Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии белково-аминокислотных корректоров кормов и биологически активных добавок на основе направленной ферментативной конверсии полимеров дрожжевой биомассы

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии белково-аминокислотных корректоров кормов и биологически активных добавок на основе направленной ферментативной конверсии полимеров дрожжевой биомассы"

На правах рукописи

Рачков Кирилл Викторович

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БЕЛКОВО-АМИНОКИСЛОТНЫХ КОРРЕКТОРОВ КОРМОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК НА ОСНОВЕ НАПРАВЛЕННОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ КОНВЕРСИИ ПОЛИМЕРОВ ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 г МАЙ 2014

Щелково-2014

005548864

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИПБТ РАСХН)

Научный руководитель: Серба Елена Михайловна,

кандидат технических наук, доцент, старший научный сотрудник ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии Официальные оппоненты: Мартыненко Николай Николаевич,

доктор биологических наук, профессор кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «Московского государственного университета пищевых производств». Гаврилов Владимир Андреевич, Доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, профессор кафедры биотехнологии ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Ведущая организация: Государственный научно - исследовательский институт биосинтеза белковых веществ.

Защита состоится «/¿>» (AjflH-i;_2014 г. в 10 часов 00 минут на заседании

Диссертационного совета Д 066.069.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ГНУ ВНИТИБП РАСХН, e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « »_2014 г.

Автореферат « » _2014г. размещен на сайте ГНУ ВНИТИБП

Россельхозакадемии http://www.vnitibp.com и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru/

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Фролов Ю.Д.

1. Общая характеристика работы Актуальность темы исследования. В современном мире с быстро растущим населением и недостаточно развитым сельским хозяйством, чрезвычайно важным становится поиск альтернативных источников пищевого белка. Большая часть населения Земли голодает из-за нерационального распределения продовольствия и отсутствия сбалансированного питания. Данная проблема обусловлена ограниченными сырьевыми ресурсами и сельскохозяйственными угодьями, необходимыми для глобального продовольственного снабжения и производства.

В последнее время с подобной проблемой столкнулись и в России. Анализ структуры питания населения России свидетельствует о дефиците пищевого белка, который по прогнозам экспертов, сохранится и в ближайшем будущем. В питании россиян стала преобладать углеводная пища, что повлекло за собой острый дефицит таких биологически важных нутриентов, как белки, незаменимые аминокислоты, витамины и минералы. Белки в живых организмах играют важную роль, выполняя регуляторные, структурные, каталитические, транспортные, защитные и другие функции, обеспечивают обмен веществ. Распад белков компенсируется ресинтезом из фонда свободных аминокислот, полученных при переваривании пищи. Однако если в составе пищи будет отсутствовать, хотя бы одна незаменимая аминокислота в организме человека не смогут синтезироваться необходимые белки. В итоге в результате неправильного питания понижается сопротивляемость населения неблагоприятным факторам, развиваются хронические заболевания, снижается продолжительность жизни.

Одними из перспективных продуцентов белка, аминокислотный скор (показатель биологической ценности белка) которого приближается к животному, являются дрожжи ЗассЬагогпусез сегеу15те. С целью повышения усвояемости внутриклеточных биологически ценных компонентов разрабатываются различные способы деструкции полимеров микробной клетки для выделения белковых веществ, из которых наиболее эффективными являются ферментативные.

В связи с вышесказанным следует, что в условиях высокого дефицита пищевого белка и несбалансированности питания, актуальной задачей является разработка эффективного способа конверсии микробной биомассы на основе регулируемого процесса деструкции субклеточных структур для получения конкурентоспособных биологически полноценных корректоров пищи и кормов с заданными структурно-функциональными свойствами.

Степень разработанности проблемы. Проведенные исследования основаны на научно-теоретических трудах и экспериментальных исследованиях ученых: А.И. Албулова, В.М. Беликова, Г.Л. Воробьева, Л.А. Ивановой; С.А. Коновалова, В.А. Полякова, Л.В. Римаревой, Е.М. Сербы, М.А. Фроловой и других ученых, работающих над этой проблемой. В этих работах исследовались проблемы

3

получения белковых обогатителей и БАД на основе дрожжевой биомассы. Однако высокая механическая прочность клеточных стенок микроорганизмов и низкая доступность ферментов к биокаталитическому воздействию на внутриклеточные полимеры не позволили осуществить глубокий гидролиз микробной биомассы. Кроме того, в проведенных ранее работах не изучен спектральный состав белковых веществ после ферментативной деструкции микробной биомассы и не установлена его взаимосвязь с функциональными свойствами ферментолизатов дрожжевых клеток. Все это указывает на необходимость разработки комбинированных методов регулируемой деструкции дрожжевой биомассы для получения белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов с заданными структурно-функциональными свойствами.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в совершенствовании основных этапов получения биологически активных добавок (БАД), белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов, получаемых на основе направленной ферментативной конверсии высокомолекулярных полимеров дрожжевой биомассы, для повышения эффективности производства биологически полноценных продуктов пищевого и кормового назначения и использование их в АПК РФ.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- проведение мониторинга существующих методов подготовки дрожжевой биомассы к ферментативной деструкции субклеточных структур;

- изучение степени баротермического воздействия на клеточные стенки (КС) дрожжей ЗассЬаготусез сегеу^ае для выделения белковых веществ;

- исследование влияния баротермического воздействия на эффективность процесса ферментативной деструкции внутриклеточных структур дрожжей;

- проведение спектрального анализа и электронно-микроскопических исследований ферментолизатов микробной биомассы в процессе деструкции белковых веществ протоплазмы дрожжевой клетки;

- исследование взаимосвязи спектрального состава белковых веществ и функциональных свойств ферментолизатов дрожжевой биомассы;

- проведение испытаний и наработка опытной партии биокорректоров.

Научная новизна работы. Получены и научно обоснованы экспериментальные данные в области биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой биомассы:

- изучено влияние баротермической обработки дрожжевой биомассы на степень конверсии белково-полисахаридных полимеров клеточных стенок дрожжей;

- установлена зависимость глубины гидролиза субклеточных структур дрожжевой биомассы от параметров предобработки дрожжевой биомассы (давления, температуры, длительности воздействия);

- исследован спектральный состав белковых веществ ферментолизатов дрожжевой биомассы;

- установлено влияние ферментативных систем на степень деструкции белковых веществ дрожжевой клетки;

- определены параметры процесса направленной биокаталитической конверсии субклеточных полимеров дрожжей с получением ферментолизатов с заданным структурно-фракционным составом;

- установлена взаимосвязь спектрального состава дрожжевых гидролизатов с функциональными свойствами получаемых продуктов.

Практическая значимость. На основе установленных закономерностей баротермической и ферментативной конверсии полимеров микробной клетки усовершенствована технология получения белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов. Разработанная технология позволяет повысить степень деструкции внутриклеточных структур дрожжей и получать добавки целевого назначения с заданными структурно-функциональными свойствами аппаратурно-технологическая схема. На целевые продукты разработана нормативная документация (ТУ 9182-056-00334586-2012 «Белково-аминокислотный биокорректор пищи»; ТИ по производству белково-аминокислотного биокорректора пищи; ТУ 9182-114-00334586-2013 «Кормовая белково-аминокислотная добавка Протамин»; ТИ по производству кормовой белково-аминокислотной добавки Протамин; ТУ 9182-115-00334586-2013 «БАД Суперпротамин»). Проведена наработка опытных партий белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов на ЗАО «Биопрогресс» ВНИТИБП (Московская область, Щелковский район).

Показана перспективность использования продуктов конверсии дрожжевой биомассы, в качестве эффективных добавок повышающих биологическую ценность пищи и кормов. Проведены испытания по использованию ферментолизатов дрожжей для обогащения ферментированных молочных продуктов, косметических изделий и стартовых комбикормов для личинок осетровых рыб, подтвердившие их высокую биологическую эффективность.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований по влиянию баротермической предобработки дрожжевой биомассы на повышение степени биокаталитического воздействия ферментативных систем на высокомолекулярные полимеры клеточных стенок и протоплазмы клетки.

2. Закономерности направленной ферментативной деструкции дрожжевой биомассы с получением ферментолизатов с заданным фракционным составом белковых веществ.

3. Усовершенствованная технология получения биологически активных добавок (БАД), белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов.

