Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биокаталитической технологии производства 7-аминоцефалоспорановой кислоты

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка биокаталитической технологии производства 7-аминоцефалоспорановой кислоты"

На правах рукописи

ЯХКИНД МИХАИЛ ИЛЬИЧ

ОС334Э 16 15

РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА 7-АМИНОЦЕФАЛОСПОРАНОВОЙ КИСЛОТЫ

Специальности: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.00.16-Экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

1 1 ФЕВ 2010

Москва-2010

003491615

Работа выполнена в ГОУ ВПО Пензенской государственной технологической академии (ПГТА) на кафедре "Технологии и инженерные средства защиты окружающей среды"

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Таранцева Клара Рустемовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Никитин Александр Викторович

кандидат химических наук Курочкина Валентина Борисовна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН

Защита диссертации состоится "25" февраля 2010 г. в 16:00 на заседании диссертационного совета Д 212.145.03 при Московском государственном университете инженерной экологии по адресу: 105066, г. Москва, ул. Старая Басманная, д. 21/4, ауд. им. J1.A. Костандова (JI 207).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета инженерной экологии (МГУИЭ).

Автореферат диссертации разослан января 2010 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. 7-Аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК) - ключевой полупродукт для синтеза большинства полусинтетических цефалоспори-нов, которые являются наиболее применяемой группой антибиотиков. В России 7-АЦК не производят и поэтому закупают субстанции и готовые лекарственные формы цефалоспориновых антибиотиков за рубежом, что обуславливает их высокую стоимость и снижает лекарственную безопасность государства.

В специализированных научных учреждениях - Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков (ВНИИА), позже Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА), и его Пензенском филиале (ПФ ВНИИА, ПФ ГНЦА), позже Пензенском научно-исследовательском и технологическом институте антибиотиков (ПНИТИА), начиная с 1981 г. по госзаказам № 103, 42-0263-02 и 140-187-БМ проводились исследования и разработка вначале химической, а затем энзиматической технологии промышленного получения 7-АЦК. После ликвидации ПНИТИА научно-исследовательская работа продолжена в Пензенской государственной технологической академии при поддержке РФФИ, гранты № 07-08-00557,09-08-07049.

Актуальность указанной проблемы определила выбор направления исследования и основное содержание работы.

Цели и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлась разработка биокаталитической технологии производства 7-АЦК для промышленного освоения на российских предприятиях.

Для реализации поставленной цели автором сформулированы и решены следующие задачи:

- проведен сравнительный анализ существующих за рубежом технологий синтеза 7-АЦК и выбраны наиболее перспективные;

- на основе выбранных вариантов разработаны опытно-промышленные технологии получения 7-АЦК с учетом особенностей отечественного производства;

- проведен сравнительный анализ воздействия этих опытно-промышленных технологий на окружающую среду;

- предложена безопасная ресурсосберегающая биокаталитическая технология производства 7-АЦК для отечественных предприятий.

Научная новизна.

- в соответствии с характеристиками ферментов для обеих энзиматичес-ких стадий синтеза 7-АЦК выбраны и обоснованы оптимальные условия проведения процессов: температура, рН и оптимальная начальная концентрация цефа-лоспорина С.

- установлена зависимость протекания всех стадий процесса энзиматиче-ского синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного дезаминирования. Показано, что чем меньше давление кислорода, тем больше продолжительность процесса окисления, что приводит к уменьшению выхода тутарил-7-АЦК на этой стадии из-за гидролиза продуктов реакции. Установ-

лено, что уменьшение выхода глутарил-7-АЦК на первой стадии приводит к уменьшению выходов на последующих стадиях дезацилирования и осаждения.

- предложены и подтверждены кинетические модели для обеих энзимати-ческих стадий синтеза 7-АЦК. Для стадии окисления это модель линейной зависимости скорости реакции от давления кислорода, причем константа скорости Кр зависит от условий массопередачи для данной системы. Для стадии дезацилирования - модель, использующая уравнение Михаэлиса-Ментен, в котором константы ^ и Кт также зависят от условий массопередачи для данной системы.

- установлено, что обе энзиматические стадии протекают в диффузионном режиме, поэтому при масштабировании этих процессов на стадии окисления необходимо достичь по возможности большего значения константы скорости К? как характеристики массопередачи, а также определить предельное значение давления /> , при котором скорость реакции перестает зависеть от давления. На стадии дезацилирования необходимо достичь по возможности большего значения константы V как характеристики массопередачи.

Практическая значимость работы.

- разработана опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С двухстадийным энзиматическим дезацилиро-ванием с использованием иммобилизованных ферментов, которую можно использовать как основу при организации промышленного производства 7-АЦК в Российской Федерации. Для данной технологии разработана нормативно-техническая документация для промышленного освоения 7-АЦК: опытно-промышленный регламент на получение 7 АЦК методом двухстадийного энзиматичес-кого дезацилирования (ОПР 64-0263-55-2000); технические условия на 7-АЦК (ТУ 0263-15-2000) и решены вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов. Предложенная технология апробирована на ОАО "Биосинтез" (г. Пенза) на пилотной установке.

- проведен сравнительный анализ энзиматической технологии получения 7-АЦК и химической. Показано, что на 1 кг 7-АЦК при энзимэтической технологии: суммарный расход реагентов в 7 раз меньше; расход питьевой воды в 11 раз меньше; выбросы в атмосферу в 24 раза меньше; количество сточных вод и отходов в 16 раз меньше, чем при химической технологии. При этом выход готового продукта при энзимэтической технологии (79 %) больше, чем при химической (76 %).

- даны рекомендации для масштабирования разработанных процессов в промышленном оборудовании.

На защиту выносятся.

- технологические решения по условиям проведения процесса двухстадийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С и осаждения целевого продукта;

- установленные зависимости протекания всех стадий энзиматического синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного деза-минирования;

- кинетические модели для стадии окисления и стадии дезацилирования процесса синтеза 7-АЦК;

- предложения по масштабированию разработанных процессов в промышленном оборудовании;

- результаты сравнительного анализа воздействия на окружающую среду энзиматической и химической технологии получения 7-АЦК;

- опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК двухстадийным энзиматическим дезацилированием с использованием иммобилизованных ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: Всесоюзной конференции "Биосинтез вторичных метаболитов" (Пущино, 1987); Всесоюзной конференции "Наука и производство в решении комплексной проблемы "Антибиотики" (Москва, 1989); IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Юрмала, 1991); V Международной научно-практической конференции "Медицинская экология" (Пенза, 2006); III Всероссийской научно-практической конференции "Окружающая среда и здоровье" (Пенза, 2006); IX Международной научно-практической конференции "Экология и жизнь" (Пенза, 2006); I Международаом конгрессе "Экология и безопасность жизнедеятельности промышленно-транспортных комплексов" (Тольятти, 2007); IV Всероссийской научно-практической конференции "Окружающая среда и здоровье" (Пенза, 2007); XXIII Международном симпозиуме "Новые технологии в образовании, науке и экономике" (Москва - Сидней, 2008); XXIV Международном симпозиуме "Новые технологии в образовании, науке и экономике" (Москва - Сингапур, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, и две монографии.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, результатов и выводов, содержит список литературы (488 наименований). Работа изложена на 210 страницах и включает 18 рисунков и 17 таблиц.

Автор выражает признательность всем сотрудниками ПНИТИА и ОАО "Биосинтез" (г. Пенза), которые работали вместе с ним при воспроизведении технологий на опытной и пилотной установках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы основная цель, охарактеризована научная новизна и практическая значимость полученных результатов, сформулированы основные положения, выносимые на защиту.

1. Анализ существующих технологий получения 7-АЦК

Проведен анализ известных химических и энзиматических технологий получения 7-АЦК из природного антибиотика цефалоспорина С.

Выявлено, что оптимальным химическим методом получения 7-АЦК из цефалоспорина С в настоящее время является его взаимодействие с пятихлористым фосфором при силильной защите реакционноспособных групп. При этом методе используются разнообразные химические реагенты, вредные для человека и окружающей среды, требуется регенерация значительных количеств органических растворителей, в ходе процесса образуется большое количество отходов.

В связи с этим актуальна разработка энзиматической технологии получения 7-АЦК из цефалоспорина С с использованием иммобилизованных ферментов, в которой применение химических реагентов сведено к минимуму.

Установлено, что в настоящее время в мире параллельно разрабатываются две энзиматические технологии получения 7-АЦК - одностадийная и двух-стадийная. При этом до последнего времени не удалось разработать технологию одностадийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С с таким выходом, чтобы ее можно было применить в промышленности.

Напротив, способ двухстадийного энзиматического дезацилирования позволяет получить 7-АЦК из цефалоспорина С с достаточно высоким выходом на уровне 70-84 %. Этот выход сопоставим с выходом при упомянутой выше оптимальной химической технологии получения 7-АЦК, который находится на уровне 76-91 %.

В связи с этим в рамках данного диссертационного исследования была поставлена задача разработать биокаталитическую опытно-промышленную технологию получения 7-АЦК двухстадийным энзиматическим дезацилированием.

2. Объекты и методы исследования

Исследуемые материалы. Для изучения процесса трансформации цефалоспорина С в 7-АЦК двухстадийным энзиматическим дезацилированием использовали натриевую соль цефалоспорина С производства ПНИТИА с массовой долей цефалоспорина С-кислоты 72-75 %, и коммерчески доступные иммобилизованные ферменты: оксидазу D-аминокислот Т. variabilis и глутарилаци-лазу Acinetobacter sp., рекомбинантную в Е. coli, компании Roche (Швейцария).

