Ферментативное и неферментативное восстановления легоглобина в клубеньках бобовых растений

Шлеев, Сергей Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ферментативное и неферментативное восстановления легоглобина в клубеньках бобовых растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферментативное и неферментативное восстановления легоглобина в клубеньках бобовых растений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.Н. БАХА

авш0дописи

1 3 ДЕК 2000

ШЛЕЕВ СЕРГЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ФЕРМЕНТАТИВНОЕ II НЕФЕРМЕНТАТИВНОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЛЕГОГЛОБИНА В КЛУБЕНЬКАХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в лаборатории метаболизма азота и синтеза белка у растений Института биохимии им. Л.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.Ф. Топунов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.Я. Жизневская, доктор биологических наук, профессор Н.П. Львов.

Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН (г. Пущино).

Защита диссертации состоится « 2000 г.

в « ¿/.¿э » часов на заседании диссертационного совета К 002.96.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке биологической литературы ОБН РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан «

_2000 г.

кандидат биологических наук

Ученый секретарь диссертационного совета

Характеристика работы

Актуальность проблемы. Биологическая фиксация атмосферного азота - глобальный процесс, обеспечивающий возможность существования жизни на Земле. Способность восстанавливать N2 до N11/ выявлена у мнотах прокариот, но у эукариотических организмов она до сих пор не обнаружена. Однако многие растения, грибы и животные могут вступать в симбиоз с азотфиксаторами, что существенно расширяет экологические возможности как микро-, так и макросимбионта.

Наиболее активно изучается процесс симбиотической азотфиксации микробно-растительными сообществами, и, в частности, бобово-ризобиальными симбиозами. Проблема фиксации азота бобово-ризобиальной симбиотической системой включает в себя большое количество тесно связанных между собой вопросов. Одним из важнейших является изучение легоглобина (леггемоглобина) - гемопротеида бобовых растений, участвующего в регуляции кислородного режима в клубеньках бобовых. Он необходим для нормального функционирования бактероидов, в которых содержится нитрогеназа - фермент, катализирующий реакцию восстановления молекулярного азота. Легоглобин способен функционировать только в физиологически активном, восстановленном состоянии. Описано. несколько путей восстановления легоглобина, как ферментативных, так и неферментативных, однако многие из них пока недостаточно изучены.

Изучение легоглобина и процесса его восстановления важно как с сочки зрения теоретических аспектов (изучение механизмов симбиотической азотфиксации и теории эволюции гемопротеидов), так и чисто практических, каковыми являются поиск путей повышения плодородия почв и методов лечения заболеваний, связанных с нарушениями в функционировании гемоглобина (например, метгемоглобинемии).

Цель и задачи работы. Настоящая работа была направлена на изучение как самого легоглобина, так и процесса его восстановления, а также различных восстановителей, поддерживающих легоглобин в физиологически активном состоянии, из различных видов бобовых растений. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Выяснение наличия в цитозоле клубеньков различных бобовых множественных форм метлегоглобинредуктаз и разработка метода их получения в препаративных количествах в гомогенном состоянии.

2. Изучение и сравнение метлегоглобинредуктаз и легоглобина различных видов бобовых.

3. Изучение процесса неферментативного восстановления легоглобина и некоторых

Принятые обозначения: ЬЬ, ЬЬ2+, 1Л>3+, ЬЬОг - легоглобин, восстановленный, окисленный, оксигенированный легоглобин, соответственно; МЬ - миоглобин; НЬ - гемоглобин; MI.bR -метлегоглобинредуктаза, вБЗ - додецилсульфат натрия, РМЯР - фенилметилсульфонилфторид. ПААГ - полиакриламидный гель, ИЭФ - изоэлектрофокусировка, ИЭТ - изоэлектрическая точка, ЭС1Р - 2,6-дихлорфенолиндофенол, МТТ - тиазолил голубой, ОЯН, ОЗ-БС -восстановленный и окисленный глутатион, ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота, ТХУ -трихлоруксусная кислота, в ОБ - супероксиддисмутаза, Е° - стандартный окислительно-восстановительный потенциал, 1АА - индолилуксусная кислота, ПК - персональный компьютер.

низкомолекулярных восстановителей, а также оценка вклада различных путей восстановления в процесс поддержания легоглобина в восстановленном состоянии.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан метод одновременного получения различных форм метлегоглобинредуктаз и компонентов легоглобина из цитозоля клубеньков бобовых растений в электрофорстически гомогенном состоянии.

В клубеньках желтого и узколистного люпинов обнаружены две формы метлегоглобинредуктазы (мопомерный флавопротеид и димерный негемовый железофлавопротеид), в клубеньках гороха - одна (димерный флавопротеид).

Изучены различные свойства низкомолекулярных восстановителей из клубеньков бобовых растений. Высказано предположение об их возможной роли в азотфиксирующих клубеньках.

• Произведен расчет термодинамической возможности поддержания окислительно-восстановительного статуса Lb в цитозоле клубеньков бобовых растений.

Разработана программа расчета концентраций различных форм гемопротеидов для персональных компьютеров «1ВМ». Разработана конструкция ячейки для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 41 рисунок и 7 таблиц. Список цитируемой литературы включает 199 наименований, в т.ч. 131 на иностранном языке.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на:

- IV съезде Общества физиологов растений России, Москва, 1999 г.

- Школе-конференции: «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, 2000 г.

- Международной конференции «Biocatalysis-2000», Москва, Россия, 2000 г.

- совместном коллоквиуме лаборатории метаболизма азота и синтеза белка у растений и лаборатории металлсодержащих белков Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Работа в 2000 году отмечена стипендией имени члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 12 печатных работах.

Материалы и методы исследований

В работе использовали: а) корневые клубеньки люпина желтого (Lupinus luteus L.) сорта «Брянский-27» и люпина узколистного (Lupinus angustitolium L.), сорта «Брянский-109». инокулированных клубеньковыми бактериями Rhizobium lupini (эффективный штамм 359а из коллекции ВНИИ биотехнологии) и выращенных в полевых условиях Московской области; б) корневые клубеньки растений гороха посевного (Pisum sativum L. cv. Finae). инокулированных клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum (эффективный штамм bv. Viceae C1AM 1026 из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН) и выращенных в полевых условиях Московской области.

Клубеньки собирали на стадии бутонизации - начала цветения, так как ранее было показано (Баширова с соавт., 1979), что активность MLbR, как и содержание Lb, являются максимальными в данной фазе развития растений.

Получение белков из цитозоля клубеньков проводили по методу С.С. Мелик-Саркисян с соавторами (1972) с модификациями. Белки растворимой фракции клубенька осаждали сульфатом аммония диапазоне насыщения 40-80%, собирали центрифугированием и хранили в виде пасты в плотно закрытых бюксах при -20 "С.

Концентрации Lb и других кислородпереносящих гемопротеидов определяли спектрофотометрически при Х=525 нм. Для расчетов использовали коэффициент милимолярной эксгинции Е„515 = 9,52 (Quast, Vesterberg, 1968), поскольку было показано (Мелик-Саркисян с соавт., 1975), что данный коэффициент применим для всех кислородпереносящих гемопротеидов.

Электрофорез белковых фракций проводили в градиенте ПААГ 5-20 % и 10-20 % (при электрофорезе MLbR) и 15-25 % (при электрофорезе Lb) в Трис-HCl буфере pH 8,9 по методу (Tombs, Akroyd, 1967). Окрашивание геля после электрофореза проводили с использованием Кумасси голубого по методам (Chiambach et al., 1967; Devis, 1964; Nesterenko et al., 1994).

Зимограммы получата по методу (Kaplan, Beutler, 1967) в модификации А.Ф. Топунова с соавт. (1980), который основан на диафоразной активности фермента.

Определение молекулярной массы проводили а) методом электофореза в ПААГ в присутствии SDS (Weber, Osborn, 1969); б) методом гель-хроматографии (Andrews, 1964). В качестве носителя использовали Toyopearl WH-55 S.

Изоэлектрофокусирование проводили по методу (Vesterberg, Svensson, 1966) с использованием естественного градиента pH, стабилизированного глицерином или сахарозой.

Концентрирование белков проводили методом ультрафильтрации в ячейке Amicon (США) на мембранах РМ-Ю и UM05 или UM2 соответственно.

Метлегоглобинредуктазную активность определяли по методу, описанному в работе Н.Ф. Башировой с соавторами (1979) с модификациями.

Определение активности компонента R. Активность определяли спектрофотометрически по количеству восстановленного миоглобина с использованием разработанной нами программы. Реакционная смесь состояла из 1,45 мл 0,02 M фосфатного буфера pH 7,2 (0,02 N4 КН2РО4, 0,02 M К2НРС4), 0,5 мл раствора Mb (3 мг/мл), 0,05 мл раствора компонента R.

Спектрофотометрические исследования. Спектры оптического поглощения снимали на спектрофотометре Hitachi - 557, спектры флуоресценции и возбуждения флюоресценции на спектрофлюориметре MPF-4 (приборы фирмы «Hitachi» (Япония)). КД-спектры снимали на спектрополяриметре J-40AS «Jasco» (Япония). Для обработки данных КД-спектроскопии использовали программу «Белок» (Россия).

Проведение жидкостной колоночной хроматографии. Все виды колоночной хроматографии низкого давления проводились с помощью комплекта стандартного оборудования для жидкостной хроматографии низкого давления фирмы «LK.B» (Швеция) при температуре +4°С. Проведение гидрофобной хроматографии высокого давления осуществляли

на приборе High Pressure Pump HPP 5001 (Чехия). Ионообменная хроматография высокого давления проводилась на оборудовании фирмы «LKB» (2150 HPLC PUMP, 2158 UVICORD 50. 2212 HELIRAC, 2195 pH/ION Monitor) (Швеция).

Получение окисленных, восстановленных и оксигенированных гемопротеидов. Гемопротеиды окисляли феррицианидом калия по методу (Шаронов с соавт., 1973). Восстановленные гемопротеиды получали добавлением к окисленному гемопротеиду дитионита натрия до конечной концентрации 2 мМ. Оксигенированные Lb, Mb, Hb получали добавлением к гемопротеиду в окисленной форме NADH+H* до конечной концентрации 2 мМ и метиленовую синь до концентрации 2,5 мкМ.

Биозлектрохимические эксперименты проводили в строго анаэробных условиях в ячейке, описание которой приведено в пункте 5.2. Для создания анаэробных условий применяли «коммерческий» аргон марки «высокой чистоты». Для очистки аргона от следов кислорода и органических примесей мы использовали методику, описанную в работе (Карякин. Ангелов. 1974). Для снятия поляризационных кривых использовали потенциостат ПИ-50-1, программатор ГЕР-8, самописец планшетный Н 307/1 (отечественного производства). Для измерения потенциалов применяли как потенциостат ПИ-50-1, так и иономер И-120.1 (отечественного производства). Подготовка поверхности электродов осуществлялась стандартным методом, который используется в баоэлектрохимических экспериментах (Taylor, 1981).

