Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические основы ресурсосберегающей переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические основы ресурсосберегающей переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов"

На правах рукописи

СЕРБА ЕЛЕНА МИХАИЛОВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩЕЙ ПЕРЕРАБОТКИ ЗЕРНОВОГО СЫРЬЯ И ВТОРИЧНЫХ БИОРЕСУРСОВ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

005559063

12 СЕВ 2015

Щелково-2015

005559063

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийском научно-исследовательском институте пищевой биотехнологии» (ФГБНУ ВНИИПБТ)

Научный консультант: Поляков Виктор Антонович, академик РАН,

доктор технических наук, профессор

Официальные оппоненты: Мартыненко Николай Николаевич,

доктор биологических наук, профессор кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза» ФГБОУ ВПО «Московского государственного университета пищевых производств».

Гаврилов Владимир Андреевич,

Доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, профессор кафедры биотехнологии ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Гернет Марина Васильевна, доктор технических наук, профессор, заведующая лабораторией брожения и санитарии пивоварения ФГБНУ «ВНИИ пивобезалкогольной и винодельческой промышленности»

Ведущая организация: Государственный научно - исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (ОАО «ГосНИИсинтезбелок»).

Защита состоится 27 марта 2015 г. в 10 часов 00 минут на заседании Диссертационного совета Д 066.069.01 при ФГБНУ Всероссийском научно-исследовательском и технологического института биологической промышленности по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ФГБНУ ВНИТИБП, e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ ВНИТИБП. Автореферат разослан Ж

Автореферат « J^n /_ 2015г. размещен на сайте ФГБНУ ВНИТИБП

http://www.vnitibp.com и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru/

Ученый секретарь

Диссертационного совета кандидат биологических наук

Фролов Ю.Д.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. На современном этапе проблема обеспечения потребностей животноводства эффективными белково-аминокислотными кормами может быть решена на основе использования качественно новых методов производства кормов с привлечением биотехнологических процессов глубокой переработки сельскохозяйственного и вторичного сырья растительного и микробного происхождения. Данная проблема обусловлена не только ограниченными сырьевыми ресурсами и сельскохозяйственными угодьями, необходимыми для глобального продовольственного снабжения, но и современным экологическим состоянием перерабатывающих производств.

Агропромышленный комплекс России ежегодно перерабатывает более 100 миллионов тонн сельскохозяйственного сырья. Для повышения его эффективности необходимо создание инновационных ресурсосберегающих технологий, способствующих решению экологических проблем перерабатывающих отраслей и производству конкурентоспособной биополноценной продукции для сохранения лидирующих позиций национальных производителей. Одним из крупномасштабных потребителей зерна является спиртовое производство, перерабатывающее более 2 млн. тонн сырья с образованием порядка 8-10 млн. тонн в год послеспиртовой барды. При организации производства топливного биоэтанола вопрос о рациональном использовании вторичных ресурсов (ВСР) будет стоять еще более остро, что диктует необходимость проведения работ по их применению в качестве сырьевых источников для создания биотехнологической продукции.

Перспективными источниками белка, незаменимых аминокислот и других эссенциальных нутриентов являются вторичные биоресурсы перерабатывающих предприятиях АПК - остаточная биомасса мицелиальных грибов, спиртовых, пивных, винных и кормовых дрожжей. Это обусловлено не только способностью микроорганизмов синтезировать вещества, имеющие промышленное значение, но и возможностью использовать их биомассу в качестве субстрата для получения белково-аминокислотных кормовых добавок, а также биологически активных веществ с функциональными свойствами для создания сбалансированных продуктов и эффективных для животноводства кормов.

Таким образом, для экономики России представляется перспективным создание биотехнологических производств глубокой переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов на основе современных процессов биокаталитической и биосинтетической трансформации в конкурентоспособные продукты, имеющие спрос как в России, так и за рубежом. Реализация ресурсосберегающих биотехнологий позволит повысить рентабельность производства, обеспечить импортозамещение, способствовать снижению техногенного воздействия перерабатывающих отраслей АПК.

Степень разработанности проблемы. Результаты исследований в области комплексной биокаталитической и микробной конверсии зернового сырья на спирт и кормовые добавки представлены в работах таких известных ученых как Воробьева Г.И., Гернет М.В., Грачева И.М., Леденев В.П., Поляков В.А., Римарева Л.В., Родзевич В.И., Степанов В.И., Устинников Б.А., Яровенко В.Л. и др. Однако,

эти исследования проводились на низкоконцентрированных зерновых средах, а для переработки вторичного сырья в кормовые добавки использовали в основном термомеханические методы сушки зерновой барды или микробного синтеза на основе дрожжей рода Candida, Saccharomyces - продуцентов белка. Увеличение производства протеинсодержащих продуктов и кормов не решает в целом проблему сбалансированного белкового питания, так как наряду с общим уровнем белка в рационе животных важную регуляторную роль играет его аминокислотный состав и особенно содержание незаменимых аминокислот, в первую очередь, лизина

Ведутся исследования по разработке биотехнологических методов конверсии микробной биомассы и подбору перспективных видов микроорганизмов для производства белково-аминокислотных, вкусо-ароматических обогатителей и биологически активных пищевых и кормовых добавок. Развито направление исследований по автолитической и ферментативной деструкции полимеров микробного сырья, результаты которых приведены в научно-практических трудах А.И. Албулова, В.М. Беликова, Н.Б. Градовой, JI.A. Ивановой, С.А. Коновалова, J1.B. Римаревой, М.А. Фроловой и др. ученых. При этом в работах практически отсутствует системный подход к исследуемой проблеме, не установлена взаимосвязь условий и субстратной специфичности ферментативных систем, катализирующих биотрансформацию субклеточных полимеров микробной клетки, с принципиально новыми структурно-функциональными свойствами и возможностями получаемых ферментолизатов. В связи с высокой механической прочностью клеточных стенок микроорганизмов и низкой доступностью ферментов к биокаталитическому воздействию не были исследованы процессы направленного глубокого гидролиза внутриклеточных полимеров микробной биомассы, не установлено влияние спектрального состава белковых веществ на медико-биологическую активность и функциональные свойства ферментолизатов. Кроме того, недостаточно представлены исследования по биокаталитической конверсии вторичного микробного сырья (грибной биомассы, кормовых дрожжей, остаточных дрожжей бродильных производств) как потенциальных субстратов для получения биологически активных добавок (БАД). Сложившаяся ситуация тормозит решение многих прикладных задач, связанных с реализацией в промышленности ресурсосберегающих биотехнологий глубокой переработки растительного и микробного сырья.

Цель и задачи исследований. Цель - разработка научных основ ресурсосберегающих биотехнологий глубокой переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов в биоэтанол, кормовые белково-аминокислотные добавки, БАД с заданными структурно-функциональными свойствами для повышения эффективности производства и решения экологических проблем. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследований: - провести системный анализ информационного представления объектов и процессов, необходимых для разработки новых подходов и методов при создании ресурсосберегающих биотехнологий глубокой переработки растительного и микробного сырья в целевые продукты;

- осуществить скрининг продуктивных штаммов микроорганизмов, биомасса которых

- субстрат для получения БАД и функциональных добавок, а синтезируемые ферменты - инструмент для осуществления биокаталитической деструкции полимеров микробного и растительного сырья, в т.ч. вторичных биоресурсов;

- теоретически и экспериментально обосновать подбор и состав ферментативных систем, обеспечивающих деструкцию субклеточных полимеров каждого вида субстратов: зернового сырья, мицелиальной биомассы и остаточных дрожжей бродильных производств;

- провести сравнительные исследования биосинтетической способности осмо-фильных рас спиртовых дрожжей и отобрать активный штамм, обеспечивающий высокую степень конверсии углеводов зернового сырья в биоэтанол;

- исследовать влияние субстратной специфичности ферментативных систем на биохимические показатели концентрированного зернового сусла, процессы генерации осмофильных рас дрожжей и спиртового брожения;

- разработать научные основы биокаталитической и микробной конверсии полимеров зернового сырья в ресурсосберегающей технологии биоэтанола, обеспечивающие интенсивный процесс сбраживания концентрированных сред осмофильными расами дрожжей с пониженным образованием побочных продуктов и направленным синтезом этанола;

- исследовать процессы биоконверсии растительного сырья и вторичных сырьевых ресурсов АПК в кормовую лизино-белковую добавку;

- разработать биотехнологические основы ресурсосберегающей переработки зернового сырья в биоэтанол и кормовую лизино-белковую добавку;

- исследовать закономерности биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой и мицелиальной биомассы для получения белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов, БАД;

- провести испытания и наработать экспериментальные образцы биокорректоров, БАД и исследовать взаимосвязь их биохимического и фракционного состава с функциональными свойствами;

- разработать научные основы направленной биотрансформации полимеров микробного сырья в белково-аминокислотные и биологически активные добавки с заданными структурно-функциональными свойствами;

- теоретически обосновать и экспериментально подтвердить возможность создания функциональных и специальных продуктов на основе биоконверсии микробного и растительного сырья.

Научная концепция заключается в комплексном решении проблемы экологии, питания и здоровья человека на основе системы направленных биокаталитических и биосинтетических процессов конверсии полимеров растительных и микробных субстратов (биоресурсов АПК) с использованием продуктивных штаммов микроорганизмов — источников биополноценных белков, ценных полисахаридов и биологически активных веществ, а также ферментативных систем с заданным спектром субстратной специфичности.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнялась в соответствии с Планом фундаментальных и приоритетных научных исследований Россельхозакадемии по научному обеспечению АПК на 2006-2010 и 2011-2015 гг.; с Федеральной целевой программой Минобрнауки по ГК № 02.512.11.2012 «Провести проблемно-ориентированные поисковые исследования с целью создания научно-технического задела в области биокатализа полимеров животного и микробного сырья на основе новых мультиэнзимных систем для создания биологически полноценных продуктов питания и напитков» (2007 г.); по грантам РФФИ: № 07-08-13581 «Провести целевые поисковые исследования фундаментального характера с целью создания научно-технического задела по технологии биотоплива на основе микробной конверсии возобновляемого растительного сырья» (2007-2008 г.); № 08-08-13637 «Провести исследования микробной конверсии сахарного сорго в лизин и этанол на основе новых мутантных штаммов микроорганизмов с целью создания научно-технического задела в ресурсосберегающей биотехнологии комплексной переработки сельскохозяйственного сырья» (2007-2008 г.) и № 09-08-13518 «Провести исследования по созданию натуральных биокорректоров пищи с заданными структурно-функциональными свойствами на основе направленного ферментативного катализа полимеров микробного и сельскохозяйственного сырья с целью получения конкурентоспособных социально значимых продуктов здорового питания» (2009-2010 г.г.); а также по гранту Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ (HLLI-7127.2012.4) в 2012-2013 г.г. «Биотехнологические основы направленной ферментативной конверсии полимеров микробной биомассы для создания ресурсосберегающих технологий биологически активных добавок, обогащенных продуктов и кормов».

Научная новизна работы. В соответствии с выдвинутой научной концепцией предложены новый подход и методы создания ресурсосберегающих биотехнологий глубокой переработки зернового сырья и вторичных сырьевых ресурсов в белково-аминокислотные кормовые добавки, БАД с функциональными свойствами.

- Селекционирован новый мутантный штамм микромицета Aspergillus oryzae - источник биополноценных белковых веществ, ценных полисахаридов и биологически активных веществ, с широким спектром синтезируемых ферментов протеолитического, амилолитического, ß-глюканазного, маннаназного, хитиназного и нуклеазного действия.

На основе установленных закономерностей метаболизма и новых экспериментальных данных по биосинтетической активности дрожжей осуществлен скрининг осмофильного штамма Saccharomyces cerevisiae 1039, обладающего направленной способностью к синтезу этанола с пониженнымобразованием сопутствующих метаболитов.

- Установлена зависимость степени гидролиза полимеров концентрированного зернового сусла, процессов роста и метаболизма дрожжей S. cerevisiael039 от субстратной специфичности ферментативных систем. Показано, что ферменты протеолитического и ß-глюканазного действия, катализирующие глубокий гидролиз растительных белков и полисахаридов, способствуют снижению синтеза побочных

метаболитов в 1,5-1,7 раза за счет снижения образования высших и ароматических спиртов.

- Научно обоснована ресурсосберегающая технология биокаталитической и микробной конверсии полимеров зернового сырья, обеспечивающая интенсивный процесс сбраживания углеводов концентрированных сред осмофильными расами дрожжей Saccharomyces cerevisiae с пониженным образованием побочных продуктов и направленным синтезом этанола.

- Исследованы закономерности комплексной биокаталитической и микробной конверсии зернового сусла и послеспиртовой барды в L-лизин с использованием селекционированного штамма Brevibacterium sp., синтезирующего наряду с основным продуктом биосинтеза и секреции - лизином другие аминокислоты и внутриклеточные белковые вещества. Получены новые экспериментальные данные и установлена корреляционная зависимость степени конверсии углеводов комплексных питательных сред в L-лизин от содержания в них зерна и барды.

На основе разработанной модели и установленных закономерностей биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой клетки выявлена регуляторная роль ферментов с различной субстратной специфичностью и разработан регулируемый процесс направленной конверсии субклеточных структур Saccharomyces cerevisiae с получением ферментолизатов с заданным структурно-фракционным составом и функциональными свойствами.

- Получены новые экспериментальные данные о биохимическом и спектральном составе белковых веществ биомассы грибов Aspergillus oryzae. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность получения биопрепаратов с заданными структурно-функциональными свойствами на основе ферментативного гидролиза полимеров мицелиальной биомассы.

- Научно обоснованы и подтверждены новые знания о взаимосвязи биохимического и спектрального состава полученных биопрепаратов с их функциональными свойствами, о перспективных направлениях конструирования функциональных и специальных продуктов и эффективных для животноводства кормов.

Новизна технических решений подтверждена 7 патентами РФ.

Практическая значимость. Научно обоснованы, экспериментально подтверждены и разработаны биотехнологические основы ресурсосберегающих технологий глубокой переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов АПК в биоэтанол, белково-аминокислотные корректоры пищи и кормов, БАД с функциональными свойствами.

Теоретически и экспериментально обоснованы состав ферментативных систем, условия и параметры биотехнологических процессов, обеспечивающих направленную конверсию субклеточных полимеров зернового сырья, мицелиальной биомассы и остаточных дрожжей бродильных производств в целевые продукты.

