Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рекомбинантные аналоги ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантные аналоги ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta"

На правах рукописи

G03487983

/

Закирова Светлана Анатольевна

Рекомбинантные аналоги ацилазы глутарил -7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta

03.00.03 - Молекулярная биология

1 о ДЕК 2009

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003487983

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии Центра «Биоинженерня» Российской Академии Наук.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

НИИ Физико-химической медицины, РАМН Позмогова Галина Евгеньевна

кандидат биологических наук,

«НИИ Аджииомото-Генстика» (ЗАО «АГРИ») Мтицыи Леонид Романович

Ведущая организация:

Факультет Биоинформатики и Биоинженерии МГУ им М.В.Ломоиосова

Защита диссертации состоится //, ¿^декабря 2009 г. в 14"" часов на заседании совета Д 217.Я13.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУ11 «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: Москва. 117545,1-ый Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат разослан «20» ноября 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

кандидат химических наук

Т.Л.Воюшина

Актуальность работы

Ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (С17АСА-ацшшы, ЕС 3.5.1.93) - промышленные ферменты, наряду с пенициллин ацплазами, способные превращать цефалоспорины в ценные промежуточные соединения, используемые для производства новых антибиотиков. вПАСА-ацилаза катализирует ферментативное превращение глутарил-7-АСА (017АСА) в 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АСА), при котором происходит расщепление амидной связи с образованием глутарата и 7-АСА.

Активные ферменты являются гетеротетрамерами, состоящими из 2х и- и 2х р-субьединиц, которые формируются из одноцепочечного полипептидного предшественника в результате специфического процессинга белка-предшественника и характеризуются высокой активностью по отношению к С17АСА, при низкой активности по отношению к цефалоспорину С (ЬЬп е! а1., 1994).

Высокое биотехнологическое значение 017АСА-ацилаз определяет интерес к разработке эффективных и экономичных систем продукции этого фермента.

В тоже время, существующие методы получения рекомбинантных 017АСА-ацилаз нельзя признать достаточно эффективными, что связано со сложной структурой предшественника и недостаточной изученностью закономерности процессинга и сборки функционально-активного тетрамера фермента (1-1 е( а!., 1998; 1_ее е( а!., 2004). Необходимость освобождения иммобилизованных препаратов С17АСА-ацилаз от примесей неспецифических бета-лактамаз и эстераз, относительно невысокая каталитическая активность фермента, нестабильность тетрамера белка под действием мягких денатурирующих агентов, при умеренных температурах, частичная инактивация фермента под действием «сшивающих» агентов, осложняют получение эффективных иммобилизованных препаратов С17АСА-ацилаз (РпеЬв et а]., 1993; Vethanayagam е\ а1., 2005).

В этой связи весьма актуальным является проведение исследований, посвященных созданию новых штаммов-продуцентов и усовершенствованию известных методов получения препаратов С17АСА-ацилазы, а также исследований, направленных на углубленный структурно-функциональный анализ этого фермента и создание новых аналогов С17АСА-ацилазы с улучшенными физико-химическими и ферментативными свойствами с использованием методов биоинформатикн и белковой инженерии.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлось создание систем экспрессии аналогов GI7ACA-ацилазы, обеспечивающих эффективный синтез данных ферментов в клетках E.coli и упрощающих процедуры их очистки и иммобилизации, а также разработка подходов для получения более стабильных аналогов фермента, изучение особенностей процессов формирования четвертичной структуры С17АСА-ацилазы. Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Клонирование гена 017АСА-ацилазы бактерии Breviwdimonas diminuta (BrdGIA), конструирование вариантов гена BrdGIA, модифицированных присоединением аффинных остатков к различным участкам кодирующей последовательности фермента.

2. Оптимизация процессов биосинтеза созданных вариантов BrdGIA в штаммах E.coli-продуцектах, отработка условий получения и очистки рекомбинантных аналогов BrdGIA и изолированных субъединиц фермента.

3. Разработка схемы одностадийной аффинной очистки аналога BrdGIA с присоединенным N-концевым хитин-связывающим доменом на хитиновых сорбентах, определение кинетических и физико-химических параметров очищенного фермента.

4. Исследование закономерностей реконструкции и сборки функционально-активной BrdGIA in vitro с использованием изолированных рекомбинантных а- и (5-субъединиц.

5. Изучение области контакта между субъединицами 017АСА-ацилазы, определение относительного вклада гидрофобных и электростатических взаимодействий в поддержание четвертичной структуры тетрамера 017АСА-ацилазы.

Научная новизна и практическая значимость

В настоящей работе впервые создана высокоэффективная система экспрессии гибридного белка 017АСА-ацилазы слитой с хитин-связывающим доменом (BrdGIA/ChBD), позволяющая проводить одностадийную аффинную очистку рекомбинантного функционально-активного фермента.

Показано, что полученный гибридный белок обладает улучшенными физико-химическими и энзиматическими свойствами по сравнению с другими известными аналогами рекомбинантной GnACA-ацилазы - более высокой специфической активностью, улучшенной афинностью по отношению к субстрату, повышенной термостабильностью.

2

Впервые методам» биоинформатпкп выявлены значимые аминокислотные остатки, формирующие область взаимодействия между субъединицами С17АСА-ацнлазы. Показано, что в предсказанной области контакта димера а- и р-субъединиц, доминируют взаимодействия гидрофобного типа.

В результате экспериментов по совместной и раздельной ренатурации препаратов изолированных а- и (З-еубъединиц 017АСА-ацшшы показано, что формирование нативпой пространственной конформации фермента происходит, скорее всего, в процессе его синтеза, процессинга и взаимодействия вновь синтезируемых субъединиц.

Созданные в ходе работы штаммы-продуценты, разработанные методы получения и иммобилизации гибридных аналогов 017АСА-ацилазы открывают новые возможности для углубленного структурно-функционального изучения этого важного фермента, создания экономичных и эффективных технологий получения иммобилизованных препаратов G17ACA-amma3 для непосредственного использования в технологических процессах получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на 10-ой школе-конференции молодых ученых, «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2006 г.), 9-ой международной конференции «Системная биология и биоинжерения» (Москва, 2005 г.), международной конференции «Protein folding and Drug design», (Варенна, 2006 г.), международной конференции «Workshop on Biocalorimetry and Biological Thermodynamics», (Рио де Жаненро, 2006 г.), 4-ом международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития, (Москва, 2007 г.), международной конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009 г.). По материалам диссертации было опубликовано 2 статьи в российском и зарубежном журнале, получено 2 патента РФ и одно положительное решение о выдаче патента РФ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают 7 таблиц и 30 рисунков. Библиография включает 149 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клонирование и экспрессия гена BrdGlA

Штамм Brevandimonas diminuta ВКМ В-1297 был отобран из лабораторной коллекции, как обладающий максимальной активностью 017АСА-ацилазы, приблизительно 4 МЕ/л культуры.

Полноразмерный ген BrdGlA был получен методом ПЦР на матрице хромосомной ДНК штамма Brevundimonas diminuta ВКМ В-1297 с праймерами, соответствующими консервативным фланкирующим 5' и 3' -концевым последовательностям генов G17ACA-ацнлаз (рис.1, А).

А

промотор и RBS

В. diminuta геном

7 ACA-R(SacI)

Xbal (5 522) EcoRI(l)

Рис.1 Стратегия клонирования и экспрессии гена ВгсЮ1А. (А) Строение гена ВгсЮ1А и положение праймеров, использованных для выделения и секвенирования гена, ЯВБ -рибосом-связывающий сайт. (Б) Физическая и генетическая карта экспрессионного вектора рЭУНОШб, содержащего ЕсоШ/З'ас1 фрагмент, кодирующий ген Вгс101 А.

Секвенирование и анализ полученной последовательности позволили установить, что

выделенный ген кодирует белок размером 74 кДа, высокогомологичный

последовательностям известных 017АСА-ацилаз, при этом имеющиеся отличия

4

локализованы в сайтах, удаленных от участков активного центра фермента и областей межсубъединичных контактов (Ishiye et al., 1992).

Для получения вектора, способного направлять синтез BrdGIA в клетках E.coli, ген 017АСА-ацилазы был встроен в вектор рАСТ7, содержащий промотор фага Т7, терминатор Т7 с образованием плазмиды pSVH0106 (рис.1, Б).

Уровень продукции рекомбинантной BrdGIA в полученных трансформантах штамма E.coli BL21(DE3) в оптимизированных условиях индукции составил 160-200 МЕ/л культуры.

GnACA-ацилаза, как и другие белки этого семейства - периплазматический белок, содержащий характерный сигнальный пептид. Однако известно, что полученный методами генной инженерии «усеченный» аналог GnACA-ацилазы, лишенный сигнального пептида, способен без дополнительных факторов подвергаться автокаталитическому процессингу с образованием функционально-активного цитоплазматического белка. Более того, скорость процессинга «усеченного» предшественника С17АСА-ацилазы выше, чем секретируемого предшественника, что может приводить к повышению выхода рекомбинатной G17ACA-ацилазы при ее экспрессии в клетках Escherichia coli (Ishii et al., 1994).

Принимая во внимание известные данные о том, что модификация N-концевой области а-субъединицы не оказывает значительного влияния на ферментативную активность G17ACA-amwa3U (Ishiye et al., 1994), а также данные о влиянии природы N-концевых аминокислот на протеолитическую стабильность белков в бактериях (Varshavsky et al., 1991), методом сайт-направленного мутагенеза мы получили аналог BrdGIA с измененной N-концевой кодирующей последовательностью (АЕР FPT).

Активность С17АСА-ацилазы в соответствующем рекомбинантном штамме E.coli BL21(DE3)/pSVH1811 увеличивалась в полтора-два раза и составила 400 МЕ/л культуры.