Определение негемового железа, а) качественное определение негемового железа проводили с использованием ЭПР-спектроскопии. Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре Radiopan, резонатор RX 102 (Poland) при температуре -196 °С, СВЧ мощности 20 мВт и амплитуде ВЧ модуляции магнитного поля 1 мТ. б) количественное определение негемового железа определяли с о-фенантролином по методу, описанному в работе (Яковлев, Сырцова, 1967) либо по калибровочным ЭПР-спектрам. Работа по определению негемового железа проводилась совместно с Институтом химической физики РАН (лаб. д.х.н. А.Ф. Ванина)

Белок определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Множественные формы метдегоглобинредуктазы в клубеньках желтого люпина.

1.1. Разработка метода получения в препаративных количествах множественных форм

метдегоглобинредуктазы и компонентов легоглобина из клубеньков бобовых растений.

Ранее в группе А.Ф. Топунова было показано наличие множественных форм MLbR в клубеньках желтого люпина методами ИЭФ и иммунохимии. Оставался невыясненным вопрос о том. присутствуют ли различные формы MLbR в клубеньках in vivo.

Для проверки этого предположения нами была разработана методика разделения двух изоформ фермента за максимально короткое время и минимальное количество стадий очистки. Эта методика включает в себя высаливание (МЦ^Од в диапазоне насыщения 40-80%, гель-фильтрацию на колонке с носителем Ultrogel АсА 44 и, в качестве последней стадии,

адсорбционную хроматографию на гидроксилапатите линейным градиентом фосфатного буфера pH 6,8 (стартовый буфер 0,02 М, конечный - 0,4 М). Весь процесс очистки занимал около 22 часов, велся при температуре +4 "С с применением ингибиторов протеаз. При хроматографии на гидроксилапатите было получено две фракции, обладающие MLbR активностью. В первой фракции выходил белок с молекулярной массой 66 кДа, во второй - 62 кДа. (масса определена методом SDS-электрофореза в ПААГ). При этом удельная активность MLbR с массой 66 кДа была примерно в два раза ниже, чем у белка с массой 62 кДа. На основании этих данных можно было предположить, что белки различной молекулярной массы, обладающие MLbR активностью, могут присутствовать в клубеньке in vivo.

Следует отметить, что при исследовании MLbR необходимо наличие и субстрата фермента - Lb. Как уже упоминалось, Lb является гетерогенным белком, поэтому для исследования редуктазы необходимо наличие электрофоретически гомогенных компонентов Lb в препаративных количествах.

Нами разработан метод, позволяющий одновременно получать в препаративных количествах множественные формы MLbR и компоненты Lb, необходимые для исследований. Схема очистки представлена на рисунке 1.

На рисунке 2 приведены результаты SDS-электрофореза гомогенных фракций MLbR. полученных с использованием данного метода; 2-й трек - MLbR с молекулярной массой 66 кДа (форма с более высокой ИЭТ), 3-й трек - 62 кДа (форма с более низкой ИЭТ).

Следует отметить, что в процессе ИЭФ наблюдаются несколько зон с MLbR активностью в диапазоне pH 3,5-6,5. Получение результаты совпадают с ранее полученными данными о гетерогенности хроматографически гомогенных препаратов MLbR при использовании метода ИЭФ (желтый люпин (Топунов с соавт., 1980); соя (Ji et al., 1991)).

Были проверены и другие возможные способы выделения фермента. Однократная ИЭФ на стандартной колонке фирмы «LKB» (L = 25 см) в градиенте концентрации как глицерина, так и сахарозы не давала качественного разделения изоформ MLbR (Рис. 2 - 5-й трек). Использование ионообменной хроматографии на носителе DEAE-Toyopearl 650М в качестве последней стадии очистки фермента (вместо повторной ИЭФ) приводило к снижению MLbR активности, при этом также не происходило разделения множественных форм (Рис. 2 - 4-й трек).

Полученные результаты служат еще одним доказательством возможного существования в клубеньках бобовых растений in vivo нескольких белков, обладающих MLbR активностью.

Интересно, что при изучении метгемоглобин- и метмиоглобинредуктаз из различных объектов также были получены разные значения молекулярных масс ферментов, причем и из одного объекта часто выделяли несколько активных фракций с различными молекулярными массами (Kaplan, Beutler, 1967; Kitajima et al., 1981; Yubisui, Takeshita, 1982; Levy et al„ 1985; Van Iersel, Blaauboer, 1985). Авторами этих работ было предложено несколько возможных объяснений этим фактам, в том числе наличие множественных форм, аггрегирование молекул, ограниченный протеолиз.

Рисунок 1. Получение множественных форм МЬЬИ и компонентов ЬЬ в гомогенном состоянии в препаративных количествах.

Белки цитозоля клубеньков люпина _

Высаливание сульфатом аммония, насыщение 40-80 %

Гель-фильтрация на Шго§е1 АсА 44, 0,02 М К-фосфатный буфер, рН 7,2

4- 4

Фракции, содержащие Фракции, содержащие

МШ1 ЬЬ

4 4-

ИЭФ (24 ч) ИЭФ (24 ч) Ионообменная

РН 5,0-7,0 РН 4,0-6,0 ЖХВД

Повторная ИЭФ Повторная ИЭФ

(36 ч) рН 5,7-6,2 (36 ч)рН 4,7-6,1

; 4

Гомогенные препараты Гомогенные препараты

множественных форм MI.bR компонентов ЬЬ

Таким образом, можно сделать заключение, что наличие множественных форм является достаточно распространенным явлением среди редуктаз, восс 1 анавливающих различные кислородпереносяшие гемопротеиды.

Очистку компонентов ЬЪ, содержащихся в третьей фракции, осуществляли двумя способами.

Первый способ - ИЭФ. В работе (Мелик-Саркисян с соавт., 1975) было показано, что в результате ИЭФ суммарного 1,Ь на стандартном оборудовании фирмы «1.КВ» можно получить гомогенные препараты компонентов ЬЬ.

Второй способ, использовавшийся в нашей работе - разделение компонентов с помощью ионообменной хроматографии как высокого, так и низкого давления (0,01 К-фосфатный буфер, рН 6,5; градиент [№С1] 0 - 0,5 М). На рисунке 3 показан профиль элюции с колонки ТКК-ОЕАЕ-8Р\\г (21,5x150 мм) (хроматография высокого давления).

Таким образом, в результате применения разработанной нами методики очистки были выделены электрофоретически гомогенные препараты множественных форм редуктазы и компонентов легоглобина.

Рис. 2. SDS-электрофорез белков с MLbR активностью m клубеньков желтого люпина полученных в результате очистки различными методами.

97 кХг

67 к Дя бОкДа<

46 ф ;

39*4.1

1 - белки-метчики, 2 - «катодная» форма MLbR после повторной ИЭФ (66 кДа), 3 - «анодная» форма MLbR после повторной ИЭФ (62 кДа), 4 - препарат после ионообменной хроматографии (0,12 М NaCl), 5 - препарат после первой ИЭФ.

Рис. 3. Профиль элю ни н при ЖХВД суммарного препарата Lb желтого люпина, (колонка TSK-DEAE-SPW; 0,01 М К-фосфатпый буфер рН 6,5).

А - компонент LЫ, С - компонент Г_ЫГ, (1 - минорный компонент 1.Ьс1. I- оптическая плотность при X = 280 нм, 2 - ионная сила, 3 - рН.

1.2. Изучение множественных форм метлегоглобинпедуктази желтого люпина.

Две высокомолекулярные ML.bR были подвергнуты дальнейшему исследованию. Методами гель-фильтрации и ЭОЗ-электрофореза показано, что белок с массой 62 кДа является мономером (Рис. 2, 3-й трек). По значению своей молекулярной массы, спектральным (максимум пика поглощения при 450 нм, плечо при 325 нм) и электрохимическим (значение ИЭТ 5,83) характеристикам, удельной активности (1088 мКат/кг белка) он сходен с iVIL.bR желтого люпина, выделенной и исследованной в работе Л.И. Голубевой с соавторами (1988). По видимому, редуктазы, выделенные нами и Л.И. Голубевой с соавторами, являются одним и тем же белком.

Другой фермент, с массой 66 кДа (Рис. 2, 2-й трек), оказался гомодимером с массой нативной глобулы около 120 кДа. Масса нативного белка была установлена методом гель-фильтрации на колонке с носителем Тоуореаг1 У/Н-55 в. Удельная активность димерной редуктазы с молекулярной массой 120 кДа была примерно в 2 раза ниже, чем у 62 кДа ML.bR (603 мКат/кг белка). Значение ИЭТ данной MI.bR составило 6,14.

Произведено выяснение наличия металлов в составе двух ML.bR желтого люпина. Методом ЭПР-спектроскопии показано наличие в гомогенном препарате димерного фермента с молекулярной массой 120 кДа негемового железа (2 атома на молекулу димера). На рисунке 4 (нижний спектр) представлен ЭПР-спектр димерной MI.bR, восстановленной дитионигом натрия и обработанной N0. Измерения проводились при температуре -196 °С. Видно, что в спектре присутствует сильный сигнал с поглощением на g = 2,03, что свидетельствует о наличии в препарате негемового железа.

Ингибиторный анализ димерной ML.bR показал, что ионы железа входят о состав активного центра фермента. Так, при добавлении в реакционную среду офенантролина происходит ингибирование активности фермента, причем степень ингибирования зависит от концентрациии ингибитора.

Таким образом, димерная МГ.ЬЯ по своим свойсгвам очень близка к железосерному белку, изучаемому в Институте физиологии растений РАН (Жизневская с соавт., 1999). Можно предположить, что выделенные нами и Г.Я. Жизневской с соавторами димерные редуктазы. содержащие в своем составе негемовое железо, являются одним и тем же белком.

Изучение аналогичными методами мономерной МШ1 (62 кДа) показало, что в ее составе металлы отсутствуют. Активность фермента не ингибировалась о-фенантролином и цианидом качия, в препаратах гомогенного фермента металлы методом ЭПР-спектроскопии не детектировались (Рис. 4, верхний спектр). Эти результаты совпадают с ранее полученными данными о свойствах мономерной ML.bR из клубеньков люпина (Голубева с соавторами, 1988).

Нами была также изучена вторичная структура димерной и мономерной MI.bR из клубеньков желтого люпина методом КД-спектроскопии. На рисунке 5 представлены КД-спектры ферментов. Заметно отличие двух кривых как по характеру, так и по абсолютным значениям удельной дихроичной плотности (ДБ). Была проведена компьютерная обработка КД-спектров с использованием математической программы «Белок» (Россия). Показано, что имеются значительные отличия во вторичной структуре белков с массами 120 кДа и 62 кД.

Рис. 4. ЭПР-спектры MLbR желтого люпина.

(восстановление дитионитом натрия и обработка N0) Z.03 ' г.оо

Рис. 5. КД-спектры MLbR желтого люпина

ДБ

240

к, нм

— 120кД --- 62кД

Несмотря на сходство участков с нерегулярной структурой, имеются достоверные различия в а-спиральной и ^-структурной организации ферментов.

Таким образом можно предположить, что в клубеньках желтого люпина могут существовать две формы MLbR. Первая - белок с массой 62 кДа, являющийся мономерным флавопротеидом и содержащий в своем составе SH-группы, которые важны для проявления MLbR активности. Вторая MLbR является димерным флавопротеидом, с нативной массой около 120 кДа (масса субъединицы - 66 кДа). Она содержит в своем составе негемовое железо и, возможно, относится к группе железосерных белков.

2. Метлегоглобинредуктаза и легоглобин узколистного люпина и гороха посевного.

