Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕГУЛЯЦИЯ НИТРОГЕНАЗЫ . БАКТЕРОИДОВ RHIZOBIUM LUPINI

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "РЕГУЛЯЦИЯ НИТРОГЕНАЗЫ . БАКТЕРОИДОВ RHIZOBIUM LUPINI"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ' ОРДЕНА ЛЕНИНА. ИНСТИТУТ БИОХШИИ им.А.Н.БАХА. ■

Л На правах рукописи

ПОДЛЕЛА Елена Михайловна*

РЕГУЛЯЦИЯ НИТРОГЕНАЗЫ ЁАКТЕР05Щ0В ни20вюм шрвп.

ч ' т ' -.

г щ, , . • .

(Биологическая химия - 03.00.04)

1 ■

Автореферат у

диссертации на соискание ученой степени ■ ' ■ ; кандидата <5к о логических наук

а .

Москва - 1978

Работа выполнена з лаборатории энзш.'ологии ордена Ленине ' Института бпохилии имешг А.К.Баха -У! СССР.

Научные руководители - член-корреспондент АН СССР, профессор В.Л. Кретович и доктор биологических наук 3.Г.Евстигнеева,

Официальные оппоненты:

Профессор, дортор биологических наук* -

В,К.ШИЛЬНИКОВА _

Кандидат биологических наук

В'.В.ШСОЛОВ

На официальный отзыв работа направлена в Институт -физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР , ,

Автореферат разослан -Ж» не я 197С г.

Защита состоится " ишя 1978 г. на • заседании Спецяалпзярованного Совета (К002.96.01) ■

давите диссергздай на со ¡:с капке ученой степени кандидата .ологических наук 2 Институте бксззойти иг.:. А.Н.Бежа АН СССР (117071, Москва В—71, Ленинский проспект, 33, корхи 2).

С диссертацией мокко ознакомиться в библиотеке Биолог-/-' 1кого отделения АН СССР (Москва, Ленинский проспект, 33,

Учешй секретарь Спэцзаж;з::ровэнного Совете, кандидат биологических наук Ц

. а/.М?-

1

3.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PAEOTU .

Актуальность проблем«.; "Биологическкй" .азот. накапливаегшй в почве азотфиксирующиыи микроорганизмами, имеет г.ергостепеп-ное значение; душ земледелия. Фпксацио атмосферного азота осу-ществляот две групшг микроорганизмов: свободвоживущие и сем- . ; биотро<£ные азотфдксаторы. Сельскохозяйственная продукция мера ежегодно выносит из почвы до 100 млн. тонн азота. Шещийся азотный дефицит в значительной мере компенсируется за счет дея- ; г тельности почвенных азотфиксаторов. НакопиЕшп2ся к настоящему' i

■ времени опыт позволяет оценить огромную роль бобовых растений

в плодородии почвы. Клубеньковые бактерии б симбиозе с 6о6оеы- , ми растениями способна возвратить в почву до- 200 кг азота на , ; га'(Мииустгн, Шальникова, 1968). Этот процесс имеет большое ; значение для повшения плодородия почв и урожайности сельскохозяйственных культур. . .

V-t Весьма важным является изучение механизма .действия нитрогеназы (К.Ф. 1.7.99.2), фермента, катализирующего реакцию вое-становления молекулярного'азота, в частности,''изучение регу-' ляции фермента метаболитами.энергетического и азотного обмена. ' Цель я задачи исследования. Задачей исследования бцяо: раз- . ., работка методов получения и очистки препаратов нитрогеназы V из 'бактероидов люпина, а также изучение кинетических харак- . териотик нитрогеназы. .' ' : ^ . "

Известно,4 что для действия нитрогеназы из различных источников обязательным является присутствие источника энергии. . в виде ¿ТФ.,В связи о этим задачей данной работы явилось исследование роли ATS и некоторых днугих метаболитов энергети-. ческого обмена в регуляции активности нитрогеназы. \ 1 Било также изучено влияние ашкака - первого стабильного продукта .фиксации молекулярного азота на процесс азотфкксацяи,

■ а также'некоторых метаболитов, участвующих в ассимиляция амша-.•■'.' ка, такжкак аминокислота. В частности, нас интересовало влияние на активность нитрогеназы дпкарбоновых аминокислот и. - лч

■ /.амидов, .V; ;■ '■■.'-.■.■'■

Научная новизна работы. Установлены "Кинетические параметры нитрогеназы вз бактероидов Rh . ¿upinL. ИсследоЕана

