Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые аспекты нерепликативной рекомбинации между фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Некоторые аспекты нерепликативной рекомбинации между фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ _ 2 имени М' в- ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

356-8

на правах рукописи

Евгений Валерьевич Белоусов

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ НЕРЕПЛИКАТИВНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ МЕЖДУ ФРАГМЕНТАМИ ГЕНОМНОЙ РНК ВИРУСА ПОЛИОМИЕЛИТА

03, 00. Об - вирусология

автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2002

Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН и РАМН В. И. Агол Кандидат биологических наук А, П. Гмыль

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН А. Д. Альтштейн Доктор биологических наук, профессор С. Ю. Морозов

Ведущая организация:

Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАН

Защита состоится_2002 г. в ' часов на заседании Диссертационного совета

Д501.001.76 при Московском государственном университете им. М, В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ Физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан №^ 2002 г/

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биологических наук

Н. О. Калинина

1. Общая характеристика работы 1.1 Актуальность проблемы. Первые данные в пользу генетической рекомбинации между двумя несегментированными РНК-геномами были получены на примере вируса полиомиелита и вируса ящура (Ledinko et al.. 1963: Pringle. 1965). За последнее время РНК-рекомбинация была описана для многих РНК-содержащих вирусов животных, растений и бактерий (см. обзоры King 1988: Lai. 1992: Agol 1997: Nagy and Simon. 1997: Aaziz and Tepfler. 1999). При этом частота рекомбинации у некоторых вирусов (например, у пикорна- и коронавирусов) сравнима с частотой ДНК-рекомбинации. Ясно, что РНК-рекомбинация у РНК-содержащих вирусов выполняет определенные общебиологические функции. Во-первых, она может выполнять репаративную функцию. Как известно, ни одна из вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз не обладает корректирующей активностью, что обуславливает относительно высокий уровень частоты спонтанных мутаций при репликации геномной РНК (см. обзоры Lai. 1992: Domingo et al.. 1996: Domingo and Holland. 1997). Следовательно, вирусы должны иметь определенные механизмы, которые могут устранять спонтанные мутации или компенсировать их негативное фенотипическое проявление. РНК-рекомбинация может быть таким механизмом, который за счет замены участков генома на гомологичные последовательности может устранять функционально значимые ошибки. Во-вторых. РНК-рекомбинация - один из механизмов эволюции РНК-содержащих вирусов. При этом предполагается, что образование вирусов с новыми фенотипическими признаками может идти по блочному способу, за счет передачи друг другу функционально значимых модулей посредством генетической РНК-рекомбинации (Lai. 1992: Simon and Bujarski. 1994). Таким образом, изучение механизмов рекомбинации между РНК геномами вирусов является одной из важных биологических задач.

1.2 Цель и задачи исследования. Для объяснения механизма РНК-рекомбинации разработаны две принципиально отличающиеся модели: реплнкативная и иерепликативная. В рамках репликативной модели (модель смены матрицы), перестройки молекул РНК обусловлены способностью РНК-зависимой РНК-полимсразы мешгть матрицу при репликации родительских геномов. Иерепликативная модель (модель «разрыв-лиги рование») предполагает что. рекомбинация между молекулами РНК осуществляется без участия РНК-зависимой РНК-полимеразы. за счет разрывов одних межнуклеотидиых ковалентных связей в предварительно синтезированных родительских молекулах и образования новых в дочерней молекуле.

До недавнего времени в качестве единственного механизма РНК-рекомбинашш рассматривали репликативную модель. Иерепликативная модель, довольно давно

обсуждаемая в литературе, рассматривалась большинством авторов как маловероятная. Однако нелавно в работе А. Б. Четвернна с соавторами было продемонстрировано, что рекомбинация между фрагментами сателлитной RQ РНК фага Qß может происходить по механизму, отличному от решшкативного (Chetverina et а!.. 1999).

В связи с этим, была поставлена задача выяснить возможность рекомбинации молекул РНК вируса полиомиелита по нерешшкатнвному механизму.

Для решения этой задачи было необходимо создать рекомбинациоиные партнеры, которые должны удовлетворять двум основным условиям: (1) каждый из партнеров не должен самостоятельно реплицироваться, но рекомбинация между ними должна приводить к образованию жизнеспособного вируса; (2) вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза должна появиться только после образования рекомбинантной молекулы РНК. В задачи исследования входили: а) разработка условий, в которых рекомбинация будет наиболее эффективна; Ь) изучение механизма нерепликативной рекомбинации между полученными партнерами.

1.3 Научная новизна и практическая ценность. В ходе выполнения работы, в качестве рекомбинационных партнеров были использованы неинфекционные взаимодополняющие 5'- и З'-фрагменты геномной РНК полиовируса. Впервые было показано, что совместная трансфекция монослоя клеток неинфекционными 5'- и 3*-фрагментами полиовирусной РНК приводит к образованию инфекционного потомства, которое было представлено истинными рекомбинантами между этими фрагментами. Поскольку образование вирусной РНК-полимеразы до акта рекомбинации было блокировано, впервые было получено большое количество рекомбинантов полиовируса (около 850) по нерепликативному механизму. Данные, полученные при использовании РНК 5'-фрагмента с модифицированным 3'-концевым нуклеотидом. позволили предположить гипотетический механизм нерепликативной рекомбинации. Впервые были получены данные, указывающие на участие критической рибозимной активности полиовирусной РНК в нерепликативной рекомбинации. Разработаны экспериментальные подходы, с помощью которых возможно .изучение новых фундаментальных и прикладных acneicroe генетической РНК-рекомбинации.

1.4 Лпиобаиия работы и публикации. По материалам диссертации опубликована одна статья. Материалы работы были доложены на V-ом Международном симпозиуме "Вирусы с позитивным РНК-геномом". Х-ой международной конференции «Молекулярная биология пикорнавирусов» (Германия. 1998). на научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», посвященной 90-летию со дня рождения М. П. Чумакова, на XI-ой международной конференции «Молекулярная биология

пикорнавирусов» (Италия. 2000) и на семинарах в институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова.

1.5 Стр\-ктхуа диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на/$9страницах машинописного текста и содержит^рисунков и 10 таблиц.

2. Результаты и обсуждение

2.1 Конструирование 5'- и З'-фрагментов геномной РНК вируса полиомиелита

Для решения поставленной задачи в качестве рекомбинационных партнеров использовали взаимодополняющие фрагменты геномной РНК вируса полиомиелита.

Поскольку ожидалось, что большинство рекомбинантов. образовавшихся по нерепликативному механизму, будут негомологичными, было решено конструировать фрагменты с таким расчетом, чтобы предполагаемые места перекреста концентрировались на участке между IR£Som (точнее олигопиримидин-АЧТОчи тандемом) и стартовым кодоном AUGi^s. т. е. на участке между положениями 586-743. Здесь разрешены существенные перестройки первичной структуры без ущерба для инфекционности вируса (Kuge and Nomoto. 1987: Pilipenko el al„ 1992: Gmyl et al„ 1993; Slobodskaya el ai, 1996). При этом отсутствие явного селективного давления на структуру рекомбинанта на данном участке позволит получить относительно полную и объективную информацию о распределении и структуре мест перекреста у рекомбинантов.

Было сконструировано два вида молекул РНК вируса полиомиелита, которые назвали 5'-и 3"-фрагментами (рис. 1).

5"-фрагменты содержали интактную последовательность 5"-НТО полиовируса. которая заканчивалась на участке между IRESom и стартовым кодоном AUG743 Следовательно, у всех 5'-фрагментов отсутствует участок генома, кодирующий полнпротеии и содержащий З'-НТО. З'-фрагменты содержали участки, отсутствующие у 5'-фрагментов (участок генома, кодирующий полипротеин, и содержащий З'-НТО). При этом все З'-фрагменты содержат летальные изменения в трансляционных и репликативных цис-элементах 5'-НТО. Таким образом, образование жизнеспособного вируса возможно только в том случае, если произойдет рекомбинация между 3"- и 5'-фрагментами на участке между положениями 586 и 743.

Было создано три З'-фрагмента (рис. 1). У фрагмента ДВВ был удален участок генома 225-669. Такая деления приводит к удалению всего IRESa - cis-элемента.

з

осуществляющего кеп-независимую инициацию трансляции (Pelletier and Sonenberg, 1988; Pelletier et al., 1988).

У фрагмента, обозначенного PA2, часть олигопиримидинового блока [î6oUUCCWUU<67] была заменена олиго-А последовательностью [А]я. Данная замена полностью ингибирует способность 5*-НТО скушествлять кеп-независимую инициацию трансляции. Таким образом. РА2 и ДВВ фрагменты не могут транслироваться с образованием вирусных белков.

5'- фрагмент Э'-фрошеит

„ , З'-жмгаоий Добавленные Удаленны*

- ' У-Фрммсиг аауусяыД ит. иуклеотилы У- фрялишт радио«

BN «4« UC ABB BB

BY m AWAGAGAVC Ab L

BG_m_AGAUC РАЗ нет

Рис. 1. Схематичное изображение 3'- и 5'-фрагментов геномной РНК вируса полиомиелита, использованных для изучения рекомбинации. Сплошные линии соответствуют сегментам вирусного генома; черный прямоугольник обозначает инвертированный участок вирусной РНК (его координаты обозначены как п'). Критический (положение 586) и иниииаторный (положение 743) AUG триплеты обозначены белой и черной звездами, соответственно. Нативный и измененный (замена на олиго-А последовательность) олигопирнмндиновый мотав выделены белым и черным ромбом, соответственно. Маркерные мутации 5'-фрагмента в положения 451 и 552. обозначены черными точками. Границы решшкативного (oriL) и трансляционного (IRES) элементов показаны на схеме 5'-фрагмента. Координаты З'-кониевых вирусных нуклеотидов и невирусные нуклеотиды, добавленные к 3'-кониу 5'-фрагментов, а также сегменты, удаленные у различных 3'-фрагментов, указаны в таблицах. Удаленные участки 5'-НТО З'-фрагмента у конструкций AL и ДВВ обозначены серыми прямоугольными фигурами, соответственно. ОРС - открытая рамка считывания. НТО -нетранслируемая область.

Дополнительно был создан еще один З'-фрагмент, названный AL. У данного фрагмента, наряду с заменой части олигопиримидинового блока [560UUCCUUUU567] на олиго-А последовательность (аналогично конструкции РА2). отсутствуют первые сто нуклеотидов. которые формируют репликативный cis-элемент oriL. Инициация синтеза плюс и минус цепи полиовирусной РНК требует наличие нативной структуры репликативного элемента oriL (Andino et а!.. 1993; Gamamik and Andino. 1998: Herold and

Andino. 2001; Barton et al.. 2001: Lyons et al., 2001). Таким образом, наряду с блокировкой трансляции и инициации синтеза плюс цепи геномной РНК. у фрагмента Д1 маловероятна инициация синтеза минус цепн геномной РНК.

Также было создано три варианта 5'-фрагмента (рис. 1). BN-фрагмент. хтнной 650 нт.. содержит первые 648 нт. РНК вируса полиомиелита и два дополнительных 3'-концевых нематричных нуклеотида UC. BG-фрагмент. хтиной 674 нт.. содержит первые 669 нт. вирусной РНК и пять З'-концевых нематричных нуклеотида AGAUC. BY-фрагмент, хтиной 659 нт.. содержит первые 649 нт. вирусной РНК и десять З'-концевых нематричных нуклеотидов AUUAGAGAUC.

Все 5~-фрагменты содержат 3"-концевые невирусные последовательности различной длины. Данные 3'-концевые невирусные нуклеотиды выполняют функцию маркеров, с помощью которых можно точно картировать место перекреста на 3"-фрагменте в том случае, если образуются рекомбинанты. в состав которых последовательность 5"-фрагмента будет входить полностью. Также возможно образование рекомбинантов. в состав1 которых будет входить усеченная с 3"-конца последовательность 5'-фрагмента. Чтобы подтвердить, что 5"-НТО рекомбинантньгх вирусов произошла от 5'-фрагмента. все конструкции содержат точечные маркерные мутации в положении 451 и 552 (C45i=>AG. G;5:=>UC).

