Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биотехнологического способа получения препаратов белка из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae на основе направленного ферментативного гидролиза клеточных стенок

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологического способа получения препаратов белка из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae на основе направленного ферментативного гидролиза клеточных стенок"

На правах рукописи

Юскпна Ольга Николаевна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БЕЛКА ИЗ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ вассЬагошусе« сегеушае НА ОСНОВЕ НАПРАВЛЕННОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК

Специальность 03.00 23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1гоэаэ

Щелково - 2008г

003170989

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИПБТ)

Научный руководитель доктор технических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Римарева Любовь Вячеславовна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Скичко Николай Данилович

кандидат технических наук, доцент Румянцева Галина Николаевна

Ведущая организация Государственное научное учреждение

«Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им В М Горбатова» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИМП)

Защита состоится « 20 » июня 2008г в Ю00 час на заседании Диссертационного совета Д 006 069 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Россельхозакадемии по адресу 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос Биокомбината ВНИТИБП

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП

Автореферат разослан « 20 » мая 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ЮД Фролов

I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРНО ГИКА РАБОТЫ

Актуальность. Актуальность выбранного направления исследований обусловлена сложившимся дефицитом белка в структуре питания населения России Продовольственная проблема, связанная с недостатком биологически полноценных продуктов, со временем не только не теряет своей остроты, но и становится одной из актуальнейших Эффективность решения этой проблемы определяется использованием качественно новых методов производства пищи, а также привлечением новых сбалансированных источников пищевого белка, одним из которых является белок микроорганизмов Работы многих ученых посвящены вопросам изучения возможности использования микроорганизмов как источников белковых веществ (Коновалов В А, 1975, Ьеликов ВМ 1977, Шкляр Б X,1977, Латов В К, 1990, Римарева ЛВ, 1993, Иванова Л А , 1998, Неклюдов А Д , 2000, и др )

Наиболее перспективным источником пищевого белка является дрожжевая биомасса, что объясняется полноценностью белковых веществ, аминокислотный скор которых приближается к животному белку, а также безопасностью и абсолютным отсутствием токсичности дрожжей Кроме того, наличие витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рассматривать дрожжи как перспективные субстраты для получения биологически активных добавок Более того, к настоящему времени разработано много способов производства белковых концентратов и изолятов микробного происхождения Однако, до сих пор не созданы эффективные методы выделения белка из дрожжевой клетки, которые обеспечивали бы его полноценное усвоение Существующие физические и химические методы биотрансформации клеточной стенки дрожжей имеют ряд недостатков технического и технологического характера и не обеспечивают получение качественного белкового продукта с высокой биологической ценностью Поэтому перспективным направлением является использование ферментативных процессов, которые позволяют в «мягких» условиях получать пищевые белковые добавки с функциональными свойствами для решения проблемы коррекции питания населения и получения сбалансированных биологически полноценных продуктов

Цель и задачи исследования. Цель настоящих исследований состояла в разработке научно обоснованного способа получения белкового препарата на основе направленного ферментативного катализа полимеров клеточных стенок дрожжей Для достижения поставленной цели исследований предусмотрено решение ряда задач - на основе анализа структуры строения клеточной стенки дрожжей и возможных способов ее деградации научно обосновать состав ферментативной системы, необходимой для деструкции дрожжевой клетки и экспериментально исследовать

степень воздействия индивидуальных ферментов на структурообразующие биополимеры клеточной стенки,

- провести сравнительные исследования ферментных препаратов отечественного и импортного производства по составу основных и минорных ферментов комплекса, уровню их активностей и осуществить скрининг наиболее перспективных,

- разработать эффективную мультиэнзимную композицию (МЭК) с научно-обоснованным соотношением ферментов в составе выбранного комплекса для трансформации биополимеров клеточной стенки дрожжей,

- исследовать процессы выделения белковых веществ протоплазмы клеток и разработать принципиальную схему получения белковых продуктов с использованием энзиматической деструкции дрожжевой биомассы с максимально возможным выделением белковых веществ из исследуемого сырья,

- охарактеризовать полученный белковый препарат по биохимическим и функционально-технологическим показателям,

- разработать научно-техническую документацию для производства белкового препарата

Научная новизна работы Получен новый экспериментальный материал, позволивший выявить закономерности биокатализа структурообразующих полимеров клеточной стенки дрожжей Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены состав МЭК и условия ферментативной деструкции полимеров клеточной стенки Выявлен синергизм действия ферментов МЭК, повышающий степень деградации биополимеров На основе установленной зависимости выхода белка от состава МЭК и уровня в нем ферментативных активностей (протеазы, р-глюканазы, маннаназы и хитиназы) разработан принципиально новый способ направленного ферментативного гидролиза клеточной стенок дрожжей с выделением белковых веществ протоплазмы Практическая значимость. Осуществлен скрининг продуктивного по белку штамма дрожжей и разработаны оптимальные МЭКи и условия ферментативной деструкции клеточных стенок

Разработана технологическая схема получения белковых препаратов из биомассы дрожжей ЗассЬагошусез сегеушае, позволяющая

- исключить применение химических реагентов (кислот и щелочей) в результате использования подобранного МЭК для деструкции клеточных стенок,

повысить выход белковых веществ в 7,6 раз в сравнении с технологией без применения ферментативной обработки,

- улучшить качество целевого продукта за счет сохранения полимерности структуры белка и повышения его биологической полноценности,

- получать белковый препарат (67% белка), обладающий влагоудерживающей (1 2,5) и жироудерживающей (1 0,7) способностью

Разработана нормативная документация на технологический процесс и получаемую продукцию (Технологическая инструкция по производству белкового препарата на основе биомассы дрожжей, Технические условия на препарат белковый дрожжевой) Проведены производственные испытания и наработаны опытные партии белкового препарата на Мичуринском экспериментальном заводе и во ВНИТИБП- ЗАО «Биопрогресс»

Апробация работы Основные положения работы были представлены на следующих конференциях

- XII Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы создания продуктов здорового питания Наука и технологии», Углич, 2006 г,

-V Юбилейной школе - конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» Московский Государственный университет пищевых производств, 2007г,

- Научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий», Углич, 2007г,

- X Международной научно-практическои конференции «Актуальные проблемы мясной промышленности инновации, качество, управление», ВНИИ мясной промышленности им В М Горбатова, Москва, 2007г

- Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», ВНИТИБП, Щелково, 2007г

- 4-м Международном научно-практическом симпозиуме «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях», Москва, 2008г

Публикации По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано 7 печатных работ

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы

-Л

и патентов, экспериментальной части, состоящей из 7" глав, выводов, списка литературы, включающего наименования работ отечественных и иностранных

авторов и приложения Диссертация изложена на страницах машинописного

текста, содержит таблиц, /'/ рисунков

Основные научные положения, выносимые на защиту.

- селекционированный штамм 8 сегеУ1Б1ае-265 - перспективный источник белковых веществ,

- анализ и сравнительная характеристика гидролитической способности ферментных препаратов различного спектра действия по отношению к структурным полимерам клеточной стенки дрожжей,

- теоретическое и экспериментальное обоснование состава МЭК и условий биокатализа, обеспечивающих деструкцию клеточной оболочки и выделение белков протоплазмы дрожжей,

- биотехнология получения белкового препарата на основе направленного ферментативного катализа полимеров клеточных стенок дрожжей и научно-экспериментальное обоснование направлений его применения

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2 1 Материалы и методы исследования

Исследования осуществляли в лабораторных и полупромышленных условиях на базе ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии и ВНИТИБП -ЗАО «Биопрогресс»

Объектами исследования служили расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и ферментные препараты различной направленности действия

В работе применяли общепринятые в дрожжевой и ферментной промышленности и специальные физико-химические, биохимические, микробиологические, спектрофотометрические и колориметрические методы анализа В работе также использовали современные методы жидкостной хроматографии («KNAUER»), электрофореза («Вю-Rad Protein»), электронной микроскопии

2.2 Результаты исследований и их обсуждение

2 21 Скрининг дрожжей Saccharomyces cerevisiae по скорости роста и уровню продуктивности белковых веществ

В отделе биотехнологии ферментных препаратов ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии Россечьхозакадемии проведен анализ более 80 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae из коллекции микроорганизмов института

о. и

198 20(1 204 232 235

Штаммы сегс'У!::1яе

Рисунок 1 - Удельная скорость роста дрожжей БассИаготусеэ сегеуЫае

Скрининг перспективных штаммов дрожжей 8ассЬаготусей сегеу1э1ае проводили на основании показателей средних значений удельной скорости роста как фактора, характеризующего белоксинтезирующую способность микроорганизма, при культивировании на стандартных питательных средах с солодовым суслом.

Отобраны 14 штаммов по удельной скорости роста ц (рис. 1), значение которой превышало 0,13 час " . Из них наибольшей удельной скоростью роста обладали штаммы дрожжей № 258, 265 и 267 - 0,1715; 0,1725 и 0,1797 час"' соответственно. При культивировании отобранных 14 штаммов дрожжей на пшеничном сусле подтвердились те же закономерности роста.

Штамм № 265

Штамм № 267

Штамм № 258

Рисунок 2 - Сравнительная характеристика исследуемых штаммов дрожжей по синтезу белковых веществ

Изучены показатели содержания белка в клетках и средние значения скорости роста 3-х отобранных физиологически активных штаммов дрожжей. Показатели скорости роста дрожжей коррелировали с величиной значения содержания белка в биомассе. Наибольшей белоксинтезирующей способностью обладали штаммы 265 (48%), 267 (41%) и 258 (39%) (рис.2). По полученным данным из них выбран штамм дрожжей № 265, который использовали для наработки биомассы в дальнейшей работе.