^д. -fiiiisii wssifi.. г.я;Д, кг.% Шил

г,-

. . ■ л -

, регуляция.фермента метаболнтама энергетического и азотного обмена. АТФ является нё<только донором:энергии в'реакции, ката-'лдзируемой нитрогеназой, но и аллостерическлм эффектором, влия-,кщим на конфорлацкзэ1 фермента. Адениловке нунлеозадфосфатн ДЦф п АМФ являются ^'ингибиторами исследуемой нетрогеБазы . Ре^ллдто-■ цую роль может играть соотношение концентраций А№': ДДФ : Показано, что аммиак в определенной концентрации является^ин-- гибитором ннтрогеназн из бактероидов лтина. Приоритетными - ■■ -являются данные о ингибирующеи действен ряда аминокислот и аъга--дов, образующихся в результате:ассимиляции аммиака,икетокЕслот, являвшихся предшественникам амлнокислот. Характер действия •■■ хетокислот и ряда аминокислот„зависит от концентрации эффекто-' : ра. ;Иягибирук<еб действие дакарбоновых аминокислот й амидов . представляет собой регуляцию литрагевазы по принципу отрицательной обратной связи. Показано, что; по характеру,внгибнрова-.-ния действие аминокислот является кумулятпвнш. . ^ , . ; Практическая ценность работы. Полученные нами данные по 1шнетлчесаим параметрам шггрогеыазн и регуляции активности фермента различными метаболитами позволяет глубже понять молекулярный механизм действия этого фермента в клубеньках высшего" растекся. Практическое значение'полученных¿результатов по изучению свойств и регуляции активности нитрогеназы определяется ; огрошшм народохозяйственным значением всей проблемы биологической Таксации молекулярного азота. Исследование.механизмов „,." регуляции этого важнейшего фермента имеет большое значение дая ; разработки ^инципов интенсификации процесса азотфиксации л ■ позволяет наметить подхода к управленио'интепсивноотью процесса фиксации молекулярного азота. ■'."■ .V '.*■■ -" ■ Апробация работы. Основный положения диссертационной работа докладывались-на 4 и 5 ¿Всесоюзных Баховскдх коллоквиумах по биохимии азотфиксацзи (Москва, 1971; Канев, 1976), 3 Всесоюзном биохимическом съезде (Еига, 1974),' 9 Международном ботаническом .конгрессе (Ленинград, 1975). . ' ? Публикации. По полученным результатам работы опубликовано 5 печатных рабох. ... ■■.'■"'

, Структура и объем ртссертации. Диссертация состоит из « введения, 5 глав и выводов. Работа содержит страниц машинописного текста, 15 рисунков, в таблиц. Библиография включает

190 наименований, в том числе ./ЗУ иностранныхработ. .

' . МАТЕРИАЛ И-МЕТОДЫ

; В настоящей работе бил использован эффективный 359а штамм ЙЬ. 1ир1пС. . ; \ Этот штамм клубеньховых бактерий был полу-1 чен нами из ВНИИ сельскохозяйственной ьшфобиологии.

Материалом для исследования служила клубеньки люпина жел- . того Цир£/?и$ ЕиЫирМ. ). Семена лшина перед посевом-пно-кулировали эффективным 359а штаммом ДА. '^смачивая сем- , . на суспензией клубеньковых бактерий в 0,3 И сахарозе., 1 -.*■ . Растения выращивали в поле совхоза Горки ^ 2 псковской об- ' ласти на супесчаной почве. ■

" Свеяесобранные растения лшина промывали водой и отделяли-клубеньки с частью корпя под струей аргона.

, Клубеньки лшина разрушали в гомогенезаторе для раз пельмени^ растительных' тканей при 8000 •об/мин в течение I г.кшуты в фосфатном буфере рН 7,0.(в отношении 1:1,5), содержащем 0,3 М сахарозы, 1,5$ поливинилшролЛцдона, 0,2 М аскарбиновой кислоты ■■■' натриевой соли. Разрушение проводили в атмосфере аргона, путем . непрерывного продувания .аргона'через все объемы и дезинтегратор. " ^ ■ ,, .

Полученный после разрутпения клубеньков.гомогенат отаимали через нейлон 100 меш; обрывш тканей клубеньков отбрасывали, экстракт центрифугировали при 500р £ в течение 20 минут в.цент-■ рифуташх стаканах с герметичными специальными;пробками. Осадок полученный после центрифугирования, состоящий в основном из бактероидов, промывали 0,1 М ^-фосфатным буфером рН 7,0 для : удаления легоглобина. Промытые бактероиды суспендировали в ОДМ трис-НС1 буфере рН 7,2 в соотношении 1:2.

Для получения бесклеточного экстракта суспензию бактероидов помещали в камеру для разрушения клеток микроорганизмов (Любимов, Львов, 1968), охлэзденпую сухш льдом до -90-70°С и разрушали при наложении давления 100-150 ата, пользуясь гидравлическим прессом. Полученную мзссу оттаивали и центрифугиро- . вали на центрифуге К-24 при 22СО0 у в течение -30 минут для уда.. ления неразрушенных клеток и юс крупных осколков. Далеенад-осадочная квдкость .была частично очищена прогреванием при 54°С под водородом в течение 5-7 минут. Перед тепловой обработкой

: * к препарату для стабшиззцди ^ерлента добавляли дат;:отреитол : ■■/(■).'■'.' ез расчэта 5-8 ?лг на 10 мл препарата и сернокислое железо за- ,

••V.;- кисное из расчета 20 мг на 10 мл.' После прогревания "препарат 1 : центрифугировали на" центрифуге К-24 при 22000 в течение'20 • '•'••

•;.. *5"ТГ- кинут« Осадок. отбрасывали, 'а .кадосадочпую жидкость лсполъэовэ- * :

в качестве ферментного препарата пктрогенази. ¡."\'г'' . ^ Для разделения нитрогеназы на.белковые компоненты исполь- ^ ; зов зли анаэробною хроматографию на ДЭАЭ^Деллгаозо. Болок» схо-^ .