Для того, чтобы относительно точно (до нескольких нуклеотидов) картировать места перекреста рекомбинантов на участке между олнгопиримиднн-А1ГС58(, тандемом и стартовым кодоном AUG7.13- необходимо обеспечить различие первичной структуры у З'-н 5"-фрагментов на данном участке. Для этого у З'-фрагментов были инвертированы участки генома 633-729 (у фрагментов РА2 и AL) и 633-669 (у фрагмента ДВВ). При этом участок между положениями 568-634 (67 нуклеотидов) остается идентичным для всех фрагментов. Кроме того, подобная инверсия позволяет молекулам З'-фрагмента взаимодействовать с З'-концевым участком 5'-фрагментов с образованием совершенного межмолекулярного гетеродуплекса. Предполагалось, что образование гетеродуплскса у фрагментов на разрешенном для рекомбинации участке (между IRESom и стартовым кодоном AUG74j) повысит эффективность (частоту) негомологичной рекомбинации. Для проверки данного предположения использовали три конструкции 5'-фрагмента. которые различаются протяженностью и структурой предполагаемого гетеродуплекса с 3'-фрагментом.

Ни один из транскриптов. полученных с плазмид 5'-фрагментов (pT7PVl/54-BN. -BG: -BY) и З'-фрагментов (pT7PVl/SNR-PA2. -ДВВ: -AL), не был инфекционным при трансфекции клеток КПЗМ. Притом, что трансфекцию повторяли многократно и

использовали как длительные периоды инкубации (до 27 дней), так и большие количества транскрюгга (до 2 мкг на 106 клеток).

2.2 Неинфекциоиные фрагменты геномной РНК вируса полиомиелита могут рекомбиннровать с образованием инфекционного потомства

Как только для трансфекции использовали смесь 5'- и 3'-фрагментов (1 мкг каждого) в любой комбинации, получали инфекционное потомство. Бляшки появлялись на 3-6 день после трансфекции. Анализ первичной структуры показал, что данные вирусные РНК являются рекомбинантами между 3'- и 5'-фрагментами (рис. 2).

Все рекомбинанты содержали маркерные мутации 5'-фрагмента (в положении 451 и 552) и характерную для З'-фрагмента первичную структуру инвертированного участка перед стартовым АШ-кодоном. Данные о эффективности рекомбинации между 3'- и 5'-фрагментами геномной РНК полиовируса представлены в табл. 1.

Таблица 1. Эффективность рекомбинации между взаимодополняющими 3'- и 5'-фрагментами геномной РНК полиовируса

Транскрнпт Транскрипт плазмид 3'-фрагментов"

плазмид 5'-

фрагментов рТ7РУШШ-РА2 рТ7РУ1/5Ш-ДВВ рТ7РУ1/8Ж-ДЬ

РТ7РУ1/ВО 1.5±0.5 1.5±1.0 1.75±1.25

РТ7РУ1/ВУ 0,75±0.35 1.0±0.0 0.5±0.5

РТ7РУ1/Ш 0.7510.35 0.75±0.35 0.2±0.32

11 Для трансфекции использовали смесь 3'- и 5'-фрагментов (1 мкг каждого). Приведено среднее число бляшек на флакон, на 6 день после трансфекции ± стандартное отклонение.

Таким образом, эффективность рекомбинации примерно одинакова при любой комбинации 3'- и 5'-фрагментов.

Подавляющее большинство мест перекреста рекомбинантов картировано на участке между ГОЕЗом и стартовым А1ГО-кодоном. Только у 14 %рекомбинантов места перекреста на 3'- и 5'-фрагментах находились на участке 568-634 (область гомологии 3'- и 5'-фрагментов), Таким образом, большинство полученных рекомбинантов являются негомологичными. Места перекреста на 3'- и 5'-фрагментах располагаются неравномерно, формируя "горячие точки" (рис. 2). При этом если у нескольких рекомбинантов места перекреста на 5'-фрагменте идентичны (формируют "горячие точки"), то места перекреста на З'-фрагменте у этих рекомбинантов, как правило, не совпадают. В большинстве случаев места перекреста определены с достаточно высокой степенью точности, так как участки

гомологии межлу фрагментами в месте перекреста составляли от 0 до 7 нуклеотидов. При этом у подавляющего количества рекомбинантов область гомологии составляла от 0 до 2 нуклеотидов.

5'-фра г ме нт

? V

V 1 1 1 7 V «V £

bn

юш&тх:

«I ------- -------------- ---------- ^

37 avöC

3' -фр а г ме нт

ир иЭ w '^у/

«f was I___—

V %/в

^ 7 __7 7 ^

МЗвДОвр'

Рис. 2. Локализация мест перекреста на 5"- и 3"-фрагментах. Места перекреста рекомбинантов. которые расположены ближе к З'-концу от нуклеотида 648. обозначены отдельно для каждого 5'-фрагмента. Места перекреста обозначены или вертикальными линиями (если картирование возможно с точностью до нуклеотида) или треугольником (если место перекреста содержит гомологичные обоим фрагментам нуклеотиды). Гомологичный участок 3'- и 5~-фрагментов выделен курсивом. Нуклеотиды инвертированной) участка 3"-фрагментов (позиции 633-671 у ABB. 633-729 у РА2 и AL) обозначены как п'. Стартовый AUG-кодон выделен . Участки между положениями 633'-736 и 559-568 соответствуют сайту для рестриктазы Ball и олиго-А последовательности, соответственно. Нуклеотиды 3'- и 5'-фрагментов, участвующие в образовании гетеродуплекса. обозначены черными линиями (длинная линия соответствует BG-. короткая - BN- и BY-фрагменгам). Предполагаемый каталитический мотив рибозима типа hammerhead затенен. Черными вертикальными стрелками показаны возможные сайты автокаталитического разрыва (а. Ь. с) предполагаемыми рибозимами А. В и С. соответственно. Обозначены места перекреста рекомбинантов в экспериментах с: BGxPA2 - I. 3. 5. 8. 15. 21. 25. 31. 32. 35. 36: BG/ABB - 26. 30. 33. 34. 37. 38: BNxPA2 - 2. 4. 6. 10. 11. 17. 22. 23. 27. 28: BN* ABB - 7. 14. 18. 19.29: BN'xAL-9. 12. 13: BYxPA2-24: BYxABB - 20. 39.40: BYxAL - 16.

Итак, при парной трансфекции 3"- и 5"-фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита, которые не могут транслироваться, было получено инфекционное потомство (рекомбинанты). Таким образом, образование рекомбинантов в наших экспериментах идет ло появления вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. что говорит о нерепликативном механизме рекомбинации.

2.3 Механизм нерепликативнон рекомбинации между фрагментами геномной РНК

вируса полиомиелита

Образование рекомбинантной молекулы РНК в рамках нерепликативной модели принципиально возможно по нескольким схемам. По одной из них рекомбинация может осуществляется за счет прямой атаки З'-концевым гидроксилом одной молекулы РНК фосфодиэфирной связи другой РНК (см. обзор Cheh and Bass. 1986). Согласно данным Chetverin el al. (1997) и Chetverina el al. (1999). рекомбинация между 5'- и З'-фрагментами сателлитной RQ РНК фага QP, в присутствии РНК-полимеразы данного фага может идти по данному механизму (реакция нуклеофильного замещения), при этом, в состав большей части рекомбинантных RQ РНК входит полная последовательность 5'-фрагмента.

В рамках другой гипотетической схемы, образование рекомбинанта осуществляется с помощью двух последовательных реакций. На первом этапе происходит разрыв межнуклеотидной связи у каждой из родительских РНК. Образование рекомбинанта идет за счет перекрестного лигирования образующихся концевых нуклеотидов. Данной схеме соответствуют два механизма, которые различаются химической структурой концевых нуклеотидов. участвующих в образовании стандартной фосфодиэфирной связи. Согласно одному механизму, межнуклеотидные связи родительских РНК разрываются с образованием З'-концевого гидроксила и 5'-коицевого фосфата. Данные концевые нуклеотиды могут быть использованы для перекрестного лигирования РНК-лигазами. например. РНК-лигазой фага Т4 (см. обзор Adams et al„ 1986). Второй механизм, предполагает разрыв межнуклеотидных связей родительских РНК с образованием 2". 3"-циклофосфата и 5'-гидроксила. Молекулы РНК с данной химической структурой концевых нуклеотидов могут быть лигированы, например. РНК-лигазной активностью клетки.

Чтобы получить информацию о возможном механизме нерепликативной рекомбинации в наших экспериментах, было решено выяснить, как частота рекомбинации зависит от структуры З'-кониевого нуклеотида 5'-фрагмента, Для этого, наряду с исходным 5'-фрагментом. использовали ^'-фрагмент после последовательных обработок:

(1) периодатом: (2) анилином; (3) щелочной фосфатазой. Изменение структуры 3'-

концевого участка 5'-фрагмента при данных модификациях изображены на рнс. 3.

Ряс. 3. Схематичное изображение изменения химического строения 3'-концевого нуклеотида 5"-фрагмента при различных модификациях. (А) Обработка РНК 5'-фрапмента солями йодной кислоты приводит к разрыву ковалентной С"-С* связи рнбозы 3'-концевого нуклеотида (выделен пунктиром) с образованием диальдегнда. (В) В результате последующего взаимодействия с анилином РНК э'-фрагмента становиться на один нуклеотид короче, при этом, образовавшийся 3"-концевой нуклеотид содержит 3 "-концевой монофосфат, (с) Последующая обработка щелочной фосфатазой удаляет З'-конпевой фосфат с возобновлением цис-гликольной группы 3"-концевого нуклеотида.

Бьши использованы 5'фрагменты (всех конструкций) после каждой модификации. Результаты экспериментов с использованием конструкций ВЫ и ДЬ представлены в табл. 2. Окисление 3'-концевого нуклеотида 5"-фрагмента периодатом увеличивало выход рекомбинантов в несколько раз. Последующая обработка анилином не сопровождалась каким-либо дальнейшим изменением выхода рекомбинантов. Однако, обработка 5'-фрагмента щелочной фосфатазой вызывала снижение выхода до значений, характерных для неокисленного 5'-фрагмента.

Таблица 2. Эффекг модификации 3"-концевого нуклеотида 5"-фрагмента на эффективность рекомбинации между фрагментами ВЫ и ДЬ

Характер модификации З'-концевого нуклеотида 5 -фрагмента Количество бляшек на мкг РНКа

3 день 4 день

Без обработки 0 4,3 + 4.7

№104 11.2 ±4.1 слив

ЫаЮд + анилин 9.2 ± 2.8 слив

ЫаЮа + анилин + фосфатаза 0.3 ± 0.5 0.5 ± 1.0

Без обработки 0 2.0 ± 1.7

рСр лигирование 8.5 4 2.6 10.5 + 3.1

* Показано среднее числом бляшек на флакон ± стандартное отклонение. Слнв - невозможно точно определить количество бляшек из-за отсутствия четких границ между ними.

n3

Л- он /V- он /гон -1' 1

А

n3

/у он /-он /""0-2' ' " ~ Р-^-о- О -3 •

1

анилин

Л- он Л- он -2 '

1

фосфатаза

/\- он Л- он ■ ^о-^он -Г

Определение первичной структуры мест перекреста у рекомбинантов. полученных в экспериментах с модифицированным э'-фрагментом (окисление, обработка анилином), выявило появление нового класса рекомбинантов. Появились рекомбинанты (- 40 %). в состав которых последовательность 5'-фрагмента входила полностью (табл. 3: рис. 4). При этом большинство рекомбинантов. в состав которых последовательность 5"-фрагмента входила полностью, в месте перекреста между последним нуклеотидом 5'-фрагмента и первым нуклеотидом 3"-фрагмента содержали чужеродные вставки различной длины.

Таблица 3. Эффект модификации З'-концевого нуклеотида 5'-фрагмента на структуру рекомбинантов при использовании конструкций BN и ЛЬ

Характер модификации 3'-кониевого нуклеотида 5'-фрагмента Количество рекомбинантов

Общее С укороченной последовательностью 5'-фрагмента в составе рекомбинанта С полной последовательностью 5'-фрагмента в составе рекомбинанта

Без обработки 40 40 0

N3104 25 15 10(40%)

№104 + анилин 18 11 7 (39%)

№104 +■ анилин + фосфатаза 4 4 0

рСр липнрование 18 10 8 (44%)

Мы предположили, что увеличение выхода рекомбинантов в несколько раз и появление нового класса рекомбинантов. может бьгть обусловлено образованием у большинства молекул 5'-фрагмента З'-концевого монофосфата. Для проверки данного предположения был использован 5'-фрагмент. у которого З'-концевой нуклеотид фосфорилирован в результате лигирования с 3', 5'-цитидилдифосфатом (далее рСр). Результаты экспериментов с использованием конструкций ВЫ и АЬ представлены в табл. 2 и 3. и на рис. 4. При такой модификации З'-концевого нуклеотида 5"-фрагмента выход рекомбинантов соответствовал экспериментам с использованием 5'-фрагментов, окисленных периодатом и обработанных анилином (табл. 2), Определение первичной структуры мест перекреста также показало появление класса рекомбинантов (44 %). в состав которых последовательность 5'-фрагмента входила полностью (табл. 3: рис. 4). У большинства данных рекомбинантов между последним нуклеотидом 5'-фрагмента и первым нуклеотидом 3"-фрагмента также были обнаружены чужеродные вставки различной длины. При этом у данных рекомбинантов. как правило, нуклеотид чужеродной вставки, расположенный перед первым нуклеотидом 3'-фрагмента, был представлен цитидиловым остатком (рис. 4). Следовательно, данные чужеродные вставки

входили в состав последовательности 5'-фрагмента до модификации его 3'-концевого нуклеотида.

