Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная эволюция и эпидемиология полиовирусов на примере двух популяций

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная эволюция и эпидемиология полиовирусов на примере двух популяций"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

-РЯэ—ОД

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ .

1 8 ЛЕН 71П

На правах рукописи

ГАВРИЛИН ЕВГЕНИЙ ВИКТОРОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ И ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ПОЛИОВИРУСОВ НА ПРИМЕРЕ ДВУХ ПОПУЛЯЦИЙ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

МОСКВА

2000

Работа выполнена в отделе взаимодействия вируса с клеткой НИН физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М. В Ломоносова

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Член-корреспондент РАН и РАМН, профессор, доктор биологических наук

B.И. АГОЛ

Кандидат биологических наук Г.Ю. ЛИПСКАЯ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор

Ю.З. ГЕНДОН

Доктор биологических наук

C.Ю. МОРОЗОВ

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского

Защита диссертации состоится « 15 » ноября 2000 г. в 10 — час на заседают Диссертационного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университет им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ физика химической биологии им. А. Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультет МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» октября 2000 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета д.х.н. Ю.Ф. Дрыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность проблемы. К настоящему времени установлено, что темпы волюции вирусной РНК достаточно высоки (Gojobori et al., 1990; Ito et al., 991). Изучение внутренней структуры популяций вирусов выявило тот факт, то любая популяция представляет собой сложное распределение различных гномных вариантов (Domingo et al., 1985, 1998). Нуклеотидные оследователыюсти, соответствующие вирусным генам, не являются строго онсервативными, а варьируют в пределах популяции.

Эволюционные исследования ДНК-организмов, а позднее, и РНК-вирусов оказали, что большинство фиксирующихся нуклеотидных замен не роявляются фенотипически, и, следовательно, являются нейтральными ■Cimura, 1983; Gojobori et al., 1990). К ним преимущественно относятся шюнимичтше мутации, не приводящие к замене аминокислот. Эта исоиомсрность легла в основу теории нейтральной эволюции (Kimura, 1983). 'та теория хорошо согласуется с предложенной в 1965 г. Zukerkandl и Pauling горией «молекулярных часов», ход которых выражается в постояшшм числе фиксированных мутаций на единицу времени. В последние годы получены ашше, свидетельствующие о нейтральном характере накопления замен в гномах некоторых пикорнавирусов (Takeda et al., 1994; Zhang et al., 1999). 'олиовирус является одним из наиболее изученных РНК-вирусов, однако сследования его эволюции детально не проводились. В настоящей работе были характеризованы полиовирусные популяции, представляющие собой две золюционные ветви.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сследование закономерностей фиксации мутаций в двух полиовирусных опуляциях, одна из которых была представлена дикими штаммами, зонированными в ходе вспышек полиомиелита, другая - вакцинно-

родственными вирусами, выделенными от больного иммунодефицитом. В ходе исследования решались следующие задачи:

♦ оцепить скорость фиксации мутаций в двух полиовирусных популяциях;

♦ провести анализ замен на разных участках генома с целью детализации закономерностей фиксации мутаций;

♦ охарактеризовать особенности изменчивости вакцинных штаммов выделенных от больного первичным иммунодефицитом;

♦ провести филогенетический анализ диких полиовирусов типа 1 ( использованием протяженных нуклеотидяых последовательностей.

Научная новизна и практическая ценность работы. Несмотря hî большое количество полиовирусных нуклеотидных последовательностей депонированных в генетические банки, эволюционные исследования их обычн< сводились к частным задачам практической эпидемиологии - выявлению свя-iei между вспышками полиомиелита, идентификации источника при заносе вирус; и т. д. Кроме того, имеющиеся в байках последовательпости, как правило, н позволяли сформировать репрезентативную выборку полиовирусов, генетическ] связанных между собой но типу "предок-потомок". Определенные в данно] работе протяженные нуклеотидные последовательности штаммою составляющих две эволюционные ветви, впервые позволили провеет: эволюционный анализ полиовирусов на разных участках генома. Данный анали также предоставил возможность убедиться в правильности выбранного ране критерия родственности полиовирусов для целей молекулярной эпидемиологии.

Изучение штаммов полиовируса, выделенных от больного первичны иммунодефицитом, помимо возможности получить достоверную эволюциошгут ветвь, ценно также и в практическом смысле. Известно, что в кишечник иммунокомпетентных лиц вакцинный полиовирус размножается в течете 1-месяцев, после чего его выделение заканчивается. В то же время, по имеющимс в литературе данным, в кишечнике лиц с дефектами иммунной систем] репродукция вакцинного полиовируса может продолжаться в течеш: нескольких лет (Kew et al., 1998; Bellmunt et al., 1999; Martin et al., 2000). Xoi доля таких людей в человеческой популяции невелика, нельзя исключить, что ï

¡азе иммунодефицитных лиц может сформироваться стойкий резервуар (ериватов вакцинного полиовируса, в котором возможно возникновение шйровирулентпых вариантов. После прекращения прививок и накопления [рослойки неиммунных шщ возможно распространение этих вирусов в гопуляции человека. Выявление особенностей изменчивости полиовируса в |рганизме со сниженным или отсутствующим иммунным ответом может юзволить скорректировать стратегию ВОЗ по искоренению полиомиелитной шфекции.

Апробация работы. Диссертация была апробировала на совместном заседалии афедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела взаимодействия ;нруса с клеткой НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского. Материалы работы были представлены на X и XI международных конференциях Молекулярная биология пихорнавирусов» (Йена, Германия, 1998; Маттината, 1талия, 2000), а также на совместных семинарах отдела взаимодействия вируса клеткой НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ и :аборатории биохимии Ипститута полиомиелита и вирусных энцефалитов им. 4. П. Чумакова РАМН.

Губликацни. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Структура диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах (ашинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания 1атериалов и методов исследований, собственных исследований, обсуждения езультатов, выводов и списка литературы, состоящего из 172 источников, 'абота иллюстрирована 15 рисунками и 7 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

¡ирусы. Дикие штаммы полиовируса типа 1, выделенные в период 1959-1995 .г. в разных районах бывшего СССР, были получены из коллекции Института олиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН. Работу со гаммами, выделенными от больного общей вариабельной имунной «достаточностью, мы проводили в Centers for Disease Control and Prevention

(CDC, USA). Штаммы размножали на культурах клеток RD (рабдомиосаркома человека), НЕр 2 (эпидермоидная карцинома человека) или L20B (клетки мыши, экспрессирующие человеческий полиовирусный рецептор). Выделение РНК. РНК выделяли из культуральной жидкости гуаиидиновыы методом с фенольной депротеинизацией с использованием коммерческого реактива ULTRASPEC 3 по протоколу производителя (Biotexc, USA). Праймеры. Нами использоваиы описанные в литературе праймеры: 1] универсальный праймер для частичного секвенировапия полиовирусной РНК (Rico-Hesse et al., 1987); 2) праймеры для анализа методом полиморфизма длинь рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (Georgescu et al., 1994). В работе также использовались праймеры, сконструированные нами для амплификации i секвенирования соответствующих участков полиовирусного генома Синтетические олигодезоксинуклеотиды были сконструированы с помощьк программы «Oligo» (National Bioscience, USA) и синтезированы стандартны» фосфорамитидньш методом на автоматическом синтезаторе 380А (Appliei Biosystems, USA).

Амплификация в ПЦР и анализ продуктов амплификации. Для полученю ДНК-копии вирусного генома использовали гексануклеотидную затравю (Boebiinger Ingelheim, USA) и обратную траискриптазу из вируса миелобластоз; птиц (Promega, USA). Реакцию проводили в присутствии ингибитора РНКаз и человеческой плаценты (Boehringer Ingelheim). Амплификацию фрагменто] вирусного генома проводили на ДНК-амплификаторе (Модель РЕ480, Perkii Elmer, USA) с использованием соответствующих праймеров. Ссквенирование. Частичное секвенирование ДНК-копии полиовирусной РШ проводили методом дидезоксинуклеотидиой терминации цепи в дву модификациях: с использованием дезоксиаденозишрифосфата, меченого 32Р шп 33Р с использованием набора Sequenase ver. 2.0 (US Biochemicals, USA) n протоколу производителя, и с использованием флюоресцентш>г дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Мечение олигодезоксинуклеотидо флюоресцентной меткой (BigDye Mix; Applied Biosystems) проводили циклической асимметрической ПЦР в ДНК-амплификаторе (РЕ 9600, Perki

lmer). Разделите флюоресцентно-меченных олигодезоксинуклеотидов роводшш в 5%-ном полиакриламидном геле (Long Ranger) в присутствии 7 M очевины на ДНК-секвенаторе (ABI Prism 377, Applied Biosystems), цифровыеапие гелей проводили при помощи программы ABI Prism версии 3.0 Applied Biosystems).

уклеотидные последовательности. В настоящей работе были определены эследовательности полиовирусного генома 29 штаммов: нуклеотидные эследовательности, кодирующие вирусные белки VP1 (906 нт; координаты 500-3408), 2А (447 irr; 3409-3855) и 2В (291 нт; 3856-4146), а также фрагмент эследовательности гена 2С (51 нт; 4147-4197; далее 2С'). Фрагмент гена элимеразы 3D (792 нт; 6601-7392, далее 3D') был проанализирован в 9 таммах. Координаты участков даны в соответствии с нуклеотидным .хравниванием Toyoda et al. (1984).

Все нуклеотидные последовательности, определенные в этой работе, шонированы в банк последовательностей GeneBank со следующими кодами: F233098-AF233222. Последовательности участка VP1 изолятов от ■шунодефицитного пациента были депонированы ранее (AF083933-AF083937) :ew et al., 1998).