'•••&';•« парзтов нитрогеназы определяли ацетиленовыхметодом,: прэдложен-.0 нкм Хардп ( Нап/у (¿а/, 1968а). ■ Метод основанна' способно- V

ста нптрогенаэц восстанавливать ацетилен в:этилен^.'' . V ■•*"'. - Количество образовавшегося. этилена определяла' газово-хро- ■; ■..' * '"'.'••?•- матографяческшл ■ ¿¡'¿годом' на Г газо-хадаюстяом хроматографе' 1ром-ЗХ ;

:• (чсср). \

Разделение этилена и ацетилена проводили на колонке .Г )■'. 2000 мм) нержавеющей стали,: наполненной Порапаком '.'/у ; ^.100-120 меа фир^; "у/о£ёг$ \ffss0c." **• сша, который предназначен ' V ', ; \' ^К- -■ специально для разделения этилена и ацетилена. Время удержа- Т

-ионизационным детектором.^Объем вводимой пробы I мл. '■';.' ^ Я V Для определения азотфзксирупдей активности клубеньков

= рия и 0,001 лк'оль ^С^.бНзО. - •'• : -; ' ■ V

;Реакционная"смесь для определения азот&лкеярухсей актяв-; " ности содержала (мкиольДух) : • трис-НС1 буфер рК 7,2 - 100; ';. V . К^С^.бйзО -;5;.'АТФ - 10; креаткнфосфат натрия - 35; креатин- ' ' ' ; фосфокиназа - 2 мг, дитионит - 20. Газовая смесь содэряала V / ; аргона, 1255 ацетилена. -Белок определяла по ыетоду Доури :

(Cowry etal} 1951). За'единицу активности принимали количество нмолей образовавшегося этилена - за минуту. Удельная активность*— единицы актиэнооти на ш* "белка..г * ■ ; :',"-- " ' • .Содержанке кеге:лш:ового селе за, в .белковых фракциях опре-дсляла:по.методу Рамсёя( RcimffOyf Д953),, Ьсноэахшжу на об- ■ разоваиии окраиешюго' в розовый цвет комплекса неге:жшового гелеэа.с U, Д' -.диппрадило.^ .. ''.'■■'" :'■:■. ■

V* ;' Содержание. молибдена в белковых фракциях определяли спект-рофотометрическп на спектрофотометре ЕЕРД. ■ ■

Для оценки кинетических параметров фермента использовала-графический метод и метод Курганова (Курганов, 1971).

;; РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЭДЕЖЕ '. "/ ' '-Уу/,

I. Выделение и очистка'ниттюгенаэц_кз бастерошгоэ лтопиа

, Последовательные стадии взделения и очистки китрогеназ-ного ;ко!,й!лекса из бактероидов Rh. Cupini представлены на ■ схеме I.,Очистка китрогеназы проводиласъ нами в два этапа. Первый этап включает в себя экстракцию фэр/ентаиз разрупен- . пых' бактероидов, центрифугирование полученного экстракта и предварительную очистку путемпрогревания. Второй этап знлзэча-ет более тонкуп очистку, путем хроматография на иошюобглешшкег j ДВ-52-целлюлозе■ (фирмы VJathman ).

В результате прогревания форгдштного препарата, проводимого в строго;контролируемых,условиях при. 54°С в течение 5 '■• ьянут под водородом в прюутствии дитиотреитола. и ионов двухвалентного железа,удельная активность китрогеназы увеличивалась в 3-6 раз (таблица.I). Выход по белку составлял около 25JS, по активности около 95JS. Данный препарат китрогеназы использовался наш для исследования.кинетических характеристик и регуляции фермента. Этот.препарат сохранял 80^.активности в течение недели при хранении в замороженном состоянии в ге]>-ыетачн!» сосудах в атмосфере аргона.

Препарат," полученный после "прогревания с иоследущкм цент-, рифугированием использовался нами для дальнейшей очясткл "'';.'.; хроматографией на ДЕ-52-целлюлозе . За основу была принята схе-' ма очистки. нит.рогеназы из Л. vinei<m<Jii . предложенная Кейли'

, Бактероида

1 г* .

: Цромывгние 0,1 М К-фосфатным буфером рП 7;0 ; ; . Суспевдировение в 0,1: М трис-НС! буфере рН 7,2 ;-■ Разрушение б прессе при -70УС ;;.■•: '

Центрифугирование при 22000 ^ 30 минут ■ ■ — :

Осадок : .отбросить :

Прог^оевание при 54°С 5 манут

под водородом ;:

' "у* 'Центрифугиро^аиие при 22000 о

■/ V: , .. 20 кинут -

Осадок , отбросить

Ферментный препарат;нитрогенаэа

. Раздолеше ¡штрогеназы на компоненты на ДЭАЭ-целлалозе ; У'..

-белок

^Га-белок

Ракоглбинация кошюнентов

I - '

МИТРСГЕ21АЗА

Схеш1. Выделение и отасткв нитрогеназного комплекса, ' из клубеньков люпина.•V " • ■ .

I

9.

( fiztiy d ûl, 1967). Предварительно коленку с ДЗ-52* : * 1 -диаметром 12 мл и высотой 40 ил пребывали 0,025 M

• ' трис-JICI буфером рН 7,2. Воздух был полностью удален и замещен в системе аргоном, буферы и посуда был:: промыты аргоном, все операции проводились в строго анаэробных условиях. Частич— ; , но очищенный экстракт бактеровдов люпина наносили • анаэробно ■-.