Получение аналогов BrdGIA для аффинной очистки рекомбинантных ферментов

Препараты GUACA-ацтаз, используемые в составе биокатализаторов, должны быть свободны от примесей лактамаз, эстераз и ацетилаз, разрушающих 7-аминоцефалоспорановую кислоту и снижающих выход продукта. Эти требования усложняют масштабирование процедур выделения 017АСА-ацилаз даже с использованием эффективных рекомбинатных штаммов. Для преодоления этих проблем мы использовали стратегии аффинной очистки рекомбинантной BrdGIA.

На основании данных о пространственной структуре 017АСА-ацилазы, комплексов этого фермента с субстратом и продуктом реакции, а также свойствах двухсубъединичных

периплазматических ферментов, подвергающихся автокаталитическому процессингу (1992; Li et al-, 1998; Lee et al., 1998) была разработана стратегия конструирования и экспрессии генов аналогов BrdGIA, модифицированных присоединением хитин-связывающего домена хитиназы AI Bacillus circulans (ChBD) и олигогистидиновых остатков к N- и С-концевой кодирующей последовательности фермента.

Наш выбор ChBD в качестве аффинного домена для создания гибридного белка объясняется тем, что такой белок может непосредственно использоваться в качестве биокатализатора, поскольку в одну стадию может быть очищен и напрямую иммобилизован на инертном хитиновом носителе, без последующих химических обработок, которые могут приводить к инактивации фермента.

Проведенный анализ показал, что С- и N- концевая область а-субъединицы и С-конец ß-субъединицы 017АСА-ацилазы, по всей вероятности, являются наиболее доступными участками полипептидной цепи для присоединения ChBD и олигогистидиновых остатков соответственно (рис.2). С-конец а-субьеденицы находится на достаточно удаленном расстоянии от активного центра фермента и не принимает участия в катализе, в отличии, например, от N-концевой области ß-субъединицы, концевые аминокислоты которого входят в состав активного центра и важны для процессинга фермента. Хотя механизм процессинга GlTACA-ацилаз до конца не выяснен (Ishiye et al., 1992; Kim et al., 2001), считается, что для правильного отщепления спейсерного пептида существенно сохранение интактной последовательности на стыке С- концевой области а-субьединицы и N-конца спейсерного пептида. Использованная нами стратегия мутагенеза приводила к незначительному изменению кодирующей последовательности «стыка» а-субъединицы и спейсера и позволяла рассчитывать, что встроенный в эту область ChBD не будет отщепляться вместе со спейсерным пептидом.

Для экспрессии новых аналогов BrdGIA использовали метод культивирования в условиях «автоиндукции» полученных трансформантов штамма E.coli BL21(DE3) (Studier et al., 1990).

PSVH0106 Г7_ сп j „ • СП|.

pSVHlSll T7 J/2-,--,-------5-,

« I СПП | ß I—

pSVH18U/Hx7J(?-

His6

| СПП 1 ß I—

ChBD ---—3 концевых а.к.£*-суб.

psvH0i07 T7

pSVH0I08 T7 J^L

ChBD_m

»SVHC m _„ fr_, ___

- „ щщ>пГспгП г

Tcnffl ß 1—

ChBD niL ~ концевых а.к. а -суб.

Рис.2 Схема векторов экспрессии рекомбииаитных аналогов BrdGlA. Обозначения: Т7- Т7 промотор, СП - сигнальная последовательность, а - кодирующая последовательность а-субьединицы, ß - кодирующая последовательность ß-субъединицы, СПП-спейсерный пептид.

Уровень экспрессии аналога BrdGlA с измененной N-концевой последовательностью в штамме E.coü BL21(DE3)/pSVH1811 в этих условиях увеличивался примерно в 4 раза по сравнению со стандартным методом IPTG индукции и составил 1400 мЕ/мл при плотности культуры 20 ОЕ/мл.

Сходный уровень экспрессии был характерен для аналогов BrdGlA, модифицированных присоединенной к С-концу ß-субъединицы олигогистидиновой последовательностью (pSVH 1811/Н), либо с ChBD, присоединенным к С-концу а-субъединицы (pSVH0107).

Электрофоретическое разделение бесклеточного экстракта штамма E.coli BL21 (DE3)/pSVH0107 показано на рис.3.

Рис.3 ДДС-ПААГ-электрофорез бесклеточного экстракта штамма Е.соИ ВЬ21 (ОЕЗУрЭУНО 107. Дорожки: 1-маркер молекулярной массы, 2,3 - условия автоиндукция, 4-5-1РТй индукция. Стрелками указаны положения а-, р-субъедениц и предшественника рекомбинантного фермента.

a-cyü+ChBD

Уровень экспрессии белка ВгсОА/ЫтСИВО, содержащего модифицированный С11ВВ присоединенный к Ы-концу а-субъединицы (р8УН0108, см. ниже) был выше, чем в других штаммах, активность фермента составила 2100 мЕ на 1 мл культуры, что не менее чем в полтора раза превышает продуктивность лучших из известных штаммов-продуцентов рекомбинантных 017АСА-ацилаз.

Таким образом, метод «автоиндункции» является весьма простым и надежным способом повышения выхода рекомбинатной Вг<Ю1А и ее аналогов. Динамика роста культур полученных штаммов и накопления активности ОПАСА-ацилаз представлены на рис.4.

А.

Б.

- 2200

о.

р 2000 -

5? 1800 -

С5 Я 1600 -

ы 1400 -

Н 1200 ■

С- 1000 -

•в* 800 ■

н

600 •

X

400 -

ь

< 200 -

0 -

ш

8 22 36

Время культивирования.час

2400 3 2200 ¡2 2000 | 1800 1 1600 4} 1400 | 1200 1 1000 -

1 800 -

2 600 1 400

Ё 200 < 0

8 22 36 Время культнвирования.час

Вг<Ю1А Вг(Ю1А/Н Вг(Ю1А/СЬВО BгdGlA/NmChBD

Рис.4. Сравнение уровней активности вариантов Вг(Ю1А в трансформантах штамма Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ) в условиях 1РТО (А) и автоиндукции (Б).

Получение очищенных препаратов рекомбинантных аналогов Вгс1С1А

Первоначальные попытки аффинной очистки белка ВгсЮ1А/Н на колонках с Си2+-ЮА оказались не слишком удачными - специфичность адсорбции была довольно низкой, поскольку с Си2+-ЮА сорбентом в этих условиях связывалось и заметное количество балластных белков. Значительно повысить селективность адсорбции гибридного белка удалось с использованием Со2+-ГОА сорбента, что позволило за одну стадию хроматографии

получить рекомбинантный фермент с выходом не менее 60%. Специфическая активность очищенного фермента составила S.6 МЕ/мг белка.

Для проверки способности рекомбинантного белка BrdGIA/ChBD к связыванию с микрокристаллическим хитином, образцы, полученные путем фракционирования субклеточных экстрактов штамма BL21(DE3)/pSVH0107 наносили на колонку с хитиновыми гранулами и проводили анализ активности BrdGIA и белковых спектров в препаратах, полученных на различных стадиях аффинной очистки. Было показано, что «слитый» белок BrdGIA/ChBD прочно связывался с хитиновым сорбентом без заметной потери ферментативной активности.

Электрофоретический анализ препарата белка, элюированного в «жестких условиях» с хитиновых гранул (рис.5) показал высокую гомогенность связавшегося с сорбентом «слитого» белка, представленного двумя формами - 54кДа (5-субъединицей и 20 кДа а-ChBD-субъединицей. Определенная удельная активность BrdGIA/ChBD составила 10 МЕ/мг белка, и близка к характерной удельной активности очищенных препаратов рекомбинантных «немодифицированных» 017АСА-ацилаз, описанных ранее (Ishiye et al.,1992; Lee et al, 2000; Kim et al., 2003; Luo et al., 2004).

1 2 J 4

•stei*

14.4

Ш S&

Рис.5. ДДС-ПААГ-электрофорез белковых фракций штамма E.coli BL21(DE3)/pSVH0i07. Аффинная очистка рекомбинантной BrdGIA/ChBD на колонке с хитиновыми гранулами. Дорожки: 1 - маркер молекулярной массы, 2 - отрицательный контроль, штамм E.coli BL21(DE3), 3 - бесклеточный экстракт штамма E.coli BL21(DE3)/pSVH0107, 4 - элюат с аффинной колонки, очищенный препарат фермента BrdGIA/ChBD. Стрелками указаны положения двух субъединиц рекомбинантного фермента.

Разработка схемы одностадийной аффинной очистки аналога BrdGIA

Хотя полученный нами гибридный белок BrdGlA/ChBD обладает высокой хитин-связывающей активностью, недостаток данного метода заключается в необратимом связывании гибридных ферментов с хитиновыми сорбентами, что препятствует последующему получению свободных от нерастворимого хитина препаратов 017АСА-ацилаз для различных исследовательских целей и иммобилизации на пригодных для биокаталитических приложений промышленных носителях.

Мы разработали систему получения функционально-активного гибрида BrdGIA с вариантом хнтин-связывающего домена хитиназы AI Bacillus circulons, который способен к обратимому связыванию с хитином и позволяет проводить одностадийное выделение растворимого функционально-активного гибридного фермента на хитиновых сорбентах.

Для создания варианта BrdGlA/ChBD, способного к обратимому связыванию с сорбентом, были получены аналоги BrdGIA с присоединенным к N- и С-концевым участкам а-субъединицы ChBD (BrdGlA/NmChBD и BrdGlA/CmChBD соответственно), несущим точковую мутацию W42F в консервативном сайте, ослабляющую гидрофобные взаимодействия этого домена с микрокристаллическим хитином, что позволяет проводить элюцию гибридных белков иммобилизованных на хитиновых сорбентах за счет изменения ионной силы элюента (Ferrandon et al., 2003).

Для оценки способности гибридных белков к взаимодействию с хитиновым сорбентом, белковые экстракты рекомбинантных штаммов, полученные после фракционирования сульфатом аммония, анализировали хроматографией на колонке с «chitin beads» (New England Biolabs, США) в низкосолевых и высокосолевых условиях. Рекомбинантные белки адсорбировались на хитине только в буфере с 2М NaCl и элгоировались в низкосолевом буфере (рис.6, дорожки 2-6). Электрофоретический анализ подтвердил высокую чистоту выделенного препарата состоящего из двух субъедениц 54 кДа ß-субъеденицы, и 20 кДа а-субъединицы слитой с ChBD доменом, несущим точковую мутацию (рис.6, дорожки 7,8).

