Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция биосинтеза эфиров шиконина в клеточной культуре воробейника краснокорневого

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляция биосинтеза эфиров шиконина в клеточной культуре воробейника краснокорневого"

од

российская академия наук ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ .ИНСТИТУТ

На правах рукописи

КОЗЫРНОЮ МАРИНА ЩХА&ЛОШ1А

РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА Э<1ИРОВ ИИКОЮША В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ ВОРОБЕЙНИКА КРАС1ЮКОРНЕВОГО

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 1993

- г -

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института Дальневосточного отделения РАН.

Научный руководитель - чл.-корр. РАН Ю.Н. Журавлёв

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

В.А. Пасешниченко (г. Москва); кандидат биологических наук, зав. группой физиологии растений В.И. Малиновский (г. Владивосток)

Ведущее учреждение: Тихоокеанский институт Сиоорганической * химии ДВО РАН (г. Владивосток)

-о

Защита диссертации состоится 199_/_ года

в _ часов на заседании специализированного совета К 003.97.01.

по физиологии растений в Виолого-почвенном институте ДВО по адресу: 690022. Владивосток, проспект 100-летия Владивостоку. 159

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ДВО РАН

Автореферат разослан ".

Учёный секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук {-Р- и. И. Сибирякова

- 3 -

общая характеристика работы

Актуальность проблемы определяется постоянно растущей потребностью в новых лекарственных препаратах, парфюмерных и пищевых композициях для медицинской промышленности и народного хозяйства В нашей стране лекарственные препараты растительного происхождения составляют приблизительно 30 X от общего числа испольэуемых в практической медицине, при этом растёт вклад препаратов, полученных из культивируемых клеток растений. Кроме того, при введении в культуру т vitro клеток растений решаются, как правило, две задачи - создание воспроизводимого источника сырья для промышленности и снижение воздействия антропогенного пресса на лекарственные растения.

Первоочередными объектами для введения в культуру ткани обычно являются растения, продуцирующие ценные и дорогостоящие вещества и имеющие ограниченную сырьевую базу. К таким растениям относится.воробейник краснокорневой (Lithospermim erythrorhizon

т

Sieb, et Zucc.), продуцент нафгохиноидных пигментов - шиконина и его эфиров. Шиконин - ярко-красный пигмент, обладающий ценными терапевтическими свойствами. Шиконин используется в Восточной медицине, а также в косметике и пищевой промышленности.

Работы японских исследователей с клеточной культурой воробейника показали перспективность её применения в промышленности.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение физиологических и биохимических аспектов регуляции биосинтеза шиконина и его эфиров в культивируемых клетках воробейника красно-корневого (Lifchospemm erythrorhizon Sieb, et Zucc.) и создание отечественного клеточного штамма - продуцента эфиров шиконина.

Ллл достижения этой цели ставились следующие задачи:

1. Получить клеточную культуру воробейника краснокорневого, способную стабильно продуцировать эфиры шиконина;

2. Изучить факторы и условия, обеспечивающие высокие показатели биосинтеза;

3. Провести химическое изучение нафгохиноидных пигментов в культуре клеток;

4. Получить промышленный штамм клеток воробейника краснокорневого, депонировать его во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений и адаптировать к условиям промышленного производства

Научная новизна Впервые получен отечественный клеточный штамм воробейника краснокорневого - активный продуцент эфиров шиконина. Изучено влияние биохимических предшественников на образование эфиров шиконина в клетках и найдена возможность направленно регулировать биосинтез целевого продукта. Впервые совместно с сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН изучен качественный и количественный состав нафгохиноидных и бензохинонилфурановых пигментов, продуцируемых клеточной культурой. Структура трёх хинонов установлена впервые. Доказана возможность одностадийного промышленного культивирования .клеток воробейника без потери продукционной способности в течение продолжительного времени.

