Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нерепликативная гомологичная рекомбинация между фрагментами РНК полиовируса

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Нерепликативная гомологичная рекомбинация между фрагментами РНК полиовируса"

на правах рукописи

Коршенко Сергей Анатольевич

НЕРЕПЛИКАТИВНАЯ ГОМОЛОГИЧНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ МЕЖДУ ФРАГМЕНТАМИ РНК ПОЛИОВИРУСА

03.00.02 - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2003

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН и РАМН Агол Вадим Израилевич Кандидат биологических наук Гмыль Анатолий Петрович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич Кандидат физико-математических наук Макеев Всеволод Юрьевич

Ведущая организация:

Государственное Учреждение Научно-исследовательский Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится 18 декабря 2003 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К212.156.03 при Московском физико-техническом институте по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института.

Автореферат разослан «_» ноября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

Брагии В.Е.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

Под рекомбинацией между молекулами РНК понимают возникновение новой дочерней молекулы РНК ич двух или более родительских молекул РНК Впервые рекомбинацию между молекулами РНК наблюдали у полиовируса Hirst (1962) и Ledinko (1963). С тех пор количество работ, посвященных РНК-рекомбинации, растет лавинообразно. На сегодняшний день известно, что рекомбинация между молекулами РНК - широко распространенное явление, присущее многим РНК-содержащим вирусам животных, растений и бактерий (см. обзоры Lai, 1992; Agol, 1997).

Рекомбинация между молекулами РНК может быть объяснена с помощью репликативной модели «смена матрицы», которая постулирует, что незаконченная рождающаяся молекула РНК оставляет матрицу и присоединяется к другой матрице, где происходит возобновление синтеза (Agol, 1997). До недавнего времени репликативная модель была общепринятой, и с ее помощью объясняли большинство полученных рекомбинантных молекул. Однако в последнее время появились первые указания на существование нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК (Chetverin et al., 1997; Gmyl et al., 1999). Согласно нерепликативной модели рекомбинация происходит не в процессе синтеза новой цепи, а в результате разрыва и воссоединения предварительно синтезированных молекул РНК.

Поскольку представленные свидетельства в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК не являются полностью неуязвимыми, получение неоспоримых доказательств возможности молекул РНК нерепликативно рекомбинировать между собой является важной задачей. Данная работа посвящена исследованию нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК вируса полиомиели га.

Первое свидетельство в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК было получено А. Б. Четвериным с соавторами в бесклеточной системе репликации фага (СЬе^епп е! а1., 1997). В системе использовались <ЗР репликаза, гОТР и неспособные к экспоненциальной репликации перекрывающиеся

1.2. Цель и задачи исследования

фрагменты одной из сателлитных РНК. Способные к репликации молекулы РНК появлялись в результате негомологичной рекомбинации, которая зависела от присутствия З'-ОН группы у 5'-фрагмента. На основании полученных результатов авторы предположили, что рекомбинация идет по нерепликативному механизму, напоминающему вторую стадию вырезания самосплайсирующихся интронов. Второе свидетельство в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК было получено в нашей лаборатории в системе in vivo вируса полиомиелита (Gmyl et al., 1999). В системе использовались неспособные к репликации и трансляции перекрывающиеся фрагменты вирусной РНК. При совместной трансфекции восприимчивой к полиовирусу культуры клеток такими фрагментами образовывалось жизнеспособное вирусное потомство. Было показано, что вирусные геномы являются рекомбинантами между 5'- и З'-фрагментами. Часть рекомбинантов включала целый 5'-фрагмент. Такие рекомбинанты образовывались только в том случае, если 5'-фрагмент содержал З'-концевой фосфат. На основании полученных результатов и в связи с тем, что образование вирусной РНК-полимеразы до акта рекомбинации было блокировано, авторы сделали вывод, что рекомбинация идет по нерепликативному механизму. Однако, принимая во внимание, что в первом случае рекомбинация, видимо, зависит от присутствия вирусной РНК-полимеразы, а во втором - этот фермент мог образоваться (хотя и маловероятно) в результате трансляции одного из фрагментов, полностью исключит ь возможность образования рекомбинантов репликативным путем было нельзя. Поэтому мы поставили перед собой цель неоспоримо доказать, что рекомбинация между молекулами РНК полиовируса может происходить без участия РНК-полимеразы, и, если это будет выполнено, то определить необходимые условия этого процесса. В частности, были поставлены и решались следующие задачи: (1) определение возможной роли вторичной структуры в образовании рекомбинантных молекул РНК; (2) определение необходимых условий для эффективного лигирования молекул РНК в зависимости от химической структуры концевых нуклеотидов.

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе выполнения настоящей работы были сконструированы четыре пары неинфекционных 5'- и З'-фрагментов РНК полиовируса. Любая пара фрагментов представляла собой взаимодополняющие части вирусного генома, разорванного в

участке, кодирующем вирусную РНК-полимеразу. При этом фрагментам трех пар не хватало только одной фосфодиэфирной связи для образования целого генома, а фрагменты четвертой пары содержали перекрывающиеся гомологичные последовательности. Было показано, что при совместной трансфекции восприимчивой к полиовирусу культуры клеток неинфекционными 5'- и 3'-фрагментами полиовирусиой РНК образовывалось жизнеспособное вирусное потомство, которое было представлено рекомбинантами между этими фрагментами. Поскольку образование вирусной РНК-полимеразы до акта рекомбинации было невозможно, полученные данные неоспоримо свидетельствуют в пользу того, что рекомбинация между молекулами РНК полиовируса может идти по нерепликативному пути. Впервые было продемонстрировано существование гомологичной нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса. Было показано, что 5'- и 3'-фрагменты могут объединяться путем (1) лигирования конец-в-конец, (2 и 3) взаимодействия между 3'- или 5'-концевыми нуклеотидами одной молекулы и внутренним нуклеотидом другой молекулы и (4) взаимодействия между внутренними нуклеотидами двух молекул. Вставка целого 5'- или З'-фрагмента в рекомбинантную РНК активировалась присутствием З'-фосфата и 5'-ОН группы, соответственно.

Существование нерепликативной рекомбинации РНК предоставляет дополнительную возможность для объяснения эволюции вирусных и, возможно, клеточных геномов.

1.4. Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликована одна статья. Материалы работы были доложены на ХЫ-ой и ХШ-ой научных конференциях «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» в Московском физико-техническом институте (Москва, 1998, 1999), на научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», посвященной 90-летию со дня рождения М.П. Чумакова (Москва, 1999), на Х1-ой ХИ-ой международных конференциях «Молекулярная биология пикорнавирусов» (Италия, 2000; США, 2002), на восьмом международном съезде РНК-сообщества (Австрия, 2003), на международном семинаре по программе ШТАБ «РНК-геномы: структура и функции» (Россия, 2003) и на семинарах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова.

1.5. Структура диссертации

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из традиционных разделов. Диссертация содержит 21 рисунок и 2 таблицы. Список литературы включает 123 источника.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Чтобы исключить возможность появления РНК-полимеразы до того, как произойдет рекомбинация, было решено разорвать геном вируса полиомиелита типа 1 (МаЬопеу) в участке, кодирующем РНК-полимеразу, и на основе полученных частей вирусного генома сконструировать различные пары взаимодополняющих партнеров для рекомбинации (рис. 1). Следовательно, образование полноразмерного вирусного генома было возможно только в результате разрывов и воссоединения фрагментов РНК. О существовании нерепликативной рекомбинации РНК свидетельствовало появление жизнеспособных вирусов после ко-трансфекции восприимчивых к полиовирусу клеток различными парами фрагментов геномной РНК. Для образования жизнеспособного вирусного генома была необходима точная (гомологичная) рекомбинация между фрагментами РНК. Требование точности обусловлено необходимостью сохранения рамки считывания РНК-полимеразы.

5'НТО_З'НТО

5'-!—|2В1 "^¡е [ЗА!, ¡;ЗС| ЗР !-!- ААА

^ Разрыв

5'НТО

у-Цщ^^МИШ» I 3,нто

5'-фрагмент УРй I И" ААА

З'-фрагмент

Рис.1. Схема образования взаимодополняющих фрагментов для рекомбинации. Вирусная РНК состоит из 5'НТО, открытой рамки считывания, З'НТО и поли(А). Белым цветом выделен участок генома, кодирующий вирусную РНК-полимеразу (ЗО).

2.1. Лигирование фрагментов РНК полиовируса

Механистически нерепликативную рекомбинацию РНК можно представлять как лигирование фрагментов РНК, образующихся после стадии расщепления. Поэтому вначале было решено изучить возможность образования целого вирусного генома путем лигирования фрагментов его РНК, точно дополняющих друг друга. Для решения этой задачи было создано три пары 5'- и 3'-фрагментов, отличающихся местом разрыва в последовательности РНК-полимеразы - Hrpl, Нгр2 и Sup. При этом места разрывов были внесены в участок, лежащий ближе к N-концу от активного центра вирусной РНК-полимеразы. Это было сделано для того, чтобы предотвратить образование сколько-нибудь протяженного фрагмента РНК-полимеразы в результате трансляции 5'-фрагмента (5'-фрагмент мог быть транслирован благодаря наличию у него необходимых cis-дейетвующих элементов).