4. Спектральный состав целевых добавок и перспектива их применения для повышения биологической ценности продуктов питания и кормов.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на следующих конференциях: Международная конференции «Биология - наука XXI века». Москва, 2012 г; 46-ая Международная научная конференция молодых ученых, докторантов, аспирантов и соискателей ученых степеней доктора и кандидата наук «Эффективность применения средств химизации в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур. ГНУ ВНИИ агрохимии им. Д.Н.Прянишникова, Москва, 2012 г; Международная конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Мурманск, 2012 г; Всероссийская научно-практическая конференция «Научно-инновационные аспекты при создании продуктов здорового питания», Углич, 2012 г; VII Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2013 г; Всероссийская научно-практическая конференция «Пищевые ингредиенты и инновационные технологии в производстве продуктов питания» С.-Петербург, 2013.

Публикации. По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано 15 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и патентов, экспериментальной части, состоящей из трех глав, выводов, списка литературы. Общий объем диссертации - 152 страницы, в том числе таблиц - 15, рисунков и схем - 35, 6 приложений. Список использованной информации содержит 133 наименований.

2. Общее содержание работы 2.1 Материалы и методы исследований

В работе использовали общепринятые физико-химические, биохимические, микробиологические и спектрофотометрические методы анализа, а также современные методы ВЭЖХ, тонкослойной хроматографии и электронной микроскопии. На рисунке 1 приведена структурно-методическая схема проведенных исследований для достижения цели диссертационной работы.

Получение дрожжевой биомассы

Предобработка дрожжевой биомассы

Термолиз Баротермическая обработка УЗ-обработка

Ферментолиз дрожжевой биомассы ферментативными системами различной субстратной специфичности

Масс-спектральные исследования полученных продуктов Исследования целевых продуктов методом электронной микроскопии

Наработка экспериментальных образцов и их испытания

Рисунок 1 — Структурно-методическая схема проведенных исследований

6

2.2 Результаты исследований и их обсуждение 2.2.1 Влияние баротермического воздействия на степень подготовки дрожжевой биомассы к ферментативной деструкции

Цель данного этапа работы состояла в исследовании влияния высокого давления и температуры на степень деструкции дрожжевой биомассы и разработке условий ее подготовки для ферментативной конверсии субклеточных структур в технологиях пищевых и кормовых добавок.

Работу проводили с использованием реактора высокого давления Parr Instrument Company 4562, обеспечивающего деструктивное действие сразу двумя факторами: высокого давления и механического разрушения из-за контакта клеток друг с другом. В качестве биокатализаторов для деполимеризации клеточных структур использовали подобранную ранее ферментативную систему (КФС), в состав которой входят ферменты р-глюканазного, маннанолитического и протеолитического действия, обеспечивающие каталитическую деструкцию белково-полисахаридных полимеров КС дрожжей. В качестве контрольного варианта использовали дрожжевую суспензию после термолиза при 90 °С в течение 15 мин., не подвергнутую воздействию высоких параметров давления.

Для изучения степени баротермического воздействия на проницаемость клеточных стенок дрожжей исследовали влияние различных режимов обработки дрожжевой суспензии (давления в реакторе, температуры процесса, длительности процесса) на показатели исходной суспензии, а также на эффективность ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы после предварительной обработки в реакторе высокого давления.

Выявлено, что воздействие на клетки высокого давления (2,5, 5,0 и 7,5 МПа) и температуры (25, 50 и 100°С) при экспозиции 30 мин приводило к разрушению клеточных стенок дрожжей и способствовало повышению экстрактивности дрожжевой биомассы по сравнению с контрольным вариантом, где биомасса не подвергалась действию повышенных давлений. При этом увеличивалось содержание в фильтрате дрожжевой суспензии растворимых углеводов в 1,70-1,85 раза и белковых веществ в 1,40-1,55 раза, что свидетельствовало о разрушении белково-полисахаридных комплексов КС дрожжей (рис. 2а, 2в). Увеличение времени воздействия высокого давления и температуры с 30 мин до 90 мин приводило к повышению содержания растворимых белковых веществ и некоторому снижению концентрации сухих веществ и растворимых углеводов в фильтратах дрожжевой суспензии (рис. 26, 2г). При этом воздействие давления 2,5 и 5,0 МПа, а также повышенных температур до 100°С способствовало увеличению выхода белковых веществ практически в 2 раза. Повышение давления в реакторе до 7,5 МПа при температуре 100°С негативно сказывалось на процессе экстракции и приводило к снижению концентрации растворимых белковых веществ.

термолиз 2,5 МПа 5 МПа 7,5 МПа ■ 95С я 25С ■ 50С я 100С

а)

термолиз 2,5 МПа 5 МПа 7,5 МПа Я95С »25С я 50С ■ 100С

б)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

—

1

1

к

термолиз 2,5 МПа 5 МПа 7,5 МПа и 95С Ш 25С «50С ■ 100С

в)

термолиз 2,5 МПа 5 МПа ■ 95С В25С И50С

г;

7,5 МПа 1100С

а, в) длительность обработки 30 мин. б, г) длительность обработки 90 мин.

Рисунок 2 - Влияние длительности баротермической обработки на степень деструкции полисахаридов (а, б) и белковых веществ (в, г) клеточных стенок

дрожжей

На следующем этапе исследовали влияние параметров баротермического воздействия на степень подготовки дрожжевой биомассы к ферментативной деструкции белково-полисахаридных полимеров клеточных стенок для выделения белковых веществ в технологии пищевого белка. В качестве биокатализаторов использовали комплексную ферментативную систему, состоящую их ферментов глюканолитического и протеолитического действия. Расход ферментов осуществляли в соответствии с подобранной композицией из расчета 300 ед. р-ГкС и 2 ед ПС/г дрожжей. Длительность биокатализа составила 5 ч.

Изучение биохимических показателей после ферментативного гидролиза полученных дрожжевых суспензий, обработанных в реакторе высокого давления, позволило выбрать наиболее эффективные баротермические режимы

предподготовки дрожжей для обеспечения максимального выхода из клетки белковых веществ: температура в реакторе 50°С, давление 5 МПа, длительность обработки - 30 мин (рис.3).

термолиз 2,5 МПа 5 МПа 7,5 МПа термолиз 2,5 МПа 5 МПа 7,5 МПа

S95C Ш 25С ■ 50С • 100С « 95С • 25С я 50С В 100С

в) г)

а, в) длительность обработки 30 мин. б, г) длительность обработки 90 мин.

Рисунок 3 - Влияние длительности баротермической обработки клеток на степень ферментативной деструкции полисахаридов (а , б) и белковых веществ (в, г)

дрожжевой биомассы При увеличении длительности обработки до 90 мин. возможно снижение давления в реакторе до 2,5 МПа и температуры до 25°С (рис. 3 в, г). При оптимальных режимах баротермической обработки дрожжей достигалось повышение степени ферментативной деструкции субклеточных структур, что выразилось в увеличении выхода экстрактивных веществ: растворимых белковых — на 40-43% и редуцирующих веществ на 126-130 %, по сравнению с контрольным вариантом (термолиз). Выявлено, что повышение температуры предварительной обработки дрожжевой биомассы в реакторе высокого давления снижает эффективность последующего ферментативного гидролиза (рис.3).

Сравнительные исследования динамики процесса ферментативной деструкции

полимеров КС дрожжей под действием экзогенных ферментов подобранной КФС показали, что практически за 6 ч происходил максимальный выход растворимых белковых веществ из клеток, обработанных предварительно в реакторе высокого давления при оптимальном режиме: 50°С, давление 5 МПа, 30 мин (рис.4). При этом уровень накопления растворимых белковых веществ в дрожжевой суспензии превышал на 39 % показатели контрольного варианта, в котором дрожжи были предварительно подвергнуты термолизу. Процесс автолитической деструкции дрожжевой биомассы под действием собственной ферментативной системы был не эффективен в связи с возможной инактивацией ферментов клетки в процессе баротермической обработки.

ментолиза, ч

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 —Ф"— реактор+автолиз —Ш—реактор+ГкС+ПС «-Ф^термолиз+ГкС+ПС

Рисунок 4 - Динамика извлечения белковых веществ протоплазмы в процессе деструкции полимеров клеточной стенки дрожжей Таким образом, в результате исследований показано влияние баротермического воздействия на повышение проницаемости клеточной стенки дрожжей. Установлена эффективность применения комплексной обработки дрожжевой биомассы, включающей предварительную обработку высоким давлением и процесс ферментолиза подобранным ферментативным комплексом, состоящим из протеолитических и глюканолитических гидролаз. Полученные экспериментальные данные показывают, что воздействие высокого давления и повышенных температур приводит к увеличению содержания растворимых белковых веществ и редуцирующих Сахаров в фильтратах дрожжевой суспензии, что свидетельствует о повышении степени деструкции белково-полисахаридных комплексов КС дрожжей и уровня экстрактивности белковых и углеводных веществ. В результате биокаталитической деструкции субклеточных структур дрожжей достигнут наиболее высокий выход белковых веществ при использовании дрожжевой биомассы, подвергнутой баротермической обработке при следующих значениях давления и температуры: 5,0 МПа и 50°С.