50 mlVl 21VI NaCl

47

Jfe»— ß-суб.

36

20

а-суб.+ChBD

14

2 3 4 5 6 7 8

Рис. 6. ДДС-ПААГ-электрофорез белковых фракций штамма Е.соЧ BL21 (DE3)/pSVH0108 полученных на различных стадиях аффинной хроматографии. Фракционирование рекомбинатной BrdGlA/NmChBD на колонке с хитиновым сорбентом. Дорожки: 1 - маркер молекулярной массы; 2 - фракция после осаждения сульфатом аммония, буфер с 50 шМ NaCl; 3- фракция «проскока» с колонки, нанесенного в низкосолевом буфере; 4 - фракция элюата с хитиновой колонки материала, нанесенного в буфере с 50 шМ NaCl; 5-фракция после осаждения сульфатом аммония, буфер с 2М NaCl; 6 - фракция после промывки колонки материала нанесенного в буфере с 2М NaCl; 7,8- фракция, элюированная с хитиновой колонки в буфере с 50 mM NaCl. Стрелками указаны положения двух субъединиц рекомбинантного фермента.

Удельная активность очищенной BrdGlA/NmChBD составила 15 МЕ/мг белка, т.е. была сравнима с известными значениями удельной активности очищенных препаратов «нативных» G17ACA-amuia3. Очистку BrdGlA из штамма Е.соЧ BL21(DE3)/pSVHC_m осуществляли аналогичным способом.

Энзиматические свойства аналогов BrdGlA

Кинетические параметры очищенных ферментов (Km, Vmax, kcat) определяли используя в качестве субстрата глутарил-7-ACA. Vmax для BrdGlA/NmChBD и BrdGlA/ChBD составили 13дмоль/мин/мг и 12.1 цмоль/мин/мг соответственно, Km 0.36 mM и 0.42 шМ соответственно (рис.7). Полученные значения оказались весьма близкими к

кинетическим параметрам препаратов «нативной» 017АСА-ацилазы и рекомбинантнон ВгсЮ1А/Н. Таким образом, использованные аффинные модификации не оказывают негативного влияния на ферментативные свойства рекомбинантной йПАСА-ацилазы, не нарушают процессинг и фолдинг фермента при его экспрессии в клетках Е.соИ. Более того, гибридный фермент ВпЮ1А/МтСЬВО отличался повышенным сродством к субстрату и обладал более высокой каталитической активностью по сравнению с другими аналогами (кса! 13.2 е-1).

глутарил-7-АСА

ВгсЮ1А/Н сг=з ВгсОА/СЬВО п ВгсЮ1А/№т\СЬВО

Рис.7 Кинетические параметры гибридных вариантов ВгсЮ1А.

Профили зависимости энзиматической активности от рН не имели значительных отличий для всех вариантов ферментов. В интервалах от рН 6 до рН 9 активность меняется незначительно, но резко снижается при более низких значениях рН (рис.8, А), в соответствии с полученными ранее литературными данными для нативной 017АСА-ацилазы (Вай181е1 е1 а1., 1997). Такая же картина наблюдалась и при определении чувствительности фермента к действию денатурирующих агентов. Было показано, что присутствие 0.5М гуанидин-хлорида приводит к снижению активности на 40%, а добавление гуанидин-хлорида до концентрации 2М приводит к полной инактивации фермента (рис.8, Б).

А 5 6 7 8 9 10 И рН

— Вп1С1А/Н -- Вг(1С1А/СНВО —ВгсКЛА/КтСЫН)

Б.

0,5 1 1,5

Концентрация СиН1, М — Вг(Ю1А/Н • *■ Вгс1С1А/СЬВО—ВгсКЛА/ГМтСЬВО

Рис 8. Исследование чувствительности рекомбинантных аналогов А к рН (А) и действию гуанидин-хлорида (Б).

Термостабильность рекомбинантных аналогов Вгс1С1А

Исследование термостабильностп полученных очищенных препаратов ВгсЮ1А/ЫтСЬЕШ и ВгсЮ1А/Н проводили методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Для обоих белков наблюдали появление трех перекрывающихся пиков, соответствующих вероятнее всего отдельным калориметрическим доменам. Области до и после пика соответствовали температурным зависимостям теплоемкости нативного и денатурированного состояния фермента, соответственно. Максимум температуры плавления ВгсЮ1А/Н составил 48.9 °С (рис.9. А), в то время как для ВгсКПА/ЫтСйВО мы наблюдали

значительное увеличение термостабильности. Тепловой переход Тт смещался в сторону более высокой температуры на 5.4 °С и составил 54.3 °С (рис.9. Б). Денатурация в обоих случая была необратимой.

Рис. 9. Тепловая денатурация GnACA-ацилазы.

А. - BrdGIA/H

Б. - BrdGIA/NraChBD

10.....~................50........"......... 60.....

Температура Г"С]

Таким образом, введение N-концевого хитин-связывающего домена в молекулу СПЛС'Л-ацн.шзы позволило нам получить рекомбинаитный гибридный фермент, обладающий повышенной термостабильностыо и заметно улучшенными энзиматическими свойствами.

Высокий уровень экспрессии гибридного белка BrdGIA/NmCliBD в полученном

рекомбинантном штамме может объясняться стабилизирующим влиянием N-концевого

ChBD. защищающего рекомбинаитный фермент от протеолитической деградации.

Введенный ChBD не оказывал негативного влияния на процесспнг и фолдинг

синтезируемого фермента, который сохранял стабильность при высокой ионной силе и мог

быть в одну стадию аффинно-очищен на хитиновом сорбенте.

14

Полученный новый аналог С17АСА-ацилазы, разработанные методы экспрессии и очистки гибридного фермента, являются весьма перспективными для дальнейшего структурно-функционального исследования этого важного фермента, разработки экономичных и эффективных технологий получения иммобилизованных препаратов 017АСА-ацилаз для непосредственного использования в технологических процессах получения 7-АСА.

В то же время, обнаруженная нами и другими авторами нестабильность тетрамера фермента под действием низких значений рН и денатурирующих агентов обосновывают целесообразность получения методами белковой инженерии более устойчивых аналогов 017АСА-ацнлазы за счет стабилизации дпмер-димерных взаимодействий. Для разработки рациональных подходов к дизайну и получению таких аналогов мы изучили особенности процессов сборки функционально-активного фермента из его отдельных субъеднниц и провели молекулярно-графическнй аналнз областей межсубъединичных контактов в молекуле 017АСА-ацнлазы. Для решения этой задачи предстояло разработать методы получения изолированных рекомбинантных субъеднниц ВгсЮ1А и ренатурации фермента.

Экспрессия субъеднниц В|ч1С1А

При дизайне конструкций для экспрессии а- и [З-субъединиц ВгсЮ1А учитывали данные предыдущих исследовании по экспрессии полноразмерной 017АСА-ацилазы, особенностях пространственной структуры нативного фермента и процессинга предшественника С17АСА-ацилазы (ЬЫуе е( а1., 1992; Ы е! а!., 1998).

Для получения рекомбинантной [3-субъединицы была сконструирована плазмида рМТУЗ, направляющая экспрессию гибридного белка 01АЮН, который является аналогом белка ВгсЮ1А/МтС11ВВ, модифицированного присоединением декагистидиновой последовательности к С-концу (3-субъединицы. Плазмида рМ Г\Ч - вектор экспрессии и-субъедпницы, модифицированной присоединением мутантного концевого связывающего хитин-связывающего домена (СЬВОа) (рис.Ю).

рмтуз т7^-тт " гепп 11 в

аш)_т

рмтм" Н

С||В|)_ш

Рис.Ю. Схема векторов экспрессии а- и [3-субъединиц ВгсЮ!А.

15

н 1*1 к

р-субъединица была выделена в денатурирующих условиях с помощью металло-хелат аффинной хроматографии после диссоциации нативного фермента 01АЮН в буфере с 8М мочевиной. В результате был получен препарат денатурированной р-субъединицы, свободный от примесей а-субъединицы, который был использован в опытах по ренатурации и реконструкции нативного фермента. Для очистки рекомбинантного белка СЬВОа также использовали аффинную хроматографию на хитиновом сорбенте.

Реконструкция BrdGlA в системе in vitro

Для исследования возможности реконструкции 017АСА-ацилазы из очищенных препаратов а- и [i-субъединнц проводили эксперименты по ренатурации выделенной |3-субъединицы. Предварительно подбирали условия ренатурации денатурированного препарата GIA10II. После инкубации в буфере для ренатурации препарата, обработанного ХМ мочевиной, активность фермента восстанавливалась на 60% (рис. 11).

л ь о

0 г со

5

£ го к го г

.п Ц

01 Ч

>4

юо

iii

80

60 -

40 -

20

п

G1AI0H GIAI0H рренат.+а р+а ренат, ренат.

Препараты белков

Рис.11. Зависимость активности ренатурированной рекомбинантной СТАЮН и Р-субъединицы от условий ренатурации. 01А ЮН - нативный фермент, С1А10Нренат. -денатурнрированный в 8М мочевине препарат, Рренат.+а - ренатурированный препарат р-субъединицы после добавления а-субъединицы, р+а ренат. - совместная ренатурация субъединиц.

После ренатурацни препарата Р-субъединицы в аналогичных условиях и добавления препарата а-субъединицы активности не наблюдалось. Если перед ренатурацией к препарату Р-субъединицы добавляли препарат а-субъединицы, активность восстанавливалась на 10% в пересчете на содержание р-субъединицы в исходном препарате GIA10H (рис.И).

Полученные данные позволили сделать вывод, что присутствие а-субъединицы необходимо для формирования правильной пространственной структуры р-субъединицы и образования функционально-активного фермента. Эти данные соответствуют известным наблюдениям, что раздельная экспрессия субъединиц С17АСА-ацилазы приводит к формированию функционально-активного фермента только при совместной экспрессии субъединиц в одной клетке.

