Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция биосинтеза противогрибкового антибиотика имбрицина и механизм его действия на грибы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция биосинтеза противогрибкового антибиотика имбрицина и механизм его действия на грибы"

г 05

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ _ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ_

На правах рукописи

СУХАРЕВИЧ

Марина Эдуардовна

РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ПРОТИВОГРИБКОВОГО АНТИБИОТИКА ИМБРИЦИНА И МЕХАНИЗМ ЕГО ДЕЙСТВИЯ

НА ГРИБЫ

03.00.07 —микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

на правах рукописи

СУХАРЕВИЧ Марина Эдуардовна

Регуляция биосинтеза противогрибкового антибиотика имбрицина и механизм его действия на грибы

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии

Научный руководитель:

доктор биологических наук Е.П .Яковлева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.А.Заикина

кандидат биологических наук Е.Б Львова

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский Государственный Технологический Институт (Технический университет).

Защита состоится 1997 г в часов на

заседании специализированного совета K084.63.0t при СПХФА (197376, Санкт-Петербург, ул. проф.Попова ,14).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке СПХФА

Автореферат разослан 19?7г.

Ученый секретарь специализированного й^ета^

кандидат биологических наук /*— ^-^ ~^~"Т5.В.Кириллова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Антибиотики - большой класс природных соединений, обладающих высокой биологической активностью и специфичностью действия. Несмотря на то, что к настоящему времени известно значительное количество (более 6000) антибиотиков и их химических производных, потребность в этих веществах постоянно возрастает. Они широко используются не только в медицине и ветеринарии как химиотерапевтические средства, но и в других областях практической деятельности - в растениеводстве , в пищевой и консервной промышленности для создания рациональных способов хранения пищевых продуктов, для борьбы с биоповреждениями различных материалов.

Этим и обусловлено активное проведение исследований не только по изысканию новых, но и по интенсификации и совершенствованию способов получения известных антибиотиков.

Особенно высока потребность в противогрибковых антибиотиках, так как в количественном отношении они составляют незначительную часть от общего числа известных антибиотиков, а области их возможного применения постоянно расширяются.

Обособленную и наименее изученную группу противогрибковых антибиотиков представляют собой неполиеновые макролиды, спектр биологического действия которых несколько шире, чем у более распространенных и хорошо изученных полиеновых макролидов.

К этой группе антибиотиков относится имбрицин, который не является лечебным препаратом, а такие свойства как стабильность, высокая биологическая активность, широкий спектр действия и низкая токсичность позволяют отнести его к числу перспективных противогрибковых препаратов для использования в различных областях хозяйства.

В настоящее время имбрицин получают с использованием продуцента со сравнительно низкой активностью. Мало изучены способы регуляции его биосинтеза, также неясным остается механизм действия этого антибиотика , в связи с чем исследования в этом направлении являются актуальными.

Цель исследования. Цель настоящей работы состояла в интенсификации процесса биосинтеза имбрицина, основанной на получении и использовании активного продуцента, оптимизации условий его культивирования, в изучении механизма противогрибкового действия имбрицина.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели предусмотрено решение следующих задач:

1. Изучить естественную и индуцированную изменчивость продуцента и отобрать наиболее активный и стабильный вариант по признаку антибиотикообразования.

2. Оптимизировать такие условия культивирования продуцента как интенсивность аэрации и уровень окислительно-восстановительного потенциала среды, состав ферментационной среды.

3. Исследовать влияние ионов натрия на проницаемость клеток продуцента и на процесс выделения антибиотика из биомассы.

4. Определить возможный механизм действия имбрицина на мицелиальные грибы.

5. Изучить возможность использования имбрицина для защиты целшолозосодержащих материалов (бумаги разных видов) от микоповреждений.

Научная новизна исследования.

Методом ступенчатого отбора выделен вариант продуцента имбрицина,биосинтетическая активность которого на 35% выше активности исходного штамма и характеризующийся более высокой скоростью роста.

Изучена зависимость процесса биосинтеза имбрицина от аэрации и уровня редокс-потенциала среды. Показано, что активный синтез имбрицина происходит при интенсивной аэрации и определенном уровне редокс-потенциала. С помощью редокс-потенциала среды можно направленно регулировать процесс антибиотикообразования: в условиях лимита по кислороду повышение уровня этого фактора окислителями стимулирует, а снижение восстановителями - ингибирует процесс. В условиях интенсивной аэрации наблюдается обратная зависимость.

Показано, что имбрицин оказывает значительное влияние на цитологические, морфолого-культуральные и физиологические признаки микромицетов - деструкторов целлюлозы; выявлено свойство имбрицина влиять на процесс пеллетообразования мицелиальных грибов при глубинном способе их культивирования - в присутствии имбрицина образуются более мелкие и очень плотные пеллеты.