2.1. Изучение метлегоглобинредуктаз узколистного люпина и гороха посевного.

В настоящее время хорошо исследован состав цигозоля клубеньков желтого люпина, сои, гороха. В то же время люпин узколистный (Lupinus angustifolium L.), еще один представитель рода люпинов, являющийся важной сельскохозяйственной культурой и хорошим модельным объектом физиологии и биохимии растений, практически не изучен в отношении белков, участвующих в азотфиксирующем симбиозе, в том числе, MLbR и Lb. Исключение составляют работы Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. направленные на изучение металлсодержащих белков бобовых растений (Пейве с соавт., 1971; Жизневская. 1972).

С использованием разработанного нами метода была выделена в гомогенном состоянии MLbR из цитозоля клубеньков узколистного люпина. Дальнейшие исследования двух форм MLbR показали, что одна из них является мономерным белком с массой около 60 кДа, а другая - гомодимером с массой около 120 кДа. Значение ИЭТ ферментов составляет 5,88 и 6,18 соответственно. Удельная активность мономерной MLbR выше димерной приблизительно в 2 раза (1059 и 628 мКат/кг белка, соответственно). Были проведены спектральные исследования MLbR узколистного люпина. Спектр поглощения имел небольшой максимум в районе 430 нм, что говорит о возможном присутствии в обоих белках FAD. Спектры эмиссии флуоресценции и возбуждения флуоресценции не имели максимумов, характерных для флавиновых коферментов. Это, скорее всею, связано не с их отсутствием, а с маскировкой белковой молекулой флуоресценции флавиновых групп, так как показано, что спектральные свойства свободных и белоксвязанных флавиновых коферментов сильно отличаются (Диксон, Уэбб, 1982) и для их детального детектирования необходимо проводить отщепление коферменга от белковой глобулы.

Исследованы множественные формы MLbR в цитозоле клубеньков узколистного люпина. Показано, что при проведении различных видов хроматографии, ИЭФ, электрофореза, выделяется несколько зон с MLbR активностью.

По разработанной методике была выделена гомогенная MLbR из цитозоля клубеньков гороха посевного (Pisum sativum L. cv. Finae). В отличие от ИЭФ белков цитозоля люпинов, наблюдался только один пик MLbR активности со средним значением ИЭТ равной 5,65 (Рис. 6).

Масса фермента, определенная методом гель-фильтрации на колонке с носителем Toyopearl HW-55S и нативным диск-электрофорезом с окраской на белок и MLbR активность, оказалась равной около 120 кДа. MLbR гороха является гомодимером (масса субъединицы

Рис. 6. ИЭФ МЬЬН гороха посевного.

(колонка «ЬКВ» 440 мл; после иНк^е! Ас А 44; диапазон рН 5-7)

1 - оптическая плотность, 2 - рН, заштрихован пик МЬЬК активности.

Рис. 7. Спектр поглощения М1Л>Я гороха.

(0,01 М К-фосфатный буфер рН 7,2)

X, нм

около 59 кДа), со значением ИЭТ 5,65.

Гомогенный фермент гороха был исследован на наличие металлов ингибиторным анализом и методом ЭПР-спектроскопии. Данными методами в составе МЬЬЯ клубеньков гороха металлов обнаружено не было.

Спектр поглощения MI.bR гороха представлен на рисунке 7. Он имеет характерные максимумы при 275 и 410 нм, а также плечо в области 335 нм и достаточно сильно отличается от спектра Mi.bR желтого люпина (Голубева с соавт., 1988). Максимум в области 450 нм и плечо в районе 335 нм указывают на возможное наличие в составе фермента кофермента флавопротеидной природы, однако его состояние в белке несколько отличается от состояния РАО в Ml.bR желтого люпина.

.Метлегоглобинредуктаза из клубеньков гороха посевного по своим свойствам близка к редуктазам, выделенным из сои и вигны. Можно предположить, что, как и все ранее изученные МИзИ, редуктаза гороха является флавинсодержащим белком, выполняющим в клубеньках м г/уо функцию поддержания ЬЬ в физиологически активном восстановленном состоянии.

Таким образом, к настоящему времени выделены и изучены ML.bR многих видов бобовых растений. Нами проведена работа по систематизации сведений по их строению и свойствам (Табл. 1). Исходя из имеющихся к настоящему времени данных, можно сделать вывод, что в клубеньках сои, вигны, а также гороха имеется димерная ML.bR с массой около 110-120 кДа. Фермент является флавопротеидом, имеет в своем составе КАБН-связывающий домен, Г'ЛО-сБячывающий домен и дисульфидный активный центр. В клубеньках люпинов возможно существование нескольких MI.bR. Основными являются: мономерная флавинсодержащая редуктаза с массой около 60 кДа, имеющая в своем составе сульфидный активный центр, а также димерная ML.bR массой около 120 кДа, являющаяся иегемовым железофлавопротеидом.

Интересно отметить, что в некоторых случаях из клубеньков люпина выделялись белки с ML.bR активностью, молекулярные массы которых намною превышали приведенные выше. Масса этих белков была около 280 кДа, при этом масса субъединицы около 66 кДа. Это подтверждает ранее высказывавшееся мнение о возможности наличия множественных форм фермента и его аггрешрования. Обнаружение двух изоформ ML.bR, одна из которых является достаточно гидрофобной структурой, способной к агтрегации с сохранением активности, наводит на мысль о возможном существовании в цитозоле клубеньков люпинов мембранно-связанного белка, восстанавливающего ЪЬ, подобного ранее описанной мембранно-связаной метгемоглобинредуктазы животных. При этом, как у растений, так и у животных, наличие двух форм белка может определяться видовой специфичностью.

2.2. Изучение легоглобииа узколистного люпина и гороха посевного.

По разработанной методике были получены основные компоненты ЬЬ узколистного люпина и гороха посевного в гомогенном состоянии

Спектрофотометрически ЬЫ (а) и ГЫ1 (с) как узколистного^ так и желтого люпина, мало различаются между собой. Обращает на себя внимание длина волны максимума полосы Соре, сильно различающаяся для гемопротеидов двух видов люпина (430 и 406 - желтый, 421 и 419 -узколистный).

Таблица 1. Сравнение свойств MLbR различных бобовых растений.

Свойства Люпин Люпин Горох Соя" Вигна"

желтый узколистный

Наличие + -t- - - -

изоформ 2 2 - - -

М(кДа)

Нативного 120 62 120 60 120 110 110

Субъеди- 66 62 66 60 59 55,7 55

ницы

Наличие + ■ + + + +

FAD

ИЭТ 6,14 5,83 6,18 5,88 5,65 5,6е -

а Данные взяты из работ (Ji, 1991, 1994), ь Данные взяты из работы (Luán, 2000),

с3начение взято из работы (Ji, 1991) как средняя ИЭТ множественных форм фермента.

Таблица 2. Сравнение изоэлектрнческих точек компонентов ЬЬ из разных видов бобовых.

Компоненты Lb Люпин узколистный Люпин желтый Соя Сераделла Фасоль Вигна Горох

А 4,82 5,00 5,13 4,70 4,90 5,02 4,7 5,19 5,01

В _ 4,93 5,08 _ 4,70 4,97 4,55 5,16 4,94

С 4,56 4,90 5,04 4,40 4,59 4,88 _ 5,00 4,76

D 4,51 4,88 5,00 _ 4,47 4,82 _ _ 4,72

Е 4,81 _ ___ _ 4,76 _ _ -

Литературный источник Н [1] И [3] [4] [2] [5] [6] Н

Метод ИЭФ * ** »- ** ** *

Примечания: «—» - нет данных, * - ИЭФ в градиенте сахарозы, »* - ИЭФ в ПААГ. Литературный источник: Н - наши данные, 1 - (Мелик-Саркисян с соавт., 1975), 2 - (Broughton et al., 1972). 3 - (Broughton, Dilworth, 1971), 4 - (Мелик-Саркисян с соавт., 1970), 5 - (Lehtovaara. EUfolk, 1975), 6 - (Fuchsman, Appleby, 1979).

Нами были определены значения ИЭТ ЬЪ узколистного люпина и гороха посевного. Была проведена систематизация имеющихся данных по значениям ИЭТ 1.Ь бобовых растений (Табл. 2).

3. Изучение свойств и строения неферментативных восстановителей из клубеньков желтого люпина.

3.1. Выделение и изучение свойств компонента Я.

Из цитозоля клубеньков люпина был выделен новый неферментативный восстановитель, который мы назвали компонентом К.

Изучение восстановительных свойств компонента Я показам, что он быстро восстанавливает разные гемсодержащие белки (легоглобин, миоглобин, гемоглобин) (Рис. 8). Этот процесс проходит в течение нескольких секунд, не зависит от присутствия посторонних доноров, подобных ЫАЭН, и переносчиков, подобных метилсновому голубому. Степень восстановления белка зависит от количества восстановителя. Металлы, подобные Мо или Мп. ингибируют восстановительную активность компонента, а азид натрия активирует ее. При больших концентрациях азида (> 100 мкМ) эта активация очень существенна. Прогревание при 90 °С в течении 3-х минут полностью дезактивировало компонент, активность впоследствии не восстанавливалась.

Для выяснения строения нового восстанавливающего агента из цитозоля клубеньков желтого люпина были проведены его спектрофотометрические и электрохимические исследования.

Спектр оптического поглощения очищенного компонента Я имеет максимум при 211 нм. плечо при 250-285 нм и плато постепенного снижения оптической плотности до 390 нм. Это указывает на наличие ароматических соединений в составе восстановителя. Оптическое поглощение компонента в УФ области является относительно невысоким, в видимой части спектра вообще отсутствует. При этом спектры флуоресценции и возбуждения флюоресценции имеют четко выраженные максимумы и при низкой чувствительности прибора, что говорит о большом квантовом выходе молекулы восстановителя.

На спектре флюоресценции (Х,шб = 280 нм) имеются два пика: четкий при 312 нм и широкий при 340 нм. Спектр возбуждения флюоресценции (/.„„, = 340 нм) имеет два острых пика при 287 нм и 302 нм. Широкий пик при 340 нм и острый пик при 287 нм подтверждают" факт наличия в составе компонента К ароматических соединений, в частности триптофана (Артюхов, Путинцева, 1991). Наличие двух других пиков (312 нм на спектре флюоресценции и 302 нм на спектре возбуждения флюоресценции) может свидетельствовать о том, что в другой части восстановителя также имеется сопряженная я-система электронов.

Были изучены некоторые электрохимические свойства низкомолекулярного компонента Для определения Е° компонента Я методом хроновольтамперометрии были сняты поляризационные кривые фосфатного буфера (фон) и компонента И в том же буфере при различных значениях рН на стационарных платиновом, стеклоуглеродном и ртутном электродах. При обработке полученных результатов стандартный окислительно-восстановительный потенциал компонента оказался равен -390 мВ. С использованием

Рис. 8. Восстановление компонентом К ЬЬ (а), МЬ (б), НЬ (в).

(0,02 М К-фосфатный буфер рН 7,2; + 100 мкл И) а

X, нм

На всех рисунках обозначения аналогичны рисунку а.

уравнения Рендлса-Шевчика (ip = 2.72-10sN3a-D"2-A-V"2-C°) показано, что количество электронов, участвующих в реакции восстановления Lb компонентом R, составляет N = 0,76 » le.