Определение аминокислотных остатков, образующих область контакта между а-р субъединицамн и р~р субъединицами димера С17АСА-ацилазы

Для оценки вклада различных аминокислот, формирующих область контакта между а- и р-субъединицами С17АСА-ацилазы, было выполнено виртуальное аланиновое сканирование данной области с помощью сервера Roberta (http://robetla.bakerlab.org) для кристаллической структуры тетрамера бПАСА-ацилазы (PDB-код lgkl). Для визуализации результатов сканирования и структурного анализа использовали программу ViewerLite v.5.0.

В результате анализа были установлены аминокислотные остатки, формирующие межсубъеденичную область контакта, и выявлены среди них значимые путем отбора по значению энергетического эффекта, вносимого ими в процесс комплексообразования. Как было установлено в результате сканирования зоны контакта между а- и р-субъединицами димера, эту область образует 64 остатка а-субъединицы и 70 остатков Р-субъединицы. 31 аминокислотный остаток а-субъединицы и 31 аминокислотный остаток Р-субъединицы играют ключевую роль во взаимодействии между субъединицами (рис.12).

Что касается преобладания того или иного вероятного вида взаимодействий в предсказанной области контакта а-Р димера GnACA-ацилазы, то можно говорить о доминировании гидрофобного типа, т.к. в ряду значимых остатков наибольшее количество неполярных аминокислот. Вторыми по распространенности взаимодействиями являются водородные связи.

Рис.12. Ван-дер-Ваальсова модель йПАСА-ацилазы. Показаны остатки участвующие в формировании области контакта между а- и р-субъединицами. Аминокислотные остатки, относящиеся к а- цепи, показаны в серых тонах, относящиеся к Р-цепи - в розовых тонах. По мере увеличения интенсивности окрашивания того или иного остатка на рисунке, показано увеличение ДО(аР) по данным аланинового сканирования.

Аланиновое сканирование было проведено для пары Р-субъединиц тетрамера вПАСА-ацилазы (таблица 1). Для пары а-субъединиц аланиновое сканирование не приводится по причине удаленности друг от друга а-субъединиц в структуре гетеротетрамера.

Таблица 1. Влияние замены аминокислот на аланин, формирующих области контакта двух димеров, на стабильность тетрамера 017АСА-ацилазы.

рей Субъеденица вПАСА-ацилазы Заменяемый аминокислотный остаток АО(р,р2), ккал/моль

85 Р. О -0.35

94 Р1 V 0.21

99 Р1 я -0.06

107 Р2 I* 1.28

108 Р2 0 0.00

110 Р2 О 1.52

112 Р2 т 1.39

113 Р2 т -0.02

рс1Ь - номер аминокислоты в РБВ файле белка; ДО^Рг) - изменение свободной энергии связывания Р1- Р2 субъедениц двух димеров по данным аланинового сканирования. Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки значимые во взаимодействии димеров.

Исходя из пространственного анализа и приведенных данных сканирования, можно предположить, что преобладающим типом связей, благодаря которым обеспечивается взаимодействие гетеродимеров ОПАСА-ацилазы в составе тетрамера, являются электростатические связи (рис.13, А, Б).

Рис.13. Аминокислотные остатки формирующие область контакта между |3-субъедеиицами двух димеров ОПАСА-ацилазы, предсказанные с помощью виртуального аланинового сканирования.

А.-Ван-дер-Ваальсова модель ОПАСА-ацилазы. Аминокислотные остатки, относящиеся к Ргцепи, показаны в коричневых тонах, относящиеся к ^2-иепи - в зеленых тонах. Ярко-зеленым цветом показаны остатки, прошедшие уровень значимости исходя из данных по ДСф^).

Б.-Взаимное расположение

аминокислотных остатков, участвующих в формировании предсказанной области межсубъеденичных контактов двух димеров ОПАСА-ацилазы.

Сложно говорить о понятии «электростатическая комплементарность» ввиду слишком малого количества предсказанных остатков в зоне контакта, что явно свидетельствует о слабости димер-димерных взаимодействий в тетрамере ОПАСА-ацилазы (рис.13, А). Тем не менее, от этих данных в совокупности с данными об энзиматических свойствах фермента можно отталкиваться для дизайна более стабильных вариантов ОПАСА-ацилазы. Стратегия

получения таких аналогов может заключаться, например, в введении дополнительных аминокислотных остатков или целых белковых доменов, отвечающих за белок-белковое узнавание, в С-концевую область р-субъединицы для усиления димер-димерных взаимодействий.

Выводы:

1. Клонирован ген 017АСА-ацилазы бактерии Brewmdimonas diminuta (BrdGlA), оптимизированы системы экспрессии для получения «нативной» рекомбинантиой BrdGlA и ее аналогов в клетках E.coli.

2. Показано, что продуцируемые в клетках E.coli рекомбинантные аналоги G17ACA-ацилазы, несущие N- и С-концевые аффинные модификации, подвергаются правильному автопротеолитическому процессингу с образованием функционально-активных ферментов.

3. Разработана схема одностадийной аффинной очистки аналога С17АСА-ацилазы с присоединенным N-концевым хитин-связывающим доменом на хитиновых сорбентах, позволяющая получать стабильный фермент с высоким выходом. Показано, что такой аналог 017АСА-ацилазы обладает повышенной термостабильностью и улучшенными энзиматическими характеристиками по сравнению с немодифицированными рекомбинантными вариантами этого фермента.

4. Показано, что формирование нативной пространственной конформации субъединиц ОПАСА-ацилазы происходит в процессе синтеза и процессинга фермента и взаимодействия вновь синтезируемых субъединиц.

5. С помощью структурно-графического анализа димера и тетрамера GnACA-ацилазы показано, что доминирующим типом взаимодействий в области контакта двух субъединиц являются соответственно гидрофобные и электростатические взаимодействия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи и патенты

1. Хатунцева С.А. (Закирова), Эльдаров М.А., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Клонирование и экспрессия вариантов ацнлазы глутарнл 7-аминоцефалоспорпиовои кислоты бактерии Brevimdimonas dimimila в клетках Escherichia coli.// Прикладная биохимия и микробиология, 2007, том 43, №4, с. 462-470.

2. Khatuntseva S.A.(Zakirova), Eldarov М.А., Skryabin K.O. Purification and immobilization of recombinant variants of glutaryl 7-amino-cephalosporanic acid acylase ßrevundinmiuis tlimimua expressed in Escherichia coli.// Journal of Biotech., 2008 Jan I; 133( 1): 123-6.

3. Хатунцева С.А. (Закирова), Эльдаров M.A., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Рекомбинантная плазмида pSVH0106, обеспечивающая синтез 017АСА-ацилазы в клетках Escherichia coli, и рекомбннантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0106 - продуцент G17ACA-auплазы. Патент РФ №2300566 от 10.06.2007.

4. Хатунцева С.А. (Закирова), Эльдаров М.А., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Рекомбппаптная ДНК, кодирующая функционально активный гибридный белок 017АСА-ацнлазы с хнтпн-связывающим доменом (BrdG17ACA-cbd), рекомбпнантная плазмида pSVHOIOS, обеспечивающая его синтез в клетках Escherichia coli и рекомбннантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108 - продуцент BrdGI7ACA-cbd. Заявка на изобретение №2006123901. положительное решение от 03.07.2007.

5. Редо В.А., Эльдаров М.А., Жгун A.A., Хатунцева С.А. (Закирова), Зейналов O.A., Скрябин К.Г Рекомбинантная ДНК, кодирующая функционально-активный гибридный белок оксидазы D-аминокислот с хнтин-связывающнм доменом (DAOcbd), рекомбинантная плазмида pVRl, обеспечивающая его в клетках Escherichia coli, и рекомбннантный штамм Escherichia coli C41(DE3)/pVRl - продуцент DAOcbd. Патент РФ № 2310688 от 20.11.2007.

Материалы конференций

1. Khatuntseva (Zakirova) Svetlana, Lopatin Sergey, and Eldarov Mikhail. Cloning, expression and protein engineering of a novel glutaryl 7-amino-cephalosporanic acid acylase.// Abstracts of the Workshop on Biocalorimetry and Biological Thermodynamics, Rio de Jeneiro, Brazil. April 30-May 4, 2006. P. 132.

2. Khatuntseva S.A.(Zakirova), Eldarov M.A., Skryabin K.G. Production and protein modifications of an autoproteolyticaily processed glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase from Brevimdimonas diminuta. // Abstracts of the International Conference «Protein folding and Drug design», Varenna, Italy. July 4-14, 2006. P.16-17.

3. Хатунцева С.А. (Закирова), Кузнецов Б.Б., Эльдаров М.А., Клонирование и экспрессия GI7ACA_acylase Brevimdimonas diminuta и ее аналогов.// 9-ая международная конференция «Системная биология и биоинжерення», Москва, Россия. 28 ноября-2 декабря, 2005. С.216.

4. Хатунцева С,'.А.(Закирова), Эльдаров М.А..Скрябин К.Г. Секреторная экспрессия ацилазы глутарил 7 аминоцефалоспориновой кислоты в рекомбинантых штаммах Escherichia coli.ll 10-ая международная конференция «Биология-наука XXI века», Пущино, Россия. Апрель! 721,2006. С.401.

5. Хатунцева С.А.(Закирова), Эльдаров М.А., Скрябин К.Г. Иммобилизация и очистка рекомбинантных вариантов С17АСА_ацилазы экспресспрованных в E.coh.ll 4-ый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Россия, март 12-16, 2007. С.282.

(5. Закирова С.А.. Михайлова Т.В., Эльдаров М.А., Скрябин К.Г. Изучение термостабильности и особенностей процессов сборки холофермента ОЬ7АСА-ацнлазы из бактерии Brevundiminas diminuta ВКМ В-1297.// Международная конференция «Горизонты нанобиотехнологии», Звенигород, Россия, октябрь 2009. C.40I.