Установлено, что одним из механизмов ингибирующего действия имбрицина на микромицеты является увеличение проницаемости их клеточных мембран, в результате чего происходит "утечка" из клеток таких жизненноважных метаболитов как аминокислоты, белки, нуклеотиды, ионы калия.

Впервые показано, что для защиты целшолозосодержащих материалов (бумаги) от микоповреждений может быть использован противогрибковый антибиотик имбрицин, превосходящий по основным показателям многие вещества, используемые для этих целей.

Практическая значимость работы. Выделен вариант продуцента имбрицина, превосходящий по активности и скорости роста исходный штамм, использование которого позволит повысить эффективность процесса биосинтеза и сократить его продолжительность на 1 -1,5 суток.

Предложен упрощенный состав ферментационной среды, на которой культивирование продуцента не сопровождается значительным повышением рН, вызывающим инактивацию антибиотика.

Разработан способ интенсификации биосинтеза имбрицина путем регуляции редокс-потенциала среды. При снижении редокс-потенциала восстановителями в условиях эффективной аэрации (2,9 г О2Л1/4) возможно увеличить выход антибиотика на 40%, а в условиях менее эффективной аэрации существенная интенсификация его биосинтеза достигается при повышении редокс-потенциала окислителями.

Установлено, что более полная экстракция имбрицина из биомассы продуцента органическими растворителями происходит при добавлении к биомассе солей натрия.

Показано, что имбрицин является высокоэффективным биоцидом для борьбы с микоповреждениями целлюлозосодержащих материалов - бумаги различных видов. Испытания имбрицина как биоцида проведены в мастерской реставрации графических произведений АООТ "Реставратор" (Санкт-Петербург), получено заключение о перспективности применения имбрицина для защиты от микоповреждений различных материалов на бумажной основе, в том числе и гравюр.

Апробация работы. Результаты исследований обсуждены на заседаниях сотрудников кафедры биотехнологии СПХФА, доложены на 4-й Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург,21-25 мая 1996 г.), на Международном конгрессе студентов, аспирантов и молодых ученых "Молодежь и наука - третье тысячелетие" (Москва, 28 января - 4 февраля 1996г).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи и тезисы.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 36 рисунков, 7 фотографий. Библиография включает 217 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объект исследования. Исследования проводили с культурой Эиер^тпусез ¡тЬпсаШБ штамм ЛИА 0112/90 - продуцентом

противогрибкового антибиотика имбрицина из коллекции ВНИТИАФ.

Изучение изменчивости штамма. Естественную изменчивость изучали по общепринятой методике В.Д .Кузнецова, индуцированную -вышеуказанным методом после воздействия на споры продуцента УФ-лучей в дозах 48,39 Дж/м2, 96,78 Дж/м2 , 161,ЗДж/м2 и химического мутагена N-нитрозо-М-метилбиурета в концентрации 0,05 %.

Содержание имбрицина в культуралыгой жидкости определяли спектрофотометрическим методом, биологическую активность -методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Candida utilis ЛИА 01. В качестве рабочего стандарта использовали очищенный препарат имбрицина Пензенского АО "Биосинтез" с активностью 830 ЕД/мг.

Оптимизацию состава ферментационной среды для культивирования продуцента проводили методом планирования эксперимента по схеме ортогональных латинских прямоугольников по 4-м факторам на 4-х уровнях.

Измерение окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) сред и культуральных жидкостей проводили гладким платиновым электродом ЭВП-1 и вспомогательным хлорсеребряным электродом ЭВЛ-1МЗ на потенциометре рН-673 и выражали в мВ. Регуляцию уровней ОВП ферментационной среды проводили с помощью различных окислителей (КзРМСЫ)«], К2СГ2О7, КМ11О4) и восстановителей (аскорбиновая кислота, L-тирозин, К4 [Fe(CN)$] ). Различные уровни аэрации создавали варьированием объема среды в колбах от 30 до 200 мл, скорость сорбции кислорода оценивали по сульфитному числу.

Механизм действия имбрицина на морфологические и физиологические признаки грибов изучали с использованием микромицетов: Aspergillus niger var.Tieghem, A. terreus Thom, A. flavus Link, Penicillium funiculosum Thom, P. ochrochloron Biourge, Trichoderma viride Persoon Fries, Paecilomyces variotii Bainier, Chaetoniuin globosum Kunze. Культивировали грибы в поверхностных и глубинных условиях на среде Чапека с 1% глюкозы, в которую вносили имбрицин в различных концентрациях. При росте грибов в поверхностных условиях через 7,14,28 суток определяли диаметр колоний и рассчитывали степень угнетения роста(%). При глубинном культивировании действие имбрицина на грибы оценивали по приросту биомассы.