Контрольно-аналитические методы. Величину pH определяли с помощью иономеров ЭВ-74 (СССР) и И-130М (Белоруссия), для аппарата АНКУМ-2М - с помощью встроенного иономера. Концентрации всех веществ в растворах определяли методом обращеннофазовой ВЭЖХ с помощью жидкостных хроматографов "Милихром" (Россия) и Waters 510 с детектором Waters 486 (США) методом внешнего стандарта, используя раствор соответствующего вещества (стандартного образца), в аттестованных лабораториях ПНИТИА и ОАО "Биосинтез". Поскольку для а -кетоадипинил-7-АЦК стандартный образец отсутствовал, ее концентрацию рассчитывали, используя раствор птутарил-7-АЦК. Для цефалоспорина С во всех случаях рассчитывали концентрации в пересчете на кислоту.

Химическая схема процесса. Подробная химическая схема всех стадий процесса приведена на рис. 1. На первой стадии проводят окисление цефалоспорина С до глутарил-7-АЦК кислородом (или воздухом) под действием окси-дазы D-аминокислот в водном растворе.

Процесс окисления протекает в два этапа. Вначале под действием кислорода и оксидазы D-аминокислот происходит окислительное дезаминирование цефалоспорина С и образуется а-кетоадипинил-7-АЦК, при этом в качестве побочных продуктов выделяются аммиак и пероксид водорода (образуется из воды). Затем под действием этого пероксида водорода (самопроизвольно, без участия ферментов) происходит окислительное декарбоксилирование а-кетоадипинил-7-АЦК до ппута-рил-7-АЦК, при этом в качестве побочных продуктов выделяются диоксид углеро-

да и вода (из пероксида водорода). Необходимо добавление раствора аммиака для нейтрализации диоксида углерода и под держания оптимального рН.

После отделения иммобилизованного фермента раствор глутарил-7-АЦК направляют на следующую стадию без ее выделения. Для разложения пероксида водорода, который может окислить глутарилацилазу, отфильтрованный раствор глутарил-7-АЦК выдерживают в течение 30 минут при перемешивании для окончания окислительного декарбоксилирования.

Вторая стадия - энзиматическое дезацилирование глутарил-7-АЦК до 7-АЦК под действием глутарилацилазы в водном растворе с отщеплением глу-таровой кислоты. Необходимо добавление раствора аммиака для нейтрализации глутаровой кислоты и поддержания оптимального рН. После отделения иммобилизованного фермента раствор натриевой соли 7-АЦК направляют на осаждение. Оба иммобилизованных фермента используются многократно.

Рис. 1. Схема энзиматического дезацилирования натриевой соли цефалоспорина С

Перед осаждением раствор натриевой соли 7-АЦК обрабатывают активным утем для удаления окрашивающих примесей и примесей родственных соединений.

Осаждение 7-АЦК из осветленного раствора проводят ступенчато при охлаждении. Вначале раствор 7-АЦК подкисляют 20 % раствором хлористоводородной кислоты до рН 5,5 ±0,1 и выдерживают при медленном перемешивании в течение 10-15 минут для начала кристаллизации. Далее раствор медленно подкисляют до рН 4,0 ±0,1, после чего добавляют охлажденный ацетон в объеме 60 % от объема раствора 7 АЦК, вновь доводят рН до 4,0 ±0,1 и выдерживают при перемешивании 2,0-2,5 часов, затем без перемешивания 16-18 часов. Продукт отделяют, промывают ацетоном и сушат.

Условия проведения экспериментов. Эксперименты проводили в лабораторных, опытно-промышленных и промышленных условиях. Во всех случаях эксперименты проводили сериями, от 5 до 8 экспериментов в каждой. Первые два эксперимента любой серии не учитывались, поскольку выход в них был ниже из-за того, что часть глутарил-7-АЦК и 7-АЦК оставалась в своих иммобилизованных ферментах. Перерыв между экспериментами внутри серии составлял не более одних суток.

Лабораторные эксперименты. Обе энзиматические стадии проводили в лабораторных стеклянных стаканах вместимостью 1 л. Для окисления использовали кислород под атмосферным давлением. Было проведено 4 серии экспериментов, в ходе которых были подобраны оптимальные параметры процессов: начальная концентрация цефалоспорина С, рН среды и температура на обеих энзиматических стадиях. Загрузка ферментов - 2600 ед/л для оксидазы, 5000 ед'л для глутарилацилазы.

Опытно-промышленные эксперименты. Опытно-промышленная технология разрабатывалась по госзаказу 140-187-БМ. Для проведения обеих энзиматических стадий использовали аппараты АНКУМ-2М (СССР) вместимостью 10 л, остальные операции проводили в лабораторном оборудовании. Была проведена серия экспериментов с параметрами, подобранными в лабораторных экспериментах: температура 20°С; для первой стадии рН 7,2, для второй - рН 8,1. Для окисления использовали кислород под давлением 1,0 ати. Начальная концентрация цефалоспорина С была увеличена с 30 г/л в лабораторных экспериментах до 33 г/л в опытно-промышленных.

По результатам опытно-промышленных экспериментов был разработан опытно-промышленный регламент на получение 7-АЦК методом двухстадий-ного энзиматического дезацилирования и технические условия на 7-АЦК. Для данной технологии были решены также вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов.

Эксперименты на пилотной установке. В этих экспериментах использовали специально сконструированный стальной аппарат, позволяющий проводить процесс под давлением. Была проведена серия экспериментов, в которой для окисления использовали воздух под давлением 2,0 ати, при этом количество иммобилизованной оксидазы было увеличено до 3100 ед/л. Затем была проведена серия экспериментов с подачей кислорода под давлением 0,3 ати.

Кинетические расчеты. Зависимости, предложенные для упрощенных кинетических моделей обеих энзиматических стадий, выражали в линейной форме. Построение уравнений линейной зависимости по точкам методом наименьших квадратов, вычисление констант и статистических характеристик проводили при помощи программы Microsoft Excel.

3. Результаты экспериментов и их обсуждение

Влияние начальной концентрации цефалоспорина С. Обнаружено, что при увеличении начальной концентрации цефалоспорина С с 30 г/л (72 ммоль/л) до 40 г/л (96 ммоль/л) продолжительность процесса увеличивается с 4,33 до 6 часов, поскольку скорость процесса лимитируется концентрацией кислорода. В результате наблюдается некоторое уменьшение выхода глутарил-7-АЦК - с 89 до 86 %, по всей видимости, за счет гидролиза продуктов реакции в течение этого времени. Уменьшение выхода на первой стадии было скомпенсировано увеличением выходов на последующих стадиях, вероятно, за счет более высокой концентрации реагентов, в результате чего общий выход составил 70,5 % для 30 г/л и 69,5 % для 40 г/л.

Кроме того, увеличение начальной концентрации цефалоспорина С приводит к повышению содержания родственных примесей в 7-АЦК. Поэтому в дальнейших экспериментах использовали начальную концентрацию 30 г/л. В экспериментах, проводимых в АНКУМ-2М, начальная концентрация была увеличена до 33 г/л (79 ммоль/л), поскольку в этом случае ожидалось значительное уменьшение продолжительности процесса окисления и увеличение выхода.

Влияние рН. Известно, что оба фермента проявляют максимальную активность при рН 7,5-8,5. Однако использование рН выше 8 нецелесообразно в связи с тем, что уменьшается стабильность как продуктов реакции, так и самих ферментов.

Поэтому при изучении влияния рН на стадии окисления использовали рН среды 7,2; 7,5 и 7,8. Заметных отличий по выходу на этой стадии не было обнаружено (88-89 %). Продолжительность процесса с увеличением рН несколько уменьшалась. В последующих экспериментах для уменьшения скорости разложения продуктов реакции использовали рН 7,2-7,3.

При изучении влияния рН на стадии дезацилирования использовали рН среды 7,5 и 8,1. Было обнаружено, что при рН 7,5 выход на этой стадии несколько ниже, чем при рН 8,1 - 86 % против 89 %, также немного уменьшается выход на стадии осаждения. Поэтому в последующих экспериментах использовали рН 8,0-8,1.

Влияние температуры. Несмотря на то, что оба фермента имеют максимальную активность при температуре 50-55°С, оптимальной для них является температура от 20 до 30°С. При превышении этой температуры уменьшается стабильность продуктов реакции и самих ферментов.

Для стадии окисления в лабораторных экспериментах было установлено, что увеличение температуры с 20 до 30°С ускоряет реакцию - продолжительность процесса уменьшается с 4,5 до 3,5 часов. Однако выход при этом уменьшился с 89 до 87 %, очевидно, из-за увеличения скорости процессов разложения.

Для стадии дезацилирования в лабораторных экспериментах было показано, что увеличение температуры с 20 до 30°С практически не влияет на выход -88-88,5 %. Поэтому дальнейшие эксперименты проводили при 20°С.

Влияние давления кислорода на стадии окисления. При всех вариантах окисления цефалоспорина С его концентрация убывает со временем почти линейно (рис. 2). Однако продолжительность процесса окисления находится в обратной зависимости от давления кислорода (рис. 3). Увеличение продолжительности процесса приводит к уменьшению выхода на этой стадии, очевидно, из-за большей степени гидролиза продуктов реакции - цефалоспорина С, а-кетоа-дипинил-7-АЦК и глутарил-7-АЦК.

Вследствие уменьшения выхода на стадии окисления уменьшается концентрация глутарил-7-АЦК в растворе, поступающем на дезацилирование. При этом наблюдается увеличение продолжительности процесса дезацилирования и некоторое уменьшение выхода на этой стадии (рис. 3). Поэтому концентрация 7-АЦК в растворе, поступающем на осаждение, уменьшается при снижении давления кислорода на стадии окисления. Так как остаточная концентрация 7-АЦК в маточнике практически одинакова, то чем ниже концентрация 7-АЦК в растворе, поступающем на осаждение, тем меньше выход на этой стадии.

