Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рекомбинантная дуплекс-специфическая нуклеаза

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантная дуплекс-специфическая нуклеаза"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАПИЧЕСКОИ ХИМИИ ИМ АКАДЕМИКОВ

М М ШЕМЯКИНА И Ю А ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

Анисимова Вероника Евгеньевна

РЕКОМБИНАНТНАЯ ДУПЛЕКС-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ НУКЛЕАЗА

Специальность - 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ии344 /ОСИ

Москва, 2008

003447004

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий для биологии и медицины Института бноорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель

член- корреспондент РАН, доктор биологических наук Лукьянов С А Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Гусев Н Б кандидат биологических наук Акопов С Б

Ведущая организация

НИИ физико-химической биологии имени А Н Белозерского

Защита состоится 15 октября 2008 г в 10 00 на заседании диссертационного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН по адресу 117871 ГСП-7, Москва В-437, ул Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан 12 октября 2008 г Ученый секретарь диссертационного со----

доктор физико-математических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ В настоящее время известно множество типов нуклеаз - от высокоспеци-фичиых эндонуклеаз рестрикции, атакующих строго определенные последоватетыюсти ДНК, до ДНК, РНК-неспецифичных экзо- эндо- нуклеаз, гидролизующих не только нуклеиновые кислоты, но и нуклеозид-З'-моно-фосфаты Некоторые из описанных нуклеаз обладают уникальной специфичностью и имеют практическое значение дтя методов молекулярного клонирования, изучения ДНК-белковых взаимодействий, определения структуры нуклеиновых кислот и других

Ранее в нашей лаборатории была выдетена и охарактеризована нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба, впоследствии названная дуплекс-специфической нуклеазой (ДСН) Она гидролизует только двуцепочечную ДНК или цепь ДНК в ДНК-РНК гибридах Для осуществления гидролиза ей необходимо минимум 10 идеально комплиментарных пар оснований Кроме того, ДСН обладает высокой стабильностью Эти свойства позволили разработать несколько молекулярно-биологических методик на основе ДСН, такие как нормализация библиотек полноразмерных кДНК и детекция точечных нуклеотидных замен в геноме Был клонирован ген этого фермента Оказалось, что его аминокислотная постедовательность гомологична ДНК, РНК - неспецифическим эндонуклеазам - ферментам, гидролизующим, как ДНК, так и РНК, как дву-, так и одноцепочечную Поэтому изучение структурно-функциональной организации ДСН является очень интересной научной задачей

ЦЕЛЬ РАБОТЫ Целью данной работы было изучение структурно-функциональной организации дуплекс-специфической нуклеазы камчатского краба

СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, а также выводов и списка литературы Работа изложена на 122 страницах машинописного текста и содержит 44 иллюстрации, 18 таблиц и 135 ссылок на литературные источники

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ Данная работа посвящена изучению рекомбинантной ДСН Мы разработали метод получения активного рекомбинантного фермента, который необходим для исследования структурно-функциональных связей в белке Для аккуратного сравнения ДСН с другими ДНК, РНК - неспецифическими эндонуклеазами мы клонировали несколько нуклеаз из представителей класса Ракообразных Филогенетический анализ выявил две эволюционно различающихся группы нуклеаз - ДСН - подобные и Бш -

подобные («классические») Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей этих белков показало наличие существенных структурных различий представителей упомянутых групп Так же мы создали ряд мутантных вариантов ДСН, содержащих как точечные замены, так и лишенных определенных концевых участков Анализ свойств этих мутантов показал, что «дополнительные» (по сравнению с нуклеазой Serratia marcescens) участки ДСН обеспечивают ее необычные свойства, в том числе субстратную специфичность Исходя из этих результатов, мы выделили новое семейство ферментов -дуплекс-специфические нуклеазы Кроме того, рекомбинантная ДСН была успешно применена в ранее разработанной методике нормализации библиотек полноразмерных кДНК, а термолабильный вариант ДСН был успешно использован для удаления примесей ДНК из РНК проб перед синтезом кДНК

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные материалы диссертации были доложены на следующих международных конференциях Международная конференция молодых ученых «Ломоносов 2007» (Москва, 2007), 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007), 12-ый Международный биологический научный конгресс (Kuala Lumpur, Malaya, 2007)

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 4 статьи

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИВНОЙ РЕКОМБИНЛНТНОЙ ДСН

Экспрессия и выделение рекомбинантной ДСН

Для экспрессии кДНК ДСН была клонирована в экспрессиониый вектор рЕТ 22Ь(+), который обычно используется при экспрессии в клетках Е сок секреторных или токсичных белков Данный вектор обеспечивает наличие у рекомбинантного белка //-концевой сигнальной последовательности, специфичной для кишечной палочки, которая направляет секрецию белка в периплазматическое пространство, а также С-концевой последовательности из шести гистидинов, которая позволяет выделять рекомбинантный белок методом аффинной хроматографии на пикель-содержащем сорбенте Клонированная кДНК ДСН была лишена нетранслируемых областей и участка, предположительно кодирующего собственный сигнальный пептид Однако электрофоретический анализ белков рекомбинантного штамма показал, что рекомбинантная ДСН присутствует в водонерастворимой фракции

В качестве контрольного штамма использовался штамм кишечной палочки, трансформированный вектором без вставки После очистки рекомбинантного белка на кобальт-содержащем сорбенте распределение белка существенным образом не изменилось рекомбинантный белок присутствовал только в нерастворимой фракции, очищенной в денатурирующих условиях Выход очищенного денатурированного белка составил 100 мг на один литр бактериальной культуры

Ренатурацня и очистка рекомбинатной ДСН

Мы опробовали три различные схемы ренатурации одноступенчатый диализ (от 8 до 0 М), трехступенчатый диализ (от 8 до 2 М, от 2 до 0,4 М, от 0,4 до 0 М) и плавное понижение концентрации мочевины многократным разведением Самым эффективным оказался трехступенчатый диализ Поэтому в дальнейшем для ренатурации применяли трехступенчаты» диализ

Поскольку ДСН содержит 10 цистеинов и, предположительно, все они формируют Б-Б связи, мы решили подобрать оптимальные условия для формирования этих связей Известно, что изомеризация дисульфидных связей стимулируется присутствием смеси восстановленных и окисленных низкомолекулярных дитиолов Мы протестировали две окислительно-востановительные пары глутатион восстановленный/окисленный (ОБН/ОББС) и цистеин/цистин (Суз/Суэ-Суэ) Мы показали, что пара глутатион восстановленный/глутатион окисленный в концентрации 5-3 мМ и 0,5 - 0,3 мМ соответственно более чем на порядок увеличивает выход активного фермента (Таблица 1)

Рис. 1 Электрофорез геномной ДНК тимуса теленка, обработанной ренатурированной ДСН или препаратами, полученными в аналогичных условиях из контрольного штамма рЕТ.

Дорожка 1. Контрольный образец, необработанный протеи-назой К.

Дорожка 2. Ренатурированная ДСН, необработанная про-теиназой К.

Дорожка 3. Контрольный образец после обработки протеи-назой К.

Дорожка 4. Ренатурированная ДСИ после обработки про-теиназой К.

М - маркер молекулярной массы.

Ранее для некоторых дисульфид-богатых белков было показано, что эффективность изомеризации дисульфидных связей увеличивается с увеличением рН ренатурирующего буфера от 6 до 10. Мы протестировали три различных варианта ренатурирующего буфера с рН 8, 9 и 10. Последний оказался оптимальным.

1 O^A^RIRQM Рнс' 2 ВестеРн-блот ' ¿ОЧ-ОО / о о IVI гибридизация препа-

Шратов ДСН до и после 150 ренатурации.

Дорожка I - тельца ,. включения рЕТ, очищенные на смоле TALON. 50 Дорожки 2,3,4,5-тельца «—у включения рЕТ-ДСН,

л 37 очищенные на смоле TALON. 1/5, 2/15, 1/10, 1/15 от количества 20 белка, ис-пользованного для ре-натурации и , 15 обработ-ки протеиназой К.

Дорожка 6 - рЕТ после ренатурации и обработки протеназой К. Дорожка 7 - рЕТ-ДСН после ренатурации и центрифугирования. Дорожка 8 - рЕТ-ДСН после ренатурации и обработки протеиназой К. Дорожка 9 - нативная ДСН, выделенная из гепатопанкреаса камчатского краба. М - маркер молекулярных масс.

Кроме того, мы проверили другие реагенты, для которых ранее было показано положительное влияние на репатурацию различных белков (детергенты Т\уш-80 и Ттйоп Х-100, ионы тяжелых металлов (Си+2), глицерин, ПЭГ 3350) (Таблица 1)

Таблица 1 Дополнительные реагенты, влияющие на эффективность ренатурации ДСН

Реагенты Активность, ед Кунитца

Без дополнительных реагентов 560

3 мМ 0 3 мМ СБНЛЗЗЗО 6070

3 мМ/0 3 мМ Суэ/Сув-Суз 4100

3 мМ/0 3 мМ ОЗШЗЗБС + 0,05% ПЭГ 3350 3950

3 мМ/0 3 мМ ОЗН/ОЭЗО + 0,4 М глицерина 2640

3 мМ/0 3 мМ ОЗН/ОЗБО + 1 мкМ СиВг2 40

3 мМ/0 3 мМ Суз/Сув-Суя + 0,4 М глицерина + 0,05% ПЭГ 3350 4210

3 мМ/0 3 мМ СЗН/СЗЭС + 0,01% Тритон Х-100 110

После окончания ренатурации ДСН подвергалась обработке протеиназой К Обработка протеиназой К позволяет избавиться от несвернувшегося белка и других примесных белков, а также удалить сигнальный пептид Это приводит к значительному увеличению активности ДСН (Рис 1) После обработки протеиназой К мы очистили ДСН на колонке Мопо-О до гомогенного состояния (Таблица 2) Идентичность нативного и рекомбинантного фермента мы показали методом вестерн-блот гибридизации и определением Ы-концевой последовательности (Рис 2)

Таблица 2 Итоговая схема очистки и ренатурации рекомбинантной ДСН

Шаги очистки Суммарный белок (мг) Целевой белок (мг) Удельная активность (единиц Кунитца па мг.)