5' -фра гмент

diJST «кадгёо»! ой)

0«yt7 ' «С

о(М) •S4

¥

v by

н и оцсасс old о(2ци)1

аЩМСМ

"ЦК 014 САС

ои!7 р5 са

оЗЭ ЕААОвСЛААС аЕСДСШиСД i31cmxgc озсииисдс

o2S АСССйА pUftCUUUC

З'-фра г ме нт

-J7ACC осмда««:

iS с

7 ?

0CWWi»7 0<Э, olsc

pi7 КЗДН.

тщт.

О 291

вахтам

изо)

__V, У У

САЮСЮХАШЗЗШЕОШЩЗ^^

рзр мэр «17 oUf

<КИ»)да(Ц,14) »lSpl

o2fi

И

Рис, 4. Локализация мест перекреста на 5'- и З'-фрагментах. Невирусные (олиго) нуклеотиды. картированные между последовательностями фрагментов а составе рекочбинанта. показаны вправо от вертикальной линии (последний нуклеотид 5'-фрагмента). Рекомоннаты, полученные в экспериментах с модифицированным 5'-фрагментом: окисление и лигирование рСр - выделены добавлением знаков о И р. соответственно. Обозначены места перекреста рекомбинантов в экспериментах с: BGxPA2 - оЗ. о4. о17-19: BGxAL - ol6: BNxPAl - ol. a2, oS. ой. o8. olO. о 13. o24. o27: BNxABB -o22: BNxiL - o7. 09. ol I. ol2. o!4, о 15. a23. o25, o26. o28-33. pl-19: BYxPA2 - o20: BYxAL - o2l, Другие обозначения - см. подписи к рис. 2.

Наиболее вероятно, что чужеродные вставки образовались в процессе транскрипции in vitro полимеразой фага Т7, Известно, что этот фермент в процессе транскрипции in vitro, при отсутствии сигналов термииации на ДНК-матрице способен удлинять З'-кониевой участок синтезированного транскрипта. При этом довесок, как правило, формирует относительно стабильную 3'-концевую шпильку (Triuna-Aloazo et al.. 1495). Действительно, в большинстве случаев у рекомбинантов. содержащих полите

последовательность 5'-фрагмента, чужеродные вставки потенциально способны образовать шпилечные структуры на З'-кониевом участке 5'-фрагмента (рис. 5).

032 5'-фрагмепт: о29

619 619

У У А

}^тавшх1асшссасас1ЛЛ1Я!вл-а ккааввктазссихсвапа\А в0 5 ,:АМйШаА ЛЬЬЬШЛЛ(зАс

оЗО р!7

619 <24

V „в у

5'- ЛАШооАоосесопссоетеАААо0 А Б'-алтоотссАПССвот-ОААытсАд """"апла ШШйоА

Рис. 5. Предполагаемая структура З'-концевого участка РНК 5"-фрагмента (BN-конструкция). Чужеродная (невирусная) последовательность (затенена) предположительно образуется за счет вторичного удлинения молекулы РНК 5'-фрагмента Т7 РНК-полимеразой при транскрипции in vitro.

Таким образом. образование рекомбинантов. содержащих полную последовательность 5'-фрагмента. определяется наличием З'-концевого монофосфата.

Достаточно трудно объяснить, как З'-концевой монофосфат 5'-фрагмента повышает эффективность лигирования. Однако существует клеточный фермент - циклаза З'-концевого фосфата, которая АТФ-зависимо переводит З'-концевой монофосфат в 2', З'-циклофосфат (Filipowicz and Shatkin. 1983; Filipowicz et al.. 1983. 1985. 1998). Циклаза З'-концевого фосфата может использовать в качестве субстрата различные высокомолекулярные РНК и синтетические олигонуклеотиды (Filipowicz and Shatkin. 1983; Filipowicz et al.. 1983. 1985. 1998; Reinberg et al.. 1985: Vicente and Filipowicz, 1988: Genschik et al.. 1997). При этом даже небольшого количества циклазы концевого 3'-монофосфата в цитоплазматическом экстракте клеток HeLa (около 2% от обшего количества на клетку) достаточно для эффективной циклизации концевого З'-фосфата у различных РНК (Filipowicz et al.. 1983; Genschik et al.. 1997). Таким образом, можно предположить, что в клетке циклизация концевого 3"-монофосфата возможна и у 5'-фрагмента геномной РНК полиовируса.

Как известно, клетки животных содержат две биохимически различные PHK-лигазные активности, которые эффективно лигаруют молекулы РНК. содержащие концевые 5'-гидроксил н 2". З'-циклофосфат (Perkins et а!.. 1985; Reid and Lazinski. 2000). Таким образом, образование рекомбинанта принципиально возможно за счет лигирования 5'- и 3'- фрагментов, содержащих концевые 2'. З'-циклофосфат и 5'-гидроксил. соответственно. Более того, согласно данным Filipowicz et al. (1983). экстракт клеток HeLa. содержащий как циклазу концевого З'-фосфата. так и РНК-лигазу. способен

лигировать синтетические олигонуклеотиды. содержащие З'-концевой монофосфат и 5'-концевой гидроксил. При этом эффективность лигирования олигонуклеотида. с данной структурой 3"-концевого нуклеотида. абсолютно зависела от присутствия циклазы концевого 3"-фосфата (РШроичсг ег а1.. 1983). Таким образом, нереплнкатнвная рекомбинация между фрагментами геномной РНК полиовируса в наших экспериментах предположительно может протекать по двухстадийной схеме (рис. 6):

5'РРР- .

5РРР-

5'-фрагмент

*L3,P

циклаза З'-концевого фосфата РНК

2

З'-фрагмент лнгнрованне

-З'ОН

рекомбинантная РНК

Рис. 6. Гипотетическая модель нереплнкативной рекомбинации между 3'- и 5"-фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита. (1) З'-концевон монофосфат 5"-фрагменга (тонкая линия) переводится в циклическую форму (2\ З'-ииклофосфат) при помоши циклазы концевого З'-фоефата. (2) Образование стандартной 3". 5"-фосфодиэфирной связи между 5'-фрагментом и З'-фрагментом (утолщенная линия) идет за счет реакции трансэтерификации. где 5'-концевой гидроксил 3"-фрагмента является нуклеофилом.

2.4 Изучение возможного участия критических рибозимов типа hammerhead в

рекомбинации между фрагментами геномной РНК внруса полиомиелита

Места перекреста на 5'- и 3 "-фрагментах формируют несколько точек кластеризации («горячие точки»), В рамках нереплнкативной модели, концентрация мест перекреста на отдельных сайтах может быть обусловлена тремя причинами.

( 1 ) Высокой частотой разрыва определенной ковалентной межнуклеотндной связи.

(2) Высокой частотой лигирования фрагментов, после разрыва по данным связям.

(3) Двумя выше указанными причинами одновременно.

Анализируя расположение горячих точек на 5'-фрагменте (BG-конструкцяя). можно заметить, что на З'-концевом участке данного фрагмента на некотором расстоянии к З'-концу от мотива 6з81ЮАААыз расположена «горячая область» (рекомбинанты 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37: см. рис. 2)

(a) I I 5'

N • N N • N A * U

A~~ "k

5'—NNNY- / iNNN"

-nnnra

~GNaG~

(b)

A -A

G G U • A G- С

6,35 aA- ' -г^Г jG~ ^AUUA

5>—CGGU— ^AUUA U CUAUCUGyyUG-3' 327—UCUGAq gUCGGAUucGAUGUGAGACCCC — 298

G A С

В A • U G • С

H'u 31,32,33,34

6,35 '

5'- CGGU—~ -""ТСУ* и ? V Q U U U-3' 327 -UCUGa у CGGAUUC G AUGUGAGACCCC-298

С Vif

f ' A

у

635 .A • U __ 36,37

CGGUfi- ^UCUG U UUGCUA-3' 327- UCUGaguaSUCGGAUu ^All GUGAGACCCC 298

Рис. 7. Гипотетическая модель образования горячих точек на З'-кониевом участке 5'-фрагмента (BG-конструкиия) за счет криптической рибозимной активности полиовирусной РНК. (а) Консенсусная структура рибозима hammerhead, где N - это любой нуклеотид, а Н - любой, кроме G. Подчеркиванием выделены консервативные нуклеотиды, образующие каталитический центр (R - пурин, a Y - пиримидин). Сайт автокаталнтнческого разрыва обозначен стрелкой. (Ь) Предполагаемые варианты фолдинга З'-кониевого участка 5'-фрагмента (нт. 635-665) с образованием криптических рибозимов типа hammerhead (А. В и С). Стрелками обозначены предполагаемые сайты автокаталитического разрыва, которые совпадают с местами перекреста рекомбинантов (см. так же рис. 2). Мутация в положении 320 (A=oU: показана на структуре В) должна ннактнвировать каталитическую активность рибозима.

Компьютерный анализ первичной структуры вируса полиомиелита показал, что в 5"-НТО есть участок между положениями 300-330. который теоретически может взаимодействовать с участком 635-665 той же самой или другой молекулы РНК 5"-

фрагмента, с образованием структур (А, В и С), соответствующих консенсусной структуре рибозима типа hammerhead (рис. 7). При этом сайты разрыва межнуклеотидной связи данными структурами (критическими рибозимами В и С) совпадают с локализацией мест перекреста рекомбинантов в указанной выше «горячей области». Таким образом, если структуры критических рибозимов действительно образуются, то наличие данной «горячей области» можно объяснить более частым разрывом соответствующих межнуклеотидных связей (рис. 7 Ь).

Поскольку разрыв фосфодиэфирной связи 5'-фрагмента рибозимом типа hammerhead приведет к образованию концевого 2", З'-циклофосфата, лигирование 5"- и 3'-фрагментов (образование рекомбннанта) после разрьша данной связи может идти в рамках предложенного выше гипотетического механизма.

Для изучения возможного участия криптических рибозимов типа hammerhead в нерепликативной рекомбинации фрагментов полиовирусной РНК в каталитический центр предполагаемого рибозима на участке 295-330 была введена мутация Азм=>и (см. рис. 7 Ь). Такая замена должна полностью ингибировать автокаталитическую активность рибозима (Ruffner et al.. 1990; Symons. 1991; 1992). Как оказалось, данная мутация не сказывается на бляшечном фенотипе полиовируса и удельной инфешионности его РНК. В дальнейших экспериментах мы параллельно использовали два 5 "-фрагмента. Один фрагмент содержал только маркерные мутации (далее «исходный» 5"-фрагмент). Второй 5"-фрагмент содержал как маркерные мутации, так и замену в положении 320 (далее «мутантный» 5"-фрагмент). Наличие достоверной разницы в частоте рекомбинации в сайтах а. Ь или С у исходного и мутантного 5'-фрагментов было бы веским аргументом в пользу того, что данная «горячая область» образуется за счет эндонуклеазной активности крнптическнх рибозимов типа hammerhead. В качестве 3"-фрагмента использовали конструкцию AL. Места перекреста рекомбинантов на З'-кониевом участке исходного н мутантного 5"-фрагментов показаны на рис. 8. Количественные данные представлены в табл, 4.

При статистической обработке полученных данных (использовали критерий у'). нулевая гипотеза была сформулирована следующим образом: возможные различия по частоте рекомбинации в исследуемом сайте у исходного н мутантного 5"-фрагментов получены случайно. Альтернативная гипотеза предполагает, что возможные различия по частоте рекомбинации в исследуемом сайте у исходного и мутантного 5'-фрагментов не случайны, и могли бы определяться участием криптических рибозимов типа hammerhead в нерепликативной рекомбинации.