В итоге общий выход 7-АЦК от цефалоспорина С уменьшается с понижением давления кислорода на стадии окисления. Для аппарата АНКУМ-2М выход готового продукта при 2,0 ата составил 79 %, для лабораторного оборудования - 73 % при 1,3 ата, 71 % при 1,0 ата и 62 % при 0,63 ата (рис. 3). Кроме того, параллельно наблюдается увеличение содержания примесей в конечном продукте - с 2 до 3,5 %.

1 - пилотная установка, кислород 0,63 ата 2 - лабораторные эксперименты, кислород 1,0 ата

Рис. 2. Изменение концентрации реагентов в ходе процесса окисления

■ - цефалоспорин С .Вши,«

о - а-кетоадш1Ин1И-7-АЦК

• - гаутарил-7-АЦК

ю-

ю-

о

70-

2-

03

1.5

15

2

Рис. 3. Зависимость выходов (слева) и продолжительности (справа) процессов от давления кислорода на стадии окисления

■ - стадия окисления о - стадия дешшлирования

• - стадия осаждения о-общий выход

Кинетика процесса окисления. Исследования показали, что концентрация це-фалоспорина С при окислении убывает со временем почта линейно практически до полного исчерпания (0,5-1 % от исходного). Коэффициенты корреляции Я линейных уравнений прямых, построенных по точкам для графиков концентраций цефа-лоспорина С, приведенных на рис. 2, составили соответственно 0,992, 0,993, 0,992 для лабораторного оборудования и 0,989 для аппарата АНКУМ-2М. При этом продолжительность процесса окисления находится в обратной зависимости от давления кислорода (рис. 3), т.е. при невысоких концентрациях кислорода в растворе данный фактор является лимитирующим и определяет общую скорость реакции.

Исходя из этого, при построении упрощенной кинетической модели для стадии окисления было принято предположение, что в данных условиях скорость реакции не зависит от концентрации цефалоспорина С, но прямо пропорциональна концентрации растворенного кислорода, которая, в свою очередь, прямо пропорциональна давлению кислорода. При этом скорость реакции v, ммоль/(л-мин), может быть выражена линейным уравнением:

где Кр - константа скорости, ммоль/(л-мин-ат), Р0г - давление кислорода, ата.

Для проверки этого предположения были рассчитаны средние скорости реакции окисления V для каждого из четырех давлений кислорода Р0,, и по точкам 1, 2 и 3 и началу осей координат была построена прямая (рис. 4). Для точки 1 при этом была сделана поправка, поскольку в этом случае было взято больше фермента. Коэффициент корреляции Я. соответствующего линейного уравнения равен 0,999, что подтверждает наличие предложенной линейной зависимости для данного оборудования. Константа скорости Кр по этому линейному уравнению равна 0,264 ммоль/(л-мин-ат). Ее также можно выразить на г иммобилизованного фермента (учитывая, что взято 110 г/л фермента), тогда она равна 2,40 мкмоль/(г-мин-ат).

Точка 4 не находится на этой прямой, поскольку условия проведения процесса окисления для точек 1, 2 и 3 (лабораторное оборудование) были близки, тогда как для точки 4 (аппарат АНКУМ-2М) они заметно отличались. Для аппарата АНКУМ-2М условия перемешивания гораздо лучше, поэтому выше конценг-

рация растворенного кислорода и лучше условия массопередачи у поверхности иммобилизованного фермента, что важно для диффузионного режима, поэтому при прочих равных условиях скорость данной реакции будет выше.

Av, ммоль/(л-мин)

I - пилотная установка, кислород 0,63 ата

>аторные эксперименты, кмслород 1,0 ата

4 3 - пилотная установка, кислород 1,3 ата 4 - АНКУМ-2М, кислород 2,0 ата

Рис. 4. Зависимость скорости окисления от давления кислорода

Таким образом, константа скорости Кр зависит от условий массопередачи в аппарате, и чем лучше эти условия, тем она выше. Для проверки этого предположения определили константу скорости Кр для аппарата АНКУМ-2М, проведя прямую через точку 4 и начало осей координат и поделив среднюю скорость данного процесса на давление. Полученная константа составила 0,498 ммоль/(л-мин-ат), или 4,53 мкмоль/(гмин-ат), т.е. почти вдвое больше, чем для лабораторного оборудования, что подтверждает выдвинутое предположение.

Очевидно, что с увеличением давления кислорода будет достигнуто некоторое предельное значение Р , когда этот фактор перестанет быть лимитирующим. В результате график (рис. 4) сначала начнет изгибаться, а выше значения Р станет параллельным оси абсцисс. При этом кинетика процесса окисления будет описываться другими уравнениями.

Рекомендации по масштабированию процесса окисления. Для того, чтобы достичь по возможности большего значения константы скорости Кр как характеристики массопередачи, рекомендуется для каждой установки построить график зависимости скорости реакции окисления V от давления кислорода Р0г и определить эту константу, а также, если возможно, предельное значение давления Р , поскольку использовать более высокое давление не имеет смысла. Это значение константы скорости Кр можно будет сравнивать с полученным для аппарата АНКУМ-2М или другого оборудования.

Для улучшения массопередачи рекомендуется использовать многоярусные мешалки с плоскими вертикальными лопастями, чтобы свести к минимуму измельчение иммобилизованного фермента. Скорость вращения мешалки должна быть по возможности больше. Для улучшения массопередачи следует использовать кольцевые барботеры с большим количеством отверстий. По возможности также рекомендуется увеличивать скорость подачи кислорода.

Кинетика процесса дезацилирования. Большая продолжительность процесса дезацилирования для лабораторного оборудования (рис. 3) объясняется тем, что для аппарата АНКУМ-2М условия массопередачи у поверхности иммобилизованного

фермента лучше, что важно для диффузионного режима и приводит к увеличению скорости этой реакции. Кроме того, уменьшение начальной концентрации глугарил-7-АЦК для лабораторного оборудования само по себе также приводит к некоторому уменьшению скорости процесса дезацилирования, поскольку эта скорость определяется концентрацией глутарил-7-АЦК как единственного исходного реагента.

В результате в аппарате АНКУМ-2М скорость процесса дезацилирования больше й достаточно быстро достигается конверсия глутарил-7-АЦК 97,5 %, тогда как в лабораторном оборудовании даже при большей продолжительности процесса она составляет только 95 %. С увеличением продолжительности процесса также происходит уменьшение выхода вследствие большей степени гидролиза продуктов. В этих условиях не имеет смысла увеличивать продолжительность процесса дезацилирования, поскольку гидролиз сводит на нет возможное небольшое увеличение конверсии.

При построении упрощенной кинетической модели для стадии дезацилирования использовали уравнение Михаэлиса-Ментен для мономолекулярных ферментативных реакций в стационарных условиях, где скорость реакции V, ммоль/(л-мин), определяется как:

V ■С

у — гш

КЯ+СГА'

где ^ - максимальная скорость реакции, ммоль/(л-мин), Кт - константа Ми-хаэлиса, ммоль/л, Сгл - концентрация плутарил-7-АЦК, ммоль/л.

При этом график зависимости V от СГА должен представлять из себя гиперболу, и полученные зависимости близки к этому (рис. 5).

Однако в диффузионном режиме вычисленные значения констант У^ и Кт будут зависеть от условий массопередачи для данной системы. Для проверки этого предположения были вычислены значения этих констант для всех четырех вариантов проведения процесса. Использовали метод Лайнуивера-Берка, в котором это уравнение выражается в форме:

1 = 1 Кя 1

у V УС'

у 'пих шах ГА

по точкам строили прямую зависимости 1/у от УСГА и по соответствующему линейному уравнению вычисляли константы ^ и Кт. Максимальную скорость реакции также выражали в расчете на г иммобилизованного фермента (учитывая, что взято 50 г/л фермента). Результаты расчетов приведены в таблице 1.

Судя по значениям коэффициентов корреляции Я, зависимость 1/у от 1 /СГА для каждого из вариантов достаточно близка к линейной, причем для аппарата АНКУМ-2М эта корреляция лучше. При этом для всех трех вариантов проведения процесса в лабораторном оборудовании константы и Кт достаточно близки друг к другу, тогда как для аппарата АНКУМ-2М максимальная скорость реакции Кш приблизительно в 2 раза больше, чем для лабораторного оборудования, константа Михаэлиса Кт также несколько больше. Это подтверждает выдвинутое выше предположение, что в данном случае для описания

11

процесса можно использовать уравнение Михаэлиса-Ментен, но его константы зависят от условий массопередачи. При этом максимальную скорость реакции ^ можно рассматривать как характеристику массопередачи, чем лучше условия массопередачи, тем она выше.

1 - пилотная установка, кислород 0,63 ата 2 - лабораторные эксперименты, кислород 1,0 а та

3 - пилотная установка, кислород 1,3 ата 4 - АНКУМ-2М, кислород 2,0 ата

Рис. 5. Изменение концентрации реагентов в ходе процесса дезацилирования • - глутаркл-7-АЦК «-7-АЦК

Таблица 1

Константы и Кт дом различных вариантов проведения процесса дезацилирования

Варианты проведения процесса Давление кислорода на стадии окисления, />0., ата Максимальная скорость ммоль/(лмин) Максимальная скорость Кюю, цмоль/(гмин) Константа Михаэлиса Кт, ммоль/л Коэффициент корреляции R линейного уравнения

Пилотная установка 0,63 4,0 80 129 0,986

Лабораторные эксперименты 1,0 4,6 92 128 0,989

Пилотная установка 1,3 4,9 98 138 0,990

АНКУМ-2М 2,0 9.8 196 155 0,999

Рекомендации по масштабированию процесса дезацилирования. Для достижения по возможности большего значения константы У^ как характеристики массопередачи рекомендуется для каждой установки экспериментально определить эту константу. Это значение можно будет сравнивать с полученным для аппарата АНКУМ-2М или другого оборудования. Видимо, следует использовать на этой стадии такой же аппарат, как на стадии окисления, но без устройства для барботажа.

