Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аланиндегидрогеназа из бактериоидов Rhizobium Lupini

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аланиндегидрогеназа из бактериоидов Rhizobium Lupini"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ юл.А.Н.БАХА

На правах рукописи

КАЗАКОВА Ольга Васильевна

УДК 577.31. 577.15.051

АЛАНИНДЕ1ВДР0ГЕНАЗА ИЗ БАКТЕРОВДОВ шпгозтом ьирпп:

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на .соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

член-корреспондент АН СССР, профессор В.Л.Кретович

доктор биологических наук М.С.Крицкий

доктор биологических наук В.И.Муронец

Институт биохимии растений АН ГССР

Защита диссертации состоится " 9 " ЦМУШО- 1988 г. в Ю часов на заседании специализированного совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им.А.Н.Баха АН СССР (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1).

Автореферат разослан

1988 Г.

Ученый секретарь

специализированного совета, ^ ^

доктор биологических наук сС- I.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Общеизвестно, что азотное питание растений является одним из важнейших факторов их ррста и развития. Дефицит азота в почве приводит к снижению урожая и, в конечном счете, обуславливает дефицит белка - проблему, имеющую глобальное значение. В увеличении содержания связанного азота в почве существенную роль играет биологическая фиксация молекулярного азота. Этот процесс осуществляют микроорганизмы - свободноживу-щие или развивающиеся в прикорневой стстеме, либо в симбиозе с растениями. Все они содержат фермент нитрогеназу (КФ 1.18.2.1.). Наиболее хозяйственно важными среди азотфиксирующих микроорганизмов являются бактерии рода ИМиоМит ■, образующие клубеньки на корнях главным образом бобовых растений / Кретович,1987 /. Эти растения, увеличивая количество связанного азота в почве, кроме того,сами являются хорошим источником кормового и пищевого белка. В нашей, стране одной из важнейших зернобобовых культур является люпин. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что продуктивность растений в большой степени определяется, начальными этапами усвоения неорганического азота, которое сводится в конечном счете к ассимиляции аммиака, образующегося в бактериальной части азотфиксирующих клубенькоз, путем включения в аминокислоты и амиды. Поэтому выяснение механизмов ассимиляции аммиака, изучение свойств и регуляции ферментов, осуществляющих эти процессы в клубеньках бобовых растений, является основополагающим при исследовании симбиотической азотфикса-ции.

До недавнего времени считалось, что в бактероидах происходит лишь фиксация молекулярного азота, а ассимиляция образующегося аммиака полностью осуществляется в растительной части клубенька - цитозоле, под действием глутаминсинтетазы (КФ 6.3.1.2.) и глу-таматсинтазы (КФ 1.4.1,13.). Однако, в настоящее время есть данные, которые позволяют заключить, что связывание аммиака происходит также и в самих бактероидах путем включения в глутаыин, глутаминовую и аспарагиновую кислоты. Одним из возможных путей связывания аммиака в бактероидах может бить также образование аланина, так как эта аминокислота заметно преобладает среди

свободных аминокислот бактероидов R. lupini в условиях интенсивной азотфиксации / Шапош1Иков,1977 /. Полагают, что основным путем новообразования аланина у микроорганизмов является путь восстановительного аминирования пировиноградной кислоты, осуществляемого had —зависимой аланиндегидрогеназой (КФ I.4.IЛ.). Этот фермент довольно широко распространен у бактерий, в том числе и у азотфиксирующих / Озолинь,1966 /. Следует отметить, что к началу нашей работы в литературе имелись данные об ала-ниндегидрогеназе только из двух азотфиксирующих объектов -цианобактерии Anabaena cylindrica /Rowell,Stewart, 1976' / и симбиотической азотфиксирующей бактерии Rhizobium japonicum / Dunn,Clucae,1973; Müller,Werner, 1982 /. Авторы ЭТИХ работ предполагают, что аланиндегидрогеназа может играть определенную роль в ассимиляции аммиака.

Цель и задачи исследования. Учитывая возможную роль аланин-дегидрогеназы у симбиотрофных азотфиксирующих бактерий в асси- . миляции аммиака, образущегося в процессе азотфиксации, или же в снабжении свободноживущих бактерий источниками углерода и азота, главной целью настоящей работы было изучение аланинде-гидрогеназы бактероидов Rhizobium lupini.

Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1) исследовать синтез аланина целыми изолированными бактероидами R. lupini из аммиака и различных источников углерода;

2) выделить аланиндегидрогеназу в гомогенном состоянии, изучить её структурную организацию и определить некоторые физико-химические свойства;

3) исследовать специфичность и кинетику действия аланиндегидро-геназы;

4) изучить регуляцию активности и синтеза исследуемого фермента.

Научная новизна работы. В результате проведенной работы показано, что целые изолированные бактероида R» lupini из аммиака и источников углерода (сахароза,пируват) синтезируют главным образом аланин. Максимальное количество аланина образуется при использовании аммиака, пирувата и наш , что свидетельствует о возможной причастности к этому процессу аланиндегидрэгена-зы.

Аланиндегидрогеназа обнаружена в виде двух молекулярных форм, незначительно различающихся по электрофоретической подвижности. В условиях интенсивной азотфиксации в бактероидах преобладает форма ( > 20% суммарной активности) с меньшей электрофоретической подвижностью.

Аланиндегидрогеназа бактероидов 1ир1п1 получена в гомогенном состоянии (степень очистки ~Ю00, выход около 4%). Ферментный препарат содержал обе формы в соотношении, равном исходному, и не содержал посторонних белков.

Молекулярная масса аланиндегидрогеназы равна 180 кДа. Показано, что исследуемый фермент обладает олигомерной структурой -состоит из четырех идентичных мономеров молекулярной массы 41 кДа. Впервые для аланиндегидрогеназ изучена четвертичная структура фермента методом электронной микроскопии. Показано, что идентичные мономеры в молекуле аланиндегидрогеназы из бактероидов к« 1ир1п1 расположены с диэдрической точечной группой симметрии 222 ( С2 ) по вершинам искаженного тетраэдра.

Изоэлектрическая точка аланиндегидрогеназы (5,05) свидетельствует о том, что фермент по этой характеристике не отличается от других ферментов ассимиляции аммиака у иыгоМит 1ирз.п1.

Аланиндегидрогеназа бактероидов 1ир1п1 1 в отличие от аланиндегидрогеназ из других объектов, обладает строгой специфичностью по отношению к субстратам и кофактору. Фермент не-> активен с ь-аспартатом, ь-глутаматом, 2-оксоглутаратом, ^акта том, оксалоацетатом, а также с иаорн.

Кинетика действия фермента характеризуется отрицательной неоперативностью, что может играть заметную роль в регуляции его активности. Ключевую роль в регуляции активности аланиндегидрогеназы играют субстраты (аммиак, пируват и аланин). В регуляции -синтеза исследуемого фермента также основная роль принадлежит субстратам.

Совокупность полученных в работе данных свидетельствует о том, что в азотфиксирующих бактероидах н. 1ир1п1 аланиндегидрогеназа играет определенную роль в ассимиляции аммиака и является, вероятно, основным ферментом синтеза аланиня.

Практическая значимость. Полученные в работе данные расгирпп1 и углубляют представления об азотном метаболизме азэ1фнкскрук%;;1х

корневых клубеньков люпина и об участии бактериального компонента симбиотической системы в ассимиляции аммиака, а также о связи ассимиляции аммиака и биосинтеза аминокислот с углеродным обменом. Полученные результаты мохут быть использованы при селекции клубеньковых бактерий и определении факторов, влияющих на продуктивность бобовых растений.

Апробация работы. Результаты работы докладывались: на У11 Всесоюзном Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Тбилиси,1983); на 16-й Конференции ФЕБО (Москва,1984); Всесоюзном симпозиуме "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе"(Пущина, 1985).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения , выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 5 таблиц. Список цитированной литературы включает 179 названий, в том числе 57 на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ'

Объект исследования. В настоящей работе был использован эффективный штамм ИМгоМиш 1ир1л1 359а, полученный из ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (Ленинград). Материалом для исследования служили бактероида, выделенные из клубеньков желтого люпина ( Ьир1пив 1игсиа Ь, ). Семена люпина перед посевом инокулировали эффективным штаммом В» 1ир1п1 359а, смачивая их суспензией клубеньковых бактерий. Сбор растений проводили в фазе бутонизации и начала цветения, когда на корнях растений были хорошо сформировавшиеся клубеньки. В этот период бактероида обладают наивысшей азотфиксирующей активностью / Шапошников и др.,1975 /.

Выделение бактероидов из корневых клубеньков люпина проводили по методу Бергерсена / Вегеегзеп, 1967 /.