5' -фрагмент {ВG-конструю?ия) :

6X8-

I

353

| _домен Е_^ _домен S

UCCGUGUUOCCUUOUA[i(7l/UACii?SyGG CUGCUUAOGGOGACAAUC ACAGAUUGUUAUCAUAAAGCG

1 2ii,3

219,285,29?

223,233, 2£l*JS£i-222

229,

7

279 | 27« j/"

130.201.ЗОВ.261.307 j/7"

"a" "b" "c"

1 I 1

'•241 L-^" iss

1,27« I

»K

«19

*

AAUUGGAtfUGGCCAUCCGGiJ££££G'UGAGACZJCAUUAUC U A U С X7 GUUUGCtJA 6АДС 243,?*51 222 | 217 J лаа J 188, 258,311, 218,373, ,2111 23fi J

13,151 j/7 -221 p7 21i | 287 [/ЭТ 1,253^.255 j 2SS j/7 1В0Г181 251 [

1И 187 j 2SS.

7,281 У 17»,2Q2t25i 2£i

I 29*,Z9S,2

237,: Z34 I

232

7

Рис. 8. Локализация мест перекреста рекомбинантов на З'-концевом участке 5'-фрагмента (BG-конструкция). Рекомбинанты получены в экспериментах с использованием AL З'-фрагмента. Нанесены места перекреста рекомбинантов, полученных в экспериментах с использованием нативного (выделены жирным шрифтом) и мутантного (выделены подчеркиванием) 5'-фрагментов. Участок перекреста гомологичных рекомбинантов 194, 195, 172, 178, 184, 212, 238, 240, 278, 182, 244. 263. 265 на 3'- и 5!-фрагментах совпадает с областью гомологии данных фрагментов (67 нт. - выделены курсивом см. рис 2). Поэтому установить точно место перекреста на 3*- и 5'-фрагментах для данных рекомбинантов не представляется возможным. Предполагаемый каталитический мотив рибозима типа hammerhead выделен курсивом и подчеркнут. Черными вертикальными стрелками показаны сайты (а, Ь, с) автокаталитического разрыва гипотетическими критическими рибозимами А, В, С, соответственно. Другие обозначения - см. рис.2.

Таблица 4. Распределение мест перекреста на З'-концевом участке мутантного н исходного 5"-фрагментов (рекомбинация между ЕЮ н Д1. фрагментами)8

Исходный 5'-фрагмент Мутантный 5'-фрагмент Уровень значимости Р (а)

Общее число рекомбинантов 53 34

Количество рекомбинантов с местом перекреста в точке а 17.9% (9) 2.9% (1) 0.05

Количество рекомбинантов с местом перекреста в точке Ь 9.4% (5) 14.7% (5) 0.47

Количество рекомбинантов с местом перекреста в точке С 3.7%(2) 0 0Л5

3 Указано количество рекомбинантов. полученных на 6 день после трансфекиии. Количество рекомбинантов с местом перекреста в соответствующем сайте показано в процентах от общего числа. В скобках указано абсолютное количество рекомбинантов.

Значения уровня значимости 0.47 и 0.25. полученные при статистической обработке данных по частоте рекомбинации в сайтах Ь и С. говорят о том. что данных, подтверждающих возможность участия критических рибознмов В и С в нерепликативной рекомбинации, нами не получено.

Однако значение уровня значимости 0.05. полученное для частоты рекомбинации в

сайте а (табл. 4). говорит в пользу возможного участия криптического рибозима А в нерепликативной рекомбинации. Таким образом, концентрацию мест перекреста рекомбинантов в сайте а у исходного 5'-фрагмеита можно объяснить более эффективным разрывом данной межнуклеотидной связи криптическим рибозимом А (рис. 7).

Для проверки данного предположения был сконструирован новый З'-фрагмент. обозначенный, как ДЦ4] (рис. 9). Данная конструкция создана на основе фрагмента AL. т. е. содержит олиго-А последовательность, которая замешает часть олигопирнмидинового блока [560UUCCUUUUj67]. Однако структура 5"-НТО фрагмента ДЦ4] существенно отличается от таковой у фрагмента AL. У фрагмента ДК4) удалены первые 322 иуклеотида, формирующих как репликативный элемент oriL. так и часть IRE Sa. При этом отсутствие участка 1-322 делает невозможным участие молекулы фрагмента ДЦ4) в формировании вторичной структуры криптических рибозимов А. В и С. В этом случае криптнческие рибозимы могут образоваться только при формировании

внутримолекулярной (или межмолекулярной) вторичной структуры 5"-фрагментом. Участок 567-727. расположенный между олнго-А последовательностью и стартовым AUG-кодоном, был замещен на последовательность 642-725 полиовируса штамма Sabin 2, которая существенно отличается по первичной структуре от участка 567-727 полиовируса штамм Mahoney. Таким образом, у фрагмента ДЦ4) отсутствует область гомологии с 5'-фрагментами. Кроме того, при подобной замене невозможно образование протяженного совершенного гетеродуплекса между молекулами 3'- и 5"-фрагментов.

З'-фрагмент

З'-фрагмент Делегированный

учветок

D Ц4) L(4) and Е

Рве. 9, Схематичное изображение 5"-НТО 3'-фрагмента ДЦ4) геномной РНК вируса полиомиелита. Сплошные черные линии соответствуют участкам 5'-НТО вируса полиомиелита штамм Mahoney: черный прямоугольник обозначает участок РНК вируса полиомиелита штамм Sabin 2 (его координаты обозначены как п"). Другие обозначения-см. рис. I.

Места перекреста рекомбинантов на З'-кониевом участке исходного и мутантного 5"-фрагментов изображены на рнс. 10. Количественные данные представлены в табл. 5.

Значения уровня значимости 0.32 и 0.07 (табл. 5), полученные для частот рекомбинации в сайтах Ь и С говорят о том. что данных, подтверждающих возможность участия критических рибозимов В и С в нерепликативной рекомбинации, нами не получено. Следовательно, на основании данных двух экспериментов с использованием различных 3'-фрагментов, можно сказать, что предположение о возможном участии критических рибозимов В и С в нерепликативной РНК-рекомбинации является необоснованным. С другой стороны, достоверное различие в частоте рекомбинации по сайту а у исходного и мутантного 5"-фрагментов (Р = 0,02; табл. 5) еще раз подтверждает возможность участия критического рибозима А в нерепликативной рекомбинации.

I о

5? фрагмент

ОССООСПВССООООАООа11АиПСОвСС13вСОСАиС0ОСАСААССАСАСА13иСОиАОСАОААХССС

Ш I 5« I I

£Ь5 I

'V

I I 1

£

932.933.547,535. »«0,5«! ,542.5«, 572 531.546,«00 р7" 3«3

3» р7^ зэа,иШ7« р3" ^ Р^ е^.здг | «31,422 р7" (тез. «<п 588,700,<7*. 686 р7 531,544 .301 ,Й1,ЩЛЗ [ 803, р7" ,Ш.6Д1.Ш.зат,891 I и3 рГ 334 ¿1

т на рТ7" и?.«»? Х^^ ■ ««|

рК. 3« Г <07 .712 ■ 344. В7« П7

£25

W2.53S.SSl.5iJ

А А

С А А А С

Рис. 10. Локализация мест перекреста рекомбинантов на 3-концевом участке 5-фрагмента (ВО-констркуция). Рекомбинанты получены в экспериментах с использованием ДЬ{4) 3'-фрагмента. Невирусные нуклеотиды, картированные между последовательностями фрагментов в составе рекомбиншгга, показаны вправо от вертикальной линии (последний нуклеотид б'-фрагмента). Другие обозначения - см. рис.

Таблица 5. Распределение мест перекреста у исходного и мутантного 5"-фрагментов (рекомбинация между BG и ДЦ4) фрагментами)3

Исходный 5'-фрагмент Мутантный 5"-фрагмент Уровень значимости Р(а)

Общее число рекомбинантов 47 49

Количество рекомбинантов с местом перекреста в точке Я 34% (16) 14,2% (7) 0.02

Количество рекомбннантов с местом перекреста в точке Ь 12.7% (б) 20.4% (10) 0,32

Количество рекомбинантов с местом перекреста в точке С 6,3% (3) 0 0.07

а Указано количество рекомбннантов, полученных в одном опыте на 6 день после трансфекции. Количество рекомбинантов с местом перекреста в соответствующем сайте показано в процентах от общего числа. В скобках указано абсолютное количество рекомбинантов.

Однако необходимо отметить, что в данном эксперименте и при использовании мутантного 5"-фрагмента обнаруживается существенное количество рекомбинантов с

местом перекреста в сайте а (14,2%). Кроме того, нужно обратить внимание на то. что в

исходных экспериментах (рис. 2) горячей точки в сайте а обнаружено не было.

Отсутствие постоянного характера распределение горячих точек в исследуемой «горячей области», а также обнаружение рекомбинантов с местом перекреста в точке а при использовании мутантного 5'-фрагмента может говорить о том. что разрыв межнуклеотидной связи криптическим рибозимом типа hammerhead является лишь одним из факторов, определяющих существование и локализацию этой горячей точки.

Таким образом, полученные данные указывают на возможное участие криптнческой рибозимной активности полиовирусной РНК в нерепликативной рекомбинации. Однако возникает вопрос о том. какой количественный вклад она вносит в рекомбинацию. Для ответа на этот вопрос требуются дополнительные исследования.

Выводы

1. Показана возможность образования инфекционной РНК путем нерепликативной рекомбинации между взаимодополняющими 5'- и 3'-фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита, которые не способны самостоятельно транслироваться и реплицироваться.

2. Выявлено два класса рекомбинантов: (1) рехомбинанты. содержащие в своем составе полную последовательность 5'-фрагмента: (2) рекомбинаиты. места перекреста которых располагаются на внутренних участках обоих фрагментов.

3. Для эффективного образования рекомбинантов первого класса требуется наличие З'-концевого монофосфата у 5"-фрагмента. Предложена гипотетическая модель образования таких рекомбинантов.

4. Места перекреста рекомбинантов второго класса на 3"- и 5'-фрагментах располагаются неравномерно, формируя "горячие точки". Получены указания на возможное участие критической рибозимной активности полиовирусной РНК в образовании одной из этих «горячих точек». Однако вопрос о том. какой количественный вклад в рекомбинацию вносит криптический рибозим. требует дополнительных исследований.

Благодарности

Я глубоко признателен моим научным руководителям, профессору В. И. Аголу н в. н. с. А. Р. Гмылю. за предложенную тему работы и возможность пройти настоящую научную школу. Я так же благодарен Е. В. Хитриной, ¡С. В. Масловой.] С. А. Коршенко. в сотрудничестве с которыми была выполнена часть исследований. Большое спасибо всем сотрудникам лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН, а также сотрудникам лаборатории молекулярной эпидемиологии полиовируса НИИ Физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ. поддержку и содействие которых я ощущал постоянно.

Слисок работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Gmyl А. P., Belousov Е. V.. Masiova S. V.. Khitrina Е. V.. and Agol V. I. Nonreplicative RNA recombination in poliovirus. 1999. J. Virol., v. 73. p. 8958-8965.

2. Agol V. I.. Gmyl A. P., Belousov E, V.. Masiova S. V.. Khitrina E. V.. and Chetverin A. B. Rescue of viable poliovirus by nongomologus recombination between nontanslatable and nonreplicating parts of it's RNA. Vth International Symposium on Positive Strand RNA viruses. 23-28 May 1998. St. Petersburg, USA. Pl-06.

3. Gmyl A. P., Belousov E. V„ Masiova S. V.. and Agol V. 1. Non homologous recombination between mutually supplementing parts of Picomavinis RNA due to ribosime-like reaction? Xth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. 5-11 September 1998, Jena, Germany. V-36.

4. А. П. Гмыль. E. В. Белоусов, С. А. Коршенко, E. В. Хитрина. С. В. Маслова и В. И. Агол. Нерепликативная рекомбинация между фрагментами полиовирусной РНК. «Актуальные проблемы медицинской вирусологии». Москва. 23-25 ноября 1999 г., ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН. стр. 81

5. Gmyl. А. P., Belousov, Е. V., Korshenko, S. А„ Khitrina Е. V.. and Agol. V. I, Dissecting nonreplicative poliovirus RNA recombination into the breakage and ligation steps. XI th. Meeting of the European Study Group on Molecular Biology of Picornaviruses. 25-31 May 2000. Baia delle Zagare (Mattinata), Italy. G-16.