Выбор условий осаждения 7-АЦК. На моделях было проверено три режима осаждения (при охлаждении): 1) сразу доводят рН раствора до 4,0±0,1, добавляют ацетон, вновь доводят рН и выдерживают 2,0-2,5 часа при перемешивании; 2) вначале доводят рН раствора до 5,5 ± 0,1, выдерживают при медленном перемешивании в течение 10-15 минут для начала кристаллизации, далее медленно дово-

дят рН до 4,0 ±0,1 и выделяют продукт, как описано в предыдущем варианте; 3) процесс проводят, как описано в варианте 2, но перед фильтрацией выдерживают суспензию без перемешивания при той же температуре в течение 16-18 часов.

Выход при реализации вышеуказанных режимов составил, соответственно, 85,2 %; 88,5 % и 90,4 %, поэтому в последующих экспериментах использовали только третий вариант осаждения. 4. Сравнительный анализ химической и энзиматической технологий получения 7-АЦК, в том числе по воздействию на окружающую среду

Для обоснования правильности выбора энзиматической технологии промышленного производства 7-АЦК в России был проведен сравнительный анализ химической и энзиматической технологий.

Сравнивалась разработанная в ходе данного исследования биокаталитическая технология получения 7-АЦК методом двухстадийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С, и химическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С на основе взаимодействия с пятихлористым фосфором при синильной защите реакционноспособных групп.

Показано, что при энзиматической технологии суммарный расход реагентов на 1 кг 7-АЦК в 7 раз меньше, чем при химической, при этом отсутствуют такие токсичные реагенты как хлорсиланы, пятихлористый фосфор и Ы,Ы-ди-метиланилин, представляющие опасность для обслуживающего персонала и окружающей среды.

Расход органических растворителей при энзиматической технологии без учета регенерации в 7 раз меньше, с учетом регенерации - в 8 раз меньше. При этом в химической технологии используется три органических растворителя -хлористый метилен, метанол и ацетон, при энзиматической один - ацетон.

Расход питьевой воды на 1 кг 7-АЦК при энзиматической технологии в 11 раз больше, чем при энзиматической.

При этом выход готового продукта при энзиматической технологии получения 7-АЦК выше, чем при химической, соответственно, 79 % и 76 %. Качество конечного продукта при энзиматической технологии получения 7-АЦК также выше, чем при химической. Все это подтверждает преимущества энзиматической технологии.

В пользу энзиматической технологии получения 7-АЦК свидетельствуют также результаты сравнительного анализа выбросов в атмосферу, сбросов в гидросферу и количества образующихся твердых отходов.

Установлено, что выбросы в атмосферу в ходе основного технологического процесса при энзиматической технологии в 24 раза меньше, выбросы органических растворителей при регенерации - в 7 раз меньше чем при химической технологии, при этом состав выбросов заметно менее опасен. Количество сточных вод и отходов при энзиматической технологии в 16 раз меньше, чем при химической.

Таким образом, использование энзиматической технологии получения 7-АЦК вместо химической многократно снижает загрязнение окружающей среды и позволяет формировать экологически доброкачественную среду обитания человека и животных. Все это позволяет рекомендовать разработанную биокаталитическую технологию производства 7-АЦК для промышленного освоения в России.

Основные результаты и выводы

1. Проведен сравнительный анализ существующих за рубежом технологий синтеза 7-АЦК из цефалоспорина С и выбран наиболее перспективный вариант - двухстадийное энзиматическое дезацилирование, включающее окислительное дезаминирование цефалоспорина С до глутарил-7-АЦК и дезацилирование ее до 7-АЦК.

2. Произведен поиск и выбор иммобилизованных ферментов, осуществляющих обе основные стадии двухстадийного энзиматического дезацилирова-ния цефалоспорина С - оксидазы D-аминокислот Т. variabilis и глутарилацила-зы Acinetobacter sp., рекомбинантной в Е. coli.

3. В соответствии с характеристиками ферментов для обеих энзиматичес-ких стадий выбраны и обоснованы оптимальные условия проведения процессов: для стадии окислительного дезаминирования: температура (20 ± 1 )°С, рН 7,2 ± 0,1; для стадии дезацилирования: температура (20± 1)°С, рН 8,1 ±0,1. Оптимальная начальная концентрация цефалоспорина С-кислоты - 30-33 г/л (72-79 ммоль/л).

4. Установлена зависимость протекания всех стадий процесса энзиматического синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного дезаминирования. Показано, что чем меньше давление кислорода, тем больше продолжительность процесса окисления, что приводит к уменьшению выхода глутарил-7-АЦК на этой стадии из-за гидролиза продуктов реакции. Установлено, что уменьшение выхода глутарил-7-АЦК на первой стадии приводит к уменьшению выходов на последующих стадиях дезацилирования и осаждения.

5. Предложены и подтверждены кинетические модели для обеих энзимати-ческих стадий синтеза 7-АЦК. Для стадии окисления это модель линейной зависимости скорости реакции от давления кислорода, причем константа скорости Кр зависит от условий массопередачи для данной системы. Для стадии дезацилирования - модель, использующая уравнение Михаэлиса-Ментен, в котором константы V^ и Кт также зависят от условий массопередачи для данной системы.

6. Установлено, что обе энзиматические стадии протекают в диффузионном режиме, поэтому при масштабировании этих процессов на стадии окисления необходимо достичь по возможности большего значения константы скорости Кр как характеристики массопередачи, а также определить предельное значение давления при котором скорость реакции перестает зависеть от давления. На стадии дезацилирования необходимо достичь по возможности большего значения константы V как характеристики массопередачи.

7. Проведен сравнительный анализ энзиматической технологии получения 7-АЦК и химической. Показано, что на 1 кг 7-АЦК при энзиматической технологии: суммарный расход реагентов в 7 раз меньше; расход питьевой воды в 11 раз меньше; выбросы в атмосферу в 24 раза меньше; количество сточных вод и отходов в 16 раз меньше, чем при химической технологии. При этом выход готового продукта при энзиматической технологии (79 %) больше, чем при химической (76 %).

8. Разработана опытно-промышленная биокаталигическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С двухстадийным энзиматическим дезацилиро-ванием с использованием иммобилизованных ферментов, которую можно ис-

14

пользовать как основу при организации промышленного производства 7-АЦК в Российской Федерации. Для данной технологии разработана нормативно-техническая документация для промышленного освоения 7-АЦК: опытно-промышленный регламент на получение 7-АЦК методом двухстадийного энзиматичес-кого дезацилирования (ОПР 64-0263-55-2000); технические условия на 7-АЦК (ТУ 0263-15-2000) и решены вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов. Предложенная технология апробирована на ОАО "Биосинтез" (г. Пенза) на пилотной установке.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Грабарник М.С., Письмарова О.Б., Яхкинд М.И., Володина Т.И. Количественные аспекты использования силильных методов защиты в производстве цефалоспориновых антибиотиков. // Всесоюзная конференция "Биосинтез вторичных метаболитов". Тезисы докладов. - Пущино. - 1987. - С. 68.

2. Грабарник М.С., Яхкинд М.И., Письмарова О.Б. Пути совершенствования технологического процесса получения технической натриевой соли цефа-лотина. // Всесоюзная конференция "Наука и производство в решении комплексной проблемы "Антибиотики". Тезисы докладов. - Москва. - 1989. - С. 50.

3. Горбунова С.М., Беляева О.Я., Грабарник М.С., Яхкинд М.И. Синтез, физико-химические свойства и методы аналитического контроля гидроксими-нотиазолов - промежуточных продуктов получения цефалоспориновых антибиотиков. И Всесоюзная конференция "Наука и производство в решении комплексной проблемы "Антибиотики". Тезисы докладов. - Москва. - 1989. - С. 88.

4. Грабарник М.С., Яхкинд М.И., Знаменский Ю.В., Кочережко H.A. Влияние структурных факторов радикала в седьмом положении ядра цефема на биологическую активность цефалоспориновых антибиотиков. // IX Всесоюзный симпозиум по целенаправленному изысканию лекарственных веществ. Тезисы докладов. - Рига. - 1991. - С. 28.

5. Грабарник М.С., Яхкинд М.И., Кочережко H.A.. Связь структура - активность цефалоспориновых антибиотиков. I. Влияние азотных функций на биологическую активность цефалоспоринов - производных 7-аминоцефалоспорановой кислоты. // Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Т. 36. - № 3. - С. 24-28.

6. Грабарник М.С., Яхкинд М.И., Знаменский Ю.В., Кочережко H.A.. Связь структура - активность цефалоспориновых антибиотиков. II. Влияние кислородсодержащих функциональных групп на биологическую активность цефалоспоринов - производных 7-аминоцефалоспорановой кислоты. // Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Т. 36. - № 4. - С. 12-15.

7. Грабарник М.С., Яхкинд М.И., Знаменский Ю.В., Кочережко H.A. Связь структура - активность цефалоспориновых антибиотиков. III. Влияние серосодержащих функциональных групп на биологическую активность цефалоспоринов - производных 7-аминоцефалоспорановой кислоты. // Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Т. 36. - № 4. - С. 15-17.

8. Таранцева K.P., Яхкинд М.И. Сравнительный анализ химических и энзи-матических технологий получения 7-АЦК. // Медицинская экология: Сборник

материалов V Международной научно-практической конференции. - Пенза: ПДЗ. - 2006. - С. 85-88.

9. Таранцева K.P., Яхкинд М.И. Анализ отходов производства 7-аминоцефа-лоспорановой кислоты, полученной по химической и энзиматической технологиям. // Окружающая среда и здоровье: Сборник статей III Всероссийской научно-практической конференции. - Пенза: МНИЦ ПГСХА. - 2006. - С. 191-193.

10. Яхкинд М.И., Таранцева K.P., Тихонова Т.Д. Перспективы применения энзиматических технологий получения цефалоспориновых антибиотиков. // Экология и жизнь: Сборник материалов IX Международной научно-практической конференции. - Пенза: ПДЗ. - 2006. - С. 68-71.

11. Яхкинд М.И., Таранцева K.P. Оценка химической технологии получения 7 АЦК с точки зрения воздействия на окружающую среду. // Экологические проблемы отраслей народного хозяйства: Сборник научных трудов Международной научно-практической конференции. - Пенза: ПГТА. - 2006. - С. 129-140.

12. Таранцева K.P., Яхкинд М.И. Влияние химической технологии получения 7 АЦК на окружающую среду. Н ELPIT 2007. Сборник трудов Первого Международного конгресса "Экология и безопасность жизнедеятельности промыш-ленно-транспортных комплексов". - Тольятти: ТГУ. - 2007. - Т. 1. - С. 411-416.

13. Таранцева K.P., Яхкинд М.И. Влияние энзиматической технологии получения 7-АЦК на окружающую среду. // ELPIT 2007. Сборник трудов Первого международного конгресса "Экология и безопасность жизнедеятельности про-мыш-ленно-транспортных комплексов". - Тольятти: ТГУ. - 2007. - Т. 1. - С. 417-422.

14. Яхкинд М.И., Таранцева K.P. Оценка энзиматической'технологии получения 7 АЦК с точки зрения воздействия на окружающую среду. // Сборник статей IV Всероссийской научно-практической конференции "Окружающая среда и здоровье". - Пенза: РИО ПГСХА. - 2007. - С. 231-234.

15. Яхкинд М.И., Коростелева A.B., Красная Е.Г.; Таранцева K.P. Разработка оптимальной энзиматической технологии получения 7-аминоцефалоспо-рановой кислоты (7-АЦК) из цефалоспорина С и способов утилизации и обезвреживания отходов производства. // Материалы X Международной научно-практической конференции "Интеллектуальный потенциал вузов на развитие Дальневосточного региона России и стран АТР". - Владивосток: Изд-во ВГУ-ЭС. -2008.-Кн. 4.-С. 137-141.

16. Яхкинд М.И., Таранцева K.P. Технология переработки отходов, получаемых в процессе химического синтеза 7-АЦК из солей цефалоспорина С. // Экология и жизнь: Сборник материалов XV Международной научно-практической конференции. - Пенза: ПДЗ. - 2008. - С. 88-90.

17. Яхкинд М.И., Таранцева K.P. Технология переработки отходов, получаемых в процессе энзиматического синтеза 7-АЦК. // Экология и жизнь: Сборник материалов XV Международной научно-практической конференции. - Пенза: ПДЗ.-2008.-С. 86-87.

18. Таранцева К. Р., Яхкинд М. И. О коррозионной стойкости оборудования при получении 7-аминоцефалоспорановой кислоты. // Коррозия: материалы, защита. - 2008. - № 11.-С. 16-18.

19. Таранцева K.P., Яхкинд М.И. О химическом сопротивлении неметаллических материалов оборудования при получении 7-аминоцефалоспорановой кислоты. // Коррозия: материалы, защита. - 2008. - № 12. - С. 34-36.

20. Таранцева K.P., Яхкинд М.И., Казаков В.А. Анализ безопасности технологий получения 7-АЦК. // Новые технологии в образовании, науке и экономике. Труды ХХШ-го Международного симпозиума. - Москва - Сидней: Информационно-издательский центр Фонда поддержки вузов. - 2008. - С. 125-134.

21. Таранцева K.P., Пятирублевый Л.Г., Яхкинд М.И. Выбор материалов на основе квалиметричесюго подхода. // Коррозия: материалы, защита. - 2009. -№6.-С. 13-18.

22. Таранцева K.P., Яхкинд М.И. Анализ воздействия на окружающую среду в процессе синтеза 7-аминоцефалоспорановой кислоты. // Безопасность в техносфере. - 2009. - № 3. - С. 9-14.

23. Таранцева K.P., Яхкинд М.И. Анализ безопасности опытно-промышленной энзиматической технологии получения 7-АЦК и отходов ее производства. // Новые технологии в образовании, науке и экономике. Труды XXIV-ro Международного симпозиума. - Москва - Сингапур: Информационно-издательский центр Фонда поддержки вузов. - 2009. - С. 181-184.

24. Таранцева K.P., Яхкинд М.И. Технологии синтеза 7-аминоцефалоспорановой кислоты и безопасность в техносфере. - Пенза: Изд-во Пенз. гос. технол. акад., 2009. -194 с. - ISBN 978-5-98903-115-3.

25. Таранцева K.P., Яхкинд М.И. Анализ технологий синтеза 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК) и выбор оптимальной безопасной промышленной технологии. - М.: Научный мир, 2009. - 216 с. - ISBN 978-591522-130-6.

Компьютерная верстка Д.Б. Фатеева, Е.В. Рязановой

Сдано в производство 14.01.10. Формат 60x84 '/16 Бумага типогр. №1. Печать трафаретная. Шрифт Times New Roman Суг. Усл. печ. л. 0,97. Уч.-изд. л. 1,0. Заказ № 1736. Тираж 100.

Пензенская государственная технологическая академия. 440605, Россия, г. Пенза, пр. Байдукова/ ул. Гагарина, 1*/11.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Яхкинд, Михаил Ильич

Введение

Глава 1. Анализ существующих технологий получения 7-А ЦТС

1.1. Химические способы получения 7-АЦК

1.1.1. Гидролиз и подобные процессы

1.1.2. Реакция с нитрозилхлоридом

1.1.3. Реакция с тетрафторборатом триэтилоксония

1.1.4. Реакция с пятихлористым фосфором

1.1.4.1. При защищенной боковой аминогруппе и обеих карбоксигруп- 20 пах

1.1.4.2. При силильной защите реакционноспособных групп

1.1.4.3. При защите карбоксигрупп смешанными ангидридами

1.1.5. Через 7-тиоацилпроизводные цефалоспорина С

1.1.6. Сопоставление химических способов получения 7-АЦК

1.2. Энзиматические способы получения 7-АЦК

1.2.1. Одностадийное энзиматическое дезацилирование цефалоспорина 33 С

1.2.1.1. Поиск ферментов, способных дезацилировать цефалоспорин С

1.2.1.2. Цефалоспорин С-ацилаза Pseudomonas sp. SE-83 и ее мутанты

1.2.1.3. Цефалоспорин С-ацилаза Pseudomonas sp. N176 и ее мутанты

1.2.1.4. Природные цефалоспорин С-ацилазы других микроорганизмов

1.2.1.5. Условия проведения одностадийного энзиматического дезаци- 40 лирования цефалоспорина С и общая оценка цефалоспорин С-ацилаз

1.2.1.6. Лучшие мутантные цефалоспорин С-ацилазы

1.2.2, Окислительное дезаминирование цефалоспорина С — первая ста- 43 дия двухстадийного энзиматического дезацилирования

1.2.2.1. Действие оксидаз D-аминокислот на цефалоспорин С

1.2.2.2. Оксидаза D-аминокислот Trigonopsis variabilis

1.2.2.3. Получение оксидазы D-аминокислот Т. variabilis при помощи 50 рекомбинантных микроорганизмов

1.2.2.4. Оксидаза D-аминокислот Rhodotorula gracilis

1.2.2.5. Необычные гибридные оксидазы D-аминокислот

1.2.2.6. Оксидазы D-аминокислот из других источников

1.2.2.7. Химический способ дезаминирования цефалоспорина С

1.2.2.8. Определение активности оксидаз D-аминокислот

1.2.2.9. Условия проведения окислительного дезаминирования цефа- 59 лоспорина С

1.2.3. Энзиматическое дезацилирование глутарил-7-АЦК — вторая ста- 64 дия двухстадийного энзиматического дезацилирования

1.2.3.1. Назначение глутарилацилаз

1.2.3.2. Глутарилацилазы Pseudomonas sp. SY-77-1 и GK

1.2.3.3. ГлутарилацилазаPsewdomo^as' sp.

1.2.3.4. Глутарилацилаза Pseudomonas dim inuta KAC

1.2.3.5. Глутарилацилазы других псевдомонад

1.2.3.6. Глутарилацилазы других микроорганизмов

1.2.3.7. Классификация цефалоспоринацилаз

1.2.3.8. Определение активности цефалоспоринацилаз

1.2.3.9. Условия проведения энзиматического дезацилирования глута- 79 рил-7-АЦК

1.2.4. Проведение обеих стадий трансформации цефалоспорина С в 82 7-АЦК

1.2.4.1. Проведение окислительного дезаминирования цефалоспорина С 82 и дезацилирования глутарил-7-АЦК в двух аппаратах

1.2.4.2. Проведение окислительного дезаминирования цефалоспорина С 84 и дезацилирования глутарил-7-АЦК в одном аппарате

1.2.5. Сопоставление энзиматических способов получения 7-АЦК

1.3. Сопоставление химического и энзиматического способов получе- 88 ния 7-АЦК

1.4. Выводы по главе

1.5. Постановка задач исследования

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Исследуемые материалы

2.2. Контрольно-аналитические методы 93 2.3 Химическая схема процесса

2.4. Условия проведения экспериментов

2.4.1. Методика лабораторного эксперимента

2.4.2. Методика опытно-промышленного эксперимента

2.4.3. Методика испытаний на пилотной установке

2.5. Кинетические расчеты

2.6. Выводы по главе

Глава 3. Результаты экспериментов и их обсуждение 118 3.1 Результаты экспериментов

3.1.1. Результаты лабораторных экспериментов

3.1.2. Результаты опытно-промышленных экспериментов

3.1.3. Результаты экспериментов на пилотной установке

3.2. Обсуждение результатов

3.2.1. Влияние начальной концентрации цефалоспорина С на протека- 120 ние процессов

3.2.2. Влияние рН на протекание процессов

3.2.3. Влияние температуры на протекание процессов

3.2.4. Влияние абсолютного давления кислорода на стадии окисления 125 на протекание процессов

3.3. Изучение кинетики энзиматических процессов

3.3.1. Кинетика процесса окисления

3.3.2. Кинетика процесса дезацилирования

3.4. Выбор условий осаждения 7-АЦК

3.5. Выводы по главе

Глава 4. Сравнительный анализ химической и энзиматической техноло- 143 гий получения 7-АЦК, в том числе по воздействию на окружающую среду

4.1. Сравнительный анализ химической и энзиматической технологий 143 получения 7-АЦК

4.2. Сопоставление техногенной нагрузки на атмосферу, гидросферу и 155 литосферу

4.3. Выводы по главе 4 159 Основные результаты и выводы 160 Литература 163 Приложение. Акт апробации технологии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биокаталитической технологии производства 7-аминоцефалоспорановой кислоты"

Актуальность работы. В ближайшие годы в мире ожидается рост производства продуктов биотехнологии. По оценке известной международной консалтинговой компании McKinsey & Company [1, 2] мировой объем продаж химических продуктов, полученных с использованием биотехнологических процессов, в 2000 г. составлял 53 млрд. евро (5 % всех химических продуктов), в 2005 г. - 77 млрд. евро (7 %), в 2007 г. — 99 млрд. евро (6 %), прогноз на 2010 г. - 125 млрд. евро, на 2012 г. - 153 млрд. евро (9-10 %).

Примерами наиболее массовых производств, в которых биокаталитические процессы заменяют или заменили химические, является получение следующих веществ [3]:

- глюкоза, изоглюкоза, изомальтоза - моносахариды;

- акриламид - мономер для полиакриламидных полимеров;

- L-аспарагиновая кислота - аминокислота;

- аспартам - подслащивающее вещество;

- никотинамид — витамин РР;

- пантотеновая кислота - витамин В6;

- эфедрин - алкалоид;

- 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК) - исходный полупродукт для синтеза полусинтетических пенициллинов;

- 7-аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК) - исходный полупродукт для синтеза полусинтетических цефалоспоринов.

Изучение технологии получения 7-АЦК является предметом данного диссертационного исследования. Мировое производство 7-АЦК в 2003 г. оценивалось в 4000 тонн в год [3], в 2006 г. в 5000 тонн в год [4].

Цефалоспориновые антибиотики, исходным сырьем для которых является 7-АЦК, широко применяются при лечении тяжелых инфекционных заболеваний, имеют широкий спектр действия, малотоксичны, хорошо переносятся. В 32 Фармакопее США (2009 г.) [5] описано 27 цефалоспоринов. В Реестре зарегистрированных лекарственных средств Российской Федерации в январе 2009 г. присутствовало 29 цефалоспоринов, из них разрешена продажа 14, а для 15 истек срок действия регистрации [6]. Общее число цефалоспоринов в мире, разрешенных к применению или дошедших до последних стадий клинических испытаний, превышает 50 [7].

Объем продаж цефалоспоринов в 2005 г. оценивался в 9,7 млрд. долларов США (около 32 %) из около 30 млрд. долларов США мирового объема продаж антибиотиков [8], это первое место среди всех групп антибиотиков.

В России 7-АЦК не производят и поэтому закупают субстанции и готовые лекарственные формы цефалоспориновых антибиотиков за рубежом, что обуславливает их высокую стоимость и снижает лекарственную безопасность государства. В настоящее время производство цефалоспориновых антибиотиков в нашей стране признано приоритетным направлением. В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке оптимальной технологии получения 7-АЦК из цефалоспорина С с учетом новых, появившихся в последние годы знаний и достижений.

В специализированных научных учреждениях - Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков (ВНИИА), позже Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА), и его Пензенском филиале (ПФ ВНИИА, ПФ ГНЦА), позже Пензенском научно-исследовательском и технологическом институте антибиотиков (ПНИТИА), начиная с 1981 г. по госзаказам № 103, 42-0263-02 и 140-187-БМ проводились исследования и разработка вначале химической, а затем энзиматической технологии промышленного получения 7-АЦК. После ликвидации ПНИТИА научно-исследовательская работа продолжена в Пензенской государственной технологической академии при поддержке РФФИ, гранты № 07-08-00557, 09-08-07049.

Актуальность указанной проблемы определила выбор направления исследования и основное содержание работы.

Цели и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлась разработка биокаталитической технологии производства 7-АЦК для промышленного освоения на российских предприятиях.

Для реализации поставленной цели автором сформулированы и решены следующие задачи:

- проведен сравнительный анализ существующих за рубежом технологий синтеза 7-АЦК и выбраны наиболее перспективные;

- на основе выбранных вариантов разработаны опытно-промышленные технологии получения 7-АЦК с учетом особенностей отечественного производства;

- проведен сравнительный анализ воздействия этих опытно-промышленных технологий на окружающую среду;

- предложена безопасная ресурсосберегающая биокаталитическая технология производства 7-АЦК для отечественных предприятий.

Научная новизна.

- в соответствии с характеристиками ферментов для обеих энзиматиче-ских стадий синтеза 7-АЦК выбраны и обоснованы оптимальные условия проведения процессов: температура, рН и оптимальная начальная концентрация цефалоспорина С.

- установлена зависимость протекания всех стадий процесса энзимати-ческого синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного дезаминирования. Показано, что чем меньше давление кислорода, тем больше продолжительность процесса окисления, что приводит к уменьшению выхода глутарил-7-АЦК на этой стадии из-за гидролиза продуктов реакции. Установлено, что уменьшение выхода глутарил-7-АЦК на первой стадии приводит к уменьшению выходов на последующих стадиях дезацилиро-вания и осаждения.

- предложены и подтверждены кинетические модели для обеих энзима-тических стадий синтеза 7-АЦК. Для стадии окисления это модель линейной зависимости скорости реакции от давления кислорода, причем константа скорости Кр зависит от условий массопередачи для данной системы. Для стадии дезацилирования - модель, использующая уравнение Михаэлиса-Ментен, в котором константы Fmax и Кт также зависят от условий массопередачи для данной системы.

- установлено, что обе энзиматические стадии протекают в диффузионном режиме, поэтому при масштабировании этих процессов на стадии окисления необходимо достичь по возможности большего значения константы скорости Кр как характеристики массопередачи, а также определить предельное значение давления Рпр, при котором скорость реакции перестает зависеть от давления. На стадии дезацилирования необходимо достичь по возможности большего значения константы Vmax как характеристики массопередачи.

Практическая значимость работы.

- разработана опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С двухстадийным энзиматическим дезаци-лированием с использованием иммобилизованных ферментов, которую можно использовать как основу при организации промышленного производства 7-АЦК в Российской Федерации. Для данной технологии разработана нормативно-техническая документация для промышленного освоения 7-АЦК: опытно-промышленный регламент на получение 7-АЦК методом двухста-дийного энзиматического дезацилирования (ОПР 64-0263-55-2000); технические условия на 7-АЦК (ТУ 0263-15-2000) и решены вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов. Предложенная технология апробирована на ОАО «Биосинтез» (г. Пенза) на пилотной установке.

- проведен сравнительный анализ энзиматической технологии получения 7-АЦК и химической. Показано, что на 1 кг 7-АЦК при энзиматической технологии: суммарный расход реагентов в 7 раз меньше; расход питьевой воды в 11 раз меньше; выбросы в атмосферу в 24 раза меньше; количество сточных вод и отходов в 16 раз меньше, чем при химической технологии. При этом выход готового продукта при энзиматической технологии (79 %) больше, чем при химической (76 %).

- даны рекомендации для масштабирования разработанных процессов в промышленном оборудовании.

На защиту выносятся.

- технологические решения по условиям проведения процесса двухста-дийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С и осаждения целевого продукта;

- установленные зависимости протекания всех стадий энзиматического синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного де-заминирования; кинетические модели для стадии окисления и стадии дезацилирования процесса синтеза 7-АЦК; предложения по масштабированию разработанных процессов в промышленном оборудовании; результаты сравнительного анализа воздействия на окружающую среду энзиматической и химической технологии получения 7-АЦК;

- опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК двухстадийным энзиматическим дезацилированием с использованием иммобилизованных ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: Всесоюзной конференции «Биосинтез вторичных метаболитов» (Пу-щино, 1987); Всесоюзной конференции «Наука и производство в решении комплексной проблемы «Антибиотики» (Москва, 1989); IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Юрмала, 1991); V Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2006); III Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Пенза, 2006); IX Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2006); I Международном конгрессе «Экология и безопасность жизнедеятельности про-мышленно-транспортных комплексов» (Тольятти, 2007); IV Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Пенза, 2007); XXIII Международном симпозиуме «Новые технологии в образовании, науке и экономике» (Москва - Сидней, 2008); XXIV Международном симпозиуме «Новые технологии в образовании, науке и экономике» (Москва

- Сингапур, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, и две монографии.

Автор выражает признательность всем сотрудниками ПНИТИА и ОАО «Биосинтез» (г. Пенза), которые работали вместе с ним при воспроизведении технологий на опытной и пилотной установках.

1. Анализ существующих технологий получения 7-АЦК

История цефалоспоринов началась с того, что итальянский ученый Дж. Бротцу обнаружил, что несовершенный гриб вида Cephalosporium acremo-nium (в настоящее время именуемого Acremonium chrysogenum), выделенный им из проб, взятых в море около места сброса сточных вод г. Кальяри на о. Сардиния в 1945 г., выделяет вещество или вещества, которые подавляют рост ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий [9]. В своей работе он использовал фильтрат культуральной жидкости и концентрат, полученный из него после осаждения неактивных продуктов этанолом, выделить активные вещества ему не удалось из-за отсутствия возможностей и финансирования.