Исследовано влияние концентрации минеральных солей, значений рН питательной среды, длительность культивирования отобранного штамма на уровень белоксинтезирующей способности микроорганизмов Подобрана питательная среда, основу которой составляло пшеничное сусло (СВ-15%), КНДЬРО^ мочевина, рН 4,05,5 Длительность культивирования составила 12-14 часов

После культивирования дрожжей рост останавливали термолизом культуральную жидкость нагрели до 90°С и по достижении этой температуры выдерживали 20-25 минут При этом происходила инактивация внутриклеточных ферментов дрожжей, особенно протеолитического действия, что необходимо для сохранения полимернои структуры белковых веществ клетки

2.2.2 Подбор мультиэнзимного комплекса для эффективной деструкции полимеров клеточной стенки дрожжей

Для получения микробного белка пищевого достоинства необходимо разрушить клеточную стенку дрожжей с максимальным сохранением нативнои структуры белка Использование ферментативного катализа полимеров дрожжевой клетки позволит создать условия целенаправленного получения продукта заданного состава на основе контролируемого процесса

Клеточные стенки дрожжей имеют слоистую структуру (рис 3) Внешний слой клеточной стенки представляет собой гладкую мембрану, под ним лежит маннано-протеиновый комплекс Во внутреннем слое расположены аморфные маннаны, структурообразующие Р-глюканы и протеины, ковале! ггно связанные сеткой из микрофибрилл, состоящих из глюканов

Фибриллярный слой

<

Цитоплазма

Внешний маннано-протеиновый слой

Внешний глюкановый слой

Слой с повышенным содержанием белка

Внутренний глюкановый слой с хитином

Цито плазматическая мембрана

Рисунок 3 - Строение клеточной стенки дрожжей

Проведенные теоретические исследования и результаты научно-экснериментальных работ дают основания считать, что для выделения белков протоплазмы дрожжей на первой стадии необходимо максимально повысить проницаемость клеточных стенок и осуществить деструкцию полимеров белково -глюканового комплекса, что достигается путем использования протеиназ эндодействия в комплексе с |3-глюканазой Разрушение оболочки дрожжевой клетки на первой стадии обработки биомассы должно привести к высвобождению полисахаридов клеточных стенок из белковых комплексов, повышению атакуемости глюканазами и маннаназами на второй стадии ферментолиза, а также к освобождению внутриклеточных белков из белково-полисахаридных матриксов

После первой стадии ферментолиза необходимо проведение последующей инактивации экзопротеаз и остаточных внутриклеточных ферментов, катализирующих п»д-ролиз по пептидным связям, во избежание разрушения белков протоплазмы с целью обеспечения сохранения полимерной структуры высвобождающихся белков протоплазмы

На второй стадии для осуществления более глубокой деструкции клеточной стенки, целесообразно использование ферментов р-глюканазного, хитиназного и маннанолитического действия Ферментативная обработка биомассы на второй стадии не должна затрагивать освобождающиеся белки протоплазмы, но должна обеспечивать глубокую биотрансформацию оболочки в результате гидролиза полисахаридных полимеров клеточных стенок

2.2.3 Подбор ферментных систем для биокатализа полимеров клеточных стенок

дрожжей

2.2 3 1 Модельные опыты по биокатализу полисахаридов клеточных стенок

На первом этапе исследований изучали специфичность действия ферментных препаратов (ФП), различающихся по составу ферментативного комплекса и микробным происхождением В качестве субстратов использовали 1%-ные растворы полисахаридов, участвующих в структурообразовании клеточной стенки дрожжей, таких как глюкан и маннан из дрожжей 8ассЬагошусез сегеу^те, а также коллоидный раствор хитина из панцирей крабов В ходе эксперимента изучали накопление продуктов гидролиза полимеров глюкана, маннана, хитина (по концентрации восстанавливающих Сахаров) Из 21 исследованных ФП были отобраны препараты, обладающие наибольшей активностью по отношению к указанным субстратам

Исследовали гидролитическую способность ферментных препаратов различной специфичности действия при 50°С в течении 1 часа

ферментный препарат грибных пептидаз и протеиназ с преобладающей протеолитической активностью (ФП|),

9

препарат р-глюканазы, хитиназы, маннаназы (ФП2); препарат- источник маннаназы, (З-глюканазы, хитиназы (ФП3); препарат бактериальной протеазы, содержащий протеиназы, хитиназу (ФП4). Результаты представлены на рисунке 4.

Полученные результаты позволяют выделить препараты: ФП2 как наиболее активный катализатор по отношению к |3-глюкану и хитину, ФП3- к маннану и хитину. Гидролитическая способность препаратов-источников ферментов нротеолитического действия по степени воздействия на маннан и хитин практически не различается, но при деструкции глкжана наибольшее количество продуктов гидролиза отмечалось при использовании ФП4, чем ФП].

а

£ о о to R

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Маннан

Глюкан

Хитин

□ ФП1 ВФП2 ШФПЗ ВФГ14

Рисунок 4 - Эффективность действия различных ферментативных систем на степень деструкции полисахаридов - структурообразователей клеточной стенки

2.2.3.2 Модельные опыты по биокатализу полимеров клеточной

стенки дрожжей под действием различных ферментативных систем

На данном этапе работы исследовали влияние протеаз и гемицеллюлаз на степень гидролиза клеточных стенок дрожжей. Исследования проводили на примере препарата клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae («Sigma»), а также

непосредственно на суспензии дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. В качестве катализаторов использовали ранее описанные комплексные ферментные препараты отечественного производства ФП], ФП2, ФП3, ФП4, а также ФП5- источник только гемицеллюлаз, и ФП6 - источник протеаз, не содержащий гемицеллюлаз.

Оценивали эффективность действия препаратов по накоплению продуктов гидролиза полимеров клеточных стенок: редуцирующих Сахаров и растворимых

белковых веществ при 50°С, время экспозиции составляло 1час Результаты представлены в таблице 1

Проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что при гидролизе клеточных стенок дрожжей наибольшее количество высвобождаемых белковых веществ отмечается при использовании комплексных препаратов ФП, (36, 7 мг/г с в), затем ФП3 и ФГ12 Наименьшее количество белковых веществ выделялось при использовании ФП4 в 2,3 раза меньше, чем в случае использования препарата протеолитического действия грибного происхождения ФП) При этом, степень деструктивного воздействия исследуемых препаратов непосредственно на биомассу дрожжей с целью выделения белковых веществ была практически на одном уровне (40,4-53,4 мг/г с в ) (табл 1)

Таблица 1- Эффективность гидролиза биополимеров дрожжевой клетки ФП различной специфичности действия_

Ферментный препарат Клеточные стенки Суспензия клеток дрожжей

РВ, мг/г с в Растворимые белковые вещества, мг/г с в РВ, мг/г с в Растворимые белковые вещества, мг/г с в

ФП, 1,32 36,7 22,59 53,4

ФП2 12,8 25,2 34,3 50,1

ФПз 12,2 28,6 26,6 40,4

ФП4 1,5 15,9 19,6 44,8

ФП5 (без протеаз) 10,1 7,5 28,5 42,0

ФП6 (без гемицеллюлаз) 0,6 14,3 6,5 31,0

Комплекс протеаз и гемицеллюлаз 22,8 48,5 51,3 56,9

На образовании продуктов гидролиза полисахаридов - структурных компонентов клеточной стенки дрожжей - наиболее эффективно отразилось действие препаратов, содержащих в составе (3-глюканазу, маннаназу и хитиназу ФП2 и ФПз Эта зависимость подтвердилась при использовании в качестве субстрата, как суспензии клеточных стенок, так и биомассы дрожжей (содержание редуцирующих Сахаров в пределах 12,812,2 мг/г - для стенок дрожжей, 26,3- 34,3 мг/г с в - для биомассы, соответственно)

При исследовании эффективности воздействия на клеточные стенки и биомассу дрожжей ФП гемицеллюлазного действия (ФП5), не содержащего протеаз и ФПб протеолитического действия, не содержащего (З-глюканаз и маннаназ, отмечена более низкая их каталитическая способность по отношению к исследуемым субстратам Совместное использование ФП протеолитического и гемицеллюлазного действия способствовало более эффективному гидролизу полимеров клеточных стенок дрожжей,

что свидетельствует о синергизме их действия. Полученные результаты подтверждают правильность предложенного ранее направления исследований.

2.2.3.3 Модельные опыты, направленные на подбор оптимальной мультиэнзимной композиции для эффективного катализа полимеров клеточных стенок дрожжей

Изучали возможность подбора мультиэнзимной композиции (МЭК) для эффективного гидролиза клеточной стенки путем составления различных комбинаций ферментов и оценивали вклад каждого фермента, воздействующего на полимеры клеточной стенки дрожжей.

Эффективность применения различных ферментов и их комплексов изучали на основании данных о накоплении в гидролизатах белковых веществ, редуцирующих Сахаров и аминного азота (рис. 5).

хитиназа протеаза глюканаза глюканаза+ глюканаза+ глюканаза+

протеаза протеаза+ протеаза+ хитиназа хитиназа+ маннаназа

Рисунок 5 - Эффективность действия ферментов различного спектра действия и их комплексов на степень биодеградации структурных полисахаридов клеточной стенки дрожжей

Полученные данные свидетельствуют об эффективности действия ферментов р-глюканазного, протеиназного, хитинолитического и маннанолитического действия при деструкции клеточной стенки дрожжей. Применение МЭК, включающего вышеупомянутые ферменты позволяет значительно увеличить выход белка (на 37,1122,3%) по сравнению с использованием индивидуальных ферментов, а также положительно влияет на накопление редуцирующих Сахаров и аминного азота (рис. 5) как продуктов гидролиза биополимеров клеточной стенки дрожжей.

12

2.2.4 Исследование процессов ферментативной деструкции клеточных стенок дрожжей при получении препаратов белка

2.2.4.! Исследование процессов деструкции р-глюканов и белковых полимеров клеточных стенок дрожжей (1 стадия)

В качестве источников протеолитического фермента использовали препараты, в составе ферментного комплекса которых преобладали ферменты протеиназного действия, во избежание глубокой деструкции белковых составляющих клеточной стенки.

Как видно из представленных на рис. 6-8 результатом, наибольшее увеличение выхода белковых веществ в гидролизат наблюдается при использовании ферментативного комплекса, дозируемого из расчета 0.2 ед протеолитического фермента (ед ПС) и 80 ед |3-глюканазы (ед ГкС) на 1 г с.в. дрожжей.