Концентрация компонента R в растворе была также рассчитана с использованием разработанной нами программы расчета форм гемопротеидов в растворе (см. пункт 5.1.) по количеству восстановленного Lb или Mb с учетом количества электронов, участвующих в реакции. Вычисления с использованием ПК показали, что концентрация компонента в растворе равна я 1,80'Ю"5 моль/л. Близость значений концентрации восстановителя, вычисленных разными методами, указывает на достоверность полученых результатов по строению и свойствам компонента R.

3.2. Выделение и изучение свойств компонента В.

Ранее было показано наличие в клубеньках сои, фасоли и вигны низкомолекулярного неферментативного восстановителя - компонента В (Becana, Klucas, 1990). Бьии изучены его некоторые свойства, однако никаких данных по строению приведено не было. Нами произведен поиск аналогичного компонента в цитозоле клубеньков желтого люпина. Такой восстановитель был обнаружен и очищен. Было изучено его строение и некоторые свойства.

Строение компонента В из клубеньков желтого люпина было изучено методом спстрофотометрии. Показано, что компонент В не содержит в своем составе птеринов и фдавинов, а характеристики его спектров поглощения и флюоресценции близки к спектрам веществ, имеющих в своем составе имидазодьный цикл (358 - максимум спектра испускания флюоресценции и 295 - максимум спектра возбуждения флюоресценции) (Рис. 9).

Сравнение свойств двух компонентов из цитозоля клубеньков желтого люпина представлено в таблице 3. Из таблицы видно, что основным отличием компонента R от компонента В является его сильная восстановительная способность по отношению к кислородпереносящим гемопротеидам in vitro в отсутствие доноров электронов. При этом компонен! В может приобретать такую способность только в процессе температурного воздействия in vitro. Для выяснения вопроса о возможном присутствии восстановленного компонента R в цитозоле клубеньков желтого люпина, а также механизмов его функционирования in vivo требуются дальнейшие исследования.__

Таким образом, на основании вышеперечисленных данных мы предполагаем, что в клубеньках бобовых растений присутствуют высокопотенциальные низкомолекулярные компоненты, способные к переносу электрона от восстановленных пиридиннуклеотидов к Lb. В состав этих компонентов входят аминокислотные остатки, имеющие в своем составе сопряженную я-систему электронов (например такие, как триптофан, гистидин). Восстановительные свойства компонентов связаны с нашчисм в их составе как индольного цикла, так, возможно, и какого-либо кофермента (например, кофермента М (2-этансульфоновая кислота - HS-CH2CH2SO3H)), реактивной SH-группы (подобно эрготионеину) или металла переменной валентности.

Рис. 9. Спектр флюоресценции (а) (Лв(п6=280им) и возбуждения флюоресценции (б) (Х.исп=370 им) компонента В.

Относительная интенсивность флюоресценции

300 350 400 450

X, нм

Относительная интенсивность флюоресценции 1

2Ю 20 30 35)

X., нм

Таблица 3. Сравнительная характеристика компонента В и компонента И.

(на основании литературных данных по компоненту В из клубеньков сои обыкновенной (Весапа, Юисаэ, 1990) и наших данных по компонентам В и Я из цитозоля клубеньков желтого люпина)

Свойства Компонент В Компонент Я

Молекулярная масса » 500 Да »500 Да ■

Гидрофобность + +

Строение:

1. наличие птеринов Нет Нет

2. наличие флавинов Нет Нет

3. другое наличие имидазольного наличие двух

цикла сопряженных я-систем

электронов, одна из

которых - индольный

цикл.

Восстановление

гемопротеидов:

а) легоглобина + +

б) миоглобина + +

в) гемоглобина - +

Собственная + +

восстановительная (только после

активность температурного

воздействия)

Сппгпбнпсть к + +

восстановлению

гемопротеидов в

присутствии ЫАОН+Н+

Температурное воздействие устойчив, приобретает теряет собственную

незначительную восстановительную

восстановительную активность.

активность.

4. Восстановление легоглобина в клубеньках бобовых растений.

4.1. Расчет термодинамической возможности поддержания окислительно-восстановительного статуса ЬЬ в цитозоле клубеньков бобовых растений.

До настоящего времени в большинстве работ доля неферментативного восстановления ЬЬ считалась незначительной, несмотря на то, что некоторые низкомолекулярные вещества (например, компонент В (Весапа, КЛисав, 1990)) восстанавливали легоглобин в опытах т \itro эффективнее, чем метлегоглобинредуктаза.

В настоящей работе для выяснения доли различных путей восстановления ЬЬ в клубеньках нами был проведен расчет термодинамической возможности поддержания окислительно-восстановительного статуса ЬЬ в цитозоле клубеньков бобовых растений известными к настоящему времени ферментативными и неферментативными восстановителями. Расчет основан на прямопропорциональной зависимости между величиной стандартной свободной энергии (ДО0) биохимической системы и ее окислительно-восстановительного потенциала.

Исходя из реальной концентрации и удельной активности имеющихся в клубеньке восстановителей, можно утверждать, что основную долю легоглобина в восстановленном состоянии поддерживает имеющаяся в клубеньках бобовых растений ферментативная система флавинсодержащих метлегоглобинредуктаз. Это становится очевидным при проведении расчетов, осуществленных нами на основании имеющихся данных по ферментативной системе восстановления ЬЬ сои и люпина. Даже при условии полного окисления ЬЬ, физиологическое состояние (практически 100 % степень восстановления ЬЬ) будет достигнуто менее чем за 30 секунд с использованием лишь восстановительного потенциала метлегоглобинредуктазы.

Однако мы предполагаем, что в условиях уменьшения активности флавинсодержащих редуктаз (влияние различных стрессовых факторов (Топунов, Петрова, 1997), нарушение синтеза ферментов и т.д.) потенциал флавинсодержащих ферментов может оказаться недостаточным для поддержания нормального окислительно-восстановительного статуса ЬЬ. Именно в данных условиях низкомолекулярные восстановители, имеющие более низкий потенциал (по сравнению с флавинсодержащими ферментами), могут способствовать более сильному смещению равновесия ЬЬ31' ЬЬ21" в сторону ЬЬ2+.

По нашему мнению, перенос электрона на легоглобин может осуществляться с участием низкомолекулярных веществ как переносчиков электронов. Можно выделить два возможных пути такого участия:

1. N АБН переносчик -> ЬЬ (подобная схема представлена в работе (Весапа, К1шж. 1990). Показано, что восстановление легоглобина т \itro по данной схеме могут осуществлять свободные флавины, а также низкомолекулярные компоненты, подобные компоненту В.

2. КАО(Р)Н -> фермент -» переносчик -» ЬЬ (по данной схеме восстановление легоглобина осуществляется цистеином (фермент - цистинредуктаза), глутатионом (фермент -глутатионредуктаза), низкомолекуляриыми компонентами, подобными компонентам В и Я (фермент - флавинсодержащие метлегоглобинредуктазы)). В последнем случае

низкомолекулярные восстановители могут выполнять функцию, аналогичную функции цитохрома bs в ферментативной системе восстановления НЬ животных.

4.2. Схема возможного механизма ферментативного восстановления Lb3* in vivo. Известно, что окислительно-восстановительные реакции, катализируемые флавин- и дисульфид-содержащими ферментами, как правило, являются бимолекулярными. Очевидно, что MLbR выполняет функцию двухэлектронного акцептора электронов в случае связывания с восстановленным пиридиннуклеотидом и одноэлектронного донора при восстановлении Lb3+. Это предположение согласуется с полученными данными о парном наличии в активном центре фермента сульфидных групп (в случае SH-флавинсодержащей MLbR гороха, сои и вигны) или железосерно! о кластера (в случае железосерной флавинсодержащей MLbR люпинов). Можно предположить, что после связывания NADH+H+ два электрона передаются по внутримолекулярному пути на молекулу окисленного FAD+, восстанавливая его до FAD*H2.

Таким образом, схема возможного механизма ферментативного восстановления LbJ+ in vivo может быть представлена следующим образом:

1. NADH+H+ + +FAD-MLbR-A2+ -*• 2H*FAD-MLbR-A2+ + NAD+

2. 2H*FAD-MLbR-A2+ -> 'FAD -MLbR-A° + 2H+

с участием переносчика, либо без него Lb3+

3. + FAD-MLbR-A°----------------------------------------------------> 4-1

- "FAD-MLbli-A3 Lb2+,

где A° и A2+- восстановленный и окисленный активный центр фермента. Представленная схема достаточно условна. Для точного качественного и количественного описания механизма ферментативного восстановления Lb необходимы дальнейшие исследования строения и функционирования MLbR и Lb.

5. Разработка и усовершенствование некоторых методов, использованных при изучении

легоглобина и его восстановителей. 5.1. Программа расчета концентраций трех форм кислородпереносяших гемопротеидов в

растворе.

Для изучения восстановления; гемопротеидов используются математические программы расчета их фор10^астворе/Гйк, в няпткй группа йита разработана программа расчета форм^Ь в растворе, работа на которой проводилась с использованием ЭВМ «Réalité» (Топунйв с соавт.. 1986). Однако эта программа не подходит для компьютеров с современным программным обеспечением. Нами была разработана новая программа, с помощью которой можно с высокой степенью точности рассчитывать концентрацию каждой из трех основных форм кислородпереносящих гемопротеидов (Lb, Mb, НЪ), (восстановленного Lb2+ (степень окисления 2'), оксигенированного Lb02 (степень окисления 2+), окисленного Lb3+ (степень окисления 3+)). исходя из имеющегося спектра оптического поглощения. Точность вычислений, с учетом погрешностей расчетов современных ЭВМ, зависит только от качества прогабулированных стандартных спектров Lb. Стандартные спектры Lb высокой степени точности были взяты нами из работы (Appleby, Bergersen, 1980), протабулированы и внесены в макрос программы.

При расчете использовалось свойство аддитивности оптической плотности растворов смеси нереагнруютцих веществ, которое можно выразить:

Dy W =

^ м i=i

где N - число компонентов в растворе,

К, - s, / (eî s - коэффициент экстинкции i-ro компонента, / - длина оптического пути в

сантиметрах) (Васильев, 1989).

Алгоритм расчета по этой формуле реализован на языке Vigual Basic for Application (VBA). Аппаратные и програмные требования: IBM PC-совместимый компьютер с процессором не ниже Pentium 100 МН, операционная система Windows 98, Excel 97 из пакета MS Office 97.

Программа осуществляет оценку концентрации компонентов путем минимизации суммы квадратов отклонений теоретически расчитанного спектра от экспериментальных значений (R). Программа также рассчитывает погрешности определений, используя следствие теоремы Гаусса-Маркова (Худсон, 1970):

S2 = R/(M - N), где б2 - оценка средней погрешности расчета. Далее расчитывается ковариационная матрица (матрица ошибок):

o{C) = ô{KT К)х

Диагональные элементы матрицы О представляют собой искомые погрешности вычисленных концентраций.

Эта программа была применнена нами при расчете активностей ферментативных и неферментативных восстановителей Lb, а также при изучении и самих компонентов Lb.

5.2. Ячейка для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектросЬотометрическнм контролем исследуемого вещества.

Одними из наиболее широко распространенных методов, применяемых в биологии для изучения белков, являются спектрофотометрические и электрохимические методы. Электрохимические эксперименты предполагают наличие электрохимической ячейки и соответствующих приборов, а спектрофотометрические - спектрофотометра и оптической кюветы. Однако очень часто необходимо одновременное использование обоих методов. Такая необходимость возникает, например, при изучении гемоглобинподобных белков, когда важно определение доли окисленной и восстановленной форм белка при измерении его окислительно-восстановительного потенциала. Для такого определения используются, как правило, электрохимические ячейки с возможностью спектрофотометрического детектирования раствора.

Перед нами сгояяа задача создания простой в изготовлении ячейки, удобной для измерения окислительно-восстановительных потенциалов компонентов легоглобина с возможностью параллельного спектрофотометрического контроля.

Была разработана конструкция ячейки, совмещающая в себе как электрохимическую, гак и спектрофотометрическую ячейку (кювету). На рисунке 10 представлено изображение ячейки в

Рис. 10. Чертеж-схема ячейки для биозлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества.

А - вид спереди, Б - вид сбоку (со снятым водяным затвором), В - вид сверху. 1 - Кварцевая кювета; 2 - Плоский шлиф; 3 - Зажим; 4 - Ячейка для проведения электрохимических измерений; 5 - Трубка ввода газа; 6 - Кран; 7 - Мешалка; 8 - Платиновые электроды; 9 - Трубка вывода газа и ввода веществ; 10 - Простой шлиф; 11 - Водяной затвор; 12 - Капилляр; 13 - Трубка для соединения рабочего раствора с электродом сравнения; 14 - Трубка для шланга (ввод газа).

трех проекциях. ______

При изготовлении ячейки имеется принципиальная возможность использования различных электродов. Могут быть использованы золотые электроды, которые в настоящее время находят все большее распространение, поскольку уже разработана методика защиты белков от денатурации па их поверхности. Через специальную тефлоновую насадку можно вставить внутрь конструкции и стеклоуглеродный электрод, который также широко применяется в электрохимических исследованиях. Принципиально возможна и комбинация вышеперечисленных типов рабочих электродов. В наших исследованиях был использован платиновый электрод, так как он традиционно используется при изучении гемоглобин-подобных белков.

Для проверки возможностей ячейки нами была произведена калибровка по потенциалу растворов равных концентраций ферро-феррицианида (Ем° = 430мВ) и восстановленного/окисленного антрахинон-2-сульфонага (Ем° = -234мВ), а также было осуществлено восстановление в ячейке нефракционированного легоглобина дитионитом натрия до конечной концентрации последнего 2 мМ. Было показано, что при работе с ячейкой (измерение окислительно-восстановительных потенциалов, запись спектра, перенос ячейки из

одного помещения и другое, подключение и отключение газа и электродов и т. д.) она оставалась герметичной.

Ячейка была использована нами при изучении компонента R. В дальнейшем мы предполагаем использовать данную конструкции для измерения окислительно-восстановительных потенциалов гемеодержащих белков и их восстановителей.

Выводы

1. Разработан метод одновременного получения в гомогенном состоянии множественных форм метлегоглобинредуктазы и компонентов легоглобина из клубеньков бобовых растений.

2. Впервые выделены и получены в гомогенном состоянии метлегоглобинредуктазы из клубеньков узколистного люпина и гороха посевного.

3. Клубеньки разных видов бобовых различаются по наличию различных форм метлегоглобинредуктазы. В то время, как в клубеньках обоих видов люпина содержатся две ее формы, сильно различающиеся по свойствам, в клубеньках гороха содержится лишь одна форма фермента.

3. Показано, что в клубеньках желтого люпина содержатся две формы метлегоглобинредуктазы: гомодимерная железосодержащая с молекулярной массой 120 кДа и мономерная с молекулярной массой 62 кДа, не содержащая металлов. Более активной является мономерная метлегоглобинредуктаза.

5. Из клубеньков желтого люпина выделен новый низкомолекулярный восстановитель легоглобина (компонент R). Компонент имеет массу около 500 Да, содержит в своем составе индольный цикл.

6. Из клубеньков желтого люпина выделен низкомолекулярный восстановитель - компонент В. ранее обнаруженный в клубеньках других видов бобовых. Впервые изучено его строение. Показано наличие в его составе имидазольного цикла. В отличие от компонента R, компонент В не способен восстанавливать кислородпереносящие гемопротеиды в отсутствие доноров электронов.

7. Проведен расчет термодинамической возможности восстановления легоглобина в клубеньках различными восстановителями. Показано, что в нормально функционирующих клубеньках потенциала флавинсодержащих редукгаз достаточно для поддержания легоглобина в восстановленном состоянии.

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э., Шлеев С. В., Розов Ф.Н., Жабаева М.У. Реакции, в которых участвует легоглобин, и схема его функционирования в азотфиксирукяцих клубеньках бобовых. U XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Химия живого. Рефераты докладов и сообщений. № 4. Санкт-Петербург, 1998. С.155.

2. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э., Розов Ф.Н., Шлеев С.В. Влияние внешних условий на регуляцию кислородного режима в клубеньках бобовых растений. // Проблемы ботаники на рубеже XX - XXI веков. Тезисы докладов, представленных II (X) съезду Русского ботанического общества. Санкт-Петербург, 1998. С.203.

3. Шлеев С.В., Розов Ф.Н., Петрова Н.Э., Топунов А.Ф. Пути восстановления легоглобина и его функционирование в клубеньках бобовых растений. // Физиология растений - наука Ш тысячелетия. Тезисы докладов, представленных IV съезду Общества физиологов растений России. Москва, 1999. С.250-251.

4. Шлеев С.В., Кузнецов С.В., Топунов А.Ф. Ячейка для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества. II Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т.36. N 3. С. 35-4-358.

5. Шлеев С.В., Петрова Н.Э., Топунов А.Ф. Метлегоглобинредуктазы бобовых растений. // Горизонты физико-химической биологии. Тезисы стендовых сообщений. Пущино, 2000.

—С-.-156.-

6. Topunov A.F., Shleev S.V., Petrova N.E., Rozov F.N., Zhabaeva M.U. Reductases reducing plant hemoglobins and possible mechanism of their action. // Biocatalysis-2000. International congress. Abstracts. Moscow, Russia, 2000. P.57-58.

7. Topunov A.F., Shleev S.V., Petrova N.E., Rozov F.N., Zhabaeva M.U. Reductases reducing plant hemoglobins and possible mechanism of their action. // Moscow University Chemistry Bulletin. 2000. Special Issue. P. 9-11.

8. Шлеев C.B., Розов Ф.Н., Топунов А.Ф. Метод получения множественных форм метлегоглобинредуктазы и компонентов легоглобина из клубеньков люпина. П Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. N 2. (в печати).

Издательский центр ССКТБ - ТОМАСС г. Москва, ул. Нижняя Красносельская д. 13 Зак. 112 тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шлеев, Сергей Валерьевич

Введение

Список используемых сокращений Часть 1. Литературный обзор

Глава 1. Азотфиксирующий клубенек бобового растения

1.1. Образование и строение клубеньков

1.2. Бактерии и бактероиды

Глава 2. Легоглобин и его функционирование в клубеньках 2:1. Строение молекулы легоглобина

2.2. Компоненты и биосинтез легоглобина

2.3. Состояние и локализация легоглобина в клубеньках

2.4. Функционирование легоглобина

Глава 3. Восстановление легоглобина 3:1. Ферментативное восстановление 3.2. Неферментативное восстановление

Часть 2. Материалы и методы исследований

1. Материал, использованный в работе

2. Получение белков из цитозоля клубеньков 3: Определение концентрации легоглобина и других кислородпереносящих гемопротеидов

4. Проведение электрофореза белков. Получение зимограмм

5. Определение молекулярной массы

6. Изоэлектрическое фокусирование

7. Концентрирование белков методом ультрафильтрации

8. Определение активности метлегоглобинредуктазы

9. Определение активности компонента К

10. Спектрофотометрические исследования

11. Проведение жидкостной колоночной хроматографии

12. Получение окисленных, восстановленных и оксигенированных гемопротеидов

13. Проведение электрохимических экспериментов

14. Определение негеминового железа

15. Определение содержания белка

16. Реактивы, использованные в работе Часть 3. Результаты и их обсуждение

1. Множественные формы метлегоглобинредуктазы в клубеньках желтого люпина

1.1. Разработка метода получения в препаративных количествах множественных форм метлегоглобинредуктазы и компонентов легоглобина из клубеньков бобовых растений

1.2. Изучение множественных форм метлегоглобинредуктазы желтого люпина

2. Метлегоглобинредуктаза и легоглобин узколистного люпина и гороха посевного

2.1. Изучение метлегоглобинредуктаз узколистного люпина и гороха посевного

2.2. Изучение легоглобина узколистного люпина и гороха посевного

3. Изучение свойств и строения неферментативных восстановителей из клубеньков желтого люпина

3.1. Выделение и изучение свойств компонента Л

3.2. Выделение и изучение свойств компонента В

4. Восстановление легоглобина в клубеньках бобовых растений

4.1. Расчет термодинамической возможности поддержания окислительно-восстановительного статуса легоглобина в цитозоле клубеньков бобовых растений

4.2. Схема возможного механизма ферментативного восстановления легоглобина ш vivo

5. Разработка и усовершенствование некоторых методов, использованных при изучении легоглобина и его восстановителей

5.1. Программа расчета концентраций трех форм кислородпереносящих гемопротеидов в растворе

5.2. Ячейка для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ферментативное и неферментативное восстановления легоглобина в клубеньках бобовых растений"

Актуальность проблемы. Биологическая фиксация атмосферного азота -глобальный процесс, обеспечивающий возможность существования жизни на Земле. Способность восстанавливать N2 до ЫН/ выявлена у многих прокариот, но у эукариотических организмов она до сих пор не обнаружена. Однако многие растения, грибы и животные могут вступать в симбиоз с азотфиксаторами, что существенно расширяет экологические возможности как микро-, так и макросимбионта.

Наиболее активно изучается процесс симбиотической азотфиксации микробно-растительными сообществами, и, в частности, бобово-ризобиальными симбиозами. Проблема фиксации азота бобово-ризобиальной симбиотической системой включает в себя большое количество тесно связанных между собой вопросов. Одним из важнейших является изучение легоглобина (леггемоглобина) - гемопротеида бобовых растений, участвующего в регуляции кислородного режима в клубеньках бобовых. Он необходим для нормального функционирования бактероидов, в которых содержится нитрогеназа - фермент, катализирующий реакцию восстановления молекулярного азота. Легоглобин способен функционировать только в физиологически активном, восстановленном состоянии. Описано несколько путей восстановления легоглобина, как ферментативных, так и неферментативных, однако многие из них пока недостаточно изучены.

Изучение легоглобина и процесса его восстановления важно как с точки зрения теоретических аспектов (изучение механизмов симбиотической азотфиксации и теории эволюции гемопротеидов), так и чисто практических, каковыми являются поиск путей повышения плодородия почв и методов лечения 6 заболеваний, связанных с нарушениями в функционировании гемоглобина (например, метгемоглобинемии).

2. Изучение и сравнение метлегоглобинредуктаз и легоглобина различных видов бобовых.

3. Изучение процесса неферментативного восстановления легоглобина и некоторых низкомолекулярных восстановителей, а также оценка вклада различных путей восстановления в процесс поддержания легоглобина в восстановленном состоянии.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан метод одновременного получения различных форм метлегоглобинредуктаз и компонентов легоглобина из цитозоля клубеньков бобовых растений в электрофоретически гомогенном состоянии.

В цитозоле клубеньков желтого и узколистного люпинов обнаружены две формы метлегоглобинредуктазы (мономерный флавопротеид и димерный негемовый железофлавопротеид), в клубеньках гороха - одна (димерный флавопротеид). 7

Изучены различные свойства низкомолекулярных, восстановителей из клубеньков бобовых растений. Высказано предположение об их возможной роли в азотфиксирующих клубеньках.

Произведен расчет термодинамической возможности поддержания окислительно-восстановительного статуса Lb в цитозоле клубеньков бобовых растений.

Разработана программа расчета концентраций различных форм гемопрогеидов для персональных компьютеров «1ВМ». Разработана конструкция ячейки для биоэлектрохимических исследований с параллельным спектрофотометрическим контролем исследуемого вещества.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шлеев, Сергей Валерьевич

Выводы

2. Выделены и получены в гомогенном состоянии метлегоглобинредуктазы из клубеньков узколистного люпина и гороха посевного.

5. Из клубеньков желтого люпина выделен новый низкомолекулярный восстановитель легоглобина (компонент Я). Компонент имеет массу около 500 Да, содержит в своем составе индольный цикл.

6. Из клубеньков желтого люпина выделен низкомолекулярный восстановитель -компонент В, ранее обнаруженный в клубеньках других видов бобовых. Впервые изучено его строение. Показано наличие в его составе имидазольного цикла. В отличие от компонента Л, компонент В не способен восстанавливать кислородпереносящие гемопротеиды в отсутствие доноров электронов.

7. Проведен расчет термодинамической возможности восстановления легоглобина в клубеньках различными восстановителями. Показано, что в нормально функционирующих клубеньках потенциала флавинсодержащих редуктаз достаточно для поддержания легоглобина в восстановленном состоянии.

142

В заключение хочу выразить глубокую благодарность моему научному руководителю доктору биологических наук Топунову Алексею Федоровичу за предложенную тему и всемерную поддержку при выполнении данной работы.

Хочу выразить глубокую благодарность кандидату биологических наук Шубину Владимиру Вениаминовичу (ИНБИ РАН) за помощь в проведении спектроскопических исследований, доктору биологических наук профессору Ванину Станиславу Федоровичу и кандидату биологических наук Воевудской Нине Владиславовне за помощь при проведении ЭПР-спектроскопии (ИХФ РАН), кандидату химических наук Кузнецову Сергею Викторовичу (БГПУ), помогавшему в изготовлении оборудования и проведении электрохимических экспериментов, Кузнецову Александру Валентиновичу, Хлупову Александру Юрьевичу (МПГУ) и Ионову Александру Вячеславовичу (МГГУ), оказавшим существенную помощь при математической обработке данных, кандидату биологических наук Софьину Алексею Владимировичу (ИНБИ РАН) за ценные замечания при обсуждении полученных результатов.

Также выражаю искреннюю благодарность заведующему лаборатории метаболизма азота и синтеза белка у растений Института биохимии им. А.Н. Баха доктору биологических наук профессору Валерию Романовичу Шатилову и всем сотрудникам лаборатории за неизменно доброжелательное отношение к себе и своей работе.

Хочу также поблагодарить обслуживающий персонал нашего института, особенно стеклодува Николая Яковлевича Александрова, за помощь в изготовлении и ремонте оборудования.

Работа была выполнена при поддержке РФФИ (гранты 96-04-50379 и 9904-48640) и Госпрограммы Миннауки России "Фитобиотехнология".

143

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шлеев, Сергей Валерьевич, Москва

1. Артюхов В.Г., Путинцева О.В. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем. Воронеж: Изд. ВГУ. 1996. 240 с.

2. Арутюнян Э.Г. К вопросу о сродстве гемоглобинов к молекулярному кислороду (по данным структуры леггемоглобина люпина). // Докл. АН СССР. 1980. Т.252. N 2. С.413-420.

3. Арутюнян Э.Г. Структура леггемоглобина. // Молек. биол. 1981. Т. 15. N 1. С.27-43.

4. Атанасов Б.П., Пейве Я.В. Окислительно-восстановительные равновесия леггемоглобина люпина (Lupinus luteus L.) и некоторых родственных гемсодержащих белков // Докл. АН СССР. 1974. Т. 216. N 5. С. 1161-1164.

5. Барбацкий С. Люпин. М.: Иностранная литература, 1959, 261 с.

6. Баширова Н.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Кретович В.Л. Влияние ферментативного восстановления Lb и Mb на азотфиксирующую активность бактероидов Rhizobium lupini. II Физиология растений. 1978. Т.25. N 4. С.720-725.

7. Баширова Н.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Кретович В.Л. Метлегоглобинредуктаза клубеньков люпина. Очистка, свойства. // Биохимия. 1979. Т.44. N 7. С.1240-1245.

8. Бороденко Л.И., Генина О.С., Жизневская Г.Я., Измайлов С.Ф. Редуктазные свойства негеминового железофлавопротеида из клубеньков люпина желтого. //Физиология растений. 1990. Т.37. N 6. С.1131-1137.

9. Бороденко Л.И., Жизневская Г.Я. Диафоразная активность негеминового железопротеида из клубеньков люпина. // Физиология растений. 1978. Т.25. N 3. С.455-463.144

10. Высшая школа, 1989. 384 стр. Галюс 3. Теоретические основы электрохимического анализа. М.: Мир. 1974. 256 с.

11. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции / под ред. И.А.

12. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. 1982. 1022 с.

13. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. 544 с.

14. Дуброво П.Н. Определение содержания восстановленных и окисленных НАД и НАДФ в тканях клубеньков люпина желтого // Физиология растений. 1978 Т. 25. N3. С. 615-622.

15. Егоров Ц.А., Казаков В.К., Шахпаронов М.И., Фейгина М.Ю. Аминокислотная последовательность леггемоглобинов I и II из клубеньков желтого люпина. // Биоорган, химия. 1980. Т. 6. N 5. С. 666-683.145

16. Жабаева М.У. Метфитоглобинредуктаза й функционирование легоглобина в клубеньках люпина. Дис. . канд. биол. наук. М.: ИНБИ им. А.Н. Баха РАН. 1991.170 с.

17. Жизневская Г.Я. Медь, молибден и железо в азотном обмене бобовых растений. М.: Наука, 1972. 335 с.

18. Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И., Меклер В.И., Белоногова О.В., Измайлов С.Ф. Взаимодействие гемина и леггемоглобина с липидным бислоем в перибактероидной мембране клубеньков люпина желтого. // Физиология растений. 1994а. ТТП.И 1. С.80-84.

19. Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И., Федорова Е.Е., Кудрявцева Н.Н, Андреева И.Н., Измайлов С.Ф. Исследование локализации леггемоглобина в клубеньках люпина желтого. // Физиология растений. 1994. Т.41. N 1. С.70-79.

20. Калинин Ф.Л., Лобов В.П., Жидков В.А. Справочник биохимика. Киев: Изд. "Наукова думка". 1971. 1014 с.

21. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества. М.: Химия, 1974. 287 с.

22. Коржуев П.А. Гемоглобин. М.: Наука. 1964. 287 с.

23. Кретович В.Л. Усвоение и метаболизм азота у растений. М.: Наука. 1987. 488 с.

24. Кретович В.Л., Мелик-Саркисян С.С., Матус В.К. Состав цитохромов клубеньков люпина желтого. // Биохимия. 1972. Т.37. N 4. С.711-719.146

25. Ливанова Г.И., Жизневская ГЛ., Андреева H.H. Внетриклеточная локализация леггемоглобина в клубеньках Lupinus luteus L. // Докл. АН СССР. 1979. Т.245. N 3. С.739-742.

26. Лихтенштейн Г.И. Многоядерные окислительно-восстановительныеметаллоферменты. М.: Наука, 1979. 324 с. Львов Н.П. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов. М.: Наука, 1989. 87 с.

27. Мелик-Саркисян С.С., Баширова Н.Ф., Владзиевская Л.П., Карпиленко Г.П., Кретович В.Л. Изучение легоглобина клубеньков люпина методом изоэлектрического фокусирования. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1975. N 6. С. 837-845.

28. Мелик-Саркисян С.С., Баширова Н.Ф., Зауралова Н.О., Кретович В.Л. Ферментативное восстановление легоглобина. // Биохимия. 1976. Т.41. N 7. С.1330-1333.

29. Органическая электрохимия. / Под ред. М. Бейзера и X. Лунда, М.: Химия, 1988. 1022 с.

30. Остерман J1.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммунноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983. 304 с.

31. Остерман J1.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985, 536 с.

32. Пейве Я.В. Микроэлементы и биологическая фиксация атмосферного азота. XXXI Тимирязевское чтение. М.: Наука. 1971.

33. Пейве Я.В., Атанасов Б.П., Жизневская Г.Я.; Краснобаева H.H. Способ получения леггемоглобина из клубеньков люпина методом дробного высаливания (NH4)2S04. // Физиология растений. 1973. Т. 20. N 4. С.852-856.

34. Пейве Я.В., Жизневская Г.Я. Гемоглобин в клубеньках бобовых культур, микроэлементы и фиксация молекулярного азота. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1966. N 5. С.644-652.

35. Пейве Я.В., Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И. Кристалический гемоглобин из клубеньков люпина Lupinus luteus L. // Физиология растений. 1972. Т. 19. N 5. С.1053-1061.

36. Пейве Я.В., Жизневская Г.Я., Ливанова Г.И. Кристалический гемоглобин из клубеньков люпина Lupinus luteus L. // Докл. АН СССР. 19676. Т. 177. N 5. С.1229-1231.

37. Пейве Я.В., Жизневская Г.Я., Ливанова Г.И., Сафонов В.И. Сравнительное исследование гемоглобинов из клубеньков сои, кормовых бобов и люпина методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле. // Докл. АН СССР. 1967а. Т. 173. N4. С.956-959.148

38. Пейве Я.В., Ягодин Б.А., Бакеева Н.М. Препаративный электрофорез белков на полиакриламидном геле // Биофизические методы в физиологии растений / Под ред. Ю.Г. Молотковского. М.: Наука, 1971.С. 5.

39. Пейве Я.В., Ягодин Б.А., Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И. Полиморфизм кристаллов гемоглобина из клубеньков различных видов люпина. // Физиология растений. 1970. Т. 17. N 2. С.290-294.

40. Практикум по электрохимии. / Под ред. Б. Б. Дамаскина, М.: Химия, 1991. 287 с.

41. Проворов H.A. Взаимосвязь между таксономией бобовых и специфичностью их взаимодействия с клубеньковыми бактериями. // Ботанический журнал. 1992. T.77.N8. С. 21-32.

42. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: Теория, методы и применение. М.: Мир, 1986. 398 с.

43. Сухотин A.M. Справочник по электрохимии. Л.: Химия. 1981. 488 с.

44. Топунов А.Ф. Легоглобин и его роль в регуляции кислородного режима в азотфиксирующих клубеньках бобовых. // Биохимия. 1995. Т.60. N 1. С.66-74.