омпьютериый анализ последовательностей. Компьютерный анализ юводили на IBM-совместимой платформе с процессором PentiumII и тематическим сопроцессором под управлением MS-DOS 7.0. Кроме того, счеты вели на платформе UNIX Института Пастера (Париж) через Ар-сервер.

Множественное выравнивание последовательностей проводили с ¡пользованием программы CLUSTAL W 1.74 (Thompson et al., 1994).

Для построения дендрограмм использовали программу PUZZLE 4.0 trimmer & von Haeseler, 1996), пакет программ для филогенетического анализа 1YLIP 3.5с (Felsenstein, 1993) и программу METREE (Rzhetsky and Nei, 1994). 1ализ по критерию наибольшего правдоподобия (maximum likelihood) оводили с использованием эмпирических частот оснований и модели клеотидпых замен Хасегавы-Кишино-Яно (HKY85; Hasegawa et al., 1985). jeinca достоверности (значимости) образования ОТЕ (операционная

таксономическая единица) проводили путем итераций (puzzling) 1000( квартетов.

Для построения дендрограмм последовательностей по невзвешенном; парногрупповому методу с арифметическим усреднением (UPGMA) и метод; ближайшего соседа (neighbor-joining; Saitou and Nei, 1987) использовал] программу NEIGHBOR из пакета PHYLIP 3.5с. Матрицу расстояпи! нуклеотидных последовательностей для этих методов генерировали uporpaMMoi DNADIST с использованием двух алгоритмов: двухпараметрической модеот Кимуры (Кшшга, 1980) и модели Тамуры - Нея (Tamura and Nei, 1993).

Анализ по алгоритму максимальной экономии (maximum parsimony; Ее! and Dayhoff, 1966) и минимальной эволюции (Rzhetsky and Nei, 1993) вели использованием программы DNAPARS пакета PHYLIP 3.5с и программ! METREE.

Статистическую значимость топологий дендрограмм оценивали методо] бутстрэшшга (bootstrapping) при помощи программы SEQBOOT с 100 бутстрэп-выборок. Построение консенсусного дерева производили, использу программу CONSENSE.

Во всех алгоритмах получение корневых деревьев проводили методо] внешней группы, в качестве которой служил штамм полиовируса типа /169AZB59. Корневые деревья визуализировали при помощи программ] TREEVIEW 1.5.2.

Регрессионный анализ при расчетах скорости фиксации мутаци проводили с использованием программ пакета STATISTICA для WINDOW версии 4.3 (StatSoft, Inc. 1993). В качестве независимой перемешюй (НГ использовали временной интервал между самым первым вирусным изолятом i эволюционной ветви и его потомком. Скорость фиксации мутаций выражали числе мутаций на сайт в год (мут/сайт/год).

Для оценки нуклеотидных отличий использовали три параметра: процег мутировавших нуклеотидных сайтов из общего числа сайтов при попарно сравнении последовательностей (Kt); процент мутировавших синонимичнь: сайтов из числа всех синонимичных (1С) и процент мутировавши

«синонимичных сайтов из числа всех несинонимичных сайтов (Ка). Ks и Ка зычисляли с иснользова1шем программы, предложенной Li et al. (1985).

Расчет частот использования кодонов в геноме полиовируса проводили с тепользованием пакета геномного анализа GCG (GCG Corp., USA). Частоты ^пользования кодопов в геноме человека брали из Базы данных, по кпользованиго кодонов (Codon Usage Database, Japan). Кодон считали редким, :сли его содержание в таблице частот использования кодонов в геноме юлиовируса не превышало 30 процентов от содержания самого часто гспользуемого синонима. Чтобы избежать искажения результатов ;татистичсского апализа, которые возникли бы из-за близкородственности «которых штаммов в нашей выборке, из 29 нуклеотидных последовательностей участков VP1 и 2АВ были выбраны 6 наиболее удалешгых друг от друга юследовательпостей. В ходе анализа бьши сделаны следующие допущения: а) >се нуклеотидные сайты мутируют независимо друг от друга и б) скорость *утаций в пределах анализируемого участка неизменна. Долю данного редкого :одона среди соответствующих ему синонимических кодонов высчитывали как шюшение числа этого редкого кодона к сумме чисел других синонимичных ему :одонов гепома штамма Собин 1. Для вычисления вероятности встречи (пределенного числа редких кодонов (от 1 до 6) в данной кодоновой позиции в 6 1ыровненных последовательностях использовали функцию биномиального >аснределения (формула Бернулли). Кодоповые позиции со статистически начимым отклонением (р < 0.05) от частоты использования синонимических лдонов в сторону преобладания редкого кодона считали аномально хшссрвативными.

Для поиска консервативной вторичной структуры РНК использовали [ротрамму RNAStructure версии 2.52 (Jaeger et al., 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

-Общая характеристика двух полиовирусных популяций

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей VP1/2ABC' (нт 2500-4197) длиной 1694 нт подтвердил прежде сделаиные выводы с классификации по геотипам диких полиовирусов типа 1, циркулировавших г 1985-1995 г.г. на территории бывшего Советского Союза (Lipskaya et al., 1995) Ранее для геотипирования диких штаммов полиовируса использовался участок генома VP1/2A (Rico-Hesse et al., 1987), кодируюпщй 30 С-концевы* аминокислот капсидного белка YP1 и 20 N-концевых аминокислот неструктурного белка 2А (150 нг; 3319-3368). Анализ более протяженного участка генома подтвердил принадлежность к геотипу Т 11 диких штаммов типа 1, вошедших в одну из популяций, изученных в пастоящей работе (Lipskaya el al, 1995; Рис. 1).

6341UKR92

7TAJ91

100

- 4TAJ91

100

6794UZBS4

Ht

L »

8011TAJ34 — Б0Б4СНЕ95 J® 64U5ING9S ^ 64271NG9S г54- 64S6CHE95 6484CHE95 6490CHE95

4?

-je;

- eoi3TAJ94 ■ 6430PAK95

- S990TAJ94 - Б433РАК9

P23M CM8M D1S8M

-¿тш

Q.

£> О и ВО

H

Рис. 1. Родство диких и вакцинных полиовирусов типа 1. В качестве внешней групп I штамм 169А2В59. Шкала соответствует 10% нуклеотидных отличий. Эволюционные соотвесгвующие диким вирусам и вирусам, изолированным от больного иммунодефш находятся в рамках. Индексы надежности топологии (бутстрэп) приведены у осно бифуркаций.

Выбранный кластер штаммов Т-геотипа представляет единую волюциопнуга ветвь, поскольку все они имели одного общего предка, который ыл импортирован на территорию Таджикистана из Пакистана в 1991 г. (Mulders t al., 1995). Самый ранний из штаммов Т-геотипа был выделен на территории аджикистана в 1991 г. и на участке VP1/2A имел 99% идентичных нуклеотидов о сравнению с пакистанским штаммом.

Изоляты от больного иммунодефицитом имели первичную структуру уклеотидной последовательности, кодирующей белок VP1, сходную с таковой акцшшого вируса Сэбин 1 (Kew et al., 1998). Однако, фрагменты 2АВС' всех золятов этой группы имели рекомбинантпуго природу: участки, кодирующие глок 2А и N-конец белка 2В, имели наибольшее нуклеотидное сходство со [таммом Сэбин 1, в то время как участки, кодирующие С-конец белка 2В и N-эпец белка 2С, имели большее сходство с последовательностями штамма Сэбин . Участок рекомбинации предположительно располагается на коротком уклеотидном отрезке между позициями 3973 и 3996 (Рис. 2).

и

!М J2

11

IM

12

3921

Т—Т---р[-тт-с---С-А-

3984

----А—Т—С-----Т—А—G---

с-ш-----g---

G

-------А—С—

Т— С—т-

-с--jc)-- а-

-т—У--В-

4048

2. Предполагаемый участок рекомбинации в гене 2В самого раннего штамма (Оау23М), дленного от больного иммунодефицитом. Тире обозначают идентичные основа!шя во всех яедовательносгях. Рекомбинациопное событие, по-видимому, произошло на участке (3973-'6 кг), заключенном в рамку. Начало участка 2В2 показано стрелкой.

- Ход эволюции в двух полиовирусных популяциях и характер фиксацш мутаций в разных участках вирусного генома

Изученные в настоящей работе полиовирусные популяции имеют межд; собой ряд отличий:

первые изоляты в изученных популяциях были представлены дгадама (скорее всего, хорошо адаптированными) или атгенуированными (мене жизнеспособными) вирусами;

передача диких вирусов от человека к человеку имела прерывисты характер, в то время как другая ветвь была представлена непрерывп размножающейся популяцией в одном хозяине;

более ранние изоляты диких вирусов, вероятно, не являютс непосредственными прародителями последующих изолятов, что скоре всего имело место в случае вакцинно-родственной популяции.

Несмотря на указанные различия, в эволюции этих популяций наблюдаютс общие закономерности. В обеих популяциях показана линейность накоплени как синонимичных, так и за малым исключением, несшюнимичных мутаци (Рис. 3, 4). Кроме того, подавляющее число мутаций было, по-видимому фенотипически нейтрально. Такой вывод можно сделать на основании того, чт более 75% обнаруженных нуклеотидных замен были синонимичными. Эт наблюдения свидетельствуют о преимущественно нейтральном характер эволюции. В рамках теории нейтральности замены, не приводящие нарушениям структуры и функции молекулы, в ходе эволюции фиксируютс чаще тех, которые вызывают существенные изменения, и накапливаются постоянной скоростью (Кйпига, 1983).