Отпечатано в копииентре «Учебная полиграфия» Москва, Воробьевы горы, МГУ, 1 ГуманитрныП корпус.

www.sinrint.ru e-mail: zakaz@stpritit.ru Заказ №172, тираж 100 экз. Подписано п печать 17.04.2002

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белоусов, Евгений Валерьевич

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1 Механизмы генетической рекомбинации РНК-содержащих вирусов.

2.1.1 Репликативная модель смены матрицы.

2.1.2 Модель разрыв-лигирование.

2.1.3 Возможные механизмы нерепликативной рекомбинации.

2.2 Структура 5 '-НТО вируса полиомиелита.

3 Материалы и методы

3.1 Ферменты и реактивы.

3.2 Плазмиды.

3.3 Бактериальные штаммы.;.!.

3.4 Синтетические олигонуклеотиды.

3.5 Базовые методы молекулярного клонирования.

3.6 Направляемый олигонуклеотидами мутагенез.

3.7 Получение полноразмерных мутантных клонов полиовирусной кДНК.

3.8 Создание рабочих конструкций.

3.9. Получение полноразмерных транскриптов.

3.10 Трансфекция монослоя культуры клеток.

3.11 Анализ вирусных клонов.

3.12 Модификация 3'-концевого нуклеотида РНК 5 '-фрагмента.

4. Результаты. 4.1 Конструирование 5'-и 3 '-фрагментов геномной РНК вируса полиомиелита .94 4.2 Неинфекционные фрагменты геномной РНК могут рекомбинировать с образованием инфекционного потомства.

4.3 Влияние структуры 3'-концевого нуклеотида 5'-фрагмента на эффективность рекомбинации и распределение мест перекреста.

4.4 Изучение возможного участия криптических рибозимов типа hammerhead в рекомбинации между фрагментами РНК.

5.0бсуждение результатов.

5.1 Рекомбинация между фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита идет по нерепликативному механизму.

5.2 Механизм нерепликативнойрекомбинации между фрагментами РНК.

5.2.1 Образование рекомбинантов, содержащих полную последовательность 5'-фрагмента.

5.2.2 Участие криптических рибозимов типа hammerhead в нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК вируса полиомиелита.

6. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Некоторые аспекты нерепликативной рекомбинации между фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита"

РНК-рекомбинация - процесс образования новых (дочерних) последовательностей РНК из двух или нескольких предшествующих (родительских) молекул РНК. Под такое определение рекомбинации попадают известные различные перестройки РНК-геномов, такие как вставки, делеции, образование химерных молекул РНК.

Первые данные в пользу генетической рекомбинации между двумя несегментированными РНК-геномами были получены на примере вируса полиомиелита (Ledinko et al., 1963). Смешанная инфекция двумя штаммами полиовируса, несущими разные фенотипические маркеры (такие, как устойчивость к небольшим концентрациям гуанидина.НС1 или ингибиторам, присутствующим в некоторых пулах лошадиной или бычьей сыворотки), приводила к появлению вариантов вируса, содержащих оба фенотипических маркера. Так как частота появления вируса с «двойным» фенотипом была выше, чем частота спонтанных мутаций, было предположено, что образовавшийся вирус является продуктом рекомбинации между молекулами РНК исходных вирусов. Используя тот же подход, было показано, что вирус ящура также способен рекомбинировать с образованием вирусов с «двойным» фенотипом (Pringle, 1965).

P. D. Cooper с соавторами, используя набор температурочувствительных мутантов полиовируса, определял частоту рекомбинации между разными парами маркеров. Обнаруженные частоты рекомбинации позволили построить карты сцепления данных маркеров, где расстояние между маркерами было пропорционально частоте рекомбинации между ними (Cooper, 1968). Полученные частоты рекомбинации были аддитивны по отношению к любой паре маркеров и позволяли расположить их линейно по геному. Несколько позднее подобные карты были получены для вируса ящура (Lake et al., 1975; McCahon et al., 1977). Возможность построения таких карт является сильным аргументом в пользу рекомбинации между РНК-геномами (Lai, 1992). Дальнейшие исследования показали (McCahon et al., 1885; Kirkergaard and Baltimore, 1986; Agut et al., 1987; King 1988a), что места перекреста у рекомбинантов принципиально могут располагаться на любом участке вирусного генома (см. также обзоры King, 1988b; Lai, 1992; Agol, 1997).

Первые биохимические доказательства в пользу РНК-рекомбинации были получены в результате анализа структурных и неструктурных белков рекомбинантных вирусов полиомиелита (Romanova et al., 1980; Tolskaya et al., 1983) и вируса ящура (King et al., 1982).

Определение первичной структуры мест перекреста рекомбинантных вирусов окончательно доказало, что их последовательности произошли от разных молекул РНК (Romanova et al., 1986; Kirkegaard and Baltimore, 1986).

Вторым семейством РНК-содержащих вирусов, на представителях которого была доказана возможность рекомбинации между РНК геномами, являются коронавирусы (см. обзор Lai, 1992). При смешанной инфекции двумя различными штаммами (А59 и JHM) вируса мышиного гепатита (MHV), содержащих в качестве фенотипических маркеров температурочувствительные мутации, при непермиссивной температуре было получено инфекционное потомство (Lai, 1985). Полученный вирус был представлен рекомбинантной РНК, содержащей 5'-концевой участок (приблизительно 3000 нт) от геномной РНК JHM, тогда как остальная часть вирусного генома соответствовала штаму А59 (Lai, 1985).

В дальнейшем рекомбинанты у коронавирусов были получены при использовании в качестве фенотипических маркеров температурочувствительных мутаций (Keck et al., 1987, 1988; Makino et al.,

1986), способность вызывать слияние клеток, устойчивость к нейтрализующему действию моноклональных антител (Makino et al., 1987). Характерной особенностью рекомбинации коронавирусов является наличие множественных мест перекреста. Места перекреста располагались не только на участке между селективными маркерами, но и за его пределами (Makino et al., 1987; Keck et al., 1988). Так как эти случаи рекомбинации не требовали какого-либо селективного давления, то подобная структура рекомбинантов говорит о высоком рекомбинационном потенциале геномной РНК коронавирусов (Lai, 1992). И хотя первые данные свидетельствовали, что места перекреста концентрируются в 5'-концевой области генома (Lai et al., 1985; Makino et al.,1986; Keck et al.,

1987), в последующих работах были описаны рекомбинанты, места перекреста которых были распределены по всему геному соответствующих вирусов (Makino et al., 1987; Keck et al., 1988).

Полученные частоты рекомбинации при скрещивании вирусов мышиного гепатита [А59], содержащих различные температурочувствительных мутации, так же позволили построить линейную аддитивную карту сцепления данных фенотипических маркеров на 5'-участке генома длинной 23000 нуклеотидов. (Baric etal., 1990).

Впервые РНК-рекомбинация у вирусов растений была продемонстрирована у представителей семейств: бромовирусов (вирус мозаики костра; Bujarski and Kaesberg, 1986), кармовирусов (вирус скрученности турнепса; Cascone et al., 1990). Первые данные по РНК-рекомбинации у бактериофагов были получены на примере фага QP (Munishkin et al., 1988).

За последнее время РНК-рекомбинация была описана для многих РНК-содержащих вирусов животных, растений и бактерий (см. обзоры Lai, 1992; Agol, 1997; Nagy and Simon, 1997; Aaziz and Tepfler, 1999). При этом частота рекомбинации у некоторых вирусов (пикорна - и коронавирусов) сравнима с частотой ДНК-рекомбинации (King 1988b; Lai, 1992). Таким образом, становиться ясно, что РНК-рекомбинация у РНК-содержащих вирусов выполняет определенные общебиологические функции. Во-первых, она может выполнять репаративную функцию. Как известно, ни одна из РНК-зависимых РНК-полимераз и обратных транскриптаз не обладают корректирующей активностью, что обуславливает относительно высокий уровень частоты спонтанных мутаций при репликации геномной РНК (см. обзоры Lai, 1992; Domingo et al., 1996; Domingo and Holland, 1997). Частота ошибочного встраивания у различных РНК-полимераз от 10'3 до 10"5 говорит о том, что каждая реплицированная молекула РНК будет содержать 0.1-10 мутаций (если геномная РНК вируса состоит из 10000 нуклеотидов) (Domingo and Holland, 1997; Sierra et al., 2000; Crotty et al., 2001). Следовательно, вирусы должны иметь в распоряжении определенные механизмы, которые могут устранять спонтанные мутации или компенсировать их негативное фенотипическое проявление. РНК-рекомбинация может быть таким механизмом, который за счет замены участков генома на гомологичные последовательности устраняет функционально значимые ошибки (King 1988b; Lai, 1992; Nagy and Simon, 1997).

Во-вторых, РНК-рекомбинация - один из механизмов эволюции РНК-содержащих вирусов. При этом предполагается, что образование вирусов с новыми фенотипическими признаками может идти по блочному способу, за счет передачи друг другу функционально значимых модулей посредством генетической РНК-рекомбинации (Lai, 1992; Simon and Bujarski, 1994).

Итак, РНК-рекомбинация, с одной стороны, выполняя репарационные функции, устраняет различные изменения первичной структуры вирусного генома. С другой - играет важную роль в эволюционном развитии вирусов. Следовательно, изучение механизмов рекомбинации у РНК-содержащих вирусов является одной из важных биологических задач.

Для объяснения механизма РНК-рекомбинации разработаны две принципиально отличающиеся модели: репликативная и нерепликативная.

1) Репликативная модель} или модель смены матрицы. Согласно этой модели, различные перестройки молекул РНК обусловлены способностью РНК-зависимой РНК-полимеразы менять матрицу при репликации родительских геномов.

2) Нерепликативная модель, или модель «разрыв-лигирование». Согласно этой модели, рекомбинация между молекулами РНК осуществляется без участия РНК-зависимой РНК-полимеразы за счет разрывов в предварительно синтезированных родительских молекулах РНК одних межнуклеотидных ковалентных связей и образования новых в дочерней молекуле РНК.

Репликативная модель на данный момент является общепринятой. С ее помощью, с тем или иным успехом, объясняют образование рекомбинантов у подавляющего большинства РНК-содержащих вирусов. Действительно, репликативная модель хорошо объясняет механизм рекомбинации между родственными молекулами РНК с одинаковой или близкой первичной структурой. При этом места перекреста у рекомбинантов располагаются на одинаковых или очень близких по первичной структуре участках родительских молекул РНК. Иными словами, репликативная модель хорошо объясняет образование гомологичных рекомбинантов.

Однако в рамках репликативной модели, существуют объективные трудности с объяснением механизма рекомбинации между неродственными молекулами РНК с различной первичной структурой (негомологичная рекомбинация). Негомологичные рекомбинанты привлекают к себе внимание с точки зрения эволюции РНК-содержащих вирусов. За последнее время было получено большое количество данных, согласно которым вирусная и клеточная РНК могут рекомбинировать между собой по негомологичному типу (см. обзор Четверин, 1999). При этом отмечены случаи, когда вставки различных клеточных последовательностей вызывали появление штаммов вирусов с новым фенотипом (Collett et al., 1989; Khatchikian et al., 1989; Meers et al., 1991).

Тем временем, существует нерепликативная модель, которая принципиально может объяснить образование негомологичных рекомбинантов любого типа. Несмотря на это, нерепликативная модель рассматривается большинством авторов как маловероятная альтернатива репликативной модели.

Тем не менее, недавно было показано, что негомологичная рекомбинация между фрагментами сателлитных РНК фага QP идет по нерепликативному механизму, вероятно, за счет химических свойств, присущих самим молекулам РНК (Chetverin et al., 1997; Chetverina et al., 1999).

В связи с этим, в качестве основной, была поставлена задача, выяснить возможность получения инфекционных рекомбинантов вируса полиомиелита по нерепликативному механизму.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Белоусов, Евгений Валерьевич

6. Выводы

1. Показана возможность образования инфекционной РНК путем нерепликативной рекомбинации между взаимодополняющими 5'- и 3'-фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита, которые не способны самостоятельно транслироваться и реплицироваться.

2. Выявлено два класса рекомбинантов: (1) рекомбинанты, содержащие в своем составе полную последовательность 5'-фрагмента; (2) рекомбинанты, места перекреста у которых располагаются на внутренних участках обоих фрагментов.

3. Для эффективного образования рекомбинантов первого класса требуется наличие З'-концевого монофосфата у 5'-фрагмента. Предложена гипотетическая модель образования таких рекомбинантов.