45. Топунов А.Ф. Функционирование легоглобина и регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых. Дис. . доктора биол. наук. М.: ИНБИ им. А.Н. Баха РАН. 1996. 232 с.

46. Топунов А.Ф., Голубева Л.И. Редуктазы, восстанавливающие кислородпереносящие гемопротеиды: гемоглобин, миоглобин, легоглобин. // Успехи биол. химии. 1989. Т.30. С.239-252.

47. Топунов А.Ф., Голубева Л.И., Осокин П. Л., Осокина М.В., Кретович В.Л. Исследование с использованием ЭВМ процесса ферментативного восстановления легоглобина. //Докл. АН СССР. 1986. Т.289. N 1. С.236-239.149

48. Топунов А.Ф., Голубева Л.И., Сварадж К., Кретович В.Л. Метлегоглобин редуктаза и цитохром-с-редуктаза клубеньков сои. // Докл. АН СССР. 1985. Т.281. N 5. С.1258-1261. Топунов А.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Лысенко Л.А., Карпиленко Г.П., Кретович

49. B.Л. Метлегоглобинредуктаза клубеньков люпина. Некоторые свойства. // Биохимия. 1980. Т. 45. N 11. С. 2053-2059.

50. Топунов А.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Лысенко Л.А., Кретович В.Л. Свойства метлегоглобинредуктазы клубеньков люпина. // Биохимия. 1982. Т.47. N 11.1. C.442-445.

51. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э. Регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых и классическая концепция стресса. // Физиология растений. 1997. Т.44. С.671-675.

52. Шаронов Ю.А., Яровенко В.В., Мелик-Саркисян С.С., Кретович В.Л. Исследование дисперсии магнитооптического вращения легоглобина люпина. //Биохимия. 1973. Т.38. N 1. С.80-86.150

53. Шемаханова Н.М., Бунько И.П. Содержание витаминов группы «В» и глутатиона в клубеньках и корнях фасоли. // Сельхоз. биология. 1968. Т.6. С.859-863.

54. Яковлев В.А., Сырцова J1.A. Выделение и. изучение железосодержащего белка негеминовой природы из Azotobacter vinelandii. В сборнике: «Механизмы дыхания, фотосинтеза и фиксации азота». М.: Наука, 1967. С.351-353.151

55. Arredondo-Peter R., Moran J.F., Sarath G., Luan P., Klucas R.V. Molecular cloning of the cowpea leghemoglobin II gene and expression of its cDNA in Escherichia coli. II Plant Physiol. 1997. V.l 14. P.493-500.

56. Allen O.N., Allen E.K. The Leguminosae. A source book of characteristics, uses and nodulation. Madison, 1981. 800 p.

57. Andrews P. Estimation of the molecular weight of protein by Sephadex gel-filtration // Biochem. J., 1964, V. 91. N 2, P. 222-223.

58. Appleby C.A. The oxigen equilibrium of leghemoglobin. // Biochim. Biophys. Acta. 1962, V.60. N 2. P.226-235.

59. Appleby C.A. The origin and function of haemoglobin in plants // Sci. Progr. 1992. V. 76. P. 365-398.

60. Appleby C.A., Bergersen F.J. Preparation and experimental use of leghaemoglobin. // Methods of evaluating biological nitrogen- fixation. / Ed.: Wiley & Sons. 1980. Canberra. Australia.

61. Appleby C.A., Nicola N.A., Hurrell J.G.R., Leach S.J. Characterization and improved separation of soybean leghemoglobin. // Biochemistry. 1975. V.14. N 20. P.4444-4450.

62. Becana M., Klucas R.V. Enzymatic and nonenzimatic mechanisms for ferric leghemoglobin redaction in legume root nodules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V.87. P.7295-7299.

63. Becana M., Klucas R.V. Oxidation and reduction of leghemoglobin of leguminous plants. // Plant Physiol. 1992. V.98. P. 1217-1221.

64. Becana M., Klucas R.V. Transition metals in legume root nodules: Iron-dependent free radical production increases during nodule senescence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 8958-8962.

65. Becana M., Salin M.L., Ji L., Klucas R.V. Flavin-mediated reduction of ferric leghemoglobin from soybean nodules // Planta. 1991. V. 183. P. 575-583.

66. Behnke J.N., Dagher S.M., Massey T.H., Deal W.C. I I Anal. Biochem. 1975. V. 69. P. 1-9.

67. Beinert H. Iron sulphur proteins, the most diversified components of the mitochondrial electron transfer system // Iron and Copper Proteins / Ed. Beinert H.N.Y.; L.: Pergamon Press, 1976. P. 137-145.

68. Bergersen F.J. Oxygenation of leghemoglobin in soybean root nodules in relation to the external oxygen tension. // Nature. 1962. V.1'94. N 4833. P.1059-1061.

69. Bergersen F.J., Appleby C.A. Leghemoglobin within bacteroid-enclosing membrane envelopes in soybean root nodules. // The Fourth Int. Symp. On Nitrogen Fixation. Programme and Abstracts. Canberra. 1980. P.83.

70. Bergersen F.J., Appleby C.A. Leghemoglobin within bacteroid-enclosing membrane envelopes from soybean root nodules. // Planta. 1981. V. 52. N 6. P. 534-543.

71. Bergersen F.J., Goodchild D.J. Cellular localization and concentration of leghemoglobin in soybean root nodules. // Aust J. Biol. Sci. 1973. V.26. N 4. P.741-756.

72. Bergersen F.J., Turner G.L., Appleby C.A. Studies of the effects of nitrogen on soybean nodule extracts. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V.292. N 1. P.272.

73. Bergersen F.J., Turner G.L. Comparative studies of nitrogen fixation by soybean root nodules bacteroid suspensions and cell-free extracts. // J. Gen. Microbiol. 1968. V. 53. N2. P.205-220.

74. Bergman K., Gulash-hoffee M., Hovestadt R.E. Phisiology of behavorial mutants of Rhizobium meliloti: evidence for a dual chemotaxis pathway // J. Bacteriology. 1988.V. 170. P. 3249-3254.

75. Bethlenfalvay N. C., Waterman M.R., Lima J.E., Waldrup T. Cytosolic and membrane-bound methemoglobin reductases in erythrocytes of the opossum, Didelphis virginiana. II Comp. Biochem. Physiol. 1982. V.73b. N 3. P.518-594.

76. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein due binding. // Anal. Biochem. 1976. V.72. N 1. P.248-254.

77. Brisson N., Verma D.P.S. Soybean leghemoglobin gene family: normal, pse.udo and truncated genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. N 13. P. 4055-4059.

78. Broughton W.J., Dilworth M.J. Control of leghaegemoglobin synthesis in Snake Beans // Biochem. J. 1971. V. 125. P. 1075-1080.

79. Broughton W.J., Dilworth M.J., Godfrey C.A. Molecular properties of lupin and serradella leghaemoglobins // Biochem. J. 1972. V. 127. P. 309-314.

80. Chrambach A., Reisfeld R.A., Wyckoff M., Laccari J.A. Procedure for rapid and sensitive staining of protein fractionated by polyacrilamide gel electrophoresis. // Anal. Biochem. 1967. V.20. N 1. P. 150-154.).

81. Coventry D.E., Dilworth M.J. Synthesis and turnover of leghemoglodin in lupin root nodules, i! Biochim. Biophys. Acta. 1976. V.447. N 1. P.l-10.

82. Cutting J. A.,, Schulman H.M. Leghemoglobin concerning the sites of biosynthesis of its components. // Federation Proc. 1968. V.27. N 2. P.768.

83. Cutting J.A.,, Schulman H.M. The determinant in the Rhizobium-legume symbiosis for leghemoglobin specificity. // Biochem. Biophys. Acta. 1971. V.229. N 1. P.58-62.

84. Dart P.J. Legume root nodules. Initiation and development. // The Development and Function of Roots. L., N.-Y.: Acad. Press. 1975. P.468-469.

85. Dart P.J., Mercer P.V. Development of the bacteroid in the root nodule of barrel medic (Medicago tribuloides Desr.) and subterraneum clover (Trifolium subterraneum L.). II Arch. Microbiol. 1963. V.46. N 4. P.382-401.

86. Dazzo F.B. Bacterial attachment as related to cellular recognition in Rhizobium-legume symbiosis // J. Supermolec. Struct. Cell. Biochem. 1981. V. 16. P. 29-41.

87. Denison R.F. Mathenatical modeling of oxygen diffusion and respiration in legume nodules. // Plant Physiol. 1992. V.98. P.901-907.

88. Devis B.J. Disc electrophoresis II. Method and application to human serum proteins. // Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1964.V.121. Part 2. P.404-427.

89. Diaz C.A., Melchers L.S., Hooykaas P.J. Competitive nodulation blocking of Afghanistan pea is determined by nodDABC and nodEF alleles in Rhizobium leguminosarum. II Mol. And Gen. Genet. 1989. V. 216. P. 170-174.

90. Dilworth M.J.,, Kidby D.K. Localization of iron and leghemoglobin in the root nodule by electrone microscope autoradiography. // Exp. Cell. Res. 1968. V. 49. N 1. P. 148159.

91. Dixon M. The acceptor specifity of flavins and flavoproteins // Biochim. Biophys. Acta. 1971. V. 226. P.238-242.

92. Dutton P.L. Redox potentiometry: determination of midpoint potentials of oxidation-reduction components of biological electron-transfer systems. // Methods in Enzymology. N.Y. etc.: Acad. Press, V. 54. 1978. P. 411-435.

93. Elfolk N. Crystallin leghemoglobin. II. The molecular weights and shapes of the tho main components. // Acta Chem. Scand. 1960. V. 14. N 8. P. 1819-1827.

94. Elfolk N., Sievers G. Crystallin. leghemoglobin. X. The ferrihemochromt of leghemoglobin. // Acta Chem. Scand. 1967. V.21. N 6. P.1457-146.1.

95. Elfolk N., Sievers G. The primary structure of soybean leghemoglobin. // Biochim. Biophis. Acta. 1971. V. 25. N 9. P.3532-3534.

96. Elfolk N., Virtanen A. Electrophoresis of leghemoglobin // Acta Chem. Scand. 1950. V. 4. N.7. P. 1014-1019.

97. Fred E.B., Balwin I.L., McCoy E. Root nodule bacteria and legumin plants. Madison: University Wisconsin Press. 1932.

98. Fuchsman W.H., Appleby C.A. Separation and determination of the relative concentrations of the homogeneous components of soybean leghemoglobin by isoelectric focusing // Biochim. et Biophys. Acta. 1979. V. 579. P. 314-324.

99. Goodfrey C.A., Dilworth MJ. Haem biosyntesis from 14C.-d-aminolaevulinic acid in laboratory grown and root nodule Rhizobium lupini. 11 J. Gen. Microbiol. 1971. V.69. N 3. P.385-390.

100. Gourret J.P., Fernandez-Arias H. Etude ultrastructurale et cytochimique de la différenciation des bacteroides de Rhizobium trifolium. Dangeard dans les nodules de Trifolium repens. // Can. J. Microbiol. 1974. V.20. N 8. P.l 169-1181.

101. Gresshoff P.M., Caetano-Anolles G. Systemic regulation of nodulation in legumes // Plant Biotech. Develop. Boca Raton etc., 1992. P. 87-100.