Получение бесклеточных экстрактов.' Замороженные при -70е

бактероида разрушали в прессе типа Хьюза-Итона /Любимов.Львов, 1968/. Экстракцию осуществляли 0,05 М трис- НС1 буфером, рН 7,5, содержащим 10 мМ ЭДТА и 5 мМ 2-меркаптоэтанол. Центрифугированием при 20 ООО g в течение 40 мин. отделяли неразрушенные клетки и их остатки, а супернатант использовали в качестве исходного экстракта для очистки аланиндегидрогенази.

Клетки R. lupini 359а культивировали в течение 24-72 часов при температуре 28° на среде, содержащей экстракт из семян гороха, маннит, минеральные соли, тиамин и биотин. При изучении влияния источников азота на синтез аланиндегидрогеназы, из состава среда исключали гороховый экстракт, заменяя его единственным источником азота.

Метода исследования.

Аминирующую активность аланиндегидрогеназы определяли спек-трофотометрически по убыли поглощения реакционной смеси при 340 нм. Реакцию начинали добавлением препарата фермента в реакционную смесь, содержащую: 100 мМ трис- НС1 буфер, рН 8,2 , 100 мкМ NADH , I мМ пируват натрия и 100 М ira^ci . Молярный коэффициент экстинкции для nadh равен 6,22 • 10 см-1. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее окисление I мкМ nadh за I мин. Удельную активность выражали числом единиц активности,, приходящимся на I мг белка.

•Дезаминирующую активность аланиндегидрогеназы также определяли спектрофотометрически в реакционной смеси, содержащей: 100 мМ карбонат-бикарбонатный буфер,рН 10,5 , 10 мМ ь-аланин и I мМ NAD+.Реакцию начинали добавлением препарата фермента. За единицу дезаминирующей активности принимали количество фермента, катализирующее восстановление I мкМ nad+ за I мин.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Эресмана / Ehreamann et al., 1975 / И колориметрически ПО методу Хартри / Hartree, 1972 /.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили rio методу Дэвиса / Davia, 19&4 /.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецкл-сульфата натрия проводили по методу Лэммли / Laemmli, 1970 /.

Молекулярную массу аланиндегидрогеназы определяли методом

гельфилътрации через м Toyopearl HW-55 " и методом электрофореза в градиенте концентрации полиакриламидного геля /Остерман, 1981/.

Изоэлектрическую точку аланиндегидрогеназы определяли методом хроматофокусирования на полибуфере-ионообменнике ПБИ-94 (" Pharmacia Швеция) на колонке 2X20 см /Остерман,1985/.

Электронная микроскопия использована для изучения четвертичной структуры аланиндегидрогеназы. Этот раздел работы проводили совместно со старшим научным сотрудником лаборатории электронной микроскопии Института кристаллографии им.А.В.Шубников8 АН СССР, канд. физ.-мат. наук В.Л.Цупруном. Образцы перед исследованием негативно контрастировали 2% фосфорновольфрамовой кислотой. Микрофотографии получены на электронном микроскопе Philips ем 400 при увеличении 50 ООО и ускоряющем напряжении 80 kB. Обработку электронномикроскопических изображений проводили по методу Маркхэма /uarkham et ai., 1963 /. При обработке, изображений фермента на ЭВМ последние переснимались с увеличением на пленку и оцифровывались на автоматическом микроденситометре барабанного типа Optronics Р-ЮОО (США). Обработку изображений проводили на мини-ЭВМ NORD-100 (Норвегия). Усреднение изображений осуществляли на основе функции корреляции / Орлова,1984 /. Порядок симметрии вращения частиц определяли по Кроузеру и Амос /Crowther,Arnos, 1971 / с помощью комплекса программ ем group , составленного и адаптированного для ЭВМ ЕС 1040.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биосинтез аланина изолированными интактными бактероидами Л. lupini.

Известно, что основным фотоассимилятэм, поступающим из листьев в другие органы большинства высших растений, включая и бобовые, является сахароза / Курсанов,1976; Burley,1961; Merbach, Shilling,1980; Pate et al,,1979; Zimmerman, 1960 /. Из

корней растения сахароза попадает в клубеньки, а затем и в бактероида /Trinchan et al.,1981,1903; Trinchan,Rigaud,1979; Romanov et al., 1985 /. Около половины углерода, поступающего

в клубеньки , используется на связывание образующегося аммиака и возвращается в надземную часть растения в виде азотистых соединений, а остальная часть идет на энергообеспечение процесса азотфиксации, на рост и поддержание жизнедеятельности клеток обоих симбионтов /Imsand,198l; Pate et al., 1981 /.