Установлено, что разработанный ферментативный комплекс (ферменты амилолитического, протеолитического и гемицеллюлазного действия) и условия глубокой конверсии полисахаридных и белковых полимеров зерна позволяют:

- увеличить концентрацию аминного азота и сбраживаемых углеводов в зерновом сусле в 1,5-2,0 раза;

- улучшить реологические свойства концентрированного зернового сусла, снизив его вязкость в 4 раза;

- повысить физиологическую и бродильную активность дрожжей Б. сегеУ151ае1039, ускорить процессы генерации и спиртового брожения при конверсии концентрированного зернового сусла на 30-40%;

- повысить концентрацию этанола в бражке на 25-40% и увеличить выход этанола на 2,5-3,5%;

- сократить объемы образования послеспиртовой барды на 40-50% и побочных продуктов - в 1, 5-1,7 раза.

Разработана комплексная ресурсосберегающая технология производства кормовой лизино-белковой добавки с использованием полупродуктов и отходов спиртового производства. Предлагаемая технология комплексной переработки зернового сырья обеспечит повышение качества кормопродуктов, обогащение зерновой барды ценным микробным белком, аминокислотами, в т.ч. лизином. Реализация данной технологии позволит утилизировать отходы спиртового производства, повысить продуктивность сельскохозяйственных животных и птицы на 12 - 15%, сократить расход кормов в результате введения в рацион высокоэффективных кормовых добавок, обогащенных лизином и белком.

Разработан регулируемый биотехнологический процесс получения белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов, биологически активных добавок на основе биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой и мицелиальной биомассы - отходов перерабатывающих отраслей АПК, позволяющий получать биодобавки целевого назначения с заданными структурно-функциональными свойствами.

Проведены испытания и наработаны опытные партии белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов, функциональных БАД на ЗАО «Биопрогресс» ВНИТИБП (Московская область, Щелковский район), Мичуринском экспериментальном заводе (Тамбовская обл.).

Для реализации биокаталитических технологий, контроля качества и норм расхода перерабатываемого сырья разработан новый универсальный метод определения протеолитической активности ферментных препаратов (ФП), включенный в Национальный стандарт РФ.

На технологии и целевые продукты разработаны, апробированы и утверждены комплекты нормативной документации; ТУ 9182-055-00334586-2007 «Гидролизат дрожжевой «Протамин», ТИ по производству гидролизата дрожжевого «Протамин»; Санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.99.913.Т.001564.07.07 от 18.07.2007 г., а также свидетельство о государственной регистрации № 77.99.26.9.У.5708.8.07 от 18.07.2007 г. на гидролизат дрожжевой «Протамин»; ТУ 9182-115-00334586-2013 «БАД Суперпротамин»; Опытно-промышленный регламент на производство кормовой лизино-белковой добавки; ГОСТ Р 53974-2010

«Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения протеолитической активности».

Основные положения, выносимые на защиту:

- новые подходы и методы для создания ресурсосберегающих биотехнологий глубокой переработки растительного и микробного сырья в биоэтанол, белково-аминокислотные кормовые и биологически активные добавки;

- продуктивные штаммы микроорганизмов Aspergillus oryzae, биомасса которых -субстрат для получения белково-аминокислотных добавок и функциональных БАД, а синтезируемые ферменты - инструмент для осуществления биокаталитической деструкции полимеров микробного и растительного сырья;

научно обоснованные требования к составу ферментативных систем, обеспечивающих направленную деструкцию биополимеров растительных и микробных субстратов;

результаты сравнительных исследований биосинтетической способности осмофильных рас спиртовых дрожжей и обоснование выбора наиболее перспективного штамма, обеспечивающего направленную конверсию углеводов зернового сырья в биоэтанол с пониженным образованием побочных метаболитов;

- биотехнологические основы глубокой переработки зернового сырья и ВСР в комплексной ресурсосберегающей технологии биоэтанола и кормового лизино-белкового препарата;

- научные основы направленной биотрансформации полимеров дрожжевой и мицелиальной биомассы в белково-аминокислотные и биологически активные добавки кормового и пищевого назначения с заданными структурно-функциональными свойствами.

Личный вклад автора заключается в формулировании нового направления и разработке основных положений диссертации, выносимых на защиту, постановке целей и задач исследований, решении поставленных задач, планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении результатов и использовании их в практике. Результаты диссертационной работы являются совокупностью многолетних научных исследований, проведенных в ФГБНУ ВНИИПБТ лично автором и при его непосредственном участии в качестве ответственного исполнителя.

Достоверность результатов исследований подтверждается соответствием теоретических данных с полученными результатами экспериментальных исследований и производственных испытаний. Экспериментальные данные, выводы и рекомендации основаны на общепринятых теоретических закономерностях, не противоречат и с достаточной степенью точности согласуются с известными концепциями, апробированы и подтверждены в промышленных условиях.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФГБНУ ВНИИПБТ (2002-2014 гг.). Основные положения и результаты исследований диссертационной работы доложены на 22-х международных и региональных конференциях и симпозиумах: Международной конференции «Биология - наука XXI века». Москва, 2012 г; 46-ой Международной научной конференции молодых ученых, докторантов, аспирантов «Эффективность

применения средств химизации в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур», Москва, 2012 г; Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Мурманск, 2012 г; Всероссийской научно-практической конференции «Научно-инновационные аспекты при создании продуктов здорового питания», Углич, 2012 г; Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2008-2013 г.г; Всероссийской научно-практической конференции «Пищевые ингредиенты и инновационные технологии в производстве продуктов питания» С.Петербург, 2013; Ш-УН Международный научно-практический симпозиум «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов», 2006, 2008, 2010, 2012, 2014 г.г.; УН Всероссийской конференции «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция», Петрозаводск, 2014г.

Публикации. По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано 80 печатных работ, из них 31 статья в журналах, рекомендуемых ВАК, 7 патентов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, состоящей из 6 глав, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации - 362 страницы, в том числе таблиц - 26, рисунков - 65 и 20 приложений. Список использованной информации содержит 386 наименований.

2 Основное содержание работы 2.1 Методология проведения исследований

Представлены объекты исследований, обоснованы методологический подход и методы исследований. Разработана структурно-методологическая схема исследований для достижения цели диссертационной работы (рис. 1). При проведении исследований использовали как общепринятые физико-химические, биохимические, микробиологические и спектрофотометрические методы анализа, так и современные инструментальные методы капиллярного электрофореза, спектральной люминесценции, ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), ВЭЖХ, тонкослойной хроматографии, электронной микроскопии.

Для проведения исследований биосинтетической способности штаммов микромицетов и уровня активности ФП разработан универсальный метод определения протеолитической активности в широком диапазоне рН, включенный в национальный стандарт.

Обработку результатов биотехнологических экспериментов (с числом повторов >3) проводили статистическим методом анализа и обработки данных, а для определения эффективных норм расхода биопрепаратов и технологических параметров процесса использовали метод математического планирования эксперимента Гаусса - Зайделя.

2.2 Результаты исследований и их обсуждение

Важной проблемой в свете реализации Государственной программы развития сельского хозяйства является обеспечение потребности в биополноценном кормовом и

Рисунок 1 - Структурно-методологическая схема исследований

пищевом белке. Согласно подсчетам ежегодный мировой дефицит белков составляет более 5 млн. т. Рациональное использование вторичных ресурсов пищевых производств в Российской Федерации позволяет получать порядка 500 тыс. т. сухих белоксодержащих кормовых добавок на основе микробного синтеза и глубокой переработки зернового сырья и ВСР АПК.

Одним из перспективных направлений исследований в этой области является глубокая переработка зернового сырья с использованием современных технологий и методов микробной и биокаталитической трансформации в белково-аминокислотные, углеводные и витаминные корректоры пищи и эффективные для животноводства корма

Кроме того, необходимо решать существующую проблему рационального использования вторичных сырьевых ресурсов (ВСР), образующихся на предприятиях АПК по переработке зерна. Это позволит снизить техногенное воздействие перерабатывающих производств на окружающую среду.

Основными вторичными сырьевыми источниками перерабатывающих отраслей являются: послеспиртовая зерновая барда, остаточные дрожжи S. cerevisiae бродильных производств и биомасса мицелиальных грибов, образующаяся после культивирования промышленных штаммов, синтезирующих гидролитические ферменты для конверсии полимеров зернового сырья.

2.2.1 Скрининг продуктивных штаммов микромицетов для биокаталитической деструкции полимеров микробного и растительного сырья

С целью создания конкурентоспособной биотехнологии производства и применения ферментных препаратов для глубокой переработки зернового сырья и ВСР необходимо получение активного штамма, обладающего по сравнению с промышленным штаммом Aspergillus oryzae - продуцентом комплекса протеаз и а-амилазы более высокой продуктивностью по отношению к ферментам, катализирующим гидролиз не только белковых веществ, но и некрахмальных полисахаридов, нуклеиновых кислот растительных и микробных субстратов. Существующая потребность в комплексных ферментных препаратах широкого спектра действия не реализуется отечественной промышленностью из-за отсутствия активных продуцентов.

Целью данного направления исследований явился отбор перспективных штаммов микромицетов Aspergillus oryzae, синтезирующих ферменты протеолитического, ß-глюканазного, хитиназного, маннаназного и нуклеазного действия для эффективного гидролиза растительных и микробных субстратов. В селекционных работах в качестве родительского штамма был использован штамм Aspergillus oryzae POM - 156 (ВКПМ F-981) один из наиболее активных продуцентов комплекса протеаз (протеиназ и пептидаз). Недостатком этого штамма являлся низкий уровень активности нуклеаз, хитиназ, ß-глюканаз и маннаназ в культуралыюй жидкости гриба.

Из большого массива данных отобрано 2 физиологически активных штамма гриба Aspergillus oryzae 12-84 и 41-294, отличающихся однородностью колоний и высокой скоростью роста (рис.2). В результате многоступенчатой селекции и мутагенеза получен новый штамм А. oryzae 12-84, в котором уровень активности

нуклеаз в 5,8-8.6 раз превышал уровень активности ферментов родительского штамма: хитиназы - в 3,0-5,0 раз. |3-глюканазы - в 1,7-4,5 раза, маннаназы - в 1.4-7,5 раз в зависимости от способа их культивирования (рис.3). Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ЯСАМ 01134).

а) Г-981 6)41-294 в) 12-84

Рисунок 2 -Гигантские колонии штаммов АярегзШто^ае

Отличительной особенностью мутантного штамма А. огугае 12-84 является способность к синтезу комплекса ферментов, обеспечивающих гидролиз высокомолекулярных полимеров не только растительного, но и микробного сырья.

б)

Рисунок 3 - Сравнительная характеристика продуцирующей способности грибов Aspergillus oryzae - продуцентов протеаз, нуклеаз. хитиназы. ß-глюканазы и маннаназы при твердофазном (а) и глубинном (б) культивировании

Применение ферментного препарата, полученного с использованием данного штамма, позволяет катализировать глубокий гидролиз зернового и микробного сырья, увеличить выход и качество целевых продуктов, улучшить экологическое состояние перерабатывающих производств. Наиболее характерное практическое применение комплексных препаратов протеолитического, ß-глюканазного, нуклеазного, хитиназного и маннаназного действия связано с повышением эффективности биотехнологических процессов переработки высокомолекулярных полимеров микробной биомассы, в том числе дрожжевой биомассы - отхода бродильных производств, мицелиальной биомассы - отхода ферментной и микробиологической промышленности. Наличие в комплексе пептидаз, протеиназ, нуклеаз, ß-глюканазы, хитиназы и маннаназы позволяет использовать ферментные препараты для глубокого гидролиза микробного сырья с целью получения биологически активных пищевых и кормовых добавок с различными структурно-функциональными свойствами.

2.2.2 Исследование биотехнологических процессов глубокой переработки зерна и ВСР в комплексной ресурсосберегающей технологии биоэтанола и кормовой лизино-белковой добавки

При организации в России промышленного производства биоэтанола на основе возобновляемого растительного сырья возникает основная острая проблема - это использование отходов производства, которые потенциально являются вторичными ресурсами для биотехнологических производств. При этом объем производства спирта возрастет не менее чем в 3 раза, что повлечет за собой пропорциональное увеличение количества образующихся отходов.

Одним из эффективных способов снижения образования отходов спиртового производства достигается технологическим путем, включающим:

- повышение концентрации зернового сусла;

- подбор ферментативной системы, катализирующей глубокий гидролиз полимеров зерна до веществ, ассимилируемых дрожжами;

- рациональное использование для сбраживания концентрированного сусла осмофильной расы дрожжей, обладающей способностью к направленному синтезу этанола и пониженному образованию побочных метаболитов.

2.2.2.1 Сравнительные исследования биосинтетической способности осмофильных рас спиртовых дрожжей и скрининг наиболее активного штамма 5асс1и1готусе*сегеуч$1ае для технологии биоэтанола

Существующее в России промышленное производство спирта-ректификата основано на сбраживании зернового сусла с концентрацией 16-22% растворимых сухих веществ (СВ). Повышение концентрации зернового сусла до 30-35% позволит сократить объем образования барды почти в 2 раза. Для эффективного сбраживания такого сусла в ресурсосберегающей технологии требуются дрожжи, обладающие осмофильными свойствами и обеспечивающие высокую степень конверсии углеводов в биоэтанол. Поэтому задачей данного этапа являлся отбор активного штамма 5'. сет>шае, способного к наиболее полному сбраживанию высококонцентрированного зернового сусла.

Промышленные расы дрожжей ¿'.сегеушае XII, 985-Т (У-3137) и 987-0 (У-3136) неустойчивы к повышенному осмосу и обладают способностью сбраживать зерновое сусло с концентрацией сухих веществ не более 24-26% СВ.

В результате многоступенчатой селекции и мутагенеза промышленного штамма дрожжей Б. сегеу1з1ае 987-0 выделены мутантные варианты, из которых более активными оказались №19 и 1039, тестируемые по способности сбраживать пшеничное сусло с концентрацией сухих веществ 30% (рис.4). При этом установлено, что наиболее высокая концентрация этанола в бражке была достигнута при использовании дрожжей расы 1039 и составила 14,8 % об., превысив показатели исходного штамма на 20 %.

Штамм дрожжей 5. сеге\ч.Ч1ае 1039 отличался от исходного штамма не только по культуральным, но и морфологическим признакам (рис.5).

Рисунок 4 - Сбраживание пшеничного сусла (30% СВ) отобранными расами дрожжей Б. сегеу181ае 19 и 1039

Исследования, проведенные с

использованием метода ЯМР по изучению проницаемости воды через цитоплаз-матические мембраны дрожжевых клеток, подтвердили различия физиолого-морфологических свойств родительского и селекционированного штамма. Установлено, что клетки 5. сегеушаерасы1039. имеющие меньший размер, обладали более высокой проницаемостью, характеризующей способность дрожжей Засскаготусез сеге\1$1ае 1039 сбраживать концентрированные зерновые среды.