Практическая ценность работы. Создан штамм ВК-39 клеточной культуры воробейника краснокорневого - продуцент эфиров шиконина Штамм адаптирован к условиям промышленного производства в России и Казахстане, где его продуктивность составила 5-6 % эфиров шиконина от сухой массы клеток. Получена линия-суперпроду-

цент, синтезируюшзя в лабораторных условиях евшие 14 % эфири« шиконина. Клеточная культура может служить основой длп биотехнологического получения ценных нафтохиноидных пигментов и создания новых лекарственных препаратов, косметических композиций и пищевых добавок.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-м Всесоюзном съезде физиологов растений (Минск, 1990), Всесоюзной научно-практической конференции по биотехнологии растопчи (Владивосток.1991). научной сессии, посвященной 60-летию академической науке и 30-летию БПИ (Владивосток, 1993), научных семинарах лаборатории биотехнологии БГМ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ .

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из ш-.ч-ния, литературного обзора, описание объектов и методов игол-д'» вания, иэлоленин полученных экспериментальных данных и их к'.сул дения, заключения, выводив и списка литературы. В нрилоьлши представлены паспорт штамма ВК-ЗЭ и справка о депинироьании. ia бота содержиí 1;; таблиц, 17 рисунков. В списке литературы iQ! работа, из них 17 отечественных и 84 зарубежных автороь.

обшгг и ¡тот исследования

Объектом исследования явилась клеточная культура ьорооейника краснокорневого(¿jt-hospeniL/w eryLhrorhizon Sieb. ul Zucc.). Эксплантаты для получения этой культуры были изолированы из корней дикорастущих растений, заготовленных в Партизанским районе Приморского кран в 1986 году.

Культура клеток воробейника краснокорневого. Таеточную культуру. как при поверхностном гак и при глубинном культивировании, выращивали в темноте при 25 град. С и относительной влажности 70 X. Использовали следующие питательные среды:

MC-20 - среда, содержащая макро- и микросоли по прописи Му-

расиге и Скуга, в которой содержание сульфата меди увеличено до

0,075 мг/л. Среда дополнена следующими веществами, мг/л: тиамина

гидрохлоридом - 0,2; пиридоксина гидрохлоридом - 0,5; никотино-i

вой кислотой - 0,5; мезо-инозитом - 100; индолилуксусной кислотой (ИУК) - 0,2; кинетином - 2,0; сахарозой - 30000; агаром -6000. pH до автоклавирования 5,6-5,8.

UC-30 - основная "продукционная" среда, содержит макро- и микросоли по прописи Мурасиге и Скуга, в' которой содержание нитрата аммония уменьшено до 400 мг/л, все остальные компоненты такие же, как и в среде MC-20.

MC-32 - оптимизированная "продукционная" среда, её состав приведён ниже.

Компоненты питательных сред - лактон ыевалоновой кислоты, мезо-инозиг получены от фирмы "Signa" (США); кинетин, ИУК, п-гидроксибензойная, транс-коричная, бензойная кислоты - от фирмы "Serva" (ФРГ).

Иовторность в факторных опытах была 10-кратной. Каллусную культуру пассировали через 30 суток, суспензионную - через 14. Масса инокулюма составляла 160 мг при поверхностном культивировании и 2-3 г - при глубинном. Шогофакторные опыты проводили по методике Максимова, коэффициенты в уравнениях регрессии рассчитывали по алгоритму Йетса. Значимость коэффициентов определяли по коэффициентам Стьюдента. Ошибки представлены как среднеквадрати-•ческие ошибки среднего арифметического.

Химический анализ биологически активных веществ. Качественный и количественный состав компонентов экстракта из культуры клеток воробейника исследовали при помовд препаративной колоночной и тонкослойной хроматографии на оиликагеле с последующим анализом полученных фракций методами ВЭЖХ и ЯМР-спектроскопий. В качестве стандартного образца использовагш шиконин, полученный из корней интактных растений (температура плавления 147-148 град. С). Для количественного определения зфиров шиконина испольэов&пи фотоколориметрический метод анализа. Оптическую плотность экстрактов определяли при длине волны 526 нм.