Заказ № 117-а/| 1/09 Подписано и печать 19.11.211»') Тираж 100 жч. Усл. и.л. 1.5

ООО "Цифровнчок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; е-таИ.чп/Ыа^с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Закирова, Светлана Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика вПАСА-ацилаз

1.1.1. Систематика цефалоспорин-ацилаз

1.1.2. Гомология последовательностей цефалоспорин-ацилаз

1.1.3. Свойства цефалоспорин-ацилаз

1.1.4. Структура генов цефалоспорин-ацилаз

1.1.5. Процессинг G17АСА-ацилаз

1.1.6. Клонирование и гетерологичная экспрессия цефалоспорин-ацилаз

1.1.7. Коэкспрессия субъединиц G17 АС А-ацилаз in vivo

1.2. Пространственные структуры вПАСА-ацилаз 23 1.2.1. Конформация спейсерного пептида

1.3. Аминокислотные остатки существенные для катализа и активации 26 фермента 017АСА-ацилазы

1.4. Роль а -аминогруппы N-концевого серина р-субъединицы в катализе 28 и активации фермента С17АСА-ацилазы

1.5. Механизм и сайты автопротеолиза ОПАСА-ацнлазы

1.6. Активный центр GlTACA-ацилазы

1.7. Методы направленной эволюции в исследовании 017АСА-ацилаз

1.8. Методы сайт-направленного мутагенеза для повышения активности 40 и стабильности цефалоспорин-ацилаз

1.8.1. Сайт-направленный мутагенез поверхностных остатков для 41 повышения стабильности фермента в щелочных условиях

1.8.2. Сайт-направленный мутагенез ключевых остатков для повышения 43 активности 017АСА-ацилаз

1.9. Белок-белковые взаимодействия

1.9.1. Классификция белок-белковых взаимодействий

1.9.2. Область межсубъединичных взаимодействий белок-белкового 44 комплекса

1.9.3. Методы исследований белок-белковых взаимодействий

1.9.4. Виртуальное аланиновое сканирование

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рекомбинантные аналоги ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta"

Ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (вПАСА-ацилазы, ЕС 3.5.1.93) - промышленные ферменты, наряду с пенициллинацилазами, способные превращать цефалоспорины в ценные промежуточные соединения, используемые для производства новых антибиотиков. вПАСА-ацилаза катализирует ферментативное превращение глутарил-7-АСА (G17ACA) в 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АСА), при котором происходит расщепление амидной связи с образованием глутарата и 7-АСА [Ichikawa et al, 1981а; Ichikawa et al., 1981b],

Активные ферменты являются гетеротетрамерами, состоящими из 2х а- и 2х Р-субъединиц, которые формируются из одноцепочечного полипептидного предшественника в результате специфического процессинга белка-предшественника и характеризуются высокой активностью по отношению к G17ACA, при низкой активности по отношению к цефалоспорину С [Ichikawa et al., 1981а; Matsuda et al., 1985; Ishii et al., 1994].

Высокое биотехнологическое значение вПАСА-ацилаз определяет интерес к разработке эффективных и экономичных систем продукции этого фермента. В тоже время, существующие методы получения рекомбинантных 017АСА-ацилаз нельзя признать достаточно эффективными, что связано со сложной структурой предшественника и недостаточной изученностью закономерности процессинга и сборки функционально-активного тетрамера фермента [Li et al., 1998; Li et al., 2004]. Необходимость освобождения иммобилизованных препаратов С17АСА-ацилаз от примесей неспецифических бета-лактамаз и эстераз, относительно невысокая каталитическая активность фермента, нестабильность тетрамера белка под действием мягких денатурирующих агентов, при умеренных температурах, частичная инактивация фермента под действием «сшивающих» агентов, осложняют получение эффективных иммобилизованных препаратов вПАСА-ацилаз [Friehs et al., 1993; Vethanayagam et al., 2005].

В этой связи весьма актуальным является проведение исследований, посвященных созданию новых штаммов-продуцентов и усовершенствованию 7 известных методов получения препаратов GlVACA-ацилазы, а также исследований, направленных на углубленный структурно-функциональный анализ этого фермента и создание новых аналогов GnACA-ацилазы с улучшенными физико-химическими и ферментативными свойствами, с использованием методов биоинформатики и белковой инженерии.

Целью настоящей работы являлось создание систем экспрессии аналогов 017АСА-ацилазы, обеспечивающих эффективный синтез данных ферментов в клетках E.coli и упрощающих процедуры их очистки и иммобилизации, а также разработка подходов для получения более стабильных аналогов фермента, изучение особенностей процессов формирования четвертичной структуры 017АСА-ацилазы. Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Клонирование гена GnACA-ацилазы бактерии Brevundimonas diminuta (BrdGIA), конструирование вариантов гена BrdGIA, модифицированных присоединением аффинных остатков к различным участкам кодирующей последовательности фермента.

2. Оптимизация процессов биосинтеза созданных вариантов BrdGIA в штаммах E.col/-пр оду центах, отработка условий получения и очистки рекомбинантных аналогов BrdGIA и изолированных субъединиц фермента.

3. Разработка схемы одностадийной аффинной очистки аналога BrdGIA с присоединенным N-концевым хитин-связывающим доменом на хитиновых сорбентах, определение кинетических и физико-химических параметров очищенного фермента.

4. Исследование закономерностей реконструкции и сборки функционально-активной BrdGIA in vitro с использованием изолированных рекомбинантных а- и р-субъединиц.

5. Изучение области контакта между субъединицами GnACA-ацилазы, определение относительного вклада гидрофобных и электростатических взаимодействий в поддержание четвертичной структуры тетрамера 017АСА-ацилазы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Закирова, Светлана Анатольевна

ВЫВОДЫ:

1. Клонирован ген GlVACA-ацилазы бактерии Brevnndimonas diminuta (BrdGlA), оптимизированы системы экспрессии для получения «нативной» рекомбинантной BrdGlA и ее аналогов в клетках E.coli.

2. Показано, что продуцируемые в клетках E.coli рекомбинантные аналоги GlVACA-ацилазы, несущие N- и С-концевые аффинные модификации, подвергаются правильному автопротеолитическому процессингу с образованием функционально-активных ферментов.

3. Разработана схема одностадийной аффинной очистки аналога GlVACA-ацилазы с присоединенным N-концевым хитин-связывающим доменом на хитиновых сорбентах, позволяющая получать стабильный фермент с высоким выходом. Показано, что такой аналог GnACA-ацилазы обладает повышенными термостабильностью и улучшенными энзиматическими характеристиками по сравнению с ^модифицированными рекомбинантными вариантами этого фермента.

4. Показано, что формирование нативной пространственной конформации субъединиц С17АСА-ацилазы происходит в процессе синтеза и процессинга фермента и взаимодействия вновь синтезируемых субъединиц.

5. С помощью структурно-графического анализа димера и тетрамера GlVACA-ацилазы показано, что доминирующим типом взаимодействий в области контакта двух субъединиц являются соответственно гидрофобные и электростатические взаимодействия.

1.10. Заключение

Основным направлением белковой инженерии ОПАСА-ацилаз является создание ферментов с улучшенными ферментативными и физико-химическими характеристиками, обладающих повышенной стабильностью пространственной структуры, устойчивостью к температурным изменениям, химическим агентам.

Иммобилизация на различных носителях является распространенным способом создания более стабильных биокатализаторов на основе ОПАСА-ацилаз [Alonso-Morales et al. 2004, Park et al., 2002a, 2003b]. В работах [Park et al., 2002b, 2003a] иммобилизация осуществлялась на модифицированном силикагеле. Несмотря на ухудшение кинетических характеристик иммобилизованного фермента (снижение Vmax, повышение Km), по сравнению со свободным ферментом, иммобилизованная 017АСА-ацилаза была активна в более широком рН диапазоне и отличалась повышенной температурной стабильностью. Множество исследований посвящено получению более стабильных аналогов 017АСА-ацилазы методами белковой инженерии [Seung et al., 2001; Oh et al, 2003; Saito et al., 1996; Yamada et al, 1996].

Несмотря на известные данные о лабильности четвертичной структуры ацилазы, [Kim et al, 2000] нет работ, посвященных изучению межсубъединичных взаимодействий как в димере С17АСА-ацилазы, так и в гетеротетрамере. В то же время, представляется очевидным, что знание закономерностей фолдинга фермента, сборки активного гетеротетрамерного комплекса, определение констант взаимодействия субъединиц фермента будут способствовать рациональному дизайну и получению улучшенных аналогов С17АСА-ацилазы для создания более стабильных биокатализаторов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Реактивы

Додецил сульфат натрия (ДСН) - (Fluka, Германия), Твин 20, Кумасси R-250, гидроксид натрия, тетраборат натрия, карбонат натрия, хлорид марганца (II), хлорид калия, хлорид кальция, фосфат натрия, хлорид натрия, гидрокарбонат натрия, (3-меркаптоэтанол, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (Sigma-Aldrich, UK), глицерин - (Serva, Германия), изопропанол (Ос.ч., «Экос-1», Россия), питательные среды (Difco, США). Хитиновые гранулы для аффинной хроматографии гибридных белков с хитин-связывающим доменом (New England Biolabs, США).

2.2. Ферменты и коммерческие наборы

Эндонуклеазы рестрикции, Taq-полимераза, Pfu-ДНК-полимераза (MBI Fermentas, Вильнюс, Литва; Сибэнзим, Новосибирск, Россия), Т4ДНК лигаза (Roche Diagnostics,East Sussex, Англия). Набор для выделения плазмидной ДНК QIAprep Miniprep Kit (Qiagen, West Sussex, Англия). Набор для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, West Sussex, Англия).

2.3. Бактериальные штаммы

Различные штаммы псевдомонад находились в коллекции Центра «Биоинженерия» РАН. Штамм Brevundimonas diminuta ВКМ В-1297 был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Для конструирования рекомбинантных плазмид использовали штамм Escherichia coli XLl-Blue recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac [FyproAB lacPZAM15 TnlO (Tet1)] (Stratagene, США). Экспрессию вариантов 017АСА-ацилазы осуществляли в штамме E.coli BL21 (DE3) [F-, ompT, hsdSB (гв-, тв-), dcm, gal, dcm (DE3)] (Novagen, США), который синтезирует РНК-полимеразу фага Т7, а также обладает сниженной протеазной активностью, что способствует повышению выхода целевых белков.

2.4. Бактериальные среды

Для выращивания E.coli использовали среду LB (Luria-Bertani): 0.5% дрожжевого экстракта, 1% бакто-триптона, 1% NaCl, рН 7,5. Для получения твердых сред при приготовлении чашек Петри в соответствующую жидкую среду добавляли агар до концентрации 1.5%.

Для выращивания штаммов E.coli BL21(DE3) - продуцентов субъединиц вПАСА-ацилаз использовали среду Overnight Express ТВ medium (Novagen, США).

Антибиотики: ампициллин, канамицин.

Методы

2.5. ДНК манипуляции и компьютерные программы

Определение нуклеотидных последовательностей ПЦР-фрагментов и плазмид проводили путем автоматического секвенирования на приборе ABIPrizm 3100 DNA Sequencer с использованием набора Applera «fluorescent Big dye Cycle sequencing kit». Нуклеотидные последовательности анализировали с помощью пакета программ Vector NTI8 (Informax Inc., США).

2.6. Виртуальное аланиновое сканирование

С целью определения аминокислотных остатков, образующих область контакта между субъединицами в димере и тетрамере вПАСА-ацилаз и выявления среди них значимых, был выполнен анализ зоны контакта между мономерами с помощью виртуального аланинового сканирования на сервере Robetta Oittp://robetta.bakerlab.org). Для этого каждый аминокислотный остаток поочередно заменяли на аланин и оценивали изменение энергии взаимодействия между субъединицами в результате замены по уравнению, приведенному в общем виде [Kortemme et al., 2004а]:

AG А/В = (GA/В - Ga - ОД - (G'A/B " G'A " G'B), где: AGa/B ~ изменение энергии связывания между партнерами белок-белкового взаимодействия до и после замены; Gа/В — свободная энергия комплекса дикого типа; Ga - свободная энергия белка-партнера А дикого типа; Gg - свободная энергия белка-партнера В дикого типа; G'a/B ~ свободная

52 энергия комплекса мутантного типа; С'д - свободная энергия белка-партнера А мутантного типа; G'g — свободная энергия белка-партнера В мутантного типа.

Программа, используемая для визуализации результатов сканирования и структурного анализа - ViewerLite v.5.0.

2.7. Рекомбинантные плазмиды

Для экспрессии 017АСА-ацилазы и ее различных аналогов использовали сконструированную нами ранее плазмиду рАСТ7 [Эльдаров с соавт., неопубл.] и вектор рЕТ28С (Novagen, США). В качестве источника хитин-связывающего домена использовали плазмиду pTYB4 (New England Biolabs, США).

В ходе работы были получены следующие конструкции для экспрессии вариантов ИЛАСА-ацилазы и отдельных субъединиц фермента:

1. pSVH0106 - вектор экспрессии «полноразмерной» BrdGlA.

2. pSVH1811 - вектор экспрессии варианта BrdGlA без последовательности сигнального пептида.

3. pSVH1811/H - вектор экспрессии BrdGlA с гексагистидиновой последовательностью, присоединенной к С концу Р-субъединицы (BrdGlA/H).

4. pSVH0107 - вектор экспрессии, направляющий в клетках E.coli синтез BrdGlA с хитин-связывающим доменом присоединенным к С-концу а-субъединицы (BrdGLA/ChBD).

5. pSVH0108 - вектор экспрессии направляющий в клетках E.coli синтез BrdGlA с присоединенным N-концевым модифицированным хитин-связывающим доменом (BrdGlA/NmChBD).

6. pSVHCm - рекомбинантная плазмида с присоединенным мутантным хитин-связывающим доменом к С-концу а-субъединицы (BrdGlA/CmChBD)

7. pMTVl - вектор экспрессии а-субъединицы с N-концевым ChBD (ChBDa).

8. рМТУЗ - вектор экспрессии рекомбинантной BrdGlA с декапiстидиновой последовательностью HaN-коице р-субъединицы (G1A10H).

2. 8. Синтетические олигонуклеотиды

При конструировании векторов экспрессии изолированных а- и (3-субъединиц 017АСА-ацилазы использовали синтетические олигонуклеотиды, структура и номенклатура которых приведены в таблице 2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Закирова, Светлана Анатольевна, Москва

1. Arroyo, M., Acebal, C., & Castillon, M.P. 2003. Biotechnological applications of penicillin acylases: state-of-the-art. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:507-514.

2. Aramori, I., Fukagawa, M., Tsumura, M., Iwami, M., Yokota, Y., Kojo, H., Kohsaka, M., Udea, Y., and Imenaka, H. 1991a. Isolation of soil strains producing new cephalosporin acylases. J. Ferment. Bioeng. 72:227-231.

3. Aramori, I., Fukagawa, M., Tsumura, M., Iwami, M., Ono, H., Ishtani, Y., Hiroshi, K., Kojo, H., Kohsaka, M., Udea, Y., and Imenaka, H. 1992. Comparative characterization of new glutaryl-7-АСА acylase. J. Ferment. Bioeng. 73:185-192.

4. Alonso-Morales, N. A., Lopez-Gallego, F., Betancor, L., Hidalgo, A., Mateo, C., Fernandez-Lafuente, R., and Guisn, J. M. 2004. Reversible immobilization ofglutaryl acylase on SEPABEADS coated with polyethylenimine. Biotechnol. Progr. 20: 533-536.

5. Alam, M. M., N. Nikaidou, H. Tanaka, and T. Watanabe. 1995. Cloning and sequencing of chiC gene of Bacillus circulans WL-12 and relationship of its product to some other chitinases and chitinase-like proteins. J. Ferment. Bio eng. 80:454-461.

6. Abraham, E. P., and Loader, P. B. 1972. Cephalosporin C, In:Cephalosporins: Chemistry and Biology, pp. 2-26, E. H. Flynn, ed., Academic Press, New York.

7. Abraham, E. P., and Newton,G. G.F. 1961. The structure of cephalosporin C. Biochem. J. 79: 377-393.

8. Barber,M.S., Giesecke,U., Reichert,A., & Minas,W. 2004. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams. Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 88:179-215.

9. Barends, T. R., Yoshida, H., and Dijkstra, B. W. 2004. Three-dimensional structures of enzymes useful for beta-lactam antibiotic production. Curr.Opin.Biotechnol. 15: 356-363.

10. Brannigan JA, Dodson G, Duggleby HJ, Moody PC, Smith JL, Tomchick DR, Murzin AG. A 1995: protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Erratum in: Nature. 378:(6557):644-638.

11. Binder, R. G., Numata, K., Lowe, D. A., Murakami, Т., and Brown, J. L.1993. Isolation and characterization of a Pseudomonas strain producing glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase. Appl. Environ.Microbiol. 59:3321—3326.

12. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal.Biochem. 72:248-254.

13. Battistel, E., Bianchi, D., Bortolo, R., & Bonoldi, L. 1998. Purification and stability of glutaryl-7-АСА acylase from Pseudomonas sp. Appl. Biochem. Biotechnol. 69:53-67.

14. Bruggink, A., Roos, E.C. & deVroom, E. 1998. Penicillin acylase in the industrial production of beta-lactam antibiotics. Organic Process Res. Dev. 2:128-133.

15. Balasingham, K., Warburton, D., Dunnill, P., & Lilly, M.D. 1972. The isolation and kinetics of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 276:250-256 .

16. Choi, K. S., J. A. Kim, and H. S. Kang. 1992. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J. Bacteriol. 174:6270-6276.

17. Chilov G.G, Stroganov O.V, Svedas VK. 2008. Molecular modeling studies of subbstrat binding by penicillin acylase. Biochemistry(Mosc) 3(l):56-64.

18. Deshpande, B.S., Ambedkar, S.S., Sudhakaran, V.K. & Shewale, J.G. 1994 Molecular biology of p-lactam acylases. World J. Microbiol. Biotechnol. 10:129138.

19. Deshpande, B. S., Ambedkar, S. S., and Shewale, J. G. 1996.Cephalosporin С and penicillin V acylase formation by Aeromonas sp. ACY 95. World J. Microbiol. Biotechnol. 12:373-378.

20. Diez, В., E.Mellado, R.Fouces, M.Rodriguez, and J.I.Barredo. 1996. Recombinant Acremonium clirysogenum strain for the industrial production of cephalosporin. Microbiologia. 12:359-370.

21. Duggleby H.J, Tolley S.P, Hill C.P, Dodson E.J, Dodson G, Moody P.C. 1995 Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre. Nature. 19:373(6511):264-8.

22. Del Rio G, Rodriguez ME, Munguia ME, Lopez-Mungui A, Soberon X. Mutant 1995. Escherichia coli penicillin acylase with enhanced stability at alkaline pH. BiotechnolBioeng. 20:48(2): 141-8.

23. Eisenhaber F., Argos P. 1996.Hydrophobic regions on protein surfaces: definition based on hydration shell structure and a quick method for their computation Protein Eng. 9: 1121-1133.

24. Friehs,K. & Reardon,K.F. 1993. Parameters influencing the productivity of recombinant E. coli cultivations. Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 48:53-77

25. Fersht A.R., and L.Serrano. 1993 Principals of protein stability derived from protein experiments.Curr.Opin.Struct.Biol. 3:75-83.

26. Franzosi, G., Battistel, E., Gagliardi, I., and Van der Goes, W. 1995. Screening and characterization of microorganisms with glutaryl-7-ADCA acylase activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:508-513.