3 9,5

§ 9

I 8,5

а. 8

Г 7,5

«1 -

5 7

§ 6,5

I «

си о

^ 45

^ 4

Р5" "5 5

° 3

О 0 ед ГкС О 20 ед ГкС О 40 ед ГкС □ 60 ед ГкС Н 80 ед ГкС □ 100 ед ГкС

Рисунок 6- Изменение содержания экстрактивных веществ в супернатанте при различных дозировках ферментов в составе комплекса

О 0,1 0,15 0,2 0,3 0,5 5

Дозировка протеолитического фермента, ед ПС/г дрожжей

ШОедГкС □ 20 ед ГкС @40едГкС ПбОедГкС В 80 ед ГкС ЕЭЮОсдГкС

Дозировка протеолитического фермента, ед ПС/г дрожжей

Рисунок 7 - Эффективность действии композиции ферментов протеазы глюканазы для выделения белковых веществ из дрожжевой биомассы

0,51 0,46 0,41 0,36 0,31 0,26 0,21 0,16 0,11 0,06 0,01

0 0,1 0,15 0,2 0,3

Дозировка протеолитического фермента, ед

0,5 5

ПС/г дрожжей

-»- 0 ед ГкС -а- 20 ед ГкС —а— 40 ед ГкС

-в-60 ед ГкС -*- 80 ед ГкС -»- 100 ед ГкС

Рисунок 8 - Влияние состава комплекса ферментов на выход белковых веществ из дрожжевой биомассы

Увеличение дозировки протеазы до 5 единиц ПС на 1 г дрожжей также позволяет увеличить выход белковых веществ, но со значительным изменением полимерности структуры, о чем свидетельствует резкое повышение выхода аминокислот и пептидов, \ не осаждаемых раствором ТХУ (рис. 9).

Дозировка протеолитического фермента, ед ПС/г дрожжей

-*- 0 де I кС —.з- 20 ед ГкС -л- 40 ед ГкС

-в- 60 ед ГкС —Ж— 80 ед ГкС 100 ед ГкС

Рисунок 9 - Накопление аминокислот и пептидов в процессе гидролиза биомассы дрожжей при различных дозировках протеолитического фермента

Анализ действия выбранной композиции ферментов (0,2 ед ПС+80 ед ГкС) позволяет сделать вывод, что на начальной стадии экстракции белковых веществ из биомассы дрожжей отмечается выход более низкомолекулярных фракций белка (дозировка протеазы в пределах 0,15 ед ПС/г дрожжей), о чем свидетельствует нарастание содержания аминокислот и коротких пептидов, не осаждаемых ТХУ. При дозировке протеолитического препарата 0,2 ед ПС/г дрожжей практически не происходит существенного увеличения образования низкомолекулярных фракций (рис.9). При этом отмечается нарастание белковых веществ в среде (рис.8), что позволяет сделать вывод об извлечении высокомолекулярных белков за счет более глубокого гидролиза клеточной стенки. Дальнейшее увеличение дозировки | протеолитического фермента приводит к увеличению содержания общих белковых ■I веществ, но также и к деструктивным изменениям последних, о чем свидетельствует увеличение содержания аминокислот и пептидов с низкой молекулярной массой (рис.9).

Исследовали динамику накопления экстрактивных и белковых веществ, а также | накопление редуцирующих углеводов (РВ) в процессе ферментативного катализа. ' Длительность ферментативного воздействия на полимеры клеточной стенки варьировали от 15 до 75 мин.

3 „

й § 5

а § *

I

I 4

й)

3*

сз

3 2

О

□ Содержание растворимых

сухих веществ, " %

7] Ш Содержание | — растворимых * углеводов, мг/г! _ с.п.

Водный гидролиз

15 мин 30 мин 45 мин 60 мин 75 мин 90мин

75 мин 90 мин

!Белок методом Лоури

Рисунок 10 - Влияние длительности обработки протгопитическим ФП дрожжевой биомассы на извлечение растворимых сухих веществ и углеводов

Наибольший выход белковых веществ наблюдался при экспозиции в течение 60 мин, дальнейшее продолжение ферментолиза (до 75 мин и более) приводило к повышению экстрактивности растворимых веществ, увеличению накопления РВ (рис. 10) и, гго-видимому, к некоторому нарушению полимерной структуры белковых молекул, т.к. отмечается некоторое увеличение выхода белковых веществ, определяемых методом Лоури, но при этом снижается выход белка, определяемого методом Бредфорда, который в свою очередь, как известно, отражает полимерность белковых молекул (рис. 11). Поэтому, оптимальной длительностью воздействия протеаз является 60 минут при дозировке 0,2 ед ПС/ г дрожжей.

О Белок методом Бредфорда

Рисунок 11 - Влияние продолжительности обработки дрожжевой биомассы протеояитическим ферментным препаратом в комплексе с Р-глюканазным ферментом на выход белка

С целью повышения степени деструкции клеточных стенок исследовали влияние предварительной обработки дрожжевой биомассы методом кислотного гидролиза на выход белковых веществ Исследованы различные условия проведения «щадящего» кислотного гидролиза, чтобы не нарушить биологическую ценность получаемого целевого продукта Наиболее эффективными были условия, соответствующие рН -2,0, температуре воздействия - 65°С, длительности -1 час

Таблица 2 Влияние комбинированного метода обработки биомассы дрожжей с применением кислотного гидролиза и фермешполиза

Вариант обработки Дозировки ФП св, % Редуцирующие сахара, г/100 мл Выход белковых веществ, мг/100 мл

Концентрация белковых веществ, мг/100 мл % выхода белковых веществ от первоначального содержания в дрожжах

ДоТХУ После ТХУ (аминокислоты и короткие пептиды)

Кислотный гидролиз 65 °С, 1 час, рН-2,0 Ферментолиз 55°С, 1 час, 0,2 ед ПС/1 г с в + 80 ед Р-ГкС/1г с в 8,6 2,3 0,426 0,29 9,1

Ферментолиз 55°С, 1 час 0,2 ед ПС/1 г с в + 80 ед р-ГкС/1гс в 7,9 2,31 0,384 0,251 8,2

В результате проведенных экспериментов существенного повышения выхода белка не было установлено Показатели различались в пределах 10% при одинаковых дозировках гидролитических ферментов (таблица 2)

Таким образом, для осуществления I стадии деструкции клеточной оболочки подобран состав МЭКа, концентрация ферментов в составе комплекса и условия воздействия ферментов на биополимеры клетки комплекс р-глюканаз и протеиназ (0,2 ед ПС+80 ед Р-ГкС), время 60 мин, рН-5,5-6,0, температура ферментации-50°С

2 2 4 2 Исследование процессов деструкции полисахаридов клеточных стенок

дрожжей (II стадия)

Для повышения эффективности ферментолиза клеточной стенки дрожжей на

следующем этапе работы подбирали дозировку Р-глюканазы для гидролиза более глубоких слоев стенки

В работе использовали комплексные препараты, содержащие ферменты как (5-глюканазного, так и маннано- и хитинолитического действия

В качестве контрольных вариантов рассматривались водная экстракция белковых веществ (вариант без применения ферментолиза), а также гидрочиз биомассы дрожжей под действием гидроокиси натрия как наиболее «агрессивного» агента, используемого для разрушения клеточной стенки

Таблица 3 Влияние дозировки р-глюканазы на II -ой стадии ферментолиза на состав получаемых гидролизатов

о. се Я % Ферментативный комплекс для I стадии обработки, ед активности/ г СВ Дозировка Р-глюканазы для II стадии обработки, ед Р-ГкС/ г СВ РВ, г/100 мл Количество аминного азота, мг% Масса белковых веществ, г/100 мл % выхода общих белковых веществ от исходного содержания в дрожжах % выхода белка, имеющего полимер-ную структуру.от исходного содержания белковых веществ в дрожжах

До ТХУ (общие >елковые вещества После ТХУ 1 (аминокислоты, короткие

1 Без обработки ферментами 1,27 28 0,154 0,134 3,4% 0,5%

2 Гидролиз с применением 1N раствора ЫаОН 1,93 66,5 1,473 1,326 30,4% 3,1%

3 0,2 ед ПС 1,46 31,5 0,2 0,0835 2,62 % 1,4%

4 0,2 ед ПС 80 ед ГкС - 2,3 35,0 0,384 0,251 8,2% 2,5%

5 0,2 едПС 80 ед ГкС 80 2,9 38,5 0,491 0,247 10,4% 5,2%

6 0,2 ед ПС 80 ед ГкС 150 3,5 40,2 0,508 0,237 10,5% 5,6%

7 0,2 ед ПС 80 ед ГкС 300 3,71 52,5 1,24 0,371 25,8% 18,8%

8 0,2 ед ПС 80 ед ГкС 600 6,7 52,5 1,343 0,535 26,8% 15,6%

Исходная суспензия 0,3 12,2 0,147 0,0869 2,58% 1,1%

Как видно из результатов представленных в таблице 3, наиболее эффективная дозировка для глубокого гидролиза клеточной стенки дрожжей составляет 300 ед р-ГкС/ г с в дрожжей, включающая также 6,2 ед мананнолитической и 0,44 ед хитинолитической активности При данной дозировке наблюдается наиболее высокий выход белковых веществ (25,8% - при водной экстракции), аминного азота (52,5 мг%)

МЭК использовали в виде смеси ферментных препаратов, дозируя их по активности в указанных соотношениях Ферментативный гидролиз дрожжевой биомассы проводили в две стадии сначала гидролизовали клеточные стенки при 55°С в течение 2 ч, используя комплекс протеиназ и р-глюканаз, экзо- и эндодействия, а затем температуру повышали до 85-95°С и выдерживали в течение 10-20 мин для инактивации протеиназ После температурной обработки дрожжевую суспензию охлаждали до 50-55°С и задавали МЭК, состоящую из экзо- и эндо-(3-глюканаз, маннаназы и хитиназы при периодическом перемешивании и выдерживали в течение 2-4-х часов

Контроль за процессом осуществляли по нарастанию экстрактивных веществ, РВ, и растворимых белковых веществ

По окончании ферметолиза инкубационную смссь центрифугировали и из супернатанта выделяли белковые компоненты дрожжей известными методами

Описанная схема обработки дрожжевой биомассы позволяет повысить проницаемость клеточной оболочки дрожжей, увеличить степень деструкции структурообразующих полимеров клеточных стенок, максимально сохранить структуру белковых веществ протоплазмы дрожжей

По результатам работы подобрана композиция ферментов для эффективного гидролиза клеточных стенок дрожжей с целью извлечения белковых веществ (рис 12)