получение и характеристика клеточного оташа вк-39 воробейника красшкорневого

Первичные каллусы, полученные из корней воробейника красно-корневого, содержали редкие зоны розовой пигментации. Окрашенные агрегаты диаметром 3-4 мм отбирали для пересадки в течение 3-4 пассажей до получения однородных каллусов розово-красного цвета. Выяснилось, что дальнейший отбор розовых агрегатов не приводит к увеличению продуктивности каллусов. Биосинтез производных шиконина составлял 0,2-0,6 X от сухой массы ткани.

При селекции окрашенных в розовый цвет каллусов отметили, что некоторые селекционные линии содержат мелкие ярко-окрашенные агрегаты в диаметре до 1 мм. Первые попытки клонировать эти агрегаты не увенчались успехом - они либо не росли, либо погибали к концу пассажа или становились белыми при последующих пересадках. Поэтому в дальнейшем мелкие красные агрегаты культивировали в малом объеме (5 мл) среды МО-20, а цикл выращивания в пассаже

уменьшили до 3 недель. За это время ааьедоыо высокопродуктивные клетки активно росли и не синтезировали больших количеств нафто-хинонов. В последующи пассатах их переносили на продукционную среду МЗ-ЗО. Таккы образом было получено несколько клеточных линий, лучшая иа ко-торых депонирована во Всесоюзной коллекции клеток высших растений под индексом ВК-39 (коллекционный номер 36).

Каллусная ткань штамма ВК-39 имеет рыхлую консистенцию, окрашена в тимно-красный цвет. Ростовой индекс культуры 15. Средний размер клеток 30-50 мкм. Максимум митотической активности наблюдаете« на шестой день культивирования. Число хромосом варьирует, наиболее часты диплоидные {2?Л) и тетраплоидные (317.) клетки.

Суспензионная культура клеток воробейника краснокорневого была получена в результате переноса рыхлых каллусньк клеток штамма ВК-39 в жидкую питательную среду. Провели селекцию интенсивно окрашенных и быстрорастущих клеток, в результате получили суспензионную культуру, синтезирующую 400-500 мг зфиров ш-конина на литр среди при плотности еусиензии 12,5 г/л по сухому весу. Популяция состоит из клеточных агрегатов темно-красного цвета диаметром 0,5-2,0 ш. Живые клетки составляет 70-75 X.

Ш7ШУ ВК-39 КАК АКГШШ ПРОДУЦЕНТ &ШРСВ ШШШНА

Содерышие эфироь шшюиина в клейках штамма ВК-39 составляет 6-8 X в пересчете на сухую массу.

При исследовании пигментных компонентов меточной культуры ВК-09 установили, что состав на^'охинонов в культуре и корнях воробейника аналогичен (табл.. )).

Сравнительная характеристика состава эфиров шиконина в клеточном штамме ВК-39. корнях воробейника краснокор-невого и полученной в Японии суспензионной культуре

Эфирн шиконина, Штамм ВК-39 Суспензионная Корни воробейника

7. культура * краснокорневого *

ацетилшиконин 27,3 43-49 26-63

изобутирилшиконин 39,5 17-20 14-33

пропионилшиконин 3,4 - -

изовалерилшиконин 12,5

метил- н-бути- 11-14 11-26

рилшиконин 6,3

^-оксииэовалерил-

шконин 9,1 16-18 9-18

р ~ диметилакрил-

шиконин 1,8 1-3 1-4

Другие (шиконин и

дезоксишиконин) следы 2-4 1-5

Содержание эфиров

шиконина в ЕЬ20 или

гексановом экстрак- 80,7 55-65 22-52

те, 7.

* - Ги;ЦЬа еЬ а1. , 1983.

В культивируемых клетках штамма ВК-39 преимущественно накапливаются изобутирилшюсонин и ацетилшиконин - 39,5 и 27,3 X от общей суммы эфиров. Количество других пигментов в культуре значительно меньше, а свободный шиконин содержится в следовых количествах. Вместе с тем, в каллусах обнаружен новый эфир шиконина в незначительном количестве - до 3,7 X от обшэй суммы нафгохино-нов. Это вещество идентифицировано как - 5.8-диокси-2-(4'~ме-тил-г-пропаноилокеипеит-3'-енил)-1,4-нафгохинон (пропионилши-конин)..

