Влияние физиологических лигандов на функционирование легоглобина

Космачевская, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние физиологических лигандов на функционирование легоглобина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние физиологических лигандов на функционирование легоглобина"

На правах рукописи

Космачевская Ольга Владимировна

Влияние физиологических лигандов на функционирование легоглобиыа

03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ ОЗ 168ЬЫЬ>

Москва

2008

003168586

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им АН Баха РАН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук А.Ф. Топупов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор A.C. Капрельяиц Доктор биологических наук В.П. Реутов, Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г Саратов

Защита диссертации состоится -я-*-еИ-в 2008 г в часов на заседании

диссертационного совета (Д 002 247 01) при Институте биохимии им АН Баха РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН (119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп 1)

Автореферат разослан <°^g-g2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета ,

кандидат биологических наук I ]

АФ Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

За последние 20 лет в области изучения гемо1лобинов в связи с открытием новых представителей этого суперсемейства белков произошел переворот Изучение новых гемоглобииов привело к выяснению важности таких функций этих белков, как детоксикация и детекция N0, которые, как полагают многие ученые, являются первичными функциями гемоглобинов В свете этих данных возникла необходимость изучения альтернативных функций и легоглобина - растительного гемоглобина бобовых, функционирование которого, по-видимому, не ограничивается только переносом кислорода к микросимбионту симбиотической азотфиксирукмцей системы Также очень важным является изучение физиологических внешних лигандов гемоглобина, модулирующих его активпость по отношению к активным формам кислорода и азота.

Цель и задачи работы. Целью работы было исследование влияния физиологических лигандов на функционирование легоглобина, в том числе и при постгрансляционной модификации в условиях ш vivo и ш vitro

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи

1) Изучить влияние редокс-медиаторов на рост клеток Escherichia coli, содержащих ген легоглобина, и синтез Iba клетками Е coli,

2) Определить характер соединений, модифицирующих легоглобин,

3) Изучить влияние модификации легоглобина на его функционирование, в том числе в условиях окислительного и нитрозативного стресса,

4) Изучить влияние диннтрозильных комплексов железа, связанных с гемоглобином, на степень окислительной модификации гемоглобина

Научная новизна. Показано, что легоглобин в системе м vivo может образовывать шггрозильные комплексы с гемовым и негемовым железом. Впервые показано, что дищпрозильные комплексы железа, связанные с гемоглобином, защищают его от окислительной деструкции. Также впервые установлено, что легоглобин, выделенный из клубеньков, содержит долю гликозилированнош Lb, устойчивого к действию гидропероксидов Продукты гликоокисления, связанные с белками, могут функционировать как кофакторы в окислительно-восгановительных реакциях, причем реакция взаимодействия модифицированного легоглобина с Н2О2 при определенных концентрациях субстрата протекает в автоколебательном режиме Показано, что ранее обнаруженные в клубеньках бобовых низкомолекулярные восстановители (В и R), скорее всего, представляют собой продукты гликозилирования аминокислот и пептидов

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные могут помочь выяснению механизмов ответа азотфшссирукяцей системы на окислительный, нитрозативный и карбонильный стресс, что важно для селекции бобовых растений, устойчивым к внешним воздействиям, а также при их выращивании в неблагоприятных условиях Гликозилированныи легоглобин может быть использован как маркер физиологического состояния корневых клубеньков Разработанный метод определения концентрации гемоглобинподобных белков может быть применен для изучения гемоглобинов разного происхождения, в том числе в гетерогенных смесях

Структура и объем диссертаиии Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы Работа изложена на 193 страницах машинописного текста, содержит 50 рисунков и 9 таблиц Список цитируемой литературы включает 345 наименований, из них 290 работ зарубежных авторов

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003), Межвузовской научной конференции «Биология растений в новом тысячелетии» (Калининград, 2007), XIV и XV международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», сателлитный симпозиум «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Гурзуф, Украина, 2006, 2007) Доклад на XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» был отмечен как лучший доклад молодого ученого

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (4 статьи, 5 тезисов)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительный и бакгериальпый материал, использованный в работе. Были использованы растения гороха посевного (Piswn sativum L ) сорта Sparkle и бобов (Faba bona Medik) copra «Русские черные», выращенные в полевых условиях Московской области Растения были инокулированы клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv Viciae, штамм CIAM 1026 из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (Санкт-Петербург) Клубеньки собирали на стадии бутонизации — начала цветения

В работе были использованы клетки Escherichia coli штамма ТВ-1, модифицированного плазмидой pEMBL18+: SyLba со встроенным геном Lba сои, полученного сотрудниками Автономного университета штата Морелос (Мексика) и Университета штата Небраска (США)

Выращивание и обработка клеток редокс-медиаторами Маточную культуру (15 ч роста) использовали для засева серии колб объемом 350 мл, содержащих 60 мл жидкой среды LB с ампициллином (50 мкг/мл - в случае модифицированного штамма) до Абоо = 0,02 -0,03 Режим аэрации меняли путем варьирования объема питательной среды в колбах

Выращивание клеток осуществляли при 37 °С на термошейкере фирмы «Биоком» (Россия) с частотой орбитального движения 200 об/мин Гидропероксид трет-бутпэ. (f-BOOH), бензилвиологен (Bv) и S-ннтрозоглютатион (GSNO) в различных концентрациях вносили в среду через 3 ч после засева (Авоо = 0,12-0,15). Концентрацию клеток в культуре измеряли через каждые 2 ч по величине оптической плотности при 600 им в 0,1 см кювете

Подучспне различных Форм гемопротеидов Окисленные гемопротеиды получали их окислением феррицианидом калия Для получения восстановленных гемопротеидов белок восстанавливали дитионитом натрия Нитрозилированный Lb получали обработкой белка GSNO Образование соответствующих форм гемоглобинов контролировали спектрофотометрически, используя следующие коэффициенты миллимолярной экстинкции (мМ~'см"1) оксиЬЬ Е4ц=125, 6541= 15,0, 6575=14,8 (Herold, 2005), дезоксиЬЬ &ш=111, €5545~13,3, метЬЬ £4оз=157, £ó26=4,92 (Jones et al, 1998), шпрозилЬЬ e4i8=T30, 6545=12,6, 8575=13,0 (Ernesto, Di lorio, 1981)

Определение концентрации гемопротеидов. Для образца гемопротеида в щелочном растворе пиридина определяли разницу AD = (Б55бге<1 - D 5560x1 ) - (D j39red - D 5390x1) (Riggs, 1981) Концентрацию гемовых белков рассчитъшали, используя значение коэффициента миллимолярной экстинкции АЕ = 4,3 ммоль"'см"', определешюе в нашей работе для данного AD Концентрацию Lb в смесях, содержащих примеси, определяли по разработанному нами методу (Космачевская, Топунов, 2007)

Определение общего белка. Количество общего белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976)

Электрофорез белков в ПА А Г. Денатурирующий электрофорез Hb проводили в блоках 15% ПААГ размером 150*150*1 мл но методу Лэммли (Laemrah, 1970) с модификациями, используя прибор для вертикального электорофореза серии VE («Хеликон», Россия) Реакционная смесь содержала 25 мкл Hb, НЬ-ДНКЖ или Hb с ДНКЖ после распада в 0,2 М K-Na фосфатном буфере (pH 7,4) и 5 мМ DTPA Н2О2 добавляли к смеси до концентраций 400, 800 и 1600 мкМ Концентрация Hb во всех случаях была 560 мкМ (НЬ-ДНКЖ —-780 мкМ) Конечный объем смеси составлял 45 мкл Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин ДНКЖ после распада были получены при инкубации в течении 5 ч при комнатной температуре

Электрофорез белков легоглобинсодержащей фракции клеточного экстракта Е coli в неденатурирукяцих условиях проводили в 15% ПААГ без SDS Буфер для образцов был приготовлен на основе 125 мМ Tris -HCl буфера (pH 6,8) с 0,1 М феррицианидом калия и 15% глицерином Белок на гель наносили в количестве, содержащем 100 мкг белка на дорожку

Выделение и очистка лигаидов Y', Y, Z. Лиганды (Y', Y, Z) отделяли от легоглобина, используя модифицированный метод (Fluckiger et al, 1997), суть которого заключается в мягком кислотном гидролизе кегоаминной связи в глнкозилированном Lb

Получение гликозилированных гемопротеидов. К растворам гемопротеидов в концентрации 0,3 мМ в 0,1 М K-фосфатном буфере (pH 7, 4), содержавшем 0,02% азида патрия, предварительно деаэрированных продувкой аргоном, добавляли метилглиоксаль до концентрации 5,5 мМ Растворы инкубировали в темноте при 30 °С

Определение пероксидазной активности. При измерении пероксидазной активности в качестве субстрата использовали пероксид водорода, уменьшение концентрации которого регистрировали спектрофотометрически при 240 им (с24о = 43,6 М"'см"') (Amao et al, 1990) Для определения кинетических параметров использовали очищенные препараты легоглобипа в 0,02 М K-фосфатном буфере (pH 7,2), измерения проводили не менее, чем в трех повторностях, при 20 °С

Регистрация ДНКЖ в клетках и модельных системах. После инкубации с GSNO (6,5 мМ) и í-BOOH клетки концентрировали в 75 раз, помещали в пластиковые трубки и быстро замораживали при температуре жидкого азота (-170 °С) Измерения проводили также при температуре -170°С Количество ДНКЖ оценивали по интенсивности характерного сигнала ЭПР парамагнитной формы комплекса (g = 2,034). ЭПР спектры снимали на

спектрометре Х-диапазона («Vanan», США) при следующих параметрах измерения частота модуляции 100 кГц, мощность микроволнового излучения 10 мВ, частота микроволнового излучения 9,15 ГГц и амплитуда модуляции 0,2 или 0,1 мТл для спиновых аддуктов ДНКЖ или DEPMPO соответственно

Регистрация спиновых аддуктов РЕРМРО со свободными радикалами. Исследование генерации свободных радикалов при взаимодействии гемоглобина с гидропероксидом mpem-бутила проводили с использованием спиновой ловушки DEPMPO в среде, содержавшей 150 мМ K-Na фосфатный буфер (pH 7,4), 40 мМ DEPMPO, 1,6 мМ ДТГТА, 235 мкМ гемоглобина и гидропероксид трет-бутила в концентрациях 0,4 и 0,8 мМ В экспериментах с НЪ-ДНКЖ их концентрация составляла 340 мкМ

Стандартный ЭПР спектр аддукта DEPMPO с тиильным радикалом был зарегистрирован в смеси, содержавшей 0,5 мМ пероксида водорода, 0,8 мМ восстановленного ппотатиона и пероксидазу хрена (0,2 мг/мл) В аналогичной системе, содержавшей вместо глютатиона 2 мМ тирозина, был получен аддукт DEPMPO с тирозиновым радикалом Спектры аддуктов DEPMPO с ажокси- и алкилпероксильными радикалами были зарегистрированы при взаимодействии 1,4 мМ гидропероксида трет-бутияа с 0,45 мМ гемином Во всех экспериментах реакционная среда содержала 0,J5 М К-Na-фосфапшй буфер (pH 7,4), 40 мМ DEPMPO, 1,6 мМ ДТПА Спектры ЭПР записывались через 3 мин после смешивания всех компонентов реакционной среды

Регистрация спектров поглощения. Спектры поглощения растворов белков, лигандов и целых клеток записывали на спектрофотометре "Beckman Coulter DU 650" (США) в 1 см кювете Запись спектров осуществляли при комнатной температуре со скоростью 600 нм/мин

Сиектрофлуоримегрия. Регистрацию спектров флуоресценции проводили при 20 "С в 0,02 М К-фосфатном буфере, (pH 7,2) на спектрофлуориметре "Shanadzu RF-5301 PC" (Япония) Длина волны возбуждения составляла 320 нм

ИК-спектроскопня. ИК-спекгры образцов снимали на Фурье-спектрометре "AFS-66/V/S" фирмы "Brucker" (Германия) Исследуемый материал прессовали в виде таблеток с КВг Спектры снимали в области 400 - 4000 см"1 Разрешающая способность составляла 1 см"'

КД-спектроскмшя. Спектры кругового дихроизма соевого Lba снимали на спектрометре "Chirascan" фирмы "Applied Photophysics" (США) в 0,2 см кварцевой кювете при температуре 5 °С, со скоростью сканирования 0,6 ям/с

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Функционирование легоглобипа в системе £. coli

В качестве модели для изучения функционирования легоглобипа в условиях окислительного стресса использовали клетки Е coli с встроенным геном легоглобина сои. Для создания в клетках условий окислительного и нитрозативного стрессов использовали следующие вещества гидропероксид те^ети-бутила, бензилвиологен и S-нитрозоглутатион Исследования были проведены на трех типах культур клеток не синтезирующие легоглобин (C-lb) — 0,08 мкг гема/мг белка, синтезирующие Lb в малых количествах (Сцл) — 0,15 мкг гсма/мг белка, и активно синтезирующие Lb (С+ц,) — 0,45 мкг гема/мг бела

В наших экспериментах рост культур С.ц» С±ц, и С+ц> в середине логарифмической фазы роста (7 ч) подавлялся гидропероксидом трет-бутила в равной степени (~ 45%) (рис 1) Культуры C+Lb и C+Lb обнаруживали большую чувствительность к /-ВООН — уровень

роста C+Lb и CtLb к 24 ч по сравнению с контролем составлял 88% и 60% соответственно В случае С ц, рост достш ал уровня контроля в стационарной фазе Этот факт согласуется с результатами, ранее полученными в нашей лаборатории (Петрова, 2002) в аналогичных опытах с использованием штамма Е coli BL21(DE3)pI ysS с встроенным в плазмиду рЕТ-За геном Lbll люпина

S-нитрозоглютатион в концентрациях до 200 мкМ существенно не ингибировал рост исследуемых бактериальных культур Более того, рост всех типов клеток Е coli в условиях индуцированною i-BOOH окислительного стресса стимулировался GSNO (рис 1) Защитный эффект GSNO являлся дозозависимым Следует отметить, что восстановление роста бактериальных культур наблюдалось даже при добавлении GSNO вместе с /-ВООН, при концентрациях последнего, вызывавших практически полное подавление роста исследуемых штаммов

Роль оксида азота в биологических системах двойственна С одной стороны, NO и другие активные метаболшы азота обладают цитотоксическим действием, а, с другой, NO способен непосредственно взаимодействовать с возникающими в ходе окислительного стресса феррилгемопротеидами и органическими радикалами (Bastian et al, 2002) в соответствии с реакциями

Протекторные свойства NO могут проявляться при восстановлении /-ВООН согласно реакции (Gorbunov et al, 1997)

Fe(II)-NO + /-BOOH +H20 ->■ Fe(III) + /-ВОН + HN02 + OH- (3) В то же время эффект совместного действия GSNO и бензилвиологена существенно отличался от такового при действии GSNO совместно с /-ВООН В случае Bv мы наблюдали отсутствие защитного действия GSNO (рис 1), хотя бензилвиологен также, как и гидропероксид т/>ет-бутила, является индуктором окислительном стресса

Гемоглобин является уникальным белком, поскольку способен связывать NO тремя различными способами (рис 2) Оксид азота может взаимодействовать с гемовой группой и остатками цистеина с образованием ншрозилгемоглобина (HbFe(II)NO) и S-нитрозогемоглобина соответственно Кроме того, с участием различных белковых групп, в первую очередь тиолсодержащих, могут формироваться динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) Впервые образование ДНКЖ в биосистемах было показано в клетках дрожжей Ваниным (Ванин, Налбандян, 1965)

reM-Fe!V=0*+ NO* -> reM-Fcnl-ONO reM-Felu + N02" NO'+ R02* -> ROONO

(1)

(2)

110

100

£ О 90

О.