Ранее полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что лигирование 5'- и З'-фрагментов может зависеть от структуры их концевых нуклеотидов (Gmyl et al., 1999). На основании этого в большинстве случаев фрагменты были приготовлены в одной из двух форм (фосфорилированной либо нефосфорилированной) - 5'-фрагмент содержал З'-концевой фосфат (ЗР) или гидроксил (ЗОН), а З'-фрагмент нес 5'-гидроксил (50Н) или 5'-трифосфат (5РРР). Было высказано также предположение, что возникновению рекомбинантов, включающих целиком 5'-фрагмент, могло способствовать образование шпилечноподобных гетеродуплексов между фрагментами в районе места перекреста (рис. 2). Благодаря внутримолекулярной поддерживающей

5'-фрагмент 5'-фрагмент

5' - AAOTGGA UGGCC-AUCCGGUGAAAGUG AG 5' - AAUUG-GA UGGCCAUCCGGUGAAAGu

3' -UOAGUCU-ACCGG^AGH gpODUCAC^ З'-CUGGU UUcGUCG0g^GCCACUAGAG

З'-фрагмент J] З'-фрагмент g

5'-фрагмент 5'-фрагмент

5' -AAUUGGAUUGGCC-AUCCG-GUGAAAGU<5A 5' -GAUUGGCCAUCCGGU-GAAAGUGAG

З'-UUAGUCU-ACCGG OAGGO 0ACUDUCUaG 3' -UU„GUCGGU— ¿{^[¿|uinijCAC (jA

З'-фрагмент 0 З'-фрагмент £

S'"C0A 5' -U

Рис. 2. Гипотетическая модель, объясняющая вставку полноразмерного 5'-фрагмента в рекомбинантные геномы (Стту1 е1 а1., 1999). Нуклеотиды, между которыми образуется фосфодиэфирная связь, обведены рамками.

последовательности такие гетеродуплексы (в случае их образования) приводили бы в соседство взаимодействующие нуклеотиды двух фрагментов, чго могло способствовать их дальнейшему лигированию. С целью определения возможной роли этого фактора в образовании рекомбинаптов пары фрагментов были наделены разными потенциалами для образования такого рода гетеродуплексов. Нгр!

Фрагменты Нгр1 имели потенциал для образования стабильного гетеродуплекса, который сводил вплотную лигируемые нуклеотиды внутри спирального элемента (рис. 3). Для повышения вероятности образования межфрагментного гетеродуплекса было увеличено число нуклеотидов, способных образовывать комплементарные пары внутри него. Это было достигнуто при помощи синонимических мутаций, которые служили также генетическими маркерами.

При ко-траисфекции 5'-фрагментом (ЗР) Нгр1 и З'-фрагментом (50Н) Нгр1 было получено жизнеспособное вирусное потомство. Вирусные бляшки появлялись на 2-4 день после трансфекции. Выход полученных вирусов варьировал в различных экспериментах от 100 до 200 вирусных бляшек на 1 мкг каждого из фрагментов (табл. 1).

Нгр2

Место перекреста фрагментов Нгр2 располагалось на 21 нт ближе к 5'-концу от места перекреста Нгр1. Фрагменты имели потенциал для формирования стабильного гетеродуплекса, в котором реагирующие нуклеотиды были расположены на расстоянии 1 нт, вследствие чего спиральный элемент приобретал гибкий шарнир (рис. 3). Такой гетеродуплекс не сближал реагирующие нуклеотиды так, как в случае Нгр1. С целью увеличения вероятности образования гетеродуплекса в тела фрагментов были введены маркерные нуклеотидные замены, которые увеличивали число комплементарных пар внутри него. Изначально 5'-фрагменту Нгр2 не доставало одного нуклеотида для образования точного 3'-конца. Этот нуклеотид добавлялся Т4 РНК-лигазой перед трансфекцией. Это было сделано для того, чтобы определить зависимость эффективности лигирования фрагментов от природы взаимодействующих нуклеотидов и от того, в каком состоянии (спаренном или неспаренном) находится З'-концевой нуклеотид 5'-фрагмента в гетеродуплексе. В случае если этим нуклеотидом будет аденозин - реализуется спаренное состояние (Нгр2А), если же цитидин - неспаренное (Нгр2С).

Hrpl 5'-фрагмент

5'. AACCxAJA^UG Ъоии C йЕ^ ^l^CCCSfe^EOG^A A С • • <• ■ ii tiii it • пин mi ii A

3' ...AAACGAGGOtJUuGUIpiGAccPA Q С (JJGGGE&gEtG^p G

З'-фрагмент eerAsie

Hrp2 S'-фрагмент AUgC

S'...CUCAGUGGCAAUGAGAAUGGCIS,UlC)3GGAABt:uSl!U "g i i iiii i ii мим iiiiii пи С

з '...GuGACGE)cuuGGq;AEnAEpG ^оССсЯ^Шл,;. yU

З'-фрагмент cent t

6596 g595

Sup

С О A 5'.. AAAGAUGGUG UUGAGAAAAUCGGAU CGG

iiiiiiii ••••! G

3' ...CCAAAUCCAOCAGCUA ^UGj^Ggt A

З'-фрагмент с it

A 6772

UC

AG*-6773

Рис. 3. Гипотетические гетеродуплексы между 5'- и З'-фрагментами Hrpl, Нгр2 и Sup. Нуклеотиды, участвующие в лигировании, обозначены стрелками. Сконструированные молчащие мутации обведены рамками. З'-концевой нуклеотид (N) 5'-фрагмента Нгр2 соответствует нуклеотиду, А или С, лигированному к первоначальному транскрипту. Числами указаны координаты нуклеотидов. Фрагменты Sup не могут образовать стабильный гетеродуплекс, хотя некоторый потенциал для спаривания они имеют.

При ко-трансфекции 5'-фрагментом (ЗР) Нгр2 и З'-фрагментом (50Н) Нгр2 было получено жизнеспособное вирусное потомство. Вирусные бляшки появлялись на 2-4 день после трансфекции. Выход полученных вирусов был сравним с выходом, наблюдаемым при ко-трансфекции парой фрагментов Hrpl, несмотря на отсутствие принуждения к тесной близости реагирующих нуклеотидов и независимо от того, какими остатками (А или С) был представлен З'-концевой нуклеотид 5'-фрагмента (табл. 1).

Sue

Место перекреста Sup располагалось на ~150 нт ближе к З'-концу от места перекреста Hrpl. При конструировании фрагментов Sup не было предпринято особых мер для того, чтобы фрагменты могли образовать стабильный гетеродуплекс, который сводил бы в тесной близости их концевые нуклеотиды. В то же время, некоторый потенциал для спаривания эти фрагменты имели (рис. 3). Таким образом, из всех трех пар фрагаентов фрагменты Sup обладали наибольшей свободой в отношении взаимной ориентации их концевых нуклеотидов. Для подтверждения рекомбинантной природы полученных вирусов в тела 5'- и З'-фрагментов были введены маркерные мутации.

При ко-трансфекции 5'-фрагментом (ЗР) Sup и З'-фрагментом (50Н) Sup также было получено жизнеспособное вирусное потомство. Вирусные бляшки появлялись на 2-4 день после трансфекции. Несмотря на отсутствие потенциала для образования стабильного гетеродуплекса, выход полученных вирусов был сравним с выходом, наблюдаемым при ко-трансфекции парами фрагментов Hrpl и Нгр2 (табл. 1).

Таблица 1. Эффективность образования жизнеспособных вирусных клонов в зависимости от структуры концевых нуклеотидов лигируемых фрагментов

Эксперимент Формы 5'- Формы З'-фрагмента

№ фрагмента - 5РРРа 50На

Hrpl, ЗР6 0,3±0,5 15б±27

1 Sup, ЗР® 0 114±30

Sup, ЗР° нд 177±33

2 Sup, ЗОН" нд 8,3±3,6

Нгр2А, ЗРГ 0 66±14

3 Hrp2A,>P* 0 83±14

Нгр2С, ЗРГ нд 110±45

4 Нгр2С, >РД нд 85±32

аСреднее количество бляшек на флакон ± стандартное отклонение. Данные

приведены на 3 день после трансфекции. нд - не делалось.

6ЗР формы 5'-фрагментов Hrpl и Sup были приготовлены в реакции окисления/р-элиминирования.

"ЗОН форма 5'-фрагмента Sup была получена при обработке Р формы фосфатазой.

ГЗР формы 5'-фрагмента Нгр2 были приготовлены в реакции лигирования с рАр (Нгр2А) или рСр (Нгр2С).

Д>Р формы 5'-фрагмента Нгр2 были получены при обработке ЗР форм циклазой 3'-концевого фосфата РНК.

Использование для трансфекции иных комбинаций фрагментов Sup, нежели (ЗР) и (50Н), привело к значительному понижению (или отсутствию) выхода жизнеспособных вирусов (табл. 1). Подобные результаты были получены и для случаев трансфекции фрагментами Hrpl и Нгр2 (табл. 1). При ко-трансфекции Р формы 5'-фрагмента Sup не только с трифосфорилированной формой (5РРР) З'-фрагмента Sup. но и с его дифосфорилированной (5РР) и монофосфорилированной (5Р) формами также не происходило эффективного образования жизнеспособного вирусного потомства.

Рекомбинантная природа РНК полученных вирусов была продемонстрирована одновременным присутствием последовательностей, происходящих от 5'- и 3'-фрагментов: все молчащие мутации, принадлежащие этим фрагментам, были сохранены у каждого из вирусных геномов (рис. 4). Места перекреста были точны и совпадали с предполагаемым для каждой пары фрагментов.

Эффективное лигирование взаимодополняющих фрагментов вирусного генома наводит на мысль, что концевые нуклеотиды двух фрагментов могут находить друг друга с относительно высокой вероятностью, по крайней мере, при условиях, когда клетки трансфицируются большим количеством РНК. Потенциал для формирования гетеродуплекса, в котором дотирующиеся нуклеотиды находились бы в тесной близости, по-видимому, не играет в образовании рекомбинантов решающей роли.