на восстановленную дитяонитом колонку с ДВ-52. Несорбировав- ' ! ; шиеся белки удаляли 0,025 M трис-НСХ буфером рН 7,2. Элюряя . белков с колонки проводилась со скоростью тока 60 мл/час по- : следовательно четырьмя растворами с различной ионной силой:. * г 0,15 M' WaCI,' 0,035 M-^ÇIg, 0,060 M MjCIg, ;0,90 M MjCIg, кате-, дыЯ из растворов был приготовлен ita 0,025 M трис-IIGI буфере . рН 7,2. .

. фракции собирали с колонки посредством, иглы-Для инъекций

в закрытые резиновыми пробками,, промытые, аргоном.особой часто-. ". ,ти", сосуды от пенициллина! емкостью 15 мл по 5 мл в каждом. , . Возможно 'эта фракция содержало цнтохромы и значительное количество неокрашенных белков.. При^поЛтощя 0,15,M раствора WaCI с колон:ш элшровалась фракция, окрашенная в коричневый цвет. -,.-■■ Эта фракция находилась в объеме элюзта от 80 до 110 мл и со- держала значительное количество молибдена и негеьонового железа. При нанесении на колонку 0,035 М, 0,060 M и 0,000 M * растворов MjCIg происходила злюция охфзшецных в езетло-корич- .. невый цвет фракций, содержащих негеминовое делезо и слздовые • количества молибдена. * ..' ■.■.'■"'■ \ i

;,' Профиль элодти белковых фракций к содержание в пих неге- : 1

швового аелеза и молибдена изобракены на рис.1. Ни одна из . фракций в отдслыюсти не обладала нитрогеиазной активностью; ■ Объединение равных объемов йвакиий. полученных при элшрова--ния < растворами 0,15 M NaCI и 0,060 M MgGIg ''позволило воспроизвести*нитрогепазйую активность. Препарат, полученный при объединении равных объемов этих белковых фракций обладал значительно более высокой'удельной активностью, чем исходной препарат, нанесенный lia колонку»

Но данным Таблица I видно, что нами получен препарат нят-. . рогеназн, очищенный почти в пятьдесят раз. Процедура хроматографии на ДЭАЭ-целлшозе позволила очистить нитрогепэзу в десять раз. Выход по активности равнялся 60$. 1 . • .

' : * • : . . • ' " * ■ Тйблэда I <

Очистка .штрогсиагы из бактероидов люгоша - y/*'.'-

Стадия очистки ■ Í ■ '* г \' ' ■ ' Ус - Объем " мл Белок МГ . Удельная активность ; Cgfy нмошь \ мян. мг белка - Количество единиц . активности Выход во. ектиа- ности Степень оэдсткз

Неочищенный экстракт 72 . 1512 ; 0,68 ..■■'.'.■ 1028 .* ■■ 100 I .'у

Прогреваште при 54°С под водородом.. ■ 40 ; ■ зад . 2,85 . • . .972 94 4,2 ■ : .

фикция, содержащая : молибдофе рредоксин{I) ; 25 '14,1; ' 0 0. ■ ■'. - .

Фракция, содержащая1-' азоферредошшШ) го 5,0 ..■■.' .»г ' о * '

' I II.фракции. ' -- :. 19,7 . 33,0 628'' 61 48,5

нанесение I . праУы»

' коилонекш Х-

0,15 М «а И ,

I 0,035М I 0,060(1 ^ 0,090 п

Рзс Д.

гоо 2бо '¿со ■ 350 чл . , '"."V. ■ ;* .■■.'■ - — ■;. объем \ элюата .Профиль элицеи белковых фракций и,содержание в , них негешшового яеле за и. молибдена. —. -концентрация белка,' ——, -концентрация негемино-

вого железа, О *-содержание молибдена. *

\ \Г

Рис.2,

. ■ о <о го зо мин

Ьргня ■ .■■. л ■.■

Инйктивируищее действие кислорода на нитрогеназу

из бактероидов люпина. Содержание кислорода .в. га- -

зовой фазе 2,354. .."" Ч..Ч ^

[

• Из этих результатов видно; что нитрогеназо бактероидов люпина содержит . .'..'два белковых компонента,'пер-- "" ■■■

;■*'-. - вый компонент молкбдо£ерредохсин элгаруется 0,15 К ЫгС1 и, , ::■ ■ ^ " содерЕят молибден: и негемиковое железо, второй компонент азо-

ферредоксин элЕируется 0,060'М. и содерглт негешновое

-■■■:...■ ..V. железо... .л.: './<'■.-.'_'■ - ..--".;■'■; -

2* Стабильность нитрогеназы.