Мы исследовали способность суспензии целых бактероидов R. lup-ini синтезировать аминокислоты из сахарозы и аммония. На рис.1 представлены результаты этих опытов, из которых видно, что бактероиды экскретируют в среду инкубации ряд аминокислот, среди которых значительно преобладает аланин. Алании обнаруживается в среде уже через 30 мин., тогда как другие аминокислоты -через 50-60 мин. Очевидно, что под действием бактероидов сахароза превращается в соответствующие метаболиты, которые используются на синтез аминокислот. Мы предположили, что аминокислоты

Рис.1 Образование аминокислот из сахарозы и аммония суспензией интактных бактероидов:

1 - аланин,

2 - аспарагиновая кислота,

3 - глутаминовая кислота,

4 - глицин

60

НО

могут образовываться из безазотистых предшественников их прямым аминярованием аммиаком. Действительно, при замене сахарозы кетокислотами в реакционной смеси обнаруживали соответствующие аминокислоты - аспарагиновую, глуташшовув, глицин, аланин. Синтез аланина усиливался при внесении в среду инкубации НАШ , что свидетельствовало о возможном участии в этом процессе ала-ииндегидрогйназы.

Выделение и очистка алаииндегиррогеназы из бактероидов R. luplnl.

Нами была разработана схема очистки рланюдагиярогенягш,

включающая ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефацеле, хроматографию на фенил-сефарозе, голубой сефарозе и гелъфильтра-цию через " Тоуореагх вд-55 Результаты очистки представлены в табл.1. Нам удалось получить очищенный почти в 1000 раз

Таблица I

Очистка аланиндегидрогеназы из бактероидов к» 1ир1Ш

Стадия Белок, Активность Степень Выход, %

очистки мг Общая, ед сдельная ед/мг белк£ очистки

Бесклеточный экстракт 1985,5 35,8 0,018 100

Высаливание 30-40$ насыщения 266,0 16,5 0,062 3 46

.Хроматография на ДЭАЭ-сефацеле 78,1 13,3 0,17 9 37

Хроматография на фенил-сефарозе 1,8 5,7 3,19 171 16

Хроматография на голубой се- 0,935 4,1 фарозе "ТоуореоП От-55п 0,071 1,2 4,43 17,52 246 973 II 4

препарат аланиндегидрогеназы с выходом около Этот препарат при электрофорезе в полиэкриламидиом геле давал две близко расположенные белковые полосы - основную и минорную, обладавшие ферментативной активностью еланиндегидрогена-'ы (рис.2). Содержание минорного компонента не превышало 10$ от эбп:ггэ

Рис.2 Электрофореграмма (А) и зимограмма (Б) высокоочищен-ного препарата аланиндегидрогеназы:

1 - основной компонент,

2 - минорный компонент

А Б

количества белка и активности. Мы полагаем, что клетки й. 1ир1п1 содержат множественные формы аланиндегидрогеназы. Следует отметить, что две Форш этого фермента были обнаружены и у я. ¿ароп!сша/ ¡5ипп,С1исаз, 197з/. Попытки разделения двух компонентов аланиндегидрогеназы не увенчались успехом, по-видимому, вследствие сходства их характеристик. В связи с этим, изучение свойств аланиндегидрогеназы проводили на препарате, содержащем два белковых компонента.

Физико-химические свойства аланиндегидрогеназы.

Молекулярную массу дативного фермента определяли методом гельфильтрации через " Тоуореаг1 да-55 " и методом электрофореза в градиенте концентрации полиакриламидного геля. Молекулярная масса аланиндегидрогеназы, определенная таким образом, равна 180 кДа. Высокое значение молекулярной массы фермента предполагает наличие у него четвертичной структуры, что было подтверждено данными электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. На электрофореграмме наблюдали одну окрашенную полосу, соответствующую молекулярной массе 41 кДа. На основании сопоставления молекулярных масс нативного и денатурированного фермента можно заключить, что молекула аланиндегидрогеназы состоит из четырех идентичных полипептиднюс цепей, т.е. является гомологичным тетрамером.