Однако разные участки РНК в обеих популяциях различались по степен подверженности мутациям. Так, участок 2АВ мутировал примерно в 2,5 ра: быстрее участка УР1 (Рис. 3 А, Б; 4 А). При этом основной вклад в разницу скоростях вносили синонимичные замены (Рис. 3 В, Е; 4 В). Этот фа! потребовал специального изучения, т. к мало известно о механизмг селекционного давления на синонимичные сайты (см. ниже).

Следует отметить, что скорость фиксации синонимичных замен на участке !АВ в геномах вирусов, выделенных от больного иммунодефицитом, составила 18,25 • 10"2 на синонимичный сайт в год (Рис. 3 Е). Это одна из самых высоких :коростей фиксации мутаций, когда-либо отмеченных для молекул РНК. Самая шзкая скорость фиксации мутаций среди изученных штаммов была отмечена на участке ЗБ' в вакцинно-родственных

К, К, ка

Рис. 3. Скорость фиксации мутаций в изолятах от больного иммунодефицитом на участках УР1, 2АВ и 30'. Ось ОУ - процент сайтов с мутациями; ОХ - время с момента выделения первого вируса в днях. Пунктирные линии обозначают доверительный интервал в 95%.

шрусах (Рис. 3 С, Н, I). Она в 2-3 раза отличалась от таковой на участке УР1 фи сравнении, как общего числа мутаций, так и синонимичных и ^синонимичных замен (Рис. 3).

Скорости фиксации несинонимичных мутаций были существенно ниже :инонимичных (Рис. 3, 4). Характер и частота фиксации мутаций могут юдвергаться давлению негативной селекции. Безусловно, селекционное

давление, оказываемое на несинонимичные замены, приводящие к смене аминокислоты, будет больше, чем давление на молчащие замены.

К, К8 ка

Месяцы

Рис. 4. Скорость фиксации мутаций в изолятах, принадлежащих геотипу Т. Непрерывная линия регрессии соответствует участку VP1, прерывистая линия - участку 2АВ. Ось OY -процент сайтов с мутациями; ОХ - время с момента выделения первого изолята в месяцах. Пунктирные линии соответствуют доверительному интервалу в 95%.

-Неравномерность использования синонимичных кодонов

Неравномерная скорость аккумуляции мутаций в вирусной РНК не является отличительной чертой эволюции, присущей только полиовирусу. Разные скорости фиксации несинонимичных мутаций на разных участках геномг были отмечены и у других РНК-вирусов (Gojobori, 1990; Ito et al, 1991). Эк разница объясняется селективными ограничениями, накладываемыми нг структуру тех или иных вирусных белков. Более интересным представляете} изучение неодинаковых скоростей фиксации синонимичных мутаций. Hei серьезных оснований полагать, что вероятность ошибок РНК-полимеразы может варьировать от участка к участку. Скорее всего, разная скорость фиксацш синонимичных замен связана с определенными селективными ограничениями Какие же селекционные ограничения могут действовать на синонимичны« сайты? В ряде экспериментов (Adzhubei et al, 1996; Kolb et al, 1994; 1995; Oresi< et al, 1998; Zhou et al, 1999) было показано, что консервация определенны:

гдких кодонов важна для сохранения оптимальной кинетики элонгации при зансляции для должного сворачивания вновь синтезировштого белка.

На участке УР1 бьша выявлена статистически значимая (р < 0.05; см. [атериалы и методы) консервация редких кодонов в определенных позициях ;оответствуюицие им аминокислоты показаны на Рис. 5). Интересно отметить, го участки такой консервации длиной в один или несколько редких кодонов, ж правило, располагаются на границе между структурированными и ^структурированными участками белка (Рис. 5). Известно, что в ультидоменных белках сворачивание отдельных доменов , может происходить 1К независимо друг от друга, так и взаимосвязанно, когда правильное юрачивание последующих доменов невозможно без завершения формирования редыдущих (Крашенинников и др., 1989). Формирование активных молекул с 13витой доменной структурой проходит еще до завершения их синтеза на ябосоме и образование доменов происходит ко-трансляционно. Редкие кодоны их кластеры могут определять ход сворачивания белка за счет трансляциошшх 1уз (АсЫшЬе1 е1 а!., 1996). Факт обнаружения консервативных редких кодонов их локализация указывают на то, что последовательное ко-тралсляциотшое юрачивапие может иметь значите при формировании капсидных белков элиовируса. В свете гипотезы ко-трансляциошюго сворачивания, также этересен выявленный нами при анализе нуклеотидного выравнивания факт 1мены одного редкого кодона на другой, такой же редкий (данные не эиводятся). Этот пример иллюстрирует значение определенных кодоновых )зиций в обеспечении трансляциошшх пауз.

Интересно, что на участке 2АВ редкие кодоны встречались существешю :же, и консервации редких кодонов нами обнаружено не было. Но *ентифицированные нами аномальпо консервативные редкие кодоны не могут )личественно объяснить существенную разницу в мутабельности участков УР1 2АВ.

Разница в скоростях фиксации мутаций может быть также следствием юбходимоста поддержания вторичной структуры РНК. Отмечалось, что

_rv

iV

AATSRDALPNTEASGPTHSKEIPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVVQHRSRSESS

20 — — ~ 76

IES FFARGACVTIMTVDNPASTTNKDKLFAVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDME

77 133

LTFWTANFTETNNGHALNQVYQIMYVPPGAPVPEKWDDYTWQTSSNPSIFYTYGXA

134 190

-TV.

PARISVPYVGISNAYSHFYDGFSKVPLKDQSAALGDSLYGAASLNDFGILAVRWND

19l" — "" 247

HNPTKVTSKIRVYLKPKHIRVWCrePPRAVAYYGPGVDYKDGTLTPLSTKDLTTY

248 302

Рис. 5. Схематическое изображение вторичной структуры белка VP1 (Protein Dal Bank' w^v.biochem.ucl.ac.uk/bsm/pdbsum/2plv/main htmll. Аминокислоты, соответствукяцт редким статистически значимым консервативным кодонам, выделены подчеркиванием жирным шрифтом. Прямые стрелки соответствуют р-элеменгам, изогнутые - а-спираля! Нумерация аминокислот приводится от начала белка VP 1.

относительно низкая вариабельность в синонимичных и несинонимичньп нуклеотидных сайтах субтерминальпых кодирующих участков РНК вирус гепатита G может быть обусловлена их ролью как репликативных си-элементс (Simmonds and Smith, 1999). Кроме того, известно, что внутренние кодирую ни участки пикорнавирусных РНК могут нести рспликативные си-сигналы, кг правило, в форме шпилек (Lobert et al., 1999; McKnight and Lemon, 199 Goodfellow et al., 2000). Такие сигналы могут также находиться и исследованных нами участках полиовирусного генома, однако стоит отметит что они вряд ли представляют собой протяженные отрезки РНК и поэтому i могут объяснить существенной разницы в мутабельности участков VP1 и 2АВ.

Проведенный нами анализ коэффициентов p-num, характеризуют;! число возможных пар для каждого данного основания (Jaeger et al., 198 Palmenberg & Sgro, 1997), и сравнение подмножества субоптимальных структу

э лученных с использованием алгоритма М. Цукера (гикег, 1994), не позволяли ыявить участки с протяжешюй консервативной вторичной структурой.

Нами не был обнаружен факт существования консервативной вторичной груктуры РНК на участке УР1, тем не менее, мы не отрицаем возможности клада структурированных РНК-элементов в снижение скорости фиксации 1мен, поскольку существуют данные о функциональной равнозначности ,'боппшалыгых вторичных РНК-структур (Агога е! а1., 1996).

В итоге, из двух известных нам механизмов, которые могли бы привести к голь существенной разнице в скоростях фиксации мутаций на участке \Ф1 и ■^В, только гипотеза о присутствии аномально консервативных редких кодонов 1 одном из участков получила подтверждение. Однако, как уже было сказано зппе, их количество не может объяснить обнаруженную нами разницу в адростях. Мы также предполагаем, что вклад в разную мутабельность участков Р1 и 2АВ может вносить неидентифицированный на сегодняшний день фактор.

Черавномерпостъ хода молекулярных часов

Накопление всех наблюдаемых, а также синонимичных и гспношшичных замен происходило линейно со временем почти на всех :следованных участках РНК. Однако несиногашичные замены на участке УР1 популяции Т-геотипа накапливались нелинейно (г = 0,59) (Рис. 4 С). Эта глинсйность была обусловлена «всплеском» числа аминокислотных замен у [тамма 5341ЦЫ192 по сравнению со штаммом 4ТА191, что, скорее всего, может нщетельствовать о вкладе позитивной селекции.