00,2 ед ПС

□ 50 едГкС

О0,2 едПС, 80 едГкС

0 0,2сдЛС, 80 ед

Выход СВ, % Количество Выход белковых ГкС+ЗОО ед ГкС

аминного азота, веществ от мг% исходного

содержания в сырье, %

Рисунок 12- Сравнительная характеристика действия подобранного МЭК на показатели фермептолизатов

На основании полученных данных, представленных на рис 12, можно сделать вывод о том, что применение подобранного мульгиэнзимного комплекса на Н-ой стадии деструкции клеточной стенки дрожжей наиболее эффективно для извлечения гидрофильных фракций белков

2 2.5 Выделение белковых веществ из биомассы дрожжей

2.2.5.1 Осаждение белковой фракции

На следующем этапе работы изучали условия выделения белкового препарата Исследовали влияние различных наиболее часто используемых осадителей (спирт этиловый, ацетон, хлористый кальций) для 3-х видов обработки дрожжевой биомассы ферментативной, щелочной и водной Результаты представлены в таблице 4

Таблица 4 - Влияние различных видов осаждающих агентов на коагуляцию белковых молекул

№ Вариант обработки дрожжевой биомассы Осадитель белка

Спирт Ацетон Хлористый кальций

1 Ферментативный гидролиз, рН- 5,61 67,0 % * 62,5 %* Степень осаждения незначительна

Темно-коричневые осадки, рыхлые

2 Щелочной гидролиз, рН-10,57 65,5 %* 61,0%* Осадок белого цвета-гидроокиси кальция

Светло-коричневые осадки, плотные

3 Водная экстракция, рН-5,13 55,0 %* 53,0 %* Степень осаждения незначительна

*-количество сухих веществ в осадке от начального содержания с в в супернатанте

Исследовали характер и количество образующихся осадков после обработки дрожжевых гидролизатов различными осаждающими агентами Для контрольного выбора осадителя определяли остаточное содержание белковых веществ в надосадочной жидкости после коагуляции белка под действием спирта и ацетона (рис 13)

По результатам экспериментов для осаждения белка были использованы спирт этиловый и ацетон

120 100 80 60 40 20 .0

спирт ацетон спирт ацетон спирт ацетон

□ Концентрации белка в растворе после осаждения,% от первоначального содержании

О Концентрация белка в растворе до осаждении, припшан

ш 100 %

ФЕРМЕНТ л тивныи гидролиз

щелочной

гидролиз

водная экстракция

Рисунок 13 - Влияние различных осадителей на потери белка при осаждении

Представленные на рисунке 13 результаты исследований супернатанта, полученного после коагуляции белка под действием спирта и ацетона, позволяют сделать вывод о том, что при проведении ферментативного гидролиза в случае использования спирта этилового в качестве осаждающего агента отмечаются меньшие потери белка, чем с ацетоном: остаточное содержание белковых веществ в надосадочной жидкости составляет 11,5 -16,8% и 12,1-17,3 соответственно. В то же время, при проведении щелочного гидролиза эти показатели выше. Проведение ферментативного катализа клеточных стенок и использование этилового спирта для выделения белковых веществ протоплазмы позволяет максимально извлечь белок из дрожжевой биомассы.

Полученные экспериментальные данные показали перспективность ферментативной обработки дрожжевой биомассы, а также позволили выбрать способ выделения белкового препарата, который явился объектом дальнейших исследований. В таблице 5 приведена биохимическая характеристика полученного белкового препарата.

Таблица 5- Биохимическая характеристика белкового препарата

Показатель Значение показателя, %

- содержание белковых веществ, методом Лоури

(% на АСВ) 67,2

ВУС. г воды/г препарата 2,58

ЖУС, г масла/г препарата 0,72

- содержание углеводов 12,9

- жиры следы

- зола 10,5

2 2 5.2 Фракционирование белковых веществ дрожжей

Известно, что содержание белковых веществ в дрожжевой биомассе варьируется в пределах 35-50% Поэтому, представилось интересным изучить возможность максимального извлечения белковых веществ дрожжей путем экстракции различных фракций белков, основываясь на их поведении в разных растворителях

Исследования проводили после предварительного гидролиза биомассы дрожжей ранее подобранной МЭК

В качестве контрольного варианта рассматривали экстракцию белков без использования ферментативной обработки дрожжевой биомассы (нулевая точка) В ходе эксперимента варьировали температуру проведения ферментативного гидролиза в пределах 45-55°С Степень извлечения белковых веществ детектировали методом Лоури

Таблица 6 Влияние различных растворителей на фракционный состав белковых

веществ дрожжевой биомассы

№ Природа экстрагента Извлекаемая фракция Концентрация белка, мг/мл

45°С* 50°С* 55°С* Контроль

1 Вода Альбумины 12,1 12,4 12,4 0,6

2 20% Ыа2С03 в 0,1Н ИаОН Глобулины 8,5 7,1 7,2 9,67

3 70% этиловый спирт Проламины 2,3 2,6 2,5 2,91

4 1М раствор уксусной кислоты Кислая фракция глютелинов 0,13 0,13 0,13 0,19

5 1Н раствор №ОН Щелочная фракция глютелинов 7,5 11,0 11,3 12,83

Суммарное количество белковых веществ в суспензии (концентрация белковых веществ, мг/мл супернатанта) 35,1 37,9 38,2 26,2

Выход белковых веществ, мг 897,6 950,2 942,9 637,3

% извлечения общего количества белковых веществ после многостадийной экстракции от исходного содержания белковых веществ в дрожжах 44,7 47,3 46,9 31,5

* температура проведения ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы

По результатам работы, наряду с водной экстракцией, выявлено эффективное действие солевого и щелочного экстрагента для извлечения альбуминов, глобулинов и щелочной фракции глютелинов, соответственно (табл 6) При этом показано низкое содержание проламиновой фракции и кислой фракции глютелинов Отмечено, что оптимальной температурой проведения ферментативного катализа является 50°С

2 2 6 Исследования функционально-технологических свойств белковых препаратов из дрожжевой биомассы

Для рекомендации полученного препарата из дрожжей ЬассИаготусеу сегечтае-265 в качестве белково-аминокислотного обматителя пищи необходимо из>чить его функционально-технологические свойства (влаго- и жироудерживающую способности, аминокислотный состав) Аминокислотный состав полученною белкового препарата представлен на рис 14

□ Общие АК (общее количество 63,7 г/100г продукта)

□ Свободные АК (общее количество 0,57г/100г)

дЛ

АСП ТРЕ СЕР ГЛУ ГЛИ АЛА ВАЛ ЦИС МЕТ ИЗО ЛЕЙ ТИР ФЕН ЛИЗ ГИС АРГ ПРО

Рисунок -14 - Биохимическая характеристика белкового препарата из дрожжей Ъасскаготусеъ сеге\тае-265

Результаты электрофоретического анализа (рис 15) показали наличие белков с молекулярной массой 75 кДа Более того, из электрофореграммы видно, что в процессе

ферментативного гидролиза происходит очистка белковых фракций от небелковых составляющих, т.к. не отмечается наличие примесей.

Полученные данные подтверждают результаты проведенных исследований, что разработанный способ направленного биокатализа полимеров клеточных стенок позволяет получать препарат дрожжевого белка с сохранением полимерной структуры белковых веществ и достаточно эффективно очищать от примесей.

шш

ММ=76-78 кДа М М=66,25 кДа

ММ =42 к Да ММ=30 кДа

ММ=17,2 кгДа

II

белки-

маркеры

Рисунок 15- Электрофорез в полиакриамидном геле

12,5 % р-р ПА геля

Исследования функционально-технологических свойств белкового препарата из дрожжей, полученного в условиях ВНИТИБП- ЗАО «Биопрогресс», позволили установить, что полученный препарат обладает влагоудерживающей способностью (1:2,58) и жироудерживающей способностью (1:0,72). Препарат содержит 67,2% белка, 12,9 % углеводов. Сохранена полимерная структура белка и его биологическая полноценность, о чем свидетельствуют данные аминокислотного анализа (рис.14) и электрофореза (рис. 15).

Таким образом, проведенные исследования позволили выбрать наиболее продуктивный по белку штамм дрожжей ЕассЬаготусеъ сегеУ1Я1ае -265, подобрать ферментативную систему, обеспечивающую эффективную деструкцию клеточных стенок дрожжей для извлечения белка протоплазмы, а также выявить преимущество использования этилового спирта в качестве осадителя с целью получения концентрированного препарата - источника белка и аминокислот.

По результатам исследований предложена следующая схема получения белкового препарата на основе ферментативного катализа клеточных стенок дрожжей Басскаготусез сегеУ1Я1ае:

Микробная биомасса

Термолиз

Протоиназа а-Глюканаза ;

Р-глюканаза Маннаназа Хитиназа

Инактивация прслеолитического фермента

I стадия ферментолиза клеточных стенок

II стадия ферментолиза клеточных

белковый препарат

Рисунок 16- Схема ферменточиза биомассы дрожжей ^асскаготусеа еегс\>шае-265 для получения белкового препарата

Изучение функционально-технологических свойств полученного препарата позволяет предложить его как в качестве белкового обогатителя, так и в качестве технологической добавки, способствующей не только повышению биологической ценности, но и улучшению функциональных и потребительских свойств продуктов питания в мясоперерабатывающей, молочной, хлебопекарной, кондитерской и других отраслях пищевой промышленности

3 ВЫВОДЫ

1 Осуществлен скрининг дрожжей, обладающих высокой скоростью роста (0,170,18 час ') и белоксинтезирующей способностью (содержание белка 39-48%)

2. Проведены сравнительные исследования гидролитической способности ФП различного спектра действия по отношению к структурным полимерам клеточных стенок дрожжей и осуществлен выбор наиболее перспективных, содержащих в составе комплекса ферменты протеолитического, Р-глюканазного, маннанолитического и хитинолитического действия, необходимых для катализа белково-полисахаридных полимеров клеточной оболочки

3 Разработаны условия проведения ферментативного гидролиза клеточных стенок, включающие две стадии и использование двух МЭК

- для I стадии ферментолиза МЭК-1- 0,2 ед ПС+ 80 ед 0-ГкС при 50°С, длительность ферментолиза 1 час,