Вывод о том, что аланиндегидрогеиаза бактероидов й. 1ирШ1 является гомологичным тетрамером, можно сделать и на основании данных, полученных при электронномикроскопичеоком исследовании

- 12 -

фермента. На микрофотографиях (рис.3) видно, что молекула

'•■ _>[ VV*¿уц ^¡.и,..^-;, у-гVIчч>Ч'РЖ цц

' V ; ,.' -.Л.": '3 .

1- ' |Г''• ' $ /0В4Л

_ .... . . ...

1 ■ -

I

г.:,

.' 1 т - , г ;

кил' ''^К^^Г^ё^

50пт

Рис.3 Электронная микроскопия аланиндегидрогеназы из бактероидов л. 1цр1п1 : а,б - две характерные проекции молекулы. Модель молекулы в соответствующей ориентации показана в правой части рисунка.

аланиндегидрогеназы состоит из четырех мономеров, расположенных с точечной симметрией 222 ( °2 ) и имеет форму искаженного тетраэдра. Четвертичная структура аланиндегидрогеназы методом электронной микроскопии установлена впервые.

Изоэлектрическая точка аланиндегидрогеназы, определенная методом хрэматофокусирования, находится при рН 5,05.

Специфичность действия ч кинетические свойства аланнндегид-

- 13 -

рогеяазы из бактероидов R.lnpfni

Аланиндегидрогеназа бактероидов R. lupini проявляла строгую специфичность к субстрату реакции - L -аланину и кофактору - 1iadh . Высокоочищенный фермент был неактивен с L -аспарта- ■ том, L -глутаматом, оксалоацетатом, лактатом, 2-оксоглутаратом, не использовал в качестве кофактора iiadph . Описанные в литературе аланиндегидрогеназы из азотфиксируших объектов - А. су-lindrica / Rowell,Stewart, 1976/ И R. japonlcun / Uuller,Werner, 1982 / использовали в качестве субстрата также и оксало-ацетат.

Оптимум действия фермента в аминиругощей и дезаминирующей реакции был расположен при pH 8,2 и 10,5 , соответственно (рио.4).

Рис.4 Зависимость•активности аланиндегидрогеназы от pH в реакции аминирования (I) и дезаминирования (2)

Обращает внимание факт значительного преобладания скорости реакции аминирования, особенно при физиологических значениях рН.

Наличие у аланиндегидрогеназы из бактероидов й. 1ир1п1 эли-гэмерной структуры позволило предположить, что кинетика действия фермента может отличаться от классической кинетики Миха-элиса-Ментен, что могло бы играть заметную роль в регуляции этого фермента. Полученные данные свидетельствуют в пользу этого предположения. На рис.5 представлены данные по влиянию концентрации ионов эммония на скорость реакции аминирования при разных значениях рН. Концентрации пирувата и наш - оптимальные. Можно видеть, что насыщение фермента этим субстратом характеризуется отрицательной кинетической кооперативностью, что может играть физиологическое значение и указывать на ассимиля-торную роль этого фермента. Наименьшая Км(каж) для ионов аммония

10 (I

Рис.5 Зависимость активности аланиндегидрогеназы от концентрации ионов аммония при разных значениях рН: I - 6,75, 2 - 9,1 , 3 - 7,48 , 4-8,5 , 5 - 8,0. .

И.Т.мГГ

0,5 1,0

наблюдается при значениях рН, близких к оптимальному. Км(каж) при рН 8,0 изменяется от 0,1 до 2 кМ. Необходимо отметить, что аланиндегидрогеназа бактероидов и. iup3.nl имеет Км(каж) по аммонию наименьшую из всех изученных аланиндегидрогеназ, а также то, что этот фермент из азотфиксирукхцих микроорганизмов имеет Км(каж) по аммонию на порядок ниже, чем из неазот-фиксирующих. Этот факт может свидетельствовать о том, что фермент в условиях азотфиксации функционирует главным образом в направлении синтеза аланина и, возможно, играет определенную роль в ассимиляции образующегося при азотфиксации аммиака.

á» М.мМ

Рис.6 Зависимость аминирующей активности аланиндегидрогеназы от концентрации ионов аммония при разных концентрациях пирувата (А) и kadh (Б) при насыщающих концентрациях наш и пирувата, соответственно: I - [пируват}*.0,2 мМ, 2 - [гш-руват[ » I кМ, 3 - 20 мкМ, 4 -[hadh]«> 100 мкМ.