Таким образом, в биомассе клеток штамма ВК-39 обнаружен шиконин и семь его эфиров - ацетилшиконин, пропионилшиконин, иэо-бутирилшиконин, ^,/ -диметилакрилшиконин, изовалерилшиконин, р - оксиизовалерилшиконин, «¿-метил-н-бутирилшиконин.

После отделения суммы нафгохинонов в виде нерастворимых солей меди, в экстракте клеточной культуры воробейника обнаружили пигменты желто-оранжевого цвета Идентифицировали два известных производных бензОхинонилфурана (эхинофураны В и С) и два новых -изобутирил- и иговалерилбензохинонилфуран, которые не находили ранее в корнях воробейника и суспензионной культуре, полученной в Японии.

Содержание эфиров шиконина в гексановом экстракте клеток штамма ВК-39 достигает 80,7 % (табл. 1), что значительно больше, чем в соответствующей фракции из корней и суспензионной культуры. Это достигается за счёт понижения содержания липофильных примесей и является важной технологической характеристикой, обеспечивающей получение вьсокоо чищенного шиконина и препаратов на его основе.

В кэллуеной культуре воробейника в течение пяти лет'сохраня-

- и -

ются стабильные соотношения нафтохинонов и их количественное со держание.

Установлено, что биосинтез хинонов происходит одновременно с ростом каллусов, при этом к концу культурального периода клетки накапливают в 3-7 раз больше эфиров шиконина по сравнению с 5-6-летними корнями растений.

РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССОВ РОСТА И БИОСИНТЕЗА ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

Для изучения влияния компонентов питательной среди на рост и продуктивность клеточной культуры воробейника использовали методы математического планирования эксперимента, в том числе метод случайного баланса, однофакторные и полные факторные эксперименты. Оказалось, что наибольшее влияние на изучаемые парамеции оказывают сахароза, нитраты, ионы меди, а также фитогормоли.

Сахароза в концентрации 30-35 г/л стимулировала рост меток и биосинтез эфиров шиконина, но дальнейшее повышение ее концепт-рации приводило к ухудшению продукционных характеристик культуры.

Исключение из состава питательной среды ионов аммонии привело к существенному увеличению содержания эфиров шиконина ь клеточной. культуре. Так, в каллусах содержание эфиров шиконина увеличилось с 6,0 до 8,0 %.. Однако на безаммонийной среде рост культур ухудшался при последующих пересадках ткани.

Ионы меди оказывак/г стимулирующее влияние не только на синтез шиконина, но и на накопление сырой и сухой биомассы.

Повышение концентрации ионов магния, бора, цинка (сверх кон-

центрации в среде Мурасиге-Скуга), а также агара уменьшало образование эфиров шиконина, а другие испытанные компоненты питательной среды не влияли на их количество.

Учитывая результаты предварительных опытов, мы предположили, что при достижении сбалансированности компонентов питательной среды удастся достичь совмещения направлений процессов роста культуры и биосинтеза конечного продукта В развитие этого предположения провели серию факторных экспериментов, в ходе которых изучили влияние взаимодействий компонентов питательной среды на рост и биосинтез эфиров шиконина. В табл. 2 представлены матрица результаты полного факторного опыта ПВД 23, в котором изучены эффекты сахарозы, нитрата аммония и сульфата меди.

Уравнения регрессии имеют следующий вид (обозначения параметров приведены в табл. 2):

(1) У1 - 950 +■ 130х2 + 95х3 + 65Х2Х3

(2) у2 - 95.3 +• 10,5x2 + 9,3х3 + 5,0х2х3

(3) у3 - 4.43 - 1.58х2 + 0,7хд - 0,53x^3

(4) у4 - 4,1 - 1,1х2 + 1,0х3

Подтвердилось сильное стимулирующее влияние ионов меди на изучаемые параметры. В то же время ионы аммония оказывают Солее избирательное действие - стимулируют рост, но иягибируют биосинтез. Ионы меди не предотвращают угнетающего действия ионов аммония на образование эфиров шиконина (уравнение 2 и 3). Наблюдается существенный эффект положительного влияния взаимодействия фак торов х2 (сульфат аммония) и х3 (сульфат меди) на накопление сырой биомассы каллусов (уравнение 1),. что в литературе для клеточных культур растительных клеток ранее не отмечалось.