Клетки Е cok 20,00 1,00 0

Тела включения (после растворения) 3,00 1,00 0

Металл-афинная хроматография 0,50 0,50 0

Ренатурация и активация протеиназой К 0,20 0,10 3035

FPLC на Mono-Q 0,08 0,08 6070

Отработанный нами метод позволяет получать растворимый рекомбинантный фермент с выходом 20 мг на 1 л бактериальной культуры После ренатурации большая часть молекул ДСН

находится в растворе и не выпадает в осадок Однако, после обработки протеиназой К интактными остаются только 20% молекул (Рис 2) По-видимому, значительная часть молекул ДСН сворачивается, но не формирует внутримолекулярных дисульфидных связей Такие молекулы являются неактивными и гидролизуются протеиназой К

Каталитические свойства и стабильность рекомбинантной ДСН

Мы определили оптимальные условия катализа (рН, температура, концентрация двухвалентных катионов) для рекомбинантной ДСН Оптимальный рН для рекомбинантной ДСН составляет 6,8 При рН ниже 3 или выше 9 рекомбинантная ДСН практически неактивна, а при рН от 3 до 5 имеет постоянную активность (не более 20 % от максимальной) Рекомбинант-ная ДСН демонстрирует высокую термостабильность, свойственную нативной ДСН Температурный оптимум рекомбинантной ДСН равен 59°С После прогревания ренатурированной ДСН при температуре 100°С в течение 10 минут она сохраняет 5-7% исходной активности Зависимость активности рекомбинантной ДСН от рН и температуры аналогична таковой для нативной

Для осуществления катализа рекомбинантной ДСН необходимо наличие некоторых ионов двухвалентных металлов в реакционной смеси Мы определили зависимость активности ренатурированной ДСН от трех катионов Мя+2, Мп+2 и СсГ2 Наиболее эффективно ДСН активируется марганцем, в меньшей степени - магнием, и совсем незначительно кадмием Оптимальная концентрация активирующего иона находится в интервале от 10 до 25 мМ, при ее превышении активность начинает падать Нативная ДСН проявляет сходную зависимость активности от концентрации двухвалентных катионов

При добавлении к рекомбинантной ДСН смеси активирующих ионов - кальция и магния -активность непропорционально возрастает Если сравнить суммарную активность ДСН в присутствие каждого из катионов и активность ДСН при добавлении смеси катионов, то видно, что во втором случае активность ДСН во много раз больше чем в первом То есть наблюдается явление синергизма для ионов кальция и магния Оптимальная концентрация каждого иона составляет примерно 10 мМ

Функциональные пробы рекомбинантной ДСН

Специфичность рекомбинантной ДСН по отношению к ДНК и РНК мы исследовали на смеси РНК скелетной мускулатуры человека и человеческой геномной ДНК Мы показали, что рекомбинантная ДСН специфично деградирует ДНК, а РНК остается интактной (Рис 3)

Рис. 3 Активность рекомбинантной ДСН на двуцепочечной ДНК и РНК.

Дорожка 1 - смесь из 50 нг. РНК скелетной мускулатуры человека и 500 нг. человеческой геномной ДНК интактная (без обрабо-Ют.п.о. тки ДСН).

Дорожка 2 - смесь из 50 нг. РНК скелетной мускулатуры челове-3 т п ка и 500 нг. человеческой геномной ДНК обработанная ДСН. т.п.о. - тысяч пар оснований

1 т.п.о.

Специфичность рекомбинантной ДСН по отношению к одно- и двуцепочечной ДНК мы определяли на одноцепочечной ДНК фага М13 и двуцепочечной ДНК фага X. Ренатурированная ДСН продемонстрировала нуклеазную активность только по отношению к двухцепочечной ДНК (Рис. 4).

Д(3|-| Рис. 4 Определение субстратной

I---1 специфичности рекомбинантной

+ ~ ДСН. Нуклеазная активность фер-

М13 1 ¡Ы\/113 М13 I А.+М13 ™ на одно^почечной ДНК фага

М13 и двуцепочечной ДНК фага А. М 1 2 3 4 5 6 Обработка ДСН проводилась при

температуре 60°С в течение 1 часа. Дорожка 1 - ДНК фага М13 после обработки ренатурированной ДСН. Дорожка 2 - ДНК фага X после 3обработки ренатурированной ДСН.

Дорожка 3 - ДНК фагов М13 и X после обработки ренатурированной 1 т.п.оДСН.

Дорожки 4-6 - негативный Контроль: ДНК фага М13, ДНК фага X, и их смесь без обработки ДСН. М - маркер молекулярных масс.

Кроме того, нами была исследована активность фермента по отношению к идеальным десятинуклеотидным дуплексам и дуплексам с парой неспаренных нуклеотидов по ранее разработанной методике. Согласно нашим результатам, фермент проявлял нуклеазную активность только по отношению к идеальному дуплексу и не взаимодействовал с дуплексом, содержавшим замену, а также с одноцепочечным олигонуклеотидом.

дсн

I ■

+

М13 X А.+М13 М13 I А.+М13 М 1 2 3 4 5 6

КЛОНИРОВАНИЕ кДНК ГЕНОВ-ГОМОЛОГОВ ДСН

Изучаемый нами фермент мало похож на все описанные к моменту начала этой работы ферменты из группы ДНК,РНК-неспецифичных эндонуклеаз Для выявления у ДСН консервативных участков нам потребовалось клонировать несколько близкородственных нуклеаз (гомологов)

БЬг

ДСН

Б рот Б сег Бг С1

Епбос

Апа

Бт

60 АУ АЬ

"С

'|а

ИОА-РВ

И(2А-рЯ усосрЯ уйеср!

УСУСРЯ

увгвр! урн-ь!

ТРБ-Ш

ДЕикбо-ЬЩ

ывы!

N6111

ину|

ИНУ ОЫА

гшт ОСА

-Д

КУ КУ'Иа аур" Ан[

АУ. АУ| NN ЙЫ ¡ЗАИ

80

РАТ

УАТ@

ОЫС

УРС

ЙРМ

вРС

КУБ

ЭУС

П0Е@

Рис. 5 Консервативный участок выравнивания аминокислотных последовательностей ДНК,РНК-неспецифических эндонуклеаз, использовавшийся для синтеза вырожденных олигонуклеотидов

Для клонирования кДНК генов-гомологов ДСН мы решили использовать вырожденные олигонуклеотиды, соответствующие наиболее консервативному участку ДСН (Рис 5) Мы синтезировали три вырожденных олигонуклеотида соответствующих участкам РСЗШСЗАРЫ и ОАРШИЧШ ДСН Используя метод быстрой амплификации концевых фрагментов кДНК путем ОТ-ПЦР, мы амплифицировали 3'-концевые фрагменты кДНК генов нуклеаз рачка бокоплава (Оаштапи ер), стеклянной кревеки (Ра1аетошс1ае ер) и мангрового скрипичного краба (Цса сгазя/рез), используя эти олигонуклеотиды в качестве ген-специфичных олигонуклеотидов (Рис 6)

Полученные фрагменты кДНК были клонированы и были определены их нуклеотидные последовательности Используя полученные нуклеотидные последовательности, мы синтезировали несколько специфичных олигонуклеотидов для быстрой амплификации 5'-фрагмента (5'-ЯАСЕ) кДНК нуклеаз рачка бокоплава, стеклянной кревеки и мангрового скрипичного краба (Рис 6) Амплификация проводилась в три стадии ПЦР-продукт содержал молекулы массой примерно 1000 пар оснований в случае мангрового скрипичного краба и стеклянной кревеки и 900 - в случае рачка бокоплава Эти фрагменты были клонированы, и была определена их нуклеотидная последовательность Для определения нуклеотидной последовательности мы использовали плазмиды из нескольких клонов, и результаты были идентичными В итоге мы определили полную нуклеотидную последовательность кДНК нуклеаз стеклянной кревеки и мангрового скрипичного краба и последовательность фрагмента кДНК нуклеазы рачка бокоплава Полученные нами аминокислотные последовательности новых нуклеаз на 50-65% гомологичны ДСН Исключением является нуклеаза рачка бокоплава имеющая только 30% гомологии

кДНК

вырожденные олигонуклеотиды

З'-RACE

адаптерные олигонуклеотиды

З'-фрагмент «ДНК гомолога

клонирование, определение нуклеотидной последовательности

Рис. б Схема клонирования генов-гомологов ДСН нуклеазы стеклянной креветки (Ра1аетотс1ае Бр ), мангро-вого скрипичного краба (Цса сгаз$!рез) и нуклеазы рачка бокоплава (йаттапи

кДНК

адаптерные олигонуклеотиды

5-RACE

ДСН-специфические олигонуклеотиды

5'-фрагмент , кДНК гомолога клонирование, определение нуклеотидной последовательности

Для нуклеазы стеклянной креветки длина кДНК составляет 1386 нуклеотидов, не считая полиА фрагмента Анализ данной последовательности выявил открытую рамку считывания длинной 1212 нуклеотидов (начиная с первого инициаторного кодона), которая кодирует белок протяженностью 404 аминокислот Молекулярная масса этого белка составляет 44,56 кДа, изоэлектрическая точка - 4,86 Аминокислоты с первой по 23-ую предположительно являются сигнальной последовательностью, обеспечивающей секрецию данного фермента Рассчетная молекулярная масса зрелого белка составляет 41,84 кДа, изоэлектрическая точка - 4,66 Участок между 146 и 374 аминокислотой предположительно является доменом, характерным для ДНК, РНК-неспецифичных эндонуклеаз Согласно построенному нами древу филогенетического сходства нуклеаза стеклянной креветки вместе с ДСН входит в состав подгруппы нуклеаз Ракообразных (Рис 8) Она очень похожа на нуклеазу мангрового скрипичного краба (61% идентичных аминокислот, 77% аналогичных) и на ДСН (64% идентичных аминокислот, 79% аналогичных)