; Одной из прехстических трудностей, имеющих место при роботе с нитрогеназной системой, является ее *фгйняя чувствлтель— ' ность к гаслороду. Инактивация 1штрогеназ& из бактероидов ш>~_

■:■'"■ пина в присутствии 2,3% кислорода в газовой фазе при 28°С по-казана"на Рис.2, Нитрогеиаза теряет 50£ своей активности в этих условиях за шесть -минут* Полная потеря активности происходит за 40 кинут экспозиции препарата нитрогеиаза в газовой .. смеси, содеркавда 2,3£ кислорода., . " / ■■ '

: ■ Н$га било установлено, что нитрогеиаза из бактероидов люпина, также как и из других микроорганизмов холодолабильна,< • . >','../ ' • чтб отличает ее от других ферментов. При 0°С препараты нитро-' гелази теряли до 5С{? активности а течение часа. При комнатной

■ .-1" температуре активность сохранялась 3-4 часа. Однако очень быст- .. \ .! > рое - заморшашанке в жидком азоте позволяло сохранить препара— ..'.■. ты нктрогекази активными в течение педеля. Следует отметить, , ..

что по мере очистки нитрогеназы повышались ее чувствительность

■ - к кислороду и холодолабильность. Бее стадия приготовления бес- ; *■;■

клеточных экстрактов штрогеназы из■ бактероидов лапина .выполня-. . г: лись при комнатной температуре' с добавлением восстановителей '- " ; -. "датйотреитола, дитпонита и солей'двухвалентного' железа. В при- * .; <■ сутствии этих восстановителей и Н^ фермент оказался термоста-* бальным к выдергивал прогревание до 50°С в течение 5; минут, .

. . что было использовано при очистке. ■'.-.3. Кинетические пар?ктдр:тст1паг нитрогеназн.

^ ■ Исследование кинетики ферментативных реа!щий как метод ■ ';" ; изучения механизма действия индагвидуальных ферментов;получил !-■-.

- широкое распространение.-Наш-били сняты основные кинетичео- * ■■ ■.'../кие характеристики; фермента.;;": .л■

Было обнаружено.' что имеется начальный период за- " -г медленной скорости реакции, затем скорость реакщга возрастает' > \

и''после'20 минут инкубации скорость реакции достигает максимальной' величины (Рас. ЗА),

В определенных пределах увеличение концентрация белка при- . .:.'.-водит к увеличению скорости реакции восстановления ацетилена, но при дальнейшем увеличении концентрации белка в опытной сме- ' i си, превышающем 5 мг/мл, наблвдается снижение скорости реакции, что ; связано, по-видимому, с тем, что ферментный препарат очищен только частично (Рис. ЗБ). * ."■■; ■

Оптимальные концентрации донора ; электронов дигионита на- ; ' ходятся в пределах 10-20 ккМ (Рис. ЗВ). Из приведенных данных ( мокно ввдеть, что фермент интабируется высокими концентрация- ми дитионита.

Нитрогеназаиз бактероидов ;лзопкна активна в шроком ин—

■ тервале pH (Рис. ЗГ). На .основании нашпсданных определение нитрогеназной активности проводили при pli опытной смеси 7,2.

- Кривые зависимости'скорости реакции от концентрация субстрата (ацетилена) приведены на Рис.4. Кривая,^ошсывавдая : влияние концентрации субстрата на скорость реакции имеет сиг- -'.."■ моидный ( S -образный), а не гиперболический характер, что может быть обусловлено кооперативными взаимодействиями меаду активными центрами фермента. Коэффициент Хилла» расчитанный по методу Курганова (Курганов, 1971), равен 2,43, что говорят . о'^гом, что нктрогеназа имеет по крайней мере два центра связн- . ' вания субстрата, между которшя устанавливается кооперативное взашлодействио. . . *.' -.■■ \

4. Регуляция активности нитрогенззы нуклеозидФос^эташ.

Известно, что для действия нитрогеназы дз различных источников обязательным является присутствие АТФ в-опытной смеси, f ■ Нами была изучена специфичность нитрогеназы к ряду нуклео-зидфосфатов: AM, ДТФ, УТФ^ ГТФ. Из полученных данных, представленных в ТаЛя. 2, видно, что нитрогеназа строго специфич-

■ на к АТФ, активность этого фермента в присутствии ДТФ, УТ$, . ) ' ГТФ в качестве единственного источника энергии незначительна, .. ".

Активность нитрогеназы, также как и активность ряда других ферментов, кофактором которых являются катионы 2-х-валент-ише металлов, в значительной степени зависит от соотношения

■ концентраций АТФ и двухвалентного катиона В наших.от*- .

■ тах оптимальное, соотношение концентраций АТФ к было 1:2. ( ;

Рис.3. Кинетические характеристики нитрогеназы из бак- * тероидов -¿ир1п1;А) спорость реакции восстановления ацетилена во времени; Б) зависимость скорости реакции восстановления ацетилена от содержания белка в пробе. В) зависимость скорости реакцзти восстановления ацетилена от концентрации дитионкта; Г) влияние рН опытной среды на актив-; ность нитрогеназы. •

Рис.4. Зависимость активности нитрогеназн из бактероидов лшина от.-концентрации субстрата (А); те зге данные в координатах Лайнувивера-Берка

: Таблица 2.