Ионы меди рассматриваются в настоящее время как абиотический

Матрица и результаты полного факторного эксперимента 1МО 26 по изучению влияния компонентов питательной среды на рост каллусов воробейника и накопление эфиров шиконина

NN Факторы Средняя Средняя Содержание Содержание

опыта------------------ масса " масса эфироп ши- эфироь ши-

Саха- Суль- Суль- сырых сухих конина в шиконина в

роза, фат фат каллу- каллу- сухих кал- пересчете

г/л аммо- меди, сов. мг сов, мг сах, % на культ, ния, мг/л сосуд, мг мг/л

Х1 х2 х3 Vl Ч Уз

1 30 0 0,025 850 86 4,51 3,9

2 36 0 0,025 730 75 5,16 3,9

3 30 250 0.025 960 95 2,70 2,6

4 35 250 0.025 880 83 2,49 2,2

б 30 0 0,125 880 100 8,75 8,8

б 35 0 0.125 820 78 5,54 4,3

7 30 250 0,125 1260 120 3,31 4,0

8 35 250 0,125 1220 120 2,91 3,5

элиситор. Действительно, проведенные нами опыты показали, что ионы меди оказывают стимулирующее влияние на рост и биосинтез вторичных метаболитов и в других растительных культурах, например женьшеня (сведения не приводятся). Однако классические алисигори • полисахариды, по данным зарубежных авторов, стимулируют биосинтез шиконина и в присутствии высоких количеств аммония. В нашем случае внесение увеличенного количества сульфата меди в питательные среды не приводило к увеличению биосинтеза шиконина на фоне высокого содержания аммония, что может свидетельствовать о различии в механизмах действия меди и полисахаридов.

3

Для оптимизации питательной среды на основании [Ш 2 провели восхождение по поверхности отклика. Максимальное значение основных параметров (средняя масса сухих каллусов и содержание зфиров шиконина) достигнуто на третьем шаге восхождения. Оптимальная концентрация сульфата меди соотавила 0,275 мг/л, сульфата аммония - 141,0 мг/л.

2

В отдельном многофакторном опыте (ПФЭ 3 ) с тремя уровнями двух факторов изучили влияние фитогормонов. Оптимальные концентрации фитогормонов оказались такими же, какие используют для культуры ткани воробейника в Японии: кинетин - 2 мл/л; ИУК - 0,2 мг/л (М1гикап1 ег а!.. 1978).

Ниже приведен состав оптимизированной продукционной питатель

ГеБО 7Н„0 27,8

4 с

^ЕОТА-г^О 37,3

тиамина гидрохлорид 0,2 пиридоксина гидрохлорид 0,5 никотиновая кислота 0,5

ной среды, мг/л:

KNOg . 1900

(NH4)2S04 141

CaCl,,- 6Но0 665

t- с

MgSQ • ?Но0 370

4 2

KJUTO, 170

f. 4 '

Н3В03 6,2 мезо-инозит 100

1А1504- 4Н20 22,3 ЛУК 0,2

СоС1г>' 2Н20 0,025 кинетин 2,0

Си304' 5Н20 0,275 сахароза 30000

гп504«7Н2о 8,6 агар 6000

На^МэО^» 2Н«,0 0,25

«У 0,83 рН сред 5,6 до автоклавирования.

Эта среда получила индекс МС-32 и использовалась в дальнейшем для культивирования каллусов воробейника. Содержание эфиров шиконина в культуре увеличилось в среднем на 20 % при сохранении уровня накопления сырой и сухой клеточной биомассы.