В связи с этим Дж. Бротцу в 1948 г. передал свой штамм С. acremonium британским ученым, которые начали его изучение. Основные исследования велись в Оксфордском университете под руководством известного ученого Э.П. Абрахама, который в годы II мировой войны принимал активное участие в работах по пенициллину [10]1.

В результате из фильтрата культуральной жидкости этого микроорганизма вначале, в 1952 г., был выделен цефалоспорин N (I) [11-13]. Было установлено, что он является пенициллином [14], почему позже его стали называть пенициллином N. Также было найдено, что цефалоспорин N идентичен синнематину В, антибиотику, выделенному ранее из культуральной жидкости грибка Cephalosporium salmosynnematum [15-17] (позже названного Emericellopsis salmosynnematum). А затем, в 1955 г., был выделен цефалоспорин С (И) [18-20]. Его структура [21, 22] оказалась близкой к структуре пени-циллинов.

Хотя цефалоспорин N и является пенициллином, грибки вида Penicil-lium chrysogenum и других видов Penicillium, которые продуцируют природ

1 В обзоре [10], соавтором которого является Э.П. Абрахам, в частности, описана история открытия цефа-лоспорина С. ные (биосинтетические) пенициллины, не образуют это вещество. Кроме С. acremonium и Е. salmosynnematum его продуцируют некоторые другие виды Cephalosporium и Emericellopsis, а также некоторые виды Streptomyces и Рае-cilomyces persicinus. Цефалоспорин С кроме С. acremonium продуцируют некоторые штаммы Emericellopsis terricola [10].

Когда были выяснены механизмы биосинтеза природных пеницилли-нов и цефалоспорина С [23], было установлено, что на начальных стадиях они одинаковы. При этом из L-a-аминоадипиновой кислоты (III), L-цистеина (IV) и L-валина (V) образуется трипептид а-аминоадипил-цистеинил-валин

VI), который циклизируется с образованием общего предшественника всех биосинтетических пенициллинов и цефалоспорина С — изопенициллина N

VII) (рис. I)2. Изопенициллин N и пенициллин N являются оптическими изомерами, 5 атом углерода в боковой цепи в изопенициллине N имеет исходную L-конфигурацию, а в пенициллине N - обращенную D-конфигура-цию.

При биосинтезе природных пенициллинов (кроме пенициллина N) далее идет замена ацильного радикала у аминогруппы в 6 положении изопенициллина N (VII)3 (реакция переацилирования) с образованием различных биосинтетических пенициллинов (например, бензилпенициллина (VIII).

При биосинтезе цефалоспорина С следующая стадия - изомеризация изопенициллина N (VII) в пенициллин N (I) (который, следовательно, является предшественником цефалоспорина С). Далее последовательно идут процессы расширения цикла (I) с образованием З'-дезацетоксицефалоспорина С (IX), окисления (IX) с образованием З'-дезацетилцефалоспорина С (X), и аце-тилирования (X) с образованием цефалоспорина С (II).

2 Все процессы идут под действием соответствующих ферментов.

3 Общепринятая нумерация атомов в ядре пенициллинов (пенам) [24] и ядре цефалоспоринов (цефам, при наличии двойной связи между 3 и 4 атомами - 3-цефем) [25]. Для цефалоспоринов атом 3' - атом углерода боковой группы, соседний с 3 атомом ядра. Nпенам

Цефам ноос. nh2

III ноос nh2

S. CH, ноос

0 / о' VIII

-СНз -<соон nh, ноос nh, он h2n l sh

СНз сн. л. су^он h2n" 'соон IV V sh fC сн3

СНз а

COOH

VI

S СНз У

VII

I.

СНз

СООН

0 У

СНз -СНз л<

СООН

НООС nh2

НООС nh2 У

IX t н

N„

СНз

СООН 0

НООС nh2

СООН X о

СНз

СООН

II

Рис. 1. Схема биосинтеза пенициллинов и цефалоспорина С

При этом в цефалоспорине С 5 атом углерода в боковой цепи имеет D-конфигурацию, как и в пенициллине N. Считают, что именно с этим связана невозможность переацилирования пенициллина N и цефалоспорина С, в отличие от изопенициллина N, и невозможность получения других био синтетических цефалоспоринов [23, с. 190].

Поскольку в молекулах цефалоспорина С и его полусинтетических производных, как и в молекулах всех пенициллинов, присутствует Р-лактам-ное ядро, цефалоспорины и пенициллины по современной классификации входят в группу |3-лактамных антибиотиков.

Следует отметить, что биосинтетические пенициллины изначально имели высокую антибиотическую активность, но достаточно узкий спектр действия, в основном против грамположительных бактерий.

Цефалоспорин С, напротив, при широком спектре действия, в том числе против грамотрицательных бактерий, обладал относительно невысокой активностью. И, в отличие от пенициллинов, не удалось получить другие биосинтетические цефалоспорины. Поэтому сразу встал вопрос о получении полусинтетических цефалоспоринов с более высокой активностью. Подход при этом был такой же, как при получении полусинтетических пенициллинов.

Было найдено, что из природных пенициллинов отщеплением ацильно-го радикала у аминогруппы в 6 положении (реакция дезацилирования) можно получить 6-аминопенициллановую кислоту (6-АПК) (XI). Фермент, осуществляющий эту реакцию, пенициллинацилаза (пенициллинамидаза), впервые был обнаружен у P. chrysogenum [26].

6-АПК вначале была получена при биосинтезе в отсутствии предшественников боковой цепи [27, 28], но вскоре было обнаружено, что ее удобнее получать дезацилированием бензилпенициллина с использованием пеницил-линацилаз различного происхождения [29-32] (почти одновременные сообщения четырех исследовательских групп).

Н2М„ з СИ, У

СНз чсоон

XI

Ацилированием аминогруппы 6-АПК были получены многочисленные полусинтетические пенициллины.

Подобным образом из цефалоспорина С отщеплением ацильного радикала у аминогруппы в 7 положении можно получить 7-аминоцефалоспорано-вую кислоту (7-АЦК) (XII). Это вещество вначале было получено кислотным гидролизом цефалоспорина С [33, 34]. соон о

XII

7-АЦК стала исходным продуктом для синтеза большой группы полусинтетических цефалоспоринов. При этом у него больше возможностей для модификации, чем у 6-АПК, поскольку, помимо ацилирования аминогруппы в 7 положении, возможны также различные реакции замещения в 3 положении.

Как было отмечено выше, достаточно быстро был найден удобный эн-зиматический способ получения 6-АПК из пенициллинов. В связи с этим химические способы, специально предложенные для получения 6-АГЖ [35-37], практического применения не нашли.

Напротив, для 7-АЦК долго не удавалось найти энзиматический способ получения этого вещества из цефалоспорина С. В связи с этим вначале были разработаны химические методы, причем некоторые из них также можно использовать для получения 6-АПК из пенициллинов.

Обзор работ, посвященных химическим методам получения 7-АЦК из цефалоспорина С, приведен в [38]4. Известные химические методы можно подразделить на следующие группы:

- гидролиз и подобные процессы;

- реакция с нитрозилхлоридом;

- реакция с тетрафторборатом триэтилоксония;

- реакция с пятихлористым фосфором;

- через 7-тиоацилпроизводные цефалоспорина С.

Энзиматические методы получения 7-АЦК из цефалоспорина С можно подразделить на две группы:

- одностадийное энзиматическое дезацилирование;

- двухстадийное энзиматическое дезацилирование, включающее предварительное окислительное дезаминирование и последующее энзиматическое дезацилирование.

Обзор этих методов приведен ниже.

4 Этот обзор также охватывает и способы получения 6-АПК из пенициллинов.

15

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Яхкинд, Михаил Ильич

Основные результаты и выводы

1. Проведен сравнительный анализ существующих за рубежом технологий синтеза 7-АЦК из цефалоспорина С и выбран наиболее перспективный вариант — двухстадийное энзиматическое дезацилирование, включающее окислительное дезаминирование цефалоспорина С до глутарил-7-АЦК и дезацилирование последней до 7-АЦК.

2. Произведен поиск и выбор иммобилизованных ферментов, осуществляющих обе основные стадии двухстадийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С — оксидазы D-аминокислот Т. variabilis и глутарилацилазы Acinetobacter sp., рекомбинантной в Е. coli.

3. В соответствии с характеристиками ферментов для обеих энзиматических стадий выбраны и обоснованы оптимальные условия проведения процессов: для стадии окислительного дезаминирования: температура (20±1)°С, рН 7,2±0,1; для стадии дезацилирования: температура (20±1)°С, рН 8,1±0,1. Оптимальная начальная концентрация цефалоспорина С-кислоты - 30-33 г/л (72-79 ммоль/л).

4. Установлена зависимость протекания всех стадий процесса энзиматического синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного дезаминирования. Показано, что чем меньше давление кислорода, тем больше продолжительность процесса окисления, что приводит к уменьшению выхода глутарил-7-АЦК на этой стадии из-за гидролиза продуктов реакции. Установлено, что уменьшение выхода глутарил-7-АЦК на первой стадии приводит к уменьшению выходов на последующих стадиях дезацилирования и осаждения.

5. Предложены и подтверждены кинетические модели для обеих энзима-тических стадий синтеза 7-АЦК. Для стадии окисления это модель линейной зависимости скорости реакции от давления кислорода, причем константа скорости КР зависит от условий массопередачи для данной системы. Для стадии дезацилирования — модель, использующая уравнение Михаэлиса-Ментен, в котором константы Ктах и Кт также зависят от условий массопередачи для данной системы.

6. Установлено, что обе энзиматические стадии протекают в диффузионном режиме, поэтому при масштабировании этих процессов на стадии окисления необходимо достичь по возможности большего значения константы скорости КР как характеристики массопередачи, а также определить предельное значение давления Рпр, при котором скорость реакции перестает зависеть от давления. На стадии дезацилирования необходимо достичь по возможности большего значения константы Fmax как характеристики массопередачи.

7. Проведен сравнительный анализ энзиматической технологии получения 7-АЦК и химической. Показано, что на 1 кг 7-АЦК при энзиматической технологии: суммарный расход реагентов в 7 раз меньше; расход питьевой воды в 11 раз меньше; выбросы в атмосферу в 24 раза меньше; количество сточных вод и отходов в 16 раз меньше, чем при химической технологии. При этом выход готового продукта при энзиматической технологии (79 %) больше, чем при химической (76 %).

8. Разработана опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С двухстадийным энзиматическим дезацилированием с использованием иммобилизованных ферментов, которую можно использовать как основу при организации промышленного производства 7-АЦК в Российской Федерации. Для данной технологии разработана нормативно-техническая документация для промышленного освоения 7-АЦК: опытно-промышленный регламент на получение 7-АЦК методом двухстадийного энзиматического дезацилирования (ОПР 64-0263-55-2000); технические условия на 7-АЦК (ТУ 0263-15-2000) и решены вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов. Предложенная технология апробирована на ОАО «Биосинтез» (г. Пенза) на пилотной установке.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Яхкинд, Михаил Ильич, Москва

1. Perspective on Bio-based Chemicals and Biofuels. EuropaBio Open Day, Brussels, June 14, 2007. McKinsey & Company, June 2007.

2. Riese J. White Biotechnology. Press briefing. McKinsey & Company, February 2009.

3. White Biotechnology: Opportunities for Germany. Position Paper of DECHEMA e.V. November 2004.

4. Case study: Cephalosporin. // Consequences, Opportunities and Challenges of Modern Biotechnology for Europe (BI04EU) — Task 2. Report 3 / Deliverable 21. European Techno-Economic Policy Support Network (ETEPS network), September 2007. 57-73.

5. United States Pharmacopeia 32 National Formulary 27. The United States Pharmacopeial Convention, Inc., 2008.

6. Реестр зарегистрированных лекарственных средств (вер. 1.4.14.93). ФГУ НЦЭСМП. База данных: январь 2009 г.

7. Курочкина В. Б., Ныс П. С. Новые беталактамные структуры. Проблемы конструирования. // Антибиот. химиотер. 2002. 47, № 2: 29-37.

8. Injectable Generic Drugs: Prospects and Opportunities to 2010. Espicom Healthcare Intelligence, 2006.

9. G. Brotzu. Ricerche su di un nuovo antibiotico. Lavori delPIstituto di Igiene di Cagliari. Cagliari, 1948.

10. Abraham E. P., Loder P. B. Cephalosporin C. // Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and Biology. Flynn E., ed. Academic Press, New York, 1972. 1-26.

11. Патент 745208, Великобритания, 1956. Improvements relating to the production of an antibiotic substance by a Cephalosporium species.

12. Abraham E. P., Newton G. G. F., Crawford 1С., Burton H. S., Hale C. W. Cephalosporin N: a new type of penicillin. //Nature. 1953. 171: 343.

13. Abraham E. P., Newton G. G. F., Hale C. W. Purification and some properties of cephalosporin N, a new penicillin. // Biochem. J. 1954. 58: 94-102.

14. Newton G. G. F., Abraham E. P. Degradation, structure and some derivatives of cephalosporin N. // Biochem. J. 1954. 58: 103-111.

15. Патент 2658018, США, 1953. Synnematin and process of producing the same.

16. Olson В. H., Jennings J. C., Junek A. J. Separation of synnematin into components A and В by paper chromatography. // Science. 1953. 117: 76-78.

17. Abraham E. P., Newton G. G. F., Olson В. H., Schuurmans D. M., Schenck J. R., Hargie M. P., Fisher M. W., Fusari S. A. Identity of cephalosporin N and synnematin B. //Nature. 1955. 176: 551.

18. Патент 810196, Великобритания, 1959. Cephalosporin С.

19. Newton G. G. F., Abraham E. P. Cephalosporin C, a new antibiotic containing sulphur and D-a-aminoadipic acid. //Nature. 1955. 175: 548.

20. Newton G. G. F., Abraham E. P. Isolation of cephalosporin C, a penicillinlike antibiotic containing D-a-aminoadipic acid. // Biochem. J. 1956. 62: 651-658.

21. Abraham E. P., Newton G. G. F. The structure of cephalosporin C. // Biochem. J. 1961.79:377-393.

22. Hodgkin D. C., Maslen E. N. The X-ray analysis of the structure of cephalosporin C. //Biochem. J. 1961. 79: 393-402.

23. Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. Пер. с англ. М.: Мир, 1985. 272 с.

24. Sheehan J. С., Henery-Logan К. R., Johnson D. A. The synthesis of substituted penicillins and simpler structural analogs. VII. The cyclization of a penicilloate derivative to methyl phthalimidopenicillanate. // J. Amer. Chem. Soc. 1953. 75: 3292-3293.

25. Morin R. В., Jackson B. G., Flynn E. H., Roeske R. W. Chemistry of cephalosporins antibiotics. I. 7-Aminocephalosporanic acid from cephalosporin C. // J. Amer. Chem. Soc. 1962. 84: 3400-3401.

26. Sakaguchi K., Murao S. A preliminary report on a new enzyme, "penicillin-amidase". //J. Agr. Chem. Soc. Japan. 1950. 23: 411.

27. Патент 870396, Великобритания, 1961. Improvements in or relating to substances produced by penicillin-producing moulds.

28. Batchelor F. R., Doyle F. P., Nayler J. H. C., Rolinson G. N. Synthesis of penicillin: 6-aminopenicillanic acid in penicillin fermentations. // Nature.1959. 183: 257-258.

29. Rolinson G. N., Batchelor F. R., Butterworth D., Cameron-Wood J., Cole M., Eustace G. C., Hart M. V., Richards M., Chain E. B. Formation of 6-aminopenicillanic acid from penicillin by enzymatic hydrolysis. // Nature.1960. 187: 236-237.

30. Claridge C. A., Gourevitch A., Lein J. Bacterial penicillin amidase. // Nature. 1960. 187: 237-238.

31. Huang H. Т., English A. R., Seto T. A., Shull G. M., Sobin B. A. Enzymatic hydrolysis of the side chain of penicillins. // J. Amer. Chem. Soc. 1960. 82: 3790-3791.

32. Kaufmann W., Bauer K. Enzymatische Spaltung und Resynthese von Penicillin. //Naturwissenschaften. 1960. 47: 474-475.

33. Патент 953695, Великобритания, 1964. Derivatives of cephalosporin C.

34. Loder В., Newton G. G. F., Abraham E. P. The cephalosporin С nucleus (7-aminocephalosporanic acid) and some of its derivatives. // Biochem. J. 1961.79:408-416.

35. Патент 3107250, США, 1963. Process for the preparation of 6-aminopenicillanic acid and novel intermediates useful therein.

36. Патент 3271409, США, 1966. Chemical conversion of nitro-penicillins to 6-aminopenicillanic acid.

37. Johnson D. A., Panetta C. A., Smith R. R. Nonenzymatic conversion of penicillins to 6-aminopenicillanic acid. // J. Org. Chem. 1966. 31: 25602564.

38. Huber F. M., Chauvette R. R., Jackson B. G. Preparative methods for 7-aminocephalosporanic acid and 6-aminopenicillanic acid. // Cephalosporins and

39. Penicillins, Chemistry and Biology. Flynn E., ed. Academic Press, New York, 1972. 27-73.

40. Патент 3167549, США, 1965. Derivatives of 7-aminocephalosporanic acid.

41. Патент 3167550, США, 1965. Derivatives of 7-aminocephalosporanic acid.

42. Патент 3296258, США, 1967. 7-(Imidazolidinyl-butyryl)-aminocephalo-sporanic acids.

43. Патент 3454564, США, 1969. Therapeutically active derivatives of 7-ami-no-cephalosporanic acid and process for the manufacture of 7-amino-cepha-losporanic acid.

44. Патент 1027750, Великобритания, 1966. 7-Aminocephalosporanic acids and derivatives thereof.

45. Патент 3503964, США, 1970. Process for the manufacture of esters of 7-aminocephalosporanic acid.

46. Fechtig В., Peter H., Bikel H., Vischer E. Modifikationen von Antibiotika. 2 Mitteilung. Uber die Darstellung von 7-Amino-cephalosporansaure. // Helv. Chim. Acta. 1968.51: 1108-1119.

47. Патент 3188311, США, 1965. Process for the preparation of 7-aminocepha-losporanic acids.

48. Morin R. В., Jackson B. G., Flynn E. H., Roeske R. W., Andrews S. L. Chemistry of cephalosporin antibiotics. XIV. The reaction of cephalosporin С with nitrosyl chloride. // J. Amer. Chem. Soc. 1969. 91: 1396-1400.

49. Патент 1017534, Великобритания, 1966. Improvements in or relating to the production of 7-aminocephalosporanic acid.

50. Патент 3594370, США, 1971. Production of 7-aminocephalosporanic acid.

51. Патент 3507862, США, 1970. Cleavage of cephalosporin C.

52. Патент 3594371, США, 1971. Preparation of 7-aminocephalosporanic acid.

53. Barber M. S., Giesecke U., Reichert A., Minas W. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based P-lactams. // Adv. Biochem. Eng./Biotech-nol. 2004. 88: 179-215.53.