£ 80

н 70

S? 60

6' 50

а.

f-BOOH

5 10 15 20 25 30

___Ц.1Ш»___

100

i 80

о /0

г* 60

Ь 50

GSNO + f-BOOH

5 10 15 20 25 30 ч роста

ä 50

110

100

I 90

t 80

к ГО

JS 60

Ь" 50

40 -

, V _______ ■ - •вч — —*—Lb-— Lb+-Lb+

0 5 10 15 20 25 30

GSNO + Bv

--К '

л _ . ^ -------

0 5 10 15 20 25 30 ч роста

Рис 1 Влияние редокс-медиаторов на рост Е coli Bv—0,125 мМ, f-BOOH — 0,04 мМ, GSNO—0,2 мМ

110 100 I 90 -

I 80

6 *> 60

I 50

GSNO

10 15 20 ч роста

В наших экспериментах мы также наблюдали сигнал белковых ДНКЖ как в конгрольных клетках, так и в клетках, синтезирующих легоглобин, инкубированных с нитрозоглютатаоном (рис 3) В случае легоглобинсодержащих клеток, инкубированных с GSNO и f-BOOH, мы наблюдали спектр, являющийся суперпозицией двух спектров ДНКЖ и нитрозилЬЬ, который отсутствовал в контрольных клетках (рис 3)

Рис 2 Взаимодействие NO с гемоглобинами

Это показывает, что в С+ц, имеются разные пути утилизации оксида азота. Из рис 3 также видно, что гидропероксид трет-бутила не приводил к существенным изменениям в спектрах ЭПР бактериальных культур, но снижал уровень образующихся в них ДНКЖ

Интенсивность сигнала ДНКЖ при инкубации контрольных клеток с /-ВООН уменьшалась ~ на 40% В аналогичных условиях в культуре С+ць сигнал ЭПР ДНКЖ снижался лишь ~ на 10% Этот эффект может быть обусловлен, с одной стороны, деструкцией ДНКЖ при взаимодействия со свободными радикалами и оксоферрилгемопротеидами, с другой, пероксидазной активностью легоглобина, защищающей ДНКЖ от окислительной деструкции

Более низкий уровень ДНКЖ в культуре С+u» по сравнению с С-ц,, при инкубации только с GSNO (рис 3) можно объяснить процессом окисления N0 оксигенированным легоглобином, что приводит к снижению концентрации оксида азота в системе согласно реакции

LbC>2 + NO —» Lb{III) + NO3' (4)

С помощью метода ЭПР мы показали возможность образования нитрозиллегоглобина т vitro На рисунке 4 изображены характерные низкотемпературные спектры нитрозилированного по железу гемовой группы гемоглобина и полученного в аналогичных условиях нитрозилированного легоглобина Как видно, значепия g-факторов для обоих спектров совпадают

На основании полученных данных можно утверждать, что связывание легоглобином N0 имеет протекторное значение в условиях окислительного стресса. С одной стороны, это

приводит к выведению N0 из редоке-цикла реакций свободнорадюсального окисления С другой стороны, N0, как гемовый лиганд легоглобина, ингибирует образование феррил-формы при взаимодействии легоглобина с гидропероксидами

Рис 3 Низкотемпературные спектры ЭПР клеток Е coll С Lb — А и С+ц> — В 1-не обработанные бактерии, 2- бактерии после инкубации с f-BOOH, 3- после инкубации с GSNO, 4- после инкубации с GSNO и f-BOOH

12001000- А хю" д=2,034 2000- Б хю5

800- 1600- и^^СМГЧ««^.' ДНКЖ-РО, 1 ^»«■-Aw^uMVir 1 и

О ё о 5 X 1— S о 600- I 1200- || 1' .1

400200-П- нь-днкж I 800400-О- Lb-днкж J i I > t ) 1 1

-,-■-,- и-|-.-,-.-г-

320 340 280 320 360

Магнитное поле, мТл Магнитное поле, мТл

Рис 4 Спектры ЭПР нитрозилНЬ (А), ДНКЖ-РО4 (В, 1) и нитрозил!.Ь (В, 2)

2. Модифицированные легоглобины

2.1 Образование модифицированных Lb ut vivo

Помимо способности взаимодействовать с классическими низкомолекулярными лигандами, многие гемоглобины способны формировать прочные комплексы и с довольно крупными молекулами, например, с ароматическими и гетероциклическими соединениями с атомом азота (нитрозобензолом (Murayama, 1960), изохинолином (Сафонова с соавт, 1991), никотиновой кислотой (Appleby et al, 1976, Lee et al, 1995) и др )

Используемая в наших исследованиях модель — клетки Е coli со встроенным геном ЬЬд сои, позволяет спектрофотометрически регистрировать состояние Lb в целых клетках. При росте в условиях нормальной аэрации (коэффициент заполнения колбы = 0,1-0,3) клетки имели розовый цвет благодаря наличию в них LbOj Оптический спектр целых клеток являлся характерным спектром восстановленного оксигенированного Lb (541 и 575 нм) (рис 5 Л) Это свидетельствует о том, что в клетках Е colt имеются вещества, возможно и белковой природы, способные восстанавливать Lb и, тем самым, поддерживать его в функциональном состоянии Отметим, что ранее в нашей лаборатории в клетках Е coli был обпаружеи фермент, способный восстанавливать гемоглобинподобные белки (Талызин с соавт, 1988)

При выращивании культуры в условиях с уменьшенной аэрацией, мы получали клетки, имеющие не розовую, а оранжевую окраску Такое изменение окраски клеток отражало изменение состояния Lb Спектры поглощения, снятые с этих клеток, имеют гемохромогенный характер, что свидетельствует о том, что Lb в этих условиях представляет собой гемохром (522 и 552 нм) (рис 5 В)

Рис 5 Спектры поглощения целых клеток £ coli, содержащих Lb02 (А) и Lb-Z относительно клеток С-ц, (В)

В зависимости от природы соединения легоглобии приобретал специфическую окраску, что отражалось и на цвете клеток Lb-Y — розово-оранжевый, Lb-Z— ярко-оранжевый Этим комплексам мы дали названия — Lb-Y и Lb-Z, в соответствии с традицией название Lb-X было ранее дано Эпплби комплексу легоглобина с никотиновои кислотой до определения структуры лигапда (Appleby et al, 1973)

Как показано на рисунке 6, спектры поглощения восстановленных комплексов Lb-Y и Lb-Z являются классическими спектрами гемохромов с характерными максимумами поглощения в полосах аир При этом спектр Lb-Y представляет собой двойной гемохромогеп, с расщеплением в полосах а (523,532 нм) и р (552,560 им).

Рис 6 Спектры поглощения восстановленного легоглобина сои, выделенного из клеток Е coli, с лигандами Y (А) и Z (В)

Поэтому мы предполагаем, что лиганд Y структурно отличается от лиганда Z и размещение лиганда Y в гемовой полости происходит с пространственными затруднениями При выделении легоглобина из клубеньков гороха мы также получили Lb, частично связапный с лигандом, который мы обозначили как Y' Спектры Lb(II) -Y', Lb(II) -Y и Lb(U) -Z по некоторым параметрам были подобны спектрам цитохромов группы b

2Л. Природа лигапдов Y, Y'ii Ъ

Для выяснения природы лигапдов. модифицирующих лепилобин in vivo, эти

вещества были нами выделены и охарактеризованы Из сравнения спектров поглощения

нативного и модифицированного легоглобинов видно, что имеются существенные отличия в

их спектрах в УФ-области (рис. 7 А) Величина отношения поглощения при 275 нм к

поглощению в полосе Соре для LbÜ2 A27s/A4n= 0,51, что ~ в 20 раз меньше, чем для Lb-Z

(А275/А412 =12±3) (рис 8 Л) Известно, что поглощение при 250-280 нм обусловлено апобелковым компонентом молекулы и осуществляется хромофорными группами остатков ароматических и серосодержащих аминокислот Спектры оптического поглощения очищенных лигандов имеют максимум в диапазоне 205-210 нм, плечо при 240-290 нм и плато постепенного снижения оптической плогности до 390 нм (рис 7 В) Увеличение поглощения в УФ области модифицированных легоглобинов обусловлено, вероятно, наличием большого числа ароматических соедилепий При этом спектры флуоресценции Очюто ~ 320 им) модифицированных ЬЬ имели четко выраженный максимум в видимой области

Рис 7 А Оптические спектры 1_Ьа сои 1_ЬОг и В Оптические спектры лигандов, отделенных от 1_Ьа сои (У, 2) и 1_Ь гороха (V)

На рис 8 приведены инфракрасные спектры исследованных веществ Как видно из рисунка, спектры трех лигандов довольно сильно отличаются, что является прямым указанием на то, что это структурно разные вещества. Анализ ИК-спектров лигандов У и У показал, что широкая полоса с плечами в области 3800-3200 см 1 обусловлена поглощением ОН-групп, а сложные полосы в интервале 1200-1030 см"', относятся к валентным колебаниям эфирной и гидроксильной групп Полосы в области 1720 (С=0) отсутствуют Такое соотношение полос присуще такому классу соединений, как углеводы (Наканиси, 1965) Что касается спектра лиганда Ъ, то две полосы в области 1300-1100 см"1 и отсутствие полос в области 2950-2850 см"1 указывают на наличие валентных колебаний С-С Отсутствие полос в интервале 3800-3200 см'1 в спектре лиганда X, в отличие от спектров лигандов У и V, также свидетельствует о том, что это структурно разные вещества.

Полученные результаты вместе с данными литературы позволили нам предположить, что в качестве модифицирующих агентов легоглобина выступают продукты гликоокисления Термин «продукты гликоокисления» был введен для характеристики продуктов, образуемых в результате комбинации реакций гликозилирования и окисления Некоторые продукты гликоокисления могут образовываться не только из углеводов, но также из других предшественников, например из триозофосфатов, продуктов анаэробного метаболизма, а также из липидов (Thorpe, Baynes, 2003)

Рис 8 ИК-спектры лигандов, выделенных из Lba сои (Y и Z) и Lb гороха (Y')

Известно, что активные формы кислорода и азота катализируют химическую модификацию белков в реакции Майларда т vivo (Thorpe, Baynes, 2003) Классическая реакция Майларда — это взаимодействие альдегидной группы углевода с аминогруппой аминокислоты В результате этой реакции образуются короткие фрагменты сахара, а также химически реактивные интермедиаты глиоксаль и метилглиоксаль

Накопление а-кетоальдегидов (глиоксаля, метилглиоксаля и 3-дезоксиглюкозонов), образующихся в результате автоокисления глюкозы, приводит к так называемому «карбонильному стрессу» Глиоксаль и метилглиоксаль могут взаимодействовать с остатками лизина и аргинина белка с образованием широкого спектра связанных с белком продуктов гликоокисления (Thorpe, Baynes, 2003) Конечные продукты гликоокисления могут иметь различную химическую структуру Приведем формулы некоторых таких веществ.

Поглощение

Лигакд Z

1114

- j4 /\™*1в*2

1 1 1 1 . ЛигандУ 3314

1074 1410 i 1658

' 545 Т \ М (\

. Лиганд Y*

1112 :7 А? 3250 Д

J V

Н2ОН

HOCH

сн, о

НО

"^-Lys-

НО

-Lys-

-Arg--^

весперлизины

З-деоксиглюкозон-Агд-имидазолон

глюкозепан

Известно, что в наибольшей степени в молекуле белка модификации подвержены остатки лизина, аргинина и цистеина При этом в молекулах различных легоглобинов содержится достаточно большое количество лизинов Также известно, что модификация остатков лизина в белках ускоряется, если они примыкают к основным аминокислотным остаткам (Thorpe, Baynes, 2003) В молекуле Lba сои содержится 7 таких пар 4 Lys-Glu, 2 Lys-Asp и одпа Lys-Lys (Jones et al, 1998)

Следует отметить еще одну особенность строения легоглобинов — наличие лизина в гемовом кармане Этот лизин расположен в паре с глутаминовой кислотой и, может быть подвержен модификации углеводами с образованием гетероциклических соединений, которые образуют шестую координационную связь с железом тема, что видно по гемохромному типу спектра модифицированного Lb

23. Взаимодействие метплглиоксаля с гемопротеидами

Предположение, что модификация легоглобина вызвана образованием ковалентно связанных с белком продуктов гликоокисления, образующихся в результате реакции Майларда, мы проверяли, используя модельную систему, содержащую гемопротеид и мезилглиоксаль (MG) Степень модификации белков определяли по изменению интенсивности флуоресценции после отделения несвязавшихся веществ диализом

Использование метилглиоксаля в качестве модифицирующего агента обусловлено тем, что это вещество является наиболее активным карбонильным соединением, в основном взаимодействующим с остатками лизина. В последнее время MG рассматривают как универсальный медиатор образования конечных продуктов гликоокисления

Из литературы известно, что при окислительном гликозилировании белков происходит образование конечных флуоресцирующих продуктов, имеющих желтую и коричневую окраску Желтые пигменты обладают интенсивной флуоресценцией в области 398 нм при длине волны возбуждения 320 нм и охарактеризованы как имидазолоны (Lo et al, 1994, Yim et al, 1995)

Уже в первые часы инкубации гемопротеидов с МО мы наблюдали появление желтых флуоресцирующих продуктов, причем их концентрация возрастала со временем (рис 9)

—»—1_Ь из клубеньков

бобов -о—МЬ кашалота

-с— НЬбыка

—о— НЬ человека

—о— цитохром с из сердца лошади

Рис 9 Изменение интенсивности флуоресценции гемопротеидов, инкубированных с метилглиоксалем (Авозб=320 нм, Аисл=390 нм)

Как видно из рисунка 9, легоглобин в большей степени подвержен модификации метилглиоксалем, чем другие исследованные гсмопротеиды Нами было установлено, что по степени модификации легоглобин занимает промежуточное положение между гемоглобинами и альбуминами В данной реакции в легоглобипах могут участвовать как поверхностные группы, так и гем

Спектры испускания флуоресценции модифицированного метилглиоксалем легоглобина бобов (120 ч инкубации) (рис 10) по структуре были идентичны аналогичному спектру легоглобина, выделенного из клубеньков бобов, после обрабогки f-BOOH (рис 11В, врезка) Поэтому мы пришли к выводу, что легоглобиновая фракция клубеньков бобов содержала определенную долю гликозилированного белка, который устойчив к действию гидропероксидов

Рис 10 Спеетры флуоресценции (возбуждение Атах=320 нм) 1-Ьа из клубеньков бобов, нативного и обработанного метилглиоксалем (20 и 120 ч инкубации при молярном соотношении !_Ь Мв = 1 200)