Более существенное отклонение от линейности было отмечено для шрпшо-родственных штаммов при анализе разных этапов эволюции этой ;тви вирусов. С одной стороны, скорость синонимичных замен за период эемени между выделением самого ратгсго и последнего изолятов, юсштапная по показателям К„ на участке 2АВ была в пять раз выше, чем на метке УР1 (Рис. 3 В, Е). С другой, процент промутировавших синонимичных

сайтов самого раннего изолята по сравнению с предковым вакцинным шгаммок был весьма близок на этих двух участках: 30,4 и 27,9 %, соответственно. Этс цифры говорят о сравнимой скорости фиксации синонимичных мутаций на эти) участках на временном отрезке от штамма Сэбин до первого изолята. Эт< несоответствие стало еще более очевидным, когда время дивергенции первой изолята от вакцинного штамма (его «возраст») было рассчитано путе» экстраполяции с использованием полученных ранее эволюционных скоросте! фиксации мутаций на участках УР1 и 2АВ (Рис- 6). Для синонимичных замен н; участке УР1 (Рис. 6, линия А) это время (9,6 лет) приблизительно

т

0 ь >х 10

" X X 2

II

и

1 = о

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

А,/

.-••"'" с/ /

/в

/ 1

8 10 12 14 16 Возраст больного (г)

18

Рис. 6. Экстраполяция (пунктир) скоростей эволюции, рассчитанных по синонимичным сайтам для вакцинно-родственных вирусов. А. VI'I; В. 2АВ,; С. \'Р1/2ЛВ,/30'. Непрерывные участки линий соответствуют реальным данным, взятым из Рис. 3 В, Е, и скорости, рассчитанной для участка УР1/2АВ,/30' (рисунок не приводится). Черный треугольник соответствует времени последней иммунизации живой оральной полиовакциной. Время начала параличей указано стоелкой.

соответствовало времени (7 лет), прошедшему с момента последней вакцинаци пациента живой полиомиелитной вакциной до начала параличей (Ке,лг й а! 1998). В то же время, скорость фиксации синонимичных замен на участке 2А1 позволяла достичь наблюдаемого уровня дивергенции между вакцинны штаммом Сэбина типа 1 и первым изолятом в четыре раза быстрее (около 2

:т) (Рис. 6, линия В). Даже когда мы соединили все имеющиеся )Следовательности на участках VP1, 2АВ] и 3D' и провели экстраполяцию, )лученное время дивергенции от вакцшпгого штамма (3,8 года) ■ слабо ютветствовало истории болезни пациента (Рис. 6, линия С).

Возможность нелинейности накопления общего числа мутаций вирусами ш отмечена ранее (Elena et al., 1992; Villaverde et al„ 1991), но механизм этого ¡ления до конца не ясен. Нелинейность эволюции 2АВ трудно объяснить ¡менением частоты ошибок РНК-полимеразы или числом вирусных генераций, к. речь идет об ■ эволюции лтапь этого . участка в пределах одного генома, овышение скоростей фиксации : может стать ответом на накопление желательных мутаций на этом или сопряженном участке. По этой гипотезе, тышенная мутабельность 2АВ может отражать необходимость ^становления функции определенных участков вирусного генома и, [едовательно, носить адаптивный характер. Синошшичные мутации также згут быть вовлечены в этот процесс. Одним из примеров такой ситуации могло I служить рекомбинационное событие, если оно дестабилизировало (или 1зрушило) протяженный структурный элемент на участке 2АВ. Указания на >двержепность этого региона рекомбинационным событиям были получены к в этой работе (Рис. 2), так и ранее (Кутитова и др., 1989). Исчезновение ого гипотетического структурного элемента могло повлечь за собой заметное пижение жизнеспособности вируса. Как следствие, возникло селекционное вление, приведшее к постепенному накоплению мутаций и восстановлению дпсционально важного структурного элемента.

С другой стороны, нельзя исключить, что указаш!ая нелинейность копления замен на участке 2АВ носит лишь видимый характер. К примеру, за 5 года до выделения первого изолята могла произойти рекомбинация, где тором 2AB мог быть неизмененный штамм Сэбин 1.

-Модель эволюции полиовируса и эпидемиология

В эволюцию диких и вакцшшо-родственных вирусов осповной вклад, кш показали наши исследования, вносят преимущественно нейтральные механизмы Необходимы более детальные исследования патогенеза полиомиелита, чтоб! представить механизм, при котором из гетерогенной популяции полиовируса кишечнике человека может осуществляться случайный отбор генетически вариантов. Основываясь на относительно низком тигре ипфекционного вируса фекалиях (3,0 - 6,5 logi0 TCD50/r; Melnick and Rennick, 1980), можно думать, чтс либо очень малая доля восприимчивых к инфекции клеток доступна для вируса определенный момент, либо число вирусных частиц, способных ипфицироват такие клетки, очень мало. Случайный отбор геномных вариантов в популяци диких вирусов достигался также и в результате передачи малых доз вируса с человека человеку. Низкая множественность инфекции, наряду со случайны отбором, могут обеспечить фиксацию как нейтральных, так и потенциалы] нежелательных мутаций. В результате, общая жизнеспособность вируса будс более или менее постоянной, а может и снижаться (Chao, 1990). Этим мож« объясняться как низкий уровень заболеваемости полиомиелитом (< 1%; Melnicl 1996) при циркуляции диких штаммов полиовируса среди неиммунно1 населения, так и обычно длительный латентный период между прививкой возникновением заболевания у иммунодефицитных лиц. Наши данные с эпизодах позитивной селекции как в популяции диких вирусов (нелинейш увеличение числа иесинонимичных замен на участке VP1), так и у вакцина родственных штаммов (вероятное повышение мутабельности участка 2А1 свидетельствуют о колебаниях уровня жизнеспособности вируса в ходе ei эволюции. Возникающие нежелательные мутации могут быть устранен негативной селекцией или внутри/межтиповой рекомбинацией (Minor, 198 Furione et al, 1993; Georgescu et al, 1994; Lipskaya et al, 1991). Появление бол жизнеспособных и, вероятно, более нейровируленшых вариантов, мож являться причиной заболевания вакцшшо-ассоциировашшм полиомиелитом и: приводить к возникновению вспышек полиомиелита при циркуляции дши вирусов.

выводы

1. В двух популяциях полиовирусов, представляющих собой а) эволюцшншую ветвь диких штаммов Т-геотипа, изолированных в ходе вспышек полиомиелита на территории бывшего СССР, и б) производные штамма Сэбина, выделенные от иммуиодефицитного пациента, определены нуклеотагдные последовательности, соответствующие вирусным белкам УР1, 2А, 2В и частично 2С. Для 9 вирусов также определены последовательности, кодирующие С-конец белка ЗЭ.

2. Выявлен преимущественно линейный характер фиксации мутаций. На исследуемых участках генома синонимичные замены существенно преобладают над несинонимичными. Эти особенности фиксации мутаций говорят о ведущей роли нейтральных механизмов в эволюции полиовируса.

3. Несмотря на существенный вклад нейтральной эволюции, отмечены периоды неравномерного хода «молекулярных часов» и выявлена разная скорость фиксации синонимичных мутаций на разных участках генома. Эти отклонения могут свидетельствовать об адаптивном характере фиксации синонимичных мутаций.

4. Выявлена аномальная консервация редко используемых кодонов на участке УР1. Высказано предположение о роли этих кодонов в качестве «трансляционных пауз» при котрансляционном фолдинге вирусного полипротеина. Хотя консервация редких кодонов может влиять на скорость эволюции, это влияние слишком мало, чтобы объяснить разницу скоростей фиксации мутащш на разных участках РНК.

5. В связи с неравномерностью скоростей эволюции разных сегментов генома топология дендрограмм, отражающих родство вирусных штаммов, зависит от выбора участка РНК, используемого для филогенетического анализа.

6. Анализ протяжешшх нуклеотидных последовательностей диких штаммов полиовируса, выделенных на территории бывшего СССР в 1985-1995 гг, подтвердил ранее полученные данные об их эволюциотгых взаимоотношениях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gavrilin, E.V., Cherkasova, Е.А., Lipskaya, G.Yu., Kew, O.M., and Agol, V.l (2000) Evolution of circulating wild poliovirus and of vaccine-derived polioviru in an immunodeficient patient: a unifying model. J. Virol. 74, pp. 7381-90.

2. Агол, В.И., Гаврилин, Е.В., Kew, О.М., Короткова, Е.А., Липская, Г.Ю Черкасова, Е.А. (1999) Молекулярная эпидемиология полиомиелита. Тезис! научи, конф. «Актуальные проблемы медицинской вирусологии». Москвг 23-25 ноября, с. 12.

3. Иванова, О.Е., Еремеева, Т.П., Мартыыепко, И.М., Лещинская, Е.В., Липска* Г.Ю., Черкасова, Е.А., Гаврилин, Е.В. (1999) Вспышка полиомиелита Чеченской республике. Тезисы научн. конф. «Актуальные проблем! медицинской вирусологии». Москва, 23-25 ноября, с. 25.

4. Gavrilin, E.V., Cherkasova, Е.А., Lipskaya, G.Yu., Kew, O.M., and Agol, V.'.

(1998) The differences of molecular evolution rates of the structural and nor structural regions of poliovirus genome. Abs. of the Xth Meeting of the Eurof Study Group on the Molecular Biology of Picomaviruses. Jena, Germany, 5-1 September, V76.

5. Gavrilin, E. V., Cherkasova, E. A., Lipskaya, G. Yu., Kew, О. M. and Agol, V.

(1999). The "speed bumps" of poliovirus evolution. Abs. of the Xlth Internationj Congress of Virology, Sydney, 9-13 August, p. 240.

6. Gavrilin, E.V., Cherkasova, E.A., Lipskaya, G.Yu., Kew, O.M., and Agol, V.

(2000) Poliovirus evolution in an immunodefficient patient. Abs. of the Xlt Meeting of the Europ. Study Group on the Molecular Biology of Picomaviruse Baia delle Zagare, Italy, 25-31 May, H08.

7. Agol, V. I., Belov, G. A., Cherkasova, E. A., Gavrilin, E. V Kolesnikova, M. S., Romanova, L. I., and Tolskaya E. A. (2000) Some problems ( molecular biology of poliovirus infection relevant to pathogenesis an viral spread. Dev. Biol. Stand, (in press)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаврилин, Евгений Викторович

Список используемых сокращений.

Введение.

Цели работы.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Характеристика полиовируса и организация его генома.