Исх.

расы дрожжей

б)

Рисунок 5 - Гигантские колонии дрожжей 5.сеге\'тае расы 1039 (а) и 987-0 (б)

Дальнейшие исследования подтвердили, что мутантный штамм 1039 выдерживает высокое осмотическое давление зернового сусла (до 36% растворимых сухих веществ) и устойчив к повышенным концентрациям спирта (до 15-18% об.) (рис.6-8). Промышленные расы 5. сегеушде XII и 987-0 не проявляли высокой спиртоустойчивости в процессе брожения: при концентрации 12 % об. этанола в бражке количество мертвых клеток составило 45% для расы XII, в то время как при концентрации спирта 15 % об. у расы 987-0 было 30% мертвых клеток, а у расы 1039 при концентрации спирта 18 % об. - 22 % (рис.6).

Об. % спирта 19

Мертв, клетки.

расы дрожжей

] Спирт,об.% ■ % мертвых клеток

Рисунок 6 - Спиртоустойчивость осмофильных рас дрожжей

При сравнении динамики потребления углеводов отмечена высокая скорость сбраживания углеводов концентрированного пшеничного сусла (30% СВ) дрожжами 5. сегеушае расы 1039 (рис.7). Промышленные расы дрожжей уступали им по скорости

сбраживания сусла и по уровню накопления этанола.

15

12 ч 24 ч

36 ч 48 ч 60 ч 70 ч Время брожения, час

Рисунок 7 - Динамика потребления углеводов (РВ) дрожжами^. сеге\1$1ае р. 1039 по сравнению с промышленными расами спиртовых дрожжей

При исследовании степени воздействия высоких

концентраций зернового сусла

(30% и 36% СВ) на образование этанола исследуемыми расами дрожжей отмечено, что наиболее выраженными осмофильными свойствами обладала культура дрожжей 5. се^ето/де раса 1039: концентрация спирта в бражках составила 15.7-17,9 % об. соответственно, выход - 66.7 см3/100г условного крахмала (рис.8).

987-0

985-Т

Концентрация сусла 30%

Концентрация сусла 36%

1039 Расы Б. сегеувие

Рисунок 8 -Сравнительная характеристика этанол-синтезирующей способности Б.сеге^'тае р. 1039 по сравнению с промышленными расами при сбраживании зернового сусла

Кроме того, осмофильная раса 1039, как и исходная р.987-0, проявила

способность к направленному синтезу этанола с одновременным снижением уровня образования сопутствующих метаболитов в 1.4-1,7 раза, чем раса XII. (рис. 9).

Рисунок 9 - Синтез побочных метаболитов различными расами спиртовых дрожжей при

сбраживании концентрированного зернового сусла

Таким образом, отобрана перспективная раса дрожжей Басскаготусея сегеУ131ае 103 9. обладающая осмофильностью. спиртоустойчивостью, для

сбраживания концентрированного зернового сусла.

2.2.2.2 Влияние ферментативных систем на биохимический состав зернового сусла и культуральные свойства осмофильной расы спиртовых дрожжей .Часс/шготусеь сегеутае 1039

Глубокая переработка зернового сырья основана на эффективной биокаталитической конверсии высокомолекулярных полимеров зерна в доступные

для дрожжей мономеры. Особенно это важно при приготовлении концентрированного зернового сусла.

Как показали результаты последних исследований, эффективность технологических процессов генерации дрожжей и спиртового брожения зависит от качества перерабатываемого зернового сусла, его реологических свойств, азотистого и углеводного состава, которые определяются не только степенью конверсии крахмала, нотакже и степенью гидролизанекрахмальных полисахаридов и белковых веществ зерна (Абрамова И.М., Кадиева А.Т., Оверченко М.Б., Поляков В.А.. Римарева Л.В.). Роль ферментов возрастает при подготовке зернового сусла с высоким содержанием сухих веществ. Поэтому в работе исследовали влияние ферментов с различной субстратной специфичностью на степень конверсии полимеров зерна, на жизнедеятельность осмофильной расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1039 и полноту сбраживания концентрированного зернового сусла.

Результаты исследования биохимического состава сусла показали, что использование подобранного комплекса ферментов обеспечивало повышение концентрации растворимых сухих веществ (PCB) до 33,0%, редуцирующих веществ -до 23,2 г/100 см3, аминного азота — до 53.0 мг% и снижение вязкости сусла с 360 до 80 мПа-с (рис.10).

60 40 20 0

Iii!

■ РСВ,%

■ РВ.г/ЮОмл NH2

вязкость, хЮ.мПа с

АС+ГлС+ПС АС+ГлС+КС АС+ГлС+ПС+КС

Рисунок 10 - Биохимические показатели зернового сусла, обработанного ферментативными системами амилолитического (АС+ГлС). протеолитического (ПС) и гемицеллюлазного (КС) действия

Использование различающихся по субстратной специфичности ферментативных комплексов для обработки зернового сусла по-разному сказывалось и на физиологическом состоянии дрожжевой популяции. Осмос угнетающе действовал на клетки, выращенные на сусле, обработанном только ферментами амилолитического действия (АС + ГлС). Добавление к амилолитическим ферментам гемицеллюлаз (КС) приводило к снижению вязкости сусла, что способствовало некоторому улучшению процесса развития дрожжей. Введение комплекса протеаз, содержащего пептидазы (ПС), оказывало самое благоприятное влияние на дрожжевую клетку, т.к. известно, что их применение способствует обогащению сусла легкоусвояемыми аминокислотами, ассимилируемыми дрожжами.

Исследования динамики потребления углеводов и накопления спирта дрожжами 5. сегел>1$1ае 1039 показали, что наилучшие результаты достигнуты при сбраживании концентрированных зерновых сред, обработанных ферментативным комплексом, состоящим из ферментов амилолитического, протеолитического и гемицеллюлазного действия (рис. 11). При этом на 66 часов брожения концентрация остаточных

17

углеводов составила 1.10 г/100 см3, спирта - 16.2 % об. при концентрации исходного сусла 32.0 % СВ (рис. 11 г).

Таким образом, установлено, что ферментативный комплекс, содержащий ферменты широкого спектра действия, способствует получению сусла с биохимическими показателями, позволяющими улучшить культуральные свойства дрожжей, повысить их физиологическую и бродильную активность, ускорить процессы генерации и спиртового брожения при конверсии зернового сусла с высокой концентрацией сухих веществ. Использование ферментов амилолитического, гемицеллюлазного и протеолитического действия в комплексе с осмофильными дрожжами при подготовке и сбраживании концентрированного сусла позволяет сократить потери зернового сырья, снизить объем образования барды при одновременном увеличении выхода целевого продукта - биоэтанола.

Длительность брожения, ч (а) Длительность брожения, ч (б)

Рисунок 11 - Динамика потребления углеводов и синтеза этанола при сбраживании сусла, обработанного ферментами с различной субстратной специфичностью Состав ферментов: а) а-амилаза и глюкоамилаза (АС+ГлС); б) амилазы и протеазы (АС+ГлС+ПС); в) амилазы и гемицеллюлазы (АС+ГлС+КС); г) амилазы, протеазы и гемицеллюлазы (АС+ГлС+ПС+КС)

2.2.2.3 Влияние субстратной специфичности ферментативных систем на метаболизм осмофильных рас дрожжей 5. сегеч'тае 1039

В результате исследований процессов метаболизма осмофильных дрожжей 5. сетеушяе 1039 при сбраживании концентрированного зернового сусла, обработанного

различными ферментативными системами, установлено, что состав ферментов и их субстратная специфичность оказывает влияние на синтез побочных метаболитов. Показано, что наиболее высокий уровень синтеза высших и ароматических спиртов имел место на протяжении всего периода брожения в вариантах, где на стадии осахаривания использовали только амилолитические ферменты, а также при добавлении к ним источника ксиланазы и р-глюканаз (КС). При введении в состав комплекса протеолитических ферментов синтез высших и ароматических спиртов снижался (рис. 12).

О Ферментативные комплексы

п Высшие спирты я Альдегиды

а Сложные эфиры 1=1 Органические кислоты ■ Ароматическиеспирты

Рисунок 12- Состав метаболитов при сбраживании пшеничного сусла, обработанного различными ферментативными комплексами

Результаты исследования динамики синтеза метаболитов дрожжами 5. сегеушае 1039 показали, что наибольшее образование метаболитов наблюдалось при сбраживании пшеничного сусла, обработанного только амилолитическими ферментами. Добавление источника ксиланазы приводило к некоторому снижению синтеза побочных метаболитов, особенно на вторые сутки.

Регулирующую роль в метаболизме дрожжей играло азотистое питание. Введение источника грибных протеаз или полного комплекса ферментов, обеспечивающих накопление в сусле легко ассимилируемых аминокислот, снижало синтез сопутствующих веществ к концу брожения в 1.5-1.7 раза, в основном, за счет высших и ароматических спиртов. При этом происходил направленный синтез этанола дрожжами 5. Сегеушае 1039 с наименьшим образованием побочных метаболитов.

Таким образом, подтверждено, что основная роль в метаболизме осмофильных дрожжей принадлежит протеолитическим ферментам, в состав которых входят пептидазы, осуществляющие расщепление белковых веществ зерна до свободных аминокислот. Использование при обработке зернового сырья подобранной ферментативной системы, состоящей из ферментов амилолитического, протеолитического и гемицеллюлазного действия, позволяет увеличить степень ферментативной конверсии высокомолекулярных полимеров концентрированного зернового сусла и получать сусло, которое по своему биохимическому составу

обеспечивает снижение образования летучих веществ, сопутствующих синтезу этанола, и увеличение выхода спирта.

2.2.2.4 Исследование процессов биоконверсии зернового сырья и вторичных сырьевых ресурсов АПК в кормовую лизино-белковуюдобавку

Применение лизина в животноводстве увеличивает коэффициент использования белка кормов, позволяет сократить их расход, способствует повышению продуктивности животных. Определяющее значение для организации производства кормов, обогащенных лизином, имеют вопросы сырья. Ранее основным сырьем для культивирования лизинсинтезирующих бактерий являлась меласса, объем которой в России не достаточен.

Задачей настоящих исследований являлась разработка комплексной ресурсосберегающей технологии переработки зернового сырья на биоэтанол и кормовые продукты, обогащенные лизином, за счет использования полупродуктов и отходов спиртового производства - отъема зернового сусла из спиртового производства и послеспиртовой барды. В качестве продуцента лизина использовали селекционированный штамм Brevibacterium sp. 27-8, активно развивающийся на исследуемых зерновых субстратах. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM 01129).

В зерне содержится порядка 10-25% белка, гидролиз которого обеспечивает накопление в питательной среде свободных аминокислот. Проведение протеолиза белков концентрированного зернового сусла (30% СВ) комплексом пептидаз и протеиназ. продуцентом которого является Aspergillus oryzae 12-84, способствовало не только повышению уровня накопления в питательной среде свободных аминокислот, но и усвояемых углеводов, что позволило интенсифицировать рост и биосинтетическую способность Brevibacterium sp.27-8 - продуцента лизина и увеличить уровень синтеза целевого продукта в 1.5 -1,6 раза (рис. 13).

■ Биомасса, D

2,5---

2 __■ Лизин, %

J J J J

Сусло (24% СВ) Сусло (30% СВ) Сусло (24% Сусло (30% СВ)+ СВ)+протеолиз протеолиз

Рисунок 13 - Рост бактерий Brevibacteriumsp. 27-8 и накопление лизина при культивировании на концентрированном сусле

Максимальный выход лизина на средах, конструируемых на основе зернового сырья, достигнут при использовании комплекса гидролитических ферментов амилолитического. протеолитического и гемицеллюлазного действия при

20

ферментации на сусле (24% СВ). Повышение концентрации зернового сусла приводило к угнетению развития бактерий и снижению уровня образования лизина из-за высокой вязкости питательной среды. Вязкая консистенция концентрированного зернового сусла затрудняла доступ кислорода к клеткам бактерий. Для улучшения реологических свойств питательной среды исследовали возможность снижения в ней концентрации сухих веществ путем введения спиртовой барды, в качестве источника аминокислот и пептидов. Как известно, что барде содержится от 6 до 9% сухих веществ. 2,5-4,0% растворимых углеводов. 1.2-2,5% азотистых веществ.

2.2.2.5 Разработка биотехнологических основ комплексной ресурсосберегающей технологии переработки зернового сырья и ВСР в биоэтанол и кормовую лизино-белковую добавку

Целью данного этапа исследований явилась разработка научно-технического задела комплексной ресурсосберегающей технологии переработки зернового сырья на биоэтанол и кормовые продукты, обогащенные лизином на основе полупродуктов и отходов спиртового производства.

Разработанная инновационная технология биоэтанола предусматривает переработку концентрированного зернового сусла, что затрудняет массообменные и аэродинамические процессы культивирования продуцента лизина. Разбавление зернового сусла (30% СВ) бардой способствовало повышению эффективности конверсии углеводов питательной среды в лизин. Максимальный синтез лизина (36.8 г/дм3) достигнут при разбавлении сусла бардой в соотношении 1:2 (рис.14). Однако выход лизина с единицы сырья был несколько выше при соотношении сусла и барды 1:3.

Длительность культивирования,ч

Рисунок 14-Динамика синтеза лизина на зерновом сусле (30% СВ) с бардой

Исследовали возможность использования жидкой части барды для приготовления питательных сред с большей степенью разбавления зернового сусла. Концентрированное зерновое сусло - отъем спиртового производства, разводили жидкой частью барды в следующих соотношениях - от 1:2 до 1:15. В результате культивирования ВгеуЛаМепит sp.ll-8 на полученных питательных средах установлено, что максимальная концентрация лизина достигнута при соотношении сусла и барды 1:2. При дальнейшем увеличении степени разведения сусла синтез лизина снижался. При этом максимальный выход лизина с единицы сырья имел место при соотношении сусла и барды 1:5 и 1:10 соответственно (рис.15). Содержание

протеина в культуральной жидкости Вге\1Ьа&епит $р. 27-8 находилось на уровне от 38.4 до 46.1 % в зависимости от степени разведения сусла в питательной среде.