Lb-MG (20 ч) Lb-MG (120 м)

В наших экспериментах мы не наблюдали изменений в спектрах флуоресценции бобовою Lb а, предварительно модифицированного метилглиоксалем (120 ч), при добавлении /-ВООН В аналогичном опыте с модифицированным соевым легоглобином (Lb-Y и Lb-Z) происходило уменьшение одного из максимумов флуоресценции (Х„сп= 450 нм) (рис 11 А), однако окончательный спектр был подобен спектру модифицированного бобового Lba (рис 10 и рис 11 В, врезка) Вероятно, эти изменения были вызваны разрушением под действием /-ВООН продуктов гликоокисления, отличных от конечных продуктов превращения метилглиоксаля

Как видно из рис 11 С, инкубация с i-BOOH приводила к практически полному исчезновению флуоресценции при 395 нм бобового Lba в отличие от модифицированного Lb-Z Этот факт показывает, что продукты гликозилирования легоглобина, отвечающие за флуоресценцию в области 395 нм, могут защищать белок от окислительной деструкции, вызванной /-ВООН, подвергаясь при этом структурным изменениям

330 380 430 480 530 580

ЗЭЭ 360 430 480 530 580 Длима волны, нм

Длина волны, нм

120

О 2 4 в

время ыин

■о

■О - О

10 12

Рис 11 Спектры флуоресценции (возбуждение Лтах=320 нм) Lba (черная линия) и Lb, инкубированного с i-BOOH (1 355 мкМ) в течение 2 ч (серая линия) А Lb-Z из Е coli В Lba из клубеньков бобов (на врезке - спектр флуоресценции после обработки f-BOOH) С Изменение интенсивности флуоресценции Лтах=395 нм при взаимодействии с i-BOOH (1 3550 мкМ) бобового Lba (штрихпунктирная) и соевого Lb-Z (сплошная линия)

2.4. Восстановительные свойства модифицированного 1„Ьв сои

При исследовании гликозилированных белков неясными остаются вопросы о физиологическом и патологическом значении этой постгрансляционной модификации

При выращивании клеток, содержащих LЬ-¿, в присутствии Ву, рост клеток не ингибировался в течение 4-х часов, в отличие от клеток, содержащих охуЬЬ (рис 12) Также было показано, что при увеличепии концентрации Ву происходила деградация ЬЬ (рис 13 А) Неаэрируемые клетки, предварительно культивируемые с различными дозами Ву, обладали различной скоростью восстановления этого вещества (рис 13 В), которая коррелировала с количеством оставшегося модифицированного легошобина в клетках (рис 13 А) Это указывает на возможность того, что модифицированный Ы> способен выступать в качестве донора электронов на компоненты дыхательной цепи Кстати, имеются работы, в которых показано, что в анаэробных условиях гликозилированные аминокислоты способны восстанавливать цитохром с (Степуро с соавг, 1997,1999)

А В

ч роста прост»

Рис 12 Кривые роста клеток Е coli, содержащих Lb-Z (А) и Lb02 (В) в присутствии различных концентраций бензилвиологена без Bv (черная линия), 125 мкМ (черная пунктирная линия), 250 мкМ (серая линия), 375 мкМ (серая пунктирная линия) Бензилвиологен вносили в среду после 2 ч инкубации клеток в среде LB

Известно, что такая постгрансляционная модификация, как глнкозилирование, изменяет структуру, функции и физико-химические свойства белков Принимая во внимание обнаруженное в описанных выше опытах протекторное действие модифицированного Lbа в условиях окислительного стресса, мы решили проверить наличие пероксидазной активности у этих модифицированных легоглобинов Было показано, что модифицированные легоглобины достаточно эффективно катализируют восстановление пероксида водорода, в том числе и без внешних доноров электронов, то есть проявляет каталазную активность

время, с

Рис. 13. А. Количество Lba в клетках £ coli Lb-Z и Lb02, выращенных в присутствии различных концентраций Bv . В. Динамика восстановления 8v клетками Е. coli с Lb-Z. Цвет столбцов и кружков соответствует определенной концентрации Bv: 125 мкМ (белый), 250 мкМ (серый) и 375 мкМ (черный).

Кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в случае Lb-Y и Lb-Z имела явно выраженный индукционный период, что, по-видимому, связано с установлением равновесия между реакциями восстановления перекиси и восстановления кислорода. При определенных концентрациях субстрата реакция протекала в автоколебательном режиме.

Табл.1. Скорости каталазной реакции, катализируемой модифицированными Lb

Комплексы Lb V (МольЛиии-мг белка)

[Н2021=1,47 мМ [Нг021=8,82 мМ

Lb-Y 0,32±0,02 2,76±0,04

Lb-Z 0,18±0,02 0,73±0,03

Мы полагаем, что значительную роль в активации пероксидазной активности легоглобина при его модификации продуктам превращения углеводов играют изменения окружения гема и конформационные перестройки. Как видно из рис. 14, спектр КД гяикозилированного Lbа имел интенсивную положительную полосу в области Соре, в отличие от нативного Lba. Такое изменение знака в полосе Соре, как показано для гемоглобинов (№со!а е1 а!., 1975), зависит от вклада ароматических групп, окружающих гем, которые в случае Lb-Z появились в результате модификации гемового кармана продуктами гликоокисления.

[0] (град смг дмоль"1)

40000

30000

Рис 14 Спектры кругового дихроизма соевого 1-Ьа в 0,02 М К-фосфатном буфере (рН 7,2) Верхняя серая линия — \Jb-Z, нижняя черная линия — 1_Ь(1М)-ОН"

20000

10000 —

Ранее было показано наличие в клубеньках сои, фасоли и вигны низкомолекулярного неферментативного восстановителя - соединения В (Весапа, Юисав, 1990) Впоследствии в работе, выполненной в нашей лаборатории (Шлеев, 2000), в цитозоле клубеньков желтого люпина были обнаружены аналогичные соединения, которые получили обозначение Я и В'. В работе С.В Шлеева было показано, что соединение Я быстро восстанавливает

-10000

-20000

-30000

-40000

350 400 450 500 550 600 650

длина волны, нм

различные гемсодержащие белки (ЬЪ, МЬ и НЬ) в отсутствие искусственных переносчиков и доноров электронов Характеристики спектров поглощения и флуоресценции соединений В и Я были близки к спектрам веществ, имеющих в своем составе имидазольный и/или нндольный циклы Изучение электрохимических свойств соединения Л показало, что восстановление ЬЬ компонентом Я осуществляется по одноэлектронному механизму (Шлеев, 2000) В работе (Весапа, ИисаБ, 1990) было установлено, что соединение В восстанавливает гемопротеиды через Ог*" Однако несмотря на проведенные исследования, природа низкомолекулярных восстановителей до настоящего времени оставалась неизвестной

На основании обобщения экспериментальных данных в работе (Шумаев с соавт, 2008) был предложен механизм образования Ог'" в результате восстановления Ог свободнорадикальными интермедиатами метилглиоксаля, образующимися в ходе реакции Ь-лизина с метилглиоксалем Принимая во внимание этот факт, а также характеристики низкомолекулярных восстановителей и лигандов У, У' и Ъ, мы пришли к заключению, что этими восстановителями неизвестной природы являются продукты глихозилирования аминокислот и небольших пептидов Восстановительные свойства соединений У, У', Ъ, В и II связаны с наличием в их составе как индольного цикла, так, возможно, и с их способностью генерировать супероксид, аналогично лизину, модифицированному метилглиоксалем

3. Антиоксидантпое действие ДНЮК, ассоциированных с НЬ

Гемоглобины в биологических системах в условиях окислительного и нитрозативного стрессов играют противоречивую роль С одной стороны, гемоглобины обладают рядом антиоксидашных функций Гемоглобины могут восстанавливать пероксиды,

восстанавливать и окислять N0, а также катализируют реакцию изомеризации пероксинитрита в нитрат С другой стороны, гемоглобины являются основной мишенью действия органических перекисей (Gorbunov et al, 1995, Reeder and Wilson, 2005), что приводит к образованию таких активных интермедиатов, как оксоферрилгемоглобнн (НЬ-Felv=0), алкокси- (RO*) и алкилпероксильные (ROO") радикалы в следующих реакциях (Zee, 1997, Kagan et al, 2001)

Hb-Fe™ + ROOH — Hb-Fe,v=0 + RO' + Ff (5)

Hb-Fe1" + ROOH —<• Ilb"-FeIV=0 + ROH (6)

Hb*-Felv=0 + ROOH — Hb-FeIV=0 + ROO* + If (7)

Hb-Felv=0 + ROOH — Hb-Fe"'-OH + ROO* (8)

Таким образом, гемоглобины, в отличие от каталаз и гемсодержащих пероксидаз, стимулируют процессы перекисного окисления

В настоящее время установлено, что важную роль в ходе окислительного стресса играют ДНКЖ — низкомолекулярные и связанные с белками (Шумаев с соавт, 2006) В частности, ДНКЖ могут ассоциироваться на SH-группах цистеинов ß-субъединицы Hb (Vamn et al, 1998, Gow et al, 1999) В то же время эти группы одними из первых подвергаются окислительной модификации в условиях генерации активных форм кислорода и азота.

Спектры ЭПР спиновых аддуктов DEPMPO показывают, что при взаимодействии гемоглобина с гидропероксидом трет-бутила. образуются алкилпероксильные радикалы и свободные радикалы аминокислотных остатков белка, в том числе тирозиновые и тиильные радикалы (Рис 15, А и В)

Однако при взаимодействии гидропероксида трет-бутила с НЬ-ДНКЖ выход свободнорадикальных интермедиатов снижается (Рис 15 А, спектры 3-5) Причем максимальное уменьшение уровня тиильного радикала наблюдается при эквимолярных концентрациях гидропероксида трет-бутила и ДНКЖ-НЬ (Рис 15 А, спектры 4 и 5) Эта данные свидетельствует о том, что ДНКЖ перехватывают свободнорадикльные интермедиаты, реагирующие с SH-группой цистеина

На рисунке 16 методом электрофореза показано образование димеров Hb, образующихся при обработке его различными концентрациями пероксида водорода. Пероксид водорода в концентрации 400 и 800 мкМ вызывает образование димеров субьединиц гемоглобина (Рис 16 А, линия 2 и 3) Известно, что формирование таких димеров может быть следствием образования дисульфидной связи между остатками цистеинов р-93 и димеризации тирозиновых свободных радикалов (Romero et al, 2003) Под действием пероксида водорода в концентрации 1600 мкМ наблюдается фрагментации

белковой цепи (Рис. 16 А, линия 4). В то же время видно, что ДНКЖ эффективно ингибируют окислительную модификацию связанного с ними гемоглобина (Рис. 16 В). Необходимо отметить, что ДНКЖ после распада практически не ингибируют окислительную модификацию теШЬ (Рис. 16 С).

Магнитное поле (тТ) Магнитное поле (ш'Г)

Рис. 15. Спектры ЭПР спиновых аддуктов DEPMPO.

A. Спиновый аддукт DEPMPO со свободными радикалами, образующийся после добавления к 235 мкМ metHb 0,8 мМ (2) или 0,4 мМ (4) f-BOOH и добавлением к 340 мкМ НЬ-ДНКЖ 0,8 мМ (3) или 0,4 мМ (5) f-BOOH к реакционной смеси.

Реакционная смесь содержала 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,4), 40 мМ DEPMPO и 1,6 мМ ДТПА. Спектры (А1) показывают сумму ЭПР спектра спинового адцукта, рассчитанного по следующей формуле: (А1)=0,75(В1)+(В2)+0,2(ВЗ).

B. Спиновые аддукты с тиильными (1) и тирозиновыми (3) радикалами и свободно-радикальные продукты f-BOOH (2).

■ ■ ' - '■II*'?

шт:т>-тттжт»тт 16

I 2 3412341234 ABC

Рис. 16. Определение окислительной модификации гемоглобина Нг02 с помощью вОв-электрофореза в15 % ПААГ. А — гемоглобин; В — НЬ-ДНКЖ; С - НЬ-ДНКЖ после распада 1 - контроль (без Н202); 2 - 400 мкМ; 3 -800 мкМ; 4 -1600 мкМ.

выводы

1) Показано, что легоглобин способен связывать оксид азота двумя способами, исключая его из редокс-цикла реакций свободнорадикальпого окисления,

2) Легоглобин может функционировать и как про-, и как антиоксидант, причем проявление им этих свойств зависит от его концентрации в клетках,

3) Обнаружено образование модифицированною легоглобина в клубеньках гороха и клетках Е colt, экспрессирующих его,

4) Показано, что модификация легоглобина вызвана образованием ковалентно связанных с белком продуктов гликоокисления, образующихся в результате реакции Майларда,

5) Модифицированный легоглобин имеет гемохромиый характер спектра и способен восстанавливать бензилвиологен in vivo, то есть функционирует как донор электронов,

6) Модифицированный чегоглобин (комплексы Lb-Y и Lb-Z) является эффективным катализатором реакции разложения Н2О2 в отсутствие внешних восстановителей,

7) Показано, что дшштрозильные комплексы железа, связанные с гемоглобином, действуют как сайт-специфические антиоксиданты, защищающие белок, с которым они связаны, от окислительной модификации

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи-

1 Космачевская О.В., Топунов А Ф Метод определения содержания гемоглобинподобных белков в гетерогенных смесях И Прикл биохимия и микробиология 2007 Т 43 №3 С 347-353

2 Kosmachevskaya О V, Shumaev К В , Arredondo-Peter R, Topunov A F Influence of tert-butyl hydroperoxide and mtrosoglutathione on Esherichia coli cells expressing leghemoglobm 1П Stress Physiology & Biochemistry 2007 V 3 N1 P 18-24

3 Shumaev К В , Kosmachevskaya O.V., Timoshm A A , Vanm A F , Topunov A F Dimtrosyl iron complexes bound with haemoglobin as markers of oxidative stress // Methods m Enzymology 2008 V 436 Globins and Other Nitnc Oxide-Reactive Proteins P 441-457

4 Shumaev К В , Gubkm A A, Serezhenkov V A , Lobysheva 11, Kosmachevskaya O.V,, Ruuge E К, Lankm V Z, Topunov A F, Vanin A F Interaction of reactive oxygen and nitrogen species with albumin- and hemoglobin-bound dimtrosyl iron complexes // Nitric Oxide 2008 V 18 N 1 P 37-46

Тезисы докладов:

5 Космачевская O.B., Петрова Н Э , Шумаев К Б , Топунов А Ф Окислитечьный стресс в азотфиксирующих клубеньках бобовых растений // Физиология растений и экология на рубеже веков Материалы конференции Ярославль ЯГУ, 2003 С 158-159

у,

6 Topunov A F , Petrova N E, Shumaev К В , Zhabaeva M U , Kosmachevskaya О V Leghemoglobm functioning as part of symbiotic interactions in nitrogen-fixing legume nodules // Molecular Plant-Microbe Interactions New Bridges between Past and Future Volume of Abstracts St-Petersburg, July 18-26 2003 P 97