1.1.1. 5'-нетранслируемая область.

1.1.2. Кодирующая часть генома. Протеолиз и репликация вируса.

1.1.3. З'-нетранслируемая область.

1.2. Молекулярная эволюция РНК-вирусов.

1.2.1. Основные понятия и механизмы молекулярной эволюции вирусов

1.2.2. Методы эволюционного анализа нуклеотидных последовательностей.

1.2.2.1. Методы, основанные на матрице расстояний.

1.2.2.2. Методы, основанные на первичных данных.

1.2.2.3. Методы оценки статистической достоверности топологий получаемых дендрограмм.

1.3. Молекулярная эпидемиология полиомиелита.

1.3.1. Методы молекулярной эпидемиологии.

1.3.2. Географическое распределение полиовирусов и особенности их циркуляции.

1.3.2.1. Генотипы полиовирусов. Одновременная циркуляция разных генотипов.

1.3.2.2. Занос (импорт) генотипов в другие географические регионы.

1.4. Вакцинно-ассоциированный полиомиелит.

1.5. Общая вариабельная иммунная недостаточность (ОВИН).

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Описание диких штаммов полиовируса.

2.2. Описание штаммов, выделенных от больного иммунодефицитом.

2.3. Нуклеотидные последовательности. GeneBank коды.

2.4. Выделение и типирование вирусов.

2.5. Выделение тотальной РНК.

2.6. Праймеры.

2.7. Обратная транскрипция.

2.8. Амплификация фрагментов вирусного генома методом ПЦР и подготовка ДНК-матрицы к секвенированию.

2.9. Электрофорез.

2.10. Секвенирование ДНК.

2.10.1. Получение радиоактивно-меченных олигодезоксинуклеотидов.

2.10.2. Получение флюоресцентно-меченных олигодезоксинуклеотидов.

2.10.3. Разделение олигодезоксинуклеотидов.

2.11. Компьютерный анализ полученных нуклеотидных последовательностей.

2.11.1. Построение дендрограмм последовательностей.

2.11.2. Регрессионный анализ.

2.11.3. Анализ вторичной структуры РНК.

2.11.4. Анализ мутаций в синонимических и несинонимических сайтах.

2.11.5. Статистический анализ редких кодонов.

Глава 3. Результаты.

3.1. Общая характеристика двух полиовирусных популяций.

3.2. Характер фиксации мутаций.

3.3. Ход эволюции в двух полиовирусных популяциях.

3.4. Неравномерность скоростей фиксации мутаций в эволюции разных участков вирусного генома.

3.5. Неравномерность использования синонимичных кодонов.

3.6. РНК-структура и неравномерность темпов эволюции на разных участках вирусного генома.

3.7. Неравномерность хода молекулярных часов.

Глава 4. Обсуждение результатов.

4.1. Основные механизмы эволюции полиовирусной популяции.

4.2. Неравномерные скорости эволюции разных участков генома и разных вирусных геномов.

4.3. Нарушения хода молекулярных часов.

4.4. Гипотетический сценарий вирусной эволюции в иммунодефицитном хозяине.

4.5. Модель эволюции полиовируса и эпидемиология.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная эволюция и эпидемиология полиовирусов на примере двух популяций"

К настоящему времени установлено, что темпы эволюции вирусной РНК достаточно высоки (Gojobori et al., 1990; Ito et al., 1991). Изучение внутренней структуры популяций вирусов выявило тот факт, что любая популяция представляет собой сложное распределение различных геномных вариантов (Domingo et al., 1985, 1998). Нуклеотидные последовательности генома не являются строго консервативными, а варьируют в пределах популяции, составляя некую консенсусную последовательность. Однако механизмы, вызывающие такую гетерогенность, до сих пор точно не охарактеризованы. При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей отмечаются участки с большим числом замен, чередующиеся с относительно консервативными районами. Так, отмечена большая вариабельность участка нуклеотидной последовательности, соответствующего антигенным сайтам полиовирусного белка VP1 (Kinnunen et al., 1990). В то же время, в нуклеотидном выравнивании этого участка вирусов одного серотипа, отмечаются регионы, практически не затрагиваемые мутациями. Анализ динамики накопления мутаций необходим для понимания механизмов, отвечающих за изменчивость полиовируса in vivo.

Эволюционные исследования ДНК-организмов, а позднее, и РНК-вирусов показали, что большинство фиксирующихся мутаций не проявляются фенотипически, и, следовательно, являются нейтральными (Gojobori et al., 1990). Предполагается, что накопление таких нейтральных мутаций происходит линейно со временем и что среди мутаций должны преобладать т.н. синонимичные - т.е. мутации, не меняющие кодируемую аминокислоту. Еще в 1965 г. Zukerkandl и Pauling (1965) предложили т.н. теорию «молекулярных часов». Она предполагает существование вселенских часов», ход которых выражается в постоянном числе зафиксированных мутаций на единицу времени. В последние годы получена масса данных, свидетельствующих о нейтральном характере накопления замен, в том числе и в геномах пикорнавирусов (Gojobory et al., 1990; Takeda et al., 1994; Zhang et al., 1999). Однако, ряд исследований выявил факты, не укладывающиеся в рамки теории нейтральной эволюции. В частности, при анализе изменчивости одного из белков вируса ящура было выявлено преобладание несинонимичных замен над синонимичными (Martin et al., 1998). Кроме того, было также отмечено нарушение принципа линейности в накоплении нуклеотидных замен.

Следует отметить, что, несмотря на большое количество полиовирусных нуклеотидных последовательностей, депонированных в генетические банки, эволюционные исследования полиовирусов, как правило, сводились лишь к частным задачам практической эпидемиологии - выявлению связей между вспышками, идентификации источника при заносе вируса и т.д. Кроме того, имеющиеся в банках последовательности, как правило, не позволяли сформировать репрезентативную выборку вирусов, генетически связанных между собой по типу «предок-потомок».

Помимо изучения закономерностей эволюции полиовирусов, формирование такого рода выборок протяженных последовательностей важно для повышения достоверности молекулярно-эпидемиологических исследований, т.к. анализ коротких последовательностей не всегда оказывается информативным. Анализ вариабельности полиовирусов на разных (протяженных) участках вирусного генома необходим для уточнения критерия родственности, принятого в молекулярной эпидемиологии полиовирусов (см. ниже).

Изучение вирусных вариантов, выделенных от больного иммунодефицитом, помимо возможности получить достоверную эволюционную ветвь, ценно и в практическом смысле в рамках глобальной программы Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по искоренению полиомиелита. Известно, что в кишечнике иммунокомпетентных лиц вакцинный полиовирус размножается в течение 1-2 месяцев, после чего его выделение заканчивается. В то же время, по имеющимся в литературе данным, в кишечнике лиц с дефектами иммунной системы репродукция вакцинного полиовируса может продолжаться в течение нескольких лет (Kew et al., 1998). Хотя доля таких людей в человеческой популяции невелика, нельзя исключить, что на базе иммуно дефицитных лиц может сформироваться стойкий резервуар дериватов вакцинного полиовируса. После прекращения прививок и накопления прослойки неиммунных лиц возможно распространение этих вирусов в популяции человека. Выявление особенностей изменчивости полиовируса в организме со сниженным или отсутствующим иммунным ответом может позволить скорректировать стратегию ВОЗ по искоренению полиомиелитной инфекции.

В настоящей работе охарактеризованы закономерности фиксации мутаций в двух полиовирусных популяциях, представленных дикими полиовирусами, изолированными в ходе вспышек полиомиелита, и вакцинно-родственными вирусами, выделенными от больного иммунодефицитом.

Цели работы

В настоящей работе ставились следующие цели: 1) оценить скорость и закономерности фиксации мутаций в двух полиовирусных популяциях; 2) провести анализ замен на разных участках генома с целью детализации закономерностей фиксации мутаций; 3) охарактеризовать особенности изменчивости вакцинных штаммов, выделенных от больного первичным иммунодефицитом; 4) провести филогенетический анализ диких полиовирусов типа 1 с использованием протяженных нуклеотидных последовательностей.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гаврилин, Евгений Викторович

Выводы

1. В двух популяциях полиовирусов, представляющих собой а) эволюционную ветвь диких штаммов Т-геотипа, изолированных в ходе вспышек полиомиелита на территории бывшего СССР, и б) производные штамма Сэбина, выделенные от иммунодефицитного пациента, определены нуклеотидные последовательности, соответствующие вирусным белкам VP1, 2А, 2В и частично 2С. Для 9 вирусов также определены последовательности, кодирующие С-конец белка 3D.

2. Выявлен преимущественно линейный характер фиксации мутаций. На исследуемых участках генома синонимичные замены существенно преобладают над несинонимичными. Эти особенности фиксации мутаций говорят о ведущей роли нейтральных механизмов в эволюции полиовируса.

3. Несмотря на существенный вклад нейтральной эволюции, отмечены периоды неравномерного хода «молекулярных часов» и выявлена разная скорость фиксации синонимичных мутаций на разных участках генома. Эти отклонения могут свидетельствовать об адаптивном характере фиксации синонимичных мутаций.

4. Выявлена аномальная консервация редко используемых кодонов на участке VP1. Высказано предположение о роли этих кодонов в качестве «трансляционных пауз» при котрансляционном фолдинге вирусного полипротеина. Хотя консервация редких кодонов может влиять на скорость эволюции, это влияние слишком мало, чтобы объяснить разницу скоростей фиксации мутаций на разных участках РНК.

5. В связи с неравномерностью скоростей эволюции разных сегментов генома топология дендрограмм, отражающих родство вирусных штаммов, зависит от выбора участка РНК, используемого для филогенетического анализа.

