генотипирование диких штаммов полиовируса на основе данных частичного

сеоснирования генома В работе Rico-Hesse et al. (1987) на основании сравнительного анализ; полных нуклеотидных последовательностей геномов трех вакцинных штаммо! Сэбина был выбран участок полиовирусного генома длиной 150 нт (с 3296 гк 3445 iit; здесь и далее нумерация дается по Toyoda et al., 1984), кодирующш 30 С-концевых аминокислот капсидного белка VP1 и 20 N-концевьо аминокислот неструктурного белка 2А. Вследствие разных функций выполняемых этими белками, и их неодинаковой подверженностт селектирующему воздействию антител можно было предположить, чт( скорость накопления нуклеотидных замен на выбранном участке генома буде отражать среднюю скорость накопления замен на весь геном. Отличи нуклеотидных последовательностей штаммов Сэбина друг от друга на данно! участке (в дальнейшем, для краткости, будем называть его участей "VP1/2A") составляют 29%. Был проведен анализ нуклеотидны: последовательностей участка VP1/2A у 100 диких штаммов полиовируса тре серотипов, выделенных в течение 31 года в разных странах мира (Rico-Hess et al., 1987). В результате было предложено объединять в один генотип групп

б

полиовирусных штаммов, имеющих не более 15% нуклеотидных отличий при попарном сравнения последовательностей участка VP1/2A.

С целью выяснения происхождения и возможных родственных связей между штаммами, не давшими положительного сигнала в ПЦР с Сэбии-специфическими праймерами, нами были определены нуклеотвдные последовательности участка VP1/2A нескольких, произвольно выбранных из коллекции штаммов типа 1 и типа 3. Полиовирусы серотипа 1 включали 6 штаммов из Грузии, 2 из Киргизия и 4 из Таджикистана. Тип 3 был представлен 7 штаммами: 4 штамма были выделены в Армении и 3 в Грузии.

Представленные на рис. 1 выровненные последовательности участка VP 1/2А штаммов типа 1 существенно отличаются от последовательности соответствующего участка вакцинного штамма Сэбина типа 1: из 150 нт изменено от 27 до 37 (18-25%), что свидетельствует о невакциином происхождении этих штаммов. При сравнении друг с другом нуклеотвдные последовательности разных штаммов так же обнаруживали значительную гетерогенность. Тем не менее, выравнивание, представленное на рис. 1, позволило нам отнести анализируемые штаммы к трем генотипам. Для классифицирования диких штаммов полиовируса мы ввели термин "геотип", т. е. "географический генотип". Геотип А включал 2 штамма из Киргизии и 5 штаммов из Грузии (максимальное различие между ними 4%). Геотип Т был представлен 4 штаммами из Таджикистана (максимальное отличие 7%), и единственный штамм G-геотипа был выделен в Грузии. Различия последовательностей VP1/2A между штаммами, составляющими разные

геотипы, составляют: в случае сравнения штаммов геотипов А и Т - 19-26%, геотипов А и в - 17-19%, и, наконец, Т к С - 23-26%.

Все 7 проанализированных штаммов типа 3 оказались близкими друг к другу и составили один геотип С (рис. 2): максимальное различие, найденное при сравнении нуклеотидных последовательностей УР1/2А, составило 3,3%. Соответствующий геномный участок проанализированных штаммов отличался от такового у вакцинного штамма Сэбина типа 3 на 20-22%, что говорит о невакцинном происхождении этих штаммов.

Создание и использование праймеров для генотипирования диких штаммов полиовируса типа 1 и типа 3 методом П11Р Для проведения более быстрой идентификации диких штаммов полиовируса, имевшихся в нашей коллекции, на основании приведенных выравниваний нами были сконструированы олигонуклеотидные праймеры, способные специфически дифференцировать определенные геотипы (рис. 1, 2). Праймеры были сконструированы так, чтобы они соответствовали наиболее характерному для штаммов данного геотипа участку генома, на котором имеются отличия как от геномной последовательности вакцинного штамма соответствующего серотипа, так и от последовательностей диких штаммов других геотипов типа 1. При этом праймеры были выбраны так, чтобы Зч-концевой пуклеотид каждого праймера взаимодействовал с наиболее часто меняющимся нуклеотидом в третьем положении кодона гомологичной матрицы. Число некомплементарных пар хотя бы для одного из любой пары праймеров было не меньше 5 при сравнении с соответствующим фрагментом генома штамма любого другого геотипа и не меньше 4 при сравнении с

геномами любого из трех вакцинных штаммов Сэбина. В силу этого нраймеры были специфическими и не наблюдалось перекреста в ПЦР между представителями различных геотипов друг с другом. Размеры продукта амплификации составляли в случае полиовируса типа 1: для А-геотипа - 141 нт (координаты фрагмента на геноме полиовируса - 3322-3462), для Т - 103 нт (3327-3429) и G - 100 нт (3319-3418). В случае С-геотипа полиовируса типа 3 амплифицированный продукт был длиной в 103 нт (3351-3456).