7 Космачевская О В, Шумаев К Б, Топунов А Ф Действие активных форм кислорода и азота на клетки Escherichia coh с встроенным геном легоиюбина // Материалы XIV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Гурзуф, Украина, 2006 С 431-432

8 Shumaev К В , Kosmachevskaya О V., Timoshin А А , Vanin A F , Arredondo-Peter R , Topunov A F Influence of NO metabolites on interaction of animal and plant hemoglobins with reactive oxygen species // XIV International Conference on Dioxygen Binding and Sensing Proteins Book of Abstracts Stazione Zoologica Anton Dohrn, Naples September 3-7,2006 P 98

9 Космачевская O.B., Шумаев К Б, Ванин А Ф, Топунов А Ф Влияние экспрессированного легоглобипа на устойчивость бактериальных клеток к активным формам кислорода и азота // Материалы XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Гурзуф, Украина, 2007 С 425-426

Подписано в печать 24 04 08 Формат 60x90 х!ц Бумага типографская № 1 Печать офсетная Печ л 1,1 Тираж 100 экз Заказ 99

125080, Москва, Волоколамское ш, И Издательский комплекс МГУПП

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Космачевская, Ольга Владимировна

Введение

Список использованных сокращений 8 Часть 1. Обзор литературы

1.1. Гемоглобины: распространение, эволюция, функции

1.1.1. Гемоглобины животных

1.1.2. Гемоглобины растений

1.1.3. Гемоглобины грибов и прокариот

1.1.4. Эволюция гемоглобипов

1.1.5.Функции гемоглобинов

1.2. Легоглобин

1.2.1. Строение, свойства и функционирование легоглобина

1.2.2. Высоко- и низкоспиновые комплексы легоглобина

1.2.3. Экспрессия легоглобина в Е. coli

1.3. Легоглобин и окислительный стресс

1.3.1. Активные формы кислорода и азота

1.3.2. Взаимодействие легоглобина с активными формами кислорода и азота 59 Часть 2. Материалы и методы исследований

2.1. Условия выращивания растений

2.2. Выращивание и обработка клеток Е. coli редокс-медиаторами

2.3. Получение суммарного белкового препарата из клубеньков бобовых

2.4. Выделение и очистка легоглобина из клубеньков

2.5. Получение белкового экстракта из клеток Е. coli

2.6. Выделение и очистка легоглобина из клеток Е. col

2.7. Получение различных форм гемопротеидов

2.8. Определение концентрации гемопротеидов пиридингемохромным методом

2.9. Определение общего белка

2.10. Приготовление образцов Hb для электрофоретических исследований

2.11. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.12. Определение пероксидазной и каталазной активностей

2.13. Выделение и очистка лигандов Y', Y, Z

2.14. Синтез динитрозильных комплексов железа

2.15. Регистрация динитрозильных комплексов железа методом ЭПР

2.16. Подготовка клеток для регистрации динитрозильных комплексов железа

2.17. Регистрация спиновых адцуктов DEPMPO со свободными радикалами

2.18. Спектрофотометрическое исследование клеток Е. coli

2.19. Получение гликозилированных гемопротеидов

2.20. Спектрофлуориметрия

2.21. Видимая и УФ спектроскопия

2.22. ИК-спектроскопия

2.23. КД-спектроскопия

2.24. Метод определения гемоглобинподобпых белков в гетерогенных смесях

2.25. Реактивы, использованные в работе 90 Часть 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Функционирование легоглобина в системе Е. coli

3.2. Функционирование модифицированных легоглобинов

3.2.1. Образование модифицированных легоглобинов in vivo

3.2.2. Природа лигандов Y, Y' и Z

3.2.3. Взаимодействие глюкозы и метилглиоксаля с гемопротеидами

3.2.4. Взаимодействие соевого Lbа сои с бензилвиологеном, нитрозоглютатионом и пероксидом /ире/и-бутила

3.2.5. Пероксидазная активность модифицированного Lb а сои

3.2.6. Лиганды Y, Y' и Z и соединения В и R

3.3. Антиоксидантное действие динитрозильных комплексов железа, ассоциированных с гемоглобином 147 Заключение 152 Выводы 153 Список цитированной литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние физиологических лигандов на функционирование легоглобина"

Актуальность проблемы.

За последние 20 лет в области изучения гемоглобинов в связи с открытием новых представителей этого суперсемейства белков произошел переворот. Изучение новых гемоглобинов привело к выяснению важности таких функций этих белков, как детоксикация и детекция, NO, которые, как полагают многие ученые, являются первичными функциями гемоглобинов. В свете этих данных возникла, необходимость изучения альтернативных функций и легоглобина - растительного гемоглобина бобовых, функционирование которого, по-видимому, не ограничивается только переносом кислорода к микросимбионту симбиотической. азотфиксирующей системы. Также очень важным является изучение физиологических внешних лигандов гемоглобинов, модулирующих его активность по отношению к активным формам кислорода и азота.

Цель и задачи, работы. Целью работы было исследование влияния физиологических лигандов на функционирование легоглобина, в том числе и при посттрансляционной модификации в условиях in vivo и in vitro.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1) Изучить влияние редокс-медиаторов на рост клеток Escherichia coli, содержащих ген легоглобина, и синтез Lb а клетками Е. coli;

2) Определить характер соединений, модифицирующих легоглобин;

3) Изучить влияние модификации легоглобина на его функционирование, в том числе в условиях окислительного и нитрозативного стресса;

4) Изучить влияние динитрозильных комплексов железа, связанных с гемоглобином, на степень окислительной модификации гемоглобина

Научная новизна работы. " Показано, что легоглобин в системе in vivo может связывать оксид азота с образованием нитрозилированного Lb и динитрозильных комплексов, связанных с Lb. Впервые показано, что динитрозильные комплексы железа, связанные с гемоглобином, защищают его от окислительной деструкции. Также впервые 4 выделенный из клубеньков, содержит долю гликозилированного Lb, устойчивого к действию гидропероксидов. Продукты гликоокисления, связанные с белками,, могут функционировать как кофакторы в окислительно-востановительных реакциях, причем реакция взаимодействия« модифицированного легоглобина с Н2О2 при определенных концентрациях субстрата протекает в автоколебательном; режиме. Показано, что ранее обнаруженные в клубеньках; бобовых низкомолекулярные восстановители (В и R), скорее всего, представляют собой продукты гликозилирования аминокислот и пептидов. i . ^ 1

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные могут помочь выяснению механизмов ответа азотфиксирующей системы на окислительный,, нитрозативный и карбонильный стресс, что важно для селекции бобовых растений, устойчивым к внешним воздействиям, а также при их выращивании-в неблагоприятных-условиях. Гликозилированный легоглобин может быть использован- как маркер физиологического состояния корневых клубеньков. Разработанный: метод определения; концентрации гемоглобинподобных- белков , может быть использован для изучения гемоглобинов разного происхождения; в том числе в гетерогенных смесях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения,, обзора литературы, описания материалов и методов исследования^ результатов- и их., обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 193 страницах; машинописного текста, содержит. 50 рисунков и 9 таблиц;. Список цитируемой литературы включает 345 наименований;; из них 290 работ зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Космачевская, Ольга Владимировна

Выводы

1) Показано, что легоглобин способен связывать оксид азота двумя способами, исключая его из редокс-цикла реакций свободнорадикального окисления.

2) Легоглобин может выступать и как про-, и как антиоксид ант, причем проявление им этих свойств зависит от его концентрации в клетках;

3) Обнаружено образование модифицированного легоглобина в клубеньках гороха и клетках Е. coli, экспрессирующих его;

4) Показано, что модификация легоглобина вызвана образованием ковалентно связанных с белком продуктов гликоокисления, образующихся в результате реакции Майларда;

5) Модифицированный легоглобин имеет гемохромный характер спектра и способен восстанавливать, бензилвиологен in vivo, то есть функционирует как донор электронов;

6) Модифицированный легоглобин (комплексы Lb-Y и Lb-Z) является эффективным катализатором реакции разложения Н2О2 в отсутствие внешних восстановителей;

7) Показано, что динитрозильные комплексы железа, связанные с гемоглобином, действуют как сайт-специфические антиоксиданты, защищающие белок, с которым они связаны, от окислительной модификации.

В заключение хочу выразить глубокую благодарность моему научному руководителю доктору биологических наук, заведующему лабораторией биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Алексею Федоровичу Топунову за предложенную тему и постоянную помощь во время выполнения данной работы.

Хочу искренне поблагодарить старшего научного сотрудника лаборатории, кандидата биологических наук Константина Борисовича Шумаева за помощь в проведении опытов по ЭПР-спектроскопии и активное участие в обсуждении полученных результатов.

Выражаю глубокую благодарность старшему научному сотруднику Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, кандидату биологических наук Владимиру Вениаминовичу Шубину за помощь в снятии спектров кругового дихроизма и ведущему научному сотруднику Института нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева РАН, доктору химических наук Галине Николаевне Бондаренко за помощь в снятии ИК-спектров исследованных образцов.

Также хочу поблагодарить всех сотрудников нашей лаборатории за неизменно доброжелательное отношение ко мне и моей работе.

Работа была выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных исследований (гранты 03-04-49074 и 06-04-81054Бела), Целевой программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых» и программы Минобрнауки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы (2006 - 2008 годы) (проект 2.2.1.1.8916 «Расширение и развитие совместного учебно-научного центра Московского государственного университета пищевых производств и Института биохимии им. АЛ. Баха РАН с целью подготовки высококвалифицированных специалистов в различных областях биотехнологии»).

Заключение

Гемоглобины в биологических системах в условиях окислительного и нитрозативного стрессов играют противоречивую роль. С одной стороны, гемоглобины являются основной мишенью действия пероксидов, в результате чего образуются феррил-формы гема, способные окислять как белковую часть этих гемопротеидов, так и другие биомолекулы. То есть в этом случае гемоглобины, в отличие от каталаз и гемсодержащих пероксидаз, стимулируют процессы перекисного окисления: С другой стороны, гемоглобины обладают рядом - антиоксидшгшых функций. Гемоглобины могут вызывать гомолиз гидропероксидов, восстанавливать и окислять N0, а также катализировать реакцию изомеризации пероксинитрита в нитрат. Но особое внимание привлекает особенность гемоглобинов связывать различные лиганды, как низкомолекулярные (02, N0, СО), так и более крупные (ДНКЖ, гетероциклические соединения, углеводы, жирные кислоты). При этом гемоглобины могут связывать лиганды как по гему, так* и по функциональным группам аминокислотных остатков. Такая способность гемоглобинов к образованию комплексов с различными веществами может иметь протекторное значение. Например, образование ДНКЖ с участием аминокислот гемоглобина приводит к исключении ионов железа и N0 из редокс-цикла реакций свободнорадикального окисления.

Основной антиоксидантный эффект модификации гемоглобина гетероциклическими соединениями, в том числе и продуктами гликоокисления, заключается в защите гемоглобина от образования продуктов окисления гема! под действием перекисей. Также может иметь значение и тот факт, что некоторые лиганды I могут сильно менять свойства белка, выступая в качестве кофактора в* окислительно-востановительных реакциях. Таким образом, гемовые и негемовые лиганды, защищая гемоглобин от окислительного повреждения, играют функционально значимую роль для выживания клетки в условиях окислительного стресса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Космачевская, Ольга Владимировна, Москва

1. Андреюк Г.М., Кисель М.А. Образование гемихрома при взаимодействии гемоглобина с полярными производными фосфатидилхолина // Биоорганическая химия. 1997. Т. 23. № 4. С. 290-293.

2. Арутюнян Э.Г. К вопросу о сродстве гемоглобинов к молекулярному кислороду (по данным структуры леггемоглобина люпина). // Докл. АН СССР. 1980. Т. 252. № 5. С. 1264-1268.

3. Арутюнян Э.Г. Структура леггемоглобина // Молекулярная биология. 1981. Т. 15. № 1 С. 27-43.

4. Атанасов Б.П., Волькенштейн М.В., Шаронов Ю.А. Исследование модифицированного цитохрома с с миоглобинподобными свойствами методом магнитооптического вращения // Молекулярная биология. 1969. Т. Зч№ 4 С. 518-525.

5. Атанасов Б.П., Жизневская Г.Я. Кислотно-щелочные равновесия ферри-леггемоглобина люпина (Lupinus luteus L.). Спектральные исследования // Молекулярная биология. 1975. Т. 9. № 4. С.491-501.

6. Баширова Н.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Кретович B.JI. Метлегоглобинредукгаза клубеньков люпина. Очистка, свойства. // Биохимия. 1979. Т.44. № 7. С.1240-1245.

7. Белоусов Б.П. Периодически действующая реакция и её механизм // Сб. рефер. по радиац. мед. за 1958 г. М.: Медгиз. 1959. С. 145-157.

8. Вайнштейн Б.К., Куранова М.П., Арутюнян Э.Г., Егоров Ц.А. Леггемоглобин П желтого люпина. Особенности его строения в сравнении с миоглобином кашалота. // ' Биоорган, химия. 1980. Т. 6. № 5. С. 684-699.

9. Ванин А.Ф., Налбандян Р.М. Свободные радикалы нового типа в дрожжевых клетках // Биофизика. 1965. Т. 10. № 1. С. 167-168.

10. Васильева С.В., Ступакова М.В., Лобышева И.И., Микоян В.Д., Ванин А.Ф. Активация SoxRS-регулона в Escherichia coli оксидом азота и его физиологическими донорами // Биохимия. 2001. Т. 66. № 9. С. 1209-1214.

11. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. 2000. №12. С. 13-19.

12. Газарян И.Г., Хупшульян Д.М., Тишков В.И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 303-322.

13. Голубева Л.И., Топунов А.Ф., Гончарова С.С., Асеева К.Б., Кретович В.Л. Получение и свойства гомогенного препарата метлегоглобинредуктазы цитозоля клубеньков люпина. //Биохимия. 1988. Т.53. № 10. С.1712-1717.

14. Егоров Ц.А., Казаков В.К., Шахпаронов М.И., Фейгина М.Ю. Аминокислотная последовательность леггемоглобинов I и II из клубеньков желтого люпина. // Биоорган, химия. 1980. Т. 6. № 5. С.666-683.

15. Жаботинский А»М. Периодические окислительные реакции в жидкой фазе // ДАН СССР. 1964. Т. 157. С. 392-400.

16. Жаботинский А.Н., Отмер X., Филд Р. и др. Колебания и бегущие волны в химических системах: Пер. с англ. / Под ред. Р. Филда, М. Бургер. М.: Мир, 1988. 720 е., ил.

17. Жизневская Г.Я., Атанасов Б.П., Бороденко Л.И., Краснобаева Н.Н. Изучение структуры леггемоглобина из клубеньков люпина. // Физиология растений. 1976. Т. 23. № 6. С.1111-1118.

18. Заббарова И.В., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Губкин A.A., Петрова Н.Э., Руге Э.К. Взаимодействие ферритина и миоглобина как индукторов перекисного окисления' липидов. Роль активных форм кислорода и азота // Биофизика. 2004. Т. 49. № 4. С. 659665.

19. Краснобаева H.H., Атанасов Б.П. Изучение сродства леггемоглобина люпина к лигандам. Влияние pH и природы буфера. // Молекулярная биология. 1978. Т. 12. С. 12391245.