ПОВЫШЕНИЕ ПРСДУЩИОШШХ ХАРАКТЕРИСТИК ШГЛШЛ ВК-39 ЗА СЧЕТ СТИМУЛЯЦИИ ВИКИМАТ- ФНШАШШПОВОГО БИОСШГЕТИЧЕСКОГО ПУТИ

Ключевой шаг биосинтеза шиконина - это образование м-гера-нил-п-гидроксибензойной кислоты из п-гидроксибензойной кислоты и геранилпирсфосфата, предшественников из шикимат-фенилаланинового и изопреноидного биосинтетических путей. Очевидно, что низкий уровень какого-либо исходного субстрата не позволит достичь высокого содержания шиконина в культивируемых клетках воробейника. Поэтому изучили влияиие п-гидроксибензойной кислоты и мева-лоновой кислоты на биосинтез эфиров шиконина. Был поставлен полный факторный эксперимент 1КС9 2й. План и результаты представлены в табл. 3. На основании полученных результатов рассчитаны коэффициенты в уравнениях регрессии: у^ - 7,1 + 0,7х1 + 0,2х2

у2 - 1,78 - 0.45х1 - 0,07х2 + 0,13х1х2

о

Матрица и результаты полного факторного эксперимента П<Ю 2 по изучению влияния мевалоновой и п-гидроксибензойной кислот на рост каллусов воробейника и накопление эфиров шиконина

Опыт Факторы Результаты

п-гидрокси- Мевалоновая Содержание Средняя сырая бензойная к-та, мг/л эфиров шико- масса каллусов,

к-та, мг/л нина, 7. г

Х1 х2 У1 У2 '

1 О О 6.2 2,44

2 140 О 7,6 1,27

3 О БО 6,6 2,03

4 140 50 8.0 1,39

Из результатов, приведённых в таблице, видно, что п-гид-роксибензойная кислота увеличивает содержание эфиров шиконина в к&члусах как при нижнем, так и при верхнем уровнях мевалоновой кислоты. Этот эффект статистически достоверен. Мевалоновая кислота проявляет лишь тенденцию к стимуляции биосинтеза нафто-хиноидных пигментов.

Исходя из этих результатов, а также литературных данных.

согласно которым образование геранил-п-пщрокеиоенэийноЛ кислой:! из мевалоновой кислоты в /слетках воробейника не лимитироьиии !ш на одном из этапов (Не)Je and Burger, 1969), заключили, «то изопренокдный путь обеспечивает достаточную поставку суСсгнтоа для биосинтеза ашконина при условиях, в которых ставился опт.

Увеличение содержания шиконина в метках при добавлении п-гидроксибензойной кислсш может свидетельствовать, что '.>то не щество лимитирует образование шконииа Установление эмн ю привело нас к идее поьис-ить внутриклеточное содержание n i ;<д роксибензойной кислоты посредством активации тока мита0о/.ш-0ь п.. цикишт-фенилапаниновому биосинтетическому пути. Дв.1 этою ik-ofj ходино увеличить внутриклеточную концентрацию одного из клмк. eux метаболитов этого пути - фенилапашша. Как известно, д.. « увеличения эндогенного содержания фенилаланина и мю т.чкк( вать селекцию клеток на средах, содержащих антмет^шп- с,*.« аминокислоты - п-флюорофеннлаланин (PFP).

Селекцию клеток вели двумя путями: в первом случае иии«дь аовали сублетальниэ доз и PFP 1725 мкЫ) ; во втором • дог»у иигиЛи тора увеличнва!Ш постепенно с 220 до 1080 или 2170 ыкЫ. При к .л дом селективном u.are каллусы пассировали триады, отбирая л/чши. ткани. Результаты по некоторым линиям представлены в TaO/i '1 Содержание эфиров шикоНииа в селекционных линиях увеллчпл^.ь г 7,2 % до 10,4-12,8 % в пересчете на сухую массу клеток.