50 40 30 20

11. 11 1.1

I Г|1| ■ ■ ■ ■"

Сусло 1:02 1:03 1:05 1:10 1:15 Соотношение сусла (30% СВ) и послеспиртовой барды

| Содержание белка,%

|Содержание лизина, г/л

Выходлизина, кг/100кг зерна

Рисунок 15- Влияние послеспиртовой барды в составе питательных сред на содержание лизина и белка в кормовой добавке

С целью создания сбалансированных кормов обогащали дисперсную часть барды лизином, добавляя кормовую лизино-белковую добавку (ЛБД). содержащую аминокислоты и белок, в количестве 15-30-% по объему (табл. 1). В результате обогащения лизино-белковым продуктом микробного синтеза, содержание лизина в барде возросло в 37 раз, сырого протеина - 1.5 раза.

Таким образом, утилизация зерновой барды путем использования ее в составе питательных сред для культивирования продуцентов лизина и белка, способствует увеличению выхода целевого продукта с единицы зернового сырья за счет присутствия в барде ассимилируемых углеводных и азотистых соединений -остаточных продуктов зерновой среды и автолиза биомассы спиртовых дрожжей.

Таблица 1 - Характеристика кормовых продуктов, полученных с использованием зерновой барды, обогащенной аминокислотами и белком

Кормовой продукт Основные компоненты. %СВ

лизин протеин

Дисперсная часть барды 0.18 16.0

Лизино-белковая добавка (ЛБД) 22.5 46.5

Барда, обогащенная лизино-белковой добавкой( 15% ЛБД) 4.9 22.2

Барда, обогащенная лизино-белковой добавкой (30% ЛБД ) 9.0 28,0

Разработана технологическая схема и опытно-промышленный регламент производства кормовой лизино-белковой добавки по комплексной технологии с использованием полупродуктов и отходов спиртового производства (рис. 16).

Предлагаемая технология комплексной переработки зернового сырья обеспечит повышение качества кормопродуктов. обогащение барды ценным микробным белком, аминокислотами, в т.ч. незаменимой аминокислотой - лизином. Ввиду идентичности исходного сырья и части технологической схемы производства спирта, а также для обеспечения максимального использования сырья и промежуточных продуктов

переработки предлагается в технологическую схему производства биоэтанола ввести линию по получению кормового лизина.

Рисунок 16 -Принципиальная схема комплексной переработки зерна на биоэтанол,

кормовую лизино-белковую добавку и кормопродукты, обогащенные лизином

Реализация данной технологии позволит не только утилизировать отходы производства топливного спирта, но и повысить продуктивность сельскохозяйственных животных и птицы, сократить расход кормов в результате введения в рацион высокоэффективных кормовых добавок, обогащенных лизином и белком.

2.2.3 Исследование процессов направленной конверсии полимеров дрожжевой и мицелиальной биомассы в белково-аминокислотные и биологически активные добавки

На перерабатывающих предприятиях АПК образуется существенное количество вторичных биоресурсов микробного происхождения - остаточная биомасса дрожжей и мицелиальных грибов. Микробная биомасса не подлежит длительному хранению и является источником загрязнения окружающей среды канцерогенами, иммунносупрессорами и особенно аллергенами. В то же время данные о том, что в биомассе грибов и дрожжей содержатся значительное количество белковых веществ, нуклеиновых кислот, хитина, ценных полисахаридов, делают отходы производства привлекательным сырьем для получения биологически ценных препаратов. Используя натуральные биокорректоры в кормах и продуктах, можно регулировать практически все жизненные процессы, происходящие в клетках, тканях и органах через модуляцию ферментов, рецепторов, процессов всасывания и выделения, микробиологических процессов и т.д. Такая тенденция развития профилактической ветеринарии и медицины за счет функционального питания создает реальные предпосылки улучшения физического состояния животных, повышения их продуктивности и устойчивости к различным видам заболеваний, способствует здоровью и увеличению продолжительности жизни населения.

2.2.3.1 Биотехнологические аспекты использования биомассы гриба Aspergillus oryzae в качестве перспективного источника биологически активных веществ

В настоящее время определенный интерес представляют работы по использованию мицелиальных грибов как субстратов для получения БАД. В биомассе микромицетов содержатся значительные количества белковых веществ и полисахаридов, в т.ч. хитина. Так в грибах рода Aspergillus содержание хитина в клеточных стенках (КлС) варьирует от 5 до 25 %, что существенно превышает количество хитина в дрожжевой биомассе и, по-видимому, будет влиять на биологические функции препаратов, получаемых на основе ферментативной деструкции грибной биомассы.

Известно, что порядка 30% биотехнологической продукции приходится на долю промышленной микробиологии. Большинство биосинтетических технологий основаны на способах культивирования мицелиальных грибов. В связи с имеющейся в последнее время тенденцией увеличения объема и расширения ассортимента биотехнологических продуктов, особое значение приобретают вопросы утилизации отходов этих производств и в первую очередь грибного мицелия.

Положительным фактором является возможность создания безотходных технологий на основе многоцелевого использования микроорганизмов: культуральной жидкости (КЖ) - для получения промышленно значимых метаболитов (ферментов, витаминов и пр.) и биомассы - структурных элементов клетки, содержащих белковые вещества, нуклеиновые кислоты, полисахариды клеточных стенок - для получения кормовых и биологически активных добавок.

Исследовали возможность использования биомассы гриба Aspergillus oryzae 1284 - отхода производства протеаз, как перспективного источника биологически активных веществ (БАВ). Известно, что в процессе роста микромицета идет активное накопление экзоферментов, что связано со способностью гриба секретировать ферменты в культуральную жидкость. Соотношение внеклеточных и клеточно-связанных ферментов во время культивирования продуцента изменяется. Максимальное накопление экзоферментов наблюдается на 2-3 сутки, при этом в биомассе гриба остается порядка 10-20% от общего количества. В этот же период отмечено содержание общих белковых веществ (15,4-16,8%), полисахаридов - 31,3% (рис.17). Полученные данные позволяют рассматривать биомассу гриба не как отход производства ферментных препаратов (ФП), а как перспективный источник полноценного белка, полисахаридов и биологически активных веществ.

Структурный и биохимический состав биомассы в процессе роста микромицета изменялся, т.к. содержащиеся в биомассе высокомолекулярные полимеры подвергаются каталитическому воздействию внутриклеточных ферментов. В связи с этим проведен комплексный масс-спектральный анализ A. oryzae 12-84 в процессе роста гриба. Для повышения выхода экстрактивных веществ биомассу обрабатывали ферментами гемицеллюлазного действия, катализирующими гидролиз ß-глюкана - структурного полимера клеточных стенок.

На спектре, полученном при анализе фильтрата КЖ видны низкомолекулярные вещества белковой природы (рис.18, А). По-видимому, в связи

высокой активностью ферментов, секретированных в КЖ. происходит ферментативная деструкция полимеров питательной среды.

fWKwfevYt Чъ- '¿ft.

j лЯщщ

vWtixl

КЩяМ ж-

'щш ^^

| --^ёаЛ

3

ю о ь о

24 48 72

Время культивирования,ч

2012 04 25 1524 A D84 «I Ok tOOum

а) б)

Рисунок 17 -Биомасса гриба Aspergillus oryzae 12-84 (а) и биохимический состав

отхода производства ферментных препаратов (б) (протеазы, глюканазы, маннаназы. Общий белок, %) По поглощению в УФ области можно судить о наличии ароматических аминокислот. На спектре образца, приготовленного из обработанной ß-глюканазой биомассы, видно наличие большого количества аминокислот и низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 172 - 225 Да (рис.18. Б). В процессе роста гриба наблюдалось появление большего количества низкомолекулярных соединений с ММ -100-150 Да.

А) Б)

Рисунок 18 - Спектральный анализ фильтрата культуральной жидкости (А) и биомассы (Б) триба. Aspergillus oryzae

На следующем этапе исследовали влияние ферментативного гидролиза полимеров грибного мицелия на изменение структурно-функциональных свойств ферментолизатов биомассы. Полученную после отделения культуральной жидкости биомассу гриба A. oryzae 12-84 в первом случае подвергали каталитической деструкции под действием собственной ферментативной системы микромицета и экзогенных ферментов глюкано-, маннано- и хитинолитического действия (препарат ФКЖ). Приготовление второго образца (препарат БИО) осуществляли после тепловой

инактивации собственных ферментов гриба (85°С в течение 15 мин.) для использования биомассы только в качестве субстрата чтобы устранить зависимость результатов ее ферментативного гидролиза от уровня активности синтезированных ферментов. Направленный процесс деструкции полимеров биомассы осуществляли экзогенными ферментными комплексами - источниками пептидаз, (3-глюканаз. маннаназ и хитиназ.

Полученные результаты (рис.19) позволили подтвердить эффективность ферментативной конверсии полимеров биомассы микромицета по накоплению продуктов гидролиза полисахаридов клеточных стенок и белковых веществ в фугате ферментолизатов.

Данные спектрального анализа препаратов ФКЖ и БИО подтвердили несущественные различия в структуре спектров исследуемых препаратов. Ферментолизаты биомассы гриба А. огугае содержали преимущественно низкомолекулярные ди- и три-пептиды (от 110 до 500 Да) и небольшое количество пептидов с ММ 700-950Да, а также ароматических аминокислот, что подтвердилось в результате анализа спектров поглощения и люминесценции препаратов БИО и ФКЖ.

Таким образом, результаты биохимических и спектральных анализов показали наличие в ферментолизатах биомассы гриба А. огугае высокого содержания белковых веществ, представленных, в основном, аминокислотами и низкомолекулярными пептидами, а также веществ углеводной природы.

а) б)

Рисунок 19 -Характеристика ферментолизатов грибной биомассы: а) биохимический состав; б) спектральный состав белков

Медико-биологические исследования показали перспективность использования ферментолизатов мицелиальной биомассы как функциональных добавок для активации молекулярных шаперонов при диабете 1 типа (инсулинзависимом). Выявленный эффект указывает на возможность создания на основе грибной биомассы эффективных функциональных продуктов и кормов.

2.2.3.2 Исследование процесса направленной биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой биомассы для получения белково-аминокислотных и биологически активных добавок

Современные направления развития биотехнологии ориентированы на использование микробной биомассы в производстве эффективных белково-

аминокислотных кормовых добавок. К перспективным источникам белковых веществ, аминокислотный скор которых приближается к животному белку, а также витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов, можно отнести биомассу дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Однако питательная ценность дрожжевой биомассы ограничена низкой доступностью внутриклеточных биополимеров для действия пищеварительных ферментов. Поэтому ключевым моментом в технологиях натуральных биокорректоров пищи и кормов, а также БАД является подготовка микробной биомассы к ферментативной конверсии внутриклеточных полимеров, т.е. процесс дезинтеграции клетки для нарушения ее анатомической целостности.

Для обеспечения направленной ферментативной конверсии субклеточных структур подобраны оптимальные параметры баротермического воздействия на дрожжевую биомассу (температура в реакторе 50°С, давление - 5 мПа, длительность обработки — 30 мин). В результате достигалось повышение проницаемости клеточной стенки дрожжей, что положительно сказывалось на выходе из клетки растворимых белковых веществ протоплазмы.

Проведены сравнительные исследования процесса деструкции субклеточных полимеров дрожжевой биомассы под действием комплекса экзогенных ферментов ß-глюканазного, маннанолитического и протеолитического действия (КФПА), синтезируемых грибом Aspergillus oryzae 12-84. а также ФП- источников ß-глюканаз (ГкС), бактериальных протеиназ (БПС). Для подготовки биомассы применяли наряду с баротермическим воздействием методы термолиза и автолиза (рис. 20).

Длительность ферментолиза, ч Длительность ферментолиза, ч

1-реактор+автолиз; 2-реактор+ГкС+ПС; 3-реактор+КФПА: 4-реактор+ГкС+ПС+ КФПА: 5-тоже. как 4+термолиз: 6-термолиз+ГкС+ПС+КФПА: 7-реактор+ ГПС

Рисунок 20 - Динамика накопления аминного азота (а) и растворимых углеводов (б) в процессе ферментативной деструкции дрожжевой биомассы

Результаты ферментативной деструкции полимеров клетки показали, что максимальный выход белковых веществ из клетки и наиболее высокая степень их протеолиза наблюдалась в варианте, в котором дрожжевая биомасса была подвергнута

27

только баротермическому воздействию и обработана полным комплексом ферментов (рис.20 а, кривая 4). Проведение дополнительного термолиза практически не сказалось на результатах ферментолиза белков протоплазмы дрожжей до легкоусвояемых азотистых компонентов. Процесс автолитической деструкции дрожжевой биомассы под действием собственной ферментативной системы был не эффективен в связи с инактивацией ферментов клетки в процессе баротермической обработки (рис 20 а и б, кривые 1).

Таким образом, эффективная деструкция дрожжевой биомассы обусловлена совместным термомеханическим и биокаталитическим воздействием на клетку. Разработанные условия предобработки дрожжевой биомассы и рационально подобранная мультиэнзимная система позволяет проводить направленный гидролиз высокомолекулярных полимеров микробной биомассы для получения биологически активных добавок с заданным составом. Баротермическая обработка способствует повышению проницаемости клеточной стенки, обеспечивая доступность внутриклеточных полимеров к воздействию ферментов, а использование ферментативных систем (ФС) с заданной субстратной специфичностью обеспечивало проведение регулируемого процесса направленной конверсии субклеточных структур.

Известно, что протеазы существенно различаются по механизму и специфичности каталитического действия. Поэтому, задачей следующего этапа исследований явилось установление зависимости степени гидролиза дрожжевого белка от специфичности протеолитических ферментов.

Для деструкции полисахаридов клеточных стенок (КС) дрожжей в качестве источника ферментов ß-глюканазного действия использовали ФП Ксибитен-цел (300 ед.р-ГкС/г), синтезируемый грибом Trichoderma longibrachiatum. Протеолитический комплекс ФС-1 включал ферменты бактериального происхождения (продуцент Bacillus subtilis), которые, в основном, представляют собой сериновые и металлозависимые протеиназы, катализирующие гидролиз белков до пептидов с различной молекулярной массой. В ФС-2 присутствовал протеолитический комплекс грибного происхождения (продуцент Aspergillus oryzae 12-84), состоящий из карбоксильной и сериновой протеиназ, карбокси- и аминопептидаз.

Исследован процесс направленной биокаталитической деструкции белковых веществ дрожжевой биомассы с использованием подобранных ферментативных систем (ФС-1 и ФС-2).Протеолитические ферменты дозировали из расчета от 2 ед. ПС до 20 ед. ПС/г дрожжей; длительность протеолиза составила 4 ч (рис. 21).Установлено, что изменяя концентрацию протеолитических ферментов в составе ФС возможно регулировать степень гидролиза дрожжевых белков.