- для II стадии ферментолиза МЭК- II- 300 ед р-глюканазы+ 6,2 ед маннаназы+0,44 ед хигиназы при 50°С, в течение 2 часов,

4 Разработана принципиальная схема производства препарата белка, апробированная в промышленных условиях МЭЗ и ВНИТИБП -ЗАО «Биопрогресс» Наработаны экспериментальные образцы белкового препарата, содержащего 63-67% белковых веществ и изучены его аминокислотный состав, а также функционально-технологическая характеристика (ВУС=2,58 г воды/г препарата, ЖУС= 0,72 г масла/г препарата)

5 Научно обоснована целесообразность использования белкового препарата для повышения качества биологической полноценности пищевои продукции

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании полученных в результате исследований материалов разработаны Технологическая инструкция по производству белкового препарата из биомассы дрожжей от 13 03 08, Технические условия на препарат белковый из дрожжей ТУ № 9182-093-00334586-2008

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1 Римарева Л В, Курбатова Е И , Юскина О Н Исследование возможности использования дрожжей ЗассЬаготусеБ сегеу^те для получения белковых дрожжевых изолятов путем ферментативной обработки биомассы дрожжей // Сборник материалов XII Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы создания продуктов здорового питания Наука и технологии», Углич, 2006г, с 199-201

2 Юскина О.Н , Римарева Л В , Курбатова Е И Скрининг дрожжей 8 сегеушае-продуцентов белка и исследование биокатализа структурных компонентов клеточной стенки дрожжей при получении белково-аминокислотных препаратов // Журнал «Хранение и переработка сельхозсырья», Москва, 2007, № 6, с 43-45

3 Юскина О Н, Римарева Л В , Курбатова Е И Разработка эффективного способа получения белковых изолятов на основе ферментативного катализа полимеров клеточной стенки дрожжей // Тезисы V Юбилейной школы -конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» Московский Государственный университет пищевых производств, Москва, 2007г, с 232-236

4 Римарева Л В , Курбатова Е И , Юскина О Н , Соколова Е Н , Климачева Л М Мультиэнзимная система для гидролиза биополимеров клеточной стенки дрожжей с целью получения белковых изолятов для пищевой промышленности// Сб материалов научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследовании - основа развития современных аграрно-пищевых технологий», Углич, 2007г, с 287-290

5 Юскина О Н, Курбатова Е И , Римарева Л В Скрининг перспективных источников микробного белка и изучение влияния различных ферментативных систем на процессы биокатализа полимеров клеточных стенок микробной биомассы с целью поиска оптимального мультиэнзимного комплекса и условий деструкции клеточных стенок для выделения белка протоплазмы// Сб статей X Международной научно-практическои конференции «Актуальные проблемы мясной промышленности инновации, качество, управление», ВНИИ мясной промышленности им ВМ Горбатова, Москва, 2007г, с 150-153

6 Римарева Л В, Юскина О Н, Курбатова Е И Исследование процессов биокатализа полимеров клеточных стенок микробной биомассы с целью получения белкового препарата // Сб материалов международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2007г, с 308-310

7 Римарева Л В , Курбатова Е И, Юскина О Н., Соколова Е Н , Климачева Л М Влияние различных ферментативных систем на процессы биокатализа полимеров клеточных стенок дрожжей с целью получения оптимального мультиэнзимного комплекса для деструкции полимеров полимеров клеточных стенок // Сб научных трудов 4-го Международного научно-практического симпозиума «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях», Москва, 2008г, с 115-121

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юскина, Ольга Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И ПАТЕНТОВ

1.1 Мониторинг перспективности выбранного направления исследований

1.2 Микроорганизмы как продуценты белка

1.2.1 Рост и развитие микробных культур

1.2.2 Фазы роста микроорганизмов при периодическом 27 культивировании

1.2.3 Двухфазность развития популяций в условиях процесса 29 брожения

1.3 Структура клеточной стенки и биохимический состав 30 дрожжевой клетки

1.4 Перспективные способы деструкции клеточной стенки 40 дрожжей

1.5 Основы ферментативного гидролиза клеточной стенки 46 дрожжей

1.6 Применение белковых препаратов, полученных на 51 основе микробной биомассы в пищевой промышленности

1.6.1 Использование цельной биомассы

1.6.2 Использование частично облагороженной биомассы 52 микроорганизмов

1.6.3 Белковые изоляты

1.6.4 Использование аминокислотных смесей в качестве 54 пищевых и биологически активных добавок

Глава П ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1 Методы определения биохимических показателей

2.2.2 Методы определения каталитической 62 способности ферментных препаратов

2.2.3 Методы определения функциональных 66 характеристик получаемых продуктов

2.2.4 Методика математической обработки 68 экспериментальных данных

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава Ш СКРИНИНГ ДРОЖЖЕЙ вассЬаготусев сегеушае

НАИБОЛЕЕ ПЕРСПЕКТИВНОГО ПРОДУЦЕНТА БЕЛКА

3.1 Изучение продуктивности штаммов хлебопекарных дрожжей

3.1.1 Отбор штаммов дрожжей, отличающихся 70 высокой скоростью роста

3.1.2 Влияние начальной концентрации растворимых 73 углеводов в сусле на скорость роста и накопление биомассы дрожжей

3.1.3 Исследование влияния рН пшеничного сусла на 85 скорость роста и накопление биомассы дрожжей ЗассИаготусеБ сегеу1з1ае

3.1.3.1 Влияние различных значений рН на скорость роста дрожжей в разных точках кривой роста

3.1.3.2 Влияние исходных значений рН пшеничного 89 сусла на скорость роста и накопление биомассы дрожжей БассИаготусез сегеу!з1ае

3.1.4 Исследование влияния различных солей, 90 внесенных в пшеничное сусло, на скорость роста и накопление биомассы дрожжей

Глава IV ИЗУЧЕНИЕ БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ 97 ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ РАЗЛИЧНОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

4.2.1.1 Модельные опыты по биокатализу полисахаридов 106 клеточных стенок

4.2.1.2 Модельные опыты по биокатализу полимеров 108 клеточной стенки дрожжей под действием различных ферментативных систем

Определение состава ферментного комплекса 100 ферментных препаратов микробного происхождения

Изучение механизма гидролиза клеточной стенки 105 дрожжей с применением ферментных препаратов Модельные опыты по биокатализу 105 индивидуальных субстратов — структурных полимеров клеточной стенки дрожжей

4.2.1.

Модельные опыты, направленные на подбор оптимальной мультиэнзимной композиции для эффективного катализа полимеров клеточных стенок дрожжей

4.2.2 Исследование процессов ферментативной деструкции клеточных стенок дрожжей при получении препарата белка (I стадия)

4.2.2.1 Исследование процессов деструкции ß-глюканов 116 и белковых полимеров клеточных стенок дрожжей (I стадия)

4.2.2.2 Изучение динамики деструктивных воздействий 124 ферментных препаратов на клеточную стенку дрожжей на I стадии ферментолиза

4.2.2.3 Исследование процессов деструкции 128 полисахаридов клеточных стенок дрожжей (II стадия)

4.2.2.4 Изучение возможности повышения 134 проницаемости клеточной стенки дрожжей поверхностно-активными веществами

4.3 Результаты электронно-микроскопического исследования дрожжевых клеток после воздействия ферментных препаратов

Глава V ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ БИОМАССЫ 139 ДРОЖЖЕЙ ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО

ГИДРОЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК

5.1 Подбор эффективного осадителя для извлечения белковых фракций из супернатанта

5.2 Фракционирование белковых веществ дрожжей

Глава VI ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНО

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА ИЗ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ

Глава VII ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологического способа получения препаратов белка из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae на основе направленного ферментативного гидролиза клеточных стенок"

Актуальность. Актуальность выбранного направления исследований обусловлена сложившимся дефицитом белка в структуре питания населения России. Продовольственная проблема, связанная с недостатком биологически полноценных продуктов, со временем не только не теряет своей остроты, но и становится одной из актуальнейших. Эффективность решения этой проблемы определяется использованием качественно новых методов производства пищи, а также привлечением новых сбалансированных источников пищевого белка, одним из которых является белок микроорганизмов. Работы многих ученых посвящены вопросам изучения возможности использования микроорганизмов как источников белковых веществ (Коновалов В.А., 1975; Беликов В.М. 1977; Шкляр Б.Х.,1977; Латов В.К., 1990; Римарева Л.В., 1993; Иванова Л.А., 1998; Неклюдов А.Д., 2000; и

ДР-)

Наиболее перспективным источником пищевого белка является дрожжевая биомасса, что объясняется полноценностью белковых веществ, аминокислотный^ скор которых приближается к животному белку, а также безопасностью» и абсолютным отсутствием токсичности дрожжей. Кроме того, наличие витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рассматривать дрожжи как перспективные субстраты для получения биологически активных добавок. Более того, к настоящему времени разработано много способов производства белковых концентратов и изолятов микробного происхождения. Однако, до сих пор не созданы эффективные методы выделения белка из дрожжевой клетки, которые обеспечивали бы его полноценное усвоение. Существующие физические и химические методы биотрансформации клеточной стенки дрожжей имеют ряд недостатков технического и технологического характера и не обеспечивают получение качественного белкового продукта с высокой биологической ценностью. Поэтому перспективным направлением является использование ферментативных процессов, которые позволяют в «мягких» условиях получать пищевые белковые добавки с функциональными свойствами для решения проблемы коррекции питания населения и получения сбалансированных биологически полноценных продуктов.

Цель и* задачи исследования. Цель настоящих исследований состояла в разработке научно обоснованного способа получения белкового препарата на основе направленного ферментативного катализа полимеров клеточных стенок дрожжей. Для достижения поставленной цели исследований предусмотрено решение ряда задач:

- на основе анализа структуры строения клеточной стенки дрожжей и возможных способов, ее деградации научно обосновать состав ферментативной системы, необходимой для деструкции дрожжевой клетки и экспериментально исследовать степень воздействиям индивидуальных ферментов на структурообразующие биополимеры клеточной стенки;

- провести сравнительные исследования ферментных препаратов отечественного и импортного производства по составу основных и минорных ферментов комплекса; уровню их активностей и осуществить скрининг наиболее перспективных;

- разработать эффективную мультиэнзимную композицию (МЭК) с научно-обоснованным соотношением ферментов в составе выбранного комплекса для трансформации биополимеров клеточной стенки дрожжей;

- исследовать процессы выделения белковых веществ протоплазмы клеток и разработать принципиальную схему получения белковых продуктов с использованием энзиматической деструкции дрожжевой биомассы с максимально возможным выделением белковых веществ из исследуемого сырья;

- охарактеризовать полученный белковый препарат по биохимическим и функционально-технологическим показателям;

- разработать научно-техническую документацию для производства белкового препарата.