6. Анализ протяженных нуклеотидных последовательностей диких штаммов полиовируса, выделенных на территории бывшего СССР в 1985-1995 гг, подтвердил ранее полученные данные об их эволюционных взаимоотношениях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаврилин, Евгений Викторович, Москва

1. Ворошилова МЕС. Иммунология, эпидемиология и профилактика полиомиелита и сходных с ним заболеваний. М., Медицина 1966

2. Крашенинников ИА, Комар АА, Аджубей ИА. Частоты использования кодонов в мРНК и кодирование доменной структуры белка. Докл Акад Наук СССР 1989;305:1006-12

3. Кутитова ОК, Липская ПО, Маслова СВ, Агол ВИ. Выделение рекомбинантов между вакцинными штаммами полиовируса от больных полиомиелитом. Молек. генетика, микробиология и вирусология 1989; 11:14-21

4. Adzhubei АА, Adzhubei IA, Krasheninnikov IA, Neidle S. Non-random usage of 'degenerate' codons is related to protein three-dimensional structure. FEBS Lett 1996; 399:78-82

5. Agol VI. The 5'-untranslated region of picornaviral genomes. Adv Virus Res 1991;40:103-80

6. Aldabe R, Barco A, Carrasco L. Membrane permeabilization by poliovirus proteins 2B and 2BC. J Biol Chem 1996; 271:23134-7

7. Andino R, Rieckhof GE, Baltimore D. A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5' end of poliovirus RNA. Cell 1990; 63:369-80

8. Andino R, Rieckhof GE, Achacoso PL, Baltimore D. Poliovirus RNA synthesis utilizes an RNP complex formed around the 5'-end of viral RNA. EMBO J 1993; 12:3587-98

9. Argos P, Kamer G, Nicklin MJ, Wimmer E Similarity in gene organization and homology between proteins of animal picornaviruses and a plant comovirus suggest common ancestry of these virus families. Nucleic Acids Res 1984; 12:7251-67

10. Arora R, Priano C, Jacobson AB, Mills DR. Cis-acting elements within an RNA coliphage genome: fold as you please, but fold you must!! J Mol Biol 1996; 258:433-46

11. Assaad F, Cockburn WC. The relation between acute persisting spinal paralysis and poliomyelitis vaccine result of a ten year enquiry. Bulletin of a World Health Organization. 1982; 60:231-42

12. Balanant J, Guillot S, Candrea A, Delpeyroux F, Crainic R. The natural genomic variability of poliovirus analyzed by a restriction fragment length polymorphism assay. Virology 1991; 184:645-54

13. Bellmunt A, May G, Zell R, Pring-Akerblom P, Verhagen W, Heim A. Evolution of poliovirus type 1 during 5.5 years of prolonged enteral replication in an immunodeficient patient Virology 1999; 265:178-84

14. Bijkerk H. Poliomyelitis epidemic in The Netherlands. Dev. Biol. Stand. 1978; 43:195-206

15. Bottiger M, Herrstrom E. Isolation of polioviruses from sewage and their characteristics: experience over two decades in Sweden. Scand J Infect Dis 1992; 24:151-5

16. Bouchard MJ, Lam DH, Racaniello VR. Determinants of attenuation and temperature sensitivity in the type 1 poliovirus Sabin vaccine. J Virol 1995; 69:4972-8

17. Cammack N, Phillips A Dunn G, Patel V, Minor PD. Intertypic genomic rearrangements of poliovirus strains in vaccinees. Virology 1988; 167:507-14

18. Cavalli-Sforza LL, Edwards AW. Phylogenetic analysis. Models and estimation procedures. Am J Hum Genet 1967; 19:233

19. Chao L. Fitness of RNA virus decreased by Muller's ratchet. Nature 1990; 348:454-5

20. Chao L. Evolution of sex and the molecular clock in RNA viruses. Gene 1997; 205:301-8

21. Cho MW, Teterina N, Egger D, Bienz K, Ehrenfeld E. Membrane rearrangement and vesicle induction by recombinant polio virus 2C and 2BC in human cells. Virology 1994; 202:129-45

22. Chumakov KM, Norwood LP, Parker ML, Dragunsky EM, Ran YX, Levenbook IS. RNA sequence variants in live poliovirus vaccine and their relation to neurovirulence. J Virol 1992; 66:966-70

23. Clarke DK, Duarte EA, Moya A, Elena SF, Domingo E, Holland J. Genetic bottlenecks and population passages cause profound fitness differences in RNA viruses. J Virol 1993; 67:222-8

24. De L, Yang CF, Da Silva E, Boshell J, Caceres P, Gomez JR, Pallansch M, Kew O. Genotype-specific RNA probes for direct identification of wild polioviruses by blot hybridization. J Clin Microbiol 1997; 35:2834-40

25. Doedens JR, Kirkegaard K. Inhibition of cellular protein secretion by poliovirus proteins 2B and ЗА. EMBO J 1995; 14:894-907

26. Domingo E, Holland J. RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol 1997; 51:151-78

27. Domingo E, Escarmis C, Sevilla N, Baranowski E. Population dynamics in the evolution of RNA viruses. Adv Exp Med Biol 1998; 440:721-7

28. Domingo E, Escarmis C, Menendez-Arias J, Holland JJ. Viral quasispecies and fitness variations. In E. Domingo, R. Webster, and J. J. Holland (ed.), Origin and Evolution of Viruses. Acad. Press, San Diego. 1999; 141-61

29. Drake JW, Holland JJ. Mutation rates among RNA viruses. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:13910-3

30. Drebot MA, Mulders MN, Campbell JJ, Kew OM, Fonseca K, Strong D, Lee S. Molecular detection of an importation of type 3 wild poliovirus into Canada from the Netherlands in 1993. Appl Env Microbiol 1997; 63:519-23

31. Duarte E, Clarke D, Moya A, Domingo E, Holland JJ. Rapid fitness losses in mammalian RNA virus clones due to Muller's ratchet. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 6015-60

32. Duarte E, Novella IS, Ledesma S, Clarke DK, Moya A, Elena SF, Domingo E, Holland JJ. Subclonal components of consensus fitness in an RNA virus clone. J Virol 1994; 68:4295-301

33. Dunn G, Begg NT, Cammack N, Minor P. Virus excretion and mutation by infants following primary vaccination with live oral poliovaccine from two sources. J Med Virol 1990; 32:92-5

34. Echeverri AC, Dasgupta A. Amino terminal regions of poliovirus 2C protein mediate membrane binding. Virology 1995; 208:540-53

35. Eck RV, Dayhoff MO. Atlas of Protein Sequence and Structure. Natl Biomed Res Found. Silver Spring MD 1966

36. Ehrenfeld E. Initiation of translation by picornavirus RNAs. In Translational Control Hershey JWB, Matthews MB, Sonenberg N, Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1996; 549-74

37. Eisenberg D, Schwarz E, Komaromy M, Wall R. Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot. J Mol Biol 1984; 179:125-42

38. Elena SF, Gonzalez-Candelas F, Moya A. Does the VP1 gene of foot-and-mouth disease virus behave as a molecular clock? J Mol Evol 1992; 35:223-9

39. Escarmis C, Davila M, Charpentier N, Bracho A, Moya A, Domingo E. Genetic lesions associated with Muller's ratchet in an RNA virus. J Mol Biol 1996; 264:255-67

40. Escarmis С, Davila M, Domingo E. Multiple molecular pathways for fitness recovery of an RNA virus debilitated by operation of Muller's ratchet. J Mol Biol 1999; 285:495-505

41. Evans DM, Dunn G, Minor PD, Schild GC, Cann AJ, Stanway G, Almond JW, Currey K, Maizel JV Jr. Increased neurovirulence associated with a single nucleotide change in a noncoding region of the Sabin type 3 poliovaccine genome. Nature 1985; 314: 548-50

42. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 1985; 39: 783-91

43. Felsenstein J. PHYLIP: Phylogeny Inference Package (Univ. of Washington, Seattle). Version3.52c. 1993

44. Fernandez-Cuartero B, Burgyan J, Aranda MA, Salanki K, Moriones E, Garcia-Arenal F. Increase in the relative fitness of a plant virus RNA associated with its recombinant nature. Virology 1994; 203:373-7

45. Fiore L, Pierangeli A, Lombardi F, Santoro R, Crainic R, Venuti A, Perez-Bercoff R. Antigenic and biochemical characterization of poliovirus type 2 isolated from two cases of paralytic disease. Intervirology 1987; 27:196-204

46. Friedrich F. Genomic modifications in Sabin vaccine strains isolated from vaccination-associated cases, healthy contacts and healthy vaccinees. Acta Virol 1996; 40:157-70

47. Furione M, Guillot S, Otelea D, Balanant J, Candrea A, Crainic R. PoUoviruses with natural recombinant genomes isolated from vaccine-associated paralytic poliomyelitis. Virology 1993; 196:199-208

48. Georgescu MM, Balanant J, Ozden S, Crainic R. Random selection: a model for poliovirus infection of the central nervous system. J Gen Virol 1997; 78:1819-28

49. Gmyl AP, Pilipenko EV, Maslova SV, Belov GA, Agol VI. Functional and Genetic Plasticities of the Poliovirus Genome: Quasi-Infectious

50. RNAs Modified in the 5'-Untranslated Region Yield a Variety of Pseudorevertants. J Virol 1993; 67:6309-16

51. Gojobori T, Moriyama EN, Kimura M. Molecular clock of viral evolution, and the neutral theory. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:10015-8