Полученные результаты демонстрируют возможность лигирования фрагментов полиовирусной РНК в трансфицированной клетке при условии наличия у 5'-фрагмента З'-концевого фосфата, а у З'-фрагмента 5'-концевого гидроксила. Однако такие молекулы РНК вряд ли могут рассматриваться в качестве хороших субстратов для РНК-лигазы. Логично было предположить, что в клетке, возможно, происходит активация одного из фрагментов. Так как в РНК-лигазных реакциях приемлемым партнером для 5'-ОН группы является З'-концевой 2',3'-циклофосфат (Abelson et al., 1998; Reid and Lazinski, 2000; Salgia et al., 2003), был проверен эффект циклизации З'-концевого нуклеотида 5'-фрагмента Нгр2 (форма >Р) на эффективность его лигирования с З'-фрагментом Hrp2 (50Н). Циклизация достигалась при обработке 5'-фрагмента циклазой З'-концевого фосфата РНК (Filipowicz et al., 1983, 1985, 1998; Genschik et al., 1997; Billy et al., 1999). При ко-трансфекции 5'-фрагментом (>P) и З'-фрагментом (50Н) было получено жизнеспособное вирусное потомство (табл 1) Частота рекомбинации была сравнима с частотой рекомбинации для случая ко-

Рис. 4. Лигирование фрагментов вирусной РНК. Примеры последовательностей в местах перекреста продуктов дотирования для различных пар фрагментов РНК. Для 5'-фрагмента Нгр2 приведены последовательности с 3'-концевыми нуклеотидами А (Нгр2А) и С (Нгр2С). 3'-и 5'-концевые последовательности двух фрагментов приведены слева и справа от каждого из гелей, соответственно. Молчащие мутации, выполняющие роль генетических маркеров 5'- и З'-фрагментов, показаны черными и белыми треугольниками, соотвегственно. Нуклеотиды, произошедшие из З'-концевых нуклеотидов 5'-фрагментов Нгр2А и Нгр2С, указаны звездочками.

трансфекции 5'-фрагментом (ЗР) и З'-фрагментом (50Н). Таким образом, эта замена не привела к активации реакции лигирования.

Для объяснения полученных результатов можно предложить две гипотезы. Возможно, что циклизация 3'-концевого фосфата не является необходимой стадией в

реакции лигирования З'-фосфата и 5'-гидроксила. Вторая гипотеза (более вероятная) предполагает, что для лигирования этих групп циклизация З'-фосфата необходима, однако эта стадия не является лимитирующей в реакции лигирования.

2.2. Рекомбинация между фрагментов РНК полиовируса, имеющими область перекрывания

В выше указанных случаях была изучена возможность лигирования двух взаимодополняющих фрагментов РНК полиовируса. Существование частиц вирусного генома, точно дополняющих друг друга, возможно, но маловероятно. Чтобы максимально приблизить условия эксперимента к природным и, фактически, изучить истинную рекомбинацию РНК, а не ее лигирование, мы решили разорвать участок вирусной последовательности, кодирующий РНК-полимеразу, таким образом, чтобы образовались взаимодополняющие фрагменты, имеющие область перекрывания. Четвертую пару фрагментов OvI было решено сконструировать на основе взаимодополняющих фрагментов из предыдущих пар. Таким образом, пара Ovl состояла из 5'-фрагмента Sup и З'-фрагмента Нгр2 с 6 дополнительными маркерными мутациями (рис 5). Если 5'-фрагмент содержал З'-концевой фосфат (ЗР), фрагменты имели область перекрывания длиной 177 нт, а в случае если ¿'-фрагмент нес на 3'-конце гидроксил (ЗОН), фрагменты имели область перекрывания длиной 178 нт.

Ovl

5'-фрагмент 6596

6772 З'-фрагмент

Рис. 5. Структура фрагментов Ovl. Область перекрывания двух фрагментов обозначена серым прямоугольником. Введенные молчащие мутации обведены рамками. Координаты нуклеотидов указаны числами. 5'- и 3'- фрагменты Ovl соответствуют 5'-фрагменту Sup и З'-фрагменту Нгр2 (с дополнительными молчащими мутациями), соответственно. Фрагменты Ovl не могут образовать стабильного гетеродуплекса.

Разница в размере перекрывающей последовательности объясняется тем, что образование 5'-фрагмента (ЗР), происходило в результате реакции окисления/р-элиминирования З'-концевого нуклеотида 5'-фрагмента (ЗОН). Это приводило к отщеплению З'-концевого нуклеотида. Так как при конструировании этих фрагментов не было предпринято специальных попыток для облегчения формирования гетеродуплекса и не было введено других структурных ограничений, фрагменты могут рассматриваться как возникшие в результате случайного расщепления вирусного генома. При ко-трансфекции такими фрагментами образовывалось жизнеспособное вирусное потомство (табл. 2).

Рекомбинантная природа РНК полученных вирусов была продемонстрирована одновременным присутствием последовательностей, происходящих от 5'- и 3'-фрагментов (рис. 6). Большая часть рекомбинантов представляла собой точные (гомологичные) рекомбинанты. Небольшая часть рекомбинантов имела неточные места перекреста (см. ниже).

При рекомбинации между перекрывающимися фрагментами были обнаружены три типа ковалентного объединения фрагментов РНК. Первые два типа - это ин гервенция либо З'-концевого нуклеотида 5'-фрагмента, либо 5'-концевого

Таблица 2. Локализация мест перекреста в зависимости от структуры концевых иуклеотидов Оу1

Формы Количество секвенированных

_Количество рекомбинантов

5'- 3'- бляшек" с целым с целым с внутренним

фрагмента фрагмента всего 5'- фрагментом 3'- фрагментом местом перекреста

ЗОН0 5РРР 3,0±0,6 14 0 0 14

ЗОН6 50НВ 8,8±2,7 10 0 8 2

ЗРГ 5РРР 4,2±1,0 10 7 0 3

ЗРГ 50Н" 9,0±2,0 10 5 3 2

"Среднее количество бляшек/флакон на 3 день после трансфекции ± стандартные отклонения.

бЗОН форма соответствовала первоначальному транскрипту.

В50Н форма была получена при обработке 5РРР формы фосфатазой.

ГЗР форма была получена в реакции окисления/р-элиминирования ЗОН формы.

пуклеотида 3'-фрагмента во внутреннее положение их партнеров. Третий тип - это перекрест между внутренними положениями перекрывающихся последовательностей.

Расположение мест перекреста зависело от того, какие формы фрагментов использовались для трансфекции (табл. 2). Большинство рекомбинантов между5'-фрапиентом (ЗР) и З'-фрагментом (5РРР), включали целый 5'-фрагмент. Напротив, целый 3'-фрагмент был обнаружен у большинства рекомбинантов, образованных между 5'-фрагментом (ЗОН) и З'-фрагментом (50Н). Таким образом, концевые нуклеотиды 5'-фрагмента, содержащего З'-концевой фосфат, и З'-фрагмента, несущего 5'-концевой гидроксил, демонстрируют способность взаимодействовать с соответствующими нуклеотидами, находящимися внутри тел дополняющих фрагментов.

Когда для трансфекции были использованы 5'-фрагмент (ЗОН) и З'-фрагмент (5РРР), у всех рекомбинантов места перекреста располагались внутри области перекрывания, то есть они были внутренними (табл. 2).

В случае если для трансфекции были использованы 5'-фрагмент (ЗР) и З'-фрагмент (50Н), у большинства рекомбинантов в состав генома входил либо целый З'-фрагмент, либо целый З'-фрагмент. Были и такие рекомбинанты, у которых места перекреста располагались внутри области перекрывания двух фрагментов (табл. 2).

Поскольку появление РНК-полимеразы в системе до того, как произойдет рекомбинация, было невозможно, изложенные результаты показали, что рекомбинация между фрагментами полиовирусной РНК может идти по нерепликативному пути. Возможность того, что рекомбинантные геномы мот ли быть образованы в результате ДНК-рекомбинации, может быть исключена по нескольким причинам. Во-первых, транскрипты перед трансфекцией очищали в градиенте плотности сахарозы. Во-вторых, когда для трансфекции использовали кольцевые и линейные ДНК-матрицы, вирусного потомства получено не было. В третьих, обработка транскриптов перед трансфекцией ДНКазой, не обладающей РНКазной активностью, не повлияла на выход рекомбинантов. Однако, обработка транскриптов РНКазой, не обладающей ДНКазной активностью, предотвратила образование жизнеспособных рекомбинантов. Кроме этого, следует заметить, что процедуры, направленные на модификацию концевых нуклеотидов и приводящие к значительным изменениям в выходе и структуре рекомбинантов, вряд ли могли повлиять на возможные рекомбинационные свойства молекул ДНК.

к-

"ZT

^ Л \

33' 5'

3 3'

3'

G С AT

внутреннее место

AT GC

5'

G С AT

вставка целого

AT G С

вставка целого

д' перекреста gi З'-фрагмента gi 5'-фрагмента

Рис. 6. Три типа геномов, образовавшихся в результате рекомбинации между фрагментами Ovl. На схеме вверху 5'-фрагмент представлен черным прямоугольником, З'-фрагмепт - белым прямоугольником. Концевые последовательности фрагментов указаны в левой стороне рисунка. 3'-концевой остаток С 5'-фрагмента, который устраняется при приготовлении ЗР формы, указан в скобках. Маркеры 5'- и З'-фрагментов указаны черными и белыми треугольниками, соответственно. Показаны участки сиквенсных гелей, соответствующие концам фрагментов. Стрелки указывают направление электрофореза. Приведены примеры рекомбинантов, полученных при скрещивании ЗОН и 5РРР (внутреннее место перекреста), ЗОН и 50Н (вставка целого З'-фрагмента), ЗР и 5РРР (вставка целого 5'-фрашента) форм.