Научная новизна- работы. Получен новый экспериментальный материал, позволивший выявить закономерности биокатализа структурообразующих полимеров клеточной стенки дрожжей. Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены состав МЭК и условия ферментативной деструкции полимеров клеточной стенки. Выявлен синергизм действия ферментов

МЭК, повышающий степень деградации биополимеров. На основе установленной зависимости выхода белка от состава МЭК и уровня в нем ферментативных активностей (протеазы, Р-глюканазы, маннаназы и хитиназы) разработан принципиально новый способ направленного ферментативного гидролиза клеточной стенок, дрожжей с выделением белковых веществ протоплазмы. Практическая значимость. Осуществлен скрининг продуктивного по белку штамма дрожжей и разработаны оптимальные МЭКи и условия ферментативной деструкции клеточных стенок.

Разработана технологическая схема получения, белковых препаратов из биомассы дрожжей БассЬагошусез сегеу1з1ае, позволяющая:

- исключить применение химических реагентов (кислот и щелочей) в результате использования подобранного МЭК для деструкции клеточных стенок; повысить выход белковых веществ в сравнении с технологией без применения ферментативной обработки; улучшить качество целевого продукта за счет сохранения полимерности » структуры белка и повышения его биологической полноценности; получать белковый препарат (67% белка), обладающий влагоудерживающей. (1:2,5) и жироудерживающей (1:0,7) способностью.

Разработана нормативная документация на технологический процесс и получаемую продукцию (Технологическая инструкция по производству белкового препарата на основе биомассы дрожжей, Технические условия на препарат белковый дрожжевой). Проведены производственные испытания и наработаны опытные партии белкового препарата на Мичуринском экспериментальном заводе и во ВНИТИБП- ЗАО «Биопрогресс».

Апробация работы. Основные положения работы были представлены* на следующих конференциях:

- XII Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы создания продуктов здорового питания. Наука и технологии», Углич, 2006 г;

-V Юбилейной школе - конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» Московский Государственный университет пищевых производств, 2007г;

- Научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий», Углич, 2007г;

- X Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы мясной промышленности: инновации, качество, управление», ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова, Москва, 2007г.

Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», ВНИТИБП, Щелково, 2007г.

4-м Международном научно-практическом симпозиуме «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях», Москва, 2008г. Публикации. По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и патентов, экспериментальной части, состоящей из 7 глав, выводов, списка литературы, включающего 140 наименования работ отечественных и иностранных авторов и приложения. Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 34 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Юскина, Ольга Николаевна

157 ВЫВОДЫ

1. Осуществлен скрининг дрожжей, обладающих высокой скоростью роста (0,17-0,18 час"1) и белоксинтезирующей способностью (содержание белка 39-48%).

2. Проведены сравнительные исследования гидролитической способности ФП различного спектра действия по отношению к структурным полимерам клеточных стенок дрожжей и осуществлен выбор наиболее перспективных, содержащих в составе комплекса ферменты протеолитического, [3-глюканазного, маннанолитического и хитинолитического действия, необходимых для катализа белково-полисахаридных полимеров клеточной оболочки.

3. Разработаны условия проведения ферментативного гидролиза клеточных стенок, включающие две стадии и использование двух МЭК:

- для I стадии ферментолиза: МЭК-1- 0,2 ед ПС+ 80 ед (3-ГкС при 50°С, длительность ферментолиза 1 час;

- для II стадии ферментолиза: МЭК- II- 300 ед р-глюканазы+ 6,2 ед маннаназы+0,44 ед хитиназы при 50°С, в течение 2 часов.

4. Разработана принципиальная схема производства препарата белка, апробированная в промышленных условиях МЭЗ и ВНИТИБП -ЗАО «Биопрогресс». Наработаны экспериментальные образцы белкового препарата, содержащего 63-67% белковых веществ и изучены его аминокислотный состав, а также функционально-технологическая характеристика (ВУС=2,58 г воды/г препарата, ЖУС= 0,72 г масла/г препарата).

5. Научно обоснована целесообразность использования белкового препарата для повышения качества и биологической полноценности пищевой продукции

Заключение

Таким образом, дрожжи являются не только перспективным объектом для получения белково-аминокислотных добавок пищевого назначения, но и препаратов медико-биологического назначения — источников биологически активных веществ, свободных аминокислот, нуклеотидов, витаминов, ценных полисахаридов и др. Многокомпонентная структура дрожжевой клетки предполагает использование комплексных методов деструкции и подбор мультиэнзимных систем целевого назначения.

Глава П ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель настоящих исследований состояла в разработке научно-обоснованного способа получения белковых препаратов на основе направленного ферментативного катализа полимеров клеточных стенок дрожжей. Для* достижения« поставленной цели исследований'предусмотрено решение ряда задач: на основе1 анализа» структуры строения клеточной стенки дрожжей и возможных способов ее деградации научно* обосновать состав ферментативной системы, необходимой для деструкции дрожжевой клетки и-экспериментально исследовать степень воздействия индивидуальных ферментов на структурообразующие биополимеры, клеточной стенки; провести сравнительные исследования-ферментных препаратов-отечественного и импортного производства' по составу основных и минорных ферментов комплекса, уровню их активностей и осуществить скрининг наиболее перспективных; разработать эффективную мультиэнзимную композицию (МЭК) с научно-обоснованным соотношением ферментов! в составе выбранного комплекса для трансформации биополимеров клеточной стенки дрожжей; исследовать процессы, выделения белковых веществ протоплазмы клеток и разработать принципиальную схему получения белковых продуктов с использованием энзиматической деструкции дрожжевой биомассы с максимально возможным выделением белковых веществ из исследуемого сырья; охарактеризовать полученный белковый препарат по биохимическим и функционально-технологическим показателям; разработать научно-техническую документацию для производства белкового препарата.

Принимая во внимание характер задач сформулированных нами, была разработана следующая схема постановки эксперимента (рис.4).

Рисунок 4 - Схема постановки эксперимента

2.2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования рассматривали дрожжи рода БассЬагошусез сегеУ1з1ае из музея ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии для отбора высокопродуктивного штамма в отношении белоксинтезирующей способности. На разных этапах работы объектами исследования являлись ферментные препараты различной направленности действия и с различных составом ферментативного комплекса.

2.2.1 МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

Определение влажности

Содержание влаги в дрожжах определяли высушиванием, после предварительной гомогенизации. Определение вели с помощью прибора Чижовой или высушиванием до постоянного веса при 100-105 °С [ГОСТ 171-81, Грачева И.М., Смирнова Т.А. Общая технология микробиологических производств. Приложения к лабораторному практикуму для студентов технологического факультета. //М., 1971. - 170 е.].

Содержание общего экстракта

Содержание сухих растворимых веществ в дрожжах определяли^ рефрактометрическим методом. Для этого экстрагирование ведут в течении 5 часов для сухого сырья и 2 часа для влажного при температуре 80° С при предварительном разрушении клеточной стенки [Грачева И.М., Смирнова Т.А. Общая технология микробиологических производств. Приложения к лабораторному практикуму для студентов технологического факультета. // М., 1971. - 170 е.].

Определение растворимых сухих веществ

Концентрацию сухих веществ на различных этапах работы измеряли с помощью лабораторного рефрактометра марки РЛ, действие которого основано на зависимости показателя преломления раствора от его концентрации.

61

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юскина, Ольга Николаевна, Москва

1. Абрамов Ш.А., Эфендиева Д.А., Котенко С.И. «Влияние среды на содержание белка в дрожжах Sacch. cerevisiae». Прикладная биохимия и микробиология, 1994, т.ЗО, в.2, с.275-278.

2. Авторское свидетельство СССР №1416100, класс A23J 1/18, 15.08.1988 г

3. Айнулов А.Б., Джафаров А.Ф., Коршунов Б.А. и др. «Способ извлечения внутриклеточного вещества из дрожжевых клеток», С 12 N 9/00 №2038379, 27.06.95 г. Бюл. №18. Внедренческая фирма «Инсад».

4. Акцептованная заявка Японии №48-15-621, 73-2 (4) 24, опубликована 15.05.1973 г.

5. Байрамов Р.Б. Перспективы использования микроводорослей.//Ашгабат: Издательство Туркмен НИИНТИ, 1992, с. 19.

6. Безруков М.Г. «Принципы выделения и регулирования свойств белка из биомассы одноклеточных.» Автореферат дисс. на соискание уч. степени доктора хим. наук. Москва, 1989 г

7. Безрукова М.Г., Градова Н.Б. Использование биомассы микроорганизмов для пищевых целей // Сб. науч. трудов/ Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АНСССР. Пущино, 1985, с. 119.

8. Беликов В.М., Латов В.К., Цыряпкин В.А., Сергеев В.А. Биомасса дрожжей как источник аминокислот.// Микробиол. пр-сть, 1976, т.З (134), с. 6.

9. Беликов В.М., Гордиенко C.B., Патов В.К., Цыряпкин В.А. и др. Аминокислотный состав препаратов из автолизатов пекарских дрожжей. Прикл. Биохим. Микробиол., 1978, т.4,с.60-66

10. Беликов В.М., Бабаян Т.Л., Латов В.К., Князькова A.B. Способ автолиза дрожжевой биомассы. Авт. свид. СССР № 667194 // Б.И. 1979, №22, с.7.

11. Беликов В.М., Бабаян Т.Л., Харатьян С.Г., Латов В.К., Князькова A.B. Способ автолиза дрожжевой биомассы. Авт. свид. СССР № 554854 // Б.И. 1977, №15, с.12.

12. Беликов В.М., Гордиенко С.В., Латов В.К., Харатьян С.Г., Сергеев В.А., Коган A.C., Андрианов В.В. Способ получения аминокислот из низших пептидов. Авт. свид. СССР № 602543 // Б.И. 1978, №14, с.92.