Кроме того, показано, что длительность процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы также сказывалась на глубине деструкции белковых полимеров. Ферментолизаты дрожжевой биомассы, полученные после воздействия ФС-1 и ФС-2 в течение 4-х ч, различались по содержанию аминного азота (NPh+) и редуцирующих веществ (РВ), концентрация которых в образце В была в 2,7 и 1,6 раза выше, соответственно. При этом дозировки ФС были одинаковы в обоих вариантах (10 ед. ПС/г дрожжей) и различались только по составу протеолитических ферментов.

2 5 10 15 20

Дозировка протеаз, ед.ПС/г дрожжей

Рисунок 21 - Зависимость степени гидролиза белков дрожжей от расхода протеаз бактериального (ФС-1) и грибного происхождения (ФС-2)

При увеличении длительности ферментативного гидролиза разница в степени деструкции белковых веществ возрастала еще более существенно, и в образце О концентрация аминного азота превысила показатели ферментолизата С почти в 4,5 раза (табл.2).

Таблица 2 - Биохимическая характеристика ферментолизатов дрожжей

Ферментолизаты дрожжевой биомассы, после воздействия ферментативных систем Длительность, процесса, ч Характеристика ферментолизатов

РВ, % ТМН2+, мг%

А - гидролиз ФС-1 4 2.3 45

В - гидролиз ФС-2 3.0 260

С - гидролиз ФС-1 12 2.9 175

Э- гидролиз ФС-2 3.9 780

Полученные результаты свидетельствуют о более глубокой степени деструкции полисахаридов КС и белковых полимеров дрожжей под воздействием ФС-2, содержащей пептидазы. Известно, что пептидазы катализируют гидролиз белка до аминокислот, последовательно расщепляя пептидные связи, ближайшие к концевым амино- и карбокси-группам молекулы белка, а протеиназы действуют на центральные участки полипептидной цепи и расщепляют молекулы белка на пептиды с различной молекулярной массой. Протеиназы и пептидазы ФС-2, расщепляя белок, действуют согласованно: первые образуют большое число свободных концов, а вторые воздействуют на образовавшиеся фрагменты.

Исследования аминокислотного состава белковых веществ и результаты проведенного масс-спектрометрического анализа полученных препаратов подтвердили различия действия ФС, отличающихся составом протеолитических ферментов (табл.3). Биокаталитическое воздействие ФС-1 в течение 12 часов привело к частичному протеолизу белковых веществ дрожжевой биомассы с выделением 18 % аминокислот от общего количества в свободное состояние. Использование ФС-2 за тот же период

позволило повысить степень гидролиза дрожжевого белка и увеличить количество свободных аминокислот в 3.5 раза.

Таблица 3 - Содержание низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот в _ферментолизатах дрожжевой биомассы_

Содержание продуктов гидролиза, % от общего

количества

Продукты гидролиза ФС-1 ФС-2

Время гидролиза

4ч 12ч 4ч 12 ч

Пептиды, ММ до 500 Да 21 38 65 100

Свободные аминокислоты 8,5 18 23 64

Результаты исследований спектрального состава белковых веществ ферментолизатов подтвердили наличие в них низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот. На спектре препарата С, подверженного более щадящему гидролизу с применением ФС-1, видно, что образец содержит преимущественно пептиды с молекулярной массой от 500 до 1000 Да (33%) и 29% высокомолекулярных пептидов ММ более ЮООДа (рис.22 а, рис.23).

а) б)

Рисунок 22 - Спектральный анализ препарата С - ФС-1 (а ) и препарата D - ФС-2 (б ) после 12-ти часового гидролиза

Ферментолизат D, полученный при воздействии ФС-2, преимущественно содержал низкомолекулярные пептиды с ММ 124. 160. 180. 198, 212 и 230 Да (рис. 22 б). В целом, в образце D содержание свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов (ММ<300 Да) составило 89% от общей массы веществ белковой природы, пептидов с ММ 300-500 Да - 11% (рис.23). По-видимому, к ним относятся и антиоксидантные пептиды с содержанием не более 4-10 остатков аминокислот, а также незаменимые и нейромедиаторные аминокислоты, необходимые для нормального функционирования организма человека и обусловливающие функциональные свойства в целевых продуктах.

а) б)

Рисунок 23 - Фракционный состав ферментолизатов дрожжевой биомассы после биокаталитического воздействия ФС-1 (а) и ФС-2 (б) в течение 12-ти ч. гидролиза 1 - Молекулярная масса (ММ) более 1000Да: 2 - ММ от 500 до 1000 Да; 3 - ММ от 300 до 500Да; 4- ММ менее 300 Да

В результате исследований установлено, что фсрментолизаты дрожжевой биомассы, полученные на основе биокаталитической деструкции субклеточных структур различными по специфичности действия протеазами, различались по биохимическому и спектральному составу (рис.24). Препарат D с глубокой степенью гидролиза биополимеров клетки содержал в 3.5 раза больше свободных аминокислот и в 6.8 раза - низкомолекулярных пептидов с ММ<300 Да. Фракционный состав белковых веществ 4-х часовых ферментолизатов дрожжей отличался более высоким содержанием пептидов с ММ от 300 Да.

Таким образом, полученные данные подтверждают эффективное воздействие пептидаз, входящих в ФС-2 и катализирующих глубокий гидролиз белковых веществ. Результаты спектрального анализа подтверждают возможность проведения регулируемого процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы с получением ферментолизатов заданного состава. Для обеспечения необходимой степени и глубины гидролиза белковых полимеров дрожжевых клеток достаточно варьировать длительностью процесса и составом протеолитических ферментов с различной специфичностью действия.

2.2.3.3 Разработка научных основ направленной биотрансформации полимеров дрожжевой биомассы в белково-аминокислотные и биологически активные добавки На основе полученных экспериментальных данных о влиянии условий биокаталитических процессов и субстратной специфичности ферментативных систем на степень деструкции субклеточных полимеров и функциональные свойства ферментолизатов дрожжевой биомассы разработаны научные основы направленной ферментативной конверсии микробной биомассы с получением биопрепаратов с заданными функциональными свойствами.

С использованием подобранной ферментативной системы ФС-2 (300 ед. р-ГкС, 10 ед. ПС/г дрожжей) проведена направленная биокаталитическая деструкция субклеточных структур Saccharomyces cerevisiae и наработаны экспериментальные образцы ферментолизатов с различной степенью конверсии клеточных стенок (КС) и

внутриклеточных полимеров дрожжевой биомассы. После 4-х и 12-ти часов биокаталитического гидролиза дрожжевой биомассы осуществляли разделение ферментолизатов на фракции путем центрифугирования. Получены как твердые фракции - фрагменты клеточных стенок дрожжей (табл.4А, В), так и жидкие фракции-фугаты ферментолизатов дрожжевой биомассы (табл.4Б, Г).

Таблица 4- Характеристика ферментолизатов дрожжевой биомассы

Фракции ферментолизатов дрожжевой биомассы Характеристика фракций

РВ, мг/см3 N112% мг%

4-х ч. ферментолизат А - клеточные стенки Б - фугат ферментолизата 2,3 105

3,0 220

12-ти ч. ферментолизат В - клеточные стенки, Г- фугат ферментолизата 3,2 210

3,9 680

Препараты А и В различались по степени гидролиза полисахаридов и белковых компонентов клеточных стенок. Содержание низкомолекулярных углеводов (РВ) и аминного азота в препарате В превышало показатели А в 1,4 и 2,0 раза соответственно.

Результаты спектрального анализа исследуемых образцов ферментолизатов дрожжевой биомассы (А, Б, В, Г) подтвердили их различие. Остаточные клеточные стенки практически не содержали способных к ионизации молекул, т.к. отмечено отсутствие на спектре ярко-выраженных пиков (рис.24 а). В этих образцах в основном представлены вещества преимущественно небелковой, а полисахаридной природы: глюкано-маннановые и хитинсодержащие производные.

Спектральный анализ фугатов дрожжевых ферментолизатов показал, что препарат Б, подверженный более щадящему гидролизу, содержит преимущественно пептиды с ММ от 300 до 1000 Да - 57%, менее 300 Да - 30% и 13% высокомолекулярных пептидов с ММ более ЮООДа (рис. 24 б). В образце Г(12 ч гидролиз)преобладали свободные аминокислоты (ММ<100Да) - 22,25% и низкомолекулярные пептиды с ММ 100-300 Да - 64,75% . Поглощение света в УФ-диапазоне свидетельствовало о наличии свободных ароматичных аминокислот (тирозина, триптофана, фенилаланина).

В результате направленной биокаталитической деструкции субклеточных структур дрожжевой биомассы в течение 12 ч получен препарат (Г) с глубокой степенью гидролиза биополимеров клетки, содержащий в 3 раза больше свободных аминокислот и в 2,9 раза - низкомолекулярных пептидов с ММ<300 Да, чем в препарате Б после 4-х ч ферментолизата дрожжей, отличающийся высоким содержанием пептидов с ММ от 300 до 500 Да и высокомолекулярных пептидов с ММ>1000 Да (рис.25).

СООСШЬЧ иСДЙ-КГц,

вкцтотцаяоки.»

1

2

•Г ■ ■>■ " т

а) б)

Рисунок 24- Спектральный анализостаточных клеточных стенок (а) и препарата Б -фугата 4-х часового ферментолизата дрожжей (б)

Основным ключевым фактором для создания биокорректоров пищи и кормов с заданными структурно-функциональными свойствами является использование экзогенной ферментативной системы (ФС) с заданной субстратной специфичностью целевого назначения. Определяющий критерий состава ФС зависит от поставленной задачи обеспечения необходимой глубины гидролиза той или иной высокомолекулярной структуры микробной клетки.

а) б)

Рисунок 25 -Фракционный состав ферментолизатов дрожжевой биомассы после 4-х часового гидролиза (а) и 12-ти часового гидролиза (б)

1 - Молекулярная масса (ММ) более 1000 Да: 2 - ММ от 500 до 1000 Да; 3 - ММ от 300 до 500 Да: 4- ММ менее 300 Да

Для деструкции субклеточных структур использованы подобранные ферментативные системы (ФС), в состав которых входили ферменты с различной субстратной специфичностью: 1 - ферменты (3-глюканазного. хитино- и маннанолитического действия, катализирующие гидролиз полисахаридного комплекса КС дрожжей ((3-ГкС): II - дополнительно к этим ферментам включены сериновые и

металлозависимые протеиназы - ферменты бактериального происхождения (|3-ГкС+БПС) для более глубокой деструкции белково-полисахаридного комплекса КС дрожжей; III - дополнительно протеолитический комплекс усилен протеиназами (сериновой, метеллозависимой и карбоксильной) и пептидазами (амино- и карбокси-) грибного происхождения ((3-ГкС+БПС+КФПА), катализирующими глубокий гидролиз белковых веществ протоплазмы дрожжевой клетки до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот. Наиболее высокая степень деструкции белковых веществ дрожжевой биомассы достигнута при использовании ФС III, в результате которой белки протоплазмы были полностью переведены в растворимую форму, что позволило увеличить количество свободных аминокислот в 2,5 раза (табл. 5).

Таблица 5 - Аминокислотный состав ферментолизатов дрожжевой биомассы

Аминокислоты (АК) Содержание аминокислот (АК) в ферментолизатах, %

Общие АК Свободные аминокислоты

Образец III | Образец II

Асп 4,1 2,15 0,56

Тре 2.8 1.20 0,44

Сер 2.4 1,36 0,41

Глу 6,8 4,04 1,85

Гли 1,7 0,81 0,27

Ала 3,1 1,93 0,74

Вал 2,7 1,51 0,61

Цис 0,5 0,30 0,08

Мет 0,6 0.46 0,17

Иле 2,5 1,15 0,30

Лей 3.5 1,97 0.81

Тир 1,0 0,67 0,22

Фен 2,8 0.98 0,45

Лиз 3,6 1,95 0,99

Гис 0.7 0.40 0,17

Apr 1,8 1,10 0,46

Про 2.5 1.05 0,29

Суммарное количество аминокислот, 43,1 23,03 9,26

Из них незаменимых АК 18,5 9,2 3,7

Свободные АК, % от суммарного кол-ва - 53,2 21,5

Известно, что аминокислоты и белки, прежде всего, выполняют в организме пластическую функцию, являясь конструктивной основой всех формирующихся тканей, в составе которых порядка 80% белка. Однако главная роль аминокислот -участие в регуляции функций сердечно-сосудистой, нервной и дыхательной системы, обмена веществ, эндокринной системы, что делает перспективными исследования по получению натуральных биологически активных добавок на основе дрожжевой биомассы как источника богатого комплекса аминокислот. Дефицит аминокислот,

необходимых для нормального функционирования организма, может привести к серьезным патологическим изменениям.

Степень деструкции дрожжевой клетки исследовали с применением электронной и сканирующей микроскопии.

I стадию ферментолиза дрожжей осуществляли путем каталитической деструкции клеточных стенок ферментами глюканолитического и маннанолитического действия. Биокаталитическое воздействие ФС I (Р-ГкС) привело к существенной деформации дрожжевой клетки и нарушению структуры КС в результате частичной деструкции полисахаридов оболочки, увеличивающей проницаемость внутренней мембраны (рис.26).

С целью повышения степени деструкции клеточных стенок, и учитывая, что полисахариды находятся в комплексе с белками, на II стадии ферментолизааобавлены протеиназы.В результате происходило частичное высвобождение деполимеризированных субклеточных структур (рис. 27 а и б). Целостность клеточной стенки дрожжей под действием комплекса ферментов II (Р-

ГкС+БПС) нарушалась в еще большей степени. На этом этапе можно получать 2 вида биопрепаратов: белковый обогатитель и белково-аминокислотный корректор пищи и кормов.

Рисунок 26 - I стадия ферментативного катализа. Дрожжевые клетки после частичного гидролиза Р-глюканазами и маннаназой

а) 2012.04 25 15:10 АI. 09 4 х1 8к 501 б)

Рисунок 27 - II стадия ферментативной деструкции дрожжевых клеток под действием комплекса протеиназ. Р-глюканазы и маннаназы

На III стадии ферментолиза, где были применены не только комплексы ферментов, лизирующих клеточные стенки, но и протеиназы и пептидазы. катализирующие глубокий гидролиз белковых веществ протоплазмы, наиболее выражены явления деструкции клетки. В основном сохранились лишь отдельные фрагменты и окружающая клетку стенка, внутриклеточные полимеры практически полностью прогидролизованы (рис.28).

а) б)

Рисунок 28-I1I стадия ферментативной деструкции дрожжевых клеток под действием комплекса протеиназ, пептидаз, Р-глюканаз и маннаназы

На этом этапе возможно получение белково-аминокислотного и аминокислотного обогатителя пищи и кормов с преобладающим содержанием свободных аминокислот и коротких пептидов, а также ферментолизаты дрожжевой клетки, обладающие антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью.