Анализ методом ПЦР с геотип-специфическими праймерами показал, что большинство исследуемых штаммов типа 1 (30 из 42) может быть отнесено к А-геотипу. Эти штаммы были выделены на территории Закавказья: Грузии (18 штаммов), Азербайджана (6 штаммов) и Средней Азии: Туркмении (3 штамма) и Киргизии (2 штамма), один штамм был выделен в России. 11 штаммов, выделенных на территории Грузии (2 штамма), Таджикистана (8 штаммов) и Молдавии (1 штамм), давали положительный сигнал с Т-специфическими праймерами. Только один штамм (PV1/919/GE090) из исследованных нами дал положительный сигнал с G-специфическими праймерами. При анализе 24 Сэбин-отрицателышх штаммов типа 3 большинство (21) дало в ПЦР положительный сигнал с С-специфическими праймерами. Однако, 3 штамма из Грузии не дали с ними амплификации и были подвергнуты дополнительному анализу.

Анализ нуклеотидных последовательностей области VP1/2A

Для проверки результатов гепотипирования, проведенного с помощью метода ПЦР, и получения дополнительных данных о родстве штаммов как внутри отдельных геотипов, так и составляющих разные геотипы типа 1, нами

3320 3340 3360 3380 3400 3420 3440 3460

I - I I I I I I I

SAB IN -1 ССЛССОАССССАОиСССШАСиЛССОСССиОаАаиССАШАСААССАиССиАСССШАСАССССиШ^

PV1/9K/GE090'

PV1/839/GE090*

PV1/S91/GEO90*

PV1/907/GE090*

PV1/906/GE090*

PV1/2037/KRG90*

PV1/2093/KSG90*

PV1/408VGE09ÍI PV1/937/GE091 PV1/40S0/AZB90 PV1/4078/AZB90 PV1/4023/TRK90 PV1/4026/TRK91 ■ PV1/4008/TRK90 PV1/4082/GE090 PV1/422/RUS91 A/PCR

•U--A--A-UU--U--C-

* £

5'CCAAGAGCTGTTGCCTATTAC 3'

3'TCGTCCGATGTTCTAGACGrTA 5'

PV1/1/TAJ91* PV1/3/IAJ91* PV1/4/TAJ91* PV1/7/TAJ91* PV1/5/TAJ91 Г PV1/A/TAJ91 PV1/8/TAJ91 PV1/9/TAJ91 PV1/434/M0I91 PV1/827/GE085 PV1/832/GE035 T/PCR

--G.....A--G........U--U.....A....................Л--А--С--С.......

--G.....A--G........U--U.....A.........G..........A--A--C--C---U---

--G.....AU-G........U--U.....A....................A--A--C--C.......

--G.....AU-G........U--U.....A.......-............A--A--C--C.......

-G..............A--U........A.................C--G--C--C--C.....U-

-G..............A--U........A........С........С- -A- -U- -C--C.......

-о-.............A--U........A........С........С--А--и--С--с......■.

5'AGCGGTGGCGTACTATGGCCCA 3'

......А—С..............G-AU--G.....G........А......А--С..............G-AU--U-----G........А......А--С..............G-AÜ--G.....G........А-

--U....................GC-U........G........А-

U—U--A--C........U.....G--U--G.....G..........

U--U--A--C........U.....G--U--G.....G..........

3'CAAACCCGTGG7CTTGTTT 5'

-А...........G........U--U--C

-А...........G........U--U--C

-А...........G........U--U--C

-А...........С........U--U--C

-А...........G........U--U--C

-А...........С........U--U--C

-А...........G........U--U--C

-А...........G-.......U--U--C

-А.....C--U--G--C--U--U--U—

-G —

G PV1/919/GE090* .....A--A-C--U--C......

G/PCR 5'CCACCAAGAGCCGTTGCCTAC 3'

-U--G-

-A--C--U-

Í-U--AU-AA-

-А--С.....А.....С--С..........

3'GGACTGTTGTATGCCGAAGCCTG 5'

-С-А-

U

Рис. 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей участка генома VP1/2A штаммов полиовируса типа 1. Штаммы, выбранные для конструирования праймеров, отмечены звездочками. Здесь и далее обозначение штамма включает его серотип, номер, присвоенный в лаборатории, где штамм был выделен, и год случая полиомиелита, с которым данный штамм этиологически связан. Обозначения географических названий дается в сокращении: AZB -Азербайджан, GEO - Грузия, KRG - Киргизия, MOL - Молдавия, RUS - Россия, TAJ -Таджикистан, TRK - Туркмения. Буквами обозначены отличия от вакцинного штамма Сэбина, тире обозначены нуклеотиды, идентичные нуклеотидам вакцинного штамма. Представлены также последовательности праймеров A-, G- и Т- геотипов.

I I I I I

SASIN J AGACCGCCGCGCGCGGUACCUUAUUAUGGACCAGGGGUGGACUAUAGGAACAACUUGGACCUUAUCUGAGAAAGGUUUC^

PV3/316/GE09Q*.....C--A--G--A--G--G..............A.....U----AAG-UG-G--A-C.......A--C--G--AC-C--A--C...........A--C.....С.....C--U........С........A--U............

PV3/S93/GE090*.....С.....G--A--G--G..............A.....U----AAG-UG-G--A-C.......A--A--G--AC-C--A--C...........A........С.....G--U........С........A--U............

PV3/9Q3/GE090*.....С.....G-A-3--G..............A.....U----AAG-UG-G--A-C.......A--A--G--AC-C--A--C...........A--C.....С.....G--U........С........A--U............

PV3/2WARH90« .....C--A--G--A--G--G..............A-----U----AAG-UG-G--A-C.......A--A--G—C-C--A--C........C--A--C.....С.....G--U........С........A--U............

PV3/249/ARM90* .....С.....G--A...................-A.....U----AAG-UG-G--A-C.......A--A--G-AC-C--A--C...........A--C.....С.....G--U........С........A-U............