; ■ .У-Активность нитрогеназы из бактероидов люпина в присутствия различных,источников энергии. л

Удельная активность % активности

Нуклеозцдтрифосфат CgH4 нмоль ' ■ ' ■> от контроля

мнн . мг белка * •

АТФ .. ; 1,95 " ■.. • . 100,00

ЩФ . ; ; 0,11 . 6,11

УТФ ; ■ : * .0,12 ' ' 6,29

ГТ£> 0,05 2,96

; Нами' было исследовано влияние концентрация А"К> lia активность изучаемой' нитрогеназы (Ряс.5). Из приведенного рисунка' могло видеть, что кривая шеет слошшй характер, в пределах кон- , центрзций ЛТФ от-1 до 2 колей на кривой имеется плато. Такой характер зависимости может. иметь место, если фермент имеет бо- ; , лее, чем два центра связывания данного субстрата (Teipe£fKo?h-~ é) 1969). Характер кривой насщонкя меняется от гипсрболи-. ческой на S -образную. Подобный характер зависимости эктивно-: сти-нитрогеназы от концентрации Л1Ф бит получен Кеннеди (tfert--net/y, 1970). Возможно, что АТ<3>-М^ комплекс связывается не толь; ко в .активном центре, но является и алжостеричесним эффектором.' ; :Эти данные свидетельствует о регуляторном характере нитрогеназы ' из бактероидов лапина, где АТФ является не только источником энергии в реакции, катализируемой этим ферментом, но и важным эффектором, влияпщим на конформаця» фермшнта.

:-:.Намя было показано ингибируюцее действие ДЦФ на активность ■ нитрогеназы из бактероидов люпина (Вкс.6). Кривая зависимости активности Ш1трогеназы от концентрации эффектора иг.1еет слияний : характер. При увеличении концентрация АДФ ингибировашс активности нитрогеназы усиливается и достигает 60$ при • концентрациях ЛД^, превыпавдцх 5 ьй1. Ингибируюцее действие Ш на нитро-

- ч 17.

геназу.слабее действия Ада. А!зксималькое: иягябирукцее дейст- : вие -А\К>,; разное , ¿2352, -достигается только при' концентрации эффектора Ю Ш.'. Характер зависимости активности нитрогеназы из бактероидов люпина от концннтрадиг А.ЧФ имеет также сложный характер (Рас. 6), , ■ л ••';''.•--■'•. . ■ ;

Таким образом, полненные наш данные свидетельствуют о том, что нитрогеназа из бактероидов люпина является регудятор-ням' ферментем. ,Регулирующую роль мояет играть соотношение концентраций АТФ;Ада+Ал1Ф. . ,"'•:.'.' • ' . : - : '... ; 5»: Влияние аммиака к продуктов его превращения на активность питрогенрзы из бактероидов лапина.

- Нссошешшй интерес представляет изучение влияния — первого стабильного продукта фиксации молекулярного азота на процесс азотфиксашк. Ранее нс(ли было показано наличие как в бактероидцой-фракции клубеньков люпина, так и в растительных : тканях, ряда ферментов, участвующих в ассимиляции аммиака к у. превращешт его в ешшокислоты и амиды (Асеева с соавт,' 1968; ■Кретович с соэбт^ Х969в). Нами были обнаружены глэтамзт—, аландл-,' малат-;, сукцянатдегидрогеназы, 1УШтаминсинтетаза,:ас-партат-, и алашшампнотрансферазц. В связи с тем, что субстратами для действия этих' ферментов являются'не только акг.яак, . но такке'амшгакислоты и кетоннелоты наш'были проведены опиты по влиянию на активность нитрогеназы ряда кетокпелот, о тага© . дикарбонових аминокислот и-их амидов," являицихся первичным! ■...'■ продуктами ассимиляции аммиака. . -'■■■ ;: ■'/.'■'■ . ..

;Ка рисунке"? представлены кривые зависимости скоростй реакция от концентрация ацетилена.в присутствий некоторых:аминокислот и' амидов. Цогаю вздеть, что глюташн, аспэрапшовая • кислота, глютагаповая кисло та и, ^р-ш.сшомасляная кислота, в концентрации 1,мМ,. являются ингибиторами нитрогенази, практически не влияя на.характер, щжвой. Однако ■..". ¡Г-акюгомасля-ная.кислота в.концентрации 0,1 мМ» по данным ШапошниковаI(Шапошников с соавт.,;1976) близкой к природной, и при низкой . концентрации ацетилена активирует, нитрогеназу. В тех же-условиях, активирующим действием обладает аланин; в концентрациях ■

, Рио.7. Влияние аминокислот. и амидов на активность Нитро-геназн из бактероидов люпина. •1 - кривая зависимости скорости восстановления, ацетилена от концентрации субстрата без' эффектора; в присутствии эйфек-_ тора 2 - глютемин (I кУ); 3 - еепарагиковзя. гаслота 4 - глюташиовая кислота (I мМ), 5 - "у-ами. номасляная кислота (I Ш). 6 - Г-аминомасляная - : кислота' СОД мМ). '

0,1 ц X кМ и аспсрзгпн,в концентрации I мМ. Все указанные аминокислоты, а.также фенилалашш и ряд кетокислот в концентрации 10 мМ являются ингибиторами нитрогенззы (Рис. 8). У':"-

Следует отметить, что регуляция некоторых фегалентов осуществляется путем кумулятивного,действия ретролнтибиторов, в . этом случае только^ действуя совместно ' ретроингибиторы могут дать полное пнгиб1фование фермента. ,

В таблице 3 представлены результаты опытов по влияния глю-таминовой кислоты,;, глютамина и аммония, взятых по отдельности и попарно, на 'активность цитрогенаэы. Таблица содержи данные, характеризующие действие эффектора как такового (одна цифра в 1 графе) и каздрго иЬ ннх В1 паре с другим эжекторам (цифра слева в графе с тремя цифрами); кроме того на основании данных о действии на нитрогеназу1каждого эффектору, взятого в отдельности, были вычислены величины, характеризующие кумулятивность (цифра вверху)' или аодитивность^ цифра внизу) действия эффекторов. -Расчеты были сделаны по Стедману ^¿асИтоп Э58).* Кумулятивност^ вычисляли тю.формуле: ' -

" Л К т (А х В) 100, . /,. . . ~ :

где А,: В - действие каждого эффектора (остаточная активность в % от контроля); К - совместное действиеIэффекторов. Аодптив-; ность вычисляли по формуле:

=; '■■■■ С = 100 - (А + В),

где А, В -действие каждого эффектора (кнгабируюцее действие в % от конт^юля) ; Ь - совместное действие эффекторов.

'■"*/'-'..■.'' >ч ■ ■ Таблица 3

¡;."' Влияние:глютаминовой кислоты, глютамина и , па актив, Ность нитрогеназы (остаточная активность в % от исходной).

Аминокислота Тлкггамановая кислота . Глютаетш

Глптаминовая ' кислота » * ' 45 — - 30 .

Глютамин ' ,'■■.'■. 55^ . V. ■'■'■■■ ■ 51 73 : -. ' ■ 34 М : 33 .

• 45*2 38 . 34 М ■ 33 ' 60 ,

Цифра слева - результаты опита» справа■ вверху -вычислены» исходя из предпола-еш1якумулятпвностл действия эс1фокторов,:: / справа внизу - вычислены, исходя из предположения аддитивности ; /, действия Эффекторов. - < • . ' '.-. //' / '/..

/V/ Из приведенных^дапшсс мо:зго-гздеть, что в болыяшетве 'ва- / риантов (за исключением - пары глотании + аммоний) ингибпровансе у имеет кумулятивный характер. Это указывает ка то» что кавдый ^ ■ ■из о$фекторов действует на фермент .незаёисимо и имеет отдельный центр связывания, отличий! от активного центра (аллостери-' 1 -ческий центр). V / ; "/ _ -V. / Г - '•- .

■/'■'/. В опытах1 по действию из шггрогеназу акннсяйслот "семзйст- . ва аспарагтювой кислоты", было показано, что действие этих/ /. эффекторов тагсге носит кумулятивный характер (табл. '4). ;/

■■■'■' У- ■'■'.'". У ' >/ " '■■■ Таблица-.4/ ■ . '. ;

/.-"■'Влияние аспзрагиновой кислоты, аспарапша и NH4 на активность нитрогеназы (остаточная активность в % от исходной -"/ без эффектора).

аминокислоты ¡j /.' ."Аспарагиновая . ■"■■-. кислота Асларагкн; ■

Аспарагиновая /кислота/ ■■'■'■ 65 У/:'' ' 53М 32 / '■' 53 ■А/ ■ И

Аопароггл ■ -У У 53-М :/,//. 32 . 67 . 33 22 v, •/ /А/ 16 /

Ц ./'У.^'У/ У 53 — .-■У-—. 14 ' : • 33 /: » 16 / ' 49 У./уУ

' Цтфра слева - результаты опыта, справа вверху,- вычисленаУ исходя из предположения кумулятивностл действия- эффекторов, --справа внизу - вычислено исходя из предположения аддитивности.У действия Эффекторов. " - ■>;--■ А-У'/У' ^ /ч ../: ■ "-';

.•/У У По данным Папо2а!шсова (Напоеников с соэвт., 1976) бахто- У': ровдная клетка 'характеризуется высоким содержанием. /

дикарбоновых аминокислот и их амидов. Исходя из этих данных ; ■ .• наш били поставлены опыты с использованием суммы исследуемых , . ' ингибиторов. . , " : / '. '• /

" .'..'• Аспарагкковэя'кислота, аспарагкн и /VllJ- • клесте взятие, ппгибпруэт штрогеназу сильнее, чем глотамгшовся гаслота,. ее ' ' , .'.окгзд и'омькяий.при £зг"совместном действияЧтабл. 5). Это связо-'

но возможо* с/тем,что аспэрапшовая кислота И' особенно аспара- _ -" 'vimi, ^являются,основной:тренспортпой.форглой азота,в:¿0601^ . ;стенмях, усва11ваицих «оле1сул(1р15Цй азот'воздуха и, , следовательно, их'накопление как конечных "продуктов ессльклядаг аглкака - в клубеньке.шкет являться главной формой метаболического азота»';, 'регулирующей активность нитрогеназы. , ■ VУ, \ '

■ ' ' • Л'^-.' • ■.'" '■■';-'..'^ ' Таблица 5» '."■. " ; . (

•»- Влияние, дккарбоповых аминокислот и их швдов на активность

нитрогеназыСостаточная активность ъ % от контроля).г 'v, *; ..'■-" ■ «

' Вариант Т .. • ■■ £ остат.' . "... ' акт. • • •

-¿Еез добавок V. i "■." ' ' • ■ •■* '■' V ■ 1 .; юо.о "

аспарагик, , WH4 ;f ' . ^ - ■ -,..;*.. 31,3 . • у-

Глютампиовая. кислота, 1 '■'■'-'■Л", ;глш;сЦш, • NIlJ '. ••• --'■'■■■У:-";." 37,4 / :

vАспарэгяновая кислота,' аспарапш,' . глготашновая кислота,-глитамин;-'*NHt- ? '-S • - •** ' ' '.,•'• .: . - •: / * ; .21,4 , *

„'vNaCI.. .". .• . " , : • .80,2;... .'.:

"Прк_ совместном действии всех исследуемых зфректоров наблюдалось • ингиб!фование фермента, почти на; COji. Ингпбирувдсе действие в ' данном случае г*нельзя отнести.за* счет действия ионной силы раствора,* т.к. раствор U(¡01 той. ке^лошюй сшш'вызывал ингибяро- • .в^нке, но .только, па. Получерные-данные- дгшт .возможность 1 предполагать/что нитрогеназа из'бактероидов Rh. ¿upini . под-: . вергается регуляции путем шапбируицбго действия метаболитов» :, обраэуювдхся из аммиака, T.Oi.по пршвдщу отрицательной обрат-. . ной связийшибдруищее действие этих метаболитов ямееУ.куму- ( '„ дативный характер, ' . ."•'.;' ■ ■"- '■■ ■

■/.".''■■,"...'. Выводы ' V ■ :.

1. Получен препарат нитрогеназы из бактероидов ЯЛ. СирЬпс , ' очищенный в 50 раз, ~1 ■'■■■■ ■..'>. :*. . . .;..■ ■ . '.:■■■

2. Проведено анаэробное разделение нитрогеназы на ДЭАЭ-целлюлозе на два составляющих ее компонента ыолибдо- и азоферредоксин : ,

а проведена последующая рекомбинация компонентов о восстановлением азотфшссирукцей активности. . ' ■.-■./.'.'.■•

3. Установлены .кинетические характеристики нитрогеназы, позволявшие. предположить наличие ^вух центров связыва- . ■ ния субстрата. .

4*. Аденилоэые нуклеозидфосфаты АДФ и АМФ являются ингибиторами исследуемой нитрогеназы, АТФ является не только донором энергии' в реакции, катализируемой нитроге'назой, но и аллостерическим' эффектором фермента. Вегулирущую роль может играть соотношение концентраций*АТ0:АД$:АМФ, а также соотношение концентраций ЛТФ:Ь^2+. ' , ■ ■

5. Регулпрушее действие на активность нитрогеназы из бактерои-. дов №. 1ир1п1 оказывает аммиак - первый стабильный продукт . фиксации моле^лярного"азота, аминокислоты и амиды, образуй- : -щиеся в результате ассизгиляцив аммиака, а также кетокислоты, явяягаиеся предшественниками аминокислот. Характер действия кетокислот и ряда аминокислот зависит от концентрации эффектору* :" • . ' ■ ■■■■■. ■ !■■■■■ ■ '.';.-' .у"'. ■

6. Ингибарувдее действие метаболитов, являющихся продуктами ассимиляции шмиака (аминокислоты, амиды), представляет собой регуляцию фермента: по принципу отрицательной обратной связи. ?

■ Показано, что по характеру ингибирования действие аминокислот является кумулятивным. ■

"."'..■ • список :. ■ ....

* работ; опубликованных по материалам диссертации

X. Асеева К.Б., Шапошников Г.Л., Мартынова Ü.M., Мочалкина H.A.,

, .Евстигнеева З.ГДНекоторые гашетические характеристик! и • аминокислотный состав частично очищенной нитрогеназы из бактероидов люпина и сол. - Тезисы Всесоюзной конференции по«

. мехо!шзцу биологаческоЙ'Зшссацни азота, Москва, декабрь 1971, стр. 15. д ■'*

2. Асеева К.Б., Евстигнеева З.Г., Мартынова Е.М., Шапошников .'Г .1 1 Радюкггна H.A., Кретошч В.Л. Некоторые свойства нитрогеназы' .

из бактероидов люпина. - Известия Академии наук СССР,'серия биологическая, вып. 5, 75It 1973.

3. Евстигнеева З.Г., Асеева К.Б., [Мартынова K.M., Шапошников Г.Л

■J Регуляция, нитрогеназы при'симбиотической фиксации азота. - ■

. - l^eTUíl Всесоюзный биохимический съезд (Рига," октябрь 1974).

■ Тезисы симпозиальпых докладов;¿ стр. 147. ' ■ .

4^-Мартш:ова Е.М., Евстигнеева'3.Г., Асеева К.Б., Кретович В.Л. Регуляция нитрогеназы из .бактероидов люпина. - Доклады Ака-денпи наук СССР. 222. Ji4; 983. 1975. .-.*

5; Мартынова Е.М., Асеева К.Б.,-Евстигнеева З.Г., Кретович; В.Л.

'Разделепке па компоненты и рекомбинация нитрогеназы из бактероидов люпина. - Доклады Академии наук СССР, 228, jfi 5, 1230, 1976. .-Г ; ^ ■■':

£=292Sí jíl^Z¿S=I2Z8_£¿___за*.1335__тяв.аоо :

: '"*" Типография ХОЭО Госплана СССР