Для нуклеазы мангрового скрипичного краба длина кДНК составляет 1366 нуклеотидов, не считая полиА фрагмента Анализ данной последовательности выявил открытую рамку считывания длинной 1215 нуклеотидов (начиная с первого инициаторного кодона), которая кодирует белок протяженностью 405 аминокислот Молекулярная масса этого белка составляет 43,98 кДа, изоэлектрическая точка - 4,49 Аминокислоты с первой по 27-ую предположительно являются сигнальной последовательностью, обеспечивающей секрецию данного фермента Расчетная

молекулярная масса зрелого белка составляет 40,98 кДа, изоэлектрическая точка - 4,34 Участок между 196 и 375 аминокислотой предположительно является доменом, характерным для ДНК, РНК-неспецифичных эндонуклеаз Согласно построенному нами древу филогенетического сходства нуклеаза мангрового краба, как и нуклеаза стеклянной креветки входит в состав подгруппы нуклеаз Ракообразных (Рис 8) Она очень похожа на нуклеазу стеклянной кревеки (61% идентичных аминокислот, 77 % аналогичных) и на ДСН (67% идентичных аминокислот, 82 % аналогичных)

кДНК нуклеазы рачка бокоплава была клонирована не полностью Длина полученного фрагмента кДНК составляет 1330 нуклеотидов, не считая полиА фрагмента Анализ данной последовательности выявил открытую рамку считывания длинной 1150 нуклеотидов, которая кодирует белок протяженностью 383 аминокислоты Молекулярная масса этого белка составляет 44,53 кДа, изоэлектрическая точка - 6,73 Аминокислоты с первой по 19-ую предположительно являются сигнальной последовательностью, обеспечивающей секрецию данного фермента Расчетная молекулярная масса зрелого белка составляет 42,19 кДа, изоэлектрическая точка - 6,18 Участок между 44 и 66 аминокислотой предположительно является трансмембранным доменом, а со 137 по 368 - доменом, характерным для ДНК, РНК-неспецифичных эндонуклеаз Согласно построенному нами древу филогенетического сходства нуклеаза рачка бокоплава, в отличие от нуклеаз скрипичного краба и стеклянной креветки, не похожа на нуклеазы подгруппы Ракообразных и образует отдельную ветвь (Рис 8)

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ДСН Анализ аминокислотной последовательности ДСН

Поиск по базе данных BLAST дал еще две нуклеотидных последовательности похожих на ДСН нуклеазы зеленого краба (Carcinus maenas) и нуклеазы лобстера (Homarus americanus)

Доменная структура у нуклеазы зеленого краба и нуклеазы лобстера представлена единственным доменом - нуклеазным (NUC домен), который гомологичен NUC-домену остальных ДНК, РНК - неспецифических нуклеаз Кроме того, нуклеазы зеленого краба и лобстера содержат сигнальный пептид, свидетельствующий о том, что эти нуклеазы являются секреторными белками Между сигнальным пептидом и нуклезным доменом находится последовательность из 120-180 аминокислот Функция этого фрагмента не ясна

Для повышения достоверности идентификации консервативных аминокислот мы расширили нашу коллекцию нуклеотидных последовательностей за счет нуклеаз насекомых Анализ структуры этих нуклеаз показал, что большинство из них содержат сигнальный лидерный пептид и имеют единственный функциональный домен - нуклеазный (NUC-домен) За исключением нуклеазы малярийного комара Anopheles gambiae, содержащей два NUC домена и двух нуклеаз чернобрюхой дрозофилы Drosophila melanogaster и Drosophila psendoobscura содержащих три

нуклеазных домена Используя полученную коллекцию аминокислотных последовательностей, мы сделали множественное выравнивание

Анализ выравнивания (Рис 7) показал, что нуклеазный домен ДСН-подобных нуклеаз длиннее предсказанного программным пакетом SMART и предыдущим выравниванием более чем на 50 аминокислот У ДСН-подобных нуклеаз между NUC-доменом и сигнальным пептидом расположен консервативный регион с неопределенной функцией, содержащий около 140 аминокислот У группы ДСН-подобных эндонуклеаз наблюдается консервативное расположение восьми остатков цистеина по всей длине выравнивания С36, С84, CI 11, С131, С147, С184, С439 и С469

Рис 7 Схема выравнивания аминокислотных последовательностей ДНК, РНК-неспецифических эндонуклеаз NUC-нуклеазный домен, К Р -N-концевой консервативный регион у ДСН подобных нуклеаз, Л П - лидерный пептид Приведенная нумерация аминокислот активного центра и высоконсервативных аминокислот соответствует нумерации Sm нуклеазы и ДСН для Sm-подобных и ДСН-подобных нуклеаз, соответственно

Нуклеазный домен ДНК.РНК-неспецифических эндонуклеаз содержит ряд высоко-консеративных мотивов В N-концевой области он содержит мотив активного центра (270-273 а к согласно нумерации а к выравнивания) R\K, G, Н, M\L\I, а в С-концевой области - мотив (395398 а к согласно нумерации а к выравнивания) WYY\F, R\K, I\V, I\V\L Кроме того он содержит еще несколько консервативных участков в области 290-300 а к и 310-325 а к Основным отличием нуклеазного домена ДСН-подобных нуклеаз от NUC-домена Sm-подобных нуклеаз являтся вставка приблизительно 20-ти а к в районе активного центра (240-265 а к согласно нумерации выравнивания)

Полученный в результате выравнивания наиболее консервативный регион нуклеазного домена был использован для создания максимально достоверного древа филогенетического сходства (Рис 8)

ДСН-подобные нуклеазы

л п,

КР

NUC-домен

Н168Н171 R1B4_ _К235 Н2Э7

Jl 11 К R121R122 G133 G13Q| | | I I I

II

Sm-подобные нуклеазы

I и fir

NUC-домен

Н45 R57 R87H89

N а к выравнивания

1 27 178 240 265

Подгруппа нуклеаз °'-ОАШ72-рг_сс,и ,го_1 Ракообразных

Dr CGI4120 3

An_18575 CaenrCps-6 у Dr_CG8862

Са019 8582

Dr_CC3819

Dr_GA1770a Ал_19760

An_19783' Dr_CG14118 An_17934. An 17892

Dr_IP1044 Dr_GA12733

Dr_GA1190G

Anasp_NUCA

Dr CG3334S

Группа Sm-подобных нуклеаз

Группа ДСН-подобных нуклеаз

GMsal2 Gl_rsa!1

Рис 8 Древо филогенетического сходства ДНК, РНК - неспецифичных эндонуклеаз

Uca - Uca erassipes, Pen - Marsupenaeus japomcus, Pal - Palaemomdae sp , Car - Carcwus maenas, Horn - Homarus americamis, Syn - Synceplaslum racemosum, An - Anopheles gambiae, Dr -Drosophila melanogaster и pseudoobscura, SmNase - Serratia marcescens, Anasp - Anabaena variabilis, Hum_EndoG - Homo sapiens, Caen_Ced - Caenorhabditis elegans, CaO - Candida albicans, Sac - Saecharomyces cerevisiae, Cun - Cunnmghamella eehinulata, Gam - Gammarus sp, Culex - Culex pipiens, Lut - Lutzomyia longipalpis, Gl - Glossina morsitans

Анализ этого древа показал наличие двух больших групп группы Sm-подобных нуклеаз, в которую вошли наиболее изученные на момент начала этой работы Sm-нуклеаза (Serratia maicescens) и нуклеаза NucA (Anabaena variabilis), а также минорная нуклеаза С1В из Cvnmnghamella eehinulata, нуклеаза SC5314 из Candida albicans, эндонуклеаза G (Homo sapiens) и другие, и группы ДСН-подобных нуклеаз, куда вошли ДСН, нуклеазы ракообразных и куклеазы насекомых ДСН и другие нуклеазы Ракообразных, за исключением нуклеазы рачка бокоплава, образуют отдельную подгруппу

Мутагенез ДСН

Даеционный анатз

Для экспериментального определения границ нуклеазного домена мы создали четыре укороченных варианта ДСН

>

1 27

114 149 162

ДСН-фЗ

Рис. 9 Схема доменной структуры ДСН: - по результатам анализа программным пакетом

SMART;____ по данным множественного амикислотного выравнивания;.... по результатам

анализа информационной структуры;---- на основании выравнивания последовательностей

гомологов ДСН с делецией участка YI49 — Е161.

Таблица 3 Сравнение физико-химических свойств делеционных мутантов ДСН.

Фолдинг Активность Устойчивость к протемназе К Термостабильность Специфичность

ДСН-ф 1 нет - - - -

ДСН-ф2 да нет нет нет -

ДСН-фЗ да нет нет нет -

ДСН-ф4 да да нет пет нет

ДСН да да да да да

ДСН-ф1 - самый короткий фрагмент ДСН со 192 по 379 аминокислоту, фланкированный N-концевым бактериальным сигнальным пептидом и С-концевым гексагистидиновым хвостом. Это участок молекулы был выбран на основании данных программного пакета SMART (Рис. 9). Молекулы DSN-ф! после ренатурации формировали агрегаты и после центрифугирования полностью выпадали в осадок.