Интересно отметить, что высокая концентрация ИТ ■ ;:гл> и-н приводила к полной остановке биосинтеза эфнров шикиннна i-лл лусные агрегаты имели белый цьет. В дальнейшем эти клетки огт-ро восстанавливали способность синтезировать красный пигмент при удалении флюоро'фенилаланши из сред (табл. 4). При меньших кип

Содержание эфиров шиконина в исходной и РГР-реэистентной линиях воробейника краснокорневого

Линии

Схема селекции (РРР. мкМ)

Содержание эфиров шиконина, % от сухой массы клеток

Исходная

РК-39-5 7.2 + 0,6 *

Селекционные: пассажи **

2-Й 10-й 11-Й 12-й Среднее

ВК-39-55 РГР 725 13,6 12,9 13,5 11.1 12,8 + 0.6

Ш-39-53 РГР 725- 1080 7,3 12.8 11,6 10,0 10,4 + 1,2

ВК-39-50 Р1ГР 220- -1080 9.8 12.6 12,3 11.4 11.5 + 0,6

ВК- 39-56Р РГР 220- -1080-2170 - 12,0 14,2 11,7 12,6 + 0,8

Примечание: * - содержание эфиров шиконина в исходной линии , определено в течение 12 пассажей в 1990-1991гг.

** - номера пассажей селекционных линий, выращиваемых на средах без РРР (2-й пассаж - февраль 1991г.).

центрациях ингибитора каллусы были красными, но содержание суммы эфиров шиконина в них было ниже, чем в исходной линии. Повышение содержания зфиров шиконина в селекционных линиях по сравнению с исходной наблюдалось только после удаления PFP из сред.

Как видно из табл. 4, все селекционные линии достоверно повысили продуктивность. Одна из линий, BK-39-56F, предложена для депонирования как новый штамм-суперпродуцент эфиров шиконина, максимальное содержание которых в 11-м пассате достигло 14,2 Z от сухой массы клеток. Это значение в 7-14 раз превышает содержание эфиров шиконина в корнях воробейника. Достигнутые продукционные характеристики стабильны в пассажах..

На рис. 1 представлены ростовые характеристики исходной и PFP-резистентной линии BK-39-56F при выращивании их на средах, содержащих PFP.

В области умеренных концентраций ингибитора (до 217 мкМ) селекционная линия полностью к нему устойчива. Исходная линия, в отличие от селекционной, снижает ростовые характеристики при низких значениях PFP и погибает при концентрации PFP 2175 мкМ.

На основании этого графика рассчитана ЕД50 PFP (доза, вызывающая 50 7. ингибирования роста ткани) для клеток воробейника, которая составила 725 мкМ. Клетки других растений обычно более чувствительны к действию этого ингибитора - ЕДдд для клеток Nicotians tabacum составляет 170 мкМ, для клеток Cathai-anthus rosaus - 80 мкМ. Клетки растений Anchusa officinal is, способные синтезировать б9льшое количество фенольных соединений (производных розмариновой кислоты), так же как и клетки воробейника, устойчивы к действию PFP - ЕД^ -для них составляет 650 мкМ (Quesnel and Ellis, 1989). Причина природной устойчивости к PFP

Масса сырых каллусов (% от контроля)

рация РРР. мкМ

Рис.1 Рост исходной (а) и РРР-резистентной (0) каллусных линий воробейника на среде с л-флюорофенилаланишм (РРР).

у {/астений, синтезирующих большое количество фенольных соединении и, следовательно, имеющих активно работающий шикимат-фенил-а^аниновый биосинтетический путь, может заключаться в способности (меток этих растений синтезировать повышенное количество фе-нилаяанича.

В результате селекции клеток ВК ЗУ на средах с возрастающей ■^ти-итраци.-Н РРР достигли повышении устойчивости к этому селективному игеI,ту. Так. £Д,-П селекционной линии ВК-39-56Р составила

- 21 -

1220 мкМ, что в 1,7 раза превышает исходный уровень.

При проверке содержания транс-коричной, л-гидроксибензойной кислот и гликозида п-гидроксибензойной кислоты в исходной и РГР-резистентной клеточных линиях воробейника, установили, что эти вещества в клетках не накапливаются. Эти результаты соответствуют литературным данным, согласно которым количественный выход п-гидроксибензойной кислоты зависит только от величины субстратного потока, поступающего из исходной реакции дезамини-рования фенилаланина.