27. Hubbard S.J., Argos P. 1994. Cavities and packing at protein interfaces . Protein Sci. 3:№ 12. 2194-2206.

28. Huabao Zheng, Jun Chena, Liuli Sua, Yuhua Zhaob, Yunliu Yang, HongYu Zenge, Gang Xue, Sheng Yang, Weihong Jiang. 2007. One-step purification and immobilization of his-tagged GL-7-ACA acylase. Enzyme and Microbial Technology. 41:474-479.

29. Ishiye, M. & Niwa,M. 1992. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the cephalosporin acylase gene of a Pseudomonas strain. Biochim. Biophys. Acta. 1132:233-239

30. Janin J. 1999. Wet and dry interfaces: the role of solvent in protein-protein and protein-DNA recognition . Structure. 7: 277-279.106

31. Jones S. and Thornton J.M. 1996. Principles of protein-protein interaction . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:13-20.

32. Jin Kwang Kim, In Seok Yang, Sangkee Rhee, Zbigniev Dauter, Young Sik Lee, Sung Soo Park and Kyung Hyun Kim. 2003 Crystal Structures of Glutaryl 7-Aminocephalosporanic Acid Acylase: Insight into Autoproteolytic Activation. Biochemistry. 42:4084-4093.

33. Guo, H. C., Xu, Q., Buckley, D., and Guan, C. 1998. Crystal structures of Flavobacterium glycosylasparaginase. An N-terminal nucleophile hydrolase activated by intramolecular proteolysis J. Biol.Chem. 273:20205-20212.

34. Kim, D.W., Kang, S.M. and Yoon, K.H. 1999. Isolation of New Pseudomonas diminuta KAC-1 Strain Producing Glutaryl 7-Aminocephalosporanic Acid Acylase.J. Microbiol. 37: 200-205.

35. Kumar, K.K., Sudhakaran,V., Deshpande,B.S., Ambedkar,S.S., & Shewale,J.G. 1993.Cephalosporin acylases: enzyme production, structure and application in the production of 7-ACA. Hindustan Antibiot. Bull. 35:111-125.

36. Klibanov AM. 2001 Improving enzymes by using them in organic solvents .Nature.409 (6817):241-6.

37. Kim, S. and Kim, Y. 2001. Active site residues of cephalosporin acylase are critical not only for enzymatic catalysis but also for post-translational modification. J.Biol.Chem. 276:48376-48381.

38. Khang, Y. H., and Yoo, В. H. 2000. Isolation and characterization of a novel soil strain, Pseudomonas cepacia BY21, with glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase activity. Biotech. Lett. 22:317-320.

39. Kim, Y., Kim, S., Earnest, T. N., and Hoi, W. G. 2002. Precursor structure of cephalosporin acylase. Insights into autoproteolytic activation in a new N-terminal hydrolase family. J.Biol.Chem. 277:2823-2829.

40. Kim D.E., Chivian D. and Baker D. 2004. Protein structure prediction and analysis using the Robetta server. Nucleic Acids Research. 32: 526-531.

41. Kortemme T. and Baker D. 2002. A simple physical model for binding energy hot spots in protein protein complexes .PNAS. 99: 14117 14121.

42. Kortemme T. and Baker D. 2004a. Computational design of protein protein interactions Current Opinion in Chemical Biology. 8: 91 97.

43. Kortemme Т., Kim D.E., Baker D. 2004b. Computational alanine scanning of protein protein interfaces.^/. STKE. 2004b. 219: 2-12.

44. Keskin О., Ma B. and Nussinov R. 2005. Hot regions in protein-protein interactions: the organization and contribution of structurally conserved hot spot residues J. Mol. Biol. 345: 1281-1294.

45. Youngsoo Kim, Wim GJ. Hoi. 2001. Structure of cephalosporin acylase in complex with glutaryl-7-aminocephalosporanic acid and glutarate: insight into the basis of its substrate specificity .Chemistry & Biology.8:1253-1264.

46. Lee, Y. S., Kim, H. W., and Park, S. S. 2000a. The role of alpha-amino group of the N-terminal serine of beta subunit for enzyme catalysis and autoproteolytic activation of glutaryl 7- aminocephalosporanic acid acylase. J.Biol.Chem. 275:39200-39206.

47. Luo Hui, Yu Huimin, Li Qiang, Shen Zhongyao. Rapid Cloning and Expression of Glutaryl-7-Aminocephalosporanic Acid Acylase Genes from Soil Samples. 2005. Tsinghua Science and Technology. 10:529-534.

48. Ledent P, Duez C, Vanhove M, Lejeune A, Fonze E, Charlier, et al. 1997. Unexpected influence of a C-terminal-fused his-tag on the processing of an enzyme and on the kinetic and folding parameters. FEBS Letters. 413:194-196.

49. Larsen T.A., Olson A.J., Goodsell D.S. 1998. Morphology of protein-protein interfaces. Structure. 6: 421-427.

50. Li, Y., Chen, J., Jiang, W., Мао, X., Zhao, G., and Wang, E. 1999. In vivo post-translational processing and subunit reconstitution of cephalosporin acylase from Pseudomonas sp. 130. Eur.J.Biochem. 262:713-719.

51. Lawrence M.C., Colman P.M. 1993. Shape complementarity at protein/protein interfaces .J. Mol. Biol. 234:№ 4 946 950.

52. Lopez Garcia et all. Process for modifying the enzyme 7 beta-(4-carboxybutanamido) cephalosporinacylase and purifying said enzyme in single chromatographic step. European patent EP0839914,1997-10-30.

53. Matsuda, A. & Komatsu,K.I. 1985. Molecular cloning and structure of the gene for 7 beta-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase from a Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 163:1222-1228.

54. Matsuda, A., Matsumaya, K., Yamamoto, K., Ichikawa, S., and Komatsu,K. 1987a. Cloning and characterization of the genes for two distinct cephalosporin acylases froma Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 169:5815-5820.

55. Matsuda, A., Toma, K., and Komatsu, K. 1987b. Nucleotide sequence of the genes for two distinct cephalosporin С acylases from a Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 169:5821-5826.

56. McDonough, M.A., Klei, Y.E.,and Kelly, J.A.I999. Crystal structer of penicillinG acylase from Brol mutant strain of Providencia rcXgXgcxi.Prot.Sci. 8:1971-1981.

57. Matthews BW, Nicholson H, Becktel WJ. 1987 Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding. Proc Natl AcadSci USA. 84(19):6663-7.

58. McCoy A J., Chandana Ера V., Colman P.M. 1997. Electrostatic complementarity at protein/protein interfaces .J. Mol. Biol. 268: 570-584.

59. Muegge I., Schweins Т., Warshel A. 1998. Electrostatic contributions to protein-protein binding affinities: application to Rap/Raf interaction .Protein. 30: 407-423.

60. Nobbs, T. J., Ishii, Y., Fujimora, Т., Saito Y., and Niwa, M. 1994. Chemical modification and site directed mutagenesis of tyrosine residue in cephalosporin С acylase from Pseudomonas strain N 176. J. Ferment.Bio eng. 77:604—609.

61. Oh, В., Kim, K, Park, J., Yoon, J., Han, D., and Kim, Y. 2004. Modifying the substrate specificity of penicillin G acylase to cephalosporin acylase by mutating active-site residues. Biochem.Biophys.Res.Comrmm. 319:486-492.

62. Otten, L. G., Sio, C. F., Vrielink, J., Cool, R. H., and Quax, W. J. 2002. Altering the substrate specificity of cephalosporin acylase by directed evolution of the Beta -subunit. J.Biol.Chem. 277:42121-42127.

63. Otten, L. G., Sio, C. F., van der Sloot, A. M., Cool, R. H., and Quax, W. J. 2004. Mutational analysis of a key residue in the substrate specificity of a cephalosporin acylase. Chembiochem. 5:820-825.

64. Oinonen C, Tikkanen R, Rouvinen J, Peltonen L. 1995. Three-dimensional structure of lysosomal aspartylglucosaminidase. Nat Struct Biol. 12:1102-8.

65. Parmar, A., Kumar, H., Marwaha, S.S., & Kennedy, J.F. Recent Trends in Enzymatic 1998. Conversion of Cephalosporin С to 7-Aminocephalosporanic Acid (7-ACA). Critical Reviews in Biotechnology. 18:1-12.

66. Politino, M., Tonzi, S. M., Burnett, W. V., Romancik, G., and Usher, J. J. 1997. Purification and characterization of a cephalosporin esterase from Rhodosporidium toruloides. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63:4807-4811.

67. Park Seung Won, Jeewon Lee, Suk In Hong, Seung Wook Kim. 2003a. Enhancement of stability of GL-7-ACA acylase immobilized on silica gel modified by epoxide silanization .Process Biochemistiy.39:359-366.

68. Park, S. W., Lee, J. W., Hong, S. I., and Kim, S. W. 2003b. Immobilization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase on silica gel and enhancement of its stability. Appl. Biochem. Biotechnol. 104: 185—198.

69. Park Seung Won, Sang Yong Choi, Koo Hun Chungb, Suk In Honga, Seung Wook Kima. 2002a. Characteristics of GL-7-ACA acylase immobilized on silica gel through silanization .Biochemical Engineering Journal. 11:87-93.

70. Park, S. W., Kim Y. I., Chung, К. H., Hong, S. K., and Kim, S. W. 2002b. Covalent immobilization of GL-7-ACA acylase on silica gel through silanization. Reactive and Functional Polymers 51: 79-92.

71. Querol E, Perez-Pons JA, Mozo-Villarias A. 1996. Analysis of protein conformational characteristics related to thermostability .Protein Eng. 9(3):265-71.

72. Reyes, F., Martinez, M.J. & Soliveri, J. 1989. Determination of cephalosporin-C amidohydrolase activity with fluorescamine^/. Pharm. Pharmacol. 41:136-137.

73. Russell AJ, Fersht AR. 1987. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge.Nature. 328(6130):496-500.

74. Ross, G. W. 1975. p-Lactamases. In: Methods Enzymol. 43: 678-687.

75. Richmond, M. H., and Sykes, R. B. 1973. The P-lactamases of gramnegative bacteria and their possible physiological role. Adv. Microbial. Physiol.9: 31-88.