В образовании рекомбинантов между перекрывающимися фрагментами РНК мо1 у I принимать участие различные механизмы. Одна группа гипотетических механизмов предполагает существование предварительного расщепления соответствующей фосфодиэфирной связи(ей) и образование концов, которые могут участвовать в дальнейшем лигировании. Такое расщепление может быть вызвано различного рода нуклеазами. присутствующими в клетке, или может быть результатом криптической рибозим-подобной активности (Оту1 с! а!., 1999). Согласно другим механизмам, расщепление одной фосфодиэфирной связи непосредственно связано с образованием другой фосфодиэфирной связи (транеэтерификация) (СЬе^епп е1 а1., 1997). Пока трудно сказать, по какому механизму идет образование конкретного типа рекомбинантного генома: не исключено, что у каждого типа - свой механизм, но возможно, что все шпы подчиняются одному механизму.

2.3. Отклонение от точности при образовании рекомбинантов между фрагментами РНК полиовируса

Подавляющее большинство вирусного потомства, образованного фрагментами Оу1, представляло собой точные рекомбинанты. Однако существовали некоторые исключения. Образование рекомбинантных геномов иногда сопровождалось изменениями в месте перекреста. Эти изменения представляли собой либо точечные нуклеотидные замены (квази-точная рекомбинация), либо вставку одного-двух кодонов (неточная рекомбинация) (рис. 7).

Квази-точная рекомбинация наблюдалась при включении целых 5'- и 3'-фрагментов во внутреннее положение фрагментов-партнеров. Появление нуклеотидных замен в местах перекреста можно объяснить включением 5'- и З'-фрагментов, имеющих дополнительный 3'- и 5'-концевой нуклеотид, соответственно. Фрагменты с такими концами могут быть образованы при транскрипции Т7 РНК-полимеразой (Тпапа-А1опво й а1., 1995; РЫбб ег а1., 1998). Неточная рекомбинация наблюдалась при включении целого 5'-фрагмента. Вставки одного-двух кодонов в местах перекреста можно объяснить включением 5'-фрагмента на 3 или 6 позиций выше корректного места перекреста. Неточная рекомбинация также наблюдалась внутри области перекрывания фрагментов. К вставкам одного кодона в местах перекреста могло

А

i=>5'..CGC GOA GAU 3'

—►5'...CGC GUA GUC GAU...3'

—у 5' ...CGC GUA AGG GÜC GAU...3' и=> 5' .CGC GUA CAU .3'

■=<>5'...CGC GUA CUC GAU...3'

5'-фрагмент 5'...CGC GUA

З'-фрагмент 5'..AGG GUC GAU...3' \/

5'...CGC GUA С

5'-фрагмент

З'-фрагмент

Б GUC...3'

^>5'...GGA GUC...3' 5'-фрагмент #

..GGG GUC .3' 5'...GGA GUG...3'

1

G GUC...3'

З'-фрагмент

В

5'-фрагмент

ж15'...вОА иш...3' 5' вил иив..З'

'...сил ииА Шв...З' Б'..СиА"отС..З'

З'-фрагмент

5'-фрагмент

■№(5'...вАС АвА..З' 5'...вАС...З'

■ 5 ' ...GAC GAC AGG...3'

5'...<SAC...3'

З'-фрагмент

Рис 7. Аберрантные формы рекомбинантных геномов, полученные при скрещивании фрагментов Оу1. А. Вставка целого 5'-фрагмента в рекомбинации. Точная рекомбинация показана белой стрелкой. Квази-точная рекомбинация, включающая дополнительный концевой нуклеотид (подчеркнут), показана серой стрелкой. Неточная рекомбинация, в которой вставка целого 5'-фрагмента без дополнительного нуклеотида и с ним произошла на 3 позиции выше корректного места, показана толстьми черной и полосатой стрелками, соответственно. Неточная рекомбинация, в которой вставка целого 5'-фрагмента произошла на 6 позиций выше корректного места, показана тонкой черной стрелкой. Б. Вставка целого З'-фрагмента в рекомбинации СМ. Обозначения, как на панели А. В. Примеры неточной внутренней рекомбинации. Неточная внутренняя рекомбинация Оу1, при которой произошла вставка одного кодона, показана двойной черной стрелкой. Последовательность дикого типа обозначена

привести взаимодействие между внутренними нуклеотидами 5'- и З'-фрагментов, расположенных на расстоянии 3 позиций.

Полученные результаты указывают на то, что локализация мест перекреста может смещаться, по крайней мере, до некоторой степени. Вероятно, точность рекомбинантных геномов обусловлена селекцией их по вирусной жизнеспособности. В то же время, рекомбинантные геномы, имеющие неточные места перекреста, тоже могут отбираться, если их измененный геном совместим с жизнеспособностью вируса (Gmyl et al., 1999). Об этом говорят результаты, полученные при работе с частично деградированным препаратом З'-фрагмента Hrpl и неповрежденным 5'-фрагментом Hrpl (рис. 8.А). Два неточных рекомбинанта было отобрано в экспериментах, включающих такую пару фрагментов (рис. 8.Б). Рекомбинанты имели характерное для неповрежденных фрагментов Hrpl место лигирования (между 6616 и 6617 нт) и полноценную рамку считывания полипротеина, но к различным нуклеотидам внутри их З'НТО были пришиты разного рода довески. Эти довески соответствовали смежным (SKI51) и несмежным (SKI32) частям 3'-концевой последовательности РНК-полимеразы и З'НТО. Вполне вероятно, что эти «монстры» были образованы многократными случаями нерепликативной рекомбинации. Монстры, генетически нестабильны. Такой вывод можно сделать из анализа РНК SK132, выделенной после нескольких последовательных пассажей вируса, отобранного из бляшки. Анализ представлял собой секвенирование и гель-электрофорез RT PCR-продуктов, полученных для каждого вирусного пассажа. Как видно из рисунка 8.В, РНК SK132 вернулась к каноническому виду (РНК Hrpl) с потерей всех ошибочно приобретенных частей в течение 4 пассажей.

2.4. Заключение

Известно множество важных биологических процессов, как, например, сплайсинг и РНК-циркуляризация, включающих разрыв и лигирование молекул РНК. Эти реакции являются сайт-специфическими и имеют строгие структурные требования. В то же время перегруппировки РНК у вирусов, как полагают, возникают в течение синтеза РНК вирусной РНК-полимеразой. Изложенные результаты демонстрируют, что сборка генома полиовируса из его фрагментов может происходить без участия РНК-полимеразы, и для этого не требуются специфические последовательности и

5'-фрагмент 1

З'-фрагмент 2 3

6617+7392-»4 17342-

6617-7380 ■

Hrpl

В

]=з(А)п

958

Рис. 8. Аберрантные формы рекомбинантных геномов. А. Интактный препарат 5'-фрагмента Hrpl (полоса 1), частично деградировавший препарат З'-фрагмента (2). при ко-грансфекции которыми были получены рекомбинантные геномы-монстры. Для сравнения приведен интактный препарат З'-фрагмента Hrpl (3). Б. Схематические структуры геномов-монстров SKI32 и SK151, полученных при рекомбинации Hrpl. Для сравнения приведена структура корректного генома Hrpl. Части геномов, произошедшие от 5'- и З'-фрагментов, показаны черным и серым цветами, соответственно. Корректное место дотирования фрагментов Hrpl показано звездой. Сегменты, соответствующие нетранслируемым областям, показаны тоньше, чем кодирующие области. Треугольник обозначает концевой кодон полипротеиновой рамки. Местоположение сегментов-довесков показано прямоугольниками с узорами и отмечено координатами. В. Нестабильность генома SK132. RT PCR-продукты РНК Hrpl, выделенной из бляшки (полоса 0), и вирусной РНК, подвергшейся 4 последовательным пассажам (1,2,3,4) в клетках Vero. Ссквенирование продуктов длиной 958 и 1066 нт установило структуры, соответствующие каноническому геному Hrpl и первоначальному геному-монстру, показанные на панели Б, соответственно.

структуры. Образование полноразмерного вирусного генома может происходить путем (1) лигирования концевых нуклеотидов фрагментов, (2) включения целых фрагментов во внутренне положение фрагментов-партнеров и (3) взаимодействия между внутренними нуклеотидами фрагментов. Вставка полных 5'- и З'-фрагменгов в рекомбинантный геном происходила при наличии у 5'-фрагмента З'-концевого фосфата, а у З'-фрагмента 5'-концевой ОН группы, соответственно Такие пострепликативные реакции фундаментально отличны от известных клеточных РНК-перегруппировок.

Впервые показана возможность точной (гомологичной) нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса. Обнаружено, что при этом места перекреста могут располагаться в разных местах и включать различные нуклеотиды Теоретически, в образовании точных рекомбинантов могут принимать учас1ие различные механизмы.

Согласно одному механизму, в рекомбинации может участвовать любая пара нуклеотидов двух фрагментов. При этом будут образовываться в подавляющем большинстве случаев неточные рекомбинанты, в то время как точные будут представлены лишь незначительной частью от общего числа рекомбинантов. После таких случайных ковалентных взаимодействий будет происходить селективный отбор жизнеспособных геномов. Образование многочисленных неточных рекомбинантов со вставкой целых фрагментов может говорить об участии в рекомбинации механизма случайного разрыва-лигирования фрагментов РНК.

Другой гипотетический механизм разрешает только сопряженные ковалентные взаимодействия между парами визави-нуклеотидов у фрагментов РНК. Такие взаимодействия будут приводить к образованию точных рекомбинантов. Возможно, также, что образование точных рекомбинантов есть результат существующих горячих точек расщепления и лигирования двух фрагментов. Имеющиеся данные пока не позволяют сказать, какой из механизмов реализуется в нашей системе. Получение ответа остается делом будущих исследований.