Таким образом разные способы селекции культуры дают среднее увеличение содержания эфиров шиконина в клетках примерно на 75 7..

СОСТОЯНИЕ и ПЕРСПЕКТИВЫ ПРОМШ1ЛЕ1ШОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ВОРОБЕЙНИКА КРАСИОКОРИЕВОГО

Культура клеточного штамма ВК-39 передана для- промышленного испытания на Омутнинский химический завод (НПО "ВОСТОК", пос. Восточный Кировской обл.) в октябре 1989 года В мае 1990 года штамм ВК-39 передан на предприятия концерна "Космофарм" (Казахстан). С момента передачи штамма осуществляли авторский над-вор над состоянием штамма и прослеживали динамику изменения его ростовой и биосинтетической активности. Штамм успешно адаптирован к условиям промышленного производства на этих предприятиях. Это позволило заводам перейти к отработке методики выделения шиконина. Концерн "Космофарм" разработал рецептуры парфюмерных и косметических препаратов на основе шиконина и готовит их производство.

шводн

1) Получен высокопродуктивный штамм БК-39 клеток корней растений воробейника краснокорневого;

8) Изучено влияние компонентов питательной среды на рост и биосинтез эфиров шиконина; разработана и оптимизирована питательная среда, обеспечивающая одностадийное выращива-лие культуры;

3} Состав эфиров шиконина в культуре ВК-39 соответствует составу этих веществ в корнях интактных растений, что позволило рекомендовать биомассу клеток воробейника как воспроизводимый сырьевой источник для получения препаратов шиконина;

4) Установлено, что клетки полученного штамма обладают способностью стабильно продуцировать нафгохиноидные пигменты в течение долговременного культивирования;

5) Штамм ВК-39 депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений под номером 36 и передан на заводы в России и Казахстане для промышленного использования;

6) Изучена возможность регуляции биосинтетического пути образования шиконина в культуре клеток. Проведена селекция клеток во!юбейника, резистентных к п-флюорофенилаланину и получен новый штамм-суперпродуцент,.устойчивый к действию этого ингибитора, накапливающий до 14,2 7. суммы эфиров шиконина от сухой массы клеток.

Список работ, . опубликованных по материалам диссертации

1. А.с. N 1707073 МКИ С12 N6/04, 5/00. "Штамм культивируемых клеток растений Lithospernim erythrorhizon Sleb. et Zucc.

- продуцент шиконина". Журавлёв Ю.Н., Булгаков В.П., Писец-кая Н.Ф., Козыренко М. М., Старун Т.В., Артюков А.А., Федо-реев С.А.// Открытия. 1990. N Б.

2. Козыренко М.М., Булгаков В.П., Журавлёв Ю.Н., Федореев С. А. Биосинтез производных шиконина в каллусной культуре LI thospermw erythrorhizon Sieb. et Zucc. // Растит, ресурсы. 1991. Вып. 4. С. 78-81.

3. Федореев С.А., Денисенко В.А., Кулеш Н.И., Красовская Н.Н., Козыренко М.М., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Исследование химического состава хиноидных пигментов из клеточной куль-ры ВК-39 Llthosper/mm erythrorhizon (Sieb. et Zuoo.) // Хим.-фарм. журн. 1993. Вып. 6. С. 33-37.

1. Булгаков В.П., Козыренко М.М., Журавлев Ю.Н. Увеличенное образование шиконина в п-флюорофешааланин резистентных клетках L,lthospermum erythrorhizon // Тез. докл. между нар. конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алма-Ата. 1993. С. 171.

i. Bulgakov V.P., Kozyrenko М.М., Zhuravlev Y.N. High productivity of shlkonin derivatives in p-fluorophenylalanine resistant cell of Llthospermm erythrorhizon // Abstracts. XV International Botanical Congress. Tokyo. 1993. P. 531.