2.2.2 Влияние баротермического воздействия на эффективность процесса ферментативной деструкции внутриклеточных структур

дрожжей

Проведенные исследования показали, что баротермическое воздействие повышало проницаемость клеточной стенки дрожжей и положительно сказывалось на выходе белковых веществ протоплазмы при получении пищевого белка. Цель данного этапа работы состояла в исследовании влияния баротермического воздействия на степень деструкции внутриклеточных полимеров дрожжевой биомассы для создания натуральных биокорректоров пищи с заданными функциональными свойствами и лечебно-профилактических средств нового поколения.

В работе были использованы подобранные оптимальные баротермические режимы предобработки дрожжей: температура в реакторе 50°С, давление 5 МПа, длительность обработки - 30 мин. Кроме того, для предварительной подготовки биомассы применяли методы термолиза и автолиза.В качестве источника протеиназ, пептидаз и ß-глюканаз использовали комплексный ферментный препарат (КФПА), синтезируемый микромицетом Aspergillus oryzae, а также дополнительно применяли отдельные препараты - источники: бактериальных протеиназ (ПС), грибных протеиназ и пептидаз (ГПС) и ß-глюканаз (ß-ГкС).

Влияние ферментативных комплексов на степень деструкции внутриклеточных полимеров дрожжей исследовали на предварительно обработанной суспензии дрожжей вышеуказанными способами. Сравнительные результаты ферментативной деструкции субклеточных структур дрожжевой биомассы приведены на рис. 5.

После 5-ти и 18-ти часового ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы наиболее высокая концентрация растворимых белковых веществ отмечена в варианте, где клетки предварительно были обработаны при высоком давлении, подвергнуты термолизу и воздействию полного ферментативного комплекса, включающего протеиназы, ß-глюканазы и пептидазы (рис.5а, кривая 5). При этом более высокая степень деструкции белковых веществ с образованием аминного азота наблюдалась в варианте, в котором дрожжевая биомасса была подвергнута только баротермическому воздействию и обработана полным комплексом ферментов (рис.5б, кривая 4). Проведение дополнительного термолиза практически не сказалось на результатах ферментолиза белков протоплазмы дрожжей до легкоусвояемых азотистых компонентов. Подобная закономерность отмечена и при ферментативной деструкции полисахаридов дрожжевой клетки (рис.5в, кривая 4). Процесс автолитической деструкции дрожжевой биомассы под действием собственной ферментативной системы был не эффективен в связи с инактивацией

""Ж"1" 5-

реактор+термолиз+ГкС+ПС+ КФПА

О ЦЩЭ;0да 1——I—I—(—1--------——I-----—------1—4—( —«—б-термолиз+ГкС+ПС+КФПА

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

ферментов клетки в процессе баротермической обработки, поэтому его результаты использовали в качестве контрольного уровня (рис 5, кривые 1).

—$~~1-реактор+автолиз

НИН2-реактор+ГкС+ПС

3-р еа ктор+ КФ П А

—*-4-реактор+ГКС+ПС+ КФПА

«*~5-реактор+термолиз+ГкС +ПС+КФЛА

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 —#~6-термолиз+ГкС+ПС+КФПА Длительность ферментолиза, ч

а)

1-реактор+автолиз

50

И 45

3 са 40

§ 1? 35

о

»о в и 30

я я £ И Е и 25 20

н 3

я « я ¡0 15

я о 10

и 5

»3-реактор+КФПА

б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 реактор+термолиз+ГкС+ПС+К

Длительность ферментолиза, ч ФПА

б)

1-реактор+автолиз

«-Ш—2-реактор+ГкС+ПС

»»•^»~3-реактор+КФПА

4-реактор+ГкС+ПС +КФПА

Длительность ферментолиза, ч

В)

Рисунок 5 - Динамика накопления растворимых белковых веществ (а), аминного азота (ИНг) (б), растворимых углеводов (РВ) (в)

Исследования по влиянию состава ферментативного комплекса на степень деструкции внутриклеточных полимеров дрожжевой биомассы, обработанной в реакторе высокого давления, показали, что наиболее высокая концентрация редуцирующих Сахаров (рис.5в) и аминного азота (рис.5б) отмечена в варианте с использованием полного комплекса ферментов. Эффективная биокаталитическая деструкция внутриклеточных полимеров обусловлена совместным воздействием механического и ферментативного способов обработки дрожжевой биомассы. При этом воздействие высоких параметров давления сказывается на проницаемости клеточной стенки, повышая доступность ее белково-полисахаридного комплекса к биокаталитическому воздействию глюканолитических и протеолитических ферментов.

Определенный интерес представляет выявленная способность протеолитического комплекса воздействовать на белковые вещества протоплазмы дрожжевой клетки, которая предварительно была подвергнута баротермическому воздействию, но не обработана ферментами глюканолитического действия, а только комплексом грибных протеаз, включающим пептидазы (рис.5б и 5в, кривые 7). По-видимому, в результате высокого давления происходит частичная механическая деформация клеток, что способствует повышению проницаемости клеточной оболочки для биокаталитического действия гидролитических ферментов на внутриклеточные полимерные структуры. Это предположение подтверждается полученными экспериментальными результатами, показавшими увеличение концентрации аминного азота и содержания свободных аминокислот (АК) после обработки одним протеолитическим комплексом грибного происхождения (рис.5б и табл. 2). В результате протеолиза белков протоплазмы под действием ГПС, содержащего пептидазы, 37,9% аминокислот было переведено в свободное состояние. Использование ФП - источников Р-глюканаз и протеиназ более существенно сказывалось на деструкции белково-полисахаридных полимеров клеточных стенок, что подтверждается накоплением в ферментолизате дрожжевой биомассы редуцирующих веществ.

Сравнительный спектральный анализ белковых веществ в ферментолизатах дрожжевой биомассы, подвергнутой баротермическому воздействию, подтвердил, что наиболее высокая степень деструкции белков протоплазмы была достигнута при обработке ферментативной системой, в состав которой входили грибные пептидазы (КФПА, ГПС). При этом концентрация низкомолекулярных пептидов с массой до 300 Да достигала 87% (табл.1).

Данные по аминокислотному составу показывают наличие в ферментолизате дрожжевой биомассы, обработанной в реакторе высокого давления, 60,9% аминокислот в свободной не связанной форме, что повышает их медико-биологическую эффективность (табл.2). Наличие в ферментолизате

низкомолекулярных антиоксидантных пептидов, содержащих не более 4-10 остатков аминокислот, также придает ему определенные функциональные свойства.

Таблица 1 - Влияние ферментативных систем на фракционный состав белковых веществ дрожжевой биомассы_

М.м. пептидов, Да Фракционный состав белковых веществ, %

Р-ГкС +ПС ГПС Р- ГкС+ПС+КФПА

До 300 30 54 87

300-1000 49 37 13

Более 1000 21 9 -

Известно, что аминокислоты и белки, прежде всего, выполняют в организме пластическую функцию, являясь конструктивной основой всех формирующихся тканей, в составе которых порядка 80% белка. Кроме того, аминокислоты выполняют нейромедиаторную функцию, т.к. они участвуют в формировании веществ, отвечающих за передачу нервного импульса.

К нейромедиаторным аминокислотам относят, прежде всего, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, высокое содержание которых отмечено в полученных ферментолизатах дрожжевой биомассы (табл. 2). Участие медиаторных аминокислот в таких важных физиологических функциях, как высшие интегративные функции мозга (поведение, эмоции, память и др.), в регуляции функций сердечно-сосудистой и дыхательной системы, обмена веществ, эндокринной системы делают перспективными исследования по получению натуральных биологически активных добавок на основе дрожжевой биомассы как источников богатого комплекса аминокислот. Дефицит аминокислот, необходимых для нормального функционирования организма, может привести к серьезным патологическим изменениям.

Таким образом, полученные данные подтверждают эффективность баротермического воздействия при подготовке дрожжевой биомассы к ферментативной деструкции субклеточных структур. Использование ферментов глюканолитического действия позволяет наиболее глубоко разрушить клеточные стенки дрожжей, так как глюкан является ее основным структурным компонентом. Наличие в ферментативном комплексе КФПА ферментов пептидазного действия обеспечивает более глубокую деструкцию внутриклеточных компонентов, в т.ч. белковых веществ клетки с образованием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов, обусловливающих функциональные свойства в целевых продуктах.

Таблица 2 - Аминокислотный состав ферментолизатов дрожжевой биомассы, обработанной в реакторе высокого давления

Аминокислоты (АК) Содержание свободных аминокислот в ферментолизатах дрожжевой биомассы, мг/г

Общие АК 3-ГкС+ПС+КФПА ГПС Р-ГкС +ПС

АСП 39,2 16.7 6.1 1.8

ТРЕ 18.4 9.1 5.4 0.7

СЕР 19.8 10.7 4.2 0.9

ГЛУ 62.8 41.5 27.2 5.3

ГЛИ 16.7 6.3 4.7 0

АЛА 28.9 20.9 12.9 2.6

ВАЛ 14.9 8.7 3.3 0.6

ЦИС 2.9 2.3 1,6 0

МЕТ 5.4 4.6 2.9 0.7

ИЗО 12.6 5.7 3.2 0.3

ЛЕЙ 24.5 17.9 10.5 0.4

ТИР 9.8 7.2 4.7 0.3

ФАЛ 11.0 9.2 6.5 0.1

ЛИЗ 27.9 18.1 14.2 2.0

ГИС 6.7 4.0 2.5 0.5

АРГ 15.8 12.8 10.4 1.4

ПРО 14.5 6.5 5.6 0.3

Суммарное

количество АК 331.8 202.2 125.9 70.9

Из них

незаменимых АК 114.7 72.5 46.0 4.8

Конц. своб. АК, %

от общ. кол-ва - 60,9 37,9 21,4

2.2.3 Изучение степени деструкции клеточных структур дрожжей вассЬаготусев сегеу1з1ае под действием ферментативных систем 2.2.3.1 Влияние длительности процесса ферментолиза на степень деструкции внутриклеточных структур дрожжевой биомассы

Ферментативный гидролиз дрожжевой биомассы осуществляли в течение 4-х и 12-ти часов КФПА в оптимальной дозировке (10 ед ПС/г дрожжей), затем осуществляли разделение на фракции путем центрифугирования. Получены как твердые фракции - фрагменты клеточных стенок дрожжей (табл.2 а, в), так и жидкие фракции ферментолизатов дрожжевой биомассы (табл.2 б, г).

Как следует из приведенных данных, препараты А и В - клеточные стенки дрожжей, различались по степени гидролиза полисахаридов и белковых компонентов: на этапе 4-х часового гидролиза содержание низкомолекулярных углеводов (РВ) было в 1,4 раза ниже, чем на этапе 12-ти часового гидролиза (табл.3). Аналогичная картина наблюдалась по накоплению в ферментолизатах аминного

азота и растворимых форм белка. Их содержание после 4-х часового гидролиза было в 2 раза ниже, чем после 12-ти часового. Проведены масс-спектрометрический анализ (ЬСМБ) фракций, а также исследован их фракционный состав с применением тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Таблица 3 - Биохимическая характеристика ферментолизатов дрожжевой биомассы

Фракции ферментолизатов дрожжевой биомассы Характеристика фракций

рн РСВ, % РВ, мг/см3 нн2+, мг% белок, мг/см3

А -клеточн. стенки, 4 ч гидролиза 5,3 - 2,3 105 15,5

Б - фугат 4-х часового гидролиза 5,3 10,0 3,0 220 33,5

В -клеточн. стенки, 12 ч гидролиза 6,4 - 3,2 210 30,5

Г- фугат 12 ч ферментолизата 5,4 11,6 3,9 580 41,2

Исследуемые образцы содержали как минимум два одинаковых компонента, которые не светятся в ультрафиолетовом диапазоне, но проявляются нингидрином. В образцах, содержащих только клеточные стенки (А, В), полученные на основе твердой фракции ферментолизата дрожжей, этих пятен практически не обнаруживается. Из этого можно сделать вывод, что, скорее всего, в этих образцах вещества углеводного происхождения, что так же косвенно подтвердилось на ЬСМ8 - анализе (рис. 6-8). В образцах, представляющих фугат ферментолизатов (Б и Г), отмечено высокое содержание пептидов и аминокислот, о чем свидетельствовало яркое окрашивание компонентов нингидрином. Наиболее высокое содержание окрашиваемых компонентов в образце Г, полученного после глубокого 12-часового гидролиза, что говорит о преобладающем наличии низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот.

Результаты спектрального анализа исследуемых образцов ферментолизатов дрожжевой биомассы (А, Б, В, Г) подтвердили их различие по биохимическому и фракционному составу. Препараты А и В - клеточные стенки как после 4-х часового ферментолиза, так и после 12-часового не содержали способных к ионизации молекул, т.е. в этих образцах представлены вещества преимущественно небелковой, а полисахаридной природы: глюкано-маннановые и хитинсодержащие производные. Так на рисунке 6 видно практически полное отсутствие ярко-выраженных пиков, что подтверждает присутствие в образцах А и В, в основном, веществ небелковой природы.

На спектре препарата Б, являющегося фугатом ферментолизата после 4-х-часового гидролиза, видно, что образец, подверженный более щадящему гидролизу, содержит преимущественно пептиды с молекулярной массой от 300 до 1000 Да -57% и 13% высокомолекулярных пептидов с ММ более ЮООДа (рис. 7). Кроме того,

белковые вещества препарата Б представлены короткими пептидами с ММ 200-300 Да - 22,5 % и свободными аминокислотами - 7,5%. Наличие высокомолекулярных пептидов свидетельствует о том, что гидролиз прошел не полностью. Посчитав площадь пиков, и соотнеся их с молекулярной массой, можно сказать, что низкомолекулярных пептидов (ММ<300 Да) и аминокислот в образце Б всего 30%.

№^1|ГГХ"Т|Т1и 1.1,

Д^.^/ГДрДСр.уу.тртв...-¿д:зу......,

а) б)

Рисунок 6 - Спектральный анализ препаратов А и В -клеточных стенок дрожжей после 4-х ч (а) и 12-ти ч (б) ферментолиза

На рисунке 76 представлен один из наиболее информативных спектров, по которому можно сказать, что гидролиз биополимеров клетки прошел наиболее глубоко из всех изученных препаратов. В образце Г (фугате ферментолизата дрожжевой биомассы после 12-ти часового гидролиза) преобладали свободные аминокислоты 22,25% (ММ<100Да) и низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой 100-300 Да - 64,75%. Поглощение света в УФ-диапазоне, свидетельствовало о наличии ароматичных аминокислот (тирозина, триптофана, фенилаланина). Содержание аминного азота (580 мг%) в препарате Г в 2,6 раза превышало показатель препарата Б (табл.3).

|Ц«-

а)

Рисунок 7

б) в) Спектры ферментолизатов дрожжей: а) Б - фугат 4-х часового гидролиза, б) Г - фугат 12-ти часового гидролиза, в) спектры с подсчитанной площадью пиков

Подсчет площади пиков позволил определить процентное соотношение низкомолекулярных пептидов к общей массе компонентов (рис. 7в, 10). Установлено, что в образце Г содержание свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов

17

(ММ<300 Да) составляет 89% от общей массы веществ белковой природы, что почти в 3 раза превышает показатели ферментолизата дрожжей после 4-х ч гидролиза, пептидов с ММ 300-500 Да - 11 %.

Таким образом, полученные на основе направленной биокаталитической деструкции субклеточных структур дрожжевой биомассы препараты различались по биохимическому и спектральному составу. Препарат Г с глубокой степенью гидролиза биополимеров клетки содержал в 3 раза больше свободных аминокислот и в 2,9 раза - низкомолекулярных пептидов с ММ<300 Да, чем в препарате Б, в котором высокомолекулярные полимеры дрожжевой биомассы перешли в растворимое состояние. Белковый состав 4-х ч ферментолизата дрожжей отличался более высоким содержанием пептидов с ММ от 300 до 500 Да - в 2,7 раза и высокомолекулярных пептидов с ММ>1000 Да (рис.8).

а) б)

Рисунок 8 - Фракционный состав ферментолизатов дрожжевой биомассы после 4-х часового гидролиза (а) и 12-ти часового гидролиза (б) 1 - Молекулярная масса (ММ) более 1000 Да; 2 - ММ от 500 до 1000 Да; 3 - ММ от 300 до 500 Да; 4- ММ менее 300 Да

Полученные результаты подтверждают возможность проведения регулируемого процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы с получением ферментолизатов заданного состава. Для обеспечения необходимой степени и глубины гидролиза биополимеров дрожжевых клеток достаточно варьировать длительностью процесса и дозировкой и составом ферментов.

2.2.3.2 Влияние ферментативных систем с различной субстратной специфичностью на степень деструкции дрожжевой биомассы

С использованием подобранных ферментативных систем (ФС) целевого назначения проведена направленная биокаталитическая деструкция субклеточных ; структур дрожжевой биомассы БассИаготусея сегеУ151ае и наработаны два экспериментальных образца ферментолизатов с различной степенью конверсии внутриклеточных полимеров. Длительность ферментативной обработки составила 6 часов при 50°С.

В состав ФС-1 входили ферменты Р-глюканазного, маннолитического и протеолитического действия, способствующие деструкции белково-полисахаридного комплекса клеточных стенок (КС) дрожжей и частичному гидролизу белковых веществ протоплазмы. Ферменты, катализирующие гидролиз полисахаридов КС, дозировали из расчета: р-глюканазу - 300 ед р-ГкС/г, маннаназу

- 28,9 ед. МС/г дрожжей. Протеолитический комплекс ФС-1 включал ферменты бактериального происхождения (в дозировке - 10 ед. ПС/ г дрожжей), которые в основном представляли собой нейтральные сериновые и металлозависимые протеиназы, катализирующие гидролиз белков до пептидов с различной молекулярной массой, а также грибную карбоксильную протеиназу и пептидазы, гидролизующие белки и пептиды до аминокислот и коротких пептидов (в дозировке

- 2 ед. ПС/ г дрожжей). ФС-2 также состояла из ферментов р-глюканазного, маннолитического и протеолитического действия, но протеолитический комплекс был усилен повышенной дозировкой протеиназ и пептидаз грибного происхождения (10 ед. ПС/г дрожжей).

Ферментолизаты различались в основном по содержанию аминного азота (ЫН2-), концентрация которого во втором образце была в 2,7 раза выше (табл.4).

Таблица 4 - Биохимическая характеристика ферментолизатов дрожжей

Ферментолизаты дрожжевой биомассы Характеристика ферментолизатов

ОРВ,% РВ, % ЫН2\% белок, мг/см3

После обработки биомассы ФС-1 17,3 1,4 1,8 50,5

После обработки биомассы ФС-2 17,4 2,0 4,2 50,7

Несмотря на то, что дозировки ферментов, катализирующих гидролиз полисахаридов, были одинаковы в обоих вариантах, более глубокая деструкция КС с образованием редуцирующих веществ (РВ) была достигнута также во втором варианте.

Исследования аминокислотного состава белковых веществ полученных ферментолизатов подтвердили, что содержание незаменимых аминокислот составило порядка 40% от общего количества аминокислот (табл. 5).

Биокаталитическое воздействие ФС-1 привело к частичному протеолизу белковых веществ дрожжевой биомассы с выделением 21,5 % аминокислот от общего количества в свободное состояние. Использование ФС-2 позволило повысить степень гидролиза дрожжевого белка и увеличить количество свободных аминокислот в 2,5 раза.

Таблица 5 - Аминокислотный состав ферментолизатов дрожжевой биомассы

Аминокислоты (АК) Содержание аминокислот (АК) в ферментолизатах дрожжевой биомассы, %

Общие АК Свободные аминокислоты

Образец 2 (ФС-2) Образец 1 (ФС-1)

АСП 4,1 2,35 0,56

ТРЕ 2,8 1,40 0,44

СЕР 2,4 1,36 0,41

ГЛУ 6,8 4,64 1,85

ГЛИ 1,7 0,81 0,27

АЛА 3,1 2,13 0,74

ВАЛ 2,7 1,51 0,61

ЦИС 0,5 0,30 0,08

МЕТ 0,6 0,46 0,17

ИЗО 2,5 1,35 0,30

ЛЕЙ 3,5 2,27 0,81

ТИР 1,0 0,67 0,22

ФАЛ 2,8 0,98 0,45

ЛИЗ 3,6 2,15 0,99

ГИС 0,7 0,40 0,17

АРГ 1,8 1,35 0,46

ПРО 2,5 1,25 0,29

Суммарное количество

аминокислот, 43,1 25,38 9,26

Из них незаменимых. 18,5 9,22 3,77

Свободные АК, % от - 58,9 21,5

суммарного кол-ва

Результаты исследований спектрального состава белковых веществ ферментолизатов подтвердили наличие в них низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот. Оба образца преимущественно содержали вещества с массой до 350 Да. На обоих спектрах присутствовали вещества с молекулярной массой 124, 160, 180, 198, 212 и 230Да (рис. 9). По-видимому, к ним относятся и антиоксидантные пептиды с содержанием не более 4-10 остатков аминокислот, а также незаменимые и нейромедиаторные аминокислоты, необходимые для нормального функционирования организма человека и обусловливающие функциональные свойства в целевых продуктах.

Рисунок 9 - Масс-спектр ферментализата дрожжевой биомассы

Проведенные медико-биологические и клинические исследования ферментолизатов дрожжевой биомассы показали их эффективность в качестве биокорректоров пищи с функциональными свойствами при создании лечебно-профилактических продуктов для людей с пониженной резистентностью к вирусным и бактериальным инфекциям, страдающих обменными нарушениями, нарушениями желудочно-кишечного тракта и заболеваниями, полученными вследствие неправильного питания.

2.2.4 Изучение степени деструкции клеточных структур с применением электронной и сканирующей микроскопии

Исследована степень биокаталитической деструкции дрожжевой биомассы в процессе воздействия ферментативных систем (ФС) с различной субстратной специфичностью: на 1-ой стадии применяли ФС-1 (источник ферментов глюкано- и маннанолитического действия); 2-ой стадии - ФС-2 (комплекс протеиназ, глюканазы и маннаназы); 3-ей стадии - ФС-3 (комплекс протеиназ, пептидаз, Р-глюканазы и маннаназы).

На 1-ой стадии ультраструктурное строение клеток существенно не изменялось. Отмечено образование щелевидных пространств в цитоплазматической мембране между стенкой и цитоплазмой, при этом мембрана приобретала более расслоенный вид (рис. 10а).

С целью повышения степени деструкции клеточных стенок, и учитывая, что полисахариды находятся в комплексе с белками, на 2-ой стадии ферментолиза в состав ферментативной системы вводили протеолитические ферменты, представленные протеиназами, катализирующими частичный гидролиз белка до пептидов. В результате биокаталитической деструкции клеточной стенки дрожжей происходило частичное высвобождение деполимеризированных субклеточных структур (рис. 106). При этом целостность клеточной стенки дрожжей под действием комплекса ферментов нарушалась в еще большей степени.

21

2012.04.25 15:10 М 09 4 *1.8к 501

а) б) в)

Рисунок 10 - Результаты по стадийной деструкции дрожжевых клеток а) 1 стадия - после частичного гидролиза ферментами глюкано- и маннанолитического действия (ФС-1); б) 2 стадия под действием комплекса протеиназ, глюканазы и маннаназы (ФС-2); в) 3 стадия ферментативного гидролиза полимеров клетки под действием комплекса протеиназ, пептидаз, глюканазы и

маннаназы (ФС-3)

Для получения белково-аминокислотного обогатителя пищи с преобладающим содержанием свободных аминокислот и коротких пептидов использовали протеолитический комплекс, в составе которого присутствовали пептидазы - ферменты, катализирующие гидролиз белков до свободных аминокислот. В дрожжевых клетках на 3 стадии ферментолиза наиболее выражены явления деструкции цитоплазмы. В большинстве клеток сохранились лишь остатки цитоплазмы и клеточной стенки неправильной формы и различного размера (рис. 10в).

Таким образом, в результате исследований с помощью электронной микроскопии проиллюстрировано влияние ферментативных систем различной субстратной специфичности на степень деструкции субклеточных структур дрожжей, подтверждающее эффективное действие ферментов, катализирующих биодеструкцию клеточных стенок и белковых веществ дрожжевой биомассы, в технологиях белково-аминокислотных обогатителей пищи и БАД с функциональными свойствами.

2.2.5. Научное и экспериментальное обоснование получения функциональных продуктов пищевого и кормового назначения с использованием ферментолизата дрожжевой биомассы Установленные закономерности баротермической и ферментативной конверсии полимеров микробной клетки позволили усовершенствовать технологию получения белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов (табл.6). Усовершенствованная технология позволяет повысить степень деструкции внутриклеточных структур дрожжей и получать добавки целевого назначения с заданными структурно-функциональными свойствами.

Таблица 6 - Сравнительная характеристика существующей и разработанной технологии направленной ферментативной конверсии полимеров дрожжевой биомассы с получением белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов

Этапы процесса Существующая технология автолиза Разработанная технология ферментолиза Достигнутый результат

Плазмолиз 2ч 0 Сокращение времени предобработки

Термолиз или баротермия 0 15-30 мин

Использование антисептиков и индукторов Формалин, этанол и др. Не используются Исключение химических реагентов

Применение ферментов Не применяется 2-10 ед. ПС/г дрожжей 300 ед. р-ГкС/г Управляемый процесс направленной деструкции полимеров клетки

Длительность гидролиза, ч 18-36ч 4-12 ч Сокращение длительности процесса в 3-4 раза

Степень гидролиза белка, % 50-65 60-100 Повышение глубины гидролиза белка

Фракционный состав белковых веществ, % М.м.: до 300 Да 300-1000 Да более 1000 Да 5-20 10-24 90-76 Биокорректор БАД Получение ферментолизатов с заданным фракционным составом

30 57 13 89 11

Свободные аминокислоты, % от общего кол-ва 3-12 21 60 Увеличение содержания свободных аминокислот

Конечные продукты Пищевые добавки Белково-аминокислотные корректоры пищи и кормов и БАД Расширение функциональных свойств продуктов гидролиза

На ЗАО «Биопрогресс» ВНИТИБП проведена наработка опытных партий белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов. Исследован биохимический, фракционный и спектральный состав полученных опытных образцов белково-аминокислотных добавок. На целевые продукты разработана нормативная документация (ТУ 9182-056-00334586-2012 «Белково-аминокислотный биокорректор пищи»; ТИ по производству белково-аминокислотного биокорректора пищи; ТУ 9182-114-00334586-2013 «Кормовая белково-аминокислотная добавка Протамин»; ТИ по производству кормовой белково-аминокислотной добавки Протамин; ТУ 9182-115-00334586-2013 «БАД Суперпротамин»).

Показана перспективность использования продуктов конверсии дрожжевой биомассы, в качестве эффективных добавок повышающих биологическую ценность пищи и кормов. Проведены испытания по использованию ферментолизатов дрожжей для обогащения ферментированных молочных продуктов - йогуртов для геродиетического питания. Исследования проводились во ВНИИ Детского питания, разработан рецептурный состав, получены спектры обогащенного пептидами и аминокислотами продукта, подтвердившие обогащение продуктов незаменимыми аминокислотами и биолигически активными пептидами.

Проведены испытания ферментолизата дрожжей в виде препарата Протамин в составе стартового комбикорма для личинок осетровых рыб, подтвердившие биологическую эффективность препарата (повышение интенсивности роста личинок на 18-48%, увеличение массы выращенных мальков на 20-55%).

БАД, полученные на основе глубокой ферментативной деструкции дрожжевой биомассы, использованы при наработке опытных партий шампуней и косметических кремов на ОАО «Свобода». Применение добавок позволило повысить биологическую эффективность воздействия изделий на кожу.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена эффективность баротермического воздействия на повышение степени проницаемости клеточной стенки дрожжей и разработаны оптимальные условия: температура 50°С, давление 5 МПа, длительность обработки - 30 мин, обеспечивающие увеличение содержания растворимых углеводов в 1,70-1,85 раза и белковых веществ в 1,40-1,55 раза.

2. Установлено, что баротермическая предобработка дрожжевой биомассы способствует повышению степени ферментативной деструкции субклеточных структур, что выразилось в увеличении выхода растворимых белковых - на 4043% и редуцирующих веществ на 126-130%, по сравнению с контрольным вариантом (термолиз).

3. Установлена эффективность применения комплексной обработки дрожжевой биомассы, включающая предварительную обработку давлением и процесс ферментолиза подобранными ферментативными комплексами, состоящими из протеолитических и глюканолитических гидролаз.

4. Исследованы закономерности биокатализа полимеров микробной биомассы и выявлена взаимосвязь субстратной специфичности ферментов, используемых в качестве катализаторов, и степени биодеструкции внутриклеточных полимеров дрожжевой биомассы.

5. Исследован спектральный состав белковых веществ и показано наличие заменимых и незаменимых аминокислот и биологически активных пептидов в

ферментолизатах дрожжей, способных выполнять важнейшие нейромедиаторные и др. функции, обеспечивающие функциональные свойства целевых продуктов

6. С помощью электронной микроскопии проиллюстрировано влияние ферментативных систем различной субстратной специфичности на степень деструкции субклеточных структур дрожжей, подтверждающее эффективное действие ферментов, катализирующих биодеструкцию клеточных стенок и белковых веществ дрожжевой биомассы.

7. Разработана усовершенствованная технология получения биологически активных добавок, биокорректоров пищи и кормов, обеспечивающая направленный процесс биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой биомассы с получением ферментолизщатов с заданным структурно-фракционным составом.

8. Проведены производственные испытания и наработаны опытные партии биокорректоров пищи и кормов, функциональные свойства и биологическая эффективность которых исследована при создании новых ферментированных молочных продуктов, косметических изделий и стартовых комбикормов для личинок осетровых рыб.

Список работ опубликованных по материалам диссертации:

1. Рачков, К.В. Использование биомассы гриба Aspergillus oryzae в качестве источника биологически активных веществ / JI.B. Римарева, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, И.М. Абрамова // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2012. - № 9. - С.46-50.

2. Рачков, К.В. Влияние баротермического воздействия на степень подготовки дрожжевой биомассы к ферментативной деструкции / JI.B. Римарева, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков, Е.И. Курбатова, E.H. Соколова, Ю.А. Борщева // Хранение и переработка сельхозсырья. 2013. № 6. С. 31-35.

3. Рачков, К.В. Исследование фракционного состава биокорректоров пищи из дрожжевой биомассы для создания на их основе функциональных продуктов целевого назначения / Е.М. Серба, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, М.Б. Оверченко, JI.B. Римарева, В.А. Поляков // Хранение и переработка сельхозсырья. 2013. № 11. С. 1821

4. Рачков, К.В. Создание натуральных биокорректоров пищи для фукциональных продуктов / Е.М. Серба, К.В. Рачков, Н.И. Игнатова, JI.B. Римарева, В.А. Поляков // Пищевая промышленность. 2013. № 9. С. 18-20

5. Рачков, К.В. Биологически активные добавки микробного происхождения как фактор, формирующий функциональные свойства пищевых продуктов / В.А. Поляков, JI.B. Римарева, Е.М. Серба, Н.С. Погоржельская, К.В. Рачков // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2013. -№ 12. - С. 43-47.

6. Рачков, К.В. Интенсификация процессов прорастания семян с использованием отходов ферментного производства / Е.М. Серба, Л.В. Римарева, К.В. Рачков //

Материалы международной конференции «Биология - наука XXI века», г. Москва. Изд. МАКС. ПРЕСС. -2012. С. 828-830.

7. Рачков, К.В. Использование микробной биомассы как стимулятора роста растений / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков // 46-ая Межд. научная конф. молодых ученых, докторантов, аспирантов и соискателей «Эффективность применения средств химизации в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур - М.:ВНИИА.- 2012. - С.169-171.

8. Рачков, К.В. Микроорганизмы и биокаталитические технологии в создании функциональных продуктов / JI.B. Римарева, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, Н.С. Погоржельская // Материалы XI Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Мурманск, 25-30 июня 2012, с. 98-107.

9. Рачков, К.В. Некоторые аспекты использования грибной биомассы - отхода биотехнологического производства для коррекции белкового и углеводного состава продуктов питания / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Научно-инновационные аспекты при создании продуктов здорового питания». Углич. 2012.

- С.207-210.

10. Рачков, К.В. Исследование биохимического, спектрального и фракционного состава ферментолизатов микробной биомассы / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.С. Погоржельская, К.В. Рачков, Н.И. Игнатова // Сб. научн. трудов «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» под ред. В.А. Полякова, Л.В. Римаревой

- М.: ВНИИПБТ, 2012. С. 115 -125.

11. Рачков, К.В. Перспективы создания функциональных продуктов на основе хитинсодержащей микробной биомассы и биокаталитических процессов / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, К.В. Рачков // Материалы VII Межд. Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.).-М., 2013. -Ч.2.-С.40-41.

12. Рачков, К.В. Технологические особенности создания биокорректоров пищи на основе дрожжевой биомассы / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, К.В. Рачков, М.Б. Оверченко, Е.И. Курбатова, E.H. Соколова // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции «Пищевые ингредиенты и инновационные технологии в производстве продуктов питания» (г.Санкт-Петербург, 15-15 мая 2013 г.). - ГНУ ВНИИПАКК, 2013. - С. 142-145.

13. Рачков, К.В. Биотехнология натуральных биокорректоров пищи на основе микробной биомассы с заданными структурно-функциональными свойствами / Е.М. Серба, К.В. Рачков, Л.В, Римарева, Н.С. Погоржельская // Сб. материалов Межд.

научно-практ. конф. «Инновационные технологии в производстве и переработке сельскохозяйственной продукции в условиях ВТО». Волгоград. - 2013.

14. Рачков, К.В. Влияние степени биодеструкции полимеров дрожжевой клетки на фракционный состав и функциональные свойства ферментолизатов дрожжевой биомассы / Е.М. Серба, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, JI.B. Римарева, Н.С. Погоржельская // Сб. материалов VI Российского симпозиума «Белки и пептиды» (Уфа, БГАУ, 10-15 июня 2013 г.). - Уфа: БКАУ, 2013. - С. 277.

15. Рачков, К.В. Фракционный состав и функциональные свойства ферментолизатов дрожжевой биомассы / Е.М. Серба, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, JI.B. Римарева, Н.С. Погоржельская, В.А. Поляков // Известия Самарского научного центра РАН.-2013.-Т. 15.-№3(5).- С. 1680-1681.

Список сокращений:

КС - клеточные стенки

ФП — ферментные препараты

ФС — ферментативная система

ß-ГкС - ß-глюканазная способность

ПС- протеолитическая способность

ГПС - комплекс грибных протеиназ и пептидаз

КФПА - комплексный ферментный препарат ( ß-глюканазы, грибные протеиназы и пептидазы)

PCB - растворимые сухие вещества РВ - редуцирующие вещества ММ - молекулярная масса

гли- Глицин ТРП- Триптофан

AJIA- Алании СЕР- Серии

ВАЛ- Валин ТРЕ- Треонин

ЛЕЙ- Лейцин АСП- Аспарагиновая кислота

ИЛЕ- Изолейцин ГЛУ- Глутаминовая кислота

ПРО- Пролин АСН- Аспарагин

ФЕН- Фенилаланин ГЛН- Глутамин

ТИР- Тирозин цис- Цистеин

Подписано в печать:

21.03.2014

Заказ № 9977 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.auloreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рачков, Кирилл Викторович, Москва

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

04201458115

На правах рукописи

РАЧКОВ КИРИЛЛ ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БЕЖОВ О-АМИНОКИСЛОТНЫХ КОРРЕКТОРОВ КОРМОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК

НА ОСНОВЕ НАПРАВЛЕННОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ КОНВЕРСИИ ПОЛИМЕРОВ ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -Серба Елена Михайловна, кандидат технических наук

Москва, 2014

)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Введение..........................................................................................5

Глава 1 Обзор литературы....................................................................11

1.1 Состояние проблемы и задачи исследований...................................11

1.2 Получение биологически активных добавок на основе микроорганизмов.....................................................................16

1.3 Структура и биохимический состав дрожжевой клетки.....................20

1.4Методы трансформации дрожжевой клетки....................................32

1.4.1 Физические методы дезинтеграция микробных клеток...........34

1.4.2 Химические методы дезинтеграции микробных клеток...........35

1.4.3 Биологические методы деструкции полимеров дрожжевой биомассы.....................................................................36

1.4.3.1 Автолиз дрожжевых клеток.................................36

1.4.3.2 Ферментативный гидролиз..................................40

1.5 Методы получения биологически активных препаратов из микробной

биомассы и исследования их структурно-спектральных свойств..........44

1.5.1 Электрофоретические методы разделения белка....................46

1.5.1.1 Изоэлектрическое фокусирование белков................47

1.5.2 Хроматографическое разделение белков.............................47

1.5.2.1 Гель-хроматография (гель-фильтрация)...............48

1.5.2.2 Аффинная хроматография.................................49

1.5.2.3 Распределительная хроматография.....................50

1.5.3 Масс-спектрометрический анализ белков и пептидов.............51

Заключение по обзору литературы...........................................................55

Глава 2 Объекты и методы исследований ................................................57

2.1 Объекты исследования..............................................................57

2.2 Методы исследований................................................................57

2.2.1 Исследование влияния физико-механических способов предобработки дрожжевой биомассы........................................57

2.2.2 Исследование биохимического состава ферментолизатов... 58

2.2.3 Методы математического планирования эксперимента и обработка экспериментальных данных.....................................63

2.3 Структура проведенных исследований..........................................63

Глава 3 Результаты экспериментов и их обсуждение...................................64

3.1 Исследование различных способов деструкции клеточных стенок для подготовки дрожжевой биомассы к ферментативному воядейстрию ,..64

3.1.1 Изучение влияния ультразвукового излучения на интенсификацию процесса ферментолиза клеточной стенки дрожжей..................................................................64

3.1.2 Влияние баротермического воздействия на степень подготовки дрожжевой биомассы к ферментативной деструкции. Исследование влияния баротермического воздействия на степень деструкции клеточных стенок дрожжей (КС) в технологии получения белковых препаратов......................69

3.1.3 Влияние баротермического воздействия на эффективность процесса ферментативной деструкции внутриклеточных структур дрожжей.......................................................77

3.2 Изучение степени деструкции клеточных структур дрожжей ЗассИаготусеБ сегеу1з1ае под действием ферментативных систем...........85

3.2.1 Влияние длительности процесса ферментолиза на степень деструкции клеточных стенок и внутриклеточных структур дрожжевой биомассы.........................................................85

3.2.2 Влияние ферментативных систем с различной субстратной специфичностью на степень деструкции дрожжевой биомассы...................................................................92

3.3Изучение степени деструкции клеточных структур с применением электронной и сканирующей микроскопии....................................95

3.4Научное и экспериментальное обоснование получения функциональных продуктов пищевого и кормового назначения с использованием ферментолизата дрожжевой биомассы........................................101

Заключение и основные выводы.........................................................113

Список сокращений...,......................................................115

Список литературы..........................................................................116

Приложения....................................................................................130

Приложение 1 Технические условия и технологические инструкции на

разработанные продукты......................................................................131

Приложение 2 Акт испытаний и наработки опытных партий ферментолизатов................................................................................136

Приложение 3 Акт выработки и испытаний в производстве косметических кремов, протокол испытаний их эффективности........................................139

Приложение 4 Акт выработки и испытаний в производстве шампуней и протокол испытаний их эффективности...............................................................143

Приложение 5 Акт испытаний в составе стартового комбикорма для личинок осетровых рыб...................................................................................148

Приложение 6 Диплом за «Ферментолизат с антиканцерогенными свойствами и специфической цитотоксичностью по отношению к онкоклеткам».................151

Введение

В современном мире с быстро растущим населением и недостаточно развитым сельским хозяйством, чрезвычайно важным становится поиск альтернативных источников пищевого белка. Большая часть населения Земли голодает из-за нерационального распределения продовольствия и отсутствия сбалансированного питания. Ученых волнует вопрос, сможет ли уровень развития производства продуктов питания и кормов идти в ногу с темпом роста населения. Данная проблема обусловлена ограниченными сырьевыми ресурсами и сельскохозяйственными угодьями, необходимыми для глобального

продовольственного снабжения и производства.

В последнее время с подобной проблемой столкнулись и в России. Анализ структуры питания населения России свидетельствует о дефиците пищевого белка, который по прогнозам экспертов, сохранится и в ближайшем будущем. В структуре питания россиян стала преобладать углеводная пища, что повлекло за собой острый дефицит таких биологически важных нутриентов, как белки, незаменимые аминокислоты, витамины и минералы. Белки в живых организмах играют очень важную роль, выполняя регуляторные, структурные, каталитические, транспортные, защитные и другие функции. Они обеспечивают обмен веществ организма, в котором участвуют как структурные белки клеток и тканей, так и ферментные и гормональные системы. Белки в организме человека находятся в постоянном обновлении, при котором распад компенсируется ресинтезом из фонда свободных аминокислот, полученных при переваривании пищи.

Эффективность белкового обмена в значительно степени зависит от количественного и качественного состава пищи. Минимально необходимая норма потребления белка - 49г/сутки. При поступлении белков с пищей ниже рекомендуемых норм в организме начинают распадаться белки тканей, а полученные после их распада аминокислоты расходуются на синтез ферментов, гормонов и других жизненно необходимых компонентов. В то же время, клетки

организма человека не могут синтезировать необходимые белки, если в составе пищи будет отсутствовать, хотя бы одна незаменимая аминокислота. В итоге в результате неправильного питания понижается сопротивляемость населения неблагоприятным факторам, развиваются хронические заболевания, снижается продолжительность жизни.

Одними из самых перспективных продуцентов белка, аминокислотный скор которого приближается к животному, являются микроорганизмы, особенно таких таксономических групп как: дрожжи, микроскопические грибы, актиномицеты, одноклеточные водоросли, бактерии. Однако питательная ценность микробной биомассы ограничена малой доступностью содержимого клетки для действия пищеварительных ферментов. Для повышения усвояемости внутриклеточных биологически ценных компонентов разрабатываются различные способы обработки дрожжей, из которых наиболее перспективным является процесс направленной ферментативной деструкции полимеров микробной клетки с целью выделением белковых веществ и получения белково-аминокислотных обогатителей пищи [24, 57, 66, 86].

В связи с вышесказанным следует, что в условиях высокого дефицита пищевого белка, несбалансированности питания основной задачей является поиск перспективных микроорганизмов - источников белковых веществ и разработка эффективного способа конверсии микробной биомассы на основе регулируемого процесса деструкции субклеточных структур для получения

конкурентоспособных биологически полноценных корректоров пищи и кормов с заданными структурно-функциональными свойствами.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в совершенствовании биотехнологии белково-аминокислотных корректоров пищи, кормов и биологически активных добавок (БАД), получаемых на основе направленной ферментативной конверсии высокомолекулярных полимеров микробной биомассы, для повышения эффективности производства и получения пищевых добавок с заданными структурно-функциональными

свойствами, обеспечивающих повышение качества питания и создание социально значимых функциональных продуктов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- проведение мониторинга и сравнительного анализа существующих методов подготовки микробной биомассы к ферментативной деструкции субклеточных структур;

- изучение степени баротермического воздействия на клеточные стенки дрожжей ЗассИагошусез сегеу1з1ае для выделения белковых веществ;

- исследование влияния баротермического воздействия на эффективность процесса ферментативной деструкции внутриклеточных структур дрожжей;

- проведение спектрального анализа ферментолизатов микробной биомассы в процессе деструкции белковых веществ протоплазмы дрожжевой клетки;

- электронно-микроскопические исследования ферментолизатов дрожжевых клеток БассЬаготусез сегеу1з!ае;

- исследование взаимосвязи спектрального состава белковых веществ и функциональных свойств ферментолизатов дрожжевой биомассы;

- проведение испытаний и наработка опытной партии биокорректора пищи;

- научное и экспериментальное обоснование получения функциональных продуктов пищевого и кормового назначения с использованием ферментолизата дрожжевой биомассы.

Научная новизна работы. Получены и научно обоснованы экспериментальные данные в области биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой биомассы:

- изучено влияние баротермической обработки дрожжевой биомассы на степень конверсии белково-полисахаридных полимеров клеточных стенок дрожжей;

- установлена зависимость глубины гидролиза субклеточных структур дрожжевой биомассы от параметров предобработки дрожжевой биомассы (давления, температуры, длительности воздействия);

- исследован спектральный состав белковых веществ ферментолизатов дрожжевой биомассы;

- установлено влияние ферментативных систем на степень деструкции белковых веществ дрожжевой клетки;

определены параметры процесса направленной биокаталитической конверсии субклеточных полимеров дрожжей с получением ферментолизатов с заданным структурно-фракционным составом; :

- установлена взаимосвязь спектрального состава дрожжевых гидролизатов с функциональными свойствами получаемых продуктов.

Практическая значимость. На основе установленных закономерностей баротермической и ферментативной конверсии полимеров микробной клетки усовершенствована технология получения белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов. Разработанная технология позволяет повысить степень деструкции внутриклеточных структур дрожжей и получать добавки целевого назначения с заданными структурно-функциональными свойствами аппаратурно-технологическая схема. На целевые продукты разработана нормативная документация (ТУ 9182-056-00334586-2012 «Белково-аминокислотный биокорректор пищи»; ТИ по производству белково-аминокислотного биокорректора пищи; ТУ 9182-114-00334586-2013 «Кормовая белково-аминокислотная добавка Протамин»; ТИ по производству кормовой белково-аминокислотной добавки Протамин; ТУ 9182-115-003345862013 «БАД Суперпротамин»). Проведена наработка опытных партий белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов на ЗАО «Биопрогресс» ВНИТИБП (Московская область, Щелковский район).

Показана перспективность использования продуктов конверсии дрожжевой биомассы, в качестве эффективных добавок повышающих биологическую ценность пищи и кормов. Проведены испытания по использованию ферментолизатов дрожжей для обогащения ферментированных молочных продуктов, косметических изделий и стартовых комбикормов для личинок осетровых рыб, подтвердившие их высокую биологическую эффективность.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований по влиянию баротермической предобработки дрожжевой биомассы на повышение степени биокаталитического воздействия ферментативных систем на высокомолекулярные полимеры клеточных стенок и протоплазмы клетки.

2. Закономерности направленной ферментативной деструкции дрожжевой биомассы с получением ферментолизатов с заданным фракционным составом белковых веществ.

3. Усовершенствованная технология получения биологически активных добавок (БАД), белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов.

4. Спектральный состав целевых добавок и перспектива их применения для повышения биологической ценности продуктов питания и кормов.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на следующих конференциях: Международная конференции «Биология — наука XXI века». Москва, 2012 г; 46-ая Международная научная конференция молодых ученых, докторантов, аспирантов и соискателей ученых степеней доктора и кандидата наук «Эффективность применения средств химизации в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур. ГНУ ВНИИ агрохимии им. Д.Н. Прянишникова, Москва, 2012 г; Международная конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Мурманск, 2012 г; Всероссийская научно-практическая конференция «Научно-инновационные аспекты при создании продуктов здорового питания», Углич, 2012 г; VII Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы

развития», Москва, 2013 г; Всероссийская научно-практическая конференция «Пищевые ингредиенты и инновационные технологии в производстве продуктов питания» С.-Петербург, 2013.

Глава 1 Обзор литературы 1.1. Состояние проблемы и задачи исследований

В современном мире с быстро растущим населением и недостаточно развитым сельским хозяйством, чрезвычайно важным становится поиск альтернативных источников пищевого белка. Большая часть населения Земли голодает из-за нерационального распределения продовольствия и отсутствия сбалансированного питания. Ученых волнует вопрос, сможет ли уровень развития производства продуктов питания и кормов идти в ногу с темпом роста населения. Данная проблема обусловлена ограниченными сырьевыми ресурсами и сельскохозяйственными угодьями, необходимыми для глобального

продовольственного снабжения и производства [102, 119, 120, 129].

В последнее время с подобной проблемой столкнулись развитые страны и Россия. Анализ структуры питания населения России свидетельствует о дефиците пищевого белка, который по прогнозам экспертов, сохранится и в ближайшем будущем [31]. В структуре питания россиян стала преобладать углеводная пища, что повлекло за собой острый дефицит таких биологически важных веществ, как белки, незаменимые аминокислоты, витамины и минералы. Белки в живых организмах играют очень важную роль, выполняя регуляторные, структурные, каталитические, транспортные, защитные и другие функции. Они обеспечивают обмен веществ между организмом и окружающей внешней средой, в котором участвуют как структурные белки клеток и тканей, так и ферментные и гормональные системы. Белки играют ключевую роль в жизни любой клетки, регулируя все многообразие процессов протекающих в ней, и обеспечивая функционирование организма как единого целого. Белки в организме человека находятся в постоянном обновлении, при котором распад компенсируется ресинтезом из фонда свободных аминокислот, полученных при переваривании пищи.

Эффективность белкового обмена в значительно степени зависит от количественного и качественного состава пищи. Минимально необходимая норма потребления белка - 49г/сутки [52]. При поступлении белков с пищей ниже рекомендуемых норм в организме человека и животных начинают распадаться белки тканей (печени, плазмы крови и д