52. Goodfellow I, Chaudhry Y, Richardson A, Meredith J, Almond JW, Barclay W, Evans DJ Identification of a cis-acting replication element within the poliovirus coding region. J Virol 2000; 74:4590-600

53. Gorbalenya AE, Snijder EJ. Viral cysteine proteinases. Perspectives in Drug Discovery and Design, 1996; 6:63-86

54. Hahn CS, Lustig S, Strauss EG, Strauss JH. Western equine encephalitis virus is a recombinant virus. Proc Natl Acad Sci U S A 1988; 85:5997-6001

55. Hansen JL, Long AM, Schultz SC. Structure of the RNA-dependent RNA polymerase of poliovirus. Structure 1997; 5:1109-22

56. Hasegawa M, Kishino H, Yano K. Dating of the human-apesplitting by a molecular clock of mitochondrial DNA. J Mol Evol 1985; 22:160-74

57. Hogle JM, Chow M, Filman DJ. Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 A resolution. Science 1985; 229:1358-65

58. Holland JJ, De La Torre JC, Steinhauer DA. RNA Virus Populations as Quasispecies. Curr Top Micr Imm 1992; 176

59. Huovilainen A Mulders MN, Agboatwalla M, Poyry T, Stenvik M, Hovi T Genetic divergence of poliovirus strains isolated in the Karachi region of Pakistan. J Gen Virol 1995; 76:3079-88

60. Imazeki F, Omata M, Ohto M. Heterogeneity and evolution rates of delta virus RNA sequences. J Virol 1990; 64:5594-9

61. Ito T, Gorman O, Kawaoka Y, Bean W, Webster R. G. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the Ml and M2 proteins. J Virol 1991;65:5491-8

62. Jackson RJ. A comparative view of initiation site selection mechanisms. In Translational Control. Hershey JWB, Matthews MB, Sonenberg N. Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 1996; 71-112

63. Jacobson SJ, Konings DA Sarnow P. Biochemical and genetic evidence for a pseudoknot structure at the 3' terminus of the poliovirus RNA genome and its role in viral RNA amplification. J Virol 1993; 67:2961-71

64. Jaeger J A, Turner DH, Zuker M. Improved predictions of secondary structures for RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86:7706-10

65. Jang SK, Pestova TV, Hellen CU, Witherell GW, Wimmer E. Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme 1990; 44:292-309

66. Kawamura N, Kohara M, Abe S, Komatsu T, Tago K, Arita M, Nomoto A. Determinants in the 5' noncoding region of poliovirus Sabin 1 RNA that influence the attenuation phenotype. J Virol 1989; 63:1302-9

67. Kew OM, Nottay BK, Hatch MH, Nakano JH, Obijeski IF. Multiple genetic changes can occur in the oral poliovaccines upon replication in humans. J Gen Virol 1981; 56:337-47

68. Kew OM, Mulders MN, Lipskaya GYu, da Silva EE, Pallansch MA. Molecular epidemiology of polioviruses. Sem Virol 1995; 6:401-14

69. Kew OM, Sutter RW, Nottay BK, McDonough MJ, Prevots DR, Quick L, Pallansch MA. Prolonged repUcation of a type 1 vaccine-derived poliovirus in an immunodeficient patient. J Clin Microbiol 1998; 36:2893-9

70. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 1980; 16:111-20

71. Kimura M. The Neutral Theory of Molecular Evolution. Cambridge University Press, Cambridge. 1983

72. Kinnunen L, Huovilainen A, T Poyry, Hovi T. Rapid molecular evolution of wild type 3 poliovirus during infection in individual hosts. J Gen Virol 1990; 71:31724

73. Kinnunen L, Poyry T, Hovi T. Genetic diversity and rapid evolution of poliovirus in human hosts. Curr Top Microbiol Immunol 1992; 176:49-61

74. Kitamura N, Semler BL, Rothberg PG, Larsen GR, Adler CJ, Dorner AJ, Emini EA, Hanecak R, Lee JJ, van der Werf S, Anderson CW, Wimmer E. Primary structure, gene organization and polypeptide expression of poliovirus RNA. Nature 1981;291:547-53

75. Kolb VA, Makeyev EV, Spirin AS. Folding of firefly luciferase during translation in a cell-free system. EMBO J 1994; 13:3631-7

76. Kolb VA, Makeyev EV, Kommer A, Spirin AS. Cotranslational folding of proteins. Biochem Cell Biol 1995; 73 :1217-20

77. Rwok S, Shinsky JJ. Amplification PCR Technology, Principles and Applications for DNA. Ed. H.A. Erlich. New York 1989; 235-44

78. Lawson MA, Semler BL. Alternate poliovirus nonstructural protein processing cascades generated by primary sites of 3C proteinase cleavage. Virology 1992; 191:309-20

79. Li WH, Luo CC, Wu C. Molecular Evolutionary Genetics. Maclntyre RJ. Ed. Plenum N.Y.1985a

80. Li WH, Wu CI, Luo CC. A new method for estimating synonymous and nonsynonymous rates of nucleotide substitution considering the relative likelihood of nucleotide and codon changes. Mol Biol Evol 1985b; 2:150-74

81. Lipskaya GY, Muzychenko AR, Kutitova OK, Maslova SV, Equestre M, Drozdov SG, BercofFRP, Agol VI. Frequent isolation of intertypic poliovirus recombinants with serotype 2 specificity from vaccine-associated polio cases. J Med Virol 1991;35:290-6

82. Lobert PE, Escriou N, Ruelle J, Michiels T. A coding RNA sequence acts as a replication signal in cardioviruses. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:11560-5

83. Macadam AJ, Pollard SR, Ferguson G, Dunn G, Skuce R, Almond JW, Minor PD. The 5' noncoding region of the type 2 poliovirus vaccine strain contains determinants of attenuation and temperature sensitivity. Virology 1991; 181:451-8

84. Macadam AJ, Pollard SR, Ferguson G, Skuce R, Wood D, Almond JW, Minor PD. Genetic basis of attenuation of the Sabin type 2 vaccine strain of poliovirus in primates. Virology 1993; 192:18-26

85. Malcolm В A. The picornaviral 3C proteinases: cysteine nucleophiles in serine proteinase folds. Protein Sci 1995; 4:1439-45

86. Martin J, Dunn G, Hull R, Patel V, Minor P. Evolution of the Sabin strain of type 3 poliovirus in an immunodefficient patient during the entire 637-day period of virus excretion. J Virol 2000; 74:3001-10

87. Martin MJ, Nunez JI, Sobrino F, Dopazo J. A procedure for detecting selection in highly variable viral genomes: evidence of positive selection in antigenic regions of capsid protein VP1 of foot-and-mouth disease virus. J Virol Methods 1998; 74:215-21

88. Martinez MA, Pezo V, Marliere P, Wain-Hobson S. Exploring the functional robustness of an enzyme by in vitro evolution. EMBO J 1996; 15:1203-10

89. McGoldrick A, Macadam AJ, Dunn G, Rowe A, Burlison J, Minor PD, Meredith J, Evans DJ, Almond JW. Role of mutations G-480 and C-6203 in the attenuation phenotype of Sabin type 1 poliovirus. J Virol 1995; 69:7601-5

90. McKnight KL, Lemon SM. Capsid coding sequence is required for efficient replication of human rhinovirus 14 RNA. J Virol 1996; 70:1941-52

91. Meerovitch K, Pelletier J, Sonenberg N A cellular protein that binds to the 5'-noncoding region of poliovirus RNA: implications for internal translation initiation. Genes Dev 1989; 3:1026-34

92. Meerovitch K, Svitkin YV, Lee HS, Lejbkowicz F, Kenan DJ, Chan EK, Agol VI, Keene JD, Sonenberg N. La autoantigen enhances and corrects aberrant translation of poliovirus RNA in reticulocyte lysate. J Virol 1993;67:3798-807

93. Melnick JL, Rennick V. Infectivity titers of enterovirus as found in human stools. J Med Virol 1980; 5:205-20

94. Melnick JL. Enteroviruses: polioviruses, coxsackieviruses, echoviruses, and newer enteroviruses. In Field BN, Knipe DM, Howley PM. Eds. Fields Virology, 3rd Ed. Lippinkot-Raven, Philadelphia. 1996

95. Minor PD, John A, Ferguson M, Icenogle JP. Antigenic and molecular evolution of the vaccine strain of type 3 poliovirus during the period of excretion by a primary vaccinee. J Gen Virol 1986; 67:693-706

96. Minor PD, Dunn G. The effect of sequences in the 5' non-coding region on the replication of polioviruses in the human gut. J Gen Virol 1988; 69:1091-6

97. Minor PD The molecular biology of poliovaccines. J Gen Virol 1992; 73:3065-77

98. Miralles R, Gerrish PJ, Moya A, Elena SF. Clonal interference and the evolution of RNA viruses. Science 1999; 285:1745-7

99. Mirzayan C, Wimmer E. Genetic analysis of an NTP-binding motif in poliovirus polypeptide 2C. Virology 1992; 189:547-55

100. Mulders MN, Lipskaya GYu, van der Avoort HGAM, Koopmans MPG, Kew OM, van Loon AM. Molecular epidemiology of wild poliovirus type 1 in Europe, the Middle East and the Indian Subcontinent. J Infect Dis 1995; 171:1399-405

101. Murdin AD, Lu HH, Murray MG, Wimmer E. Poliovirus antigenic hybrids simultaneously expressing antigenic determinants from all three serotypes. J Gen Virol 1992; 73:607-11

102. Nathanson N, Martin JR. The epidemiology of poliomyelitis: enigmas, surrounding its appearance, epidemicity, and disappearance. Am J Epidemiol 1979;110:672-92