На рис.6 представлены данные но влиянию концентрации ионов аммония на аминирующую активность аланиндегидрогеназы при двух концентрациях субстрата и кофактора - насыщающей и ненасыщающей. Графики двойных обратных величин показывают, что во всех случаях насыщение фермента ионами аммония характеризуется отрицательной кинетической кооперативностью.

При анализе графика зависимости аминирующей активности фермента от концентрации пирувата (рис.7) можно видеть, что в этом случае имеет место ингибирэвание фермента избытком субстрата.

Рис.7 Зависимость аминирующей активности аланиндегидрогеназы от концентрации пирувата при насыщающей (I) и ненасыщающей (2) концен-

[ПтьяУ^нМ"* тРациях ионов аммония.

< I

Взаимодействие фермента с этим субстратом также характеризуется отрицательной кинетической кооперативностью. Км(каж) для насыщающей и ненасыщающей концентраций аммония изменяется в диапазоне от 0,05 до 0,3 мМ. Очевидно, что этот эффект может играть роль в регуляции активности аланиндегидрогеназы у я. 1ир1п1, Наличие отрицательной кооперативности при насыщении пируватом показано только для аланиндегидрогеназы из К. 1ир1п1 . Все другие аланиндегидрогеназы не обнаруживали кооперативных эффектов.

Рис.8 Зависимость аминирующей активности аланиндегидрогеназы от концентрации

____ на вн.

ЩЩупп^'

0,05

100 [УАЭН^МкМ

График зависимости аминирующей активности от концентрации КАШ! в координатах Лайнуивера-Берка представляет собой прямую (рис.8), что свидетельствует о том, что кривая насыщения

фермента nach имеет гиперболический вид. Км(каж) для наш у аланиндегидрогеиазы из бактероидов я; lupini сходна с этой константой для других аланиндегидрогеназ / Bellion,Tan,1987s Maller,Werner,1982; Muresem et al., 1983 /.

Рис. 9 Зависимость деза-минирующей активности от концентрации аланина.

20 ^°[Лаонин];ЛП

Кривая зависимости дезаыинигувдей активности фермента от концентрации аланина (рис.9) подчиняется классической кинетике Михаэлиса-Ментен, о чем свидетельствует график двойных обратных величин. При концентрации аланина выше 20 мМ наблюдается ингибирование фермента избытком субстрата. Характер насыщения аланиндегидрогеиазы из л» 1ир1п1 аланином не отличается от такового для аланиндегидрогеназ из других бактерий. ■

Рис.10 Зависимость деза-минирующей активности от

концентрации had

¿0 40 [д/ло^мИ*1

0,5 ^ Tva^J.MM

Анализ зависимости активности аланиндегидрогеиазы от концентрации ндр+ (рис.10) в координатах Лайнуивера-Берка выявил наличие отрицательной кинетической кооперативности, что, возможно, играет роль в рефляции этого фермента. Наличие отрицательной кооперативности при насыщении аланиндегидрогеиазы й. lupini HAD* не является, уникальным.- Оно показано и для аланиндегидрогеиазы из азотфикопрующей цианобактерии к. cyiindrica / Rorjell,Stewart, 1976 /.

Регуляция аланиндегидрогеназн из бактероидов и. iup3.nl.

Активность аланинлегидрогеназы в клетках я. 1шпп1 . выращенных в культуре на разных источниках азота. Клетки к.1ир1п1 выращивали на среде, содержащей в качестве единственного ис- • точника азота следующие соединения: I мМ нн^сь , 15 мГЛ мн4С1, I глМ пируват натрия + I мГЛ ;га^С1 , I мМ Ь-аланин ( в зависимости от варианта ). В качестве контроля использовали клет- ■ ки, выращенные на экстракте из семян гороха. Активность ала-ниндегидрогеназы определяли в экстрактах, полученных после разрушения клеток в прессе типа Хьюза-Итона. Результаты этих опытов представлены в табл.2.

Таблица 2

Активность аланиндегидрогеназн в клетках я. 1ир1п±, выращенных в культуре на разных источниках азота.