В результате глубокой ферментативной деструкции субклеточных структур под действием ФС III (Р-ГкС+БПС+КФПА) в течение 12 ч получены ферментолизаты дрожжевой биомассы с размерами деполимеризованных фрагментов полисахаридов клеточных стенок и белковых веществ протоплазмы от 10 до 250 нм. Исследования функциональных свойств полученных ферментолизатов микробной биомассы выявили их селективную цитотоксичность по отношению к онкоклеткам, при этом исходные клетки не обладали антиканцерогенной способностью.

Результаты исследований подтверждают возможность проведения регулируемого процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы с получением ферментолизатов заданного состава. Для обеспечения необходимой степени и глубины гидролиза биополимеров дрожжевых клеток достаточно варьировать длительностью процесса, дозировкой и составом ферментов.

Таким образом, с помощью электронной микроскопии проиллюстрировано влияние ферментативных систем различной субстратной специфичности на степень деструкции субклеточных структур дрожжей, подтверждающее эффективное действие ферментов, катализирующих биодеструкцию клеточных стенок и белковых веществ дрожжевой биомассы, в технологиях белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов. БАД с функциональными свойствами.

2.2.4. Научное и экспериментальное обоснование перспективных направлений использования белково-аминокислотных и биологически активных добавок

Проведенные медико-биологические и клинические исследования ферментолизатов дрожжевой биомассы показали их эффективность в качестве биокорректоров пищи и кормов с функциональными свойствами.

Препараты, полученные на основе ферментолизатов микробной биомассы, могут быть предложены в качестве биологически активных добавок, так как известно, что аминокислоты и короткие пептиды легко ассимилируются, всасываются в кровь и активизируют обменные процессы в организме человека и животных. Исследования показали возможность использования препаратов этой группы в качестве специфических антиоксидантов в комплексной терапии патологий, связанных с генерализованным оксидативным стрессом, а также как регуляторы Са-зависимых процессов в стволовых клетках при иммунодепрессивных патологиях. Кроме того, выявлен цитотоксический эффект ферментолизатов дрожжей ЗассИаготусез сегс\чх1ае на клетках перевиваемых опухолей. Установлено, что препараты с глубокой степенью деструкции субклеточных структур влияли на их клеточный цикл, вызывая увеличение числа апоптирующих клеток, и уменьшая способность клеток к митозу. Необходимо отметить, что особенность противоопухолевой активности дрожжевых ферментолизатов заключалась в их способности вызывать селективный апоптоз только раковых клетках, не подавляя нормальные.

Медико-биологические исследования показали, что препараты, содержащие остаточные клеточные стенки дрожжей, обладали хорошей сорбирующей способностью, поддерживали стабильность клеточной мембраны, препятствовали разрушению клеточной стенки, снижали перекисное окисление липидов.

Результаты исследований функциональных свойств биокорректоров позволили прийти к выводу, что использование ферментолизатов дрожжевой биомассы в спортивно-физкультурной практике способствовало повышению эффективности тренировочной и соревновательной деятельности спортсменов за счёт выявленных эффектов стимуляции работоспособности и оздоровления спортсменов, подтвердили улучшение иммунной защиты организма

Клинические исследования эффективности ферментолизатов дрожжевой биомассы в процессе реабилитации больных с черепно-мозговой травмой (ЧМТ) показали, что испытанные препараты влияли на коррекцию здоровья, улучшая функциональное состояние организма у больных, перенесших ЧМТ. Благодаря содержанию в ферментолизатах дрожжевой биомассы жизненно необходимых незаменимых аминокислот, витаминов, микроэлементов пациенты хорошо переносили ноотропную и антибиотиковую терапию, не наблюдалось осложнений, быстрее (по сравнению с контрольной группой) снизились симптомы интоксикации, отмечалось отсутствие обострений сопутствующей патологии на протяжении всего эксперимента.

Клинические испытания в туберкулезном диспансере у детей с нарушениями противоинфекционной защиты подтвердили высокую биологическую ценность полученной дрожжевой добавки для повышения иммунного статуса и функциональной выносливости организма улучшения обменных процессов.

Таким образом, в результате исследований научно обоснована и экспериментально подтверждена возможность управления процессами биоконверсии полимеров дрожжевой клетки путем рационального использования подобранных ферментативных систем целевого назначения и условий биокатализа для получения

биопрепаратов с заданными свойствами (табл. 6). Установлено, что, направленно регулируя состав ферментативных систем и условия биокатализа дрожжевой клетки, можно получать белково-аминокислотные корректоры пищи и кормов с заданными структурно-функциональными свойствами и биологически активные добавки с антикацерогенной, антиоксидантной, сорбционной, иммуномодулирующей и др. способностью.

Таблица 6 - Научные основы ферментативной деструкции биополимеров микробной биомассы для создания биопрепаратов с заданными свойствами

Биопрепараты ФС1 ФС2 ФСЗ

Состав целевой ферментативной системы ферменты р-глюканазного и маннаназного действия ферменты р-глюка-назного и маннаназ-ного действия + протеиназы ферменты 0-глюканазного, маннаназного действия +■ протеиназы и пептидазы

Глубина деструкции деструкция полисахаридного комплекса клеточных стенок (КС) дрожжей глубокая деструкция белково-полисахарид-ного матрикса клеточных стенок дрожжей и частичная деструкция белковых веществ Глубокая деструкция белковых веществ протоплазмы дрожжей до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот

Функциональные свойства ферментолтатов 1. Препараты энтеросорбентов, обладающие селективной сорбционной способностью. 2. Белковые обогатители пищи 1. Белково-аминокислотные обогатители пищи 2. БАД: - специфический антиоксидант; - регулятор Са-зависи-мых процессов в стволовых клетках в иммунодепрессивных патологиях 1 .Антиканцерогенный препарате селектив-ной цитотоксичностью по отношению к онкоклеткам; 2.Иммуномодулятор

В результате получены новые экспериментальные данные, позволяющие расширить теоретические знания о закономерностях биокатализа полимеров дрожжевой биомассы и о влиянии ферментативных систем на степень деструкции полимеров микробной клетки. Разработан научно-технический задел биотехнологии белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов, БАД с заданными структурно-функциональными свойствами (табл. 7, рис. 29). На целевые продукты разработана нормативная документация.

Проведены производственные испытания и наработаны опытные партии биологически активных добавок «Протамин» и «Суперпротамин» кормового назначения, предназначенных для повышения биологической и питательной ценности кормопродуктов. На Мичуринском экспериментальном заводе и ЗАО «Биопрогресс» ВНИТИБП наработаны опытные партии белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов.

Показана перспективность использования продуктов конверсии дрожжевой биомассы, в качестве эффективных добавок повышающих биологическую ценность пищи и кормов.

Во ВНИИ Детского питания проведены испытания по использованию ферментолизатов дрожжей для обогащения ферментированных молочных продуктов -йогуртов для геродиетического питания незаменимыми аминокислотами и биолигически активными пептидами.

БАД «Суперпротамин», полученные на основе глубокой ферментативной деструкции дрожжевой биомассы, использованы при наработке опытных партий шампуней и косметических кремов на ОАО «Свобода». Применение добавок позволило повысить биологическую эффективность воздействия изделий на кожу.

Таблица 7 - Сравнительная характеристика существующей и разработанной технологии направленной ферментативной конверсии полимеров дрожжевой биомассы с получением белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов

Этапы Процесса Существующая технология -автолиз Разработанная технология -ферментолиз Достигнутый результат

Плазмолиз 2ч 0 Сокращение времени предобработки

Термолиз или баротермия 0 15-30 мин

Использование антисептиков и индукторов Формалин, этанол и др. Не используются Исключение химических реагентов

Применение ферментов Не применяются 2-10 ед. ПС/г дрожжей 300 ед. Р-ГкС/г Управляемый процесс направленной деструкции полимеров клетки

Длительность гидролиза, ч 18-36 ч 4-12 ч Сокращение длительности процесса в 3-4 раза

Степень гидролиза белка, % 50-65 60-100 Повышение глубины гидролиза белка

Фракционный состав, % М.м.: до 300 Да 300-1000 Да более 1000 Да 5-20 10-24 90-76 Биокорректор БАД Получение ферментолизатов с заданным фракционным составом

30 57 13 89 11

Свободные АК,% от общего кол-ва 3-12 21 60 Увеличение свободных аминокислот

Конечные продукты Пищевые и кормовые добавки Белково-амино-кислотные корректоры пищи и кормов и БАД Расширение функциональных свойств продуктов ферментолиза

Во ВНИИ пресноводного рыбного хозяйства проведены испытания ферментолизата дрожжей «Протамин» в составе стартового комбикорма для личинок осетровых рыб, подтвердившие биологическую эффективность препарата (повышение интенсивности роста личинок на 18-48%, увеличение массы выращенных мальков на 20-55%).

Специалистами ГУ Волгоградского НИТИ НУ мясомолочного скотоводства и переработки продукции животноводства проведены испытания, исследована биологическая ценность ферментолизатов дрожжевой биомассы и установлена эффективность их использования в животноводстве и пчеловодстве.

Показано, что при выращивании молодняка крупного рогатого скота абсолютный прирост их живой массы увеличивался на 11%, при этом снижались затраты кормов на 1 кг прироста на 8%. Установлено, что препарат «Протамин» эффективно вводить в рационы животных в виде подкормок из расчёта 3,0 % от задаваемых кормов, что позволяет повысить уровень рентабельности производства говядины - на 6.1 %,

Применение «Протамина» при кормлении кур яичных кроссов при добавлении в комбикорма в количестве 5% позволило повысить сохранность поголовья кур. яйценоскость и выводимость суточных цыплят, а также качество яиц. Отмечена тенденция повышения в яйце содержания каротиноидов на 275%, селена - на 55, 6%, витаминов А, Е, В1 и Взна 10%, 63%, 60% и 5% соответственно.

Год ПрОИЗ&ОД<

Зерновая барда

Биомасса дрожжей

функциональны« БАД

Кормовые добавки

подл

Зерно

Ферменты

л 1*1)

Цыращми гпнба

Б ио этанол

С п и ртово

П риготоалакие

СУСА*

6ро*«ИИ>"

ОТХОД ПрОИ» ОДСТ» ЮП

Биомасса гриба

оевг*ии«т

ВиОКАТАЛМО МИКр0бМ0Й бмомнееы

барды

Рисунок 29- Ресурсосберегающие технологии переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов в кормовые белково-аминокислотные и биоактивные добавки

При подкормке пчел карпатской породы стимулирующей добавкой «Протамин» в количестве 5% к сахарному сиропу установлено положительное влияние биопрепарата на яйценоскость пчелиных маток и силу семей.

По данным проведенных комплексных испытаний, установлено, что применение «Протамина» оказывает положительное влияние на организмы животных, рыбы, птиц и пчел, повышает их жизнеспособность и продуктивность.

Таким образом, в результате исследований научно обоснованы и разработаны ресурсосберегающие технологии переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов с использованием новых высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, биокаталитических и биосинтетических процессов (рис.29).

Основные результаты и выводы

1 .Разработаны новые подходы, методы и процессы для создания ресурсосберегающих биотехнологий глубокой переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов в биоэтанол, белково-аминокислотные и биологически активные добавки кормового и пищевого назначения.

2. На основе селекции и мутагенеза осуществлен скрининг активного штамма микромицета Aspergillus oryzae 12-84 с широким спектром синтезируемых экзоферментов протеолитического, амилолитического, ß-глюканазного, маннаназного, хитиназного и нуклеазного действия, биомасса которого - источник биополноценных белковых веществ, ценных полисахаридов и биологически активных веществ.

3. Научно обоснована ресурсосберегающая технология биокаталитической и микробной конверсии полимеров зернового сырья, обеспечивающая интенсивный процесс сбраживания концентрированных зерновых сред с высоким выходом биоэтанола и пониженным образованием отходов производства, для реализации которой:

- на основе сравнительных исследований биосинтетической активности дрожжей и установленных закономерностей метаболизма осуществлен скрининг осмофильного штамма Saccharomyces cerevisiae 1039, обладающего направленной способностью к синтезу этанола с пониженным образованием сопутствующих метаболитов;

- подобран оптимальный ферментативный комплекс (ферменты амилолитического, протеолитического и гемицеллюлазного действия) и условия глубокой конверсии полисахаридных и белковых полимеров концентрированного зернового сусла, обеспечивающие увеличение концентрации аминного азота и сбраживаемых углеводов в 1,5-2,0 раза, снижение вязкости концентрированного зернового сусла в 4 раза и ускорение процессов генерации и спиртового брожения на 30-40%;

- выявлена зависимость степени гидролиза полимеров концентрированного зернового сусла, процессов роста и метаболизма дрожжей S. cerevisiae 1039 от субстратной специфичности ферментативных систем. Установлено, что ферменты протеолитического и ß-глюканазного действия, катализирующие глубокий гидролиз растительных белков и полисахаридов, способствуют снижению синтеза побочных метаболитов в 1,5-1,7 раза за счет снижения образования высших и ароматических спиртов, сокращению объема образования послеспиртовой барды на 40-50% и увеличению выхода биоэтанола - 2,5-3,5%.

4. На основе исследованных закономерностей и установленной корреляционной зависимости степени конверсии углеводов питательных сред в L-лизин от содержания в них зерна и барды разработана комплексная ресурсосберегающая технология производства кормовой лизино-белковой добавки с использованием полупродуктов и отходов спиртового производства.

5. Исследована биологическая эффективность лизино-белковой добавки и разработаны пути обогащения зерновой барды ценным микробным белком, аминокислотами, в т.ч. незаменимой аминокислотой - лизином. Установлено, что введение в рацион высокоэффективных кормовых добавок способствует повышению

продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы на 12- 15%, сокращению расхода кормов.

6. Разработан научные основы биотехнологии получения белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов, биологически активных добавок с использованием регулируемого процесса биоконверсии полимеров дрожжевой и мицелиальной биомассы - отходов перерабатывающих отраслей АПК в биопрепараты с заданными свойствами, для реализации которого:

- теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность получения биопрепаратов с заданными структурно-функциональными свойствами на основе ферментативного гидролиза полимеров мицелиальной биомассы;

на основе разработанной модели и установленных закономерностей биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой клетки выявлена регуляторная роль ферментов с различной субстратной специфичностью и разработан процесс направленной конверсии субклеточных структур Басскаготусех сеге\чх1ае с получением ферментолизатов с заданным структурно-фракционным составом и функциональными свойствами;

- установлена эффективность применения комплексной обработки дрожжевой биомассы, включающая предварительную обработку давлением и процесс ферментолиза подобранными ферментативными комплексами, состоящими из протеолитических и глюканолитических гидролаз;

- исследован спектральный состав белковых веществ и показано наличие свободных аминокислот и биологически активных пептидов в ферментолизатах дрожжей, способных выполнять важнейшие нейромедиаторные и др. функции, обеспечивающие функциональные свойства целевых продуктов;

- с помощью электронной микроскопии проиллюстрировано влияние ферментативных систем различной субстратной специфичности на степень деструкции субклеточных структур дрожжей, подтверждающее эффективное действие ферментов, катализирующих биодеструкцию клеточных структур дрожжевой биомассы.