4. Места перекреста рекомбинантов второго класса на 3'- и 5'-фрагментах располагаются неравномерно, формируя "горячие точки". Получены указания на возможное участие криптической рибозимной активности полиовирусной РНК в образовании одной из этих «горячих точек». Однако вопрос о том, какой количественный вклад в рекомбинацию вносит криптический рибозим, требует дополнительных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белоусов, Евгений Валерьевич, Москва

1. Збарский, И. Б., Дсбов, С. С. (1968). Химия и биология нуклеиновых кислот. JI: «Медицина». Стр.: 179-213.

2. Кочетков, Н. К. (1986). Общая органическая химия. М: «Химия». 10: 140-141.

3. Четверин, А. Б. (1999). Новый взгляд на рекомбинацию РНК. Мол. Биол. 33: 985-996.

4. Шалот, В. С. (1968). Нуклеазы. М: «Медицина».

5. Aaziz, R., Tepfer, М. (1999). Recombination in RNA virus and in virus-resistant transgenic plants. J. Gen. Virol. 80: 1339-1346.

6. Adams, R. L. P., Knowler, T. J., Leader, P. D. (1986). The biochemistry of the nucleic acids, 10th ed., Chapman and Hall, London, England.

7. Agol, V. I. (1991). The 5-untranslated region of picornaviral genomes. Adv. Virus Res. 40: 103-180.

8. Agol, V. I. (1997). Recombination and other genomic rearrangements in picornaviruses. Sem. Vir. 8: 77-84.

9. Agol, V. I., Paul, V. A., Wimmer, E. (1999). Paradoxes of the replication of picornaviral genomes. Virus Res. 62: 129-147.

10. Agut, H., Kean, К. M., Bellocq, C., Fichot, O., Girard M. (1987). Intratypic recombination of poliovirus: evidence for multiple crossing-over sites on the viral genome. J. Virol. 61: 1722-1725.

11. Andino, R., Rieckhof, G. E., Trono, D., Baltimore, D. (1990). Substitutions in the protease (ЗСрго) gene of poliovirus can suppress a mutation in the 51 noncoding region. J. Virol. 64: 607-612.

12. Andino, R., Rieckhof, G. E., Achacoso, P. L., Baltimore, D. (1993). Poliovirus RNA synthesis utilizes an RNP complex formed around the 5'-end of viral RNA. EMBO J. 12: 3587-3598.

13. Arnold, J. J., Cameron, С., E. (1999). Poliovirus RNA-dependent RNA polymerase (3Dpol) is sufficient for template switching in vitro. J. Biol. Chem. 274: 27062716.

14. Baric, R. S., Shieh, С. K., Stohlman, S. A., and Lai, M. M. S. (1987). Analysis of intracellular small RNA's of mouse hepatitis virus: Evidence for discontinuous transcription. Virology. 156: 342-354.

15. Baric, R. S., Fu, K., Schaad, M. C., Stohlman, S. A. (1990). Establishing a genetic recombination map for murine coronavirus strain A59 complementation groups. Virology. 177: 646-656.

16. Barton, J. D., O'Donnell, J. В., Flanegan, B. J. (2001). 5' cloverleaf in poliovirus RNA is a cis-acting replication element required for negative-strand synthesis. EMBO J. 20: 1439-1448.

17. Baumstark, Т., Schroder, A. R., Riesner, D. (1997). Viroid processing: switch from cleavage to ligation is driven by a change from a tetraloop to a loop E conformation. EMBO J. 16: 599-610.

18. Beck, D. L., Dawson, W. O. (1990). Deletion of repeated sequences from tobaccomosaic virus mutants with two coat protein genes. Virology. 177: 462-469.

19. Biebricher, С. K., Luce, R. (1992). In vitro recombination and terminal elongation of RNA by Q beta replicase. EMBO J. 11: 5129-5135.

20. Birikh, K. R., Heaton, P. A., Eckstein, F. (1997). The structure, function and application of the hammerhead ribozyme. Eur. J. Biochem. 245: 1-16.

21. Branch, A. D., Levine, B. J., Robertson, H. D. (1990). The brotherhood of circular RNA pathogens: viroids, circular satellites, and the delta agent. Seminars in Virol. 1:143-152.

22. Bruyere, A., Wantroba, M., Flasinski, S., Dzianott, A., Bujarski, J. J. (2000). Frequent homologous recombination events between molecules of one RNA component in a multipartite RNA virus. J Virol. 74: 4214-4219.

23. Bruening, G. (1990). Replication of satellite RNA of tobacco ringspot virus. Sem. Virol. 1: 127-134.

24. Bujarski, J. J., Dzianott, A. M. (1991). Generation and analysis of nonhomologous RNA-RNA recombinants in brome mosaic virus: sequence complementarities at crossover sites. J. Virol. 65: 4153-4159.

25. Bujarski, J. J., Kaesberg, P. (1986). Genetic recombination between RNA Ф components of a multipartite plant virus. Nature. 321: 528-531.

26. Bujarski, J. J., and Negy, P. D. (1996). Different mechanisms of homologous and nonhomologous recombination in brome mosaic virus: role of RNA sequences and replicase proteins. Sem. Virol. 7: 363-372.

27. Buzayan, J. M., Feldstein, P. A., Segrelles, C., Bruening, G. (1988). Autolytic processing of a phosphorothioate diester bond. Nucleic. Acids. Res. 16: 40094023.

28. Buzayan, J. M., Hampel, A., Bruening, G. (1986). Nucleotide sequence and newly formed phosphodiester bond of spontaneously ligated satellite tobacco ringspot virus RNA. Nucleic. Acids. Res. 14: 9729-9743.

29. Buzayan, J. M., van Tol, H., Zalloua, P. A., Bruening, G. (1995). Increase of satellite tobacco ringspot virus RNA initiated by inoculating circular RNA. Virology. 208: 832-837.

30. Catalano, С. E., Allen, D. J., Benkovic, S. J. (1990). Interaction of Escherichia coli DNA polymerase I with azidoDNA and fluorescent DNA probes: identification of protein-DNA contacts. Biochemistry. 29: 3612-3621.

31. Cascone, P. J., Carpenter, C. D., Li, X. H., and Simon, A. E. (1990). Recombination between satellite RNAs of turnip crinkle virus. EMBO J. 9: 17091715.

32. Cascone, P. J., Haydar, T. F., and Simon, A. E. (1993). Sequence and structure required for recombination between virus-associated RNAs. Science. 260: 801805.

33. Carpenter, C. D., Oh, J. W., Zhang, C., and Simmon, A. E. (1995). Involvement of a stem-loop structure in the location of junction site in viral RNA recombination. J. Mol. Biol. 245: 608-622.

34. Cech, Т. R. (1990). Self-splicing of group I introns. Annu. Rev. Biochem. 59: 543568.

35. Cech, T. R., Bass, B. L. (1986). Biological catalysis by RNA. Annu. Rev. Biochem. 55: 599-629.

36. Chay, C. A., Guan, X., Bruening, G. (1997). Formation of circular satellite tobacco ringspot virus RNA in protoplasts transiently expressing the linear RNA. Virology. 239:413-425.

37. Chetverina, H. V., and Chetverin, A. B. (1993). Cloning of RNA molecules in vitro. Nucleic Acids Res. 21: 2349-2353.

38. Chetverin, А. В., Chetverina, H. V., Demidenco, A. A., and Ugarov, V. I. (1997). Nonhomologous RNA recombination in cell-free system: evidence for a transesterification mechanism guided by secondary structure. Cell. 88: 503-513.

39. Chetverin, А. В., Chetverina, H. V., and Munishkin, A. V. (1991). On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qp replicase. J. Mol. Biol. 222: 3-9.

40. Chetverina, H. V., Demidenko, A. A., Ugarov, V. I., Chetverin, A. B. (1999). Spontaneous rearrangements in RNA sequences. FEBS Lett. 450: 89-94.

41. Ciesiolka, J., Lorenz, S., Erdmann, V. A. (1992). Structural analysis of three prokaryotic 5S rRNA species and selected 5S rRNA-ribosomal-protein complexes by means of Pb(II)-induced hydrolysis. Eur. J. Biochem. 204: 575-581.

42. Collett, M. S., Moennig, V., Horzinek, M. C. (1989). Recent advances in pestivirus research. J. Gen. Virol. 70: 253-266.• 48.Cooper, P. D. (1968). A genetic map of poliovirus temperature-sensitiv mutans.1. Virology. 35: 584-596.

43. Cooper, P. D. (1974). On the nature of poliovirus genetic recombination. J. Gen. Virol. 23: 41-49.

44. Crotty, S., Cameron, С., E., Andino, R. (2001). RNA virus error catastrophe: Direct molecular test by using ribavirin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 68956900.

45. Dahm, S. C., Uhlenbeck, О. C. (1991). Role of divalent metal ions in the hammerhead RNA cleavage reaction. Biochemistry. 30: 9464-9469.

46. Domingo, E., Escarmis, C., Sevilla, N., Moya, A., Elena, S. F., Quer, J., Novella, I., S., Holland, J. J. (1996). Basic concepts in RNA virus evolution. FASEB J. 10: 859-864.

47. Domingo, E., Holland, J. J. (1997). RNA virus mutation and vitness for survival.

48. Annu. Rev. Microbiol. 51: 151-178.

49. Duggal, R., Cuconati, A., Gromeier, M., Wimmer, E. (1997). Genetic recombination of poliovirus in a cell-free system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 13786-13791.

50. Edwards, M. C., Petty, I. Т., Jackson, A. O. (1992). RNA recombination in the genome of barley stripe mosaic virus. Virology. 189: 389-392.

51. Fernandez-Cuartero, В., Burgyan, J., Aranda, M. A., Salanki, K., Moriones, E., Garcia-Arenal, F. (1994). Increase in the relative fitness of a plant virus RNA associated with its recombinant nature. Virology. 203: 373-377.

52. Ferre-D'Amare, A. R., Zhou, K., Doudna, J. A. (1998). Crystal structure of a hepatitis deltavirus ribizyme. Nature. 395: 567-574.

53. Figlerowicz, M. (2000). Role of RNA structure in non-homologous recombination between genomic molecules of brome mosaic virus. Nucleic Acids Res. 28: 17141723.

54. Figlerowicz, M., Nagy, P. D., Bujarski, J. J. (1997). A mutation in the putative RNA polymerase gene inhibits nonhomologous, but not homologous, genetic recombination in an RNA virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 2073-2078.

55. Figlerowicz, M., Nagy, P. D., Tang, N., Kao, С. C., Bujarski, J. J. (1998). Mutations in the N terminus of the brome mosaic virus polymerase affect genetic RNA-RNA recombination. J. Virol. 72: 9192-9200.

56. Filipowicz, W., Billy, E., Drabikowski, K., Genschik, P. (1998). Cyclases of the 3'-terminal phosphate in RNA: a new family of RNA processing enzymes conserved in eucarya, bacteria and archaea. Acta Biochim. Pol. 45: 895-906.

57. Filipowicz, W., Gross, H. J. (1984).RNA ligation in eukaryotes. Trends Biochem. Sci. 2: 68-71.

58. Filipowicz, W., Konarska, M., Gross, H. J., Shatkin, A. J. (1983). RNA 3'-terminal phosphate cyclase activity and RNA ligation in HeLa cell extract. Nucleic Acids Res. 11: 1405-1418.

59. Filipowicz, W., Shatkin, A. J. (1983). Origin of splice junction phosphate in tRNAs processed by HeLa cell extract. Cell. 32: 547-557.

60. Filipowicz, W., Strugala, K., Konarska, M., Shatkin, A. J. (1985). Cyclization of RNA З'-terminal phosphate by cyclase from HeLa cells proceeds via formation of N(3')pp(5')A activated intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 1316-1320.

61. Frohman, M. F., Martin, G. R. (1990). PCR protocols. Ed Innis M. A. N. Y.:Academic press, 228-236.

62. Freemont, P. S., Friedman, J. ML, Beese, L. S., Sanderson, M. R., Steitz, T. A.1988). Cocrystal structure of an editing complex of Klenow fragment with DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 85: 8924-8928.

63. Furneaux, H., Pick, L., Hurwitz, J. (1983). Isolation and characterization of RNA ligase from wheat germ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 3933-3937.

64. Gamarnik, V. A., Andino, R. (1998). Switch from translation to RNA replication in positive-stranded RNA virus. Genes Dev. 12: 2293-2304.

65. Gegenheimer, P., Gabius, H. J., Peebles, C. L., Abelson, J. (1983). An RNA ligase from wheat germ which participates in transfer RNA splicing in vitro. J. Biol. Chem. 258: 8365-8373.

66. Genschik, P., Billy, E., Swianiewicz, M., Filipowicz, W. (1997). The human RNA З'-terminal phosphate cyclase is a member of a new family of proteins conserved in• Eucarya, Bacteria and Archaea. EMBO J. 16: 2955-2967.

67. Goodfellow, I., Chaudhry, Y., Richardson, A., Meredith, J., Almond, J. W., Barclay, W., Evans D. J. (2000). Identification of a cis-acting replication element within the poliovirus coding region. J. Virol. 74: 4590-4600.

68. Ш 75.Hajjou, М., Hill, К. R., Subramaniam, S. V., Hu, J. Y., Raju, R. (1996).

69. Nonhomologous RNA-RNA recombination events at the 3' nontranslated region of the Sindbis virus genome: hot spots and utilization of nonviral sequences. J. Virol. 70: 5153-5164.

70. Herold, J., Andino, R. (2001). Poliovirus RNA replication requires genome circularization through a protein-protein bridge. Mol. Cell. 7: 581-591.

71. Jacquier, A. (1996). Group II introns: elaborate ribozymes. Biochimie. 78: 474487.

72. Jarvis, G. Т., and Kirkegaard, K. (1991). The polymerase in its labyrinth: mechanism and implication of RNA Recombination. Trends. Genet. 7: 186-191.

73. Jarvis, G. Т., and Kirkegaard, K. (1992). Poliovirus RNA recombination mechanistic studies in the absence of selection. EMBO J. 11: 3135-3145.• 80.Jeffries, A. C., Symons, R. H. (1989). A catalytic 13-mer ribozyme. Nucleic Acids1. Res. 17: 1371-1377.

74. Kaufmann, G., Littauer, U. Z. (1974). Covalent joining of phenylalanine transfer ribonucleic acid half-molecules by T4 RNA ligase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71:3741-3745.

75. Khatchikian, D., Orlich, M., Rott, R. (1989). Increased viral pathogenicity after insertion a 28S RNA sequence into the hemmaglutinin gene of an influenza virus. Nature. 340: 156-157.

76. Keck, J. G., Soe, L. H., Makino, S., Stohlman, S. A., Lai, M. M. C. (1988). RNA recombination of murine coronaviruses: recombination between fusion-positive mouse hepatitis virus A59 and fusion-negative mouse hepatitis virus 2. J. Virol. 62: 1989-1998.

77. Keck, J. G., Stohlman, S. A., Soe, L. H., Makino, S., Lai, M. M. C. (1987). Multiple recombination site at the 5'-end of murine coronavirus RNA. Virology. 156: 331-341.

78. Kiberstis, P. A., Haseloff, J., Zimmern, D. (1985). 2' phosphomonoester, 3'-5' phosphodiester bond at a unique site in a circular viral RNA. EMBO J. 4: 817-827.

79. Kim, M. J., Kao, C. (2001). Factors regulating template switch in vitro by viral RNA-dependent RNA polymerases: implications for RNA-RNA recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 4972-4977.

80. King, A. M. Q. (1988a). Preferred sites of recombination in poliovirus RNA: an analysis of 40 intertypic cross-over sequences. Nucleic Acids Res. 16: 1170511723.

81. King, A. M. Q., (1988b). Recombination in positive strand RNA virus, p. 149-165. In E. Domingo, J. J. Holand, and P. Ahlquist (ed.), RNA genetics. CRC Press, Inc., Boca Raton.

82. King, A. M. Q., McCahon, D., Slade, W. R., and New-man, J. V. I. (1982). Recombination in RNA. Cell. 29: 921-928.

83. Kirkergaard, K., Baltimore, D (1986). The mechanism of RNA recombination in Poliovirus. Cell. 47: 433-443.

84. Kitamura, N., Semler, В., Rothberg, P., Larsen, G., Adler, C., Dorner, A., Emini, E., Hanecak, R., Lee, J., S. van der Werf, Anderson, C. and Wimmer, E. (1981).

85. Primary structure, gene organization and polypeptide expression of poliovirus1. RNA. Nature. 291:547-553.

86. Koetzner, C. A., Parker, M. M., Ricard, C. S., Sturman, L. S., Masters, P. S. (1992). Repair and mutagenesis of the genome of a deletion mutant of the coronavirus mouse hepatitis virus by targeted RNA recombination. J. Virol. 66: 1841-1848.

87. Koizumi, M., Iwai, S., Ohtsuka, E. (1988a). Cleavage of specific sites of RNA by designed ribozymes. FEBS Lett. 239: 285-288.

88. Koizumi, M., Iwai, S., Ohtsuka, E. (1988b). Construction of a series of several self-cleaving RNA duplexes using synthetic 21-mers. FEBS Lett. 228: 228-230.

89. Konarska, M., Filipowicz, W., Domdey, H., Gross, H. J. (1981). Formation of a 2'-phosphomonoester, 3',5'-phosphodiester linkage by a novel RNA ligase in wheat• germ. Nature. 293: 112-116.

90. Kuge, S., Kawamyra, N., and Nomoto, A. (1989). Genetic variation occurring on the genome of an in vivo insertion mutant of poliovirus type 1. J. Virol. 63: 10691075.

91. Kuge, S., Nomoto, A. (1987). Construction of viable deletion and insertion mutants of the Sabin strain of type 1 poliovirus: Function of the 5' noncoding sequence in viral replication. J. Virol. 61: 1478-1487.

92. Kuge, S., Saito, I., and Nomoto, A. (1986). The Primary structure of poliovirus defective-interfering particle genomes and possible generation mechanism of the particle. J. Mol. Biol. 192: 473-487.

93. Kuimelis, R. G., McLaughlin, L. W. (1998). Mechanisms of ribozyme mediated RNA cleavage. Chem. Rev. 98: 1027-1044.

94. Kunkel, T. A. (1985). Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492.

95. ЮЗ.Кио, Т., Herrin, L. D. (2000). Quantitative studies of Mn promoted specific and non-specific cleavages of a large RNA: Mn2+ - GAAA ribozymes and the evolution of the small ribozymes. Nucleic Acids Res. 28:4197-4206.

96. Lai, M. M. C. (1990). Coronavirus: organization, replication and expression of genome. Annu. Rev. Microbiol. 44: 303-333.

97. Ф 105.Lai, M. M. C. (1992). RNA recombination in animal and plant viruses Microbiol.1. Rev. 56: 71-89.

98. Lai, M. M. C., Baric, R. S., Makino, S., Keck, J. G., Egbert, J., Leibowitz, J. L., Stohman. S. A. (1985). Recombination between nonsegmented RNA genomes of murine coronaviruses. J. Virol. 56: 449-456.

99. Lake, J. R., Priston, R, A, J., Slade, W. R. (1975). A genetic recombination map of food-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 27: 355-367.

100. Laski, F.A., Fire, A. Z., RajBhandary, U.L., Sharp, P. A. (1983). Characterization of tRNA precursor splicing in mammalian extracts. J. Biol. Chem. 258: 1197411980.

101. Ledinko, N. (1963). Genetic recombination with poliovirus type 1: studies of crosses between a normal horse serum-resistant mutant and several guanidin

102. Ф resistant mutant of the same strain. Virology. 20: 107-119.

103. Lyons, Т., Murray, E. K., Roberts, W. A., Barton, J. D. (2001). Poliovirus 5'-terminal cloverleaf RNA is required in cis for VPg uridylylation and initiation of negative-strand RNA synthesis. J. Virol. 75: 10696-10708.

104. Mackenzie, J. S., Slade, W. R. (1975). Evidence for recombination between two different immunological types of foot-and-mouth disease virus. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 251-256.

105. Makino, S., Keck, J. G., Stohman, S. A., and Lai, M. M. C. (1986). High-frequency RNA recombination of murin coronaviruses. J. Virol. 57: 729-737.

106. Makino, S., Soe, L. H., Shieh, С. K., Lai, M. M. C. (1988). Discontinuous transcription generates heterogeneity at the leader fusion sites of coronavirus mRNAs. J. Virol. 62: 3870-3873.

107. Masuta, C., Kuwata, S., Matzuzaki, Т., Takanami, Y., Koiwai, A. (1992). A plant virus satellite RNA exhibits a significant sequence complementarity to a chloroplast tRNA. Nucleic Acids Res. 20: 2885.

108. Mayo, M. A., Jolly, С. A. (1991). The 5'-terminal sequence of potato leafroll virus RNA: evidence of recombination between virus and host RNA. J. Gen. Virol.72:2591-2595.

109. McCahon, D., King, A. M. Q., Roe, D. S., Slade, W. R., Newman, J. W. I., Cleary, A. M. (1985). Isolation and biochemical characterization ot intertypic recombinants of food-and-mouth disease virus. Virus Res. 3: 87-100.

110. McCahon, D., Slade, W. R., Prinston, R. A. J., Lake, J. R. (1977). An extendet genetic recombination map of food-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 35: 355-65.

111. McSwiggen, J. A., Cech, T. R. (1998). Stereochemistry of RNA cleavage by the Tetrahymena ribozyme and evidence that the chemical step is not rate-limiting. Science. 244: 679-683.

112. Meerovitch, K., Nicholson, R., and Sonenberg, N. (1991). In vitro mutational analysis of cis-acting RNA translational elements the poliovirus type 2 5'-untranslated region. J. Virol. 65: 5895-5901.

113. Meyers, G., Nautz, N., Dubovin, E. J., Thiel, H.-J. (1991). Viral cytopathogenicity correlated with integration of ubiquintin -coding sequences. Virology. 180: 602-616.

114. Michel, F., Ferat, J. L. (1995). Structure and activities of group II introns. Annu. Rev. Biochem. 64:435-461.

115. Molenkamp, R., Greve, S., Spaan, W. J., Snijder, E. J. (2000). Efficient homologous RNA recombination and requirement for an open reading frame during replication of equine arteritis virus defective interfering RNAs. J Virol. 74: 9062-9070.

116. Monroe, S. S., Schlesinger, S. (1983). RNAs from two independently isolated defective interfering particles of Sindbis virus contain a cellular tRNA sequence at their 5' ends. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 3279-83.

117. Munishkin, A. V., Voronin, L. A., and Chetverin, A. B. (1988). An in vivo recombinat RNA capable of autocflic synthesis by QP replicase. Nature. 333: 473475.

118. Munishkin, A. V., Voronin, L. A., Ugarov, V. I., Bondareva, L. A., Chetverina, H. V., and Chetverin, A. B. (1991). Efficient templates for Qp replicase are formed by recombination from heterologous sequences. J. Mol. Biol. 221: 463-472.

119. Nagy, P. D, Bujarski, J. J. (1992). Genetic recombination in brome mosaic virus: effect of sequence and replication of RNA on accumulation of recombinants. J. Virol. 66: 6824-6828.

120. Nagy, P. D., Bujarski J. J. (1993). Targeting the site of RNA-RNA recombination in brome mosaic virus with antigense sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6390-6394.

121. Nagy, P. D., and Bujarski J. J. (1995). Efficient system of homologous RNA recombination in brome mosaic virus: Sequence and structure requirements and accuracy of crossovers. J. Virol. 69: 131-140.

122. Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1996). Homologous RNA recombination inbrome mosaic virus AU-rich sequence decrease the accuracy of crossovers. J.11. Virol. 70: 415-426. i

123. Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1997). Engineering of homologousrecombination hotspots with AU sequence in brome mosaic virus. J. Virol. 71:3799-3810.

124. Nagy, P. D., Carpenter, C. D., Simon, A. E. (1997). A novel З'-end repair mechanism in an RNA virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94: 1113-1118.

125. Nagy, P. D., Dzianott, A., Ahlquist, P. G., and Bujapski J. J. (1995). Mutations in the helicase-like domain of protein la alter the sites of RNA-RNA recombination in brome mosaic virus. J. Virol. 69: 2547-2556.

126. Nagy, P. D., Pogany, J., Simon, A. E. (1999). RNA elements required for RNA recombination function as replication enhancers in vitro and in vivo in a plus-strand RNA virus. EMBO J. 18: 5653-5665.

127. Nagy, P. D., Pogany, J., Simon, A. E. (2001). In vitro and in vivo characterizationof an RNA replication enhancer in a satellite RNA associated with Turnip crincle virus. Virology. 288: 315-324.