Изучение морфологии грибов проводили просвечивающим и сканирующим методами электронной микроскопии. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB - 8800, окраску срезов проводили по методу Рейнольдса уранилацетатом и цитратом свинца. Препараты исследовали в электронном микроскопе JEM-100C (Япония) при

ускоряющем напряжении 80 кВ. Сканирующую микроскопию проводили с использованием микроскопа 13М- 35(Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Для определения количества полисахаридов в культуральной жидкости ее предварительно центрифугировали при 5000 об/мин для отделения биомассы, а из супернатанта 4-х кратным объемом этанола осаждали полисахариды, высушивали до постоянного веса при 80° С. Полисахариды, связанные с клетками, определяли по количеству редуцирующих веществ (РВ), образующихся при кислотном г идролизе биомассы(мкг РВ/г а.с.б.).

Об изменении уровня проницаемости грибных клеток судили по "утечке" в среду метаболитов: аминокислот- методом тонкослойной хроматографии на пластинках "ЗНиГо!"; ионов калия - фотометрически на плазменном фотометре ПАЖ-3; ультрафиолетпоглощающих веществ - спектрофогометрически на СФ - 46.

Изучение действия имбрицина на физиологическую активность грибов. Суммарную активность дегидрогеназ определяли с использованием 2,3,5-ТТХ; активность комплекса целлюлолитических ферментов - методом Мадельс-Вебера, количество РВ - методом Самоджи-Нельсона; прирост биомассы - по количеству белка в твердой фазе культуральной жидкости методом Лоури.

Процесс киелотообразования у грибов контролировали потенциометрически. Скорость киелотообразования выражали в условных единицах Д рН/ Д1, где I - время инкубации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спонтанная и индуцированная изменчивость продуцента имбрицина. В настоящей работе представлены результаты исследований изменчивости продуцента имбрицина БСгерСотусез ипЬпсаИв штамм ЛИА 0112/90 с целью отбора более активного варианта, проведенные с использованием 7 агаризованных сред: среда Чапека с крахмалом, глицерин-аспарагиновый агар, среда СР I, крахмало-аммиачный агар, минеральная среда Гаузе 1, картофельный агар и среда с кукурузным экстрактом и крахмалом.

При рассеве споровой суспензии штамма на вышеуказанные среды было установлено, что морфологическая изменчивость культуры крайне незначительна - на всех средах наблюдали однотипные колонии, как правило, без воздушного мицелия, с шелушащейся поверхностью, различающиеся иногда лишь по размеру. В связи с этим интенсивность спонтанной изменчивости изучали по физиологическому признаку - активности биосинтеза антибиотика.

Результаты проверки 250 выделенных вариантов исходного штамма показали, что наибольший размах изменчивости штамма по этому признаку наблюдается на среде с кукурузным экстрактом и

крахмалом (табл. 1), которая и была выбрана для поддерживающей селекции штамма.

Таблица 1

Изменчивость признака антибиотикообразования у штамма ЭИерШтусев ¡тЬпсаШз ЛИА 0112/90 при росте на различных средах

Наименование агаризованных сред Активность колоний, в % к контролю Квацратичес-кое отклонение, а Коэффициент вариации, в%

диапазон варьирования средняя

Чапека с крахмалом 48 - 128 94,3± 4,4 ±23,5 24,9

Глицерин- аспарагиновый агар 44-117 69,2±3,6 ±17,8 25,7

СР1 50-134 72, Ш ,7 ±19,5 27,0

Крахи ало-аммиачный агар 47 - 130 90,7±3,7 ±20,0 22,0

С кукурузным экстрактом и крахмалом 7-146 70,0±5,3 ±30,4 43,4

Картофельный агар 12 - 126 81,0±4,9 ±27,3 33,0

Минеральная Гаузе 1 45- 134 84,3±4,1 ±21,9 24,3

Однако, все отобранные варианты, антибиотическая активность которых превышала активность исходной культуры более, чем на 20%, оказались нестабильными - после 2-3 генераций наблюдалось падение активности до контрольного уровня (2000 мкг/мл).

В связи с этим были проведены исследования по изучению индуцированной изменчивости штамма ЛИА 0112/90.

Для индукции изменчивости были использованы УФ-лучи и химический мутаген И-нитрозо - N метилбиурет. Результаты изучения ИЗ вариантов штамма, выделенных после обработки спор продуцента УФ-лучами, представлены в таблице 2.

Как следует из полученных данных, под действием УФ-лучей достоверно увеличивается разнонаправленная изменчивость, при этом размах изменчивости зависит от дозы облучения. Показано, что количество вариантов, превышающих по активности исходный, сначала возрастает с увеличением дозы мутагена, а при дальнейшем увеличении дозы - снижается.

Таблица 2

Изменчивость признака анагибиотикообразования

под действием УФ-лучей у штамма Л ИА 0122/90_

Доза, Дж/м2 Количество проверенных вариантов Активность колоний, °Л к контролю Квадрати- ческое отклонение Коэффициент вариации, в%

Диапазон варьирована Средняя

Контроль 27 10-148 77,4 ±5,9 ±30,9 39,9

48,39 23 25-160 79,6+5,8 +28,8 36,2

96,78 53 36-240 141,0±6,8 +49,2 36,6

161,3 37 56-188 110,5+5,7 +33,2 32,8

Из культур, полученных при обработке спор УФ-лучами в дозе 96,78 Дж/м2, был отобран вариант 13М, антибиотическая активность которого не снижалась при нескольких повторных проверках и составляла 2300+100 мкг/мл, что на 15% превышает активность контрольного варианта.

С целью дальнейшего увеличения диапазона вариабельности продуцента по изучаемому признаку суспензия спор варианта 13М была подвергнута обработке химическим мутагеном, что позволило выявить небольшое число вариантов, активность которых незначительно превышала контрольную (рисЛ). Среди них как наиболее активный выделен вариант 9М, антибиотическая активность которого составила 2700+100 мкг/мл, т.е. 135+5% от таковой штамма ЛИ А 0112/90.

40 _

35 ■■ „„__„„

30..

25 ■■

20 ■■

15 ■■

10-■

0-20 20-40 4М0 60«) 80-100 100-120 120-140 140-160

Рис.1 Размах изменчивости по признаку антибиотикообразования у варианта 13М при обработке его >1-нитрозо-Ы-метилбиурегом по оси абсцисс - антибиотическая активность вариантов (% к контролю) по оси ординат - количество вариантов (% от общего числа)

Сопоставительное изучение морфолого-культуральных и физиологических признаков варианта 9М и исходного штамма показало, что выявленные между ними различия касаются главным

образом физиологических признаков - вариант 9М обладает большей скоростью роста и повышенной активностью синтеза имбрицина: максимум активности достигается на 3-4 сутки ферментации, а не на 45 как в случае исходного штамма (рис.2).Полученный вариант 9М стабилен, не снижает активности в течение 6-7 пассажей и 12 месяцев хранения при +4°С

Таким образом, в результате изучения естественной и индуцированной изменчивости штамма ЛИА 0112/90 был выделен новый, более активный вариант 9М, отличающийся от исходного некоторыми культуральными признаками - более высокой скоростью роста и более высокой антибиотической активностью.

в-1 I-1-1-1 I-1 I

0 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 120 ч 144 ч

Рис.2 Динамика процесса синтеза имбрицина вариантом 9М по оси абсцисс - продолжительность ферментации, час по оси ординат - активность, мкг/мл

Для варианта 9М проведена оптимизация ферментационной среды. Оптимизированная среда отличается от исходной отсутствием мела и значительно более низким значением рН до ее стерилизации.

Влияние аэрации и редокс-потенци ал а на биосинтез имбрицина. Биосинтез имбрицина осуществляется на высококонцентрированной, вязкой среде, поэтому для интенсификации процесса обеспечение среды кислородом приобретает особую важность. Как показали исследования, интенсивность аэрации оказывает значительное влияние на процесс биосинтеза имбрицина (рис.3).

Наибольшее количество антибиотика образуется при максимальном из исследуемых уровней аэрации - 2,9 г О2/л/ч, при наименьшей аэрации - 0,5 г Ог/л/ч выход антибиотика составляет только 15% от максимального. Снижение интенсивности аэрации приводит к увеличению продолжительности процесса .

В зависимости от интенсивности аэрации в среде создаются различные уровни редокс-потенциала - чем выше скорость растворения кислорода, тем выше редокс-потенциал. Следовательно, эффект от действия аэрации на биосинтез имбрицина обусловлен двумя взаимосвязанными факторами - аэрацией и редокс-потенциалом.

—О—Исходный штамн —р—Вариант 9М

3000

2000

2500

—£3—2 —¿—3 —X -4 —Ж—5

1500

1000

500

О'

0 1 2 3 4 5 6 7

Рис.3 Динамика процессов биосинтеза имбрицина при культивировании продуцента в условиях, различающихся по интенсивности аэрации среды (г 02/л/ч): 1-2,9; 2- 1,7; 3 - 0,9; 4 - 0,7; 5 - 0,5.

С целью оценки роли каждого из факторов в отдельности эксперименты проводили при определенном и постоянном уровне аэрации, но при различных значениях редокс-потенциала.

Установлено,что в условиях максимальной аэрации (2,9 rOz/л/ч) повышение редокс-потенциала на 50-100 мВ (т.е.до 550-600 мВ) ингибирует процесс биосинтеза на 10-40% в зависимости от уровня редокс-потенциала, а снижение на 70-100 мВ увеличивает выход имбрицина на 30-50% (рис.4).

При более низкой интенсивности аэрации (1,7 Юг/л/ч) и, соответственно, более низком редокс-потенциале среды, внесение окислителей и повышение уровня редокс-потенциала на 80-100 мВ (с 380 до 480 мВ) приводит к тому, что антибиотика образуется на 50% больше, чем в контроле, т.е. практически столько же, сколько и при максимальной аэрации - 2600 мкт/мл. Напротив, снижение уровня этого фактора на 100-120 мВ восстановителями сопровождается снижением концентрации антибиотика .

Аналогичная зависимость процесса биосинтеза имбрицина от редокс-потенциала среды наблюдается и при более низких уровнях аэрации - 0,9 - 0,7 - 0,5 г Ог/л/ч. Однако, следует отметить различия в величине эффектов от действия этого фактора. В этих вариантах резко усиливается ингибирующий эффект от действия восстановителей и снижается стимулирующий эффект от действия окислителей. Очевидно, что в этих условиях фактором, ограничивающим процесс, является лимит по кислороду (табл.4).

А Б В Г Д Е

Рис.4 Влияние окислителей и восстановителей на биосинтез имбрицина при культивировании продуцента на регламентной среде при интенсивности аэрации 2,9 г Ог/л/ч: К - контроль (2650 икг/мл), принят за 100%; А - КзРге(СГЫ)б] С/о): 1 - 0,05; 2 - 0,1; 3 - ОД; Б - К2СГ2О7 (%): 1 - 0,05; 2 - 0,1; 3 - ОД; В - КМпО< (%): 1 - 0,0005; 2 - 0,001; 3 - 0,005; Г - K4Fe(CN)6](%): 1 -0,1; 2-ОД; Д - аскорбиновая кислота (%): 1 - 0,1; 2 - ОД Е - Na2S205 (%): 1-0,1; 2 - ОД

Таблица 4

Зависимость биосинтеза имбрицина от интенсивности аэрации и уровня редокс-потенциала ферментационной среды

Интенсивность аэра-ции.гОг/л/ч (сл.) Контрольная среда Среда с окислителем Средас восстановителем

ЕЬ,мВ Ямбрицин %к контролю* Eh,MB Имбрицин, % к контролю* Eh,MB Имбрицин, °/о К контролю*

2,9 500 100 580 83 400 140

1,7 390 62 480 93 300 46

0,9 320 26 490 50 200 18

0,7 300 19 430 23 175 8

0,5 270 15 460 21 - :

*Контроль - концентрация имбрицина при аэрации 2,9 гОг/л/ч -100

Анализ полученных результатов показал, что при эффективной аэрации (2,9 и 1,7 г Ог/л/ч) наиболее близкий к оптимуму уровень редокс-потенциала находится в области 340-400 мВ при исходных

значениях 400-480 мВ. При соблюдении этого условия количество имбрицина в культуральной жидкости при максимальной аэрации увеличивается на 45% и достигает 4000 мкг/мл, а при аэрации 1,7 г Ог/л/ч - на 50% ( 2600 мкг/мл).

С целью определения характера воздействия этого фактора на прирост биомассы продуцента, аналогичные эксперименты были проведены на синтетической среде Чапека с глюкозой при аэрации 1,7 г Ог/л/ч.

Показано, что при повышении редокс-потенциала количество образуемой биомассы снижается на 15%, в то время как при снижении потенциала прирост биомассы такой же, как в контроле, что позволяет предположить, что и на регламентной среде интенсификация биосинтеза имбрицина с помощью окислителей обусловлена не увеличением количества образуемой биомассы, а повышением ее продуктивности.

Регуляция редокс-потенциала на разных стадиях процесса культивирования. Результатами, представленными выше, показано, что редокс-потенциал ферментационной среды оказывает значительное влияние на биосинтез имбрицина. Очевидно, что регуляция его уровня и на других стадиях также повлияет на этот процесс. Для изучения этого вопроса уровень редокс-потенциала варьировали на каждой из стадий процесса в отдельности, а также и на всех трех стадиях : подготовки поверхностного и глубинного посевного, стадии ферментации.

Из полученных результатов следует, что при использовании в качестве посевного непосредственно кулмуры, выращенной на агаризованной среде с окислителями, активность биосинтеза антибиотика возрастает только при аэрации 1,7 - 0,9 г Ог/л/ч, а при 2,9 г Ог/л/ч появляется тенденция к ее снижению. В случае использования продуцента, выращенного в присутствии восстановителя, наблюдается обратная зависимость. Во всех вариантах (по уровню аэрации) регуляция редокс-потенциала среды на стадии выращивания глубинного посевного как окислителями, так и восстановителями, практически не оказывает влияния на конечный результат процесса. Наибольший уровень эффектов, как положительных, так и отрицательных, достигается регуляцией уровня ОВП ферментационной среды.

Таким образом, редокс-потенциал является важнейшим фактором среды, с помощью которого можно направленно регулировать биосинтез имбрицина, осуществлять контроль за ходом процесса в целом, за интенсивностью аэрации среды. Наибольшая степень воздействия этого фактора на синтез целевого метаболита достигается при регуляции его уровня на стадии ферментации.

Влияние солей натрия на биосинтез имбрицина и его экстракцию из биомассы. При изучении влияния редокс-потенциала на биосинтез имбрицина было замечено,что внесение в ферментационную среду гипосульфита натрия как восстановителя приводит к существенному увеличению количества образуемого имбрицина при всех уровнях аэрации, из чего следует, что механизм действия гипосульфита натрия заключается не только в его свойстве снижать редокс-потенциал.

Учитывая, что имбрицин имеет внутриклеточную локализацию, а также данные литературы о свойстве ионов натрия увеличивать клеточную проницаемость , были проведены исследования действия различных солей натрия - N828203, ИагСОз, КагНРО« на

процессы биосинтеза антибиотика и экскрецию его в среду. Концентрации ионов натрия варьировали в пределах 2,5-4,0 г/л.

Результаты наблюдений показали, что внесение любой из 4-х названных солей в концентрации 3,2 г/л (по натрию) приводит к увеличению концентрации антибиотика в культуральной жидкости, что по-видимому, обусловлено влиянием ионов натрия на проницаемость внешней клеточной мембраны и повышением метаболитической активности продуцента. Предположение о повышении проницаемости клеток под действием солей натрия подтверждается изменением характера распределения антибиотика между биомассой и нативным раствором в опытных вариантах (с добавлением солей натрия) - увеличивается относительное содержание имбрицина в нативном растворе.

Свойство натрия влиять на экскрецию антибиотика, очевидно, может быть использовано для повышения эффективности процесса выделения его из биомассы.

С этой целью к биомассе продуцента, выращенной на контрольной среде , добавляли соли натрия в виде водных растворов и выдерживали при комнатной температуре и периодическом перемешивании в течение 1,5-2 ч. Затем проводили экстракцию имбрицина 65%-ным раствором изопропанола в течение 40 мин.(табл.5).

Как следует из данных таблицы, в опытных вариантах уже после первой экстракции выход антибиотика на единицу веса биомассы такой, какой достигается в контрольном варианте только после 3-х последовательных экстракций, а в некоторых случаях и превышает его. В опытных вариантах выделение антибиотика завершается после второй стадии экстракции, при этом суммарное количество на 10-20% превышает количество, выделяемое в контрольном варианте.

Определение степени клеточной проницаемости у продуцента при инкубации биомассы в водной среде, содержащей соли натрия, показало, что в присутствии солей она увеличивается, и тем больше, чем продолжительнее их воздействие.

Таблица 5

Степень экстракции имбрицина из биомассы продуцента

в присутствии солей натрия (контроль - без солей)_

Соли натрия Имбрицин

I экстракция II экстракция III экстракция 21 +11 +III экстракция

мкг/г* % к контролю мкг/г % к контролю мкг/г мкг/г % к контролю

Контроль 9 300 100 1 080 100 540 10 920 100

ша 10 350 111 1 110 100 550 12 000 110

ИагНРОд 11 550 124 850 62 50 12 450 114

ИагЭгОз 12 560 135 540 65 - 13 100 120

* • мкг имбрицина / г влажной биомассы

Представленные результаты в значительной степени являются предварительными, однако, свидетельствуют о возможности оптимизировать процесс выделения имбрицина из биомассы с использованием солей натрия.

Механизм ингибирующего действия имбрицина на микромидеты

Влияние имбрицина на рост грибов в поверхностных и глубинных условиях. Результаты наблюдений, полученные при выращивании грибов на средах с имбрицином, показали его высокую антифунгальную активность. При глубинном культивировании грибов в присутствии имбрицина в концентрации 5,0 мкг/мл выход биомассы снижается на 40-65% в зависимости от их видовой принадлежности, при этом проявляется тенденция к увеличению длительности процесса (рис.6)

При культивировании микромицетов в поверхностных условиях происходило подавление роста колоний на 20-55 % при концентрации имбрицина равной 10 мкг/мл. При этом наблюдалось изменение культуральных признаков грибов, а именно: у всех культур образуются плотные компактные колонии в отличии от более плоских в контроле, резко усиливается пигментация, изменяется характер окраски. Усиление пигментации отмечается и при глубинном культивировании, что, вероятно, является проявлением защитной реакции грибов на действие антибиотика.

Сканирующая электронная микроскопия выявила у всех культур микромицетов сходные изменения в морфологии. В присутствии имбрицина длина клеток значительно уменьшается - от нескольких десятков микрометров в контроле до нескольких микрометров в

опыте. Клетки приобретают неправильную форму, становятся полиморфными, часто искривленными.

При исследовании ультратонких срезов выявлено, что в цитоплазме клеток, выросших на среде с имбрицином, содержится значительно больше митохондрий, чем в контрольных. Возможно, это связано с усиленным образованием энергии, необходимой для репарации клеточных повреждений, а также со свойством митохондрий контролировать процессы адаптации, устойчивости к антибиотикам.

Еионасса. г/п [а.с.в.]

Продолжительность культивирования, сут

Рис.6. Динамика прироста биомассы микромицетов на среде с имбрицином и без него. А - Р. осктосЫогоп; Б - А. геттеиъ. 1 - среда без имбрицина (контроль); 2 - среда с имбрицином - 2,5 мкг/мл; 3 - среда с имбрицином - 5 мкг/мл.

Значительные изменения наблюдаются в поверхностных структурах клеток. Методом сканирующей микроскопии показано, что на среде с имбрицином гифы в большей степени, чем выросшие на контрольной среде, покрыты "бородавчатыми" образованиями, количество и размеры которых увеличиваются с увеличением концентрации антибиотика. Методом просвечивающей микроскопии выявлено,что в этом случае клетки покрыты толстым аморфным слоем, непрочно связанным с клеткой, и, очевидно, представлены веществами полисахаридной природы. При определении количества полисахаридов в нативном растворе и биомассе грибов установлено, что их содержание резко увеличивается (в 2-7 раз, в зависимости от культуры) и , главным образом, в нативном растворе. Поскольку

одной из многих функций, которые выполняют полисахариды клеточных стенок, является защитная, можно предположить, что усиленный их синтез под действием имбрицина является защитной реакцией грибов на присутствие в среде фунгицида.

Влияние имбрицина на некоторые физиологические признаки грибов. Действие имбрицина на физиологическую активность грибов оценивали по активности дегидрогеназ, целлюлаз и кислотообразованию. Как показали результаты исследований, имбрицин не оказывает влияния на целлюлолитические ферменты, в то время как дегидрогеназная активность грибного мицелия на среде с имбрицином резко возрастает и тем больше, чем выше концентрация антибиотика (рис.8).

Активность дегидрогеназ.ккг формазана/ЮОнг а.с.б.

100. 90 ВО 70 60 50 40 30 20 10

1 г э

48 ч

1 г з

72 ч

1 г з

48 ч

1 г э

72 ч

А

Б

Рис.8. Общая активность дегидрогеназ грибного мицелия на средах с имбрицином и без него: А - АЛеггеьсз; Б - Р.осЬгосЫогоп; 1 - контроль(без имбрицина); 2 - с имбрицином (2,5 мкг/мл); 3 - с имбрицином (5 мкг/мл).

Столь значительное повышение дегидрогеназной активности при одновременном ингибировании синтетических процессов (прирост биомассы) свидетельствует о существенных нарушениях в их метаболизме, происходящих под действием имбрицина, и, очевидно, связано с увеличением количества митохондрий в клетках.

Действие имбрицина на другой физиологический признак грибов - кислотопродукцию - было однотипно у всех культур и проявлялось в ингибировании этого процесса. В контрольных условиях максимальная удельная скорость снижения рН наблюдается уже через 1 час культивирования, в го время как в опытных - только через 3-5

часов (в зависимости от культуры), при этом ее уровень составляет только 40% от контрольного.

Влияние имбрицина на проницаемость мембран грибных клеток. Ингибирующее действие противогрибковых полиеновых и известных неполиеновых антибиотиков на грибы сводится , как правило, к повреждению мембран. Об изменении уровня проницаемости грибных клеток под действием имбрицина судили по "утечке" в среду метаболитов: аминокислот, ионов калия и ультрафиолетпоглощающих веществ при 260 и 280 нм (веществ нуклеотидной и белковой природы). Как показали результаты (рис.7), у всех 8 культур, выращенных на среде с имбрицином (5 мкг/мл), в культуральной жидкости эффект "утечки" веществ, поглощающих при 260 и 280 нм, значительно выше, чем в контрольных вариантах.

ОД, % к контролю

220 200 180 180 140 120 100

12345678 12345678

Рис.7 Интенсивность поглощения при 260 и 280 нм веществ, содержащихся в культуральной жидкости грибов, выращенных на среде с имбрицином. Интенсивность поглощения в контрольных образцах принята за 100%. А - 260 нм; В - 280 нм. 1 - Pénicillium fimiculosum; 2 - Paecilomy-ces varioilii; 3 - Aureobasidiumpullulans\ 4 - Chaetoniumglobosunr, 5 - Aspergillus niger ;6 - A. lerreus; 7 - A.flavus\ 8 - P. ochrochioron.

Учитывая, что прирост биомассы в среде с имбрицином на 30-50 % ниже, чем в контрольной, можно предположить, что в этом случае "утечка" метаболитов в расчете на единицу веса биомассы будет еще более значительной.

Предположение об увеличении проницаемости клеточных мембран под действием имбрицина подтверждается данными анализа фильтратов на содержание в них ионов калия и аминокислот.

Содержание этих веществ в фильтратах, полученных после инкубации опытной биомассы, выше, чем в фильтратах контрольной.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что первичной мишенью у клеток грибов,чувствительных к имбрицину, является цитоплазматическая мембрана. Под действием имбрицина нарушается ее проницаемость, в результате чего происходит выход из клеток низкомолекулярных компонентов внутриклеточного фонда.

Имбрицин как средство защиты бумаги от микоповреждений. Результаты изучения ингибирующего действия имбрицина на микромицеты - деструкторы целлюлозы показали, что он может представлять значительный практический интерес как биоцид для защиты материалов и изделий из нее от микоповреждений.

Исследования, проведенные совместно с сотрудниками отдела консервации документов Российской Национальной библиотеки показали, что обработка различных видов бумаги методом пропитки 0,5-0,7% раствором имбрицина повышает ее устойчивость к микромицетам - деструкторам целлюлозы и, что не менее важно, не влияет на основные физико-химические свойства бумаги.

С учетом результатов, полученных при искусственном тепло-влажном старении бумаги, расчетный эффект от воздействия имбрицина сохраняется 3-4 года. Перспективность использования имбрицина как средства для защиты изделий на бумажной основе от микоповреждений была подтверждена испытаниями, проведенными в мастерской реставрации графики АООТ "Реставратор".

ВЫВОДЫ

1. В результате последовательных циклов селекции и мутагенеза с использованием физического и химического мутагенов выделен вариант продуцента имбрицина с более высокой скоростью роста и активностью, на 35% превышающей активность исходного штамма.

2. Оптимизирован состав ферментационной среды для культивирования продуцента имбрицина. Показано, что исключение мела из регламентной ферментационной среды и стерилизация ее при нейтральном значении рН позволяют без снижения выхода антибиотика упростить состав среды и сократить потери глюкозы в процессе ее стерилизации.

3. Показано, что активный синтез имбрицина происходит в условиях эффективной аэрации и при уровне редокс-потенциала среды 340-400 мВ. Редокс-потенциал, как важнейший фактор среды, может быть использован для направленной регуляции процесса биосинтеза. В условиях лимита по кислороду повышение его на 100 мВ с помощью окислителей стимулирует, а снижение восстановителями ингибирует процесс антибиотикообразования; при интенсивной аэрации наблюдается обратная зависимость.

4. Установлено, что соли натрия усиливают выделение имбрицина из клеток продуцента в среду в процессе его культивирования. В присутствии солей натрия повышается и эффективность экстракции антибиотика из биомассы органическими растворителями.

5. Показано, что имбрицин является высокоэффективным противогрибковым антибиотиком. В субфунгистатических концентрациях имбрицина происходят существенные изменения цитологических, морфологических и физиологических признаков микромицетов -деструкторов целлюлозы, снижается прирост биомассы.

6. Установлено, что одним из механизмов ингибирующего действия имбрицина на грибы является увеличение проницаемости клеточных мембран, в результате чего происходит утечка из клеток жизненноважных метаболитов. При фунгицидных концентрациях антибиотика потери метаболитов достигают такого уровня, при котором происходит гибель клеток.

7. Установлено, что имбрицин является высокоэффективным биоцидом для борьбы с микоповреждениями бумаги различных видов и превосходящим многие, используемые для этой цели химические вещества по эффективности, стабильности, отсутствию токсичности для человека, по отсутствию негативного действия на физико-механические свойства бумаги и др.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Яковлева Б.П. и др. Действие имбрицина на целлюлоз оразрушающие грибы / М.Э.Сухаревнч, Н.Г.Медведева, О.В.Рыбальченко II Микология и фитопатология. 1995. - Т.29. - в.4. - С.22-26.

2. Медведева Н.Г. и др. Влияние имбрицина на рост и ультраструктуру клеточной поверхности микромицетов I Н.Б.Гоголушко, М.Э.Сухаревнч, О.В.Рыбальченко, Б.П.Яковлева // Микология и фитопатология. 1996. - Т.ЗО. - в.1. - С.17-21.

3. Медведева Н.Г. и др. Влияние имбрицина на рост и физиологические признаки целлюлозоразрушающих микромицетов / Ю.А.Гриднева, М.Э.Сухаревнч, Н.Б. Гоголушко, Е.П.Яковлсва II Микология и фитопатология. 1996. - Т.ЗО. - в.З. - С.43-47.

4. Добрусина С.А. и др. Имбрицин - биоцид для защиты бумаш от повреждений, вызываемых грибами / Н.Г.Медведева, Е.М.Лоцманова, М.Э.Сухаревнч II Микология и фитопатология. 1997. - Т.31. - в.2. - С.17-23.

5. Сухаревич М.Э. и др. Влияние аэрации и редокс-потенциала среды на биосинтез антибиотика имбрицина / Н.Г.Медведева, О.Г.Борисова, О.В.Рыбальченко // Материалы 4-ой Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 1996. - С.104.