13. Бравова Г.Б., Иванова Н.Г., Шишкова Э.А. и др. «Способ получения осветленного экстракта автолизированных дрожжей». АО «Биотехнология», А 23 J1/18 №2084171, от 20.07.97 г.

14. Доценко О.Н., Садова В.В. Функционально-технологические характеристики белкового продукта дрожжевой биомассы.// Изв. вузов. Пищ. технол. 2002,№ 2-3, с.25.

15. Безруков М.Г., Солошенко В.М., Ковалев А.П., Иоффе М.Л., Токаев Э.С., Бобренева И.В. «Способ получения дрожжевых экстрактов», патент А23 J 1/18, № 2007928, 28.02.94 г, Московский государственный Университет прикладной биотехнологии.

16. Берри Д. Биология дрожжей. //М.: Мир. 1985, с.95

17. Грачева И.М., Смирнова Т.А. Общая технология микробиологических производств. Приложения к лабораторному практикуму для студентов технологического факультета. //М., 1971. 170 с.

18. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов.-Москва, Элевар, 2000.-512с.

19. Грачева И.М., Иванова Л.А., Кантере В.М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия.// М.: Колос, 1992, с.384.

20. Долгов В.А. Повышение биологической ценности кормовой микробной биомассы методами деструкции. //Автореф. (канд. биол. наук) Львов. 1981, с.26.

21. Доценко О.Н., Садова В.В. Функционально-технологические характеристики белкового продукта дрожжевой биомассы.// Изв. вузов. Пищ. технол. 2002,№ 2-3, с.25.

22. Ермаков А.И., Арасимович В.В. и др. Методы биохимического исследования растений // Ленинград: Колос, 1972. 456 е.,

23. Иванова Л.А., Иванова И.С., Лабутина Н.В. Применение БАД полученных из дрожжевой биомассы в х/п пром-ти.// Хранение и переработка с/х сырья. 2003 ,№ 2, с.38-40.

24. Иванова Е.П., Романенко Л.А., Плисова Е.Ю., Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Горшкова Н.М., Ивайловский В.В., Рассказов В.А. Распространение рибонуклеаз микроорганизмов. // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. Т 30. С. 384-388.

25. Иванова Г.С., Сравнительное исследование внутриклеточных и внеклеточных рибонуклеаз грибов Aspergilius clavatus и Pénicillium claviforme. Диссретация на соискание ученой степени доктораv sбиологических наук. Пущино, 1990.

26. Иванова Н.И., Индуцированный автолиз дрожжей.//Диссертация. М.-1998, с.142.

27. Иванова Л.А., Войно Л.И. // Сб. научных трудов 4-го Международного научно-практического симпозиума «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях», Москва, 2008г

28. Иерусалимский Н.Д. «Основы физиологии микробов», 1963, Ан СССР, Москва.

29. Иоффе М.Л., Безруков М.Г. Биологическая ценность изолятов белков микробного синтеза // Биотехнология. 1986, № 5, с.73.

30. Калашников Е.Я., Николаева Н.М. //Сб.: Вопросы биохимии и технологии пищевого производства. Харьков. 1967, №5, с.29.

31. Кислухина О.В., Кузнецова Т.А., Бандоян А.К. Гидролизаты казеина как регуляторы автолиза микроорганизмов.// В кн. Получение и применение регуляторов роста. — Л. 1986, с.83-86.

32. Кислухина О.В., Калунянц К.А., Аленова Д.Ж. Ферментативный лизис микроорганизмов.// Алма-Ата: Рауан. 1990, с.200.

33. Коновалов С.А. Биохимия дрожжей. //М.: Пищевая промышленность. 1980, с.271.

34. Коновалов С. А., Воротило С.П., Соколова JI. Б. Ферментативный метод разрушения клеточных стенок дрожжей. // Прикл. биохимия и микробиология. 1975. Т. 11. № 4. С. 620-622.

35. Латов В.К., Бабаян Т.Л., Гордиенко C.B., Коган A.C., Цыряпкин В.А., Беликов В.М. Комплексная переработка дрожжевой биомассы.// Биотехнология. 1990, №3, с. 14-18.

36. Ларионов В.Л. Сахаромицеты как объект биотехнологии. Биотехнология, 1985, №2, с. 29-34.

37. Лукин Н.И., Никитенко С.И. «Способ получения пищевого биологически активного продукта переработки дрожжей», патент A23J 1/18, № 2 244 438, 21.03.2003 г.; ООО «Балтком»,

38. Малый практикум по биохимии под ред. Юркевича В.В., МГУ им. Ломоносова, // М.: Издательство Московского университета, 125 е..

39. Матвеева И.В., Белявская И.Г. Биотехнологические основы приготовления хлеба.// М.: ДеЛи принт. 2001, с.150.

40. Микеладзе Г.Г. Нетрадиционные пути получения пищевых белков.// Пищевая и перерабатывающая промышленность. 1987, №10, с.42

41. Московский В.Д., Коптелов М.М., Тюменцев В.В. «Витаминно-аминокислотный концентрат «Дрожжелизин», патент А 23 Л/18 № 210 94 59.

42. Науменко Н.И., с соавт.,1985

43. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина A.B. Получение и очистка белковых гидролизатов (обзор).// Прикладная биохимия и микробиология. 2000, т.36, №4, с.371-379.

44. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина A.B. Свойства и применение белковых гидролизатов (обзор).// Прикладная биохимия и микробиология. 2000, т.36, №5, с.525-534.

45. Нечаев А.П, Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А, Колпакова В.В., Витол И.С, Кобелева И.Б. Пищевая химия, учебник, Спб, Гиорд, 2001-592с.

46. Новаковская С.С., Шишацкий Ю.И. Производство хлебопекарных дрожжей.//М.: Агропромиздат. 1990, с.336.

47. Орлова Е.В., Орлова B.C., Римарева JI.B. Получение нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae и его биологическая эффективность. Хранение и переработка сельхозсырья, 2006, т. 12, с. 4549;

48. Патент РФ № 2070400 от 15.03.96 г., МПК: A23L 2/52, A 23J 1/18, C12N 1/18

49. Патент США №3.833.552, класс A23J 1/18, опубликован 03.09.1974 г., Патент Великобритании №1.513.836, класс A23J 1/18, 1978,

50. Патент Швейцарии № 643296, кл. С 12N 1/06, 1984

51. Перт Дж. «Основы культивирования микроорганизмов и клеток», 1978, Мир, Москва.

52. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева JI.B. Определение активности ферментов. Справочник. М.: Изд. ДеЛи принт, 2003-372с.

53. Ракитин В.Ю. Технологические аспекты дезинтеграции микроорганизмов.// Обзор. -М.: НИИТЭХИМ 1980, Вып. 15 (100), с.36.

54. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Трифонова В.И., Устинников В.А. Получение пищевых добавок лечебно-профилактического действия.// Сб.: «Пища. Экология. Человек». Межд. науч.-техн. конф. М., 1995, с.25.

55. Римарева JI.B., Оверченко M. Б., Серба Е.М., Трифонова В. В. Сравнительная характеристика микробных протеаз по степени гидролиза белковых субстратов // Прикл. биохимия и микробиология. 1997, Т. 33, № 1, с. 43-48.

56. Римарева JI.B. Биотехнология комплексных препаратов кислых протеаз и их роль в интенсификации технологических процессов в отраслях АПК / Монография. М. Издательский комплекс МГУ1111, 1997 г. - 51 с.

57. Rimareva L.V., Overchenko М.В., Serba Е.М. Comparative Characterization of Microbial Proteases by the Extent of Hydrolysis of Protein Substrates // Applied Biochemystry and Microbiology. 1997,- V.33, N 1. P. 36-41

58. Римарева JI.B., Оверченко М.Б.,Трифонова B.B. Способ производства сухих пищевых продуктов. Патент РФ № 2110934. -Б.И., 1998. № 14.

59. Римарева JI.B., Оверченко М. Б., Трифонова В. В. Способ получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы: Патент РФ № 2104300 // Б. И. 1998, №4, с. 151

60. Rimareva L.V. Comparative characterzation of microbial proteases by the extent of hydrolysis of protein substrates. Ninth congress of the Bulgarian mic robiologists with forein participation (15-17 October 1998, Sofia, Bulgaria.) -1998.-P. 11.

61. Римарева JI.B., Оверченко М.Б., Серба E.M., Игнатова Н.И.,Тулякова Т.В. Использование комплексного препарата амилопротооризин (КФПА) для энзиматического гидролиза дрожжевой биомассы. Хранение и переработка с/х сырья. 2002. - № 10. - С. 39-41.

62. Римарева JI.B. Биотехнологические и медико-биологические аспекты получения амино-кислотных добавок на основе энзиматического гидролиза микробной биомассы // Хранение и переработка сельхозсырья. -2003.-№5.-С. 95-96.

63. Римарева JI.B., Оверченко М.Б. Трифонова В.В. Способ получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы. Патент РФ № 2104300. Б.И., 1998. № 4

64. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Морозова К.А., Серба Е.М. //Влияние ферментативного комплекса гриба Aspergillus oryzae на степень гидролиза полимеров дрожжевой биомассы// Хранение и переработка сельхозсырья. 2006. - № 4. - С. 39-42

65. Римарева Л.В, Ибрагимова С.И. Отбор физиологически активного штамма Saccharomyces cerevisiae продуцента пищевого белка. Сб. докладов. Научно-практическая конференция. - Углич, 2004. - Ч.П. - С. 72-75.

66. Rimareva L.V., Ibragimova S.I. Practicing in getting yeast biomass on alcohol waste products for food protein obtaining. VI Intern. Forum "Biotechnology and the present" Abstracts of repots. St.Petrsburg, June, 2005. - P. 27.

67. Римарева Л.В., Ибрагимова С.И.,Курбатова Е.И. Рост дрожжей ЗассЬагошусез сегеу1э1ае при культивировании на пшеничном сусле // Хранение и переработка сельхозсырья. 2006. - № 7. - С. 45-49.

68. Рошкова 3. Получение и применение дрожжевых белковых продуктов пищевого назначения //Хранительная промышленность. 1986, №1, с.25

69. Руденко А.Н., Конев С.В. О влиянии моно- и дивалентных катионов на термоустойчивость дрожжевых клеток. //В сб. Микроорганизмы -продуценты биологически активных веществ. Минск. Наука и техника. 1973,с.168-172.

70. Рухлядева А.П. Инструкция по техно-химическому и микробиологическому контролю спиртового производства.// М.: Агропромиздат. 1986, с.397.

71. Садкова Н.П. «Некоторые физико-химические свойства глютелиновых фракций дрожжевых белков», автореферат диссертации на соискание кандидата химических наук, Москва, 1975

72. Фараджаева Е.Д., Кораблин Р.В. Получение и применение БАД на основе вторичных ресурсов пивоварения.// Пища. Экология. Качество.: Сб.матер. 2 Межд. науч.-практ. конфер. Новосибирск: Издательство СО РАСХН, 2002, с.38-39.

73. Фихте Б.А. Дезинтеграция микроорганизмов.//Задачи и перспективы. Пущино-на-Оке. 1972, с.5-14.

74. Химический состав пищевых продуктов. //М.: Легкая и пищевая промышленность. 1984, с.305

75. Baldwin С., Robinson С. Increased disruption resistence of Candida utilis grown for survivors of enzymatic lysis combined with high pressure homogenization.// Letters in Applied Microbiology. 1992, vol.15, p.59-62.

76. Kollar R., Sturdir E. Indukovana autolyza kvasinick. // Biologia, 1989, v.44, №12, p.1211-1223.87. Pellet P.L.,et al., 1980

77. Shetty K.I., Kinsella J.E. " Preparation of yeast protein isolate with low nucleic acid by succinylation" J. Food science, 1979, v.44, p.633-638

78. Alemohammad M.M., Knowless C.J. Osmotically induced volume and turbidity changes of E. coli due salts, sucrose and glycerol, with particularreference to the rapid permeation of glycerolin to the cell.// J. Gen. Microbiol.,*1974, v.№l,p.l25-142. '

79. Alvarez R., Enriquez A. Nucleic acid reduction in yest. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988, v.29, № 2-36 p. 208-210.

80. Adams, J. M., and S. Cory. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science, 1998, v. 281, p.1322-1326.

81. Baldwin C., Robinson C. Increased disruption resistence of Candida utilis grown for survivors of enzymatic lysis combined with high pressure homogenization.// Letters in Applied Microbiology. 1992, vol.15, p.59-62.

82. Bomar M.T.,Yakubick V., Schmidt S. Autosysis of yeast induced by elevated temperature, ultraviolet and electron radiation. // Alimenta. 1977, v. 16, p.53-57.

83. Babayan T.L., Bezrukov M.G., Latov V. K., Belikov B.M., Belatseva E.M., TitovaE.F. Curr. Microbiol. 1981, v.5, p.161.

84. Behalova В., Sillinger V.,Machek F. Баланс эргостерина при получении дрожжевого экстракта из клеток S. cerevisiae и C.utilis. // Kvasny Prüm., 1996, v.32, №11, р.279-280.

85. Briones С, Ballesta JP Conformational changes induced in the Saccharomyces cerevisiae GTPase-associated rRNA by ribosomal stalk components and a translocation inhibitor. //Nucleic Acids Res. 2000; 28(22):4497-505.

86. Chrenova N.M., Bezrukov M.G., Kogan A.S., Sergeev W.A. Autolysis der H-hefe Saccharomyces cerevisiae induziert durch metallkationen. // Nahrung,1981, В. 25, S. 837-844.

87. Deshpande RA, Shankar V. Ribonucleases from T2 family// Crit Rev Microbiol. 2002;v 28(2), p:79-122.

88. Elango N., Correa J.U., Cabib E. Secretory of yeast chitinase.// J.Biol.Chem.,1982, v.257,№3, p. 1398-1400. bei treatment with enzymes.// J. Gen. Microbiol., 1980, v.l 17, p.383-391.

89. Gale E.F., Ingram J., Kerridge D., Notario V., Waymann F. Reduction of amphotericin resistance in stationary phase cultures of Candida albicans

90. Hien N.H., Fleet G.H. Separation und characterization of six (l-3)-ß-glucanases from S.cerevisae.// J. Bacteriol., 1983,v.l56, №3, p.1204-1213.

91. Hilt W., Wolf D.H. Stress-induced proteolysis in yeast.// Mol. Microbiol., 1992, v.6, №17, p. 2437-2442.

92. Holzer H., Heinrich P.C. -Ann.Rev.Biochem., 1980, v.49, №63.

93. Gonzalez E.E., Vernon E.J.C., Moctezuma A.R.Ch., In: J. «Ind.and Enuiron.», 1985, 8, №4, p.19-20.

94. Johnson J.C. Food Additives. // Recent Developments, Noyes Data Corp., Park Ridge, 1983,s.526.

95. Jeong HS, Backlund PS, Chen HC, Karavanov AA, Crouch RJ. RNase H2 of Saccharomyces cerevisiae is a complex of three proteins. Nucleic Acids Res. 2004 v.32, p.407-14

96. Kihlberg J. Ann. Rev. Of Microbiol., 1972, v.26, p.427-431.

97. Kollar R., Sturdir E. Indukovana autolyza kvasinick. // Biologia, 1989, v.44, №12, p.1211-1223.

98. Kovach B., Deak P., Haidu D., Vealand A.// Szeszipar. Januar - Vfrcius. 1988, p.36.

99. Langedijk JP, Olijhoek T, Schut D, Autar R, Meloen RH. New transport peptides broaden the horizon of applications for peptidic pharmaceuticals //Mol Divers. 2004;v 8(2); p.101-11

100. Leduc M., van Heijenoort J. Autolysis of E.coli. J. Bacterid., 1980,v. 142,№ 16 p.52-59.

101. Lowry H.O., Rosenbrough N.I., Randall R.I.J., J. Biol. Chem. 1951, 193, 265.

102. U3. Markhame E., Eyrne W.J., In: «Continuous cultivation of microorganisms» ed. Malek I. et al., p.l 17, Academia Prague, 1969.

103. Masters P.M., Friedmon M. //J. Agr. Food Chem. 1979 27, 3, p.507.

104. Muller-Wecker H, Kofranyi E. Z. Phisiol. Chem., 1973, v.354, p. 1034-1042.

105. De Mendoza C, Gallego O, Soriano V. Mechanisms of Resistance to Antiviral Drugs Clinical Implications. AIDS Rev 2002, v.4, p. 64-82.

106. Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay. J. Immunol. Meth., 1990, v 130, № l,p. 149-151.

107. Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay. // J. Immunol. Meth., 1990, v 130, № l,p. 149-151

108. Notario V. (3-glucanases from Candida albicans: purification, characterization and the nature of their attachment to cell wall components.// J. Gen. Mikrobiol., 1982, v. 128, №4, p. 747-759.

109. Otero M.A., Wagner J.R. Thermal behaviour and hydration properties of yeast proteins from Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces fragilis. //Food Chemistry. -2000.№69. pp. 161-165.

110. PAG. Revised PAG Guidelines. PAG/UNU Guideline № 6; Preclinical testing of novel sources of food // Food and Nutr. Bull. 1983, 5, №1, p.60

111. Parente A.M., Silva M.T. Ultrastruktural aspects of autolysis of Ps. Fluorescens induced by osmotic shock. // J. Gen. Microbiol., 1984, v.130, №6, p.1459-1470.

112. Patching J.W., Rose A.N., Cold osmotic shock in S. serevisiae.//j. Bacteriol., 1971, v. 108, p. 451-458.

113. Pentremoli S., Melloni E., Salamino F., Sparatore В., Michetti M., Horecker B.L.// Endogenous inhibitors of lysosomal proteinases.//Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 1983, v.80,№5,p. 1261-1264.

114. Reyea F., Lahoz R., val Moreno A. J. Gen. Microbiol. // 1980, v.26, p.1120.

115. Riemay K.-H., Troger R. Autolyse bei Pilzen: Autolytischer Abbau von Kohlenhydraten, Proteinen, und Nucleinsaueren.// Z. Allg. Mikrobiol., 1978(8), В. 18,S.617-625.

116. Refae A.H. et al., «Оптимизация микробиологического синтеза белка из свекловичной мелассы с использованием Sacch. uvarum »., Chem. Mickrobiol. Technologie der lebensmittel.,1985, Bd. 9, № 4, s. 105 -112.

117. Rosales F. H. Yeast as protein source for human nutrition (a review).//Acta Microbiol. Hung., 1984, v.31, p. 159-172.

118. Roth F. Mikroorganismen als Proteinquelle in der Tierernaeehrung.// Kraftlutter, 1979, b.62, № 3, s. 122-128.

119. Ruggieri S., Magni G. // Phys.Chem.Phys., 1982, v.14, p.315.

120. Saheki Т., Holzer H. Proteolytic activities in yeast. // Biochim. Biophys. Acta 1975, v.384, №1, p. 203- 214.

121. Saheki Т., Holzen H. Comparisons of the tryptophan synthase inactivating enzymes with proteinases from yeast. // Eur. J. Biochem., 1974, v. 42, p.621-626.

122. Sergeev V.A., Solosenko U.M., Berzucov M.G.// Acta Biotechnol. 1984, №4,1. 105.

123. Sommer R., Yeast autolysates — production, properties and applications// Product information "Only", 1989.

124. Sajbidor J., Certic M., Grego J. Lypid analysis of baker's yeasts. J. Chromatogr., 1994, v.665, p.191-195.

125. Tempest D.W. In: Microbiol Growth, 19th Symposium Soc. Gen. Microbiol., p.87, Cambridge University Press, Cambridge, 1969.

126. Villan G. J., Enriquez M.A., Lopez S.P. Reina C.R., Permeabilization cellular de C. utillis.// Rev. cienc.biol. 1983, v. 14, №1, p.35-47

127. Wetter C., Poeppinghaus K., Morais H., Dias M., Mendes B., Santana F., Oliveira J.F.S., «Water Sci. andtechnol», 1989, 21, №12, p.1853-1856.

128. Yeast protein en hances flavour and nutrition. //Food Process. 1986 55, №10, p.13.

129. Yumi Y.,Dao Thi D., Xing X., Kanji M., Characteristics of baker's yeast destruction by means of homogenezator working with high pressure.//.!.Soc.Pwder Technol. -1999.-vol. 36.№7. -pp.534-541.