103. Nei M, Taj'ima F, Tateno Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data. J Mol Evol 1983; 19: 153-70

104. Nei M, Gojobori Т. Simple methods for estimating the numbers of synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutions. Mol Biol Evol 1986; 3:418-26

105. Nkowane BM, Wassilak SGF, Orenstein WA, Bart KJ, Schonberger LB, Hinman AR, Kew OM. Vaccine-associated paralytic poliomyelitis. J Am Med Assoc 1987; 257:1335-40

106. Nomoto A, Omata T, Toyoda H, Kuge S, Horie H, Kataoka Y, Genba Y, Nakano Y, Imura N. Complete nucleotide sequence of the attenuated poliovirus Sabin 1 strain genome. Proc Natl Acad Sci U S A 1982; 79:5793-7

107. Nottay BK, Kew OM, Hatch MH, Heyward JT, Obijeski JF. Molecular variation of type 1 vaccine-related and wild poliovirus during replication in humans. Virology 1981; 108:405-23

108. Novella IS, Duarte EA, Elena SF, Moya A, Domingo E, Holland J J. Exponential increases of RNA virus fitness during large population transmissions. Proc Natl Acad Sci USA 1995a; 92:5841-4

109. Novella IS, Elena SF, Moya A, Domingo E, Holland JJ. Size of genetic bottlenecks leading to virus fitness loss is determined by mean initial population fitness. J Virol 1995b; 69:2869-72

110. Novella IS, Quer J, Domingo E, Holland JJ. Exponential fitness gains of RNA virus populations are limited by bottleneck effects. J Virol 1999; 73:1668-71

111. Omata T, Kohara M, Kuge S, Komatsu T, Abe S, Semler BL, Kameda A, Itoh H, Arita M, Wimmer E, Nomoto A. Genetic analysis of the attenuation phenotype of poliovirus type 1. J Virol 1986; 58:348-58

112. Oresic M, Shalloway D. Specific correlations between relative synonymous codon usage and protein secondary structure. J Mol Biol 1998; 281:31-48

113. Page GS, Mosser AG, Hogle JM, Filman DJ, Rueckert RR, Chow M. Three-dimensional structure of poliovirus serotype 1 neutralizing determinants. J Virol 1988; 62:1781-94

114. Palmenberg AC, Sgro JY. Topological organization of picornaviral genomes: stastitical prediction of RNA structural signals. Semin Virol 1997; 8:231-41

115. Pilipenko EV, Gmyl AP, Maslova SV, Svitkin YuV, Sinyakov AN, AgolVI. Prokaryotic-like Cis elements in the Cap-independent internal initiation of translation on picornavirus RNA. Cell 1992; 68: 119-31

116. Pilipenko EV, Gmyl AP, Maslova SV, Belov GA, Sinyakov AN, Huang M, Brown TDK, Agol VI. Starting window, a distinct element in the Cap-independent internal initiation of translation on picornaviral RNA. J Mol Biol 1994; 241:398414

117. Pollard SR, Dunn G, Cammack N, Minor PD, Almond JW. Nucleotide sequence of a neurovirulent variant of the type 2 oral poliovirus vaccine. J Virol 1989; 63:4949-51

118. Proceedings of a NATO Advanced Study Institute Summer School on the Molecular Basis of Viral Replication. Ed. R. Perez BercofF, Plenum Press, New York, 1987.

119. Racaniello VR. Early events in poliovirus infection: virus-receptor interactions. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93:11378-81

120. Ren RB, Moss EG, Racaniello VR Identification of two determinants that attenuate vaccine-related type 2 poliovirus. J Virol 1991; 65:1377-82

121. Rico-Hesse R, Pallansch MA Nottay BK, Kew OM. Geographic distribution of wild poliovirus type 1 genotypes. Virology 1987; 160:311-22

122. Rueckert RR, Wimmer E. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J Virol 1984; 50:957-9

123. Rzhetsky A, Nei M. Theoretical foundation of the minimum evolution method of phylogenetic inference. Mol Biol Evol 1993; 10:1073-95

124. Rzhetsky A, Nei M. METREE: Program Package for Inferring and Testing Minimum Evolution Trees. Inst. Mol. Evol. Genet., Pensylvania State Univ., PA. Version 1.4.1994

125. Sabin AB, Boulger LR. History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains. J Biol Stand 1973; 1: 115-8

126. Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 1987; 4:406-25

127. Sala M, Wain-Hobson S. Drift and conservatism in RNA virus evolution: Are they adapting or merely changing? In Domingo E, Webster R, Holland JJ. Ed. Origin and Evolution of Viruses. Acad. Press, San Diego. 1999; 115-40

128. Sharp PM, Matassi G. Codon usage and genome evolution. Curr Opin Genet Dev 1994; 4:851-60

129. Simmonds P, Smith DB. Structural constraints on RNA virus evolution. J Virol 1999; 73:5787-94

130. Steinhauer DA Holland JJ. Rapid evolution of RNA viruses. Annu Rev Microbiol 1987; 41:409-33

131. Strimmer K, von Haeseler A. Quartet puzzling: a quartet maximum likelihood method for reconstructing tree topologies. Mol Biol Evol 1996; 13:964-9

132. Sutter RW, Prevots DR, Cochi SL. Poliovirus vaccines. Progress toward global poliomyelitis eradication and changing routine immunization recommendations in the United States. Pediatr Clin North Am 2000; 47:287-308

133. Svitkin YV, Gradi A, Imataka H, Morino S, Sonenberg N. Eukaryotic initiation factor 4GII (eIF4GII), but not eIF4GI, cleavage correlates with inhibition of host cell protein synthesis after human rhinovirus infection. J Virol 1999; 73:3467-72

134. Takeda N, Tanimura M, Miyamura K. Molecular evolution of the major capsid protein VP1 of enterovirus 70. J Virol 1994; 68:854-62

135. Tamura К, Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol Biol Evol 1993; 10:512-26

136. Tardy-Panit M, Blondel B, Martin A, Tekaia F, Horaud F, Delpeyroux F. A mutation in the RNA polymerase of poliovirus type 1 contributes to attenuation in mice. J Virol 1993; 67:4630-8

137. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl Acids Res 1994; 22:4673-80

138. Towner JS, Ho TV, Semler BL. Determinants of membrane association for poliovirus protein ЗАВ. J Biol Chem 1996; 271:26810-8

139. Villaverde A, Martinez MA, Sobrino F, Dopazo J, Moya A, Domingo E. Fixation of mutations at the VP1 gene of foot-and-mouth disease virus. Can quasispecies define a transient molecular clock? Gene 1991; 103:147-53

140. Walter BL, Nguyen JH, Ehrenfeld E, Semler BL. Differential utilization of poly(rC) binding protein 2 in translation directed by picomavirus IRES elements. RNA 1999; 5:1570-85

141. Ward CD, Stokes MA, Flanegan JB. Direct measurement of the poliovirus RNA polymerase error frequency in vitro. J Virol 1988; 62:558-62

142. Ward CD, Flanegan JB. Determination of the poliovirus RNA polymerase error frequency at eight sites in the viral genome. J Virol 1992; 66:3784-93

143. Weeks-Levy С, Tatem JM, DiMichele SJ, Waterfield W, Georgiu AF, Mento SJ. Identification and characterization of a new base substitution in the vaccine strain of Sabin 3 poliovirus. Virology 1991; 185:934-7

144. Westrop GD, Wareham KA, Evans DM, Dunn G, Minor PD, Magrath DI, Taffs F, Marsden S, Skinner MA, Schild GC. Genetic basis of attenuation of the Sabin type 3 oral poliovirus vaccine. J Virol 1989; 63:1338-44

145. White FM, Lacy В A, Constance PDA. An outbreak of poliovirus infection in Alberta-1978. Can J Public Hlth 1981; 72:239-44

146. Wimmer E, Hellen CU, Cao X. Genetics of poliovirus. Annu Rev Genet 1993; 27:353-436

147. World Health Organization. Manual for the virologic investigation of poliomyelitis. WHO/EPI/GEN/97.1. World Health Organization, Geneva, Switzerland. 1997

148. Wright S. The shifting balance theory and macro evolution. Annu Rev Genet 1982; 16:1-19

149. Yang CF, De L, Holloway BP, Pallansch MA, Kew OM. Detection and identification of vaccine-related polioviruses by the polymerase chain reaction. Virus Res 1991;20:159-79

150. Yu SF, Lloyd RE Characterization of the roles of conserved cysteine and histidine residues in poliovirus 2A protease. Virology 1992; 186:725-35

151. Zhang G, Haydon DT, Knowles NJ, McCauley JW. . Molecular evolution of swine vesicular disease virus. J Gen Virol 1999; 80:639-51

152. Zheng DP, Zhang LB, Fang ZY, Yang CF, Mulders M, Pallansch MA, Kew OM. Distribution of wild type 1 poliovirus genotypes in China. J Infect Dis 1993; 168:1361-7

153. Zhou J, Liu WJ, Peng SW, Sun XY, Frazer I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. J Virol 1999; 73:4972-82

154. Zuckerkandl E, Pauling L. Evolutionaty divergence and convergence in proteins. In Evolving Genes and Proteins, Bryson V, Vogel HJ. Eds. New York, Acad. Press 1965; 97-166

155. Zuker M. Prediction of RNA secondary structure by energy minimization. Methods Mol Biol 1994; 25: 267-94

156. Zullo A, Romiti A, Rinaldi V, Vecchione A, Tomao S, Aiuti F, Frati L, Luzi G. Gastric pathology in patients with common variable immunodeficiency. Gut 1999; 45:77-81