20. Кудрявцева H.H. Сравнение исследований леггемоглобинов из корневых клубеньков различных бобовых растений // Автореф. дисс. .канд. биол. наук. М., ИФР им. К. А. Тимирязева РАН, 1986. 24 с.

21. Лебедева О.В., Угарова H.H., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена //

22. Биохимия. 1977. Т. 42. № 8.Ь. 1372-1379.1

23. Лисов A.B., Леонтьевский A.A., Головлева Л.А. Оксидазная реакция гибридной, Mn-пероксидазы гриба Panus tigrinus 8/18 // Биохимия. 2005. Т.70. № 4. С. 568-574.

24. Матвиенко М.А., Заленский A.A., Филатов A.A., Тихонович И.А. Последовательности ДНК, гомологичные гену леггемоглобина. Существование и экспрессия в геноме небобовых растений семейства крестоцветные. // Генетика. 1991. Т. 27. № 1, СЛ 60-164.

25. Мелик-Саркисян С.С, Баширова Н.Ф., Владзиевская Л.П., Карпиленко Г.П., Кретович В.Л. Изучение легоглобина клубеньков люпина методом изоэлектрического фокусирования //Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1975. № 6. С. 151-155.

26. Мелик-Саркисян С.С., Баширова Н.Ф., Зауралова Н.О., Кретович B.JI. Ферментативное восстановление легоглобина. // Биохимия. 1976. Т. 41. № 7. С. 1330-1333.

27. Мелик-Саркисян С.С., Чернядьева М.Ф., Кретович В.Л. Белки и гемы клубеньков люпина в процессе вегетации и в зависимости от эффективности симбиоза. // Биохимия. 1972. Т. 37. № 2. С.415-423.

28. Мелик-Саркисян С.С., Яровенко В.В., Кретович B.JL О природе легоглобина в клубеньках люпина. // Биохимия. 1970. Т. 35. № 6. С. 1230-1237.

29. Мелик-Саркисян С.С., Яровенко В.В., Шапошников Г.Л., Владзиевская Л.П., Кретович В.Л. Хроматография и аминокислотный состав легоглобина люпина // Биохимия. 1974. Т. 39. № 4. С. 711-718

30. Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Хачатрян Г.Н., Ванин А.Ф. Протонирование нитрита — необходимая стадия в процессе генерации оксида азота из нитрита в биосистемах // Биофизика. 2006. Т. 51. № 6. С. 968-975.

31. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений.

32. Практическое руководство.: Пер. с англ. М: Мир, 1965. - 209 с.f

33. Осипов А.Н., Борисенко Г.Г., Владимиров Ю.А. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеидов // Успехи биологической химии. 2007. Т. 47. С. 259-292.

34. Пейве Я.И., Атанасов Б.П., Жизневская Г.Я., Краснобаева H.H. Спектры поглощения производных леггемоглобина из клубеньков, люпина (Lupinus luteus L.) // Доклады АН СССР. 1972. Т. 202. № 4. С. 965-968.

35. Петрова Н.Э. Влияние внешних факторов на функционирование легоглобина в клубеньках бобовых растений // Автореф. дисс. .канд. биол. наук. М:, ИНБИ им. А.Н. Баха РАН, 2002.24 е. '

36. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих // М.: Наука, 1998. 159 с.

37. Рубин Б.А., Логинова Л.Н. Альтернативные пути биологического окисления // М.: Итоги науки и техники. 1973. Т. 6. С. 394.

38. Саприн А.Н., Калинина Е.В. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов // Успехи биологической химии. 1999. Т. 39. С. 289-326.

39. Сафонова Т.Н., Тепляков A.B., Обломова Г.Б., Попов А.Н., Куранова И.П., Арутюнян Э.Г. Кристаллическая структура комплекса ферриллегоглобина желтоголюпина с изохинолином при разрешении 1,8 Ä // Биоорганическая химия. 1991. Т. 17. №12. С. 1605-1612.

40. Степуро И.И., Чайковская H.A., Виноградов В.В. Водоевич В.П. Восстановление нитрита гликозилированными аминокислотами и гликозилированным альбумином // Биохимия. 1999. Т. 64. № 1. С. 106-110.

41. Степуро И.И., Чайковская H.A., Водоевич В.П., Виноградов В.В. Восстановление метгемоглобина и феррицитохрома с гликозилированными аминокислотами и альбумином // Биохимия. 1997. Т. 62. № 9. С. 1130-1136.

42. Талзи Е.П. Ключевые интермедиаты селективного окисления // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. № 7. С. 35-41.

43. Талызин В.В., Топунов А.Ф., Баширова Н.Ф., Кретович В.Л. Бактериальные редуктазы, восстанавливающие кислородпереносящие гемопротеиды. // Докл. АН СССР. 1988. Т. 303. №4. С.1011-1012.

44. Топунов А.Ф. Функционирование легоглобина и регуляция кислородного режима в1клубеньках бобовых. Диссертация:- докт. биол. наук. М.: 1996. Ин-т биохимии им. А.Н. Баха РАН. 232 с.

45. Топунов А.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Лысенко Л.А., Карпиленко Г.П., Кретович В.Л. Метлегоглобинредуктаза клубеньков люпина. Некоторые свойства. // Биохимия. 1980. TÀ5. №11. С.2053-2058.I

46. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э. Гемоглобины: эволюция, распространение игетерогенность. //Успехи биологической химии.2001. Т. 41. С. 199-228.

47. Топунов А.Ф., Талызин В.В., Чекасина Е.В., Кретович В.Л. Метлегоглобинредуктазная активность бактерий Rhizobium, выращенных в свободной культуре. //Докл. АН СССР. 1987. Т. 296. № 6. С.1501-1504.

48. Финкелыптейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка: Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями. — 2-е изд., исп. и доп. М.: Книжный дом «университет», 2002.- 376 е., с ил.

49. Хьюз М. Неорганическая химия биологических процессов: Пер. с англ» — М.: Мир, 1983.-416 с.

50. Шлеев C.B. Ферментативное и неферментативное восстановления в клубеньках бобовых растений. Дисс. канд. биол. наук. М.: ИНБИ им. А.Н. Баха РАН, 2000. 163с.

51. Шумаев К.Б., Губкин A.A., Губкина С.А., Гудков Л.Л., Свиряева И.В., Тимошин A.A., Топунов А.Ф., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Взаимодействие динитрозильных комплексов железа с интермедиатами окислительного стресса // Биофизика. 2006. Т. 51. №. 3. С. 423428.

52. Шумаев К.Б., Губкина С.А., Кумскова Е.М., Шепелькова Г.С., Ланкин В.З., Рууге Э.К. Механизм образования супероксида при взаимодействии L-лизина с дикарбонильными соединениями // Биохимия. 2008. (в печати)

53. Шумаев К.Б., Заббарова И.В., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Влияние активных форм кислорода и азота на высвобождение ионов железа из ферритина и синтез динитрозильных комплексов // Биофизика. 2003. Т. 48. №. 1. С. 5-10.

54. Шумаев К.Б., Петрова Н.Э., Заббарова И.В., Ванин А.Ф., Топунов А.Ф., Панкин В.З., Рууге Э.К. Взаимодействие оксоферрилмиоглобина и динитрозильных комплексов железа // Биохимия. 2004. Т. 69. №. 5. С. 699-705.

55. Ahmed M.U., Frye Е.В., Degenhardt Т.Р., Thorpe S.R., Baynes J.W. Ne-1-(1-carboxy)cthyl.lysine, a prodact of the chemical modification of proteins by methylglyoxal, increases with age in human lens proteins. // Biochem J. 1997. Vol: 324. P. 565-570.

56. Andersson C.R., Jenesen E.O., Llewellyn D.J1, Dennis E.S., Peacock W.J. A new hemoglobin gene from soybean: a role for hemoglobin in all plants. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P.,5682-5687.

57. Angelo- M., Singel D., Stamler J. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006. Vol. 103. P. 8366-8371.

58. Angeloni S.V. and Potts M. Analysis of the seguences within and flanking the cyanoglobin-encoding gene, glbN, of the cyanobacterium Nostoc commune UTEX 584 // Gene. 1994. Vol. 146. P. 133-134.

59. Antonini E: Brunori M. Hemoglobin and' myoglobin in > their reactions with ligands. (Neuberger A. and Tatum E.L., eds). Amsterdam: North-Holland Publ., 1971.

60. Appleby C.A. Electron transport system of Rhizobium japonicum. II. Rhizobium haemoglobin, cytochromes and oxidases in free-living'(cultured) cells. // Biochim. Biophys. Acta. 1969a. Vol. 172. N 1. P. 88-105.

61. Appleby C.A. Leghemoglobin // in: "The Biology of Nitrogen Fixation" (Quispel A., ed.) New York, Amsterdam: Elsevier / North Holland Publ. Co., 1974. P. 521-554.

62. Appleby C.A. Leghemoglobin and Rhizobium respiration // Ann. Rev. Plant Physiol. 1984. Vol. 35. P. 443-478.

63. Appleby C.A. Properties of leghaemoglobin in vivo, and its isolation as ferrous oxyleghaemoglobin // Biochim. Biophis. Acta. 1969c. Vol. 188. N. 2. P. 222-229.

64. Appleby C.A. The separation and properties of low-spin (haemochrome) and: native, high-spin forms of leghaemoglobin; from? soybean nodule extracts // Biochim. Biophys. Acta; 1969b. Vol. 89. N. 2 P. 269-279.

65. Appleby C.A., Bergersen F.J. Preparation and experimental use of leghaemoglobin // Methods of evaluating biological nitrogen fixation / Ed. F.J. Bergersen. Chichester (UK): Wiley & Sons, 1980. P. 315-335.

66. Appleby CIA., NicolaxN.A:,, Hurrell J.G.R., Leach S.J. Characterisation and improved • separation of soybean leghemoglobin. //Biochemistry. 1975a: Vol; 14. N 20. P.4444- 4450.

67. Appleby C.A;, Tjepkema> J.D., Trinick M.J. Hemoglobin t in a nonleguminous plant,1 Parasponia: possible genetic origin and function of nitrogen fixation. // Science. 1983. V.220. N 4600. P.951-953.

68. Appleby G.A., Wittenberg B.A., Wittenberg J.B. Leghemoglobin. II. Changes in conformation and chemical reactivity linked to reaction with a dissociable low molecular weight ligand, X //J: Biol. Chem. 1973a; Vol. 248. N 9. P. 3183-3187.

69. Appleby C.A., Wittenberg B:A., Wittenberg J.B. Nicotinic acid as a ligand affecting leghemoglobin structure and oxygen reactivity // Proc. Nat. Acad: Sci. USA 1973b. Vol. 70. P. 564-568.

70. Appleby C.A., Turner CKL., Macnicol P:K. Involvement; of leghemoglobin and$cytochrome: P-450. in?an efficient oxidative phosphorylation5 pathway which supports nitrogenfixation in Rhizobium ll Biochim. Biophys. Acta. 1975b. Vol. 387. N3. P:461-474.

71. Arechaga-Gcampo E., Saenz-Rivera J;, Sarath G., Klucas R.V., Arredondo-Peter R.

72. Cloning and expression analysis of hemoglobin genes from maize (Zea mays ssp. Mays) andteosinte (Zea mays ssp. Parviglumis)// Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 1522. P. 1-8.162

73. Arredondo-Peter R., Hargrove M.S., Sarath G., Moran- J.F.,. Lohrmani Ji,, Olson, J;S., Klucas R.V. Gene cloning, analysis, and1 C)2-binding kinetics of a Recombinant Protein synthesized in Escherichia colill Plant Physiol. 1997a. Vol. 115. P. 1259-1266.

74. Arredondo-Peter R., Moran J.F., Sarath G., Luan P., Klucas R.V. Molecular cloning of the cowpea leghemoglobin H gene and expression of its cDNA in Escherichia coli II Plant. Physiol. 1997b. Vol. 114. P. 493-500. V .; ;

75. Arredondo-Petter R:, Esamilla E. A consensus seguence of plant hemoglobins // Plant Molecular Biology Reporter! 1991; Vol.19rN 3;.P: 195-207:

76. Ascenzi, P., Bolognesi, M., Milani, M.;, Guertin,. M., Visca, P. Mycobacterial truncated hemoglobins::From genes to functions.// Gene 2007. Vol. 398: P. 42-51;

77. Asmus K.-D:, Bensasson R^V., Bernier Ji-Ii., Houssin R:, Land E. J. One-electron oxidation of ergothioneine and analogues investigated by pulse radiolysis: redox reaction involving ergothioneine and vitamin C //Biochem; 1996. Vol. 315 P. 625-629.

78. Aviram I., Wittenberg B.A., Wittenberg J.B. The reaction of ferrous leghemoglobin with hydrogen peroxide to form leghemoglobin (IV) // J. Biol; Chem. 1978; Vol: 253. N16. P. 56855689.

79. Bastian N.R., Foster J:P., Ballantyne M., Lu Yanxiang. Nitrogen oxides, the good,1 the bad, and the ugly // Current Topics in Biophysics. 2002. Vol. 26. N 1. P. 115-127:

80. Becana M., Klucas R.V. Enzymatic and nonenzymatic mechanisms for ferric leghemoglobin reduction in legume root nodules//Proc. Natl. Acad: Sci. USA. 1990. Vol; 87. P: 7295-7299.

81. Becana M., Klucas R.V. Oxidation and reduction of leghemoglobin in root nodules of leguminous plants // Plant Physiol. 1992. Vol. 98. P. 1217-1221.

82. Becana M., Rodriguez-Barrueco C. Protective mechanism's of nitrogenase against oxygen excess and partially-reduced oxygen intermediates // Physiol. Plantarum. 1989.'Vol. 75. P. 429438:i

83. Becana M., Salin M.L., Ji L., Klucas R.V. Flavin-mediated reduction of ferric leghemoglobin from soybean nodules // Planta. 1991. Vol. 183. N 3. P. 575-583.

84. Benesch B.R., Benesch R.E. Preparation and properties of hemoglobin modified with derivatives of pyridoxal // Methos in enzymology. 1981. Vol. 76. P. 147-159.'

85. Bergersen F.J., Turner G.L. Leghemoglobin and the supply of O2 to nitrogen-fixing root nodule bacteroids: studies of an experimental system with no gas phase. // J. Gen. Microbiol. 1975. Vol. 89:N l.P. 31-47.

86. Berglund G.I., Garlsson G. H., Smith A.T., Szöke H., Henriksen A., Hajdu J. The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution // Nature. 2002. Vol. 47. N 6887. P. 463-467.

87. Bethke P.C., Badger M.R., Jones R.L. Apoplastic synthesis of nitric oxide by plants tissues // Plant Cell. 2004. Vol. 16. P. 332-341.

88. Bisseling T., Bovers F., Gloudemans T., Moerman M., Van Kämmen A. Expression of pea nodulin genes in effective and ineffective nodules. // Analysis of the plant genes involved in \egamQ-Rhizobium symbiosis. / Ed. R.Maxcellin. P.: OECD. 1983. P.105-111.

89. Boccini F., Herold S. Mechanistic studies of the oxidation of oxyhemoglobin by peroxynitrite // Biochemistry. 2004. Vol.43. P. 16393-16404.