- научно обоснованы и подтверждены новые знания о взаимосвязи биохимического и спектрального состава полученных биопрепаратов с их функциональными свойствами, о перспективных направлениях конструирования функциональных и специальных продуктов питания и эффективных для животноводства кормов.

7. Разработана нормативная документация, проведены производственные испытания и наработаны опытные партии белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов, БАД, функциональные свойства и биологическая эффективность которых исследована при создании новых ферментированных молочных продуктов, косметических изделий, стартовых комбикормов для личинок осетровых рыб, стимулирующей подкормки для пчел, в рационах питания сельскохозяйственных животных и птиц.

8. Для реализации биокаталитических технологий разработан новый универсальный метод определения протеолитической активности ферментных препаратов (ФП), включенный в национальный стандарт РФ (ГОСТ Р 53974-2010).

Практические предложения

Для практического использования результатов исследований предложена следующая нормативная документация: Паспорта на селекционированные штаммы; ТИ по производству гидролизата дрожжевого «Протамин»; ТУ 9182-055-00334586-2007 «Гидролизат дрожжевой «Протамин»; санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.99.913.Т. 001564.07.07 от 18.07.2007 г.; свидетельство о государственной

регистрации № 77.99.26.9.У.5708.8.07 от 18.07.2007 г. на гидролизат дрожжевой «Протамин»; ТУ 9182-115-00334586-2013 «БАД Суперпротамин»; Опытно-промышленный регламент на производство кормовой лизино-белковой добавки; ГОСТ Р 53974-2010 «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения протеолитической активности».

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

1. Римарева, JI.B. Сравнительная характеристика микробных протеаз по степени гидролиза белковых субстратов / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, В.В. Трифонова // Прикладная биохимия и микробиология. - 1997 - Т.ЗЗ - №1 -С.43-45.

2. Rimareva, L. V. Comparatlve Characterization of Microbial Proteases by the Extent of Hydrolysis of Protein Substrates / L. V. Rimareva, M.B. Overchenko, E.M. Serba, V. V. Trifonova // Applied Biochemystry and Microbiology. - 1997. - V.33 -N 1. - P.36-41.

3. Оверченко, M. Б. Новые продукты питания на основе вторичного сырья пивоваренного производства / М.Б. Оверченко, В.В. Трифонова, Е.М. Серба, В.А. Поляков II Пищевая промышленность. - 1999. - №1. - С. 33-34.

4. Римарева, JI.B. Использование комплексного препарата амилопротооризин (КФПА) для энзиматического гидролиза дрожжевой биомассы / М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова, Т.В. Туликова, Н.В. Фурсова, А.Н. Пасхин II Хранение и переработка сельхозсырья сырья. - 2002. - №10 - С. 39-41.

5. Римарева, JI.B. Исследование процесса биокатализа полимеров дрожжевой биомассы и разработка технологических параметров получения белково-аминокислотных препаратов /Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.С. Погоржельская II Хранение и переработка сельхозсырья. - 2006. - № 3. - С. 32-35.

6. Римарева, Л.В. Влияние ферментативного комплекса гриба Aspergillus oryzae на степень гидролиза полимеров дрожжевой биомассы /Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, К.А. Морозова, ЕМ. Серба // Хранение и переработка сельхозсырья сырья. - 2006. - №4 - С. 3942.

7. Григорьев, М.А. Исследования процесса ферментации зерновой композиции для конструирования продуктов питания / М.А. Григорьев, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко II Хранение и переработка сельхозсырья. - 2009. - № 2. - С.61-63.

8. Серба, ^.Л/.Универсальный метод определения протеолитической активности ферментных препарате для пищевой промышленности / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.Л. Агашичева, Л.В. Римарева!/ Хранение и переработка сельхозсырья. - 2010. - № 6. - С. 33-35.

9. Римарева, У7. Д. Стимулирующее действие детергентов на протеолитическую активность гриба Aspergillus oryzae. / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, К.Л. Агашичева//Производство спирта и ликероводочных изделий. -2010. - № 3 - С. 14-15.

10. Римарева, Л.В. Эффективный ферментный препарат протеолитического и гемицеллюлазного действия для перерабатывающих отраслей АПК / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, ЕМ. Серба, К.Л. Агашичева // Производство спирта и ликероводочных изделий. -

2010.- № 4. - С. 14-16.

11. Беляева, О.Н. Применение протеолитических ферментов в суспензиях косметических средствах / О.Н. Беляева, А.П. Нечаев, Ю.П. Гуськин, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба //Хранение и переработка сельхозсырья. -2011. -№ 5.-С.37-39.

12. Беляева, О.Н. Аквакомплекс глицеросольвага титана как стабилизатор активности ферментативных систем в суспензионной среде диоксида кремния /О.Н. Беляева, А.Ю. Кривова, А.П. Нечаев, М.Б. Оверченко, Е.М. СербаН Хранение и переработка сельхозсырья. -

2011. -№6.-С.34-36.

13. Серба, Е.М. Синтез и секреция гидролаз микромицетом Aspergillus oryzae -продуцентом ферментов, необходимых для биокатализа полмеров зернового сырья / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Л.В. Римарева // Производство спирта и ликероводочных изделий. -

2011,- № 2. - С. 18-20.

14. Серба, Е.М. Создание осмофильного штамма спиртовых дрожжей Saccharomycescerevisiae и исследование условий его поддержания в активном состоянии / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, JI.B. Римарева, K.JI. Агашичева, Н.И. Игнатова II Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2011. - №4. - С. 4-8.

15. Серба, Е.М. Сбраживание концентрированного сусла с использованием осмофильной расы спиртовых дрожжей Saccharomycescerevisiae 1039 / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, J1.B. Римарева, К.Л. Агашичева, Н.И. Игнатова II Производство спирта и ликероводочных изделий.-2011. - №3.-С. 10-13.

16. Серба, Е.М.Ълшпш детергентов на секрецию внутриклеточных ферментов из биомассы гриба Aspergillus oryzae / Е.М. Серба, М.Б.Оверченко, Ю.А. Борщева II Хранение и переработка сельхозсырья. -2011. - № 12. - С.39-40

17. Оверченко, М.Б. Создание осмофильного штамма спиртовых дрожжей Saccharomyces cereviziae и исследование условий его поддержания в активном состоянии / М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, К.Л. Агашичева, Н.И. Игнатова II Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2011. - № 4. - С. 4-8.

18. Римарева, Л.В. Использование биомассы гриба Aspergillus oryzae в качестве источника биологически активных веществ /Л.В. Римарева, ЕМ. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, И.М. АбрамоваII Хранение и переработка сельхозсырья. - 2012. - № 9. -С.46-50.

19. Римарева, Л.В. Осмофильный штамм спиртовых дрожжей Saccharomycescerevisiae 1039 для сбраживания концентрированного зернового сусла / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, Е.М. СербаИ Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2012. - № 3,-С.8-11

20. Орлова, Е.В. Влияние ферментолизатов дрожжей Saccharomycescerevisiae на клеточный цикл и апоптоз клеток перевиваемых опухолей / Е.В. Орлова, Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, B.C. Орлова, Е.М. Серба II Биозащита и биобезопасность. - 2012. - Т.4. - № 3. — С. 48-51.

21. Римарева, 77.ß. Влияние ферментативных систем на биохимический состав зернового сусла и кулыуратьные свойства осмофильной расы спиртовых дрожжей / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2013. - № 1. -С. 18-20.

22. Серба, Е.М.Исследование метаболитов, сопутствующих синтезу этанола при сбраживании концентрированного зернового сусла осмофильным штаммом дрожжей Saccharomycescerevisiae / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Л.В. Римарева, Н.И. Игнатова, О.В. Веселовская, Н.В. Шелехова // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2013. - № 2. -С. 16-19.

23. Римарева, Л.В. Влияние баротермического воздействия на степень подготовки дрожжевой биомассы к ферментативной деструкции / Л.В. Римарева, ЕМ. Серба, М.Б. Оверченко, КВ. Рачков, Е.И. Курбатова, E.H. Соколова, Ю.А. Борщева //Хранение и переработка сельхозсырья.-2013 - № 6 - С. 31-35.

24. Серба, Е.М. Активация ферментов солода и прорастания семян под действием биологически активных веществ гриба Aspergillusoryzae/E.M. Серба, М.Б.Оверченко, Н.И.Игнатова, Л.В. Римарева // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2013. - № 8. - С.35-38.

25. Серба, Е.М.Разработка национальных стандартов по методам определения активности ферментных препаратов для пищевой промышленности/ Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, E.H. Соколова, Е.И. Курбатова // Пищевая промышленность -2013,-№7.-С. 40-44.

26. Оверченко, М.Б. Перспективные расы дрожжей Saccharomycescerevisiae с термотолерантными и осмофильными свойствами для спиртового производства / М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, Е.М. Серба, Л.И.Скворцова, Л.В. Римарева // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2013. - № 4. - С. 26-29

27. Серба, Е.М. Исследование фракционного состава биокорректоров пищи из дрожжевой биомассы для создания на их основе функциональных продуктов целевого назначения /Е.М. Серба, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, М.Б. Оверченко М.Б, Л.В. Римарева, В.А. Поляков // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2013. - № 11. - С. 18-21

28. Серба, Е.М.Создание натуральных биокорректоров пищи для фукциональных продуктов / Е.М. Серба, К.В. Рачков, H.H. Игнатова, Л.В. Римарева, В.А. ПоляковИ Пищевая промышленность. - 2013. - № 9. - С. 18-20

29. Поляков, В.А. Биологически активные добавки микробного происхождения как фактор, формирующий функциональные свойства пищевых продуктов / В.А. Поляков, Л.В. Римарева, Е.М. Серба, Н.С. Погоржельская, К.В. Рачков II Хранение и переработка сельхозсырья. - 2013. - № 12. - С. 43-47.

30. Серба, £.Л/.Фракциош1ый состав и функциональные свойства ферментолизатов дрожжевой биомассы / Е.М. Серба, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, Л.В. Римарева, Н.С. Погоржельская, В.А. Поляков. // Известия Самарского научного центра РАН. - 2013. -Т. 15. -№3(5)- С. 1680-1681.

31. Зобкова, З.С. Влияние способа внесения трансглутаминазы на структурно-механические свойства йогурта и протеолитическую активность заквасочных культур/3. С. Зобкова, Т.П. Фурсова, Д.В.Зенина, Л.В. Римарева, Е.М.Серба, Е.И.Курбатова, Е.Н.Соколова II Хранение и переработка сельхозсырья. - 2014. - № 3. - С. 28-32.

Патенты на изобретение

32. Поляков В.А., Римарева JI.B., Оверченко М.Б., Серба Е.М., Курбатова Е.И. Способ получения ферментолизата клеток дрожжей.// Патент РФ № 2370526 Заявка №2007133742. Приоритет 11.09.2007. Регистрация в Госреестре изобретений РФ 20.10.2009. - Бюл. № 29.-7С.

33. Римарева JI.B.,Оверченко М.Б., СербаЕ.М., Игнатова Н.И., Поляков В.А. Способ получения белково-аминокислотного обогатителя пищи // Патент РФ № 2373770 Заявка № 2007138827 Приоритет 22.10.2007. Регистрация в Госреестре изобретений РФ 27.11.2009. -Бюл. №33.-6 С.

34. Римарева JI.B., Оверченко М.Б., Серба Е.М., Хричикова Г.Н., Поляков В.А. Способ получения биологически активной добавки. // Патент РФ №2374901 Заявка № 2007134977 Приоритет 20.09.2007.Регистрация в Госреестре изобретений РФ 10.12.2009,- Бюл. № 34.-7 С.

35. Римарева Л.В. Оверченко М.Б., Игнатова Н.И., Серба Е.М., Поляков В.А. Способ комплексной переработки зернового сырья на спирт и кормовой продукт.// Патент РФ № 2396007, Заявка № 2009111214. Приоритет от 30.03.2009. Регистрация в Госреестре изобретений РФ 10.08.2010..-Бюл. №22.-10 С.

36. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова Н.И., Серба Е.М. Способ получения питательной среды для проведения микробного синтеза лизина. Патент РФ №2412242 /Заявка № 2009111215 Приоритет от 30.03.2009. Регистрация в Госреестре изобретений РФ 20.02.2011.. - Бюл. № 5.-9С.

37. Горлов И.Ф., Струк А.Н., Маслова Е.Е., Римарева Л.В., Оверченко М.Б.,Серба Е.М., Ряднов А А., Чепрасова О.В. Способ кормления кур яичных кроссоп.// Патент РФ №2409218 Заявка № 2009110793 Приоритет 24.03.2009. Регистрация в Госреестре изобретений РФ 20.01.2011.. - Бюл. № 2.-6С.

38. Горлов И.Ф., Мосолов A.A., Мороз М.Г., Маслова Е.Е., Римарева Л.В., Серба Е.М. Способ обогащения стимулирующей подкормки для пчел Л Патент РФ №2441370 Заявка № 2010111209 Приоритет от 23.03.2010. Регистрация в Госреестре изобретений РФ 10.02.2012. - Бюл. № 27.-5С.

Статьи и материалы конференций, семинаров

39. Римарева, Л.В. Направленный ферментативный катализ полимеров дрожжевой биомассы с получением биологически активных добавок с функциональными свойствами заданного фракционного состава / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова, Г.Н. Хричикова // Сборник материалов научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития

современных аграрно-пищевых технологий». Углич. - 2007 - С. 292-294

40. Орлова, Е.В. Эффект селективного апоптоза, вызываемый ферментолизатами дрожжевой биомассы с различной степенью деструкции субклеточных структур / Е.В. Орлова, JJ.B. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.С. Погоржельская // Сборник научных трудов IV Межд. научно-практ. симпозиума «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях». М. - 2008. - С.121-128

41. Римарева, J1.B. Направленный биокатализ белковых полимеров протоплазмы и полисахаридов клеточных стенок дрожжей для получения ферментолизатов с заданным фракционным составом / Л.В. Римарева, Оверченко М.Б., Е.М. Серба, Игнатова Н.И., Курбатова Е.И.ИСборник научных трудов IV Межд. научно-практ. симпозиума «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях». М. - 2008. - С. 107114.