С одной стороны, рекомбинация РНК позволяет вирусам тасовать домены своих РНК и собирать геномы из сегментов РНК, происходящих из различных источников (неродственные вирусы, гены клетки-хозяина). Следовательно, рекомбинация РНК во многом определяет эволюцию РНК-содержащих вирусов. С другой стороны, рекомбинация позволяет вирусам избавляться от вредных точечных мутаций, которые

накапливаются в течение синтеза РНК. Таким образом, она участвует в сохранении постоянства вирусного генома. Любое из этих проявлений рекомбинации РНК может определяться как нерепликативным, так и репликативным механизмами, и вклад каждого из них еще предстоит определить. Тем не менее, даже если природная нерепликативная рекомбинация РНК - довольно редкое событие, трудно переоценить ее потенциал вызывать горизонтальный перенос генетического материала между вирусными РНК-геномами, и между клеточным и вирусным РНК-геномами. Можно предположить, что нерепликативный механизм(ы), ответственный за рекомбинацию между вирусными РНК-геномами, с успехом оперирует и с клеточными РНК.

Нерепликативная рекомбинация между молекулами РНК могла происходить как на протяжении эры РНК-мира, так и на всех последующих стадиях биологической эволюции. Более того, нельзя исключить, что нерепликативная рекомбинация РНК совместно с обратной транскрипцией также могла вносить вклад в эволюцию клеточных ДНК-геномов.

ВЫВОДЫ

1. Доказана принципиальная возможность рекомбинации между фрагментами РНК вируса полиомиелита по нерепликативному пути с образованием полноценных вирусных геномов.

2. Впервые показана возможность точной (гомологичной) нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса. Продемонстрировано, что 5'- и З'-фрагменты могут объединяться с образованием жизнеспособного вируса путем (1) лигирования конец-в-конец, (2 и 3) взаимодействия между 3'- или 5'-концевыми нуклеотидами одной молекулы с внутренним нуклеотидом другой молекулы и (4) взаимодействия между внутренними нуклеотидами двух молекул.

3. Показано, что для эффективного лигирования двух фрагментов РНК необходимо наличие у З'-фрагмента 5'-концевой ОН группы, а у ¿'-фрагмента 3'-концевого фосфата или 2',3'-циклофосфата.

4. Показано, что включение целиком 5'- или З'-фрагмента во внутренний участок фрагмента-партнера происходит при наличии у ¿'-фрагмента 3'-концевого фосфата, а у З'-фрагмента ¿'-концевой ОН группы, соответственно.

Благодарности

Я глубоко признателен моим научным руководителям, профессору Аголу В.И. и в.н.с. Гмылю А.П., за предложенную тему работы и возможность пройти настоящую научную школу. Я признателен также Белоусову Е.В. и Хитриной Е.В., в сотрудничестве с которыми была выполнена часть исследований. Большое спасибо всем сотрудникам лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова за оказанные поддержку и содействие при выполнении работы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Gmyl, А. P., Korshenko, S. A., Belousov, Е. V., Khitrina, Е. V., and Agol, V. I. Nonreplicative homologous RNA recombination: promiscuous joining of KNA pieces? 2003. RNA, (9): 1221-1231.

2. Gmyl, A. P., Belousov, E. V., Korshenko, S. A., Khitrina, E. V., and Agol, V. 1. Dissecting nonreplicative poliovirus RNA recombination into the brekage and ligation steps. XI th. Meeting of the European Study Group on Molecular Biology of Picornaviruses. May 25-31,2000, Baia delle Zagare (Mattinata), Italy. G16.

3. Gmyl, A. P., Korshenko, S. A., Belousov, E. V., Khitrina, E. V., and Agol, V. I. Requirements for the ligation step of nonreplicative recombination of poliovirus RNA. XII th. Meeting of the European Study Group on Molecular Biology of Picornaviruses. May 13-19, 2002, Sea Crest, USA. El 8.

4. Agol, V. I., Gmyl, A. P., Korshenko, S. A., Belousov, E. V., and Khitrina, E. V. Nonreplicative homologous RNA recombination: promiscuous joining of RNA pieces? 8th Annual Meeting of the RNA Society. July 1-6, 2003, Vienna, Austria. D10.

5. А. П. Гмыль, E. В. Белоусов, С. А. Коршенко, F.. В. Хитрина, С. В. Маслова и В. И. Агол. Нерепликативная рекомбинация между фрагментами полиовирусной РНК. Международная конференция, посвященная 90-летаю со дня рождения М. П. Чумакова. «Актуальные проблемы медицинской вирусологии». Материалы конференции. Москва. Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН, 23-25 ноября 1999 г., стр. 81.

6. С. А. Коршенко, А. П. Гмыль, С. В. Маслова, В. И. Агол. Получение жизнеспособного вируса при помощи негомологичной рекомбинации между двумя взаимодополняющими фрагментами его РНК. XLI Научная конференция московского физико-технического института. «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». Тезисы докладов. Москва, 27-28 ноября 1998 г., стр. 178.

7. С. А. Коршенко, А. П. Гмыль, С. В. Маслова, В. И. Агол. Нерепликативная рекомбинация между двумя фрагментами полиовирусной РНК: доказательство возможности датирования двух фрагментов с образованием жизнеспособного вируса. XLII Научная конференция московского физико-технического института «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». Тезисы докладов. Москва, 26-27 ноября 1999 г., стр. 236.

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 404, тираж 100 экз. Подписано в печать 05. 11. 2003

» 18заs

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Коршенко, Сергей Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения о полиовирусс.

2.2. Модели генетической рекомбинации.

2.3. Доказательства существования репликативной рекомбинации между молекулами РНК.

2.4. Возможные механизмы репликативной рекомбинации.

2.5. Возможные механизмы расщепления и лигирования молекул РНК.

2.6. Доказательства существования нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Ферменты и реактивы.

3.2. Плазмида.

3.3. Бактериальный штамм.

3.4. Синтетические олигонуклеотиды.

3.5. Базовые методы молекулярного клонирования.

3.6. Получение плазмидных конструкций, содержащих кДНК фрагментов.

3.7. Получение полноразмерных транскриптов.

3.8. Модификации концевых нуклеотидов транскриптов.

3.9. Анализ вирусных клонов.

3.10. Определение нуклеотидной последовательности ЯТ РСЯ-фрагмептов и плазмидной ДНК.

3.11. Моделирование вторичной структуры РНК.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Конструирование 5'- и З'-фрагмептов РНК полиовируса, точно дополняющих друг друга.

4.2. Образование рекомбинантов между 5'- и З'-фрагмептами РНК полиовируса, точно дополняющими друг друга.

4.3. Конструирование 5'- и З'-фрагментов РНК полиовируса, имеющих область перекрывания.

4.4. Образование рекомбинантов между 5'- и З'-фрагментами РНК полиовируса, имеющих область перекрывания.

4.5. Отклонение от точности при образовании рекомбинантов между фрагментами РНК полиовируса.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Доказательство существования нсрспликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса.

5.2. Лигировапие фрагментов РНК полиовируса.

5.3. Рекомбинация между перекрывающимися фрагментами РНК полиовируса.

5.4. Точность при образовании рекомбинантов между фрагментами РНК полиовируса.

5.5. Репликативпая и нерспликативная рекомбинация у РНК-содержащих вирусов.

5.6. Биологическая значимость нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нерепликативная гомологичная рекомбинация между фрагментами РНК полиовируса"

Под генетической рекомбинацией в общем смысле слова поинмают возникновение новой дочерней молекулы ДНК (РНК) из двух или более родительских молекул ДНК (РНК). До 60х годов считалось, что генетическая рекомбинация присуща только молекулам ДНК, открытие же рекомбинации между молекулами РНК заставило пересмотреть устоявшиеся взгляды на это явление. Впервые рекомбинацию между молекулами РНК наблюдали у полиовируса Hirst (1962) и Ledinko (1963). При совместной инфекции клеток HeLa двумя штаммами полиовируса типа 1, проявляющими разные фспотипическис признаки (устойчивость к малым концентрациям гуанидина или ингибиторов, присутствующих в некоторых партиях лошадиных или бычьих сывороток), они получали рекомбинантные вирусы, которые экспрессировали фенотипичсские маркеры от обоих родительских штаммов одновременно. Немногим позже Pringle (1965), используя подобный подход, наблюдал генетическую рекомбинацию между штаммами, относящимися к разным серотипам вируса ящура. Первые биохимические доказательства наследования генетической информации от двух родительских молекул РНК были получены на примере вируса полиомиелита (Romanova et al., 1980; Tolskaya et al., 1983). Используя частичный протеолиз и изоэлектрическое фокусирование, авторы показали, что вирусный РНК-геном может кодировать белки, принадлежащие разным родителям. Окончательное доказательство существования рекомбинации РНК было получено после определения нуклеотидпой последовательности мест перекреста между геномными сегментами, произошедших от разных родителей (Romanova et al., 1986; Kirkegaard and Baltimore, 1986). На сегодняшний день известно, что рекомбинация между молекулами РНК - широко распространенное явление, присущее многим РНК-содержащим вирусам животных, растений и бактерий (см. обзоры Lai, 1992; Agol, 1997; Aaziz and Tepfer, 1999; Worobey and Holmes, 1999).