128. Nagy, P. D., and Simon, A. E. (1997). New insights into the mechanisms of RNA recombination. Virology. 235: 1-9.

129. Nagy, P. D., Zhang, C., Simon, A. E. (1998). Dissecting RNA recombination in vitro: role of RNA sequences and the viral replicase. EMBO J. 17: 2392-2403.

130. Nakano, S. I., Chadalavada, D. M., Bevilacqua, P. C. (2000). General asid-base catalysis in the mechanism of a hepatitis deltavirus ribizyme. Science. 287: 14931497.

131. Negroni, M., Ricchetti, M., Nouvel, P., Buc, H. (1995). Homologous recombination promoted by reverse transcriptase during copying of two distinct RNA templates. Proc. Natl .Acad. Sci. USA. 92: 6971-6975.

132. Nicholson, R., Pelletier, J., Le, S.-Y., and Sonenberg, N. (1991). Structural and functional analysis of the ribosome landing pad of poliovirus type 2: in vivo translational studies. J. Virol. 65: 5886-5894.

133. Palasingam, K., Shaklee, P. N. (1992). Reversion of Q beta RNA phage mutants by homologous RNA recombination. J. Virol. 66: 2435-2442.

134. Paul, A. V., Rieder, E., Kim, D. W., van Boom, J. H., Wimmer, E. (2000). Identification of an RNA hairpin in poliovirus RNA that serves as the primary template in the in vitro uridylylation of VPg. J. Virol. 74: 10359-10370.

135. Peebles, C. L., Mecklenburg, K. L., Peterman, P. S., Tabor, J., Cheng, H. L. (1986). A self-splising RNA exists on intron lariat. Cell. 44: 213-223.

136. Pelletier, J., Sonenberg, N. (1988). Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334: 320325.

137. Perkins, К. K., Furneaux, H., Hurwitz, J. (1985). Isolation and characterization of an RNA ligase from HeLa cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 684-688.

138. MP 156.Perrotta, А. Т., Shih, I., Been, M. D. (1999). Imidazole rescue of a cytozinemutation in a self-cleaving ribozyme. Science. 286: 123-126.

139. Pick, L., Furneaux, H., Hurwitz, J. (1986). Purification of wheat germ RNA ligase. II. Mechanism of action of wheat germ RNA ligase. J. Biol. Chem. 261: 6694-6704.

140. Pick, L., Hurwitz, J. (1986). Purification of wheat germ RNA ligase. I. Characterization of a ligase-associated 5-hydroxyl polynucleotide kinase activity. J. Biol. Chem. 261:6684-6693.

141. Pilipenko, E.V. (1992b). Towards identification of cis-acting elements in the replication of enterovirus and rhinovirus RNAs: a proposal for the existence of tRNA-like terminal structure. Nucleic Acids Research. 20: 1739-1745.

142. Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., and Agol, V. I. (1995). A model for rearrangements in RNA genomes. Nucl. Acids Res. 23: 1870-1875.

143. Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Svitkin, Y. V., Sinyakov, A. N., and Agol, V. 1.(1992a). Prokaryotic-like cis elements in the cap-independent internal initiation of translation on picornavirus RNA. Cell. 68: 119-131.

144. Pogany, J. Romero, J., Huang, Q., Sgro, J.-Y., Shang,H., and Bujarski, J. J. (1995). De novo generation of defective interfering-like RNAs in broad bean mottle virus (BBMV). Virology. 212: 674-586.

145. Pringle, C. R. (1965). Evidence of genetic recombination in foot-and-mounth disease virus. Virology. 25: 48-54.

146. Pringle, C. R., Slade, W. R. (1968). The origin of hybrid variants derived from subtype strains of foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 2: 319-329.

147. Pyle, A. M. (1993). Ribozymes: a distinct class of metalloenzymes. Science. 261: 709-714.

148. Racaniello, V. G., and Baltimore, D. (1981). Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214: 916-919.

149. Raffo, A. J., Dawson, W. O. (1991). Construction of tobacco mosaic virus subgenomic replicons that are replicated and spread systemically in tobacco plants. Virology. 184: 277-289.

150. Rajagopal, J., Doudna, J. A., Szostak, J. W. (1989). Stereochemical course of catalysis by the Tetrahymena ribozyme. Science. 244: 692-694.

151. Raju, R., Subramaniam, S. V., Hajjou, M. (1995). Genesis of Sindbis virus by in vivo recombination of nonreplicative RNA precursors. J. Virol. 69: 7391-7401.

152. Rao, A. L., Hall, Т. C. (1993). Recombination and polymerase error facilitate restoration of infectivity in brome mosaic virus. J. Virol. 67: 969-979.

153. Reid, С. E. Lazinski, D. W. (2000). A host-specific function is required for ligation of a wide variety of ribozyme-processed RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 424-429.

154. Reinberg, D., Arenas, J., Hurwitz, J. (1985). The enzymatic conversion of 3'-phosphate terminated RNA chains to 2',3'-cyclic phosphate derivatives. J. Biol. Chem. 260: 6088-6097.

155. Rieder, E., Paul, A. V., Kim, D. W., van Boom, J. H., Wimmer, E. (2000). Genetic and biochemical studies of poliovirus cis-acting replication element ere in relation to VPg uridylylation. J. Virol. 74: 10371-10380.

156. Rivera, V. M., Welsh, J. D., Maizel, J. V. (1988). Comparative sequence analysis of the 5' noncoding region of the enteroviruses and rhinoviruses. Virology. 165: 42-50.

157. Romanova, L. I., Tolskaya, E. A., Kolesnikova, M. S., Agol, V. I. (1980). Biochemical evidence for intertypic genetic recombination of polioviruses. FEBS Lett. 118: 109-112.

158. Romero, J., Huang, Q., Pogany, J., Bujarski, J. J. (1993). Characterization of defective interfering RNA components that increases symptom severity of broad bean mottle virus infections. Virology. 194: 576-584.

159. Roossinck, M. J., Zhang, L., Hellwald, К. H. (1999). Rearrangements in the 5' nontranslated region and phylogenetic analyses of cucumber mosaic virus RNA 3 indicate radial evolution of three subgroups. J. Virol. 73: 6752-6758.

160. Ruffner, D. E., Stormo, G. D., Uhlenbeck, O.C. (1990). Sequence requirements of the hammerhead RNA self-cleavage reaction. Biochemistry. 29: 10695-10702.

161. Rupert, P. В., Ferre-D'Amare, A. R. (2001). Crystal structure of a hairpin ribozyme-inhibitor complex with implications for catalysis. Nature. 410: 780-786.

162. Saldanha, R., Mohr, G., Belfort, M., Lambowitz, A. M. (1993). Group I and group II introns. FASEB J. 7:15-24.

163. Sawicki, S.G., Sawicki, D. L. (1990). Coronavirus transcription: subgenomic mouse hepatitis virus replicative intermediates function in RNA synthesis. J. Virol. 64: 1050-1056.

164. Schwartz, R. C., Greer, C. L., Gegenheimer, P., Abelson, J. (1983). Enzymatic mechanism of an RNA ligase from wheat germ. J. Biol. Chem. 258: 8374-8383.

165. Sharmeen, L., Kuo, M. Y., Taylor, J. (1989). Self-ligating RNA sequences on the antigenome of human hepatitis delta virus. J. Virol. 63: 1428-1430.

166. Sierra, S., Davila, M., Lowenstein, P., R., Domingo, E. (2000). Responds of foog-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity. J. Virol. 74: 8316-8323.

167. Simon, A. E., and Bujarski, J. J. (1994). RNA recombination and evolution in virus infected plant. Annu. Rev. Phytopathol. 32: 337-362.

168. Simon, A. E., andNegy, P. D. (1996). RNA recombination in turnip crinkle virus: its role in formation of himeric RNAs, multimers, and in З'-end repair. Sem. Vir. 7: 373-379.

169. Slobodskaya, O. R., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Tolskaya, E. A., Victorova, E. G., and Agol, V. I. (1996). Poliovirus neurovirulence correlates with the presence of a cryptic AUG upstream of the initiator codon. Virology. 221:141-150.

170. Soukup, G. A., Breaker, R. R. (1999). Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of RNA. RNA. 5: 1308-1325.

171. Standring, D. N., Venegas, A., Rutter, W. J. (1981). Yeast tRNA3 Leu gene transcribed and spliced in a HeLa cell extract. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 5963-5967.

172. Steinschneider, A., Fraenkel-Conra, H. (1966a). Studies of nucleotide sequences in tobacco mosaic virus ribonucleic acid. 3. Periodate oxidation and semicarbazone formation. Biochemistry. 5: 2729-2734.

173. Steinschneider, A., Fraenkel-Conrat, H. (1966b). Studies of nucleotide sequences in tobacco mosaic virus ribonucleic acid. IV. Use of aniline in stepwise degradation. Biochemistry. 5: 2735-2743.

174. Sugino, A., Snoper, T. J., Cozzarelli, N. R. (1977). Bacteriophage T4 RNA ligase. Reaction intermediates and interaction of substrates. J. Biol. Chem. 252: 1732-1738.

175. Symons, R. H. (1989). Self-cleavage of RNA in the replication of small pathogens of plants and animals. Trends Biochem. Sci. 14: 445-450.

176. Symons, R. H. (1990a). The fascination of low molecular weight pathogenic RNAs. Sem. Virol. 1: 75-81.

177. Symons, R. H. (1990b). Self-cleavage of RNA in the replication of viroids and virusoids. Sem. Virol. 1: 117-126.

178. Symons, R. H. (1992). Small catalytic RNAs. Annu. Rev. Biochem. 61: 641-671.i

179. Symons, R. H. (1997). Plant pathogenic RNAs and RNA catalysis. Nucleic Acids Res. 25:2683-2689.

180. Taylor, J. (1990). Stucture and replication of hepatitis delta virus. Sem. Virol. 1: 135-141.

181. Tang, R. S., Barton, D. J., Flanegan, J. В., Kirkegaard, K. (1997). Poliovirus RNA recombination in cell-free extracts. RNA. 3: 624-633.

182. Tanner, N. K. (1999). Ribozymes: the characteristics and properties of catalytic RNAs. FEMS Microbiol. Rev. 23: 257-275.

183. Tolskaya, E. A., Romanova, L. I., Kolesnikova, M. S., and Agol, V. I. (1983). Intertipic recombination in poliovirus. Genetic and biochemical studies. Virology. 124:121-132

184. Triana-Alonso, F. J., Dabrowski, M., Wadzack, J., Nierhaus, К. H. (1995). Self-coded З'-extension of run-off transcripts produces aberrant products during in vitro transcription with T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem. 270: 6298-62307.

185. Trono, D., Pelletier, J., Sonenberg, N., and Baltimore, D. (1988). Translation in mammalian cells of a gene linked to the poliovirus 5' noncoding region. Science. 241: 445-448.

186. Tuschl, Т., Eckstein, F. (1993). Hammerhead ribozymes: importance of stem-loop II for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6991-6994.211 .Uhlenbeck, O.C. (1987). A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328: 596600.

187. Varrelmann, M., Palkovics, L., Maiss, E. (2000). Transgenic or plant expression vector-mediated recombination of Plum Pox Virus. J Virol. 74: 7462-7469.

188. Vicente, O., Filipowicz, W. (1988). Purification of RNA З'-terminal phosphate cyclase from HeLa cells. Covalent modification of the enzyme with different nucleotides. Eur. J. Biochem. 176: 431-439.

189. Weiss, B. G., Schlesinger, S. (1991). Recombination between Sindbis virus RNAs. J. Virol. 65: 4017-4025.

190. White, K. A., Morris, T. J. (1995). RNA determinants of junction site selection in RNA virus determinants and defective interfering RNAs. RNA. 1: 1029-1040.

191. Wimmer, E., Hellen, C. U. Т., and Cao, X. (1993). Genetics of poliovirus. Annu. Rev. Genet. 27: 353-436.

192. Wu, H. N., Lai, M. M. C. (1989). Reversible cleavage and ligation of hepatitisidelta virus RNA. Science. 243: 652-654.

193. Zagorowska, I., Kuusela, S., Lonnberg, H. (1998). Metal ion-dependent hydrolysis of RNA phosphodiester bonds within hairpin loops. A comparativekinetic study on chimeric ribo/2'-0-methylribo oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 26: 3392-3396.

194. Zhang, X., Lai, M. M. C. (1994). Unusual heterogeneity of leader-mRNA fusion in a murine coronavirus: implications for the mechanism of RNA transcription and recombination. J. Virol. 68: 6626-6633.