76. Studier,F.W., Rosenberg,A.H., Dunn,J.J., & Dubendorff,J.W. 1990. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185:60-89.

77. Studier, F., 2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 4: 207—234.

78. Saarela J, Laine M, Tikkanen R, Oinonen C, Jalanko A, Rouvinen J, Peltonen L. 1998. Activation and oligomerization of aspartylglucosaminidase.7" Biol Chem. 25:273(39):25320-8.

79. Szwajcer, E., and Mosbach, K. 1985. Isolation and partial characterization of a D-amino acid oxidase active against cephalosporin С fromyeast Trigonopsis variabilis. Biotechnol. Letts. 7:1—7.

80. Saito, Y., Ishii, Y., Fujimura, Т., Sasaki, H., Noguchi, Y., Yamada, H., Niwa, M., and Shimomura, К. 1996. Protein engineering of a cephalosporin С acylase from Pseudomonas strain N176. Ann.N.Y.Acad.Sci. 782:226-240.

81. Sio, C. F., Riemens, A. M., van der Laan, J. M., Verhaert, R. M., and Quax, W. J. 2002. Directed evolution of a glutaryl acylase into an adipyl acylase. Eur.J.Biochem. 269:4495-4504

82. Charles F. Sio, Linda G. Otten, Robbert H. Cool and Wim J. Quax. 2003. Analysis of a substrate specificity switch residue of cephalosporin acylase // Biochemical and Biophysical Research Communications (BBRC). 312:755-760.

83. Suzuki, H., Miwa, C., Ishihara, S., and Kumagai, H. 2004. A single amino acid substitution converts gamma-glutamyltranspeptidase to a class IV cephalosporin acylase (glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase). Appl.Environ.Microbiol. 70:6324-6328.

84. Sheinerman F.B., Norel R., Honig B. 2000. Electrostatic aspects of protein-protein interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 153-159.

85. Stites W.E. 1997. Protein-Protein Interactions: Interface Structure, Binding Thermodynamics, and Mutational Analysis.Chem Rev. 97: 1233-1250.

86. Sassenfeld HM. 1990. Engineering proteins for purification. Trends Biotechnol., 8(4):88-93.

87. Sambrook ,J., Maniatis, Т., & Fritsch, E.F. Molecular cloning a laboratory manual. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; 1989.

88. Sanggu Kim and Youngsoo Kim. 2001 Active Site Residues of Cephalosporin Acylase Are Critical Not Only for Enzymatic Catalysis but Also for Post-translational Modification. Journal of Biological Chemistry.276:48376-48381.

89. Sudhakaran, V. K., Deshpande, B. S., Ambedkar, S. S., and Shewale, J. G. 1992. Molecular aspects of penicillins and cephalosporin acylases. Process. Biochem. 27:131-143.

90. Sonawane, V. C., Jolly, R. S., and Vohra, R. M. 1996. Cephalosporin modification:An extracellular glutaryl 7-ACA acylase from Bacillus sp. Biotech. Lett. 18:965-968.

91. Slade, A., A. J. Horrocks, C. D. Lindsay, B. Dunbar, and R. Virden. 1991. Site-directed chemical conversion of serine to cysteine in penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105. Eur. J. Biochem. 197:75-80.

92. Seemiiller E, Lupas A, Stock D, Lowe J, Huber R, Baumeister W. 1995. Proteasome from Thermoplasma acidophilum: a threonine protease. Science. 268(5210):579-82.

93. Tsai C.J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nussinov R. 1997. Studies of protein-protein interfaces: a statistical analysis of the hydrophobic effect Protein Sci. 6: 53-64.

94. Thorn K.S. and Bogan A.A. ASEdb: 2001. a database of alanine mutations and their effects on the free energy of binding in protein interactions.Bioinformatics. 17: 284-285.

95. Tsai C.J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nussinov R. 1996. Protein-protein interfaces: architectures and interactions in protein-protein interfaces and in protein cores. Their similarities and differences .Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31: 127-152.

96. Thomas RM Barends, Hiromi Yoshida and Bauke W Dijkstra. 2001. Three-dimensional structures of enzymes useful for p-lactam antibiotic production. Current Opinion in Biotechnology.15:356-363.

97. Takimoto, A., Matsushima, K., Yagi, S., and Sonoyama, T. 1994. Purification and characterization and partial amino acid sequence of anovel cephalosporin С deacetylase from Bacillus subtilis. J. Ferment. Bioeng. 77:17—22.

98. Tobias JW, Shrader ТЕ, Rocap G, Yarshavsky A. 1991. The N-end rule in bacteria. Science. 254(5036): 1374-7.

99. Veselovsky A.V., Ivanov Yu.D., Ivanov A.S., Archakov A.I., Lewi P. and Janssen P. 2002. Protein-protein interactions: mechanisms and modification by drugs .Journal of Molecular Recognition. 15: 405-422.

100. Velasco J, Luis Adrio J, Angel Moreno M, Diez B, Soler G, Barredo JL. 2000. Environmentally safe production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) using recombinant strains of Acremonium chrysogenumJVcrt Biotechnol: 18(8):857-61.

101. Valle, F., Balbas, P., Merino, E., & Bolivar, F. 1991. The role of penicillin amidases in nature and in industiy. Trends Biochem. Sci. 16:36-40.

102. Vethanayagam, J. & Flower, A. 2005. Decreased gene expression from T7 promoters may be due to impaired production of active T7 RNA polymerase. Microbial Cell Factories. 4:3.

103. Wells J.A. 1996. Binding in the growth hormone receptor complex.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 11-16.

104. Wang, E.D., Zheng, Y.G., Li, Y., Jiang, W.H., & Yang, Y.L. Expression of gene encoding GL-7ACA acylase in Escherichia coli. 2002. Sheng Wu Ни a Xue. Yu Sheng Wu WuLiXue. Bao. (Shanghai).34:526-531.

105. Xu D., Lin S.L., Nussinov R. 1997b. Protein binding versus protein folding: the role of hydrophilic bridges in protein associations .J. Mol. Biol. 265: 68-84.

106. Xu Q, Buckley D, Guan C, Guo HC. 1999. Structural insights into the mechanism of intramolecular proteolysis. Cell. 98(5):651-61.

107. Xu D., Tsai C.J., Nussinov R. 1997a. Hydrogen bonds and salt bridges across protein-protein interfaces .Protein Eng. 10: 999-1012.

108. Youngsoo Kim, Ki-Hong Yoon, Yongho Khang, Stewart Turley and Wim G. J. Hoi. 2000 The 2.0 A Crystal Structure of Cephalosporin Acylas^.Structure. 8:1059-1068.

109. Yamada C, Kijima K, Ishihara S, Miwa C, Wada K, Okada T, Fukuyama K, Kumagai H, Suzuki H. 2008. Improvement of the glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase activity of a bacterial gamma-glutamyltranspeptidase^j^p/Environ Microbiol.!4(11):3400-9.

110. Yamada, H., Ishii, Y., Noguchi, Y., Miura, Т., Mori, Т., and Saito, Y. 1996. Protein engineering of a cephalosporin С acylase. Ann.N.Y.Acad.Sci. 799:4-81.

111. Y. Li., Yun, D. F., Guan, Y. Q., Peng, H. L., Chen, J. M., He, Y. S., and Jiao, R. C. 1991. Cloning of GL-7-ACA acylase gene from Pseudomonas, sp. 130 and its expression in Escherichia coli. Chin J.Biotechnol. 7: 93-104.

112. Yoon, J., Oh, В., Kim, K., Park, J., Han, D., Kim, К. K, Cha, S. S., Lee, D., and Kim, Y. 2004. A bound water molecule is crucial in initiating autocatalytic precursor activation in an N-terminal hydrolase. J.Biol. Chem. 279:341-347.

113. Yau Ming-Hon, Jun Wang, Paul W.K. Tsang, Wing-Ping Fong. 2006. J1 acylase, a glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase from Bacillus laterosporus Jl, is a member of the a/b-hydrolase fold superfamily. FEBS Letters. 580:1465-1471.

114. Yong Li, Weihong Jiang, Yunliu Yang, Guoping Zhao, Enduo Wang. 1998. Overproduction and Purification of Glutaryl 7-Amino Cephalosporanic Acid Acylase // Protein Expression and Purification. 12:.233-238.

115. Young S. Lee, Sung S. Park. 1998. Two-Step Autoeatalytie Processing of the Glutaryl 7-Aminocephalosporanic Acid Acylase from Pseudomonas sp. Strain GK16. 1998. Journal of Bacteriology. 180:4576-4582.

116. Zhou, H., Wei, Z., Yang, Y., 1997. Studies on purification and properties of GL-7ACA acylase from CU334. Acta Microbiol. Sin. 37: 196-201.

117. Zemla A. LGA: 2003 A method for finding 3D similarities in protein structures.Nucleic Acids Res. 31: 3370-3374.

118. Zhang, Q. J., and Xu, W. X. 1993. Morphological physiological and enzymatic characteristics of cephalosporin acylase producing Arthrobacter strain 45-A. Arch. Microbiol. 159:392-395.

119. Zhao H, Chockalingam K, Chen Z. 2002. Directed evolution of enzymes and pathways for industrial biocatalysis. Curr Opin Biotechnol. 13(2): 104-10.

120. Wei Zhang, Xi Huang, Guoping Zhao, and Weihong Jiang. 2004. Affinity labeled glutaryl-7-amino cephalosporanic acid acylase С130 can hydrolyze the inhibitor during crystallization Biochemical and Biophysical Research Communications (BBRC). 313:555—558.

121. Zhang Wei, Yuan Liu, Huabao Zheng, Sheng Yang and Weihong. 2005. Improving the Activity and stability of Gl-7ACA-acylase CA130by site-directed mutagenesis. Appl Environ Microbiol.71:5290-6.

122. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. 1984. 479с.

123. С. В. Хороненкова, В. И. Тишков. 2008. Оксидаза D-аминокислот: физиологическая роль и применение. Успехи биологической химии. 48: 359376