Открытие явления рекомбинации между молекулами РНК позволило с новой точки зрения взглянуть па эволюцию РНК-содержащих вирусов, поскольку рекомбинация может приводить к возникновению новых вирусных вариантов, лучше приспособленных для выживания. При этом предполагается, что образование вирусов с новыми фенотипическими признаками может идти по блочному принципу, за счет передачи друг другу функционально значимых модулей (Lai, 1992; Dolja and Carrington, 1992). Таким образом, был сделан вывод, что рекомбинация может ускорять эволюцию РНК-геномов (Worobey and Holmes, 1999). С другой стороны, рекомбинация может быть одним из способов исправления ошибок (вредные точечные мутации, делеции и др.), которые накапливаются в процессе синтеза РНК. Как известно, ни одна из вирусных РНК-зависимых PI IK-полимераз не обладает корректирующей активностью, что обуславливает относительно высокий уровень частоты спонтанных мутаций при репликации геномной РНК (Lai, 1992; Агол, 2002). В результате замены участков генома па гомологичные последовательности РНК-рекомбинация может устранять функционально значимые ошибки. Таким образом, с этой точки зрения, она играет важную роль в сохранении постоянства генома (Carpenter and Simon, 1996). Кроме этого, рекомбинация между молекулами РНК является важным фактором и с практической точки зрения. Так, рекомбинацию РНК следует учитывать при рассмотрении вакцинации аттспуированными вирусами, так как она может приводить к образованию новых вирусов среди вакцинных штаммов.

При этом у этих вирусов степень аттенуации может быть значительно ниже, чем у их родителей (Lipskaya et al., 1991; Georgescu et al., 1994). В результате появление в организме вирусов с усиленными вирулентными свойствами может привести к заболеванию. В связи с этим интерес к рекомбинации между молекулами РНК не ослабевает, и, как следствие, эта тема становится содержанием все большего числа работ.

Так как рекомбинация происходит редко и случайно, то рекомбинантные молекулы РНК могут быть обнаружены, только если их удается избирательно амплифицировать, чтобы отличить от большого фона родительских молекул РНК. По этой причине почти все описанные случаи рекомбинации РНК были обнаружены ш vivo на вирусах или на их дефектных интерферирующих геномах (DI-гепомах). В то же время у систем ш vivo есть свои недостатки. Эти системы позволяют обнаружить только те случаи рекомбинации между молекулами РНК, которые приводят к жизнеспособным геномам. В связи с этим, большая часть сообщений о рекомбинации между молекулами РНК касается гомологичной рекомбинации, то есть рекомбинации между подобными участками родительских молекул РНК. Детектирование случаев негомологичной рекомбинации затруднено тем фактом, что такого рода рекомбинация приводит к делении или вставке участка(ов) вирусиого генома. Однако если это серьезным образом не сказывается на вирусной жизнеспособности, то рекомбинаит также может быть амплифицирован и исследован. Другим недостатком является то, что большинство экспериментов на живых системах не отвечают на основные вопросы, касающиеся механизма рекомбинации. Так, например, остается невыясненным, участвуют ли в этом процессе белки вирусного рспликативного комплекса, белки клетки-хозяина.

Гомологичная рекомбинация между молекулами РНК, также как, впрочем, и негомологичная рекомбинация, может быть объяснена с помощью репликативной модели «смена матрицы», которая постулирует, что незаконченная рождающаяся молекула РНК оставляет матрицу и присоединяется к другой матрице, где происходит возобновление синтеза (Адо1, 1997). До недавнего времени репликативная модель была общепринятой, и с ее помощью объяснялось большинство полученных рекомбинантных молекул. Однако в последнее время появились первые указания на существование иерепликативной рекомбинации между молекулами РНК (СЬе^епп е1 а1., 1997; Сту1 е1 а!., 1999). Согласно перепликативпой модели рекомбинация происходит не в процессе синтеза повой цепи, а в результате разрыва и воссоединения предварительно синтезированных молекул РНК.

Поскольку представленные свидетельства в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК имеют уязвимые места (СЬеП'епп с1 а!., 1997; Сту1 е1 а!., 1999), получение неоспоримых доказательств возможности молекул РНК нереиликативпо рекомбинировать между собой является важной задачей. Данная работа посвящена исследованию нерепликативпой рекомбинации между молекулами РНК вируса полиомиелита. Цель и задачи исследования

Первое свидетельство в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК было получено А. Б. Четверимым с соавторами в бесклеточной системе репликации фага С?р (СЬе^епп е1 а!., 1997). В системе использовались (23 репликаза, гЫТР и неспособные к экспоненциальной репликации перекрывающиеся фрагменты одной из сателлитных РНК. Способные к репликации молекулы РНК появлялись в результате пегомологичной рекомбинации, которая зависела от присутствия З'-ОН группы у 5'-фрагмента. На основании полученных результатов авторы предположили, что рекомбинация идет по перепликативному механизму, напоминающему вторую стадию вырезания самосплайсирующихся иптропов. Второе свидетельство в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК было получено в нашей лаборатории в системе in vivo вируса полиомиелита (Gmyl et al., 1999). В системе использовались неспособные к репликации и трансляции перекрывающиеся фрагменты вирусной РНК. При совместной трапсфекции восприимчивой к полиовирусу культуры клеток такими фрагментами образовывалось жизнеспособное вирусное потомство. Было показано, что вирусные геномы являются рекомбинантами между 5'- и З'-фрагментами. Часть рекомбинантов включала целый 5'-фрагмснт. Такие рекомбиианты образовывались только в том случае, если 5'-фрагмент содержал З'-концевой фосфат. На основании полученных результатов и в связи с тем, что образование вирусной РНК-полимеразы до акта рекомбинации было блокировано, авторы сделали вывод, что рекомбинация идет по нерепликативному механизму. Однако, принимая во внимание, что в первом случае рекомбинация, видимо, зависит от присутствия вирусной PIIK-полимеразы, а во втором - этот фермент мог образоваться (хотя и маловероятно) в результате трансляции одного из фрагментов, полностью исключить возможность образования рекомбинантов репликативным путем было нельзя. Поэтому мы поставили перед собой цель неоспоримо доказать, что рекомбинация между молекулами РНК полиовируса может происходить без участия РНК-полимеразы, и, если это будет выполнено, то определить необходимые условия этого процесса. В частности, были поставлены и решались следующие задачи:

1) определение возможной роли вторичной структуры в образовании рекомбипантных молекул РНК;

2) определение необходимых условий для эффективного лигирования молекул РНК в зависимости от химической структуры концевых нуклеотидов. Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе выполнения настоящей работы были сконструированы четыре пары неинфекционных 5'- и З'-фрагментов РНК полиовируса. Любая пара фрагментов представляла собой взаимодополняющие части вирусного генома, разорванного в участке, кодирующем вирусную РНК-полимеразу. При этом фрагментам трех пар не хватало только одной фосфодиэфирной связи для образования целого генома, а фрагменты четвертой пары содержали перекрывающиеся гомологичные последовательности. Было показано, что при совместной трансфекции восприимчивой к полиовирусу культуры клеток неинфекционными 5'- и 3'-фрагментами полиовирусной РНК образовывалось жизнеспособное вирусное потомство, которое было представлено рекомбинантами между этими фрагментами. Поскольку образование вирусной РНК-полимеразы до акта рекомбинации было невозможно, полученные данные иеоспоримо свидетельствуют в пользу того, что рекомбинация между молекулами РНК полиовируса может идти по нерепликативному пути. Впервые было продемонстрировано существование гомологичной нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса. Было показано, что 5'- и З'-фрагменты могут объединяться путем (1) лигирования конец-в-коиец, (2 и 3) взаимодействия между 3'- или 5'-концевыми нуклеотидами одной молекулы и вн>тренним нуклеотидом другой молекулы и (4) взаимодействия между ви>тренними нуклеотидами двух молекул. Вставка целого 5'- или З'-фрагмента в рекомбипантную РНК активировалась присутствием З'-фосфата и 5'-ОН группы, соответственно.

Существование нерепликативной рекомбинации РНК предоставляет дополнительную возможность для объяснения эволюции вирусных и, возможно, клеточных геномов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Коршенко, Сергей Анатольевич

выводы

1. Доказана прннципиальиая возможность рекомбинации между фрагментами РНК вируса полиомиелита по перепликативному пути с образованием полноценных вирусных геномов.

2. Впервые показана возможность точной (гомологичной) нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса. Продемонстрировано, что 5'- и З'-фрагменты могут объединяться с образованием жизнеспособного вируса путем (1) лигирования конец-в-консц, (2 и 3) взаимодействия между 3'- или 5'-концевыми нуклеотидами одной молекулы с внутренним нуклеотидом другой молекулы и (4) взаимодействия между внутренними нуклеотидами двух молекул.

3. Показано, что для эффективного лигирования двух фрагментов РНК необходимо наличие у З'-фрагмента 5'-концевой ОН группы, а у 5'-фрагмента 3'-концевого фосфата или 2',3'-циклофосфата.

4. Показано, что включение целиком 5'- или З'-фрагмента во внутренний участок фрагмента-партнера происходит при наличии у 5'-фрагмента 3'-концевого фосфата, а у З'-фрагмента 5'-концевой ОН группы, соответственно.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко признателен моим научным руководителям, профессору Аголу В.И. и в.н.с. Гмылю А.П., за предложенную тему работы и возможность пройти настоящую научную школу. Я признателен также Белоусову Е.В. и Хитриной Е.В., в сотрудничестве с которыми была выполнена часть исследований. Большое спасибо всем сотрудникам лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова за оказанные поддержку и содействие при выполнении работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Коршенко, Сергей Анатольевич, Москва

1. Агол, В. И. (2002) Непостоянство генома пикорнавирусов. Молекулярная биология, том 36, №2, с. 286-295.

2. Грагеров, А. И. (1990) Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. Издательство «Высшая школа», с. 84-109.

3. Ленинджер, А. (1974) Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки. Издательство «Мир», с. 300-302.

4. Шапот, В. С. (1968) Нуклеазы. Издательство «Медицина», с. 9-135.

5. Aaziz, R., and Tepfer, М. (1999) Recombination in RNA viruses and in virus-resistant transgenic plants. J. Gen. Virol. 80, 1339-1346.

6. Abelson, J., Trotta, C.R., and Li, II. (1998) tRNA splicing. J. Biol. Chem. 273, 12685-12688.

7. Agol, V. I. (1991) The 5'-untranslated region of picornaviral genomes. Adv. Virus. Res. 40, 103-180.

8. Agol, V. I. (1997) Recombination and other genomic rearrangements in picornaviruses. Semin. Virol. 8, 1 -9.

9. Agol, V. I. (2002) Picornavirus genetics: An overview. In The molecular biology of picornaviruses (eds. B.L. Semler and E. Wimmer), pp. 269-284. ASM Press, Washington, DC.

10. Andino, R., Rieckhof, G. E., and Riesner, D. (1990) A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5' end of poliovirus RNA. Cell 63,369-380.

11. Arnold, J. J., and Cameron, С. E. (1999) Poliovirus RNA-dependent RNA polymerase (3Dpol) is sufficient for template switching in vitro. J. Biol. Chem. 274, 2706-2716.

12. Banner, L. R., Keck, J. G., and Lai, M. M. C. (1990) A clustering of RNA recombination sites adjacent to a hypcrvariable region of the peplomer gene of murine Coronavirus. Virology 175, 548-555.

13. Banner, L. R., and Lai, M. M. C. (1991) Random nature of Coronavirus RNA recombination in the absence of selection pressure. Virology 185,441-445.

14. Belov, G. A., Evstafieva, A. G., Rubtsov, Yu. P., Mikitas, O. V., Vartapetian, A. B., and Agol, V. I. (2000). Early alteration of nucleocytoplasmic traffic induced by some RNA viruses. Virology 275, 244-248

15. Billy, E., Hess, D., Hofsteenge, J., and Filipowicz, W. (1999) Characterization of the adenylation site in the RNA 3'-terminal phosphate cyclase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274,34955-34960.

16. Borman, A. M., Deliat, F. G., and Kean, K. M. (1994) Sequences within the poliovirus internal ribosome entry segment control viral RNA synthesis. EMBO J. 13,3149-3157.

17. Branch, A. D., Robertson, H. D., Greer, C., Gegenheimer, P., Peebles, C., and Abelson, J. (1982) Cell-free circularization of viroid progeny RNA by an RNA ligase from wheat germ. Science 217, 1147-1149.

18. Butcher, S. E. (2001) Structure and function of the small ribozymes. Structural Biology 11,315-320.

19. Carpenter, C. D., and Simon, A. E. (1996) In vivo restoration of biologically active 3' ends of virus-associatcd RNAs by nonhomologous RNA recombination and replacement of a terminal motif. J. Virol. 70,478-486.

20. Cascone, P. J., Carpenter, C. D., Li, X. H., and Simon A. E. (1990) Recombination between satellite RNAs of turnip crinkle virus. EMBOJ. 9, 1709-1715.

21. Cascone, P. J., Ilaydar, T. F., and Simon A. E. (1993) Sequences and structures required for recombination between virus-associated RNAs. Science 260, 801-805.

22. Cech, T. R., and Bass, B. L. (1986) Biological catalysis by RNA. Annu. Rev. Biochem. 55, 599-629.

23. Charini, W. A., Todd, S., Gutman, G. A., and Semler, B. L. (1994) Transduction of a human RNA sequence by poliovirus. J. Virol. 68, 6547-6552.

24. Chetverin, A. B., Chetverina, H. V., Demidenko, A. A., and Ugarov, V. I. (1997) Nonhomologous RNA Recombination in Cell-Free System: Evidence for a Transesterification Mechanism Guided by Secondary Structure. Cell 88,503-513.

25. Chetverina, H. V., and Chetverin, A. B. (1993) Cloning of RNA molecules in vitro. Nucleic Acids Res. 21, 2349-2353.

26. Chetverina, H. V., Demidenko, A. A., Ugarov, V. I., and Chetverin, A. B. (1999) Spontaneous rearrangements in RNA sequences. FEBS Lett. 450, 89-94.

27. Cooper, P. D. (1977) Genetics of picornaviruses. Comp. Virol. 9, 133-207.

28. Cruz-Reyes, J., Zhelonkina, A.G., Huang, C.E., and Sollner-Webb, B. (2002) Distinct functions of two RNA ligases in active Trypanosoma brucei RNA editing complexes. Mol. Cell Biol. 22,4652-4660.

29. Diaz, L., and DeStefano, J. J. (1996) Strand transfer is enhanced by mismatched nucleotides at the 3' primer terminus: A possible link between HIV reverse transcriptase fidelity and recombination. Nucleic Acids Res. 24, 3086-3092.

30. Diencr, T. O. (2001) The viroid: biological oddity or evolutionary fossil? Adv. Virus Res. 57, 137-184.

31. Dolja, V. V., and Carrington, J. C. (1992) Evolution of positive-strand RNA viruses. Semin. Virol. 3,315-326.

32. Doudna, J. A., and Cech, T. R. (2002) The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature 418, 222-228.

33. Duggal, R., Cuconati, A., Gromeier, M., and Wimmer, E. (1997) Genetic recombination of poliovirus in a cell-free system. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94, 13786-13791.

34. Duggal, R., and Wimmer, E. (1999) Genetic recombination of poliovirus in vitro and in vivo: temperature-dependent alteration of crossover sites. Virology 258(1), 30-41.

35. Egger, D., and Bienz, K. (2002) Recombination of poliovirus RNA proceeds in mixed replication complexes originating from distinct replication start sites. J. Virol. 76,10960-10971.

36. Fedor, M. J. (2000) Structure and function of the hairpin ribozyme. J. Mol. Biol. 297, 269-291.

37. Figlerowicz, M., Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1997) A mutation in the putative RNA polymerase gene inhibits nonhomologous, but not homologous, genetic recombination in RNA virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2073-2078.

38. Figlerowicz, M., Nagy, P. D., Tang, N., Kao, C. C., and Bujarski, J. J. (1998) Mutations in the N terminus of the brome mosaic virus polymerase affect genetic RNA-RNA recombination./. Virol. 72,9192-9200.

39. Figlerowicz, M. (2000) Role RNA structure in non-homologous recombination between genomic molecules of brome mosaic virus. Nucleic Acids Res. 28, 17141723.

40. Filipowicz, W., and Shatkin, A. J. (1983) Origin of splice junction phosphate in tRNAs processed by HeLa cell extract. Cell 32, 547-557.

41. Filipowicz, W., Billy, E., Drabikowski, K., and Genschik, P. (1998) Cyclases of the 3'-terminal phoshate in RNA: A new family of RNA processing enzymes conserved in Eucarya, Bacteria and Archaea. Acta Biochimica Polonica 45, 895-906.

42. Filipowicz, W., Konarska, M., Gross, H. J., and Shatkin, A. J. (1983) RNA 3'-terminal phosphate cyclase activity and RNA ligation in HeLa cell extract. Nucleic Acids Res. 11, 1405-1418.

43. Filipowicz, W., Strugala, K., Konarska, M., and Shatkin, A. J. (1985) Cyclization of RNA 3'-terminal phosphate by cyclase from HeLa cells proceeds via formation of N(3')pp(S')A activated intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1316-1320.

44. Frohman, M. A., and Martin, G. R. (1990) PCR protocols. Ed Innis M.A.N.Y.: Academic Press 228-236.

45. Gal-on, A., Meiri, E., Raccah, B., and Gaba, V. (1998) Recombination of engineered defective RNA species produces infective potyvirus in planta. J. Virol. 72, 52685270.

46. Genschik, P., Billy, E., Swianiewicz, M., and Filipowicz, W. (1997) The human RNA 3'-terminal phosphate cyclase is a member of a new family of proteins conserved in Eucarya, Bacteria and Archaea. EMBOJ. 16, 2955-2967.

47. Genschik, P., Drabikowski, K., and Filipowicz, W. (1998) Characterization of the Escherichia coli RNA 3'-terminal phoshate cyclase and Its a54-regulated operon, J. Biol. Chem. 273,25516-25526.

48. Gmyl, A. P., Belousov, E. V., Maslova, S. V., Khitrina, E. V., Chetverin, A. B., and Agol, V. I. (1999) Nonreplicative RNA recombination in poliovirus. J. Virol. 73, 8958-8965.

49. Gorbalenya, A. E. (1992) Host-related sequences in RNA viral genomes. Semin. Virol. 3, 359-371.

50. Hajjou, M., Hill, K. R., Subramaniam, S. V., Hu, J. Y., Raju, R. (1996) Nonhomologous RNA-RNA recombination events at the 3' nontranslated region of Sindbis virus genome: hot spots and utilisation of nonviral sequences. J. Virol. 70, 5153-5164.

51. Hirst, G. K. (1962) Genetic recombination with Newcastle disease virus, polioviruses, and influenza Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 27,303-309.

52. Jarvis, T. C., and Kirkegaard, K. (1991) The polymerase in its labyrinth: Mechanisms and implications of RNA recombination. Trends Genet. 7, 16-191.

53. Jarvis, T. C., and Kirkegaard, K. (1992) Poliovirus RNA recombination: mechanistic studies in the absence of selection. EMBOJ. 11,3135-3145.

54. Jeong, Y. S., and Makino, S. (1992) Mechanism of coronavirus transcription: duration of primary transcription initiation activity and effects of subgcnomic transcription on RNA replication. J. Virol. 66,3339-3346.

55. Kandel, E.S., and Nudler, E. (2002) Template switching by RNA polymerase II in vivo. Evidence and implications from a retroviral system. Mol. Cell 10, 1495-502.

56. Kassavetis, G. A., and Geiduschek, E. P. (1993) RNA polymerase marching backward. Science 259, 944-945.

57. Kirkegaard, K., and Baltimore, D. (1986) The mechanism of recombination in poliovirus. Cell 47,433-443.

58. Khatchikian, D., Orlich, M., and Rott, R. (1989) Increased viral pathogenicity after insertion of a 28S ribosomal RNA sequence into the haemagglutinin gene of an influenza virus. Nature 340, 156-157.

59. King, A. M. Q., McCahon, D., Saunders, K., Newman, J. W. I., and Slade, W. R. (1985) Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3,373-384.

60. King, A. M. Q. (1988) Preferred sites of recombination in polivirus RNA: An analysis of 40 intertypic cross-over sequences. Nucleic Acids Res. 16, 11705-11723.

61. Konarska, M., Filipowicz, W., Domdey, H., and Gross, H. J. (1981) Formation of a 2'-phosphomonoester, 3'-, 5-phosphodiester linkage by a novel RNA Iigase in wheat germ. Nature 293, 112-116.

62. Koonin, E. V., and Dolja, V. V. (1993) Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28,375-430.

63. Mayo, M. A., and Jolly, C. A. (1991) The 5'-terminal sequence of potato leafroll virus RNA: evidence of recombination between virus and host RNA. J. Gen. Virol. 72,2591-2595.

64. Milligan, J.F., Groebe, D.R., Witherell, G.W., and Uhlenbeck, O.C. (1987) Oligoribonuclcotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res. 15, 8783-8798.

65. Modahl, L. E., Macnaughton, T. B., Zhu, N., Johnson, D. L., and Lai, M. M. C. (2000) RNA-dependent replication and transcription of hepatitis delta virus RNA involve distinct cellular RNA polymerases. Mol. Cell. Biol. 20, 6030-6039.

66. Monroe, S. S., and Schlesinger, S. (1983) RNAs from two independently isolated defective interfering particles of Sindbis virus contain a cellular tRNA sequence at their 5' ends. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80,3279-3283.

67. Munishkin, A.V., Voronin, L. A., and Chetverin, A. B. (1988) An in vivo recombinant RNA capable of autocatalytic synthesis by Q beta replicase. Nature 333, 473-475.

68. Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1995) Efficient system of homologous RNA recombination in brome mosaic virus: sequence and structure requirements and accuracy of crossovers. J. Virol. 69, 131-140.

69. Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1996) Homologous RNA recombination in brome mosaic virus: AU-rich sequences decrease the accuracy of crossovers. J. Virol. 70, 415-426.

70. Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1997) Engineering of homologous recombination hotspots with AU-rich sequences in brome mosaic virus. J. Virol. 71, 3799-3810.

71. Nagy, P. D., Dzianott, A., Ahlquist, P., and Bujarski, J. J. (1995) Mutations in the helicase-like domain of protein la alter the sites of RNA-RNA recombination in brome mosaic virus. J. Virol. 69, 2547-2556.

72. Nagy, P. D., Zhang, C., and Simon, A. E. (1998) Dissecting RNA recombination in vitro: role of RNA sequences and the viral replicase. EMDOJ. 17, 2392-2403.

73. Nagy, P. D., Ogiela, C., Bujarski, J. J. (1999) Mapping sequences active in homologous RNA recombination in brome mosaic virus: prediction of recombination hot spots. Virology 254(1), 92-104.

74. Negroni, M., Riccheti, M., Nouvel, P., Buc, H. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 69716975.

75. Nishikura, K. (2001) A short primer on RNAi: RNA-direeted RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell 107,415-418.

76. Pelletier, J., and Sonenbcrg, N. (1989) Internal binding of eucaryotic ribosomes on poliovirus RNA: translation in HeLa cell extracts. J. Virol. 67, 4543-4548.

77. Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Svitkin, Y. V., Sinyakov, A. N., and Agol, V. I. (1992) Prokaryotic-Iike cis-element in the cap-independent internal initiation of tanslation on Picornavirus RNA. Cell 68, 119-131.

78. Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., and Agol, V. I. (1995) A model for rearrangements in RNA genomes. Nucleic Acids Res. 23, 1870-1875.

79. Pleiss, J.A., Derrick, M.L., and Uhlenbeck, O.C. (1998) T7 RNA polymerase produces 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA 4,1313-1317.

80. Pringle, C. R. (1965) Evidence of genetic recombination in foot-and-mouth disease virus. Virology 25,48-54.

81. Qiao, X., Qiao, J., and Mindich, L. (1997) An in vitro system for the investigation of heterologous RNA recombination. Virology 237, 103-110.

82. Raju, R., Subramaniam, S. V., Hajjou, M. (1995) Genesis of Sindbis virus by in vivo recombination of nonreplicative RNA precursors. J. Virol. 69, 7391-7401

83. Reed, R. (2000) Mechanisms of fidelity in pre-mRNA splicing. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 340-345.

84. Reid, C. E., and Lazinski, D. W. (2000) A host-specific function is required for ligation of a wide variety of ribozymc-processed RNAs. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97,424-429.

85. Romanova, L. I., Tolskaya, E. A., Kolesnicova, M. S., and Agol, V. I. (1980) Biochemical evidence for intertypic genetic recombination of polioviruses. FEBS Lett. 118, 109-112.

86. Romani, A., Guerra, E., Trerotola, M., and Alberti, S. (2003) Detection and analysis of spliced chimeric mRNAs in sequence databanks. Nucleic Acids Res. 31, el 7.

87. Salgia, S.R., Singh, S.K., Gurha, P., and Gupta, R. (2003) Two reactions of Haloferax volcanii RNA splicing enzymes: Joining of exons and circularization of introns. RNA 9, 319-330.

88. Schiebel, W., Pelissier, T., Riedel, L., Thalmeir, S., Schiebel, R., Kempe, D., Lottspeich, F., Sänger, H. L., and Wassenegger, M. (1998) Isolation of an RNA-dircctcd RNA polymerase -specific cDNA clone from tomato. Plant Cell 10, 20872102.

89. Shiroki, K., Ishii, T., Aoki, T., Kobashi, M., Ohka, S., Nomoto, A. (1995) A new cis-acting clement for RNA replication within the 5'-noncoding region of poliovirus type 1 RNA. J. Virol. 69, 6825-6832.

90. Sidrauski, C., and Walter, P. (1997) The transmembrane kinase Irelp is a site-specific endonuclease that initiates mRNA splicing in the unfolded protein response. Cell 90, 1031-1039.

91. Simon, A. E., and Nagy, P. D. (1996) RNA recombination in turnip crinkle virus: its role in formation of chimeric RNAs, multimers, and in 3'-end repair. Semin. Virol. 7, 373-379.

92. Simpson, L., Sbiccgo, S. and Aphasizhev, R. (2003) Uridine insertion/deletion RNA editing in trypanosomc mitochondria: A complex business. RNA 9,265-276.

93. Slobodskaya, O. R., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Tolskaya, E. A., Victorova, E. G., and Agol, V. I. (1996) Poliovirus neurovirulence depends on the presence of a cryptic AUG upstream of the initiator codon. Virology 221, 141-150.

94. Soukup and Breaker. (1999) Relationship between internuclcotide linkage geometry and the stability of RNA. RNA 5, 1308-1325.

95. Sugino, A., Goodman, H. M., Heyneker, H. L., Shine, J., Boyer, H. W., Cozzarelli, N. R. (1977) Interaction of bacteriophage T4 RNA and DNA ligases in joining of duplex DNA at base-paired ends. J. Biol. Chem. 252,3987.

96. Symons, R. H. (1992) Small catalytic RNAs. Annu. Rev. Biochem. 61, 641-671.

97. Tang, R. S., Barton, D. J., Flanegan, J. B., and Kirkegaard, K. (1997) Poliovirus RNA recombination in cell-free extracts. RNA 3, 624-633.

98. Temin, H. M. (1993) Retrovirus variation and reverse transcription: abnormal strand transfers result in retrovirus genetic variation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 69006903.

99. Tolskaya, E. A., Romanova, L. I., Kolesnicova, M. S., and Agol, V. I. (1983) Intertypic recombination in poliovirus: Genetic and biochemical studies. Virology 124, 121-132.

100. Triana-Alonso, F. J., Dabrowski, M., Wadzack, J., and Nierhaus, K.H. (1995) Self-coded 3'-extension of run-off transcripts produces aberrant products during in vitro transcription with T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem. 270, 6298-6307.

101. Van der Werf, S., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., and Dunn, J. J. (1986) Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83,2330-2324.

102. Westaway, S. K., and Abelson, J. (1995) Splicing of tRNA precursors. In (RNA: Structure, Biosynthesis and Function (eds. Soell, D., and RajBhandary, U.), pp. 7992. ASM Press, Washington, DC.

103. Westaway, S. K., Phizicky, E. M., and Abelson, J. (1988) Structure and function of the yeast tRNA ligase gene. J. Biol. Chem. 263, 3171-3176.

104. Wimmer, E., Hellen, C. U., and Cao, X. (1993) Genetics of poliovirus. Annu. Rev. Genet. 27, 353-436.

105. Worobey, M. and Holmes, E.C. (1999) Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. J. Gen. Virol 80,2535-2543.

106. Yogo, Y., and Wimmer, E. (1972) Polyadenylic acid at the 3'-terminus of poliovirus RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 1877-1882.

107. Zhang, X., and Lai, M. M. C. (1994) Unusual Heterogeneity of leader-mRNA fusion in a Murine Coronavirus: implications for the mechanism of RNA transcription and recombination. J. Virol. 68,6626-6633.