102. Henderson R.W., Appleby C.A. The redox potential of leghaemoglobin // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 283. P. 187-191.

103. Henderson R.W., Rawlinson W.A. Potentiometric and other syudes on preparations of cytochrome c from ox- and horse-heart muscle. // Biochem. J. 1956. V. 62. N 1. P. 21-29.

104. Holl F.B., Milliron M.L., Delafied S.J. Quantative variation in root nodulee leghemoglobins: intra-specific variation in component profiles. // Plant Sci. Lett. 1983. V. 32. N 3. P.321-326.

105. Kubo H. Uber das Hemoprotein aus den Wurrelknollchen von Leguminosen. II Acta. Phytochim. 1939. V. 11. N 1. P. 195-200.

106. Marcker K.A., Bojsen K., Jensen E.J., Paludan K. The soybean leghemoglobin genes. // In: Advances in Nitrogen Fixation Recearch. Proc. 5th Int. Symp. On Nitrogen

107. Fixation. The Netherlands, 1983. / Ed. C.Veeger, W.E.Newton. The Hague etc.: Martinus Nijhoff, Dr. W.Junk Publishers & Wageningen: Pudoc. 1984. P.493.

108. Mennes A.M. Indole-3-acid oxidase activity in root nodules and roots of Lupinns luteus L. Purification and kinetics of the enzyme. Ph. D. Thesis. Elve, Leiden. 1972. 96 pp.

109. Nash D.T., Schulman H.M. The absence of oxidized leghemoglobin in soybean root nodules during nodule development. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 68. P. 781-785.

110. Nesterenko M.V. et al. // Biochem. Biophys. Method. 1994. V.28. N 3. P.239-242.

111. Newton W.E., Fisher K., Kim C.H. et al. Probing catalytic function through amino-acid substitutions in Azotobacter vinelandi molybdenium-dependent nitrogenase // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Dordrecht etc., 1995. P. 91-96.

112. O'Brian M.R. Heme synthesis in the Rhizobium-legume symbiosis: a palette for bacterial and eukaryotic pigments //J. Bacteriology. 1996. V. 178. P. 13-24.

113. Ollis D.L., Appleby C.A., Colman P.M., Cutten A.E., Guss J.M., Vencatappa M.P., Freeman H.C. Crystal structure of soybean ferric leghemoglobin a nicotinate at a resolution of 3.3. // Aust. J. Chem. 1983. V. 36. N 3. P. 451-468.

114. Passon P.G., Hultquist D.E. Soluble cytochrome b5 reductase from human erythrocytes // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 275. N 1. P. 62-73.

115. Pate J.S. Studies of the growth substances of legume nodules using paper . chromatography. //Aust. J. Biol. Sci. 1958. V.l 1. P.516-528.

116. Puppo A., Rigaud J. Indole-3-acetic acid (IAA) oxidation by leghemoglobin from soybean nodules. // Physiol. Plant. 1975. V.35. P.181-185.

117. Puppo A., Rigaud J. A possible redacion pathway for leghemoglobin in vivo. // Febs letters. 1979. V.108. N 1. P.181-185.

118. Puppo A., Rigaud J., Job D. Leghemoglobin reduction by a nodule reductase. // Plant Sci. Lett. 1980. V.20. P. 1-6.

119. Puppo A., Rigaud J., Job D. Role of superoxide anion in leghemoglobin autoxidation. 11 Plant Science Letters. 1981. V.22. P. 353-360.

120. Quast R., Vesterberg O. Isoelectric focusing and separation of hemoglobins of Myxine glutinosa L. in a natural pH gradient. // Acta Chem. Scand. 1968. V.22. N 5. P. 14991508. '

121. Rhichardson V., Dilworth M.J., Scawen M.D. The amino acid sequence of leghaemoglobin I from root nodules of broad bean (Vicia faba L.). // FEBS Letters. 1975. V. 57. N l.P. 33-37.

122. Robertson J.C., Warburton M.P., Lyttleton P., Bullivant S., Grauston G.F. Membranes in lupin root nodules. I. The role of Golgi bodines in biogenesis of infection threads and peribacteroid membranes. // J. Cell. Sci. 1978. V.30. N 2. P. 129-149.

123. Roth L.T., Stacey G. Bacterium release into host cells of nitrogen-fixing soybean nodules: the symbiosome membrane comes from three sources // Europ. J. Cell. Biol. 1989. Vol. 49. P. 13-23.

124. Rydstrom J. Evidence for a proton-dependent regulation of mitochondrial nicotinamide-nucleotide transhydrogenase // Eur. J. Biochem. 1974. V. 45. P. 67-76.

125. Saari L.L., Klucas R.V. Ferric leghemoglobin reductase from soybean root nodules. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. V.231. N 1. P.102-113.

126. Saari L.L., Klucas R.V. Nonenzymatic redaction of ferric leghemoglobin. 7/ Biochim. Biophys. Acta. 1987. V.912. P.198-202.

127. Scott E.M. Purification of diphosphopyridine nucleotide diaphorase from methemoglobin erythrocytes. // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1962. V.9. N 1. P.59-62.

128. Sievers G., Huhtala M.L., Ellfolk N. The primary structure of soybean (Glycine max) leghemoglobin c. // Acta Chem. Scand. 1978. V. 32. N. 5. P. 380-386.

129. Sinclair T.R., Goudiaan J. Physical and morphological constraints on transport in nodules. // Plant Physiol. 1981. V.67. N 1. P.143-145.

130. Smith J.D. The concentration and distribution of hemoglobin in the root nodules of leguminous plants. // Biochem J. 1949. V.44. N 5. P.585-591.

131. Sprent J.I., Raven J.A. Evolution of nitrogen-fixing symbiosis // Biological Nitrogen Fixation. New York; London, 1992. P. 461-496.

132. Subba-Rao N.S., Mateos P.F., Baker D., Pankratz H.S., Palma J., Dazzo F.B., Sprent J.I. The unique root-nodule symbiosis between Rhizobium and aquatic legume, Neptunia natans (L.f.) Druce.// Planta. 1995. Vol. 196. P. 311-320.

133. Suganuma N., Kitou M., Yamamoto Y. Carbon metabolism in relation to cellular organisation of soybean root nodules and respiration of mitochondria aided by leghemoglobin. // Plant Cell Physiol. 1987. V.28. N 1. P.l 13-122.

134. Sullivan D., Brisson N., Goodchild B., Verma D.P.S., Thomas D.Y. Molecular cloning and organization of two leghaemoglobin genomic sequences of soybean. // Nature. 1981. V.289. N 5797. P.516-518.

135. Swaraj K., Garg O.P. Changes in the protein composition of leghemoglobin in greening nodulles of bengal gram (Cicer arietinum L.). IIZ. Pflanzenphysiol. 1977a. V. 81. N 2. P. 180-183.

136. Swaraj K., Garg O.P. The effect of ascorbic acid, when applied to the rooting medium on nodulation and nitrogen fixation in Gram (Cicer arietinum L.). II Physiol. Plant. 1969. V.23. P.889-897.

137. Swaraj K., Garg O.P. The effect of ageing on the leghemoglodin of cowpea nodules. //

138. Physiol. Plantarum. 1977b. V. 39. N 2. P. 185-189. Taylor J.F. Measurement of the oxidation-reduction equilibria of hemoglobin and mioglobin. // Methods in Enzymology. N.Y. etc.: Acad. Press, V.76. 1981. P. 577578.

139. Taylor J.F., Hastings A.B. Oxidation-reduction potentials of the methemoglobin system.

140. J. Biol. Chem. 1939. V. 131. N 2. P. 649-662. Thorogood E. Oxigenated ferroheme proteins from soybean nodules. // Science. 1957.

141. V.126. N 3281. P.1011-1012. Thumfort P.P., Atkins C.A., Layzell D.B. A re-evaluation of the role of the infected cell in the control of O2 diffusion in legume nodules. // Plant Physiol. 1994. V.105. P.1321-1333.

142. Tjepkema J.D., Yokum C.S. Measurment of oxygen partial pressure within soybeannodules by oxygen microelectrodes. // Planta. 1974. V. 119. N 4. P.351-360. Tombs M.P., Akroyd P. Akrylamide gel electrophoresis. // Shandon Instr. Appl. 1967. N 18. P.l-16.

143. Van Iersel A.A.J., Blaauboer B.J. NADH-ferrihemoglobin reductase in avian erithrocytes. // Comp. Biochem. Physiol. B. 1985. V. 81. P.1027-1031.

144. Verma D.P.S. Regulation of leghemoglobin gene expression during root nodule development. // Colloques Int. Acides nucliqes et synth se des prot ines chez les v getaux. Paris. 1977. P.319-325.

145. Verma D.P.S., Ball S.B. Intracellular site of synthesis and localization of leghemoglobin in root nodules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V.73. N 11. P.3843-3847.

146. Verma D.P.S., Long S. The molecular biology of Rhizobium-legumQ symbiosis. // Int. Rev. Cytol. 1983. V.14. Suppl. P.211-245.

147. Vesterberg O., Svensson H. Isoelectric fractionation analysis and characterization of ampholytes innatural pH gradients. IV. Further studies on the resolving in connection with separation of mioglobins. // Acta Chem. Scand. 1966. V.20. N 3. P.820-834.

148. Virtanen A.I., Miettinen J.K. Biological nitrogen fixation. // Plant Physiol. 1963. V.3. P.539-669.

149. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis. // J. Biol. Chem. 1969. V.244. N 16. P.4406-4412.

150. Werner D. Physiology of nitrogen-fixing legum nodules: compartments and functions // Biological Nitrogen Fixation. N.-Y., L. 1992. P. 399-431.

151. Whittaker R.G., Lennox S., Appleby C.A. Relationship of the minor soybean leghemoglobins di, d2 and d3 to the major leghemoglobins Ci, c2 and c3. // Biochem. Int. 1981. V.3.N 2. P.l 17-124.

152. Wittenberg J.B. Utilization of leghemoglobin-bound oxygen by Rhizobium bacteroids.// Nitrogen Fixation. Proc. 3rd Int. Symp. On Nitrogen Fixation, Madison, 1978. / Ed. Newton W.E., Orme-Johnson N.V. Baltimore: Univ. Park Press. 1980. Part 2. P.53-67.

153. Witty J.F., Skot L., Revsbech N.P. Direct evidence for changes in the resistans of legume root nodules to oxigen diffusion. // J. Exp. Bot. 1987. V.38. P.l 129-1140.

154. Wood S. J. Purification and characterization of soybean root nodule ferric leghemoglobin reductase. M. S. Thesis. Lincoln, Nebraska. 1990. 158 pp.

155. Yokum C.S. Leghemoglobin as oxygen transporter to bacteroids. // Science. 1964. V. 146. P.432.

156. Yubisui T., Takeshita M. Amino acid sequense of NADH-cytochrome b, reductase of human erythrocytes. // J. Biochem. 1984. V.96. N 2. P.579-582.

157. Yubisui T., Takeshita M. Purification and properties of NADH-cytochrome bj reductase of rabbit erythrocytes. // J. Biochem. 1982. V. 91. P.1467-1477.

Информация о работе

Шлеев, Сергей Валерьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Ферментативное и неферментативное восстановления легоглобина в клубеньках бобовых растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы