Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция биосинтеза эфиров циконина в клеточной культуре воробейника краснокорневого

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляция биосинтеза эфиров циконина в клеточной культуре воробейника краснокорневого"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ .ИНСТИТУТ

На правах рукописи

гаяыршшо МАРИНА. 1ИХАЯЛ0ВНА

РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ЭШЮВ 1Ш0ШНА В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРВ ВОРОБЕЙНИКА КРАСНОГОРНЕВОГО

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 1993

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института Дальневосточного отделения РАН.

Научный руководитель - чл.-корр. РАН Ю.Н. Журавлёв

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

В.А. Пасешниченко (г. Москва); кандидат биологических наук, зав. группой физиологии растений В.И. Малиновский (г. Владивосток)

Ведущее учреждение: Тихоокеанский институт биоорганической • химии ДВО РАН (г. Владивосток)

Защита диссертации состоится 199_^года

/М 7

в часов на заседании специализированного совета К 003.97.01.

по физиологии растений в Виолого-почвенном институте ДВО по адресу: 690022, Владивосток, проспект 100-летия Владивостоку, 159

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ДВО РАН

Автореферат разослан "р/с199^ г.

Учёный секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук ¿-Р- и.И. Сибирякова

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы определяется постоянно растущей потребностью в новых лекарственных препаратах, парфюмерных и пищевых композициях для медицинской промышленности и народного хозяйства. В нашей стране лекарственные препараты растительного происхождения составляют приблизительно 30 7. от общего числа используемых в практической медицине, при этом растёт вклад препаратов, полученных из культивируемых клеток растений. Кроме того, при введении в культуру in vitro клеток растений решаются, как правило, две задачи - создание воспроизводимого источника сырья для промышленности и снижение воздействия антропогенного пресса на лекарственные растения.

Первоочередными объектами для введения в культуру ткани обычно являются растения, продуцирующие ценные и дорогостоящие вещества и имевшие ограниченную сырьевую базу. К таким растениям относится-воробейник краснокорневой (Lithosperrvm erythrorhizon Sieb, et Zucc.), продуцент нафтохиноидных пигментов - шиконина и его эфиров. Шиконин - ярко-красный пигмент, обладающий ценными терапевтическими свойствами. Шиконин используется в Восточной медицине, а также в косметике и пищевой промышленности.

Работы японских исследователей с клеточной культурой воробейника показали перспективность её применения в промышленности.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение физиологических и биохимических аспектов регуляции биосинтеза шиконина и его эфиров в культивируемых клетках воробейника красно-корневого (Lithospernum erythrorhizon Sieb, et Zucc.) и создание отечественного клеточного штамма - продуцента эфиров шиконина.

Ллл достижения этой цели ставились следующие задачи:

1. Получить клеточную культуру воробейника краснокорневого, способную стабильно продуцировать эфиры шиконина;

'¿. Изучить факторы и условия, обеспечивающие высокие показатели биосинтеза;

3. Провести химическое изучение нафтохиноидных пигментов в культуре клеток;

4. Получить промышленный штамм клеток воробейника краснокорневого, депонировать его во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений и адаптировать к условиям промышленного производства.

Научная новизна. Впервые получен отечественный клеточный штамм воробейника краснокорневого - активный продуцент эфиров шиконина. -Изучено влияние биохимических предшественников на образование эфиров шиконина в клетках и найдена возможность направленно регулировать биосинтез целевого продукта Впервые совместно с сотрудниками Тихоокеанского института биоорганичеокой химии ДВО РАН изучен качественный и количественный состав нафтохиноидных и бензохинонилфурановых пигментов, продуцируемых клеточной культурой. Структура трех хинонов установлена впервые. Доказана возможность одностадийного промышленного культивирования клеток воробейника без потери продукционной способности в течение продолжительного времени.

Практическая ценность работы. Создан штамм ВК-39 клеточной культуры воробейника краснокорневого - продуцент эфиров шиконина. Штамм адаптирован к условиям промышленного производства в России и Казахстане, где его продуктивность составила 5-6 У. эфиров шиконина от сухой массы клеток. Получена линия-суперпроду-

- б -

цент, синтезирующая в лабораторных условиях свыше 14 7. эфироь шиконина. Клеточная культура молит служить основой для биотехнологического получения ценных нафтохиноидных пигментов и согдания новых лекарственных препаратов, косметических композиций и пищевых добавок.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-м Всесоюзном съезде физиологов растений (Минск, 1990), Всесоюзно й научно-практической конференции по биотехнологии р.-.стенчй (Владивосток.1991), научной сессии, посвященной 60-летию академической науке и 30-летию БГ31 (Владивосток, 1993), научных семинарах лаборатории биотехнологии БГШ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ .

Структура и объ*м диссертации. Диссертационная работа нал.) жена на 106 страницах машинописного текста и состоит из ьг ния, ' литературного обзора, описания об^-ектоь и методов и^сл-мо вания, 1шо.«;нин полученных экспериментальных данных и их (.(«.у* дения, заключения, выводов и списка литературы. Вир ни ж пит ■ представлены паспорт штамма ВК--39 и справка о депонировании. 1а бота содир,«ц' У,: таблиц, IV рисунков. В списке литературы |0! работа, из них IV отечественных н 84 зарубежных ььторив.

ОБЪЕКТ Н МИОДЦ ИССЛЕДОВАНИИ

Объектом исследования яьилась Неточная культура ьороОеЛника краснокорневого (1.1 Ноз^гнит егуС^оМизоп Би-Ь. е1 /иос. Эксплантаты для получения этой культуры были изолированы из корней дикорастущих растений, заготовленных в Партизанским район« Приморского края в 1966 году.

Культура клеток воробейника краснокорпевого. Тдеточную культуру, как при поверхностном так и при глубинном культивировании, выращивали в темноте при 25 град. С и относительной влажности 70 X. Использовали следующие питательные среды:

МС-20 - среда, содержащая макро- и микросоли по прописи Му-

расиге и Скуга, в которой содержание сульфата меди увеличено до

0,075 мг/л. Среда дополнена следующими веществами, мг/л: тиамина

гидрохлоридом - 0,2; пиридоксина гидрохлоридом - 0,5; никотино-t

вой кислотой - 0,5; меэо-инозитом - 100; индолилуксусной кислотой (ИУК) - 0,2; кинетином - 2,0; сахарозой - 30000; агаром -6000. pH до автоклавирования 5,6-5,8.

MC-30 - основная "продукционная" среда, содержит макро- и микросоли по прописи Мурасиге и Скуга, в которой содержание нитрата аммония уменьшено до 400 мг/л, все остальные компоненты такие же, как и в среде МС-20.

МС-32 - оптимизированная "продукционная" среда, её состав приведён ниже.

Компоненты питательных сред - лактон мевалоновой кислоты, мезо-инозит получены от фирмы "Signa" (США); кинетин, ИУК, п-гидроксибензойная, транс-коричная, бензойная кислоты - от фирмы "Serva" (ФРГ).

Повторность в факторных опытах была 10-кратной. Каллусную культуру пассировали через 30 суток, суспензионную - через 14. Масса инокулюма составляла 150 мг при поверхностном культивировании и 2-3 г - при глубинном. Ыногофакторные опыты проводили по методике Максимова, коэффициенты в уравнениях регрессии рассчитывали по алгоритму Йетса. Значимость коэффициентов определяли по коэффициентам Отьюдента. Ошибки представлены как среднеквадрати-•ческие ошибки среднего арифметического.

Химический анализ биологически актирных веществ. Качественный и количественный состав компонентов экстракта из культуры клеток воробейника исследовали при помошл препаративной колоночной и тонкослойной хроматографии на силикагеле с последующим анализом полученных фракций методами ВЗЖХ и ЯМР-спектроскопии. В качестве стандартного образца использовапи шиконин, полученный из корней интактных растений (температура плавления 147-148 град. С). Для количественного определения эфиров шиконина использовали фотоколориметрический метод анализа. Оптическую плотность экстрактов определяли при длине волны 526 им.

ПОЛУЧИШЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНОГО ВГГАШЛ ВК-39 ВОРОБЕЙНИКА КРАСНОКОРНЕВОГО

Первичные каллусы, полученные из корней воробейника красно-корневого, содержали редкие зоны розовой пигментации. Окрашенные агрегаты диаметром 3-4 мм отбирали для пересадки в течение 3-4 пассалей до получения однородных каллусов розово-красного цвета Выяснилось, что "дальнейший отбор розовых агрегатов не приводит к увеличению продуктивности каллусов. Биосинтез производных шиконина составлял 0,2-0,5 X от сухой массы ткани.

При селекции окрашенных в розовый одет каллусов отметили, что некоторые селекционные линии содержат мелкие ярко-окрашенные агрегаты в диаметре до 1 мм. Первые.попытки клонировать эти агрегаты не увенчались успехом - они либо не росли, либо погибали к концу пассажа или становились белыми при последующих пересадках. Поэтому в дальнейшем мелкие красные агрегаты культивировали в малом объеме (5 мл) среды МО-20, а цикл выращивания р пассаже

уменьшили до 3 недель. За это время заведомо высокопродуктивные клетки активно росли и не синтезировали больших количеств нафто-хиноноь. В последующих пассажах их перекосили на продукционную среду МО-ЗО. Таким образом было получено несколько клеточных линий, лучшая иа которых депонирована во Всесоюзной коллекции клеток высших растений под индексом ВК-39 (коллекционный номер 36).

Каллусная ткань штамма БК-39 имеет рыхлую консистенцию, окрашена в темно-красный цвет. Ростовой индекс культуры 15. Средний размер клеток 30 - 50 мкм. Максимум ыитотической активности наблюдается на шестой день культивирования. Число хромосом варьирует, наиболее часты диплоидные 1.227.) и тетраплоидные (Э1Х) клетки.

Суспензионная культура меток воробейника краснокорневого была получена в результате переноса рыхлых каллуоных клеток штамма БК-39 в жидкую питательную среду. Провели селекцию интенсивно окрашенных и быстрорастущих клеток, в результате получили суспензионную культуру, синтезирующую 400-500 мг эфиров ши-конина на литр среды при плотности суспензии 12,5 г/л по сухому весу. Популяция состоит из клеточных агрегатов темно-красного цвета диаметром 0,5-2,0. мм. Живые клетки составляет 70-75 2.

Ь'ГАШ ВК-ЗУ КАК АКГИШШЙ ПРОДУЦЕНТ ЭФИРОВ ОДШШША

Содержание эфиров шиконина в клетках штамма ВК-39 составляет 6-8 г в пересчете на сухую массу.

При исследовании пигментных компонентов клеточной культуры БК-39 установили, что состав нафтохинонов.в культуре и корнях воробейника аналогичен (табл.. 1).

Сравнительная характеристика состава эфиров шиконина в клеточном штамме ВК-39, корнях воробейника краснокор-невого и полученной в Японии суспензионной культуре

Эфиры шиконина, 7. Штамм ВК-39 Суспензионная культура * Корни воробейника краснокорневого *

ацетилшиконин 27.3 43-49 26-63

изобутирилшиконин 39,5 17-20 14-33

пропионилшиконин 3,4 - -

изовалерилшиконин 12,5

Л-метил- н-бути- 11-14 11-26

рилшиконин 6,3

р-оксиизовалерил-

пиконин 9,1 16-18 9-18

р -диметилакрил-

шиконин 1,8 1-3 1-4

Другие (шиконин и

дезоксишиконин) следы 2-4 1-5

Содержание эфиров шиконина в ЕЬ^О или гексановом экстракте, 7.

80,7

55-65

22-52

* -

ГиНЬа вt а1., 1983.

В культивируемых клетках штамма ВК-39 преимущественно накапливаются изобутирилшиконин и ацетилшиконин - 39,5 и 27,3 X от общей суммы эфиров. Количество других пигментов в культуре значительно меньше, а свободный шиконин содержится в следовых количествах. Шесте с тем, в каллусах обнаружен новый эфир шиконина в незначительном количестве - до 3,7 X от общей суммы нафгохино-нов. Это вещество идентифицировано как - 5,8-диокси-2-(4'-ме-тил-Г -пропаноилоксипенг-3' -енил) -1,4-нафгохинон (пропионилши-конин). -

Таким образом, в биомассе клеток штамма ВК-39 обнаружен шиконин и семь его эфиров - ацетилшиконин, пропионилшиконин, изобутирилшиконин, j-.fi -диметилакрилшиконин, изовалерилшиконин, ^ -оксиизовалерилшиконин, «¿-метил-н-бутирилшиконин.

После отделения суммы нафгохинонов в виде нерастворимых солей меди, в экстракте клеточной культуры воробейника обнаружили пигменты желто-оранлевого цвета Идентифицировали два известных производных бензбхинонилфурана (эхинофураны В и С) и два новых -изобутирил- и изовалерилбензохинонилфуран, которые не находили ранее в корнях воробейника и суспензионной культуре, полученной

б японии.

Содержание эфиров шиконина в гексаноиом экстракте клеток штамма ВК-39 достигает 80,7 % (табл. 1), что значительно больше, чем в соответствующей фракции из корней и суспензионной культуры. Это достигается за счёт понижения содержания, липофильных примесей и является важной технологической характеристикой, обеспечивающей получение внсокоочищенного шиконина и препаратов на его основе.

В каллусной культуре воробейника в точение пяти лет" сохраня-

- и -

ются стабильные соотношения нафтохинонов и их количественное со держание.

Установлено, что биосинтез хинонов происходит одновременно с ростом каллусов, при этом к концу культурального периода клетки накапливают в 3-7 раз больше эфиров шиконина по сравнению с 5-6-летними корнями растений.

РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССОВ РОСТА И БИОСИНТЕЗА ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

Для изучения влияния компонентов питательной среды на рощ- и продуктивность клеточной культуры воробейника использовали методы математического планирования эксперимента, в том числе метод случайного баланса, однофакторные и полные факторные эксперименты. Оказалось, что наибольшее влияние на изучаемые параметры оказывают сахароза, нитраты, ионы меди, а также фитогормони.

Сахароза в концентрации 30-35 г/л стимулировала рост меток и биосинтез эфиров шиконина, но дальнейшее повышение ее концентрации приводило к ухудшению продукционных характеристик культуры.

Исключение из состава питательной среды ионов аммония лриие-ло к существенному увеличению содержания эфиров шиконина в клеточной культуре. Так, в каллусах содержание эфиров шиконина увеличилось с 6.0 до 8,0 X. Однако на безаммонийной среде рост культур ухудшался при последующих пересадках ткани.

Ионы меди оказывают стимулирующее влияние не только на синтез шиконина, но и на накопление сырой и сухой биомассы.

Повышение концентрации ионов магния, бора, цинка (сверх кон-

центрации в среде Мурасиге-Скуга), а также агара уменьшало образование эфиров шиконина, а другие испытанные компоненты питательной среды не влияли на их количество.

Учитывая результаты предварительных опытов, мы предположили, что при достижении сбалансированности компонентов питательной среды удастся достичь- совмещения, направлений процессов роста культуры и биосинтеза конечного продукта. В развитие этого предположения провели серию факторных экспериментов, в ходе которых изучили влияние взаимодействий компонентов питательной среды на рост и биосинтез эфиров шиконина. В табл. 2 представлены матрица результаты полного факторного опыта ПФЗ 23, в котором изучены эффекты сахарозы, нитрата аммония и сульфата меди.

Уравнения регрессии имеют следующий вид (обозначения параметров приведены в табл. 2):

(1) у1 - 950 + 130х2 + 95х3 + 65х2х3

(2) у2 - 95,3 + 10,5X2 + 9,3х3 + 5,0х2х3

(3) У3 - 4,43 - 1,58х2 + 0,7х3 - 0.53x^3

(4) у4 - 4,1 - 1,1х£ + 1.0х3

Подтвердилось сильное стимулирующее влияние ионов иеди на изучаемые параметры. В то те время ионы аммония оказывают более избирательное действие - стимулируют рост, но ингибируют биосинтез. Ионы меди не предотвращают угнетающего действия ионов аммония на образование эфиров шиконина (уравнение 2 и 3). Наблюдается существенный эффект положительного влияния взаимодействия фак торов х2 (сульфат аммония) и хд (сульфат меди) на накопление сырой биомассы каллусов (уравнение 1), что в литературе для клеточных культур растительных клеток ранее не отмечалось.

Ионы меди рассматривается в настоящее время как абиотический

Матрица и результаты полного факторного эксперимента 1Ш '¿л по изучению влияния компонентов питательной среды на рост каллусов воробейника и накопление эфиров шиконина

NN Факторы Средняя Средняя Содержание Содержание

опыта масса " масса эфиров ши- эфиров ши-

Саха- Суль- Суль- сырых сухих конина в шиконина в

рова, фат фат каллу- каллу- сухих кал- пересчоте

г/л аммо- меди, сов, мг сов, мг сах, % на культ.

ния. мг/л сосуд, мг

мг/л

h х2 х3 Vi У2 у3

1 30 ü 0,025 850 86 4,51 3,9

2 35 0 0,025 730 75 5,16 3,9

3 30 250 0,025 960 95 2,70 2,6

4 35 250 0.025 880 88 2,49 2.2

5 30 0 0,125 880 100 8,75 8,8

6 35 0 0,125 820 78 5,54 4,3

7 30 250 0,125 1260 120 3,31 4,0

8 35 250 0,125 1220 120 2,91 3,5

эдиситор. Действительно, проведенные нами опыты показали, что ионы меди оказывают стимулирующее влияние на роот и биосинтез вторичных метаболитов и в других растительных культурах, например женьшеня (сведения не приводятся). Однако классические элиситори - полисахариды, по данным зарубежных авторов, стимулируют биосинтез шиконина и в присутствии высоких количеств аммония. В нашем случае внесение увеличенного количества сульфата меди в питательные среды не приводило к увеличению биосинтеза шиконина на фоне высокого содержания аммония, что может свидетельствовать о различии в механизмах действия меди и полисахаридов.

Для оптимизации питательной среды на основании ГЮЭ 23провели восхождение по поверхности отклика. Максимальное значение основных параметров (оредняя масса сухих каллуоов и содержание эфиров шиконина) достигнуто на третьем шаге восхождения. Оптимальная концентрация сульфата меди соотавила 0,276 мг/л, сульфата аммония - 141,0 мг/л.

В отдельном многофакторном опыте (ПФЭ з2) с тремя уровням! двух факторов изучили влияние фитогормонов. Оптимальные концентрации фитогормонов оказались такими же, какие используют дл! культуры ткани воробейника в Японии: кинетин - 2 мл/л; ИУК - о,; мг/л (М1гикат1 & а1., 197В).

Ниже приведён состав оптимизированной продукционной питател

ной среди, мг/л:

кш3 1900 ГеЯу 7Н20 27,8

(МН4)2504 141 Иа^ЕОТА'2Н^0 37,3

СаС1,,- 6Нг0 665 тиамина гидрохлорид 0,2

Щ304« ?Н20 й?й ииридоксина гидрохлорид 0,5

К1У°4 170 никотиновая кислота 0,5

Н3В03 6,2 мезо-инозит 100

МпЗО^ 4Н20 22,3 ИУК 0,2

СоС12-2Нг0 0,025 кинетин 2,0

СиБ04' 5Нг0 0,275 сахароза 30000

2П304»7Н20 8,6 агар 6000

На^МэО^ 2Н20 0,25

1У 0,83 рН сред 5,6 до автоклавирования.

Эта среда получила индекс МС-32 и использовалась в дальнейшем для культивирования каллусов воробейника. Содержание эфиров шиконина в культуре увеличилось в среднем на 20 % при сохранении уровня накопления сырой и сухой клеточной биомассы.

ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКЦИОННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ОТЛШЛ ВК-39 ЗА СЧЁТ СТИМУЛЯЦИИ ИИКИМАТ- ФЕНИЛАЛА] ИН080Г0 БИОСШГГЕТИЧЕСКОГО ПУТИ

Ключевой шаг биосинтеза шиконина - это образование м-гера-нил-п-гидроксибензойной кислоты из п-гидроксибензойной кислоты и геранилпирофосфата, предшественников из шикимат-фенилаланинового и изопреноидного биосинтетических путей. Очевидно, что низкий уровень какого-либо исходного субстрата не погволит достичь высокого содержания шиконина в культивируемых клетках воробейника Поэтому изучили влияние п-гидроксибензойной кислоты и мева-лоновой кислоты на биосинтез эфиров шиконина Был поставлен полный факторный эксперимент 1ИЭ г2. План и результаты представлены в табл. 3. На основании полученных результатов рассчитаны коэффициенты в уравнениях регрессии: у^ - 7,1 + 0,7х1 + 0,2x2

у2 - 1,78 - 0,45х1 - 0,07x2 + ОДЗх^

р

Матрица и результаты полного факторного эксперимента ГИЮ 2Ь по изучению влияния мевалоновой и п-гидроксибензойной кислот на рост каллусов воробейника и накопление эфиров шиконина

Опыт Факторы Результаты

п-гидроксн- Мевалоновая Содержание Средняя сырая бензойная к-та, мг/л эфиров шико- масса каллусов,

' к-та, мг/л нина, 7. г

Х1 х2 У1 ^2

1 О О 6.2 2.44

2 140 0 • 7,6 1,27

3 0 50 6,6 2,03

4 140 50 8.0 1,39

Из результатов, приведённых в таблице, видно, что п-гид-роксибенэойная кислота увеличивает содержание эфиров шиконина в камусах как при нижнем, так и при верхнем уровнях мевалоновой кислоты. Этот эффект статистически достоверен. Мевалоновая кислота проявляет лишь тенденцию к стимуляции биосинтеза нафто-хиноидяых пигментов.

Походя из этих результатов, а также литературных' данных,

согласно которым образование геранил- птидрокеибензойной кислот:,! иа мевалоновой кислоты в клетках воробейника не лимитировано ни на одном из этапов (Hehle and Berber, 1989), заключили, что изопреноидный путь обеспечивает достаточную поставку субстратов для биосинтеза шиконина при условиях, в которых ставился оти.

Увеличение содержания шиконина в клетках при добавлении п-гидроксибензойной кислоти моавт свидетельствовать, что уго lit 12ЭОТВО лимитирует сйр&ьовыше к'шокиаь. Установлении это1 ч .}.и:»<> привело нас к идее повысить BiiyTpwuiei очное содержание н гнл роксибензойной кислоты посредством актив.¿или тока Ме'Лдболнти. ib< шикимат-фенилаланшювому биоеинтетнчеокому пути. Для атш о н. ходимо увеличить внутриклеточную концентрацию одного из клы. вых метаболитов этого пути - ценилалашша. Как нзвеитно, h :! увеличения эндогенного содержания фешивдшмна м>«но исни.-: вать селекцию клеток на ергдах, содеркшких антим-.тоСти- -¡..г. аминокислоты - п-^ьиюрофенилаланнн (РРР).

Селении« клеток вели двумя путями: а первом случае «¿¡иль зовали сублетальиие дозы PFF (.725 мкШ; но втором - дозу ит ц.1й-тора увеличивали постепенно с 220 до 1080 или 2170 мкМ. Ilj.ii к дом селективном «,аге каллусы пассировали триады, отбир.ш лта«. ткани. Результаты по некоторым линиям представлены В Та'Я| -1 Содержание эфиров шнкоМина в селекционных линиях увел.гш'ьеь ( 7,2 7. до 10,4-12,8 % в пересчете на сухую массу клеток.

Интересно отметить, что высокая концентрация РГР - ; Г/u иг-.ч приводила к полной остановке биосинтеза зфиров шиконинп i^ui лусные агрегаты имели белый цвет. В дальнейшем зтн клетки сп.-т-ро восстанавливали способность синтезировать красный rutri*;iu- ира удалении флюорофенилаланина из сред (табл. 4). При меш.ши i.on

Содержание эфиров шикошша в исходной и РРР-реэистентной .линиях воробейника краснокорневого

Линии

Схема селекции (РРР, мкЮ

Содержание эфиров шиконина, 7. от сухой массы клеток

Исходная ВК-ЗЯ-5

7.2 + 0,6 *

Селекционные:

пассажи **

2-й 10-й 11-й 12-й

Среднее

1Ж- 39-55 РЬТ 725 13,6 12,9 13,5 И. 1 12,8 +

ш- ■39-53 РГР 725- 1080 7,3 12.8 11,6 10, 0 10,4 +

вк- ■30-50 РРР 220- ■1080 9,8 12.6 12,3 11. 4 11,5 +

вк- -39-Б6Р . РРР 220- 1080-2170 - 12,0 14,2 и. 7 12,6 +

Примечание: * - содержание эфиров шиконина в исходной линии

определено в течение 12 пассажей в 1990-1991гг.

** - номера пассажей селекционных линий, выращиваемых на средах без РРР (2-й пассаж - февраль 1991г.).

центрациях ингибитора каллусы были красными, но содержание суммы эфиров шиконина в них было ниже, чем в исходной линии. Повышение содержания эфиров шиконина в селекционных линиях по сравнению с исходной наблюдалось только после удаления PFP из сред.

Как видно из табл. 4. все селекционные линии достоверно повысили продуктивность. Одна из линий, BK-39-56F, предложена для депонирования как новый штамм-суперпродуцент эфиров шиконина, максимальное содержание которых в 11-м пассаже достигло 14,2 % от сухой массы клеток. Это значение в 7-14 раз превышает содержание эфиров шиконина в корнях воробейника. Достигнутые продукционные характеристики стабильны в пассатах.

На рис. 1 представлены ростовые характеристики исходной и PFP-резистентной -линии BK-39-56F при выращивании их на средах, содержащих PFP.

В области умеренных концентраций ингибитора (до 217 мкМ) селекционная линия полностью к нему устойчива. Исходная линия, в отличие от селекционной, снижает ростовые характеристики при низких значениях PFP и погибает при концентрации PFP 2175 мкМ.

На основании этого графика рассчитана ЕД50 PFP (доза, вызывавшая 50 7. ингибирования роста ткани) для клеток воробейника, которая составила 725 мкМ. Клетки других растений обычно более чувствительны к действию этого ингибитора - ЕДдд для клеток Nicotians tabacum составляет 170 мкМ, для клеток Catharanthus roseus - ВО мкМ. Клетки растений Anchusa officinal is, способные синтезировать большое количество фенольных соединений (производных розмариновой кислоты). так же как и клетки воробейника, устойчивы к действию PFP - EJtg0 -для них составляет 650 мкМ (Quesnel and Ellis, 1989). Причина природной устойчивости к PFP

Масса сырых каллусов (X от контроля)

рация РРР, мкМ

Рис.1 Рост исходной (а) и РРР-резистентной (б) каллусных линий воробейника на среде с п-фльоро^енилаланином (РРР).

у растений, синтезирующих большое количество фенольных соединении и, следовательно, имеющих актиыю работающий шикимат-фенил-аданиновия Оиосинтетмческий путь, молит заключаться в способности клеток а тих растений синтезировать повышенное количество фе-нижшшима.

В результате селекции клеток ВК ЗУ па средах с возрастающей ниши-итрцдН'-'й РРР достигли повышении устойчивости к этому селек-гиьноку агенту. Так. ЕД-л еелс-кциишюй линии ВК-39-56Р составила

- 21 -

1220 мкМ, что в 1.7 раза превышает исходный уровень.

При проверке содержания транс-коричной, п-гидроксибенэойной кислот и гликозида п-гидроксибензойной кислоты в исходной и РРР-резистентной клеточных линиях воробейника, установили, что эти вещества в клетках не накапливаются. Эти результаты соответствуют литературным данным, согласно которым количественный выход п-гидроксибензойной кислоты зависит только от величины субстратного потока, поступающего из исходной реакции дезамини-рования фенилаланина.

Таким образом разные способы селекции культуры дают среднее увеличение содержания эфиров шиконина в клетках примерно на 75 7..

СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРОШИЛИ ШОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ВОРОБЕЙНИКА КРАСНОКОРНЕВОГО

Культура клеточного штамма БК-39 передана для• промышленного испытания на Омутнинский химический завод (НПО "ВОСТОК", пос. Восточный Кировской обл.) в октябре 1989 года В мае 1990 года штамм ВК-39 передан на предприятия концерна "Космофарм" (Казахстан). С момента передачи штамма осуществляли авторский над-8ор над состоянием штамма и прослеживали динамику изменения его ростовой и биосинтетической активности. Штамм успешно адаптирован к условиям промышленного производства на этих предприятиях. Это позволило заводам перейти к отработке методики выделения шиконина. Концерн "Космофарм" разработал рецептуры парфюмерных и косметических препаратов на основе шиконина и готовит их производство.

выводы

1) Получен высокопродуктивный штамм ЕК-39 клеток корней растений воробейника краснокорневого;

2) Изучено влияние компонентов питательной среды на рост и биосинтез эфиров шиконина; разработана и оптимизирована питательная среда, обеспечивающая одностадийное выращива-лие культуры;

3) Состав эфиров шиконина в культуре ВК-39 соответствует составу этих веществ в корнях интактных растений, что позволило рекомендовать биомассу клеток воробейника как воспроизводимый сырьевой источник для получения препаратов шиконина;

4) Установлено, что клетки полученного штамма обладают способностью стабильно продуцировать нафтохиноидные пигменты в течение долговременного культивирования;

5) Штамм ВК-39 депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений под номером 36 и передан на заводы в России и Казахстане для промышленного использования;

6) Изучена возможность регуляции биосинтетического пути образования шиконина в культуре клеток. Проведена селекция клеток воробейника, резистентных к п-флюорофенилаланину и получен новый штамм-суперпродуцент, устойчивый к действию

' этого ингибитора, накапливающий до 14,2 % суммы эфиров шиконина от сухой массы клеток.

Список работ, . опубликованных по материалам диссертации

1. А.о. N 1707073 МКИ С12 N5/04, 6/00. "Штамм культивируемых клеток растений Llthospermm erythrorhizon Sleb. et Zuco.

- продуцент шиконина". Журавлёв Ю.Н., Булгаков B.U., Писец-кая Н.Ф., Козыренко М.М., Старун Т.В., Артюков А.А., Федо-реев С.А.// Открытия. 1990. N 5.

2. Козыренко М.М., Булгаков В.П., Журавлёв Ю.Н., Федореев С. А. Биосинтез производных шиконина в каллусной культуре Llthospernum erythrorhizon Sleb. et Zuco. // Растит, ресурсы. 1991. Вып. 4. С. 78-81.

3. Федореев С.А., Денисенко В.А., Кулеш Н.И., Красовская Н.Н., Козыренко М.М., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Исследование химического состава хиноидных пигментов из клеточной куль-ры ВК-39 Llthospermm erythrorhizon (Sieb. et Zuco.) // Хим.-фарм. хурн. 1993. Вып. б. С. 33-37.

4. Булгаков В.П., Козыренко М.М., Журавлев Ю.Н. Увеличенное образование шиконина в п-флюорофенилаланин резистентных клетках Ll thospermm erythrorhizon // Tea. докл. междунар. конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алма-Ата. 1993. С. 171.

В. Bulgakov V.P., Kozyrenko М.М., Zhuravlev Y.N. High productivity of shikonin derivatives in p-fluorophenylalanine resistant cell of Llthospermm erythrorhizon // Abstracts. XV International Botanical Congress. Tokyo. 1993. P. 531.