42. Римарева, Л.В. Биокаталитические технологии и микроорганизмы в создании функциональных продуктов питания / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко // 5-ый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М. - 2009. - Ч. 1. - С. 429.

43. Rimareva, L. V. Biocatalytic technologies and microorganisms in production of essential food products / L. V. Rimareva, E.M. Serba, M.B. Overtchenko II The fifth Moscow international congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development". - M. - 2009. - P. 1 - P. 430.

44. Римарева, Л.В. Биотехнология кормового Лизино-белкового препарата на основе микробной конверсии сельскохозяйственного сырья / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова, Н.С. Погоржельская И Сборник «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности» (приоритеты развития) Материалы III Межд. Научно-практ. конференции. Воронеж - 2009, т. 1.-С. 158-160

45. Римарева, Л.В. Биотехнология натуральных биокорректоров пищи с заданными структурно-функциональными свойствами / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, Е.И. Курбатова, М.Б. Оверченко, Е.В. Орлова, Соколова Е.Н. II Сборник «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности» (приоритеты развития) Материалы ШМежд. Научно-практ. конференции. Воронеж - 2009 - Т. 1. - С. 318-320

46. Римарева Л.В. Разработка биотехнологических процессов комплексной конверсии зернового сырья на спирт и белково-аминокислотную добавку для животноводства / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова, Н.С. Погоржельская II Сборник «Современные биотехнологии переработки сельхоз сырья и вторичных ресурсов». Углич. - Россельхозакадемия, 2009. -С.172-175

47. Орлова, Е.В. Влияние БАД Суперпротамин на эффекторные характеристики Са-связывающих белков и Са-сигнализации в культуре мышиных миоблатов / Е.В. Орюва, М.Б. Оверченко, Е.М.Серба, Н.С. Погоржельская, Л.В. Римарева И Сборник «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК». ВНИИПБТ, Пищепромиздат. М. -2010.-С. 207-213

48. Rimareva, L.V. Perspective biotechnological processes in food manufacture / L.V. Rimareva, M.B. OvertchenkoE.M. Serba, E.I. Kyrbatova, E.N. Sokolova II YI Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development". M. -2011. - P. 2. - P. 126

49. Орлова, Е.В. Биотехнологические аспекты биокорректоров пищи нового поколения для лечебно-профилактических целей / Е.В. Орлова, Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба II YI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М. -2011. — Ч. 2. - С. 204

50. Orlova, Е. V. Biotechnological aspects of bioproof-readers of new generation food for the treatment-and-prophylactic purposes / E. V. Orlova, L. V. Rimareva, M. B. Overchenco, E.M. Serba II YI Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development". M. - 2011. - P. 2. - P. 204

51. Орлова, Е.В. Исследование функциональных свойств биологически активной добавки, полученной на основе направленной биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой клетки / Е.В. Орюва, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, JI.B. Римарева II Сб. научных трудов. ФГУП «Типогрфия» Россельхозакадемии. -ВНИИПБТ, 2011. -С.96-101

52. Поляков, В.А. Комплексная переработка зернового сырья на спирт и кормовой Лизино-белковый продукт / В.А. Поляков, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова, Л.В. Римарева II Сб. научных трудов. ФГУП «Типогрфия» Россельхозакадемии. -ВНИИПБТ, 2011. -С.75-82

53. Римарева, Л.В. Ферментные препараты и нормы их расхода для эффективной конверсии полимеров зернового сырья в спиртовом производстве / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, Е.М. Серба, Г.Н. Хричикова, К.Л. Агашичева И Сб. научных трудов. ФГУП «Типография» Россельхозакадемии. -ВНИИПБТ, 2011. - С.61-74

54. Оверченко, М.Б. Роль ферментативного катализа полимеров зернового сырья в процессах спиртового брожения / М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова // Труды Международной научно-практ. конференции «Крахмал и крахмалопродукты, состояние и перспективы развития», М. - 2011. - С. 100-107

55. Римарева, Л.В Исследование биохимического, спектрального и фракционного состава ферментолизатов микробной биомассы /Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.С. Погоржельская, К.В. Рачков, Н.И. Игнатова II Сборник научных трудов «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» - М.: ВНИИПБТ, - 2012. - С. 115 - 125

56. Поляков В.А. Влияние различных источников биологически активных веществ на процессы прорастания семян / В.А. Поляков, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Н.С. Погоржельская, Л.В. Римарева // Сборник научных трудов «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» -М. ВНИИПБТ - 2012. - С. 126 - 131

57. Римарева Л.В. Морфологические и культуральные особенности осмофильного штамма спиртовых дрожжей Saccharomycescerevisiae 1039 / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, Е.М. Серба // Сборник научных трудов «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» под ред. В.А. Полякова, Л.В. Римаревой - М.: ВНИИПБТ- 2012 - С. 169 - 176

58. Римарева, Л.В. Ферментативные комплексы для эффективной подготовки зернового сусла в спиртовом производстве / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, Е.М. Серба И Сборник научных трудов «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» -М.: ВНИИПБТ - 2012. - С. 302 - 307

59. Римарева, Л.В. Микроорганизмы и биокаталитические технологии в создании функциональных продуктов / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков, Е.В. Орюва, Н.С. Погоржельская II Материалы XI Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Мурманск. - 2012 - С. -98-107

60. Римарева, Л.В. Некоторые аспекты использования грибной биомассы - отхода биотехнологического производства для коррекции белкового и углеводного состава продуктов питания / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков II Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Научно-инновационные аспекты при создании продуктов здорового питания». Углич. - 2012. - С.207-210

61. Серба, Е.М.Влияние мицеллиального гриба Aspergillus oryzae на прцессы прорастания семян / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, Л.В. Римарева II Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Научно-инновационные аспекты при создании продуктов здорового питания». Углич. 2012. - С.236-238

62. Серба, Е.М. Интенсификация процессов прорастания семян с использованием отходов ферментного производства / Е.М. Серба, Л.В. Римарева, К.В. Рачков И Материалы

международной конференции «Биология - наука XXI века». Москва. Изд. МАКС.ПРЕСС. -2012,- С. 828-830.

63. Серба, £.Л/. Использование микробной биомассы как стимулятора роста растений / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков // 46-ая Межд. научная конф. молодых ученых, докторантов, аспирантов и соискателей ученых степеней доктора и кандидата наук «Эффективность применения средств химизации в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур (ГИУ ВНИИ агрохимии им. Д.Н.Прянишникова,26 апреля 2012 г) - М.ВНИИА,- 2012. - С.169-171.

64. Ргшарева, JI.B. Комплексная переработка зернового сырья и ВСР АПК в эффективный для животноводства лизино-белковый кормовой продукт / Л. В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова И Сб. докладов 15-ой международной научной конференции памяти В.М.Горбатова. 13 декабря 2012 г. - Москва. ВНИИМП. - Т. 2. - С.68-74.

65. Поляков, В.А. Белково-аминокислотные биокорректоры пищи на основе направленного ферментативного катализа полимеров микробного сырья / В.А. Поляков, Л.В. Римарева, Е.И. Курбатова, Е.М. Серба, Н.С. Погоржельская, Ю.А. Борщова // Официальный каталог 5-ой Межд. биотехно-логич. выставки-ярмарки «РосБиоТех-2011 »,31 октября-2 ноября 2011 г.-М.: ЦВК «Экспо-центр», 2011.-С. 78-79.

66. Римарева, Л.В. Роль ферментативного катализа полимеров зернового сырья в процессах спиртового брожения / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова // Сб.трудов Международная научно-практ. конф. «Крахмал и крахмалопродукты, состояние и перспективы развития» (Коренёво, 14-15 декабря 2011 г.) - М.: ООО «НИПКЦ Восход-А»,- 2012 - С.100-107

67. Римарева, Л.В. Комплексная технология кормовой лизино-белковой добавки на основе микробной конверсии зернового сырья и послеспиртовой барды / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е. М.Серба // Материалы седьмой международной конференции «Комбикорма 2013. Современное производство комбикормов». Москва, МПА, 5-6 февраля 2013. - С.116-120

68. Римарева, Л.В. Биотехнология комплексной переработки зернового сырья в кормовую белковую добавку, обогащенную лизином / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, Е.М. СербаП В сб. Межд. научной конф. «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» (5-7 декабря 2012 г., ГНУ ВНИТИБП, Моск.обл, Щелково).-2012.-С.31.

69. Римарева, Л.В. Комплексная переработка зернового сырья и ВСР АПК в эффективный для животноводства лизино-белковый кормовой продукт / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, Н.И. Игнатова // Сб. докладов 15-ой международной научной конференции памяти В.М.Горбатова. 13 декабря 2012 г. - Москва. ВНИИМП. - Т. 2. - С.68-74.

70. Римарева, Л.В. Перспективы создания функциональных продуктов на основе хитинсодержащей микробной биомассы и биокаталитических процессов / Л.В. Ргшарева, Е.М. Серба, К.В. Рачков // Материалы VII Межд. Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.) - М., 2013. - Ч.2.-С.40-41.

71. Overchenko, М.В. Integrated system for quality evaluation of enzyme preparations in order to ensure the stability of biotechnological processes of food production / M.B. Overchenko, E.M. Serba, N.I. Ignatova // Congress proceedings VII Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development" (March, 19-22. Moscow, Russia). - M. -2013. - P.2. -P.43

72.Rimareva, L. (^Perspectives of creation of functional products based on microbial biomass and biocatalytic processes / L. V. Rimareva, E.M. Serba, K.V. Rachkov //Congress proceedings VII Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development" (March, 19-22. Moscow, Russia). - M. -2013. - P.2. -P.41

73.Римарева, Л.В Технологические особенности создания биокорректоров пищи на

основе дрожжевой биомассы / Л.В. Римарева, ЕМ. Серба, К.В. Рачков, М.Б. Оверченко, ЕЙ. Курбатова, E.H. Соколова // Сборник материалов Веер, научно-практ. конф. «Пищевые ингредиенты и инновационные технологии в производстве продуктов питания» (г.Санкт-Петербург, 15-15 мая 2013 г.). - ГНУ ВНИИПАКК. - 2013. - С.142-145

74. Римарева, Л.В Комплексная технология кормовой лизино-белковой добавки на основе микробной конверсии зернового сырья и послеспиртовой барды / Л.В. Ршшрева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба!I Сборник 7-ой Межд. конф. «Комбикорма-2013. Современное производство комбикормов» (Москва, Международная промышленная академия 5-6 февраля 2013 г.). - М.: МПА. - С. 116-120

75. Серба, Е.М.Биотехнология натуральных биокорректоров пищи на основе микробной биомассы с заданными структурно функциональными свойствами /Е.М. Серба, К.В. Рачков, Л.В. Римарева, Н.С. Погоржельская // Сборник материалов Межд. научно-практ. конф. «Инновационные технологии в производстве и переработке сельскохозяйственной продукции в условиях ВТО». Волгоград, 4-5 июня 2013.

76. Серба, Е.М. Влияние степени биодеструкции полимеров дрожжевой клетки на фракционный состав и функциональные свойства ферментолизатов дрожжевой биомассы / Е.М. Серба, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, Л.В. Ршшрева, Н.С. Погоржельская // Сборник материалов VI Российского симпозиума «Белки и пептиды» (Уфа, БГАУ, 10-15 июня 2013 г.). - Уфа: БКАУ, 2013. - С. 277

77. Поляков, В.А. Биокоррегирующие пищевые добавки на основе микробной биомассы /В.А.Поляков, Л.В.Ршшрева, Е.М.Серба, М.Б.Оверченко // Сборник материалов XII Межд. научно-практ. конф.«Инновационные технологии в пищевой промышленности». Минск, НПЦ HAH Беларуси по продовольствию. 2-Зоктября 2013. -Минск,- с. 47. Серба, Е.М. Влиянием состава протеолитического комплекса на степень деструкции белковых веществ микробной биомассы/ Е.М.Серба, В.А. Поляков, М.Б.Оверченко, Н.С. Погоржельская, Л.В.Ршшрева// В сб.: YII Всероссийской конференции «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция». -Петрозаводск. - 2014. - С. 67.

78. Серба, Е.М. Зависимость степени гидролиза дрожжевого белка от специфичности ферментов протеолитического действия / Е.М.Серба, В.А. Поляков, М.Б.Оверченко, Н.С. Погоржельская, Е.И. Курбатова, Л.В.Ршшрева// Материалы XII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Пермь. - 2014,- С. 287-292.

79. Серба, Е.М. Влияние барометрического воздействия на эффективность процесса ферментативной деструкции внутриклеточных структур дрожжей / Е.М.Серба, М.Б.Оверченко, Н.И. Игнатова, К.В.Рачков, Л.В.Римарева, В.А. Поляков// В сб.: «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» М. -2014. - С. 170-176.

80. Серба, Е.М. Ферментативная конверсия биополимеров зернового сусла, обеспечивающая эффективный процесс сбраживания концентрированных сред осмофильными расами дрожжей / Е.М.Серба, М.Б.Оверченко, Н.И. Игнатова, Н.В.Шелехова, О.В. Веселовская, Л.В.Римарева// В сб.: «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» М. -2014.-С. 127-134.

Список основных сокращений:

КЖ - культуральная жидкость АК — аминокислоты КлС - клеточные стенки ФП - ферментные препараты ФС - ферментативная система

КС- гемицеллюлазы Р-ГкС - Р-глюканазная способность ПС- протеолитическая способность ГПС - комплекс грибных протеиназ и пептидаз БПС - бактериальные протеиназы

КФПА - комплексный ферментный препарат из А.огугае (р-глюканазы, грибные протеиназы и пептидазы)

СВ - сухие вещества РВ - редуцирующие вещества

ММ - молекулярная масса ЫНг- аминный азот

гли- Глицин ТРП- Триптофан

АЛА- Алании СЕР- Серии

ВАЛ- Валин ТРЕ- Треонин

ЛЕЙ- Лейцин АСП- Аспарагиновая кислота

ИЛЕ- Изолейцин ГЛУ- Глутаминовая кислота

ПРО- Пролин АСН - Аспарагин

ФЕН- Фенилаланин ГЛН- Глутамин

ТИР- Тирозин ЦИС- Цистеин

Заказ № 45-Р/01/2015 Подписано в печать 21.01.15 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 2,4

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 .¿F^ тел- (495)649-83-30

(ч^// www.cfr.ru; e-mail: zakpark@cfr.ru