Источник азота

О

Активность (ед*10 / мг белка)

аминирующая дезаминирующая

1 контроль

2 I мМ ИЯ4С1

3 15 мМ нн4оь

4 I мМ пируват + I мм Ш14С1

5 I мМ аланин

30 ± 0,5 46 ± 0,6

33 ± 0,5 32 ± 0,5

36 * 0,7

2 ± 0,4 следы

1 ± 0,2

2 ± 0,3

7 ± 0,4

Из этих данных видно, что активность аланиндегидрогеназн в клетках к. iupi.nl , выращенных в культуре, зависела от источника азота. Максимальная активность наблюдалась на среде с I Ш хлористым аммонием. Аммоний в концентрации 15 мМ заметно

ингибировал активность фермента. Более или менее заметная деза-минирующая активность наблюдалась только при выращивании клеток на среде с I мМ аланином, но и в этом случае она была намного ниже аминирующей.

Рехуляция активности аланиндегидрогеназы. Нами показано, что аланин в концентрации I мМ ингибировал аминирующую активность фермента на 75$. Оксалоацетат не является субстратом исследуемой аланиндегидрогеназы, но ингибирует аминирующую активность фермента на 2Ъ% при концентрации 5 мМ, и на 85$ - при концентрации 8 мМ. На аминирующую активность фермента не оказывали влияния ь-глутамат, L-глутамин, L-аспартат, ъ -аспарагин, 2-оксоглутарат, amp, adp, atp, gtp.

Рассмотрение кинетических и регуляторных характеристик исследуемой аланиндегидрогеназы позволяет высказать предположение, что этот фермент в бактероидах R. lupini может принимать участие как в образовании аланина, так и в ассимиляции аммиака, образующегося при симбиотической аэотфиксации. В пользу этих предположений свидетельствует необычно малая величина Км(каж) по аммонию у аланиндегидрогеназы из бактероидов R. lupini , в то время как у аланиндегидрогеназ из других объектов Км(каж) по этому субстрату на порядок выше. Даже аланиндегидрогеназа из другой азотфиксирующей симбиотической бактерии R. japonicum имеет большую Км(каж) по аммонию (4,7-50 мМ). Необходимо отметить, что этот фермент, также как исследуемая нами аланиндегидрогеназа и аланиндегидрогеназа из азотфиксирующей цианобакте-рии A. cylindrica при насыщении ионами аммония проявляет отрицательную -кинетическую кооператшзность. По-видимому, это свойство присуще алашшдегидрогеназам из азотфиксирующих объектов и, вероятно, может указывать на участие этого фермента в ассимиляции аммиака, образующегося при аэотфиксации, В пользу предположения о преимущественно аминирующей роли аланиндегидрогеназы у исследуемого нами и других азотфиксирующих организмов свидетельствует расположение оптимума действия фермента в амини-руэдем направлении при более физиологических значениях рН, чем в дезаминирующем. О преимущественно аминирующей роли аланиидегид-

рэгеназы у азотфиксирующих организмов свидетельствует также значительное преобладание скорости реакции аминирования над дезаминированием. Данные о регуляции синтеза исследуемого фермента неоднозначны, но они скорее свидетельствуют об анаболической, чем о катаболической роли аланиндегидрогеиазы у R. lupini .

В заключение следует сказать, что является установленным фактом, что бактероиды R. lupini могут усваивать сахарозу и глюкозу / Романов,1987 /. Сахара используются не только как энергетические субстраты, но и как источники углерода для различных биосинтезов. Отсюда следует, что, вероятно, часть пи-рувата, образовавшегося в бактероидах в результате окислительной диссимиляции Сахаров, аминируется аланиндегидрогеназой с образованием аланина, который затем вовлекается в азотный метаболизм. Для синтеза аланина может использоваться аммиак, образующийся в бактероидах в результате азотфиксации.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что интактные бактероиды R. lupini из экзогенных аммиака и сахарозы.'синтезируют ряд аминокислот, среди которых значитёльно преобладает аланин. Синтез аланина бактероидами усиливается при замене сахарозы пируватом и внесении в среду инкубации наш , что свидетельствует о возможном участии в этом процессе аланиндегидрогеиазы (КФ I.4.I.I.).

2. Из азотфиксирующих бактероидов R. lupini выделена и очищена /v в 1000 раз аланиндегидрогеназа с выходом около 4%. Препарат содержит два белковых компонента, основной и минорный (менее 10%), обладающие ферментативной активностью аланиндегидрогеиазы, и является гомогенным по данным злектронномикро-скопическогэ исследования. Молекулярная масса аланиндегидрогеиазы равна 180 кДа. Фермент состоит из четырех идентичных мономеров молекулярной массы 41 кДа, которые, по данным электрон-номикроскопического исследования, расположены с точечной группой симметрии 222 ( d2) по вершинам искаженного тетраэдра.