90. Bogusz D. Leghemoglobin from root and stem nodules of Sesbania rostrata II Advances in Nitrogen Fixation Research. / Eds. Veeger C., Newton W.E. The Hague, etc.: Nartinus Nijhoff, Dr. W. Junk Publ., and Wageningen: Pudoc. 1984. P. 534.

91. Bogusz D., Appleby C.A., Landsmann J., Dennis E.S., Trinick M.J., Pecock W.J. Functioning hemoglobin genes in non-nodulating plant. // Nature. 1988. Vol. 331. P. 178-180.

92. Bolognesi M., Bordo D., Rizzi M., Tarricone C., Ascenzi P. Nonvertebrate hemoglobins: structural bases for reactivity. // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1997. Vol. 68. P. 29-68.

93. Bonamore A., Attili A*., Arenghi F., Catacchio B.,Chiancone E., Morea V., Boffi A. A novel' chimera: The "truncated' hemoglobin-antibiotic monooxygenase" from Streptomyces avermitilis II Gene 2007. Vol. 398. P. 52-61.

94. Bonamore A., Farina A., Gattoni M., Schinina E., Bellelli A., Boffi A. Interaction with membrane lipids and heme ligand binding properties of Escherichia coli flavohemoglobin // Biochemistry. 2003. Vol: 20. P. 5792-5801.

95. Bonamore A:, Gentili P.", Ilari A., Schinina M.E., Boffi A. Escherichia coli flavohemoglobin is an efficient alkylhydroperoxide reductase // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 22272-22277.

96. Boys B.L., Kuprowski M.C. and Konermann L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and' beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray massspectrometry //Biochemistry 2007. Vol. 46. N 37. P. 10675-10684.

97. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein due binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. N 1. P. 248-254.

98. Briggs T.S., Rauscher W.C. An oscillating Iodine clock // J. Chem. Educ. 1973. Vol. 50. P. 496-507.

99. Brunori M. Nitric oxide moves myoglobin centre stage // Biochemical sciences. 2001. Vol. 26. N4. P. 209-210.

100. Brunori M., Giuffre A., Nienhaus K., Nienhaus G.U., Scandurra F.M., Vallone B. Neuroglobin, nitric oxide, and oxygen: Functional pathways and conformational changes // PNAS 2005. Vol. 102. N 24. P. 8483-8488.

101. Bunn H.F. and Poyton R.O. Oxygen sensing and molecular adaptation to hypoxia*,// Physiol. Rev. 1996. Vol. 76. P. 839-885.

102. Burmester T., Ebner B., Weich B., Hankeln T. Cytoglobin: a novel'1 globin type' ubiquitously expressed in verterbrate tissues // Moll Biol: Evol. 2002. Vol. 19. No 4. P. 416-421.

103. Burmester T., Hankeln T. The respiratory proteins,of.insects. // J. Insect Physiol: 2007. Vol. 53. P. 285-294:

104. Burr A.H.J., Hunt P., Wagar D.R., Dewilde S., Blaxter M.L., Vanfleteren J.R., Moens L. A hemoglobin with an optical function // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. N J. P. 4810-4815.

105. Chain M.K. Heme protein biosensors // Porphyrins and Phthalocyanines. 2000. Vol. 4 P. 358-361.

106. Couture M., Chamberland H., St-Pierre B., Lafontaine J., Guertin M. Nuclear genesencoding chloroplast hemoglobins in the unicellular green alga Chlamydomonas eugameios. //

107. Mol. Gen. Genet. 1994. Vol. 243. P. 185-197.

108. Couture M.-, Guertin M: Purification and spectroscopic characterization1 of a recombinantchloroplastic hemoglobin from the green unicellular alga Chlamydomonas eugametos II Eur. J.

109. Biochem. 1996. Vol. 242. P. 779-787.

110. Couture M., Yeh S-R., Wittenberg B.A., Wittenberg J.B., Ouellet Y., Rousseau D.L.,

111. Guertin M. A cooperative oxygen-binding hemoglobin from Mycobacterium tuberculosis. II

112. Biochemistry. 1999. Vol. 96. P. 11223-11228.

113. Coventry D.E., Dilworth M.J. Synthesis and turnover of leghemoglobin in lupin rootnodules. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. Vol: 447. N 1. P. 1-10.

114. Cramm R., Siddigui- R.A., Friedrich B. Primary' Seguence and- evidence for aphysiological function of the flavohemoprotein of Alcaligenes eutrophus // J.! Biol. Chem: 1994:

115. Vol: 269. N. 10. P. 7349-7354.

116. Cruz-Ramos H., Crack J., Wu G., Hughes M.N., Scott C., Thomson A.J., Green J:, Poole

117. R.K. NO sensing by FNR: regulation of the Escherichia coli NO-detoxifying flavohaemoglobin,

118. Hmp // EMBO. 2002. Vol. 21. N 13. P. 3235-3244.166

119. Cueto M., Hernandez-Perera O., Martin R., Bentura M.L., Rodrigo J., Lamas S., Golvano M.P. Presence of nitric oxide synthase activity in roots and nodules of Lupinus albus// FEBS Letters 1996. Vol. 398. P. 159^164.

120. Davies M. J. and Puppo A. Direct detection of globin -derived radical in leghaemoglobin treated with peroxides // Biochemical J. 1992. Vol. 281. P. 197-201. "

121. Davies M.J., Mathieu C., Puppo A. Leghemoglobin: properties and reactions // Adv. Inorg. Chem. 1999. Vol. 46. P. 495-542.

122. De Duve C. Spectrophotometric method for the simultaneous- determination of myoglobin and hemoglobin in extracts of human muscle // Acta Chem. Scand! 1948. Vol. 2. N 2. P. 264-289.

123. Degn H. Bistability caused by substrate inhibition of peroxidase in an open reaction system//Nature. 1968. Vol. 217. P. 1047-1050.

124. Dikshit K.L., Spaulding D., Braun A., Webster D.AS. Oxygen inhibition of globin gene transcription and bacterial haemoglobin synthesis in Vitreoscilla II J. Gen. Microbiol. 1989. Vol. 135. P. 2601-2609.

125. Ding H. and Demple B. Direct nitric oxide signal transduction via nitrosylation of iron-sulfur centers in the SoxR transcription activator // PNAS. 2000. Vol. 97. N 10. P. 5146-5150:

126. Dordas C., Hasinoff B.B., Igamberdiev A.U., Manac'h N., Rivoal J., Hill" R.D. Expression of a stress-induced hemoglobin «affects NO levels produced by alfalfa root cultures under hypoxic stress // Plant J. 2003. Vol. 35. P. 763-770:

127. Dordas C., Rivoal J., Hill R.D. Plant haemoglobins, nitric oxide and hypoxic stress // Ann. Bot. 2003. Vol. 91. P. 173-178.

128. Downie J.A. Legume haemoglobins: symbiotic nitrogen fixation needs bloody nodules // Curr. Biol. 2005. Vol. 15. P.196-198.

129. Droge W. Free radicals in the physiological control1 of cell function. // Physiol. Rev. 2003. Vol. 82. P. 47-95.

130. Durner J., Gow A.J., Stamler J;S., Glazebrook J: Ancient origins of=nitric oxide signaling in biological systems // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 199?. Vol. 96. P. 14206-14207.

131. Ellfolk N. Crystalline leghemoglobin. II. The molecular; weights. and shapes of the two main components // Acta Chem. Scandh1960. Vol: 14: N 8: P: 1819-1827;

132. Ellfolk N. Crystalline leghemoglobin. III. Amino acid composition: of the two main? components//Acta Chem. Scand. 1961a. Vol. 15. P. 545-554:

133. Ellfolk N. Crystalline leghemoglobin. IV. Spectroscopic studies, of the two main metleghemoglobin. components and' some of their fatty acid: complexes //Acta Chem. Scand: 1961b. Vol. 15. N 5; P. 975-984.

134. Ellfolk; N;,. Sievers G. Crystalline, leghemoglobin. X. The ferrihemochrome of leghemoglobin //Acta Chem.; Scand:,1967. Vol. 21. N 6. P. 1457-1461;.

135. Ellfolk N., Sievers G. Circixlar dichroism of soybean leghemoglobin//Biochim. Biophys. . Acta. 1975. Vol. 405. P. 213-227.

136. Ermler U., Siddiqui R.A., Cramm R., Friedrich B: Crystal structure of the flavohaemoglobin from AIcaligenes eutrophus at 1.75 A resolution // EMBO J. 1995: Vol. 14. P: 6067-6077

137. Ernesto B'., Di Iorio E. Preparation of: derivatives of ferrous and ferric hemoglobin // Methods in Enzymology. 1981. Vol. 76. P. 57-72.

138. Farmer M:, Fyhn H.J., Fyhn U.E.H., Noble R.W. Occurrence of root effect hemoglobins in Amazonian fishes // Comp. Biochem. Physiol. 1979. Vol. 62A. N 1. P.l 15-123:

139. Fluckiger R., Berger W., Winterhalter K.H. HbAlc an index of diabetic control // Diabetoloia. 1977. Vol. 13. P. 393-393.

140. Fordel E., Thijs L., Moens L., Dewilde S. Neuroglobin and cytoglobin expression in mice. // FEBS J. 2007. Vol. 274. P. 1312-1317.

141. Franzen S., Gilvey L. B., Belyea J. The pH dependence of the activity of dehaloperoxidase from Amphitrite ornata II Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol. 1. P. 17182294.

142. Fräser J., de Mello L., Ward D:, Rees H., Williams D., Fang Y., Brass A., Gracey A.,

143. Cossins A. Hypoxia-inducible myoglobin expression in nonmuscle tissues // Proc. Natl. Acad.

144. Sei. USA.2006. Vol. 103. P. 2977-2981.

145. Frehm E.J., Bonaventura J., Gow A J. S-nitrosohemoglobin: an allosteric mediator of NO group firnction in mammalian vasculature // Free Radical Biology. 2004. Vol. 37. N 4. P. 442453.

146. Freitas T. A., Saito J., Hou S., Alam M. Globin-coupled sensors, protoglobins, and the last universal common ancestor. // J. Inorg. Biochem. 2005. Vol. 99. P. 23-33.

147. Freitas T.A.K., Hou S., Dioum E.M., Saito J.A., Newhouse J., Gonzales G., GillesGonzalez M.-A., Alam M. Ancestral hemoglobins in Archaea II PNAS. 2004. Vol. 101. N 17. P. 6675-6680.

148. Frühling M., Roussel H., Gianinazzi-Pearson V., Puhler A., Perlick A.M. The Vicia faba Leghemoglobin Gene VfLb29 is Induced in Root Nodules and in Roots Colonized by the

149. Arbuscular Mycorrhizal Fungus Glomus fasciculatum II Molecular Plant-Microbe Interaction. <1997. Vol. 10. P. 124-131.

150. Fuchsman W.H., Appleby C.A. Separation and determination of the relative concentrations of the homogeneous components of soybean leghemoglobin by isopelectric focusing. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol.579. N 2. P. 314-324.

151. Gardner P. Nitric oxide dioxygenase function and mechanism of flavohemoglobin, hemoglobin, myoglobin and their associated reductases. // J. Inorg. Biochem. 2005. Vol. 99. P. 247-266.

152. Gardner P., Gardner A., Brashear W., Suzuki T., Hvitved A., Setchell K., Olson J. Hemoglobins dioxygenate nitric oxide with high fidelity. // J. Inorg. Biochem. 2006. Vol. 100. P, 542-550.

153. Gardner P.R. Nitric oxide dioxygenase function and mechanism of flavohemoglobin, hemoglobin, myoglobin and their associated reductases // J. Inorg. Biochem. 2005. Vol. 99. P. 247-266.

154. Gardner P.R., Gardner A.M., Martin L.A., Salzman A.L. Nitric oxide dioxygenase: an enzymic function for flavohemoglobin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. Vol. 95. P. 1037810383.

155. Gilles-Gonzalez M.A. and Gonzalez G. Regulation of the kinase activity of heme protein FixL from the two-component system FixL/FixJ of Rhizobium meliloti II J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 16293-16297.

156. Gilles-Gonzalez M.A., Gonzalez G. Perutz M.F. Kinase activity of oxygen sensor FixL depends on the spin state of its heme iron // Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 232-236.

157. Goodfrey C.A., Dilworth MJ. Haem biosynthesis from 14C.-d-aminolaevulinic acid in laboratory grown and root nodule Rizobium lupine // J. Gen. Microbiol. 1971. Vol.69. N 3. P. 385-390.

158. Goodman M.D., Hargrove M.S.Quaternarystructure ofrice nonsymbiotic hemoglobin // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 6834-6839.

159. Gow,. A.J., Luchsinger, B.P., Pawloski, J.R., Singel, D.J., and Stamler, J.S. The oxyhemoglobin reaction of nitric oxide//Biochemistry. 1999. Vol. 96; P. 9027-9032.

160. Grisham M.B., Granger D.N:, Eefer D.JlModMation of leukocyte-endothelial interaction , by reactive metabolites of oxygen and nitrogen: relevance to ischemic heart disease. // Free Rad. Biol. Med. 1998. V. 25. P. 404-433.

161. Guo F.G., Crawford N.M. Arabidopsis nitric oxide synthasel is targeted to mitochondria and protects against oxidative damage and dark-induced senescence. // Plant. Cell. 2005. Vol. 17. P. 3436-3450.

162. Gupta K.J., Stoimenova M., Kaiser W.M. In higher plants, only root mitochondria, but not leaf mitochondria reduce nitrite to NO, in vitro and^ in situ. II J. Exp. Bot. 2005; P. 26012609; '

163. Halliwell' B. and Gutteridge J:. Free radical ' in Biology and Medicine. // Oxford: Clarendon Press, 1999.320 p.

164. Harper J.E. Evolution of nitrogen oxide(s) during in vivo nitrate reductase assay of soybean leaves // Plant, Physiol. 1981. Vol. 68. P. 1488-1493.

165. Hattory J., Johnson D.A. The detection of leghemoglobin-like sequences in legumes and non-legumes // Plant Molec. Biol. 1985. Vol. 4. N 5. P. 285-292.

166. Hausladen A., Gow A., Stamler J.S., Flavohemoglobin denitrosylase catalyzes the1reaction of anitroxyl eguivalent with molecular oxygen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2001. Vol. 98. P. 10108-10112.

167. Hebelstrup K. H., Igamberdiev A. U., Hill R. D. Metabolic effects of hemoglobin gene expression in plants // Gene 2007. Vol. 398. P. 86-93.

168. Hebelstrup K.N., Peter H. P., Dennis E., Jensen S.B., Jensen E. Hemoglobin is essential for normal growth of Arabidopsis organs. // Physiol. Plantarum. 2006. Vol. 127. P. 157-166.

169. Heckmann A.B., Hebelstrup K.H., Larsen K., Micaelo,N.M., Jensen E.O. A. single hemoglobin gene in Myrica gale retains both symbiotic and non-symbiotic specificity // Plant. Mol. Biol. 2006. Vol. 61. P. 769-779.