ДСН-ф2 - фрагмент ДСН с 162 по 407 аминокислоту нуклеазный домен на основании выравнивания последовательностей гомологов ДСН с делецией участка Y149 - Е161 (Рис. 9). После ренатурации молекулы нуклеазы ДСН-ф2 оставались в растворе. Однако, этот белок не проявлял никакой активности и, будучи обработан протеиназой К, деградировал.

ДСН-фЗ - фрагмент ДСН с 149 по 407 аминокислоту был выделен как нуклеазный домен на основании выравнивания последовательностей гомологов ДСН (Рис. 9). После ренатурации молекулы нуклеазы ДСН-3 оставались в растворе. Однако, этот белок не проявлял никакой активности и, будучи обработан протеиназой К, деградировал.

ДСН-ф4 - фрагмент со 114 по 407 аминокислоту был выбран на основании данных анализа информационной структуры (Рис. 9), согласно которым этот участок молекулы ДСН является

обособленным доменом и должен осуществлять нуклеазную активность Действительно, этот фермент обладает каталитической активностью Однако, удельная активность ДСН-ф4 составляет 6 единиц Кунитца на мг белка, что примерно в 1000 меньше, чем удельная активность ДСН При 60°С ДСН-ф4 проявляет на порядок меньшую активность, чем при 37°С, а его инкубация при 70°С в течение 20 минут приводит к полной инактивации ДСН-ф4 неустойчив к протеиназе К, но устойчив к папаину (инкубация при 37°С) Активность ДСН-ф4 по отношению к двуцепочечному флуоресцентному олигонуклеотиду всего лишь в 10 раз выше, чем по отношению к одноцепочечному, тогда как для ДСН это соотношение составляет 1000 раз (Таблица 4) Это говорит о важности участка с28по113ак,ио том, что этот участок включен в целостную пространственную структуру ДСН Более того, именно этот участок ответственен за уникальную субстратную специфичность ДСН На основании этих данных мы предположили, что ДСН-подобные нуклеазы возникли из обычной термолабильной неспецифичной нуклеазы путем инсерции приблизительно в 100 аминокислот Именно этот участок позволил «развить» такие свойства, как термостабильность и предпочтение двух цепочечного субстрата

Таблица 4 Сравнение субстратной специфичности ДСН и ДСН-ф4

Фермент Субстрат 10 ед Кунитца 1 ед Кунитца 0,1 ед Кунитца 0,01 ед Кунитца

ДСН оц ДНК + - - -

дц ДНК + + + +

ДСН-ф4 оц ДНК + + + -

ДЦ ДНК + + + +

Точечный мутагенез

Методом сайт-направленного мутагенеза мы получили 18 мутантов ДСН по 10 позициям (Таблица 5) Все мутантные конструкции были созданы на базе плазмиды рЕТ22Ь+ДСН и экспрессированы в клетках Е cok штамма BL21(DE3) Все мутантные белки были ренатурированы из телец включения и очищены до гомогенного состояния Активность определяли модифицированным методом Кунитца Проверкой на эффективный и правильный фолдинг мутантов служил тест на устойчивость к протеиназе К

Мутант ДСН Н237А не активен, а у мутанта ДСН К235А активность падает в 60 раз Обе эти амикислоты, согласно аминокислотному выравниванию, являются основными каталитическим остатками Таким образом, мы косвенно показали, что Н237 и К235 являются аминокислотами активного центра ДСН Однако, замена R184 на аланин, которая по результатам амикислотного выравнивания соответствует каталитическому остатку R57 Sm нуклеазы, приводит к незначительному снижению активности Это позволяет опровергнуть ранее высказанное утверждение, о том, что R184 аминокислота каталитического центра Мутагенез консервативных

Н168 и Н171 показал их значимость для фолдинга Одиночные негомологичные замены 11121А или Я122А не приводили к значимому падению активности ДСН, однако мутантная обоим остаткам ДСН - Я121А, Я122А - не проявляла ферментативной активности, хотя успешно рефолдировалась и была устойчива к протеиназе К Из чего мы сделали вывод, что одна из этих аминокислот является аминокислотой активного центра, и что Я121 и Ш22 взаимозаменяемы Мутагенез консервативного 0139 и 0133 показал, что замена этих аминокислот на гомологичные полностью лишает белок способности к сворачиванию

Таблица 5 Сравнение активности и эффективности фолдинга ДСН и ее мутантов

Позиция Соответствующие Аминокислоты, Активность, Выход фермента

аминокислоты на которые ед Кунитца\мг после

из Бгп нуклеазы произведена замена ренатурации

Дикий тип - - 6070 20%

Ш21 - К 5990 19%

А 5960 19%

Ш22 - К 6050 20%

А 6030 18%

Ю2Н1122 АА н д * 4%

0133 - V н д 0

0139 - V н д 0

Н168 Н1Э45 К н д 0

А Н д 0

0 н д 0

Н171 - К н д 0

А Н д 0

0 н д 0

Ю84 Я57 К 6100 18%

А 1810 22%

К235 Я87 Я 5980 20%

А 110 21 %

Н237 Н89 А н д 19%

*н д - активность не детектируется

ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДСН Применение рекомбинантной ДСН дикого типа

Ранее в нашей лаборатории был разработан метод нормализации библиотек полноразмерных кДНК, в котором ключевую роль играла нативная ДСН Мы использовали рекомбинантную ДСН вместо нативной для нормализации библиотеки кДНК плаценты человека Как и в случае применения нативной ДСН, средняя длина фрагментов кДНК оставалось неизменной, а концентрации кДНК-копий различных генов стали похожими Так, концентрация кДНК мажорных генов значительно уменьшалась, концентрация кДНК средне представленных генов

оставалась неизменной, а концентрация кДНК минорных генов возрастала Таким образом, при использовании рекомбинантной ДСН происходит эффективная нормализация библиотек кДНК

Применение мутантной ДСН

Для удаления из пробы примеси ДНК часто используют энзиматический метод - обработку

ДНКазами Однако ДСН, несмотря на ее высокую процессивность и специфичность, не может

использоваться для таких целей, поскольку после гидролиза ее сложно инактивировать

Рис. 10 Зависимость активности от температуры для ДСН и ДСН-ТЛ Активность определяли по методу Кунитца • - ДСН-ТЛ, о - ДСН

Температура, С

Нами был найден интересный мутант ДСН, названный ДСН-ТЛ В отличие от фермента дикого типа, стабильного при температуре 70°С, ДСН-ТЛ полностью инактивируется при 65°С (Рис 10) Температурный оптимум ДСН-ТЛ расположен в интервале 37-42°С В остальном он сходен с ферментом дикого типа

оптимум рН лежит в интервале 6-7, ^ устойчив к протеиназе К (при инкубации в течение 30 мин , 37°С), / для активности необходимо наличие в среде ионов М£+2 (от 5 до 20 мМ), ^ сохраняет субстратную специфичность

Термолабильность в сочетании с сохраненной субстратной специфичностью позволили использовать ДСН-ТЛ для избирательного удалении ДНК из проб По истечении необходимого для деградации ДНК времени инкубации (15 минут при 37°С) ДСН-ТЛ можно инактивировать одним из следующих способов

> добавление ДТТ до конечной концентрации 2 мМ и нагревание до 50-55°С в течение 10 минут

у добавлением ЭДТА до конечной концентрации 3 мМ и инкубация при температуре 60°С в течение 10 мин

> инкубацией при температуре 65-70°С в течение 10 мин

Оптимальным вариантом инактивации является добавление ДТГ до к.к. 2 мМ и нагревание до 50-55°С в течение 10 мин. Низкая температура инкубации предотвращает деградацию РНК, а ДТТ оптимален в качестве восстановителя, т.к. он необходим для работы обратной транскрнптазы (дальнейшего синтеза кДНК).

Применение ДСН-ТЛ для удаления ДНК т РНК-проб перед О'Г-ПЦР

Одним из возможных вариантов практического применения ДСН-ТЛ является разработанная нами методика удаления ДНК из РНК-проб перед ОТ-ПЦР.

А

ДСН-ТЛ

от

3 т.п.о

1 т.п.о.

ДСН-ТЛ ОТ

3 т.п.о

1 т.п.о.

Рис. 11 Электрофорез продуктов ОТ -ПЦР полученных с использованием ген специфичных олигонуклеотидов для 23 кДа ЯРЫ ЗА (60 Б рибосомального белка ЫЗА) (А) и ОАРБН (глицеральдегид-фосфат-дегидрогеназы) (Б).

Дорожка 1 - ОТ-ПЦР в присутствии обратной транскрнптазы (ОТ) с РНК скелетной мускулатуры человека необработанной ДСН-ТЛ;

Дорожка 2 - ОТ-ПЦР с РНК скелетной мускулатуры человека, без обратной транскрнптазы (ОТ) и необработанной ДСН-ТЛ;

Дорожка 3 - ОТ-ПЦР в присутствии обратной транскрнптазы (ОТ) с РНК скелетной мускулатуры человека обра-ботанной ДСН-ТЛ;

Дорожка 4 - ОТ-ПЦР с РНК скелетной мускулатуры человека обработанной ДСН-ТЛ; без обратной транскрнптазы (ОТ).

Она состоит из нескольких простых этапов:

1. добавление в пробу ДСН-ТЛ;

2. инкубация в течение 15 минут при 37°С;

3. инактивация ДСН-ТЛ одним из вышеперечисленных методов.

Методика была опробована на РНК скелетной мускулатуры человека. Два обработанных ДСН-ТЛ и два контрольных образца были использованы для синтеза первой цепи кДНК. Обратная транскриптаза была добавлена только в два образца: один контрольный и один опытный (Рис. 11). С этих образцов была проведена ОТ - ПЦР с использованием ген специфичных олигонуклеотидов для генов 23 кДа ЯРЫ ЗА (60 Э рибосомального белка ЫЗА) и вАРОН (глицеральдегид-фосфат-дегидрогеназы). Анализ полученных результатов методом гель-электрофореза показал, что обработка ДСН-ТЛ эффективно удаляет следовые количества геномной ДНК и на много порядков снижает уровень ее амплификации.

Мы сравнили термостабильность ДСН-ТЛ с термостабильностью двух других ферментов, которые чаше всего используются для удаления примеси ДНК из проб - бычей ДНКазы I и нуклеазой креветки. Мы показали, что ДСН-ТЛ пролностью инктивируется при температуре ~55°С, в то время как бычья ДНКаза I и нуклеаза креветки полностью инактивируются при температуре 80 и 65°С, соответственно.

Рис. 12 Влияние повышение температуры на активность ДСН-ТЛ, нуклеазы креветки и бычьей ДНказы 1. • - ДСН-ТЛ; □ - нулеаза креветки; ■ - бычья ДНКаза 1.

20

40

60

80

Температура инактивации, С

Кроме того, мы показали, что ДСН-ТЛ более чем в 2 раз активнее бычьей ДНКазы 1 и нуклеазы креветки. Удельная активность ДСН-ТЛ составляет 6070 ед. Кунитца на мг. фермента, а удельная активность бычьей ДНКазы I и нуклеазы креветки 3000 и 1800, соответственно. Кроме того, в отличие от бычьей ДНКазы 1 ДСН-ТЛ не подвержена протеолитической деградации и устойчива к действию протеиназы К.

выводы

1 Разработан метод экспрессии, ренатурации и выделения активной рекомбинантиой дуплекс-специфической нуклеазы (ДСП)

2 Клонированы кДНК новых нуклеаз (гомологов ДСН) из стеклянной креветки, манящего краба и рачка - бокоплава

3 Проведен сравнительный анализ ДСН и ее гомологов с ДНК,РНК-неспецифическими нуклеазами На основании выявленных функциональных, филогенетических и структурных отличий ДСН и ее гомологи выделены в отдельное независимое семейство дуплекс -специфических нуклеаз

4 Получен и охарактеризован термотабильный мутант дуплекс-специфической нуклеазы -ДСН-ТЛ, полностью инактивирующийся при температуре 55°С

5 Разработан метод удаления примесей ДНК из образцов РНК, основанный на использовании ДСН-ТЛ Показано преимущество ДСН-ТЛ по сравнение с другими нуклеазами, использующимися для удаления ДНК

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 Анисимова В Е , Ребриков Д В , Жулидов П А , Староверов Д В , Лукьянов С А , Щеглов А С Ренатурация, активация и практическое использование рекомбинантной дуплексспецифической нуклеазы камчатского краба Биохимия, 2006, том 71, вып 5, с 636-644

2 Veronika Е Anisimova, Denis V Rebrikov, Dmitry A Shagm, Valery В Kozhemyako, Natalia I Men70r0va, Dmitry В Staroverov, Rustam Ziganshm, Laura L Vagner, Valery A Rasskazov, Sergey A Lukyanov and Alex S Shcheglov Isolation, characterization and molecular cloning of Duplex-Specific Nuclease from the hepatopancreas of the Kamchatka crab BMC Biochemistry, 2008, May 21, 9 14

3 Veronika E Anisimova, Ekatenna V Barsova, Ekatenna A Bogdanova, Sergey A Lukyanov, Alex S Shcheglov Thermolabile duplex-specific nuclease Biotechnology Letters, 2008, 10 1007/sl0529-008-9850-y

4 Veronika E Anisimova, Alex S Shcheglov, Ekatenna A Bogdanova, Denis V Rebrikov, Alexey N Nekrasov, Ekatenna V Barsova, Dmitry A Shagin, Sergey A Lukyanov Is crab duplex-specific nuclease a member of the SerTatia family of non-specific nucleases7 Gene, 418 (2008) 41 —48

Опубликованные тезисы конференций

1 Анисимова BE, Щеглов АС, Богданова КА, Лукьянов СА Рекомбинантная дуплекс-специфическая нуклеаза - ДСН Международная конференция молодых ученых «Ломоносов 2007», Москва, 2007, с 70

2 Анисимова В Е , Щеглов А С , Богданова Е А , Лукьянов С А Изучение структурно-функциональной организации дуплекс-специфической нуклеазы 11-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2007, с 68

3 V Anisimova, A Shcheglov, К Bogdanova and S Lukyanov Recombinant Duplex-specific Nuclease (DSN) The 12lh Biological Sciences Graduate Congress, University of Malaya, 2007, p 260

Заказ № 95/09/08 Подписано в печать 11 09 2008 Тираж ЮОэкз Уел пл 1,25

- ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ^ !, \v\vw с/г ги, е-тш1 т/о@с/г ш

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анисимова, Вероника Евгеньевна

1 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

2 ВВЕДЕНИЕ

3 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1 «ДСН - член семейства РНК, ДНК-неспецифических эндонуклеаз»

3.2 Классификация нуклеаз

3.3 Источники РНК, ДНК - неспецифических эндонук-леаз

3.4 Характеристика РНК, ДНК - неспецифических эн-донуклеаз

3.4.1 Физико-химические свойства

3.4.1.1 Молекулярная масса и изоэлектрическая точка

3.4.1.2 Процессинг и посттраснсляционная модификация

3.4.1.3 Субъединичная структура

3.4.2 Оптимальные условия катализа

3.4.2.1 рН оптимум

3.4.2.2 Температурный оптимум и стабильность

3.4.2.3 Влияние катионов двухвалентных металлов на активность неспецифических РНК, ДНК - нуклеаз

3.4.2.4 Влияние ионной силы на активность неспецифических РНК, ДНК - нуклеаз

3.4.2.5 Влияние хаотропов и детергентов на активность неспецифических РНК, ДНК - нуклеаз

3.4.2.6 Влияние востановителей и окислителей на активность неспецифических РНК, ДНК - нуклеаз

3.4.2.7 Влияние полиаминов на активность неспецифических РНК, ДНК нуклеаз

3.4.2.8 Влияние нуклеотидов на активность неспецифических РНК, ДНК нуклеаз

3.4.2.9 Специфические ингибиторы РНК, ДНК нуклеаз

3.5 Субстратная специфичность

3.6 Механизм действия

3.7 Активность на разных типах субстратов

3.7.1 Активность на полинуклеотидах

3.7.2 Гидролиз плазмидной ДНК

3.8 Фосфодиэстеразная активность

3.9 Первичная структура

3.9.1 Доменная организация

3.10 Пространственная структура

3.10.1 Модель пространственной структуры Sm-нуклеазы

3.10.2 Модель пространственной структуры нуклеазы Nuc А из Anabaena sp.

3.11 Строение активного центра

3.11.1 Аминокислоты активного центра

3.11.2 Координация ионов металлов

3.11.3 Фермент-субстратные взаимодействия

3.11.4 Механизмы катализа

3.12 Биологическая роль

3.13 Применение

4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1 Материалы

4.1.1 Стандартные растворы

4.1.2 Среды

4.1.3 Штаммы и вектора

4.1.4 Ферменты

4.2 Методы

4.2.1 Клонирование нуклеаз-гомологов ДСН из других видов членистоногих

4.2.1.1 Дизайн вырожденных олигонуклеотидов

4.2.1.2 Выделение РНК

4.2.1.3 Синтез кДНК

4.2.1.4 Амплификация фрагментов кДНК

4.2.1.5 Клонирование ПЦР-продуктов

4.2.1.6 Трансформация клеток E.coli,

Метод с использованием ионов Са и теплового шока

4.2.1.7 Выделение плазмидной ДНК модифицированным методом щелочного лизиса по Бирнбойму и Долли

4.2.1.8 Определение нуклеотидной последовательности ДНК

4.2.2 Клонирование ДСН для экспрессии и мутагенез

4.2.2.1 Клонирование ДСН

4.2.2.2 Получение укороченных фрагментов ДСН

4.2.2.3 Очистка ПЦР-продуктов

4.2.2.4 Внесение точечных замен

4.2.3 Выделение и характеристика рекомбинантной ДСН

4.2.3.1 Культивирование штаммов E.coli - продуцентов рекомбинантной ДСН

4.2.3.2 Выделение рекомбинантной ДСН на кобальт-содержащем сорбенте

4.2.3.3 Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии SDS

4.2.3.4 Перенос разделенных в ПААГ белков на нитроцеллюлозную мембрану

4.2.3.5 Иммуноблоттинг белков после их разделения электрофорезом в ПААГ (Вестерн блоттинг)

4.2.3.6 Ренатурация ДСН

4.2.3.6.1 Метод с использованием одноступенчатого диализа

4.2.3.6.2 Метод с использованием ступенчатого диализа

4.2.3.6.3 Метод ренатурации плавным понижением концентрации денатурирующего агента

4.2.3.6.4 Применение протеин-дисульфид-изомеразы (ПДИ)

4.2.3.7 Активация и очистка ренатурированной ДСН

4.2.3.7.1 При помощи протеиназы К

4.2.3.7.2 При помощи папаина

4.2.3.8 Методы определения ДНКазной активности

4.2.3.8.1 По гиперхромному эффекту (модифицированный метод Кунитца)

4.2.3.8.2 По уменьшению молекулярной массы нуклеиновых кислот

4.2.3.9 Определение субстратной специфичности рекомбинантной ДСН

4.2.3.10 Изучение стабильности ДСП

4.2.3.11 Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на ДСН

4.2.4 Анализ аминокислотной последовательности ДСН

4.2.4.1 Анализ первичной структуры

4.2.4.2 Сравнение аминокислотных последовательностей методом выравнивания

4.2.4.3 Построение древа филогенетического сходства

4.2.4.4 Анализ информационной структуры ДСН

4.2.5 Применение и функциональные пробы рекомбинантной ДСН

4.2.5.1 Детекция точечных нуклеотидных замен

4.2.5.2 Нормализация библиотек полноразмерных кДНК

4.2.5.3 Обработка проб для удаления ДНК

4.2.5.4 ОТ-ПЦР с проб, обработанных ДСН-TJI и контрольных проб

5 РЕЗУЛЬТАТЫ

5.1 Получение и характеристика активной рекомбинантной ДСН

5.1.1 Экспрессия и выделение рекомбинантной ДСН

5.1.2 Ренатурация и очистка рекомбинатной ДСН

5.1.3 Каталитические свойства и стабильность рекомбинантной ДСН

5.1.4 Функциональные пробы рекомбинантной ДСП

5.2 Клонирование кДНК генов - гомологов ДСН

5.3 Изучение структурно-функциональной организации ДСН

5.3.1 Анализ аминокислотной последовательности ДСН

5.3.1.1 Поиск гомологичных структур в международных базах данных

5.3.1.2 Сравнение аминокислотных последовательностей методом выравнивания

5.3.1.3 Построение древа филогенетического сходства

5.3.2 Мутагенез ДСН

5.3.2.1 Делеционный анализ ДСН

5.3.2.2 Точечный мутагенез

5.4 Применение ДСН

5.4.1 Применение рекомбинантной ДСН

5.4.2 Применение мутантной ДСН

5.4.2.1 Свойства ДСН-ТЛ

5.4.2.2 Первичная структура ДСН-ТЛ

5.4.2.3 Удаление ДНК из проб с использованием ДСН-ТЛ

5.4.2.4 Сравнение свойств ДСН-ТЛ с другими нулеазами

6 ОБСУЖДЕНИЕ

7 ВЫВОДЫ:

8 БЛАГОДАРНОСТИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рекомбинантная дуплекс-специфическая нуклеаза"

Значение нуклеаз для современной биологии сложно переоценить. С одной стороны, нуклеазы представляют собой очень интересный и важный объект исследования. Любой живой организм содержит несколько разных нуклеаз, играющих существенную роль в его жизни. В настоящее время известно множество типов нуклеаз от высокоспецифичных эндонуклеаз рестрикции, атакующих строго определенные последовательности ДНК, до ДНК, РНК-неспецифичных экзо- эндо- нуклеаз, гидролизующих не только нуклеиновые кислоты, но и нуклеозид-три-фосфаты. Ферменты этой группы являются ключевыми участниками таких биологически важных процессов как репликация, репарация, рекомбинация (в том числе транспозиция), регуляция экспрессии генов, защита от вирусов, апоптоз, а также пищеварение. Ученые, изучающие любой из перечисленных процессов, уделяют немало внимания различным нуклеазам. Но, помимо этого, изучение самих нуклеаз, их молекулярной организации, механизмов взаимодействия с субстратом, основ специфичности очень интересная научная работа. С другой стороны, именно использование нуклеаз произвело настоящую революцию в методах молекулярной биологии. Молекулярное клонирование, позволившее на много порядков увеличить наши знания о живой природе, основано на применении высоко специфичных нуклеаз эндонуклеаз рестрикции. Также на основе использования различных нуклеаз были созданы широко распространенные изучения ДНК-белковых взаимодействий, определения структуры нуклеиновых кислот и другие. Ранее в нашей лаборатории была выделена и охарактеризована нуклеаза из гепатоианкреаса гибридах. Для камчатского краба, впоследствии ей названная дуплекс-специфической минимум 10 идеально нуклеазой (ДСН). Она гидролизует только двуцепочечную ДНК или цепь ДНК в ДНК-РНК осуществления гидролиза необходимо комплиментарных пар оснований. Кроме того, ДСН обладает высокой стабильностью. Эти свойства позволили разработать несколько молекулярно-биологических методик на основе применения ДСН. Также был клонирован ген этого фермента. Оказалось, что его аминокислотная последовательность гомологична ДНК, РНК неспецифическим эндонуклеазам ферментам, гидролизующим, как ДНК, так и РНК, как дву так и одноцепочечную. Поэтому изучение структурно-функциональной организации ДСН является очень интересной научной задачей.Данная работа посвящена изучению рекомбинантной ДСН. Мы разработали метод получения активного рекомбинантного фермента, который необходим для исследования структурно-функциональных связей в белке. Для аккуратного сравнения ДСН с другими ДНК, РНК неспецифическими эндонуклеазами мы клонировали несколько нуклеаз из представителей класса Ракообразных. Филогенетический анализ выявил две эволюционно различающихся группы нуклеаз ДСН подобные и Serratia подобные («классические»). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей этих белков показало наличие существенных структурных различий представителей упомянутых групп. Мы создали ряд мутантных вариантов ДСН, содержащих как точечные замены, так и лишенных определенных концевых участков. Анализ свойств этих мутантов показал, что «дополнительные» (по сравнению с Sm-нуклеазой) участки ДСН обеспечивают ее необычные свойства, в том числе субстратную специфичность. Исходя из этих результатов, мы выделили новое семейство ферментов дуплекс-специфические нуклеазы. Кроме того, рекомбинантная ДСН была успешно применена в ранее разработанной методике нормализации библиотек полноразмерных кДНК, а термолабильный вариант ДСН был успешно использован для удаления примесей ДНК из проб перед синтезом кДНК. Обзор литературы 3.1 «ДСН член семейства неспецифических эндонуклеаз» РНК, ДНК- Недавно в нашей лаборатории была выделена и охарактеризована новая нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба (позже названная дуплекс-специфической нуклеазой, или ДСН). Этот фермент оказался очень необычным: с одной стороны, он обладает уникальной субстратной специфичностью гидролизует только двуцепоченые ДНК-содержащие молекулы; с другой стороны, его аминокислотная последовательность гомологична последовательностям ДНК, РНК неспецифичных эндонуклеаз. Кроме того, на основе этого белка были разработаны новые молекулярно-биологические методики. Данный обзор посвящен дуплекс-специфической нуклеазе камчатского краба (ДСН) и ее структурным гомологам ДНК, РНК неспецифичным эндонуклеазам. 3.2 Классификация нуклеаз Современная классификация учитывает следующие параметры нуклеаз [1-3] (Рис. 1): 4- Тип субстрата ДНК или РНК; -i- Положение атакуемой нуклеотидной связи крайнее в цепи ДНК (РНК) (экзонуклеазы) или в середине цепи (эндонуклеазы); 4- Тип продукта реакции мононуклеотиды или олигонуклеотиды; Тип гидролизуемой связи между 5- или З-атомом сахарного остатка и 4 фосфатом Большая часть ДНК, РНК неспецифичных нуклеаз может быть

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Анисимова, Вероника Евгеньевна

7 Выводы:

1. Разработан метод экспрессии, ренатурации и выделения активной рекомбинантной дуплекс-специфической нуклеазы (ДСН).

2. Клонированы кДНК новых нуклеаз (гомологов ДСН) из стеклянной креветки, манящего краба и рачка - бокоплава.

3. Проведен сравнительный анализ ДСН и ее гомологов с ДНК,РНК-неспецифическими нуклеазами. На основании выявленных функциональных, филогенетических и структурных отличий ДСН и ее гомологи выделены в отдельное независимое семейство дуплекс - специфических нуклеаз.

4. Получен и охарактеризован термолабильный мутант дуплекс-специфической нуклеазы -ДСН-TJl, полностью инактивирующийся при температуре 55°С.

5. Разработан метод удаления примесей ДНК из образцов РНК, основанный на использовании ДСН-ТЛ. Показано преимущество ДСН-ТЛ по сравнение с другими нуклеазами, использующимися для удаления ДНК.

8 Благодарности

Я хотела бы поблагодарить:

Профессора Н.Б. Гусева за многочисленные ценные советы и неоценимую помощь при написании статей;

Е. Богданову и А. Некрасова за помощь в изучении структурно-функциональной организации ДСН;

Д. Ребрикова за помощь в клонировании кДНК копии генов-гомологов ДСН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анисимова, Вероника Евгеньевна, Москва

1. Laskowski М: Enzymes hydrolyzing DNA. Ann NY Acad Sci 1959, 81:776-783.

2. Laskowski S: Nucleases: historical perspectives. In: Nucleases. New York.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1982.

3. Bernard EA: Ribonucleases, vol. 38; 1969. >

4. Chen LY, Ho HC, Tsai YC, Liao TH: Deoxyribonuclease of Syncephalastrum racemosum— enzymatic properties and molecular structure. Arch Biochem Biophys 1993, 303(1):51-56.

5. Chow TY, Resnick MA: Purification and characterization of an endo-exonuclease from Saccharomyces cerevisiae that is influenced by the RAD52 gene. J Biol Chem 1987, 262(3 6): 1765 9-17667.

6. Cunningham L, Catlin, B.W. and Privat de Gar'lhe, M. . A deoxyribonuclease of Micrococcus pyogenes., vol. 78: J. Am. Chem. Soc.; 1956.

7. Eaves GN, Jeffries CD: Isolation and Properties of an Exocellular Nuclease of Serratia Marcescens. J Bacteriol 1963, 85(2):273-278.

8. Ho HC, Shiau PF, Liu FC, Chung JG, Chen LY: Purification, characterization and complete amino acid sequence of nuclease CI from Cunninghamella echinulata var. echinulata. Eur J Biochem 1998, 256(1 ):112-118.

9. Kanamori N, Sakabe, K. and Okazaki, R.: Extracellular nucleases of Bacillus subtilis. Purification and properties. Biochim Biophys Acta 1973, 335:172.

10. Maeda M, Taga N: Extracellular nuclease produced by a marine bacterium. II. Purification and properties of extracellular nuclease from a marine Vibrio sp. Can J Microbiol 1976, 22(10):1443-1452.

11. Mittra В, Sadhukhan PK, Majumder HK: A novel endonuclease from kinetoplastid hemoflagellated protozoan parasite Leishmania. JBiochem (Tokyo) 1998, 124(6): 1198-1205.

12. Dake E, Hofmann TJ, Mclntire S, Hudson A, Zassenhaus HP: Purification and properties of the major nuclease from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 1988, 263(16):7691-7702.

13. Chow TY, Fraser MJ: Purification and properties of single strand DNA-binding endo-exonuclease ofNeurospora crassa. J Biol Chem 1983, 258(19): 12010-12018.

14. Koa H, Fraser MJ, Kafer E: Endo-exonuclease of Aspergillus nidulans. Biochem Cell Biol 1990, 68(l):387-392.

15. Martin CE, Wagner RP: Two forms of a mitochondrial endonuclease in Neurospora crassa. Can J Biochem 1975, 53(7):823-825.

16. Matousek JaT: Purification and properties of extracellular nuclease from tobacco pollen. J Biol Plant 1984, 26:62-73.

17. Vischi MaM, S.: Strong extracellular nuclease activity displayed by barley (Hordeum vulgare L.) uninucleate microspores. Theor Appl Genet 1997, 95:185-190.

18. Siwecka MA: Purification and some properties of a novel dsRNA degrading nuclease bound to rye germ ribosomes. Acta Biochim Pol 1997, 44(l):61-68.

19. Siwecka MA, Rytel M, Szarkowski JW: Purification and characterization of nuclease I associated with rye germ ribosomes. Acta Biochim Pol 1989, 36(l):45-62.

20. Kuligowska EK, D.; Szarkowski, J. W.: Purification and properties of endonuclease from wheat chloroplasts, specific for single-stranded DNA. Phytochemistry 1988, 27:1275-1279.

21. Holstcin SEH, Kobert, В., Hillmer, S„ Brown, P.H., Ho, T.-H.D. and Robinson, D.G.: Subcellular localization of nuclease in barley alcurone. Physiol Plant 1991, 83:255-265.

22. Cordis GA, Goldblatt PJ, Deutscher MP: Purification and characterization of a major endonuclease from rat liver nuclei. Biochemistry 1975, 14(12):2596-2603.

23. Chou MY, Liao TH: Shrimp hepatopancreatic deoxyribonuclease—purification and characterization as well as comparison with bovine pancreatic deoxyribonuclease. Biochim BiophysActa 1990, I036(2):95-100.

24. Harosh I, Mezzina M, Harris PV, Boyd JB: Purification and characterization of a mitochondrial endonuclease from Drosophila melanogaster embryos. Eur J Biochem 1992, 210(2):455-460.

25. Cote J, Ruiz-Carrillo A: Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G. Science 1993, 261(5122):765-769.

26. Cuatrecasas P, Fuchs S, Anfinsen CB: Catalytic properties and specificity of the extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. J Biol Chem 1967, 242(7): 1541-1547.

27. Heins JN, Suriano JR, Taniuchi H, Anfinsen CB: Characterization of a nuclease produced by Staphylococcus aureus. J Biol Chem 1967, 242(5): 1016-1020.

28. Stevens A, Hilmoe, R.J.: Studies on a nuclease from Azotobacter agilis. Isolation and mode of action. J Biol Chem 1960, 235:3016-3022.

29. Yonemura K, Matsumoto K, Maeda H: Isolation and characterization of nucleases from a clinical isolate of Serratia marcescens kums 3958. J Biochem (Tokyo) 1983, 93(5):1287-1295.

30. Kanamori N, Cozzarelli, N.R. and Okazaki, R.: Extracellular nucleases of Bacillus subtilis. The nucleases as 5P-end-group reagents. Biochim Biophys Acta 1974, 335:173-184.

31. Iwasaki M, Igarashi H, Yutsudo T: Mitogenic factor secreted by Streptococcus pyogenes is a heat-stable nuclease requiring His 122 for activity. Microbiology 1997, 143 ( Pt 7):2449-2455.

32. Linn S, Lehman 1R: An endonuclease from mitochondria of Neurospora crassa. J Biol Chem 1966, 241(11):2694-2699.

33. Ikeda S, Maeda N, Ohshima T, Takata N: Identification and characterization of a mitochondrial endonuclease from yeast, Schizosaccharomyces pombe. Biochem Mol Biol Int 1996, 40(5): 1017-1024.

34. Rangarajan S, Shankar V: Extracellular nuclease from Rhizopus stolonifer: purification and characteristics of single strand preferential - deoxyribonuclease activity. Biochim Biophys Acta 1999, 1473(2-3):293-304.

35. Nomura A, Suno M, Mizuno Y: Studies on З'-nucleotidase-nuclease from potato tubers. I. Purification and some properties of the enzyme. J Biochem (Tokyo) 1971, 70(6):993-l 001.

36. Imagawa H, Toryu, H., Ozawa, T. and Takino, Y.: Purification and characterization of nucleases from tea leaves. Agric Biol Chem 1982, 46:1261-1269.

37. Ruiz-Carrillo A, Renaud J: Endonuclease G: a (dG)n X (dC)n-specific DNase from higher eukaryotes. Embo J 1987, 6(2):401-407.

38. Щеглов AC: Дуплекс-специфическая нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба. Диссертах\ия на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва; 2005.

39. Shuai К, Das Gupta СК, Hawlcy RS, Chase JW, Stone KL, Williams KR: Purification and characterization of an endo-exonuclease from adult flies of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 1992, 20(6): 1379-1385.

40. Wei CF, Alianell GA, Bencen GH, Gray HB, Jr.: Isolation and comparison of two molecular species of the BAL 31 nuclease from Alteromonas espejiana with distinct kinetic properties. J Biol Chem 1983, 258(22): 13506-13512.

41. Taniuchi H, Anfinsen CB, Sodja A: The amino acid sequence of an extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. 3. Complete amino acid sequence. J Biol Chem 1967, 242(20):4752-4758.

42. Fraser MJ, Chow TY, Cohen H, Koa H: An immunochemical study of Neurospora nucleases. Biochem Cell Biol 1986, 64(2): 106-116.

43. Kwong S, Fraser MJ: Neurospora endoexonuclease and its inactive (precursor?) form. Can J Biochem 1978, 56(6):370-377.

44. Brown PH, Ho TH: Biochemical properties and hormonal regulation of barley nuclease. Eur J Biochem 1987, 168(2):357-364.

45. Cote J, Renaud J, Ruiz-Carrillo A: Recognition of (dG)n.(dC)n sequences by endonuclease G. Characterization of the calfthymus nuclease. J Biol Chem 1989, 264(6):3301-3310.

46. Franke I, Meiss G, Blecher D, Gimadutdinow O, Urbanke C, Pingoud A: Genetic engineering, production and characterisation of monomeric variants of the dimeric Serratia marcescens endonuclease. FEBSLett 1998, 425(3):517-522.

47. Franke I, Meiss G, Pingoud A: On the advantage of being a dimer, a case study using the dimeric Serratia nuclease and the monomeric nuclease from Anabaena sp. strain PCC 7120 .J BiolChem 1999, 274(2):825-832.

48. Miller MD, Krause KL: Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implications for catalysis. Protein Sci 1996, 5(l):24-33.

49. Ball TK, Suh Y, Benedik MJ: Disulfide bonds are required for Serratia marcescens nuclease activity. Nucleic Acids Res 1992, 20(19):4971-4974.

50. Benedik MJ, Strych U: Serratia marcescens and its extracellular nuclease. FEMS Microbiol Lett 1998, 165(1):1-13.

51. Pedersen J, Andersen J, Roepstorff P, Filimonova M, Biedermann K: Characterization of natural and recombinant nuclease isoforms by electrospray mass spectrometry. Biotechnol Appl Biochem 1993, 18 ( Pt 3):389-399.

52. Rangarajan ESaS, V.: Nuclease Rsn from Rhizopus stolonifer : characteristics of associated -adenine speciyc -ribonuclease activity. J Biochem Mol Biol Biophys 2001, 5:99-108. ,

53. Rangarajan ES, Shankar V: Sugar non-specific endonucleases. FEMS Microbiol Rev 2001, 25(5):583-613.

54. Tucker PW, Hazen EE, Jr., Cotton FA: Staphylococcal nuclease reviewed: a prototypic study in contemporary enzymology. IV. The nuclease as a model for protein folding. Mol Cell Biochem 1979, 23(3): 131-141.

55. Fraser MJ: Purification and properties of Neurospora crassa endo-exonuclease, an enzyme which can be converted to a single-strand specific endonuclease. Methods Enzymol 1980, 65(l):255-263.

56. Filimonova MN, Baratova LA, Vospel'nikova ND, Zheltova AO, Leshchinskaia IB: Serratia marcescens endonuclease. Properties of the enzyme. Biokhimiia 1981, 46(9): 1660-1666.

57. Filimonova MN, Balaban, N.P., Sharipova, F.R. and Leshchinskaya, I.В.: Production of Serratia marcescens nuclease in a homogeneous state and study of the physicochemical properties of the enzyme. Biokhimiya 1980, 45:2097-2103.

58. Shishido K: Effect of spermine on cleavage of plasmid DNA by nucleases SI and Bal 31. Biochim Biophys Acta 1985, 826(2-3): 147-150.

59. Frank JJ, Hawk, J.A. and Levy, C.C.: Polyamine activation of staphylococcal nuclease. Biochim Biophys Acta 1975, 390:117-124.

60. Levy CC, Hieter PA, LeGendre SM: Evidence for the direct binding of polyamines to a ribonuclease that hydrolyzes ribonucleic acid at uridylic acid residues. J Biol Chem 1974, 249(21):6762-6769.

61. Suno M, Nomura A, Mizuno Y: Studies on З'-nucleotidase-nuclease from potato tubers. II. Further studies on substrate specificity and mode of action. J Biochem (Tokyo) 1973, 73(6):1291-1297.

62. Hatahet ZaF, M.J.: Specifc inhibitors of Neurospora endo-exonuclease. Biochem Cell Biol 1989, 67:632-641.

63. Meiss G, Franke I, Gimadutdinow 0, Urbanke C, Pingoud A: Biochemical characterization of Anabaena sp. strain PCC 7120 non-specific nuclease NucA and its inhibitor NuiA. Eur J Biochem 1998, 251(3):924-934.

64. Meiss G, Gimadutdinow O, Haberland B, Pingoud A: Mechanism of DNA cleavage by the DNA/RNA-non-specific Anabaena sp. PCC 7120 endonuclease NucA and its inhibition by NuiA. J Mol Biol 2000, 297(2):521 -534.

65. Nestle M, Roberts WK: An extracellular nuclease from Serralia marcescens. II. Specificity of the enzyme. J Biol Chem 1969, 244( 19):5219-5225.

66. Nestle M, Roberts WK: An extracellular nuclease from Serratia marcescens. I. Purification and some properties ofthe enzyme. J Biol Chem 1969, 244(I9):5213-5218.

67. Rangarajan ES, Shankar V: Nuclease Rsn from Rhizopus stolonifer: specificity and mode of action. Biochem Biophys Res Commun 2004, 317(l):265-268.

68. Friedhoff P, Meiss G, Kolmes B, Pieper U, Gimadutdinow O, Urbanke C, Pingoud A: Kinetic analysis of the cleavage of natural and synthetic substrates by the Serratia nuclease. Eur J Biochem 1996, 241(2):572-580.

69. П.А. Жулидов ЕАБ, А.С. Щеглов, И.А. Шагипа, Л.Л. Вагнер, Г.Л. Хазпеков, В.В. Кожемяко, С.А. Лукьянов, Д.А. Шагин: Метод создания нормализованных библиотек кДНК, обогащенных полноразмерными последовательностями. Биоорганическая химия 2005,31:1 -9.

70. Cotton FA, Hazen EE, Jr., Legg MJ: Staphylococcal nuclease: proposed mechanism of action based on structure of enzyme-thymidine 3',5'-bisphosphate-calcium ion complex at 1.5-A resolution. Proc Natl Acad Sci USA 1979, 76(6):2551-2555.

71. Pritchard AE, Kowalski D, Laskowski M, Sr.: An endonuclease activity of venom phosphodiesterase specific for single-stranded and superhelical DNA. J Biol Chem 1977, 252(23):8652-8659.

72. Felsenfeld GaS, G.: The dispersion of the hyperchromic effect in thermally induced transitions of nucleic acids. JMol Biol 1962, 5:587-610.

73. Meiss G, Gast, F.-U. and Pingoud, A.M.: The DNA/RNA non-specific Serratia nuclease prefers double-stranded A-form nucleic acids as substrates. J Mol Biol 1999, 288:377-390.

74. Gray HB, Jr., Winston TP, Hodnett JL, Legerski RJ, Nees DW, Wei CF, Robberson DL: The extracellular nuclease from Alteromonas espejiana: an enzyme highly specific for nonduplex structure in nominally duplex DNA. Gene Amplif Anal 1981, 2:169-203.

75. Ho HC, Liao TH: Protein structure and gene cloning of Syncephalastrum racemosum nuclease. Biochem J 1999, 339 ( Pt 2):261-267.

76. Wang WY, Liaw SH, Liao TH: Cloning and characterization of a novel nuclease from shrimp hepatopancreas, and prediction of its active site. Biochem J 2000, 346 Pt 3:799-804.

77. Miller MD, Cai J, Krause KL: The active site of Serratia endonuclease contains a conserved magnesium-water cluster. J Mol Biol 1999, 288(5):975-987.

78. Miller MD, Tanner J, Alpaugh M, Benedik MJ, Krause KL: 2.1 A structure of Serratia endonuclease suggests a mechanism for binding to double-stranded DNA. Nat Struct Biol 1994, 1(7):461-468.

79. Lunin VY, Levdikov VM, Shlyapnikov SV, Blagova EV, Lunin VV, Wilson KS, Mikhailov AM: Three-dimensional structure of Serratia marcescens nuclease at 1.7 A resolution and mechanism of its action. FEBS Lett 1997, 412( 1):217-222.

80. Ghosh M, Meiss G, Pingoud A, London RE, Pedersen LC: Structural insights into the mechanism of nuclease A, a betabeta alpha metal nuclease from Anabaena. J Biol Chem 2005, 280(30):27990-27997.

81. IColmes B, Franke I, Friedhoff P, Pingoud A: Analysis of the reaction mechanism of the nonspecific endonuclease of Serratia marcescens using an artificial minimal substrate. FEBS Lett 1996, 397(2-3):343-346.

82. Friedhoff P, Kolmes B, Gimadutdinow O, Wende W, Krause KL, Pingoud A: Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res 1996, 24(14):2632-2639.

83. Fraser MJ: Alkaline deoxyribonucleases released from Neurospora crassa mycelia: two activities not released by mutants with multiple sensitivities to mutagens. Nucleic Acids Res 1979, 6(l):231-246.

84. Compton MM, Cidlowski JA: Identification of a glucocorticoid-induced nuclease in thymocytes. A potential "lysis gene" product. J Biol Chem 1987, 262(17):8288-8292.

85. Gaido ML, Cidlowski JA: Identification, purification, and characterization of a calcium-dependent endonuclease (NUC18) from apoptotic rat thymocytes. NUC18 is not histone H2B. J Biol Chem 1991, 266(28): 18580-18585.

86. Matousek J, Trnena L, Oberhauser R, Lichtenstein CP, Nellen W: dsRNA degrading nucleases are differentially expressed in tobacco anthers. Biol Chem Hoppe Seyler 1994, 375(4):261-269.

87. Shapiro J, Machatlie L, Eron L, Ihler G, Ippen K, Beckwith J: Isolation of pure lac operon DNA. Nature 1969, 224(5221):768-774'.

88. Marks A, Spencer JH: Isolation of Escherichia coli transfer RNA-gene hybrids. J Mol Biol 1970, 51(1): 115-130.

89. Joseph DR, Stafford DW: Purification of sea urchin ribosomal RNA genes with a single-strand specific nuclease. Biochim Biophys Acta 1976, 418(2): 167-174.

90. Bartok K, Fraser MJ, Fareed GC: Detection of sequence heterology by use of the N. Crassa nucleases. Biochem Biophys Res Commun 1974, 60(2):507-514.

91. Kacian DL, Spiegelman S: Use of micrococcal nuclease to monitor hybridization reactions with DNA. Anal Biochem 1974, 58(2):534-540.107,108109110111112,113,1141151161. N7118119120

92. Fox KR, Waring MJ: The use of micrococcal nuclease as a probe for drug-binding sites on DNA. Biochim Biophys Acta 1987, 909(2): 145-155.

93. Al'tshuler IM, Zhulidov PA, Bogdanova EA, Mudrik NN, Shagin DA: Application of the duplex-specific nuclease preference method to the analysis of point mutations in human genes. BioorgKhim 2005, 31(6):627-636.

94. Peng RH, Xiong AS, Xue Y, Li X, Liu JG, Cai B, Yao QH: Kamchatka crab duplex-specific nuclease-mediated transcriptome subtraction method for identifying long cDNAs of differentially expressed genes. Anal Biochem 2008, 372(2):148-155.

95. Zhao Y, Hoshiyama H, Shay JW, Wright WE: Quantitative telomeric overhang determinationusing a double-strand specific nuclease. Nucleic Acids Res 2008, 36(3):el4.

96. Strimmer K, von Haeseler A: Likelihood-mapping: a simple method to visualize phylogeneticcontent of a sequence alignment. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94( 13):6815-6819.

97. Yang: The among-site rate variation and its impact on phylogenetic analyses. Trends Ecol Evol1996, 11:367-372.

98. Bukach OV, Seit-Nebi AS, Marston SB, Gusev NB: Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur J Biochem 2004, 271(2):291-302.121. 122.123.124.125.126.127.128.129.130.131.132.133.134.135.

99. John E. Coligan; Ben M. Dunn; David W. Speicher PTW: CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE John Wiley & Sons, Inc.; 2003.

100. Matz M, Shagin D, Bogdanova E, Britanova O, Lukyanov S, Diatchenko L, Chenchik A: Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. Nucleic Acids Res 1999, 27(6): 1558-1560.

101. Junowicz E, Spencer JH: Studies on bovine pancreatic deoxyribonuclease A. II. The effect of different bivalent metals on the specificity of degradation of DNA. Biochim Biophys Acta 1973, 312(1):85-102.

102. Junowicz E, Spencer JH: Studies on bovine pancreatic deoxyribonuclease A. I. General properties and activation with different bivalent metals. Biochim Biophys Acta 1973, 312(l):72-84.

103. Kunitz M: Crystalline desoxyribonuclease; digestion of thymus nucleic acid; the kinetics of the reaction. J Gen Physiol 1950, 33(4):363-377.

104. Kunitz M: Crystalline dcsoxyribonuclease; isolation and general properties; spectrophotometric method for the measurement of desoxyribonuclease activity. J Gen Physiol 1950, 33(4):349-362.

105. Price PA, Liu TY, Stein WH, Moore S: Properties of chromatographically purified bovine pancreatic deoxyribonuclease. J Biol Chem 1969, 244(3):917-923. Thatcher DNaH, A.: Mechanisms of Protein Folding. 1994:242-250.

106. Hlodan R, Craig S, Pain RH: Protein folding and its implications for the production of recombinant proteins. Biotechnol Genet Eng Rev 1991, 9:47-88.

107. Calvo E, Ribeiro JM: A novel secreted endonuclease from Culex quinquefasciatus salivary glands. J Ex/? 5Ы2006, 209(Pt 14):2651-2659.