Изоэлектрическая точка фермента равна 5,05.

3. Фермент проявляет стро1ую специфичность в отношении субстратов и кофактора как в прямой, так и в обратной реакции. Он неактивен с оксалоацетатом, 2-оксоглутаратом, лактатом, L -ас-партатом, L-глутаматом и kadph.

4. Оптимум действия аланиндегидрогеназы в аминирующем и де-заминирующем направлении расположен при рН 8,2 и 10,5 , соответственно. При оптимальных значениях рН аминируюцая активность была выше дезаминируюцей в 4 раза, а при рН 8,0 - в 17 раз.

Кинетика действия аланиндегидрогеназы характеризуется наличием отрицательной кооперативности, что может млеть значение для регуляции активности этого фермента.

5; В регуляции активности аланиндегидрогеназы существенную роль играют субстраты и оксалоац.;тат.

6. Синтез аланиндегидрогеназы в клетках R. lupini , выращенных в культуре, регулируется источником азота в среде. Максимальная активность фермента наблюдается на среде, содержащей в качестве единственного источника азота I ыМ îiH^ci.

7. Совокупность полученных в работе данных свидетельствует

о том, что в бактероидах R. lupini алашшдегидрогеназа работает главным образом в направлении синтеза аланина, и этот процесс, по-видимому, играет определенную роль в ассимиляции бактероидами образующегося при азотфиксации аммиака.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Кретович В.Л..Карякина Т.И., Казакова О.В., Калошина Г.С., Шапошников Г.Л. Биосинтез аланина и аспарагивовой кислоты из сахарозы и аммония бактероидами Rhizobium lupini // Докл. АН СССР. - 1982. - Т.263,if I. - С.215-217.

2. Кретович В.Л.,Карякина Т.И., Казакова О.В., Сидельникава Л,И. Биосинтез аминокислот из метаболитов цикла Кребса бактероидами Rhizobium lupini // Докл.АН СССР. - 1982. - Т.266,

JS 6. - C.I504-I508.

3. Krctovich W.L.,Kariakina T.I..Kazakova O.V..Sidelnikova L.I., Kaloehina G.S.,Shapoahnikov O.L. Biosynthesis of amino acids from sucrose and.Kroba cycle metabolites by Rhizobium lupini bacteroide // Molecular and Cellular Biochemistry.- 1933,-Vol. 51, Kù 1,- P. 61-66.

4. Карякина Т.И..Сидельникова Л.И..Иванушкин А.Г..Казакова О.В., Вейнова U.R. Биосинтез аминокислот бактероидами Ehlaobium

lupini Тезисы докладов 16-й Конференции ФЕБО// М.: Наука. - 1984. - С.237.

5. Казакова О.В.,Карякина Т.И. Роль фотоассимилятов в биосинтезе аминокислот в клубеньках желтого люпина. - Тезисы до- . кладов Всесоюзной конференции "Связь метаболизма углерода

и азота при фотосинтезе" // Пущина: НЦБИ АН СССР. - 1985, -С.39.

6. Кретович В.Л..Казакова О.В.,Сварадж К., Карякина Т.И. Роль бактероидов в ассимиляции аммония, образующегося при симби-отической азотфиксации // Прикл. биохим. и микробиол. -1986. - Т.22,В 3. - С.382-385.

7. Казакова О.В.,Цупрун В.Л..Иванушкин А.Г..Кафтанова A.C., Пушкин A.B.,Кретович В.Л. Четвертичная структура и кинети-

• ческие Характеристики алаюшдегидрогеназы из бактероидов Khizobiusa lupini // Докл. АН СССР. - 1988. - Т.ЗОО,^ 2.

8. Казакова 0.В..Иванушкин А.Г,»Цупрун В.Л..Кафтанова A.C., Пушкин A.B..Кретович В.Л. Очистка, структура, свойства и регуляция .алашшдегидрогеназы из бактероидов EMzoblum lupini// Биохимия. - 1988. - Т.53, Ii II.

Т- 02501 От 21.04.88г." Заказ 1 4 2 4 Тираж 100 Формат 80x84/16 Ротапринт типографии ВАСХНИЛ Москва, Б.Харнтоаьевский пер,^ 21