170. Herold S. and- Puppo A. Oxyleghemoglobin scavenges nitrogen monoxide and peroxy nitrite a possible role in functioning nodules? // J. Biol. Chem. 2005. N10. P.935-945.

171. Herold S., Fago A. Reactions of peroxynitrite with globin proteins and their possible physiological role // Gomp. Biochem. Physiol. 2005. Vol. 142. P. 124-129.

172. Herold S., Kalinga S., Matsui T., Watanabe Y. Mechanistic studies of the isomerization of peroxynitrite to nitrate catalyzed by distal histidine metmyoglobin mutants // Ji Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 126. P. 6945-6955.

173. Hersleth H.-P., RydeU., Rydbcrg P., Gorbitz G.H., Andersson K. K. Structures of thehigh-valent.metal-ion haem-oxygen intermediates in peroxidases, oxygenases and catalases // J.i . . / • "1.organ. Biochem. 2006. Vol: 100. P. 460-476.

174. Hou SI, Larsen R:W., Boudko D., Riley C.W., Karatan E., Zimmer M.,. Ordal G.W., Alam M: Myoglobin-like aerotaxis transducers in Archaea and Bacteria // Nature. 2000: Vol: 403. P. 540-544.

175. Hromatka B., Noble S., Johnson A. Transcriptional response oi Candida albicans to nitric oxide and the role of the YHB1 gene in nitrosative stress and virulence.// Mol. Biol. Cell: 2005. Vol. 16. P. 4814-4826.

176. Hundahl C., Fago A., Dewilde S:, Moens L., Hankeln T., Burmester T., Weber R. Oxygen binding properties of non-mammalian nerve globins // FEBS J. 2006. Vol. 273. P. 13231329.

177. Hunt P.W., Watts R.A., Trevaskis B., Llewelyn D.J., Burnell J., Dennis E.S., Peacock W.J. Expression and evolution of functionally distinct haemoglobin genes in plants // Plant Nolecular Biology:2001. Vol. 47. P. 677-692.

178. Hunt S., Gaito S.T., Layzell. D.B. Model of gas exchange and diffusion in legume,nodules//Planta. 1988. Vol. 173. P.128-141.

179. Hunter W.N., Appleby G.A., Guss J.M., Ollis D:L, Treeman B.C. Refinement-of crystal structure of soybean ferric leghemoglobin a nicotinate at 2.4 resolution. // Acta Crystallogr.1984. VvA. 40. Suppl. P.35.173

180. Hurrell' J.G.R., Nicola N.A., Broughton W;J., Dilworth MJ:j,Minasian E., Leach S.J: Comparative structural and immunochemicaLproperties of leghemoglobins. // Eur. J. Biochem. 1976. Vol.66. N 2. P.389-399.

181. Jacobsen-Lyon K., Jensen E.J:, Jorgensen P., Marcker K.A.,.Peacock W:J., Dennis E;S. Symbiotic and nonsymbiotic hemoglobin genes of Gasuarina glauca. il Plant Cell. 1995. Vol. 7. P. 213-223.

182. Jeney, V., Balla, J., Yachie, A., Varga, Z., Vercellotti, G.M;, I7.aton, J.W., and Balla, G. Pro-oxidant and cytotoxic effects of circulating heme.// Blood 2002. Vol. 100. P. 879-887.

183. Jones D;K., Badii R., Rosell F.I;, Lloyd E. Bacterial expression and spectroscopic characterization of soybean leghaemoglobin a // J. Biochem. 1998; Vol. 330. P. 983-988.

184. Joshi; M.S., Ponthier, J.L., and Lancaster, J.R. Jr. Cellular antioxidant» and pro-oxidant action of niMc oxide://Free Radical Biology & Medicine;1999. Vol: 27JP.1357-1366.

185. Jucket, M., Zheng, Y., Yuan H., Pastor, T.,.Antholine, W., Weber, M., and Vercellotti, G. Heme and the Endothelium. Effects of nitric oxide on catalytic iron and heme degradation by heme oxygenase. 115. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 23388-23397.

186. Jun H.-K., Sarath G., Moran J.F:, BecanaM.,KlucasR.V., Wagner F. W. Characteristics of modified'leghemoglobins isolated from soybean {Glycine max Merr.) root nodules. // Plant Physiol. 1994. Vol. 104: P. 1231-1236.

187. Kagan, V.E., Kozlov, A.V., Tyurina, Y.Y., Shvedova, A.A., and Yalowich, J.C. Antioxidantmechanisms of nitric oxide against» iron-catalyzed^^ oxidative stress in cells.// Antiox. & Redox Signaling. 2001. Vol.3. 189-202!

188. Kanatous S.B., Garry D.J. Gene deletional strategies reveal novel physiological roles for myoglobin in striated muscle. // Respir. Physiol. NeurobioL 2006. Vol. 151. N 1-2. P. 151-158.

189. Kànayama Y. and- Yamamoto Y. Inhibition of; nitrogen fixation in soybean; plants supplied with nitrate. II. Accumulation : and properties of nitrosylleghemoglobin in nodules // Plant. Cell. Physiol. 1990. Vol: 31. P. 207-299.

190. Kawashima K., Suganuma N., Tamaoki M., Kouchi H.Two types of pea leghemoglobingenes showing different 02-binding affinities and distinct patterns of spatial expression innodules. II Plant Physiol: 2001. Vol. 125. N 2. P. 641-651.175

191. Keilin D., Wang Y.L. Hemoglobin in the root nodules of leguminous plants. I I Nature. 1945. Vol. 155. N 3956. P.227-229.

192. Khosla C., Bailey J.E. The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotide sequence and genetic expression in Escherichia coli. II Mol. Gen. Genet. 1988. Vol. 214. P.158-161.

193. Kitatsuji C., Kurogochi M., Nishimura S., Ishimori K., Wakasugi K. Molecular basis of guanine nucleotide dissociation inhibitor activity of human neuroglobin by chemical cross-linking and mass spectrometry // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 150-160.

194. Klepper L. Comparison between nox evolution mechanisms of wild-type and nrl mutant soybean leaves // Plant Physiol. 1990. Vol: 93. P. 26-32.i

195. Klok C.J., Mercer R.D., Ghown S.L. Discontinuous gas exchange in centipedes and its» convergent evolution in tracheated arthropods. // J. Exp. Biol. 2002. Vol. 205. P. 1031-1036.

196. Klok E. J., et al. Expression profile analysis of low-oxygen response in Arabidopsis root cultures, // Plant. Cell, 2002: Vol, 14. P. 2481-2494,

197. Klucas R.V., Appleby C.A. Nicotinate, nicotinamide, and the reactivity of leghemoglobin in soybean root nodules // Plant. Physiol. 1991. Vol. 95. P. 551-555.

198. Klucas R.V., Arp D. Physiological and biochemical studies on senescing tap root nodules of soybeans // Can. J. Microbiol. 1977. Vol. 23. P. 1426-1432.

199. Kruszewski, M. The role of labile iron pool in cardiovascular diseases. // Acta Biochimica Polonica. 2004. Vol. 51. P. 471-480.

200. Kubo H. Uber das Hemoprotein aus den Wurrelknollchen von Leguminosen. // Acta. Phytochim. 1939. Vol. 11. N 1. P. 195-200.

201. Kundu S. and Hargrove M.S Distal heme pocket regulation of ligand binding and stability in soybean leghemoglobin // Proteins 2003. Vol. 50. P. 239-248.

202. Kundu S., Premer S.A., Hoy J.A., Trent J,T., Hargrove M.S. Direct measurement of eguilibrium constants for high-affinity hemoglobins // Biophys J. 2003. Vol. 84. P. 3931-3940.r

203. Kunkel H.G., Wallenius G. New hemoglobins in normal aduld blood // Science. 1955. Vol. 122. P.'288.

204. T.W.C., Westwood M.E., McLellan A.C., Selwood T., Thornalley P.J. Binding and modification of proteins by methylglyoxal under physiological conditions // J. of Biol. Chem. 1994. Vol. 269. N. 51. P. 32299-32305.

205. Ma, X.L., Gao, F., Liu, G-L., Lopez, B.L., Christopher, T.A., Fukuto, J.M., Wink, D.A., and Feelisch, M. Opposite effects of nitric oxide and nitroxyl on postischemic myocardial injury.

206. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. Vol. 96. P. 14617-14622.i i

207. Mansuy D., Chottard J.C., Chottard G. Nitrosoalkanes as Fe(II) ligands in the hemoglobin and myoglobin complexes formed from nitroalkanes in reducing conditions // J. Biochem. 1977. Vol. 76. N 13. P. 617-623.

208. Marcker K.A., Boj sen K., Jensen E.J., Paludan K. The soybean leghemoglobingenes. // Advances in Nitrogen* Fixation Research. / Eds. Veeger C., Newton W.E. The Hague etc.: Nartinus Nijhoff, Dr. W.Junk Publ., and Wageningen: Pudoc. 1984. P. 573-578.

209. Marsh L., Evolution of structural shape in< bacterial globin-related proteins. // J. Mol. Evol. 2006. Vol. 62. P. 575-587.

210. Matamoros M.A., Dalton D.A., Ramos J., Clemente M.R., Rubio M.C., Becana M. Biochemistry and molecular biology of antioxidants in the rhizobia-legume symbiosis // Plant Physiology. 2003. Vol.133. P. 499-509.

211. Mathews P. and Seymour R. Underwater backswimmers use their haemoglobin to help them stay stationary while waiting for prey. //Nature 2006. Vol. 441 P. 171-171.

212. Mathieu C., Moreau S., Frendo P., Puppo A., Davies M.J. Direct detection of radicals in intact soybean nodules: presence of nitric oxide-leghemoglobin complexes.// Free Radie. Biol. Med. 1998. Vol. 24. N 7-8. P. 1242-1249.

213. Meyer J. Comparison of carbon monoxide, nitric oxide, and nitrite as inhibitors of the nitrogenases from Clostridium pasteurianum II Arch Biochem Biophys. 1981'. Vol! 210: P. 246256.

214. Minning D.M., Gow A.J., Bonaventura J., Braun R., Dewhirst M., Goldberg D.E., Stamler J.S. Ascaris haemoglobin is a nitric oxide-activated "deoxygenase" // Nature. 1999. Vol. 401. P. 497-502.

215. Miranda J. L., Maillet D.H., Soman J., Olson J.S. Thermoglobin, oxygen-avid hemoglobin in a bacterial hyperthermophile // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280. N 44. P. 3675436761.

216. Mohamed A., Burr C., Burr A. Unique two-photoreceptor scanning eye of the nematode Mermis nigrescensll Biol. Bull. 2007. Vol. 212. P. 206-221.

217. Mongkolsuk S., Helmann J.D. Regulation of inducible peroxide stress responses // Mol. Microbiol. 2002. Vol. 45. P. 9-15.

218. Moreau S., Davies M.J., Mathieu C., Herouart D., Puppo A. Leghemoglobin-derived radicals // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. N. 51. P. 32557-32562.

219. Moreau S., Davies M.J., Puppo A. Reaction of ferric leghemoglobin with H2O2: formation of heme-protein cross-links and dimeric species. // Biochim Biophys Acta. 1995. Vol. 1251.N l.P. 17-22.

220. Muller, B., Kleschyov, A.L., Alencar, J.L., Vanin, A.F., Stoclet, J.C. Nitric oxide transport and storage in the cardiovascular system. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002. Vol* 962. P. 131-139.

221. Murayama M. The combining power of normal human hemoglobin for nitrosobenzene // J. Biol. Chem. 1960. Vol. 235. N 4. P. 1024-1028.

222. Nagababu E., Rifldnd J.M. Reaction of hydrogen peroxide with ferrylhemoglobin:superoxide production and heme degradation // Biochemistry 2000. Vol. 39. P. 12503-12511.1

223. Nakamura H. Rhizobial oxygen sensor FixL/FixJ system // Bioarchitect,Research. 2001.j1. N41. P. 62-63.

224. Neill.S.J:, DesikanR., Hancock J.T. Nitric oxide signaling in plants // New Phytol. 2003. Vol. 159. P. 11-35.

225. Nicola N.A1., Minasian E:, Appleby C.A., Leach S.J. Circular dichroism studies of myoglobin and leghemoglobin // Biochemistry. 1975. Vol. 14. N 23. P. 5141-5149.

226. Nie X.Z., Hill R.D. Mitochondrial respiration and hemoglobin gene; expression in barley aleurone tissue // Plant. Physiol. 1997. Vol. 114. P. 835-840.

227. Nie X.Z., Durnin D.C., Igamberdiev A:U., Hill RiD.', Cytosolic cdciumds involved in the r regulation of barley hemoglobin gene expression // Planta 2006. Vol. 223. P. 542-549.

228. Numoto.N., Nakagawa T., Kita A., Sasayama Y., Fukumori Y., Miki K. Structure of an extracellular giant hemoglobin of the gutless beard worm Oligobrachia mashikbi: II Proc. Natl; Acad. Sci. USA 2005. Vol. 102. P. 14521-14526.

229. O'Brian M.R. Heme synthesis* in the» Rhizobium legume * symbiosis: a: palette forbacterial^and eukaryotic pigments. //JlBacteriologyi .1996.' Vol.178; P.13-24:\

230. O'Donnell, V.B, and Freeman, B;A. Interaction between nitric oxide and.lipid oxidation-pathways. // Circulation Research 2001. Vol. 88. P. 12-21.

231. Ohwaki Y., Kawagishi-Kobayachi M., Wakasa K., Fujihara S., Yoneyama T. Induction of class-1 non-symbiotic hemoglobin genes by nitrate, nitrite and nitric oxide in cultured rice cells // Plant Cell Physiol. 2005. Vol. 46. P. 324-331.

232. Ollis D.L., Appleby C.A., Colman P.M., Cutten A.E., Guss. J.M., Vencatappa M.P., Freeman H.C. Crystal structure of soybean ferric leghemoglobin a nicotinate at a resolution, of 3.3 A/7 Aust. J; Chem. 1983: Vol: 36. N 3. Pj451-468:

233. Olson J.S. and Phillijjsv G.N. Myoglobin discriminates between O2, NO, and CO by electrostatic interactions with the bound ligand // J. Biol. Chem; 1997. Vol. 2. P. 544-552.

234. Ostojic J., Sakagucbi D.S., Latbouder Y., Hargrove M:S., Trent III: J:T., Kwon Y. H:, Kaedon R.H., Kuebn M.H., Betts D. M., Grozdanic S. Neuroglobin and cytoglobin: jxygen-binding proteins in retinal neurons // IOVS. 2006. Vol. 47. N 3. P. 1016-1023.

235. Park K.W., Kim K.J., Howard A.J., Stark B.C., Webster D.A. Vitreoscilla hemoglobin binds to subunit I of cytochrome bo ubiquinol oxidases // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 33334-33337. • *.

236. Pastore A.and Lesk A.M. Comparison of the structures of globins and phycocyanins: evidence for evolutionary relationship // Profc Struct. Func. Genet. 1990. Vol. 8. Pi 133-155.