PV3/253/ARM90*.....С.....G--A--G--G..............A.....U----AAG-UG-G--A-C.......A--A--G--AC-C--A--C...........A--C.....С.....G--U........С........A--U............

PV3/255/ARM90*.....С.....G--A--G--G..............A.....U----AAG-UG-G--A-C.......C--A--G--AC-C.....С...........А--С----GC.....A--U........С........A--U............

PV3/3991/TRK90 С----С.....G--A--G--G..............А.....1)----AAG-UG-G--A-C.......A--A--G--AC-C--A--C..........-А--С----GC.....A--U........С........A--U............

PV3/4020/TRK90 С----С.....G--A--G--G..............А.....U----AAG-UG-G--A-C.......A--A--G"-АС-С--А--С...........А--С.....С.....G""U........С........A--U............

PV3A002/TRK90 С----С.....G--A--G--G...............А.....U.....AG-UG-G- -A-C----G--A--A--G--АС-С--А"-С--C--G.....А--С.....C--G--G--C.....А.....G--U...........U.....С

PV3/2S9/AZB90 С----С.....G--A--G--G..............А.....U----AAG-UG-G--А-С.......С--A--G--АС-С--А-"С...........А" "С.....С.....G--U........С........A--U............

PV3/2/CKE82 С----С--А--А.....G--G--C...........А..........AAG-UGGG--A-C..........A--G"-АС-С--A--U...........С—С.....С.....G--C.....А...........А..............С

PV3/3/M0L82 С----С--А--А—A--G--G--C...........А..........AAG-UGGG--A-C.......A--A--G--AC-C--A--U...........С—С.....С.....A--C--U--A...........А..............С

PV3/398B/TRK90.....С.....G-A--G--G.....C--G.....А........C-AAG-UGGG*-ААС----G--A--A--G--AC-C--A--C.....А........С.....G----A---U--U--A-A.........А.....U--U......

PV3/3997/TRK90 С----С.....G—A--G--G.....C--G.....А........C-AAG-UGGG--AAC----G--A--A--G--AC-C—А--С.....А........С.....G........U--U--A...........А.....U--U......

PV3/10/TAD91 .....С.....G-A--G........C--G.....А........C-AAC-UGGG--A......G--A--A--G--AC-C—A--C.....А--С.....С.....С........U--U--A...........А.....U--U......

C/POt 5' AGTGGATTATAAAGATGAGTTA3' 3'CCAAATGTGACGGCCAATGTTTTAA5'

PV3/S65/GE0S7 С----С--С........G--G--C...........А..........AAG-UG-G--A-C.......A--A--G--AC-U--A--U...........А--С.....С.....АА-С.....А.....A--U...........и.....С

PV3/870/GEQ87 С----А--С.....A--G...........G.....А--А.......AAG-UG-G--ААС.......A--A--G--AC-U--A-C...........А........С.....АА-С.....А.....A--U...........и.....С

PV3/871/GE0S7 С----А--С........G--G--C...........А..........AAG-UG-G--AAC.......A--A--G--AC-U--A-C...........А........С.....АА-С.....А.....A--U.........--U.....С

Рис. 2. Сравнение нуклеотидных последовательностей участка генома VP1/2A штаммов полиовируса типа 3. Обозначения - см. подписи к рис. 1. Сокращенные обозначения географических названий, не включенные в подписи к рис. 1: ARM - Армения, СНЕ - Чечня. Представлены также последовательности праймеров С- геотипа.

было проведено дополнительное исследование некоторых штаммов методом частичного секвенироваиия области УР1/2А. Результаты проведенного исследования представлены на рис. 1, 2 и хорошо коррелируют с данными, полученными с помощью ПЦР. Все отсеквенированные штаммы А-геотипа оказались близкородственными: максимальное отличие при попарном сравнении последовательностей УР1/2А составило 7%. Группа штаммов Т-геотипа оказалась более гетерогенной: различия при попарном сравнении составили от 1 до 16%. При этом различия УР1/2А при попарном сравнении штаммов А- и Т-геотипа по-прежнему составляли 19-26%. Различия УР1/2А между штаммами геотипов Айв были выше 17%, а между штаммами геотипов ТиБ - выше 23%.

Группа штаммов С-геотипа также оказалась гетерогенной: различия УР1/2А между штаммами этого геотипа составили от 1 до 20%. Секвснировапис участка УР1/2А трех штаммов, не прореагировавших с С-специфическими праймерами в ПЦР, выявило их близкое родство друт с другом: при попарном сравнении этих штаммов было найдено 3-6% нуклеотвдных различий. Несмотря на неспособность данных штаммов реагировать с С-специфическими праймерами, анализ их нуклеотвдных последовательностей позволил отнести их к С-геотипу (рис. 2).

Кластерный анализ нуклеотидных последовательностей области УР1/2А

Анализ нуклеотидных последовательностей участка УР1/2А штаммов полиозируса типа 1 и типа 3 проводили кластерным методом с использованием пакета программ СНКЕВЕЕ (Вгос1зку е1 а1., 1992). Девдрограммы, представленные на рис. 3 и 4, дают изображение результатов

этого анализа. К сожалению, данный способ изображения не представляет возможным построение шкалы, строго количественно отражающей сходство проанализированных последовательностей. Соответствующая информация содержится в табл. 1 и 2, где приведены выраженные в процентах различия между проанализированными нуклеотидными последовательностями.

Для выяснения возможных молекулярно-эпидемиологических связей между штаммами, выделенными на территории других стран, последние также были включены в филогенетический анализ, проводимый кластерным методом (рис. 5 и 6). Была использована коллекция нуклеотидных последовательностей участка УР1/2А диких штаммов полиовируса типа 1 и 3, выделенных во всех частях света в период с 1977 по 1992 гг. (СепВапк).

Таблица 1. Попарное сравнение участка УР1/2А штаммов полиовируса . *

типа 1

геотип А в Т1 Т2 ТЗ

А 1-7

в 17-19 -

Т1 19-23 23-26 1-7

Т2 22-26 23-24 11-15 1

ТЗ 20-22 26 13-16 12-13 -

21-25 20 13-17 14-15 16 -

* Представлен минимальный и максимальный процент различий при попарном сравнении нуклеотидных последовательностей диких штаммов полиовируса внутри геотипов, между геотипами и с вакцинным штаммом Сэбина типа 1 (Б!).

Таблица 2. Попарное сравнение участка УР1/2А штаммов полиовируса типа 3*

геотип С1 С2 СЗ С4 С' 83

С1 1-3

С2 10-11 3

СЗ 10-12 12 -

С4 12-15 12-16 14-16 1-6

С' 12-16 8-14 10-12 16-20 3-6

БЗ 20-22 22-24 25 24-27 23-24 -

* Представлен минимальный и максимальный процент различий при попарном сравнении нуклеотидных последовательностей диких штаммов полиовируса внутри подгеотипов, между подгеотипами и с вакцинным штаммом Сэбина типа 3 (БЗ).

На дендрограмме штаммов полиовируса типа 1 все штаммы А-геотипа составили один кластер (рис. 3; табл. 1). Геотип А представляет собой труппу близкородственных штаммов, выделенных в двухлетний период времени, которые, по-видимому, дивершровали от общего иредкового штамма сравнительно недавно. Несмотря на это, штаммы А-геотипа были изолированы в достаточно удаленных географических районах, таких как бывшие кавказские (Азербайджан, Грузия) и среднеазиатские (Киргизия, Туркмения) республики. Первый (из всех имеющихся в нашей коллекции) по времени выделения штамм А-геотипа был изолирован в мае 1990 г. на территории Азербайджана. Более 50% случаев заболевания, зарегистрированных в Грузии в период 1990-91 гг., было отмечено среди этнических азербайджанцев, что явно не коррелирует с относительным количеством населяющих Грузию

п

4080/АгВ90 891/ЗЕ090 2037/КЯСЭ0 906/й Е090 20ЭЗ/КЙ690 4081/ОЕОЭО 4078/АгВ90 422/РШ891 4026/ТНК91 4023/ТИК90 907/СЕ090 4005/ТВК90 914/СЕ090 4 082/С Е090 889/СЕОЭО 937/0Е091 919/Э Е090 в 434/М01.91 ТЗ 832/СЕ085 827/йЕ085 1/ТАЛ91 3/ТАЛ91 4/ТАи91 5/ТАи91

6/TAJ91 Т1

8/ТА091 9/ТА091 7/ТАЛ91

ЭАВт1

у2

Рис. 3. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей участка УР1/2А штаммов полиовируса типа I, выделенных на территории бывшего СССР.

людей данной национальности. К тому же, основное число случаев было зарегистрировано на восточной территории Грузии, граничащей с Азербайджаном. Можно предположить, что распространение штаммов шло из Азербайджана в Грузию. К сожалению, отсутствие полной информации не дает возможности провести молекулярно-эпидемиологаческнй анализ штаммов, выделенных на территории Киргизии и Туркмении. Также остается неясным, в каком направлении происходило распространение полиовирусов А-геотипа: с Кавказа в республики Средней Азии или наоборот.

Единственный в пашей коллекции дикий штамм, выделенный в России (1991 г.), также относится к А-геотипу (рис. 3). Данный случай заболевания является, по-видимому, завозным. Среди штаммов, выделенных на территории других стран, был найден родственный штамм, изолированный в Болгарии в 1991 г. (рис. 5). Этот случай заболевания мог быть следствием "импорта" диких штаммов из республик бывшего СССР в Болгарию, где случаи заболевания полиомиелитом регистрируются редко.

О-геотип, представленный одним штаммом, выделенным на территории Грузии в 1990 г., формирует отдельную ветвь на дендрограмме (рис. 3). Штамм РУ1/919/вЕ090 имеет относительное родство со штаммами, изолированными в Румынии и Турции в 1991 г. (рис. 5). Учитывая близость этих стран к Черному морю, и тот факт, что нами не было обнаружено более ни одного представителя О-геотипа на территории бывшего СССР, можно предположить, что данный случай заболевания на территории Грузии является завозным.

Гетерогенность, обнаруженная внутри штаммов Т-геотипа, позволила нам разделить его на несколько "подгеотипов". Гетерогенность внутри Т-геотипа имеет четкую корреляцию с местом выделения штаммов. Все штаммы, выделенные в 1991 г. в Таджикистане, оказались близкородственными: на дендрограмме они образуют отдельную ветвь Т1 (рис. 3); максимальное различие при попарном сравнении исследованного участка генома внутри группы составило 7% (табл. 1). Надо отметить более тесное родство этих штаммов со штаммами, выделенными в то же время на территории Пакистана, Индии и Иордании, чем с другими представителями Т-геотипа, обнаруженными на территории Грузии и Молдавии (рис. 5). Можно думать, что Т-геотип является эндемичным на всей территории Индостана. Учитывая широкую циркуляцию диких штаммов полиовируса на территории Пакистана (Huovilainen et al., 1995; Mulders et al., 1995), можно предположить попадание их на территорию близлежащего Таджикистана.

Два штамма, выделенные в 1985 г. на территории Грузин, образуют на дендрограмме отдельную ветвь Т2 (рис. 3). Различие между этими штаммами составило одну нуклеотидную замену на участке в 150 нт; в то же время они имеют до 15% отличий при сравнении со штаммами группы Т1 (табл. 1), что является, по-видимому, следствием не только географической удаленности от предполагаемого очага эвдемичности, но и временем изоляции этих штаммов. Тем не менее, последнее говорит также и о весьма продолжительной циркуляции Т-геотипа. Можно предположить, что спорадические случаи заболевания полиомиелитом на территории Грузии в 1985 г., являлись завозными; дикие штаммы Т-геотипа, ассоциированные с этими случаями

заболевания, не имели возможности для столь широкой циркуляции как в случае попадания на эту территорию диких штаммов А-геотипа в 1990-91 гг.

Штамм, выделенный в 1991 г. в Молдавии, представляет третью ветвь ТЗ (рис. 3). Различия при сравнении штамма PV1/434/MOL91 со штаммами, входящими в группу Т1, составили 13-14%, со штаммами группы Т2 - 12-13% (табл. 1). Единственный случай заболевания, зарегистрированный в Молдавии, является, по-видимому, завозным. При этом штамм PV1/434/MOL91 имеет относительное родство со штаммом, выделенным в 1989 г. в Саудовской Аравии (рис. 5).

Интересно относительное родство диких штаммов полиовируса Т-геотила с вакцинным штаммом Сэбина типа 1: на проанализированном участке генома отличия составили от 13 до 17% (табл. 1), т. е. в отдельных случаях не превышали принятой для генотипа границы (Rico-Hesse et al., 1987). Ранее не было отмечено столь близкого родства между дикими и вакцинными штаммами полиовируса; данный факт дает основание думать о возможном происхождении штаммов Т-геотипа от вакцинного предка. Анализ изменчивости вакцинного вируса в условиях его естественной циркуляции, его способность к приобретению "дикого" фенотипа в регионах, эндемичных по полиомиелиту, представляет не только теоретический интерес, но и имеет важное практическое значение. Однако, для более обоснованного обсуждения этой проблемы необходим анализ если не всего генома, то существенно более протяженных его участков.

Все проанализированные нами дикие штаммы полиовируса типа 3. несмотря на превышение в отдельных случаях условно выбранной границь:

и

г

255/АКМ90 4079/Л2В90 8 93/вЕ090 903/СЕ090 253/АКМ90 3991/ТШ<90 4020/ТИК90 249/АИМ90 4085/СЕ090 246/ЛИМ90 2/СНЕ82 ' „

сз

3/М0Ь82 |

4002/ТШ<90 СЗ

865/СЕ087 |

871/СЕ087 С'

870/СЕ087 |

3988/ТКК90 | 3997/ТИК90

10/ТАЛ91 | ЭАВГНЗ

Рис. 4. Дендрограмма сходства нукдеотидных последовательностей участка УР1/2А штаммов полиовируса типа 3, выделенных на территории бывшего СССР.

для генотипа в 15% (табл. 2), были отнесены к одному геотипу С. Гетерогенность внутри группы штаммов С-геотипа позволила нам также разделить его на несколько "подгеотипов" (рис. 4). Большинство штаммов, выделенных в 1990 г. как на территории Кавказа (Армения, Азербайджан, Грузия), так и на территории Средней Азии (Туркмения) оказались близкородственными: соответствующая ветвь на девдрограмме была названа С1 (рис. 4). Максимальные различия между штаммами группы С1 составили 3%. Штаммы, выделенные в 1982 г. на территории Чечни и Молдавии, формируют ветвь С2 (рис. 4). Различия между этими штаммами также

составили 3%, в то время как от штаммов группы С1 они отличались на 1011% (табл. 2). Штамм PV3/4002/TRK90, выделенный, как и два штамма группы С1, в 1990 г. на территории Туркмении, представляет ветвь СЗ (рис. 4). Он имеет до 12% отличий от штаммов групп С1 и С2 (табл. 2). Штаммы PV3/3988/TRK90 и PV3/3997/TRK90, также выделенные в Туркменнии в 1990 г., вместе со штаммом PV3/10/TAJ91, выделенным в 1991 г. на территории Таджикистана, сформировали группу С4 (рис. 4) и имели до 6% отличий при попарном сравнении между собой (табл. 2). При сравнении штаммов группы С4 со штаммами других групп было выявлено от 12 до 16% различий. Штаммы, выделенные на территории Грузии в 1987 г., оказались близкородственными и образовали отдельную ветвь С' [максимальные различия между ними составили 6% (табл. 2)]. Попарное сравнение штаммов группы С' с другими штаммами С-геотипа выявило значительное их отличие (16-20%) от штаммов группы С4 и более близкое родство со штаммами групп CI, С2, СЗ (табл. 2). С-геогип преимущественно составили штаммы, выделенные одновременно (1990-91 гг.) на территории Кавказа (Армения. Азербайджан, Грузия) и Средней Азии (Туркмения, Таджикистан). При рассмотрении возможных родственных связей между штаммами полиовирусг типа 3, выделенными на территории бывшего СССР и других стран, былс обнаружено относительное родство штамма, выделенного в Туркмении в 199С г. (подгеотип СЗ), со штаммом, выделенным на территории Омана (рис. 6). Е целом, С-геотип широко распространен только на территории бывшего СССР.

Многолетние исследования диких штаммов полиовируса, проведенные i разных лабораториях, показали, что штаммы, выделенные в различны? регионах, как правило, имеют различные генотипы (Rico-Hesse et al., 1987 Kew et al., 1990). С другой стороны, было показано близкое родство дики;

[Г

pr— 4080/AZB90 Ц- 891/GE090 L 2037/KRG90

- 906/GE090

- 2093/KRG90

- 4081/GE090

- 4078/AZB90

- 422/RUS91

-,- 4026/TRK91

I- 4023/TRK90

- 907/GE090

4008/TRK90 914/GE090 4082/GE090 889/GE090 937/GEQ91 BUL91

919/GE090 G R0M91 TUR91 VEN82 I2K80 C0L86 GUA87 EGY91 ISR88 CYP92 ГА182 USA79 CAN78 TUH77 THA89 TUN85 I N08 6 SIN86

- 434/M0L91 T3

-- SAA89

—i—. 832/GE085 j

I- 827/GE085 |

- 1/TAJ91

- 3/TAJ91

- 4/TAJ91

I- 5/TAJ91 T1

El- 6/TAJ91

8/TAJ91 9/TAJ9X

- 7/TAJ91

- PAK91

IND91 J0R91 MAA92 SABIN1 NEP86 CHN91 SEN 8 6 MEX77 H0N91 RSA83 VTN91

IE

С

Рис. 5"

n

FRA82 TUR90 TUR91 TUN85 PER86

3988/TRK90

3997/TRK90

10/TAJ91

255/ARM90

289/AZB90

893/GE090

9Û3/GE090

253/ARM90

3991/TRK90

4 020/TRK90

2 49/ARM90

316/GE090

246/ARM90

2/CHE82

3/MOL82

4 002/TRK9 О

0MA91

865/GE087

871/GEOB7

870/GE087

VEN88

COL88

IN086

IND91

NL9 2

MEX90

EGY92

SABIN3

Рчс.6.

Рис. 5. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей участка VP1/2A штаммов полиовируса типа 1. В анализ включены дикие штаммы, выделенные на территории бывшего СССР, а также на территории других стран. Сокращенные обозначения географических названий, не включенные в подписи к рис. 1: BUL - Болгария, CAN - Канада, CHN - Китай, COL - Колумбия, CYP - Кипр, EGY - Египет, GUA

- Гватемала, HON - Гондурас, IND - Индия, INO - Индонезия, ISR

- Израиль, JOR - Иордания, МАА - Малайзия, МЕХ - Мексика, NEP - Непал, РАК - Пакистан, ROM - Румыния, RSA - ЮАР, SAA

- Саудовская Аравия, SEN - Сенегал, SIN - Сингапур, TAI -Таиланд, TUN - Тунис, TUR - Турция, VEN - Венесуэла VTN -Вьетнам, USA - США.

Рис. 6. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей участка VP1/2A штаммов полиовируса типа 3. В анализ включены дикие штаммы, выделенные на территории бывшего СССР, а также на территории других стран. Сокращенные обозначения географических названий, не включенные в подписи к рис. 1, 2, 5: FRA - Франция, NL -Недерланды, ОМА - Оман, PER - Перу.

штаммов, выделенных в течение одной эпидемии (Kew and Nottay, 1984; Magrath et al., 1986; Kinnunen et al., 1991), а также возможность достаточно длительной циркуляции эндемичных штаммов в одном географическом районе (Rico-Hesse et al., 1987; Kew et al., 1990). Эти наблюдения позволили говорить о географической локализации отдельных генотипов диких штаммов полиовируса (Rico-Hesse et al., 1987; Kew et al., 1990, 1993). Проведенный нами анализ коллекции диких штамов полиовируса типа 1 и типа 3 в целом подтвердил существующую концепцию географического распределения генотипов полиовируса. Следует отметить, что на территории кавказских (Азербайджан, Грузия) и среднеазиатских (Таджикистан, Туркмения) республик бывшего СССР в 1990-91 гг. наблюдалась одновременная циркуляция диких штаммов полиовируса типа 1 и типа 3, что явилось следствием серьезных нарушений в проводимой вакцинации. Известно, что одновременная циркуляция различных генотипов полиовируса характерна для государств с низким уровнем коллективного иммунитета у населения (Huovilainen et al., 1995; Kew et al., 1990; Zheng et al., 1993).

Анализ аминокислотных последовательностей участка VP 1/2А На основании данных, полученных с помощью метода частичного секвенирования генома, нами были выровнены соответствующие аминокислотные последовательности (рис. 7, 8). На проанализированном участке полиовирусного полипротеина было отмечено от 0 до 3 аминокислотных замен при сравнении последовательностей диких штаммов типа 1 как друг с другом, так и с вакцинным штаммом Сэбина соответствующего серотипа (рис. 7). Аминокислотные замены были найдены в обоих белках - VP1 и 2А. Два диких штамма, выделенных на территории Грузии в 1985 г., имели аминокислотные последовательности, идентичные

273 VP1 г 2A 20

SABIN 1 PPRAVAyYGPGVDYKDGrLTPLSTKDLTTSfGFGHQMKAVYTAGYKICNYH

PV1/4080/AZB90 -------------------А------------------------------

PV1/4078/AZB90 -------------------А------------------------------

PV1/4023/TRK90-------------------А------------------------------

PV1/4026/TRK91 -------------------А------------------------------

PV1/4008/TRK90 -------------------А------------------------------

PV1/914/GE090 -------------------А------------------------------

PV1/4081/GE090 -------------------А------------------------------

PV1/4082/GE090 -------------------А------------------------------

PV1/422/RUS91 -------------------А------------------------------

PV1/889/GEO90 -------------------А-----------------Р------------

PV1/891/GE090 -------------------А-----------------Р------------

PV1/907/GE090 -------------------А-----------------Р------------

PV1/906/GE090 -------------------А-----------------Р............

PViy2037/KIR90 -------------------А-----------------Р.....-......

PV1/2093/KIR90 -------------------А-----------------Р------------

PV1/937/GE091 -------------------A-F---E------------------------

PV1/434/MOL91 -------------------------------L------------------

PV1/827/GE085 --------------------------------------------------

PV1/832/GE085 --------------------------------------------------

PV1/1/TAJ91 ----Е--------------------------------Р------------

PV1/3/TAJS1 --------------------------V----Y-----Р............

PV1/4/TAJ91 -------------------------------------Р------------

PV1/5/TAJ91 -------------D.................Y------------------

PV1/6/TAJ31 ---S---------------------------Y------------------

PV1/7/TAJ91 -------------------------------Y------------------

PV1/8/TAJS1 ---S---------------------------Y..........-......-

PV1/9/TAJ91 ---S---------------------------Y..........-.......

PV1/919/GE090 -------------------A--T--------------P------------

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей полиовирусных штаммо] типа 1 на участке вирусного полипротеина VP1/2A. Буквами обозначены отличия ог вакцинного штамма Сэбина, тире обозначены аминокислоты, идентичные аминокислота* вакцинного штамма.

таковым у вакцинного штамма Сэбина типа 1. Последовательности штаммов выделенных в ходе одной вспышки заболеваемости в Таджикистане, npi попарном сравнении имеют до двух аминокислотных замен на анализируемое участке, что может говорить о высокой скорости эволюции полиовирусноп генома в ходе эпидемической трансмиссии. Интересным является наличи( дополнительного сайта протеолитического расщепления Y/G (2-3 позиции 2А] у большинства штаммов Т-геотипа, выделенных в Таджикистане (рис. 7).

270 VP1 А 2Л 20

SABIN 3 RPPRAVPYYGPGVDYRNH*LDPLSEKGLTTYGFGHQNKAVYTAGYKICNYH

PV3/316/GEO90 ---------------KDE*-A------------------------------

PV3/893/GEO90 ---------------KDE*-A------------------------------

PV3/903/GE090 ---------------KDE*-A----------------------.......-

PV3/246/ARM90 ---------------KDE*-A..............................

PV3/249/ARM90 ...............KDE*-А------------------------------

PV3/253/ARM90 ---------------KDE+-A------------------------------

PV3/255/ARM90 ---------------KDE*-A------------------------------

PV3/289/AZB90 ---------------KDE*-A------------------------------

PV3/2/CHE82 ..............-KDG*-A------------------------------

PV3/3/MOL82 ---------------KDG*-A------------------------------

PV3/10/TAJ91 ---------------KDG».........................-......

PV3/4002/TRX90 ----------------DE*-A------------------------------

PV3/3991/TRK90 ---------------KDE*-A---------------S..............

PV3/4020/TRK90 .............—KDE*-A---------------S--------------

PV3/3988/TRK90 ---------------KDG*-T---------------K-D---D--------

PV3/3997/TRK90 ---------------KDG*-T---------------К--------------

PV3/865/GE087 ---------------KDE*-A------------------I-----------

PV3/870/GE087 ---------------KDE*-T------------------I-----------

PV3/871/GE087 ---------------KDE*-T------------------1-----------

SABIN 1 ------А--------KDGT-T---T-D------------------------

PV11CONSEN ------А--------KDGT-A---T-D------------------------

SABIN 2 --------F------KDG*-T--P---------------------------

PV2 /CONSEN ---------------KDG*-T--P---------------------------

Рис. 8. Сравнение аминокислотных, последовательностей полиовирусных штаммов типа 3 на участке вирусного полипротеина УР1/2Л. Обозначения - см. подписи к рис. 7. РУ1/С(Ж5ЕК и РУ2/СО№ЕМ последовательности являются консенсусными, полученными при сравнении аминокислотных последовательностей диких штаммов полиовируса типа 1 и типа 2, соответственно.

Максимальное число аминокислотных замен, найденное при попарном сравнении последовательностей диких штаммов полиовируса типа 3, равнялось 4 (рис. 8). Как и в случае типа 1, аминокислотные замены имелись в обоих белках. При сравнении аминокислотных последовательностей диких штаммов и вакцинного штамма типа 3 было найдено от 3 до 7 замен. Следует

отметить сходство аминокислотных замен у большинства последовательностей диких штаммов типа 3 при сравнении с вакцинным.

Нами был дополнительно проведен анализ аминокислотных последовательностей данного участка у диких штаммов полиовируса всех трех серотипов, выделенных в разное время в различных странах мира (Ке\у й а1., 1990; Ке\у й а1., неопубликованные данные). В анализ также были включены вакцинные штаммы Сэбшга типа 1 и типа 2. Результаты суммированы на рис. 8. Можно видеть, что мотив КХЮ/Е (285-288 позиции аминокислот) присутствует практически во всех проанализированных нами последовательностях диких штаммов типа 3, также как в последовательностях вакцинных и диких штаммов типа 1 и типа 2, но в последовательности штамма Сэбина типа 3 этот мотив заменен на 1ШКТ (рис. 8). Эволюционное значение "аномального" строения данного участка полипротеина (и соответствующей кодирующей последовательности геномной РНК) вакцинного штамма типа 3 остается неясным.

ВЫВОДЫ

1. На основании частичного секвенирования генома и использования полимеразной цепной реакции выяснено происхождение штаммов вируса полиомиелита, послуживших этиологическими агентами заболеваний паралитическим полиомиелитом в разных регионах бывшего СССР в период с 1982 по 1991 1т.

1.1. Редкие случаи заболевания паралитическим полиомиелитом, вызванные вакцинородственными штаммами полиовируса, имели место на территории Грузии, Киргизии, Украины, Молдавии, Латвии и России.

1.2. На территории Кавказа и Средней Азии, а также Молдавии и России вспышки и отдельные случаи заболевания паралитическим полиомиелитом были ассоциированы с дикими штаммами полиовлруса типа 1 и типа 3.

2. Дикие штаммы полиовируса типа 1 были сгруппированы в три геотипа (А, Т, О.

2.1. Случаи заболеваиги паралитическим полиомиелитом, отмеченные на территории Грузии, Азербайджана, Туркмении, Киргизии и России в 199091 гг., были вызваны дикими штаммами А-геотипа.

2.2. Один случай заболевания паралитическим полиомиелитом, зарегистрированный на территории Грузии в 1990 г., был вызван штаммом С-геотипа.

2.3. Вспышка паралитического полиомиелита в Таджикистане (1991 г.) и отдельные случаи заболевания, отмеченные на территории Грузии (1985 г.) и Молдавии (1991 г.), были вызваны штаммами Т-геотипа.

3. Дикие штаммы полиовируса типа 3 составили один геотип (С). Была показана длительная циркуляция штаммов С-геотипа на территории Кавказа: Чечни (1982 г.), Грузии (1987 и 1990 гг.), Армении (1990 г.) и Азербайджана (1990 г.). Случаи паралитического полиомиелита, ассоциированные со штаммами С-геотипа, были отмечены в республиках Средней Азии: Туркмении (1990 г.) и Таджикистане (1991 г.), а также в Молдавии (1982 г.).

4. Сконструированы праймеры для быстрой детекции и идентификации диких штаммов полиовируса типа 1 и типа 3 методом ПЦР.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. G. Yu. Lipskaya, Е. A. Chervonskaya-Cherkasova, G. I. Belova, S. V Maslova, Т. N. Kutateladze, S. G. Drozdov, M. Mulders, M. A. Pallansch, О. M Kew and V. I. Agol "Geographical genotypes (geotypes) of poliovirus cas isolates from the former Soviet Union: relatedness to other known polioviru genotypes." Journal of General Virology (1995), 76, 1687-1699.

2. E. А. Черкасова, Г. Ю. Липская, Г. И. Белова, В. И. Бондаренко, В. И Задорожная, О. Е. Иванова, В. Б. Конторович, Г. А. Королева, Т. Н Кутателадзе, С. С. Максумов, Л. И. Синяк, С. Г. Дроздов. "Обнаружени штаммов вируса полиомиелита в природных изолятах и их идентификация i помощью полимеразной цепной реакции". Молекулярная генетика микробиология и вирусология (1996), 2, 25-31.

3. G. Yu. Lipskaya, Е. A. Chervonskaya-Cherkasova, G. I. Belova, О. М. Kev and V. I. Agol "Geographical distribution of wild type 1 poliovirus genotypes ii the former Soviet Union", Abstracts of VHIth Meeting of the European Stud; Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, Finland, Korpilampi, Augus 6-11, 1994, I 3.

4. G. Yu. Lipskaya, E. A. Chervonskaya-Cherkasova, G. I. Belova, О. M. Kew V. I. Agol "Molecular epidemiology of wild poliovirus type 3 circulating in thi Former Soviet Union", Abstracts of Seventh International Conference о Comparative and Applied Virology, Canada, Montreal, October 12-17, 1994, p 113.

5. G. Lipskaya, E. Chervonskaya-Cherkasova, L. De, M. Pallansch, O. Kev "Molecular reagents for detection and differentation of poliovirus strains isolatec in 1992-1994 during poliomyelitis outbreakes in NIS", Abstracts of 1995 Join Meeting "Progress in Clinical Virology", Czech Republic, Prague, September 10 14, 1995, p. 70.

6. G. Yu. Lipskaya, E. A. Cherkasova, M. Pallansch, Kew О. M. "Genetic; diversity of wild poliovirus isolates from the Former Soviet Union", Abstracts о IXth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology о Picornaviruses, Austria, Gmunden, May 18-24, 1996, p. H10.

7. G. Y. Lipskaya, E. A. Cherkasova, T. Kutateladze, S. Saidov, О. E. Ivanova, S G. Drozdov, M. Pallansch, O. Kew, V. I. Agol. "Dynamics of wild polioviru: circulation in the Former Soviet Union", Abstracts of Xth International Congres: of Virology, Israel, Jerusalem, August 11-16, 1996, p. 143.