237. Pawaria S., Rajamohan G., Gambhir V., Lama A., Varshney G., Dikshit K. Intracellular growth and survival of: Salmonella typhimurium carrying; truncated' hemoglobins- of Mycobacterium tuberculosis II Microbial; Pathog. 2007: Vol; 42! P. 119-128:

238. Perazzolli M., Dominici P., Romero-Puertas M.C., Zago Ei, Zeier Ji, Sonoda M., Lamb C., Delledonne Mi Arabidopsis nonsymbiotic hemoglobin AHbl modulates nitric oxide bioactivity//The Plant Cell. 2004. Vol. 16, P. 2785-2794.

239. Planchet E., Gupta K.J., Sonoda M., Kaiser W.M. Nitric oxide emission from tobacco leaves and cell suspensions: rate limiting factors and evidence for the involvement of mitochondrial electron transport: // Plant: J: 2005: Vol; .41. P. 732-743;

240. Poole R.K. and Hughes M.N. New function for the ancient globin family: bacterial responses to nitric oxide and nitrosative stress // Mol: Microbiology. 2000: Vol: 36 N 4: Pi 775783.

241. Poole R.K., AnjumM.F., Membrillo-Hernández Jí, Kim S.O:, Hughes MlN;vSterwart>V: Nitric oxide, nitrite and Fnr regulation of hmp (flavohemoglobin) geneexpression in Escherichia, co//K-12//J. Bacteriol. 1996a. Vol. 178. P. 5487-5492.

242. Poole R.K., Ioannidis N., Orii : Y. Reactions of the Escherichia coli flavohaemoglobin (I Imp) with NADII and near-micromolar oxygen: oxygen affinity of NADH oxidase activity // Microbiology. 1996b. Vol. 142. P. 1141-1148.

243. Potts M., Angeloni S.V., F.bel R.E., Bassam D. 1 lemoglobin in ä cyanobacterium. // Science. 1992. Vol. 256. P. 1690-1692.

244. Prutulla S:, Dyson H;J., Wright P.P. Gene synthesis high-level expression and assignment of backbone NbC resonances of soybean leghemoglobin // FEBS Letters. 1996. Vol. 399. P. 283-289.

245. Puppo A. and Halliwell Bi Generation of hydroxy! radicals by soybean nodule leghaemoglobin //Planta. 1988. Vol. 173. P. 405-410.

246. Puppo A., Monny G., Davies M.J. Glutathione -dependent conversion: of ferryl leghaemoglobin into the ferric förm: a potential protective process in soybean (Glycine max) root nodules // Biochem. J. 1993. Vol. 289. P. 435-438.

247. Puppo A., Rigaud J. Indole-3-acetic acid (IAA) oxidation by leghemoglobin from soybean nodules. // Physiol. Plantarum. 1975. Vol. 35. P.181-185.

248. Puppo A., Rigaud J., Job D. Role of superoxide anion in leghemoglobin autoxidation// Plant science Letters. 1981. Vol. 22. P. 353-360.

249. Quast R., Vesterberg O: Isoelectric focusing and separation'of Myxine glutinosa L. in a natural pH gradient. II Acta Ghem: Scandal9681/V: 22Í.N-5: P: 1499-1508:

250. Ramos G.L, Pou S., Britigan B:E. Spin-trapping evidence for myelöperoxidase-dependénthydroxyl radical formation by human neutrophils, arid monocyte. // J i Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 8307-8312:

251. Rassaf T., Flogel U., Drexhage C., Hendgen-Gotta U., Keim M., Schräder J. Nitritereductase function of deoxymyoglobin// Circ. Res. 2007. Vol. 100 P. 1749-1754.183

252. Reeder B. and Wilson M. Hemoglobin and myoglobin associated oxidative stress: from molecular mechanisms to disease States // Curr. Med. Chem. 2005. Vol. 12. P. 2741-2751.

253. Richardson M.M., Dilworth J., Scaweri M.D. The amino acid seguence of leghemoglobin I from root nodules of broad bean (Viciafaba) // FEBS Lett. 1975/Vol. 51. P. 33-37.

254. Rifkind J., Nagababu E., Ramasamy S. Nitric oxide redox reactions and red cell biology // Antioxid Redox Signal. 2006. Vol. 8. P. 1193-1203.

255. Riggs A. Preparation of blood hemoglobins of vertebrates // Methods in Enzymology. 1981. Vol. 76. P. 5-29.

256. Robertson J.B., Wells B., Bisseling T., Farndon K. J.F., Johnston A.W.B. Lmmuno-gold localization of leghaemoglobin in cytoplasm in nitrogen-fixing root nodules of pea. // Nature. 1984. Vol.311. N 5983. P.254-256.

257. Rodgers K.R. Heme-based sensors in biological systems // Curr. Opin. Chem. 1999. Vol. 3. P.158-167.

258. Rogstam A., Larsson J., Kjelgaard P., von Wachenfeldt C. Mechanisms of adaptation to nitrosative stress in Bacillus subtilis. // J. Bacterid. 2007. Vol. 189. P. 3063-3071.

259. Ross E. JH., Lira-Ruan V., Arredondo-Peter R., Klucas R.V., Sarath G. Recent insights'' ' j ' ' * • ' ,intu plant hemoglobins // Plant Biochemistry and biotechnology: 2002. Vol. l.P. 173-189.

260. Runnegar B. Derivation of the globins from type b cytochromes. // J. Mol. Evol. 1984. Vol.2i;P. 33-41.

261. Saari L.L., Klucas R.V. Ferric.leghemoglobin <reductase from soybean?root nodules. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. Vol.23 UN 1. P.102-113:

262. Salvati A.M., Tentori L. Determination of aberrant hemoglobin derivatives in human . blood // Methods in enzymology. 1981. V 76. P. 715-431.

263. Sciotti M;'-A.,. Ghanfon A., Hennecke II., Fischer- II.-M. Disparate oxygen responsiveness of two regulatori cascades; that control expression of; symbiotic genes in\ Bradyrhizobiumjaponicum II J: Bacteriology. 2003; Vol: 185. N18: P. 5639-5642:

264. Sievers G., Huhtala M.L., Ellfolk N. The primary structure of soybean* (Glycine max) leghemoglobin c. //Acta Chem. Scand:. 1978. Vol. B32.N5. P.380-386.

265. Sievers G., Ronnberg Mf Study of pseudoperoxidatic activity; ofsoybean: leghemoglobin andsperrmwhale myoglobin // Biochiim. BiophysActa: 1978. Vol; 533: P. 293-301:

266. Singel D: and Stamler J. Chemical physiology of blood flow regulation by red blood cells v //Annu: Rev. Physiol: 2005. VoL67:P. 99-145:

267. Sri Krishna S., Sadreyev R.L, Grishin N.V. A tale of two ferredoxins: sequence similarity. and structural differences. // BMC Struct. Biol. 2006. Vol. 6. P. 8-19.

268. Stamler J.S:, Jia L., Eu J;P.', McMahon^T.J:, Demchenko I:T., Bonaventura J., Gernert K., Piantadosi C.A. Bloods flow regulation- by S-nitrosohemoglobim in; the physiological oxygen gradient // Scicnce. 1997. Vol. 276. P. 2034-2037,

269. Suhaqo U.K.J:, Tjepkema J.D: Occurence of hemoglobin» in the nitrogen-fixing root nodules of Alnus glutinosa. II Physiol. Plantarum. 1995. Vol. 95. P. 247-252.

270. Sullivan D., Brisson N., Goodchild Bi, Verma D.P.S., Thomas D.Y. Molecular* cloning and organization of two leghaemoglobin genomic sequences of soybean. // Nature. 1981. Vol. 289. N5797. P. 516-518

271. Sun Y., Jin K., Mao X.O. Zhu Y., Greenberg D.A. Neuroglobin is up-regulated by and protect neurons from hypoxic-ischemic injury // Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 1530615311.

272. Sun Y., Jin K., Peel A., Mao X.O., Xie L., Greenberg D.A. Neuroglobin protects theibrain from experimental stroke in vivo II Proc. Natl. Acad Sci, USA. 2003. Vol. 100. P. 34973500.

273. Taylor E.R., Nie X.Z., MacGregor A.W., Hill R.D. A cereal hemoglobin gene is expressed in seed and root tissues under anaerobic conditions // Plant. Mol. Biol. 1994. Vol. 24. P. 853-862.

274. Terwilliger N.B., Terwilliger R.C. Oxygen binding domains of a clam (Cardita borealis) extracellular hemoglobin//Biochim. Biophys. Acta. 1978. Vol. 537. P. 77-85.

275. Thorpe S.R and Baynes J.W. Maillard reaction products in tissue proteins: new prodactsand new perspectives // Amino acids. 2003. Vol. 25. P. 275-281.

276. Thorsteinsson M.V., Bevan D.R., Potts M., DouY., Eich R.F., Hargrove M.S., Gibson Q.H., Olson J.S. A cyanobacterial hemoglobin with unusual ligand binding kinetics and stsbility properties. //Biochemistry. 1999. Vol. 38 P. 2117-2126.

277. Thulborn K.R. Minasian E., Leach S.J. Leghemoglobin from Trifolium subterraneum. Purification and characterization. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 578. N 2. P. 476-483.

278. Tjepkema J.D. Hemoglobin in the nitrogen-fixing root nodules of actinorhisal plants. //t

279. Can. J. Bot.1983. Vol. 61. N 11. P. 2924-2929.

280. Touati D. Sensing and protecting against superoxide stress in Escherichia coli how many ways are there to trigger soxRS response? // Redox Report. 2000. Vol. 5 P. 287-293.

281. Trent III J.T., Hargrove M:S; A ubiguitously human hexacoordinate hemoglobin // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 207. N 22. P. 195378-19545:

282. Trent« III J.T., Hvitved A.N., Hargrove: M.S. A model for ligand bindings to hexacoordinate hemoglobins//Biochemistry. 2001. Vol; 40; P: 6155-6163i

283. Uheda E., Syono K. Effect of leghaemoglobin. components on nitrogen fixation and oxygen consumption: // Plant Cell Physioli 1982a: V: 23: N 1. P. 85-90: , / ' .

284. Vanin A.F., Scrczhenkov V.A., Mikoyan V.D., Genkin, M.V. The 2,03 signal as an indicator o£dinitrosyl-iron-complexes with thioliconteining ligands. //Nitric Oxidet1998: Vol: 2.Pi224-234.

285. Vasudevan S.G., Armarego W.L.F.,Shaw D.C., Lilley P.E., Dixon N;E., Poole R.K. Isolation and nucleotide sequence; of the hmp,gene that encodes a haemoglobin-like protein in* Escherichia coli K-12: II Mol: Gen.Genet: 1991!. Vol: 226.N 1/2; P. 49-58.1

286. Verma D.P. Si, Bal- A.K-. Intracellular site of synthesis and localization; of leghemoglobin in root nodules. // Proc. Natl: Acad: Sci. USA: 1976.Vol: 73;N? IT: P: 3843-3847.

287. Verma D.P.S., Long S. The molecular biology of Rhizobium-legume symbiosis. // Int. Rev. Cytol. 1983. Vol.14. Suppl. P: 211-245.

288. Vinogradov S.E., Moens L. Diversity of globin function: enzymatic, transport, storage- 1 , ' ' 1• i i >and sensing // JBC. 2008. (in press).

289. Vinogradov S.N., HoogewijsD., Bailly X., Arredondo-Peter R., Guertin M., Gough J.,

290. Dewilde S., Moens L. and Vanfleteren J.R. Three globin lineages belonging to two structuralclases in genomes from the three kingdoms of life. // PNAS. 2005. Vol. 102. N 32. P. 11385' r11389. •

291. Vinogradov S.N., Hoogewijs D., Bailly X., Mizuguchi K., Dewilde S., Moens L., Vanfleteren J.R: A model of globin evolution // Gene. 2007. Vol. 398. P. 132-142.

292. Vuletich D. and-Lecomte J.T.J. A phylogenetic and structural analysis of truncated hemoglobins. // J. Mol. Evol. 2006. Vol. 62. P. 196-210.

293. Wakabayashi S., Matsubara H., Webster D.A. Primary sequence of a dimeric bacterialhaemoglobin from Vitreoscilla. //Nature. 1986. Vol. 332. N 6078. Pf 481-483.

294. Wang R., Guegler K., LaBrie S.T., Grawford N.M: Genomic analysis of nutrientresponse in Arabidopsis reveals diverse expression patterns and novel metabolic and potentialregulatory genes induced by nitrate // Plant. Cell. 2000. Vol. 12. P. 1491-1509.

295. Watts R.A., Hunt P.W., Hvitved A.N., Hargrive M.S., Peacock W.J., Dennis E.S. Ahaemoglobin from plants homologous to truncated hemoglobins of microorganisms // Proc. Natl.

296. Acad. Sci. USA 2001. Vol. 98. P. 10119-10124.

297. Waxman L. The structure of annelid and'mollusc hemoglobins. // J. Biol. Chem. 1975.1. Vol. 250. P. 3790-3795.

298. Weber R.E. and Vinogradov S.V. Nonvertebrate hemoglobins: functions and molecularadaptations//Physiological Reviews,2001. Vol. 81.'N. 2. P. 569-628.

299. Wittenberg J.B. and Wittenberg B.A. Mechanisms of cytoplasmic hemoglobin andmyoglobin function // Annu. Rev. Biophys Biophis Chem. 1990. Vol. 19. P. 217-241.188

300. Wittenberg J.B. On optima: The ease of myoglobin-facflitated oxygen diffusion // Gene 2007. Vol. 398. P. 156-161.

301. Wittenberg J.B., Appleby C.A., Wittenberg B.A. The kinetics of the reactions of leghenloglobin with oxygen and carbon monoxide // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247. N 2. P.527-531.

302. Wittenberg J.B., Bolognesi M., Wittenberg B. A., Guertin M. Truncated hemoglobins: a new family of hemoglobins widely distributed inbacteria, unicellular Eukaryotes, and Plants // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. N 2. P. 871-874.

303. Yim H.-S., Kang S.-O., Hah Y-C., Chock P.B., Yim M.B. Free radicals during the glycation reaction of amino acids by methylglyoxal // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. N 47. P. 28228-28233.

304. Zal F., Lallier F.H., Wall J,S., Vinogradov S.N., Toulmond A. Multi-hemoglobin system of the hydrothermal vent tube worm Riftia pachyptila I. Reexamination of the number and masses of its constiiuents // J. Biol. Chem. 1996a Vol. 271. P. 8869-8874.

305. Zee J.' Formation of peroxide- and globin-derived radicals from the reaction of methaemoglobin and metmyoglobin with /-butyl hydroperoxide: an ESR spin-trapping investigation. // Biochem. J. 1997. Vol. 322. P. 633-639.

306. Zemojtel T, Frohlich A, Palmieri MC, Kolanczyk M, Mikula I, Wyrwicz LS, Wanker EE, Mundlos S, Vingron M, Martasek P, Dumer J. Plant nitric oxide synthase: a never-ending story? // Trends. Plant. Sci. 2006. Vol. 11. P. 524-525.

307. Zhang W., Phillips Jr. Structure of the oxygen sensor in Bacillus subtilis signal transduction of chemotaxis by control of symmetry. // Structure. 2003. Vol. 11. P. 1097-1108.

Информация о работе

Космачевская, Ольга Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние физиологических лигандов на функционирование легоглобина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы