Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика взаимоотношений Yersinia pseudotuberculosis с растительными клетками

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика взаимоотношений Yersinia pseudotuberculosis с растительными клетками"

На правах рукописи

OQ3452451

Персиянова Елена Викторовна

/

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМООТНОШЕНИЙ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS С РАСТИТЕЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

03.00.16 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 Ч 'J Г\ О oong

Владивосток 2008

003452451

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий ГУ научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН г. Владивостока

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Тимченко Нэлли Федоровна

Научный консультант:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, Булгаков Виктор Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Бузолева Любовь Степановна

кандидат биологических наук, Змеева Вера Николаевна

Ведущая организация:

ГУ научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва

Защита состоится 28 ноября 2008 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.056.02 при Дальневосточном государственном университете МОН РФ по адресу: 690950, г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27, ауд. 435.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу. 690950, г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27, комн. 417, кафедра общей экологии.

Факс: (4232) 45-94-09.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дальневосточного государственного университета МОН РФ.

Автореферат разослан «28» октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия все большее внимание привлекает к себе группа патогенных микроорганизмов, способных с одной стороны паразитировать в организме теплокровных животных и человека, с другой - обитать в окружающей среде. Возможность сапрофитического существования ряда патогенных микроорганизмов в окружающей среде, совершенно отрицаемая в недавнем прошлом, находит все большее признание (Сомов, Литвин, 1988; Бухарин и др., 2007). Научно-технический прогресс и связанная с ним урбанизация нарушили экологическое равновесие и открыли пути для проникновения патогенных микроорганизмов из внешней среды в окружение человека. Ярким примером в этом отношении является Y. pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулеза (или дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки) у человека и животных (1'рунин и др., 1960). Малоактивные природные очаги псевдотуберкулеза в результате антропогенной трансформации превратились в мощные антропургические очаги, проявляющиеся высокой заболеваемостью населения (Кузнецов, 1994).

Анализ многочисленных вспышек псевдотуберкулеза показал, что чаще всего факторами передачи бактерий человеку являются овощи и корнеплоды (блюда, приготовленные из них) и, прежде всего свежая капуста, в которых иерсинии размножаются и накапливаются в значительных количествах, поддерживая высокую степень вирулентности (Рожкова, 1977; Сомов, 1979).

Изложенные факты свидетельствуют о том, что для поддержания жизнеспособности и численности популяции во внешней среде Y. pseudotuberculosis используют растения. В связи с этим, возникло много вопросов и, прежде всего, способны ли бактерии реализовать патогенный потенциал, какие механизмы и биомолекулы используют эти микроорганизмы при взаимодействии с растениями, как осуществляется действие их факторов патогенности с инвазивной и токсической функциями, отвечают ли растения на агрессию патогена К началу наших исследований мы обнаружили в доступной литературе лишь несколько работ, авторы которых первыми попытались рассмотреть взаимодействия растений и Y. pseudotuberculosis с экологических позиций (Беседнов, Венедиктов, 1986; Венедиктов и др., 1989).

Раскрытие закономерностей воздействия бактерий псевдотуберкулеза на растения и их ответной реакции на это действие внесет вклад в понимание стратегии патогенности этих микробов вне теплокровного организма, а также в обоснование механизмов адаптации эукариогических организмов, в том числе растений, на изменения условий их существования, особенно на действие экстремальных факторов.

Цель и задачи исследования. Изучить взаимодействие Y. pseudotuberculosis с растительными клетками в системе «паразит-хозяин», включающее раскрытие характера действия факторов патогенности микроорганизмов и ответную реакцию клеток на действие бактерий.

Для достижения поставленной цели были определены и последовательно решались следующие задачи:

1. На модели взаимодействия «паразит-хозяин» изучить динамику размножения Y. pseudotuberculosis в клеточных культурах разных видов растений (женьшеня Panax ginseng, кирказона Aristolochia manshuriensis, воробейника Lithospermum erythrorhizon, капусты белокочанной Brassica oleracea) и показать влияние иерсиний на жизнеспособность клеток при совместном культивировании.

2. В модельных экспериментах, для характеристики взаимоотношений «паразит-хозяин», выявить этапы взаимодействия Y. pseudotuberculosis с клетками растений (контакт, проникновение и токсическое действие).

3. Исследовать действие белковых токсинов Y. pseudotuberculosis на растительные клетки, как один из механизмов реализации патогенных свойств паразита.

4. Установить возможность индукции экспрессии защитных генов в клетках женьшеня на воздействие Г. pseudotuberculosis и их токсинов, как адаптивную реакцию на стресс, и определить жизнеспособность клеток с индуцированным иммунным ответом при действии бактерий.

5. Исследовать ответную реакцию растений табака с разной чувствительностью к вирусу табачной мозаики (устойчивого и чувствительного сортов) на действие Y. pseudotuberculosis и их токсинов..

6. Разработать среду на основе водного экстракта из клеток женьшеня для выделения Y. pseudotuberculosis из внешней среды и материала от больных.

Научная новизна работы и теоретическая значимость исследований.

Впервые в эксперименте установлено, что Y. pseudotuberculosis способны взаимодействовать с растительными клетками: бактерии псевдотуберкулеза размножались в клеточных культурах разных растений и влияли на их жизнеспособность при совместном культивировании, при этом длительность размножения бактерий зависела от вида клеточной культуры.

Выявлено, что бактерии псевдотуберкулеза способны проникать в межклеточные пространства клеток женьшеня настоящего P. ginseng и капусты белокочанной В. oleracea, прикрепляться и проникать в клеточную стенку, в цитоплазму, разрушать клетки этих видов растений.

Показано, что в ответ на действие белковых токсинов Y. pseudotuberculosis развивался некроз клеток женьшеня и кирказона.

Установлено, что Y. pseudotuberculosis, инъецированные в растения табака N. tabaccum, в зависимости от дозы заражения, вызывали повреждение и гибель растений, как устойчивых, так и восприимчивых к вирусу табачной мозаики.

Показано, что Г. pseudotuberculosis снижали скорость роста клеточной культуры женьшеня, обладающей малой активностью защитных генов, и не влияли на рост клеток P. ginseng, обладающих высокой экспрессией этих генов. Микроорганизмы активировали и вызывали повышение экспрессии защитных генов фенил ал анин аммиак-лиазы и Р-1,3-глюканазы в клетках женьшеня.

Практическая значимость. Теоретические разработки, представленные в настоящей работе, явились основанием для создания жидкой среды накопления

Y. pseudotuberculosis для более эффективного выделения этих микроорганизмов из внешней среды и для диагностики псевдотуберкулеза. Среда апробирована в экспериментальных условиях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Бактерии псевдотуберкулеза размножаются в культурах клеток растений P. ginseng, A. manshuriensis, L. erythrorhizon, В. oleracea, длительность этого процесса зависит от вида растений.

2. Бактерии псевдотуберкулеза используют факторы патогенности с инвазивной и токсической функциями при взаимодействии с клетками капусты В. oleracea и женьшеня P. ginseng. Они повреждают клетки растений, проникая в межклеточные пространства, меточную стенку и цитоплазму. Токсины бактерий вызывают некроз клеток женьшеня и кирказона, ингибируя синтез ДНК.

3. Клетки женьшеня распознают Y. pseudotuberculosis В ответ на действие бактерий псевдотуберкулеза в них развивается иммунный ответ. Трансгенные кулыуры женьшеня с повышенным иммунным статусом устойчивы к инфицированию бактериями.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Ростов-на-Дону, 1999), на международных конференциях «Сознание и наука: взгляд в будущее» (Владивосток, 2001), 8-мом Международном симпозиуме «The genus Yersinia. Entering the functional genomic era» (Финляндия, 2002), на VI Тихоокеанской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2005), XIII Международном конгрессе по приполярной медицине, в рамках «Международного Полярного Года» (Новосибирск, 2006), на конференции молодых ученых, посвященной 20-летию ВСНЦ СО РАМН «Актуальные вопросы современной фундаментальной и клинической медицины» (Иркутск, 2007).

Публикации. Но материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертаиии. Диссертация состоит из введения, двух глав литературного обзора, описания объектов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы (353 источников, из них 193 иностранных авторов) Работа изложена на 166 страницах, иллюстрирована 27 рисунками и 4 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы Глава 1. Экология Yersinia pseudotuberculosis

В главе анализируются имеющиеся литературные данные по всем аспектам экологии Y. pseudotuberculosis, эпидемиологии, вызываемой данными микроорганизмами инфекции. Рассматривается роль растений в существовании бактерий псевдотуберкулеза и циркуляции их во внешней среде.

Глава 2. Защитные механизмы растений в ответ на действие микроорганизмов

В главе рассматриваются возможные факторы патогенности микропаразитов, с помощью которых они способны инфицировать растения и приводить к развитию заболевания. Также освещены разнообразные механизмы защиты, индуцируемые в растениях в ответ на воздействие фигопатогенов.

Собственные исследования Глава 3. Материалы и методы исследования

Штаммы микроорганизмов и их токсины. При выполнении экспериментов использовали штаммы Y. pseudotuberculosis из коллекции ГУНИИЭМ СО РАМН: штамм 512 I серовара, несущий плазмиду вирулентности (pYV+) молекулярной массой 48 МД, пггамм 2517 Ш серовара (pYV+), и генетически связанный штамм 2517а, утративший плазмиду (pYV"). Термостабильный летальный токсин (ТСТ Yp), видоспецифический белок молекулярной массой 45 кДа (штамм 512 I серовара), и термолабильный летальный токсин (TJITYp), белок молекулярной массой 200 кДа (пггамм 2517 Ш серовара).

Штаммы клеточных культур растений. Использовали линии женьшеня настоящего Panax ginseng С.А. Меу.: культуры Rl, GV, и трансгенные - 2с2, 2cR2; воробейника краснокорневого Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. линии BK-39; кирказона маньчжурского Aristolochia manshuriensis Кот. линии А-2; капусты белокочанной Brassica oleracea L. Все клеточные культуры инкубировали в темноте при 25°С, относительной влажности воздуха 70% в течение 15-30 сут. Кроме того, использовали растения табака Nicotiana tabaccum L. сверхчувствительные к вирусу табачной мозаики сорта Ксанга нк и чувствительные к вирусу сорта Самсун. Растения выращивали в теплице, для экспериментов использовали 40-60-дневные растения (стадия 12-14 листьев).

Микробиологические методы. Идентификацию взятых в работу микроорганизмов проводили согласно инструкции «Эпидемиологическая, лабораторная диагностика иерсинеозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемиологических мероприятий» № 15-6/42 от 30.10.90. Определяли культурально-морфологические, биохимические, серологические и вирулентные свойства использованных культур бактерий псевдотуберкулеза, наличие в них ДНК pYV Готовили серийные десятикратные разведения культур микроорганизмов в физиологическом растворе либо дистиллированной воде по стандарту мутности ГИКБП имени JI.A. Тарасевича (10 ЕД = 10' микробных клеток в 1 мл раствора).

Заражение клеточных культур растений проводили в асептических условиях путем нанесения на них взвеси бактерий в дозах от 10 до 106 микробных клеток (мк). Листья растений табака заражали Y. pseudotuberculosis в концентрации 103-108 мк/мл путем нанесения бактериальной культуры на нижнюю поверхность листьев, либо введением суспензии микроорганизмов и их токсинов с помощью медицинского шприца, ' либо механической инокуляцией. В динамике определяли число жизнеспособных

микроорганизмов, выражая его среднегеометрическим показателем числа колониеобразующих единиц на грамм растительной ткани (lg КОЕ/г).

Для выяснения способности иерсиний проникать в другие органы растения, в динамике и по завершению опыта высевали материал из зараженных и незараженных органов растений.

Жидкие среды (водный экстракт женьшеня, ФБР Петерсона-Кука, индикаторную среду, среды на основе растительного экстракта) заражали бактериями псевдотуберкулеза в концентрациях 102-104 мк/мл, инкубировали при температуре 6-8°С либо 18-20°С, в зависимости от целей экспериментов, в течение 7-15 дней. Для изучения эффективности питательной среды R1 (накопления и выделения иерсиний из внешней среды) в образцы сред вносили Y. pseudotuberculosis в дозах 10, 100 мк/мл в смеси с другими бактериями из кала человека. Определяли среднегеометрический показатель числа жизнеспособных бактерий в мл пробы (lg КОЕ/мл).

Методы культуры ткани. Пересадка клеточных культур, культивирование их на питательных средах, определение прироста сырой биомассы.

Биохимические методы. Выделение и очистку термостабильного и термолабилыюго токсинов У. pseudotuberculosis проводили согласно указаниям (Тимченко и др., 1987; Тимченко и др., 2004), которые включали: накопление и лизирование бактериальных клеток, высаливание сульфатом аммония, элоция на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой и сефадексом G-200. Белок в образцах определяли по методу Бред форд (Bradford, 1976). Токсическую активность выражали в ЛД50 (Ашмарин, Воробьев, 1963)

Цитология. В динамике делали мазки контрольных и зараженных клеток растительных культур, окрашивая их водным раствором метилеяового синего (концентрация Ю^-Ю"5) в течение 5-10 мин (Степура, Сидоренко, 1970). Препараты просматривали в световом микроскопе Amplival (Германия) при увеличении 200х. Подсчет клеток вели по полям, определяя число жизнеспособных и мертвых растительных клеток на 2000 сосчитанных (живые клетки окрашивались красителем, а мертвые оставались бесцветными).

Электронная микроскопия. Зараженные иерсиниями клетки капусты и женьшеня фиксировали в 3%-ном растворе глутарового альдегида и дополнительно в 1% р-ре 0s04, обезвоживали в этиловых спиртах, ацетоне, заключали материал в эпон-аралдит, делали полутонкие и ультратонкие срезы и контрастировали в растворах уранил-ацетата (Уикли, 1975) и цитрата свинца (Reynolds, 1963). Срезы просматривали и фотографировали на трансмиссионном электронном микроскопе Jeol 100 В (Япония).

Радиоизотопный метод. Для исследования действия токсина TCTYp на скорость синтеза ДНК в клетках женьшеня, в активно растущую суспензионную культуру R1 добавляли меченый тритием тимидин В динамике отбирали аликвоты и определяли радиоактивность образцов в толуольном сцинтилляторе на счетчике радиоактивности Результаты оценивали по количеству импульсов в минуту (ерш) (Терентьева, 1987).

Молекулярно-биологические исследования. РНК выделяли из клеточных культур женьшеня в соответствии с ранее описанной методикой (Kiselev et al.,

2006). При проведении ОТ-ПЦР просчитывали ПЦР-продукты с использованием биоанализатора (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, США). Первая цепь ДНК была синтезирована с помощью обратной транскриптазы M-MLV ("Силекс", Россия) согласно протоколу производителя.

Продукты ОТ-ПЦР секвенировали с использованием набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (Applied Biosystems, США) по методике производителя на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyzer, США на базе БПИ ДВО РАН. Участки целевых генов, ограниченные вырожденными праймерами, были секвенированы, и на их основе были и получены аминокислотные последовательности при помощи программы Gene runner 3.05. Далее их сравнивали с с известными аминокислотными последовательностями в программе NCBI BLAST.

Статистика. Результаты экспериментов обработаны с помощью компьютерных программ biStat Guide Version 3.01, 32 bit for Win X/NT, (DATASETI .ISD) и Statistica, версия 8.0. Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка. Полученные результаты проверены по спаренному критерию Стьюдента. Уровень значимости в 0,05 был выбран как минимальное значение статистической разницы.

Глава 4. Изучение действия факторов патогенности Y. pseudotuberculosis с инвазивной и токсической функциями в системе с клеточными культурами растений

После внесения в систему с культурой женьшеня Y. pseudotuberculosis размножались в течение 3-4 сут до тех пор, пока значительная часть растительных клеток в популяции оставалась жизнеспособной (рис. 1). 120 -

3 4 5 6 7 8 9 Время наблюдений, сутки

ШШ Цитология каллуса, некрозы,контроль ШШ Цитология каллуса, некрозы, опыт -lgKOE/r

Рис. 1. Взаимодействие Y. pseudotuberculosis с клетками P. ginseng, штамм R1.

В эти сроки число микроорганизмов превысило исходные значения в сотни раз. Цитологические исследования функционального состояния растительных клеток в динамике (3-18 сут) показали, что в контроле число жизнеспособных клеток женьшеня существенно не изменялось и составляло 82,9-73,9%, соответственно. В опыте на 3 сут в растительной культуре выявлялся некроз, и к 5 сут число мертвых клеток достигло 63,6%. В эти сроки в системе началось снижение числа жизнеспособных иерсиний. К 11-14 сут иерсинии не высевались. К 18 сут в опытной культуре женьшеня живые клетки не обнаружены, а в контроле они сохраняли жизнеспособность и нормально развивались. О гибели растительных культур свидетельствовал также факт, что после пересадки клеток растений из опытных образцов на свежую питательную среду, они не росли.

Подобное поведение иерсиний отмечено в системе с культурой кирказона (рис. 2). В течение первых 9-11 сут бактерии размножались, и их число увеличилось за этот период более чем на 5 порядков. Визуально к 3-7 сут клетки чернели и теряли тургор, что характеризовало некроз растительной культуры. Начиная с 12 сут после инфицирования культуры кирказона, наблюдалось снижение числа бактерий псевдотуберкулеза от 7,25±0,01 1§ КОЕ/г до 1,8±0,01 КОЕ/г к 18 сут. Через 21 сут наблюдений бактерии псевдотуберкулеза в системе с клетками кирказона не обнаружены.

Рис. 2. Динамика роста Y. pseudotuberculosis в системе с клеточными культурами растений.

В ассоциации с культурой воробейника, первые двое суток число иерсиний оставалось неизменным, по сравнению с исходной дозой заражения, и

Исх. доза

2 4 6 8 11 14 21 30 41 48 60 Время наблюдений, сутки

Женьшень —О— Кирказон -й— Воробейник • Капуста

составляло 3,8 ^ КОЕ/г (рис. 2). Затем микроорганизмы стали активно размножаться, и к 30-м сут их количество в десятки тысяч раз превысило исходный уровень. Естественное старение культуры клеток воробейника незначительно повлияло на снижение интенсивности роста иерсиний, а при создании определённой влажности, бактерии выживали и в мёртвых растительных клетках до 98 сут наблюдения.

В эпидемиологическом и патогенетическом аспекте важно было исследовать поведение бактерий псевдотуберкулёза при взаимодействии с культурой капусты. В культуре клеток этого растения бактерии быстро размножались, и с третьего дня культивирования их количество увеличилось с 2 до 8 КОЕ/г сырой массы и оставалось неизменным до 60 сут наблюдения (рис. 2). Микроорганизмы повреждали культуру капусты, и длительно размножались как с живыми, так и с мёртвыми клетками. Такой тип взаимодействия свидетельствовал о том, что патоген не распознавался растительными клетками и хорошо согласовывался с ранними данными об этом растении как важном природном резервуаре иерсиний и факторе передачи возбудителя человеку.

С помощью методов электронной микроскопии тонких срезов выявлены этапы взаимодействия иерсиний с клетками культуры В. о1егасеа, которые представлены на рис. 3.

Рис. 3. Локализация Y. pseudotuberculosis в клеточной культуре капусты.

а - иерсинии в межклеточном пространстве (1 сут); б - делящаяся бактериальная клетка в межклеточном пространстве (2 сут); в - проникновение бактерии через клеточную стенку (2 сут); г - бактерии в клеточной стенке (2 сут); д - бактерия в цитоплазме клетки (3 сут); е - разрушение клеток (4-5 сут). КС - клеточная стенка, М - митохондрия, Ц - цитоплазма, ЭР -эндоплазматический ретикулум, Б - бактерия.

Через пять часов после внесения 7. pseudotuberculosis (в дозах 104-105 мк) в клеточную культуру, бактерии с ее поверхности проникали в межклеточное пространство, размножались там (рис. 3 а, б).

Ко 2-м сут Y. pseudotuberculosis прикреплялись к клеточной стенке В. oleracea, проникали и разрушали ее (рис. 3 в, г). В месте проникновения бактерий наблюдались сгустки электронно-плотного вещества, что, возможно, указывает на выработку иерсиниями литических ферментов (рис. 3 в). На 3 сут микроорганизмы выявлялись внутри частично разрушенной цитоплазмы клеток капусты, где уже невозможно было различить каких-либо органелл (рис. 3 д). К 4-6 сут после заражения в среде с иерсиниями выявлялись в основном мертвые клетки капусты с нарушенной цитоплазмой, с разрушенными органеллами и фрагментами клеточных стенок (рис. 3 е).

Рис. 4. Локализация Y. pseudotuberculosis в клеточной культуре женьшеня. а - иерсинии в межклеточном пространстве (1 сут); б - адгезия (1-2 сут); в -бактерии в цитоплазме клетки (3 сут); г - лизис клеток под воздействием бактерий (4-5 сут); д - морфология иерсиний в клетках (4 сут). КСр - растительная клеточная стенка, JIB - липофильная вакуоль, ЭР - эндоплазма-тический ретикулум, Б - бактерия, Ф - фибриллы хроматина зоны нуклеоида.

Аналогично системе с культурой клеток капусты, в культуре клеток женьшеня Y. pseudotuberculosis в первые часы проникали с поверхности в межклеточные пространства, прикреплялись к клеточной стенке, повреждали ее, и через сутки выявлялись в цитоплазме клеток (рис. 4 а, б, в). К 3-4 сут взаимодействия значительная часть растительных клеток, заселенных иерсиниями, погибала (рис. 4 г). В эти сроки бактерии псевдотуберкулеза имели строение типичное для S-форм грамотрицательных бактерий (рис. 4 д).

Термостабильный (в дозе 0,15-50 мкг) и термолабильный (в дозе 0,12 мкг) летальные токсины Y. pseudotuberculosis вызывали тяжелые морфологические повреждения и впоследствии некроз клеток женьшеня и кирказона. Термостабильный токсин подавлял включение экзогенного меченого нуклеозида в ДНК клеток женьшеня, что свидетельствовало о влиянии TCTYp на биосинтез ДНК растительных клеток (рис. 5), причем с увеличением количества токсина - быстрее снижалась скорость включения радиоактивной метки в ДНК.

Время инкубации, сут

-♦-1 —П—2 —А—3 —О—4

Рис. 5. Влияние термостабильного токсина Y. pseudotuberculosis на биосинтез ДНК в клетках женьшеня линии Rl. 1 - Контроль (без токсина); 2-5 мкг/мл TCTYp; 3-10 мкг/мл TCTYp; 4-20 мкг/мл TCTYp.

Таким образом, Y. pseudotuberculosis, используя факторы патогенноети с инвазивной и токсической функциями, как паразиты, способны размножаться в клеточных культурах растений женьшеня, кирказона, капусты, повреждать и приводить к их гибели.

Глава S. Влияние Y. pseudotuberculosis и их токсинов на индукцию защитных реакций в клеточных культурах женьшеня P. ginseng

На этом этапе работы мы сравнили влияние бактерий псевдотуберкулеза на рост контрольной культуры женьшеня GV и трансгенных культур 2с2 и 2cR2. В последних двух культурах экспрессирован ген rolC из Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes на низком (2с2) и высоком уровнях (2cR2), что приводит к созданию устойчивого защитного статуса клеток (Kiselev et al, 2006). Соответственно, контрольная культура GV обладала низким защитным статусом, 2с2 - средним и 2cR2 - высоким.

Клетки культур GV и 2с2 в отсутствие иерсиний (контроль) активно росли, и к 40-му дню культивирования их биомасса была в 15 раз больше массы первоначального инокулюма (0,2 г). При внесении Y pseudotuberculosis в дозе 10 -106 мк/г, клетки GV практически прекращали рост, по сравнению с контролем (рис. 6 а), тогда как рост клеток 2с2 был несколько понижен (рис. 6 б).

Клетки культуры 2cR2 в контроле отличались слабым ростом, давая прирост биомассы к 40-му дню в 3 раза по сравнению с посадочной массой (рис. 6 в). При внесении Y. pseudotuberculosis в эту культуру растительные клетки продолжали расти, и рост их не отличался от контрольных. Таким образом, чем выше был защитный статус клеток женьшеня, тем меньше они повреждались бактериями.

о 10 20 30 40

■2cR2 —•— 2cR2 + Y.p.

Рис. 6. Показатели роста клеток женьшеня линии GV (а), 2с2 (б), 2cR2 (в) в норме и в ассоциации с Y. pseudotuberculosis (Y.p.). Стрелкой отмечено внесение иерсиний в культуру; ось абсцисс - время культивирования, сутки; ось ординат - прирост сырой биомассы клеток, г.

Анализ жизнеспособности Y. pseudotuberculosis в этих зараженных культурах показал, что уже к 3 сут после внесения иерсиний во всех системах количество бактерий резко снизилось, и к 7 сут микроорганизмы в опытах не выявлялись.

При действии фитопатогенов, в растениях многократно возрастает количество фенилаланин аммиак-лиазы (PAL) или глюканазы (GLU) (Leubner-Metzger, Meins, 1999). Поэтому, эти белки являются маркерными для изучения иммунного статуса клеток. Для подтверждения активации защитных реакций в женьшене при действии бактериями псевдотуберкулеза, мы исследовали экспрессию соответствующих генов этих ферментов.

В незараженных культурах значение экспрессии генов PgPAL в клетках 2cR2 была более чем в 3 раза выше, чем в клетках GV, а экспрессия гена Pg-glul в клетках 2cR2 превышала таковую в клетках GV более чем в 27 раз (рис. 7 а, б).

3 1 т ■

и

GV 2с2 2cR2

Рис. 7. Показатели экспрессии генов PAL (а) и Pg-glul (б) в клеточных культурах женьшеня. Ось абсцисс - клеточные линии женьшеня; * Р< 0,05.

Количество транскриптов генов PgPAL и Pg-glul в культуре клеток 2с2 было промежуточным между значениями культур GV и 2cR2.

Y. pseudotuberculosis и их токсины (TCTYp и TJlTYp) (в дозах 103 мк, 25 и 0,6 мкг, соответственно) в первые сутки вызывали в клетках GV повышение суммарной экспрессии генов PgPAL в 2-4 раза по сравнению с контролем (рис.8). Повышенная экспрессия генов PgPAL сохранялась и на 3 сутки воздействия иерсиний и токсинов. Мы вьивили, что увеличивалась экспрессия всех известных генов PgPAL женьшеня {PgPAL l-PgPAL3). Значительней возрастала экспрессия гена подсемейства PgPALl, и стал экспрессироваться ген PgPAL2, что, возможно, говорит о большей их роли в биосинтезе защитных фитоалексинов.

Аналогично, при действии Y. pseudotuberculosis и их токсинов в 1-е сут достоверно возрастала экспрессия гена глюканазы Pg-glul в 3-4 раза, по сравнению с контролем. Повышенная экспрессия гена Pg-glul в опытных клетках GV сохранялась и на 3 сутки эксперимента.

К ТСТ ТЛТ Y.p. К ТСТ ТЛТ Y.p.

Рис. 8. Увеличение суммарной экспрессии генов PgPAL женьшеня в культуре клеток GV при добавлении Y. pseudotuberculosis и их токсинов на 1 и 3 день эксперимента.

Экспрессия в контрольных клетках (К); в клетках при добавлении токсина TCTYp (ТСТ); 'TJlT Yp (TJ1T) и бактерий (Y.p.). * Р<0,05.

Таким образом, клетки женьшеня активизируют экспрессию генов PgPAL и Pg-Glul под действием иерсиний и их токсинов, что свидетельствует о развитии иммунного ответа растительных клеток в ответ на такое действие. Динамика взаимодействия (быстрый некроз клеток женьшеня и быстрая гибель бактерий), а также высокая степень активации защитных генов указывают на то, что в клетках женьшеня развивается реакция гиперчувствительности.

Глава 6. Взаимодействие растений табака Nicotiana tabaccum сортов Ксаити ик и Самсун с К pseudotuberculosis и их токсинами

Исследования проведены с использованием разных концентраций иерсиний, которые инокулировались в листья табака уколом. В целом, низкие концентрации бактерий (103 мк/лист) вызывали поражение листа, высокие (108 мк/лист) - всего растения, средние (105-106 мк/лист) - промежуточные симптомы. При нанесении агаровой культуры Y. pseudotuberculosis на неповрежденную поверхность листьев табака обоих сортов, симптомы заболевания у растений не наблюдались, сами бактерии не проникали через эпидермис листьев - т.е. для проявления реакции необходимо было механическое внесение бактерий в ткани листа.

Динамика обсемененности инокулированных растений табака сорта Самсун и Ксанти нк бактериями псевдотуберкулеза (в дозе 103 мк/лист) показала, что бактерии в течение 1-4 суток интенсивно размножались в зараженных листьях, превосходя исходную концентрацию в 15-20 раз. По мере отмирания инфицированного листа снижалось и количество жизнеспособных иерсиний. К 13 сут их концентрация в листе приблизилась к исходной. К 18-23 сут бактерии в зараженных отмерших листьях не обнаруживались.

Инъекция бактерий псевдотуберкулеза в листья в дозе 108 мк/лист вызывала гибель растений сортов Ксанти нк и Самсун к 16-20 сут после инфицирования (рис. 9). Микроорганизмы в дозе 10б мк/лист вызывали заболевание инфицированных листьев и расположенных под ними листьев.

Рис. 9. Гибель растений табака N. tabaccum сорта Самсун и сорта Ксанти нк при инъекции Y. pseudotuberculosis в дозе 4x108 мк/лист.

а - растение сорта Самсун, б - растение сорта Ксанти нк; стрелкой указан инокулированный бактериями лист.

Несмотря на зараженность и отмирание листьев, подверженных действию бактерий, сами растения оставались до конца наблюдения (23-25 сут) в хорошем состоянии и даже цвели. При дозе 103 мк/лист растения активно росли и развивались до стадии цветения, лишь зараженный лист у этих растений желтел и отмирал. Растения сортов Ксанти нк и Самсун заражались в равной степени.

Ксанти нк не поражаются фитовирусами из-за наличия гена устойчивости (АО, "запускающего" каскад реакций гиперчувствительности, в результате которых образуется зона локального некроза, в которой вирусы погибают. Самсун не содержит такого гена и поражается вирусами. Эти данные указывают на то, что иерсинии взаимодействуют с табаком по пути, отличному от пути их взаимодействия с вирусами растений.

Обычно заболевали инокулированный бактериями лист и листья, расположенные под ним. Микробиологический анализ таких листьев показал, что иерсинии не распространялись по всему растению, а локализовались и размножались только в местах инфицирования. Эти данные свидетельствовали о том, что, либо токсины иерсиний, либо какой-то системный сигнал растения вызывали поражение неинфицированных листьев. Для проверки первого предположения изучили влияние токсинов на динамику поражения растений.

Термолабильный (TJITYp) и термостабильный токсины Г. pseudotuberculosis в дозах, дающие 100%-ную гибель мышей (10 и 0,12 мкг), не влияли на жизнедеятельность растений табака сорта Самсун. TJITYp в дозе 8 мкг вызывал локальный некроз растительных клеток в листьях табака. Термостабильный токсин в высокой дозе 50 мкг не вызывал явлений локального некроза Следовательно, гипотеза о поражении близлежащих листьев токсинами была отвергнута. По-видимому, феномен поражения близлежащих листьев обусловлен пока неизвестным сигналом растений.

Таким образом, на примере растений табака показано, что взаимодействие иерсиний и растений может носить не только характер быстрого ответа (реакция гиперчувствигельности, как показано на примере культуры клеток женьшеня, глава 5), но и медленного системного ответа

Глава 7. Экспериментальное обоснование применения жидкой среды накопления, содержащей экстракт из клеток женьшеня P. ginseng для диагностики псевдотуберкулеза

Результаты наших исследований по взаимодействию Y. pseudotuberculosis с растительными культурами показали, что иерсинии вызывая гибель клеток женьшеня, погибали и сами. Поэтому мы проверили действие водного экстракта из растительных клеток женьшеня на размножение бактерий.

В течение первых 2-х сут в контроле (колодезная вода) резко уменьшилось число микроорганизмов, и снижение их численности продолжалось до 5-6 сут, что соответствовало периоду адаптации бактерий (рис. 10) Исходная доза при заражении составила 2,29±0,1 lg КОЕ/мл, а через сутки она снизилась до 0,82±0,25 lg КОЕ/мл. С 7 сут начиналось постепенное размножение иерсиний

(экспоненциальная фаза роста), и к 19-м сут (срок наблюдения) численность бактерий уже составила 2,23±0,03 lg КОЕ/мл, равная таковой при заражении.

В системе с экстрактом 1:100 уже через сутки число микроорганизмов возросло в 100 раз (рис. 10). Так на 3-7 сут их численность превышала численность микробных клеток в контроле на 6,5 порядка. Количество иерсиний в опыте в последующие сроки инкубации продолжало нарастать и к 12 сут составило 8,2±0,12 lg КОЕ/мл. В контроле в этот период времени оно было равным \ ,56±0Д 4 lg КОЕ/мл.

В противоположность такому поведению Y. pseudotuberculosis в контроле и в экстракте 1:100, в пробах с нативным экстрактом иерсинии в системе не обнаруживались уже через 2 сут после внесения в систему и на протяжении всего срока наблюдения.

10 т

исх. 1 2 3 5 7 9 12 19 Время наблюдений, сут

ЕЗ Контроль И Экстракт 1:100 ■ Нативный экстракт

Рис. 10. Влияние водных экстрактов женьшеня на размножение иерсиний при 6-8°С. р - значимость различий по сравнению с контролем.

При разведении нативного экстракта в 2, 10, 25, 50, 100, 500, 1000 раз, мы выбрали оптимально-допустимое максимальное разведение нативного экстракта женьшеня, которое стимулировало рост иерсиний - это разведение в 100 раз.

На основе нативного экстракта женьшеня, разведенного в 100 раз, мы создали среды Ш, которую сравнили с другими средами накопления бактерий псевдотуберкулеза (ФБР Петерсона-Кука, индикаторная среда).

Было выявлено, что с 1-х сут после внесения бактерий при 18-20°С в индикаторной среде и среде Ш наблюдалось резкое (в 100 раз) увеличение числа микроорганизмов. В течение последующих четырех сут число иерсиний в

этих средах интенсивно росло, статистически не отличаясь, друг от друга. Разница в показателях количества микроорганизмов в этих двух средах и в ФБР Петерсона-Кука с 1 сут составила более 1 lg КОЕ/мл и сохранилась до 5 сут, составив приблизительно 2,3 lg КОЕ/мл (различия статистически достоверны, р<0,01).

Данные размножения иерсиний в средах при температуре 6-8°С представлены на рис. 11 Видно, что уже в 1 сут культивирования Y. pseudotuberculosis размножались несколько быстрей в среде R1, чем в других средах (р<0,01 по сравнению с ФБР), а на 2-3 сут концентрация иерсиний в R1 превосходила таковые в ФБР на 2-2,5 порядка.

I

ы>

>я к а.

\о о

£

й Среда R1

ЕЭ ФБР

I Инд. среда

1 2 3 5 7

Время наблюдений, сут

Рис. 11. Количество Y. pseudotuberculosis (lg КОЕ/мл) в средах накопления при 6-8°С. р - значимость различий по сравнению с ФБР Петерсона-Кука.

Таким образом, при оптимальном сроке культивирования 3 сут накопление бактерий псевдотуберкулеза при температуре 18-20°С и 6-8°С было интенсивней в индикаторной среде и среде R1, чем в ФБР.

Высокие показатели размножения иерсиний в растительной среде R1 позволили нам проверить ее при выделении бактерий псевдотуберкулёза из кала человека. В образцы сред (R1, индикаторная, ФБР) вносили Y. pseudotuberculosisв смеси с бактериями из кала человека. В 1 -3 -е сут, иерсинии не выделялись из всех опытных сред. Но к 5-8 сут накопительная способность среды R1 была выше других исследуемых сред, количество выросших колоний из R1 превышало таковые из ФБР и индикаторной среды на 2,5 lg КОЕ/мл (различия статистически достоверны, р<0,05). Однако среда R1 не тормозила

рост сопутствующей микрофлоры, и даже способствовала ему. Но с использованием щелочного метода обработки заразного материала перед высевом на плотную среду, можно свести к минимуму высеваемости посторонних микроорганизмов.

Таким образом, для улучшения диагностики псевдотубекулеза, нами предложена жидкая среда накопления бактерий на основе экстракта из клеток женьшеня - среда R1, стимулирующая размножение Г. pseudotuberculosis.

Заключение

Настоящая работа посвящена изучению взаимоотношений Y. pseudotuberculosis и растительных клеток, как система «паразит-хозяин». Мы исследовали поведение Y. pseudotuberculosis в клеточных культурах разных растений, свободно живущих в природе (женьшеня P. ginseng, кирказона А. manshuriensis, воробейника L. erythrorhizon) и окультуренных человеком (капусты белокочанной В. oleracea), а также ответную реакцию растений на действие патогена.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что Y. pseudotuberculosis, взаимодействуя с растениями, могут осуществлять разные формы симбиотических отношений. По-видимому, во взаимодействии с L. erythrorhizon, Y. pseudotuberculosis выступают в роли комменсала, используя растительную культуру для регуляции своих контактов с внешней средой, и не вступают с клетками воробейника в тесные отношения. С клетками же капусты, кирказона и женьшеня бактерии псевдотуберкулеза ведут себя как паразит, который приводит к гибели этих культур. Сами иерсинии длительно размножаются в культуре клеток воробейника и капусты, но быстро погибают в культурах женьшеня и кирказона.

Наиболее интересные результаты получены с культурой клеток женьшеня. Общая динамика взаимодействия была такова, что уже через 7 сут ко-культивирования жизнеспособные бактерии в системе не обнаруживались, а клетки женьшеня прекращали рост. Описанные события соответствуют тем, которые развивались бы при внесении типичного патогена растений (например, P. aeruginosa) при индукции реакции гиперчувствительного ответа Полученные данные ясно указывают на то, что происходит распознавание иерсиний клетками женьшеня и развитие в них иммунного ответа на внесение патогена. Заключение о типе реакции на этом этапе исследования сделать не представляется возможным, поскольку для этого необходимо идентифицировать ген резистентности женьшеня R и фактор патогенности иерсиний Avr и показать их взаимодействие. Теоретического запрета на такое взаимодействие нет, так как факторы патогенности фитопатогенов Erwinia, Pseudomonas и Xanthomonas и патогена человека Yersinia сходны. По-видимому, Y. pseudotuberculosis является вторым известным бактериальным видом, после Pseudomonas aeruginosa, который способен вызывать иммунный ответ, как у животных, так и у растений.

Выводы

1. Установлено, что патоген человека 7. pseudotuberculosis взаимодействует с модельными системами растительных клеток: женьшеня настоящего Р. ginseng, кирказона маньчжурского A. manshuriensis, воробейника краснокорневого L. erythrorhizon, капусты белокочанной В. oleracea.

2. При совместном культивировании выявлена зависимость длительности размножения Y. pseudotuberculosis от вида растительных клеток. Микроорганизмы были жизнеспособными в культурах клеток P. ginseng штамма GV до 7 сут совместного культивирования, штамма R1 — до 14 сут, A. manshuriensis - до 19-21 сут, L. erythrorhizon - более 50 сут и В. oleracea - более 60 сут.

3. На модели системы «паразит-хозяин» раскрыт инвазивный механизм взаимодействия Y. pseudotuberculosis с клеточными культурами растений. Бактерии псевдотуберкулеза проникали, распространялись и размножались в межклеточных пространствах культур P. ginseng и В. oleracea, контактировали с клеточной стенкой, проникали в нее и цитоплазму, разрушали клетки.

4. Термостабильный и термолабильный белковые токсины Y. pseudotuberculosis вызывали некроз клеток растений женьшеня и кирказона.

5. Установлено, что действие Y. pseudotuberculosis и их токсинов имело адаптивный эффект на клетки женьшеня P. ginseng, который выражался в усилении экспрессии защитных генов растения: р-1,3-глюканазы и фенилаланин аммиак-лиазы. При этом с повышением иммунного статуса клеток женьшеня повышалась их устойчивость к инфицированию бактериями.

6. На модели растений табака Nicotiana tabaccum L. сортов Ксанти нк и Самсун показано, что 7. pseudotuberculosis могут осуществлять взаимодействие с целым растением, реализуя патогенный потенциал и вызывая его гибель. Бактерии, инъецированные в листья растений табака, локализовались и размножались в местах заражения.

7. На основе растительного экстракта из клеток женьшеня P. ginseng разработана жидкая среда накопления для обнаружения Y. pseudotuberculosis во внешней среде и в материале от больных псевдотуберкулезом.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации: Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

1 Тимченко Н.Ф., Булгаков В.П., Булах (Персиянова) Е.В., Яснецкая Е.Г., Журавлев Ю.Н. Взаимодействие Yersinia, Listeria и Salmonella с растительными клетками // Журнал микробиол., эпидем., иммунол. 2000. № 1. С 6-10.

2. Persiyanova E.V., Kiselev K.V., Bulgakov V.P., Timchenko N.F., Chemoded G.K., Zhuravlev Yu.N. Defense Response Mechanisms of Ginseng Callus Cultures Induced by Yersinia pseudotuberculosis, a Human Pathogen // Russian Journal of Plant Physiology. 2008. Vol. 55. No. 5. P. 834-841.

Работы, опубликованные в материалах региональных и международных конференций, симпозиумов

3. Timchenko N., Eliseikina М., Bulgakov V., Bulakh Е., Yasnetskaya Е., Nedashkovskaya Е., Zhuravlev Y. Yersinia pseudotuberculosis, its toxins and plant cells // Adv. Exp. Med. Biol 2003. V. 529. P. 169-171.

4. Тимченко Н.Ф., Булгаков В.П., Яснецкая Е.Г., Булах Е.В., Журавлев Ю.Н. Ассоциации иерсиний, листериЙ, сальмонелл с растительными клетками // «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». Тезисы конференции. Новосибирск, 1998. С. 75.

5. Тимченко Н Ф, Булах Е. В., Булгаков В. П., Яснецкая Е. Г., Журавлёв Ю. Н. Патогенные для человека бактерии в модельных системах с растительными клетками // «Сознание и наука: взгляд в будущее». Тезисы Международного симпозиума. Владивосток, 2001. С. 198-207.

6. Timchenko N., Bulgakov V., Bulakh Е., Nedashkovskaya Е., Zhuravlev Y. Yersinia pseudotuberculosis, its toxins and plant cells // «The genus Yersinia. Entering the functional genomic era». 8-th Internat. Symp. on Yersinia, 4-8 September. Turku (Finland), 2002. P. 101.

7. Персиянова E.B. Воздействие экстракта из клеток женьшеня настоящего Panax ginseng С.А.Меу. линии R-1 на патогенные микроорганизмы // «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». Тезисы Vl-й Тихоокеанской научно-практ. конф. студентов и молодых ученых с международным участием, (27 апр. 2005 г.). Владивосток, 2005. С. 41-42.

8. Персиянова Е.В. Влияние салициловой кислоты и метилжасмоната на размножение Yersinia pseudotuberculosis в каллусах женьшеня // «13 Международный конгресс по приполярной медицине». Тезисы конференции (12-16 июня 2006 г.). Бюллетень СО РАМН, 2006. Приложение. С. 154-155.

9 Персиянова Е.В., Киселев К.В., Чернодед Г.К. Воздействие Yersinia pseudotuberculosis и их токсинов на экспрессию генов PgPal и PgGlul в каллусах женьшеня настоящего Panax ginseng С.А.Меу. // Тезисы Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 20-летию ВСНЦ СО РАМН (14 июня 2007), Иркутск. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2007. № 1 (53). С. 232-233.

Персиянова Елена Викторовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМООТНОШЕНИЙ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS С РАСТИТЕЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Отпечатано по оригинал-макету, подготовленному автором, минуя редподготовку Вне плана

Подписано в печать 24.10.08. Формат 60x84/16 Усл.-печ.л.0,93. Уч.-изд.л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 287

Издательство Тихоокеанского государственного

Экономического университета Участок оперативной полиграфии 690091, Владивосток, Океанский пр., 19 Тел.43-40-60. E-mail: pubJesaem@mail.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Персиянова, Елена Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

Обзор литературы.

ГЛАВА 1. Экология Yersinia pseudotuberculosis.

ГЛАВА 2. Защитные механизмы растений в ответ на действие микроорганизмов.

Собственные исследования.

ГЛАВА 3. Материалы и методы исследований.

ГЛАВА 4. Изучение действия факторов патогенности

Y. pseudotuberculosis с инвазивной и токсической функциями в системе с клеточными культурами растений.

4.1. Влияние Y. pseudotuberculosis и клеточных культур растений женьшеня Panax ginseng, кирказона Aristolochia manshuriensis, воробейника Lithospermum erythrorhizon, капусты Brassica oleracea на взаимную жизнеспособность при совместном культивировании.

4.2. Электронная микроскопия взаимодействия Y. pseudotuberculosis с клеточными культурами капусты белокочанной В. oleracea и женьшеня настоящего P. ginseng.

4.3. Выявление действия термостабильного и термолабильного белковых токсинов Y. pseudotuberculosis на растительные клетки кирказона A. manshuriensis и женьшеня P. ginseng.

ГЛАВА 5. Влияние Y. pseudotuberculosis и их токсинов на индукцию защитных реакций в клеточных культурах женьшеня P. ginseng.

5.1. Характеристика роста клеточных культур женьшеня P. ginseng линий GV, 2с2 и 2cR2 при инфицировании их Y. pseudotuberculosis.

5.2. Исследование экспрессии защитных генов фенилаланин аммиак-лиазы и р-1,3-глюканазы в культурах клеток женьшеня P. ginseng под влиянием Y pseudotuberculosis и их токсинов.

ГЛАВА 6. Взаимодействие растений табака Nicotiana tabaccum сортов Ксанти нк и Самсун с Y. pseudotuberculosis и их токсинами.

6.1. Характеристика морфологических изменений растений N. tabaccum сортов Ксанти нк и Самсун под действием

Y. pseudotuberculosis в зависимости от дозы и способа инфицирования бактериями.

6.2. Характеристика длительности обнаружения Y. pseudotuberculosis в экспериментально инфицированных растениях N. tabaccum.

ГЛАВА 7. Экспериментальное обоснование применения жидкой среды накопления, содержащей экстракт из клеток женьшеня

P. ginseng для диагностики псевдотуберкулеза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика взаимоотношений Yersinia pseudotuberculosis с растительными клетками"

В последние десятилетия все большее внимание привлекает к себе группа патогенных микроорганизмов, способных с одной стороны паразитировать в организме теплокровных животных и человека, с другой -обитать в окружающей среде. Возможность сапрофитического существования ряда патогенных микроорганизмов в окружающей среде, совершенно отрицаемая в недавнем прошлом, находит все большее признание (Сомов, Литвин, 1988, Литвин, 1991). Имеющиеся фактические материалы, полученные при изучении бактерий родов Yersinia, Listeria, Legionella, Leptospira, Pseudomonas, Vibrio и многих других, не вызывают сомнений относительно важной роли окружающей среды в экологии возбудителей сапронозов (болезней из внешней среды) и эпидемиологии вызываемых ими инфекций (Терских, 1958; Сомов, 1979; Литвин, 1985; Литвин, 1988; Гершун, 1988; Марамович и др., 1988; Тартаковский, Прозоровский, 1988).

Научно-технический прогресс и связанная с ним урбанизация нарушили экологическое равновесие и открыли пути для проникновения патогенных микроорганизмов из внешней среды в окружение человека. Ярким примером в этом отношении является Y. pseudotuberculosis — возбудитель псевдотуберкулеза (или дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки) у человека и животных (Грунин и др., 1960). Малоактивные природные очаги псевдотуберкулеза в результате антропогенной трансформации превратились в мощные антропургические очаги, проявляющиеся высокой заболеваемостью населения (Кузнецов, 1984а; Кузнецов, 1994).

Анализ многочисленных вспышек псевдотуберкулеза показал, что чаще всего факторами передачи бактерий человеку являются овощи и корнеплоды (блюда, приготовленные из них) и, прежде всего свежая капуста, в которых иерсинии размножаются и накапливаются в значительных количествах, поддерживая высокую степень вирулентности (Рожкова, 1977; Сомов, 1979).

Это свидетельствует о том, что для поддержания жизнеспособности и численности популяции во внешней среде Y. pseudotuberculosis используют растения. В связи с этим, возникло много вопросов и, прежде всего, какие механизмы и биомолекулы используют бактерии при взаимодействии с растениями, способны ли они реализовать патогенный потенциал, как осуществляется действие их факторов патогенности с инвазивной и токсической функциями, отвечают ли растения на агрессию патогена. К началу наших исследований мы обнаружили в доступной литературе лишь несколько работ, авторы которых первыми попытались рассмотреть взаимодействия растений и Y. pseudotuberculosis с экологических позиций (Беседнов, Венедиктов, 1986; Венедиктов и др., 1989).

Известно, что растения являются ведущим компонентом биосферы и определяют главную форму жизни на Земле. Поэтому, раскрытие закономерностей воздействия бактерий псевдотуберкулеза на растения и их ответной реакции на это действие внесет вклад в понимание стратегии патогенности этих микробов вне теплокровного организма, а также в обоснование механизмов адаптации эукариотических организмов, в том числе растений, на изменения условий их существования, особенно на действие экстремальных факторов.

Целью работы является изучение взаимодействия Y. pseudotuberculosis с растительными клетками в системе «паразит-хозяин», включающее раскрытие характера действия факторов патогенности микроорганизмов и ответную реакцию клеток на действие бактерий.

Для достижения поставленной цели были определены и последовательно решались следующие задачи:

1. На модели взаимодействия «паразит-хозяин» изучить динамику размножения Y. pseudotuberculosis в клеточных культурах разных видов растений (женьшеня Panax ginseng, кирказона Aristolochia manshuriensis, воробейника Lithospermum erythrorhizon, капусты белокочанной Brassica oleráceo) и показать влияние иерсиний на жизнеспособность клеток при совместном культивировании.

2. В модельных экспериментах, для характеристики взаимоотношений «паразит—хозяин», выявить этапы взаимодействия Y. pseudotuberculosis с клетками растений (контакт, проникновение и токсическое действие).

3. Исследовать действие белковых токсинов Y pseudotuberculosis на растительные клетки, как один из механизмов реализации патогенных свойств паразита.

4. Установить возможность индукции экспрессии защитных генов в клетках женьшеня на воздействие Y pseudotuberculosis и их токсинов, как адаптивную реакцию на стресс, и определить жизнеспособность клеток с индуцированным иммунным ответом при действии бактерий.

5. Исследовать ответную реакцию растений табака с разной чувствительностью к вирусу табачной мозаики (устойчивого и чувствительного сортов) на действие Y. pseudotuberculosis и их токсинов.

6. Разработать среду на основе водного экстракта из клеток женьшеня для выделения Y. pseudotuberculosis из внешней среды и материала от больных.

Научная новизна работы и теоретическая значимость исследований

Все исследования проведены впервые.

Установлено, что Y pseudotuberculosis способны взаимодействовать с растительными клетками: бактерии псевдотуберкулеза размножались в клеточных культурах разных растений и влияли на их жизнеспособность при совместном культивировании, при этом длительность размножения бактерий зависела от вида клеточной культуры.

Выявлено, что бактерии псевдотуберкулеза способны проникать в межклеточные пространства клеток женьшеня настоящего P. ginseng и капусты белокочанной В. oleracea, прикрепляться и проникать в клеточную стенку, в цитоплазму, разрушать клетки этих видов растений.

Показано, что в ответ на действие белковых токсинов Y pseudotuberculosis развивался некроз клеток женьшеня и кирказона.

Установлено, что Y. pseudotuberculosis, инъецированные в растения табака N. tabaccum, в зависимости от дозы заражения, вызывали повреждение и гибель растений, как устойчивых, так и восприимчивых к вирусу табачной мозаики.

Показано, что Y. pseudotuberculosis снижают скорость роста клеточной культуры женьшеня, обладающей малой активностью защитных генов, и не влияют на рост клеток P. ginseng, обладающих высокой экспрессией этих генов. Микроорганизмы активируют и вызывают повышение экспрессии защитных генов фенилаланин аммиак-лиазы и р-1,3-глюканазы в клетках женьшеня.

Практическая ценность работы

Теоретические разработки, представленные в настоящей работе, явились основанием для создания жидкой среды накопления Y. pseudotuberculosis для более эффективного выделения этих микроорганизмов из внешней среды и для диагностики псевдотуберкулеза. Среда апробирована в экспериментальных условиях.

Апробация результатов диссертационной работы

Материалы диссертационной работы были представлены на всероссийских научно-практических конференциях разного уровня и на международных конгрессах и симпозиумах. Основные положения диссертации были представлены на Научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Ростов-на-Дону, 1999), на Международном симпозиуме «Сознание и наука: взгляд в будущее» (Владивосток, 2001), 8-ом Международном симпозиуме «The genus Yersinia. Entering the functional genomic era» (Финляндия, 2002), VI Тихоокеанской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2005), XIII Международном конгрессе по приполярной медицине, в рамках «Международного Полярного Года» (Новосибирск, 2006), на Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 20-летию ВСНЦ СО РАМН «Актуальные вопросы современной фундаментальной и клинической медицины» (Иркутск, 2007).

По теме работы опубликовано 9 работ: 3 статьи, из них 2 в рецензируемых журналах и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, собственных исследований, отраженных в 5-ти главах, заключения, общих выводов, списка литературы. Текст диссертации изложен на 166 страницах, работа иллюстрирована 27 рисунками и 4 таблицами. Список литературы включает 160 источников отечественных и 193 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Персиянова, Елена Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что патоген человека Y. pseudotuberculosis взаимодействует с модельными системами растительных клеток женьшеня, настоящего P. ginseng, кирказона маньчжурского А. manshuriensis, воробейника краснокорневого L. erythrorhizon, капусты белокочанной В. oleracea.

2. При совместном культивировании выявлена зависимость длительности размножения Y. pseudotuberculosis от вида растительных клеток. Микроорганизмы были жизнеспособными в культурах клеток Р. ginseng штамма GV до 7 сут совместного культивирования, штамма R1 — до 14 сут, A. manshuriensis — до 19-21 сут, L. erythrorhizon — более 50 сут и В. oleracea — более 60 сут.

3. На модели системы «паразит-хозяин» раскрыт инвазивный механизм взаимодействия Y. pseudotuberculosis с клеточными культурами растений. Бактерии псевдотуберкулеза проникали, распространялись и размножались в межклеточных пространствах культур P. ginseng и В. oleracea, контактировали с клеточной стенкой, проникали' в нее и цитоплазму, разрушали клетки.

4. Термостабильный и термолабильный белковые токсины Y pseudotuberculosis вызывали некроз клеток растений женьшеня и кирказона.

5. Установлено, что действие Y. pseudotuberculosis и их токсинов имеет адаптивный эффект на клетки женьшеня P. ginseng, который выражался в усилении экспрессии защитных генов растения: |3-1,3-глюканазы и фенилаланин аммиак-лиазы. При этом с повышением иммунного статуса клеток женьшеня повышалась их устойчивость к инфицированию бактериями.

6. На модели растений табака Nicotiana tabaccum L. сортов Ксанти нк и Самсун показано, что Y pseudotuberculosis могут осуществлять взаимодействие с целым растением, реализуя патогенный потенциал и вызывая его гибель. Бактерии, инъецированные в листья растений табака, локализовались и размножались в местах заражения. 7. На основе растительного экстракта из клеток женьшеня P. ginseng разработана жидкая среда накопления для обнаружения Y. pseudotuberculosis во внешней среде и в материале от больных псевдотуберкулезом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рост заболеваемости инфекционными болезнями, возбудители которых обладают паразитическими и сапрофитическими свойствами, потребовал изучения экологии подобных микроорганизмов (Сомов, Литвин, 1988; Сомов, 1994). К таким патогенам относят Y. pseudotuberculosis, которые убиквитарно распространены в окружающей среде (почве, воде). Анализ многочисленных вспышек псевдотуберкулеза показал, что чаще всего факторами передачи бактерий человеку являются растительные субстраты, в которых иерсинии размножаются и накапливаются в значительных количествах, поддерживая высокую степень вирулентности (Рожкова, 1977; Сомов, 1979).

Из этих фактов стало ясно, что для поддержания жизнеспособности и численности популяции во внешней среде Y. pseudotuberculosis используют растения как хороший питательный субстрат. Однако для этой цели бактерии должны использовать механизмы и биомолекулы, которые позволяли бы им извлекать питательные вещества из растений.

Настоящая работа посвящена изучению взаимоотношений Y. pseudotuberculosis и растительных клеток, как система «паразит-хозяин». С такой позиции мы попытались определить жизнеспособность обоих организмов, характер и этапы их взаимодействия, возможность использования иерсиниями биомолекул патогенности, а растениями -индукции защитных ответов на действие микроба.

Чтобы избежать антропоцентризма, мы исследовали поведение Y. pseudotuberculosis в клеточных культурах разных растений, свободно живущих в природе (женьшеня P. ginseng, кирказона A. manshuriensis, воробейника L. erythrorhizon) и окультуренных человеком (капусты белокочанной В. oleracea), а также ответную реакцию растений на действие патогена.

Одним из видов растений, взятым в работу, явилась капуста белокочанная В. oleracea L., поскольку известно, что эта овощная культура является наиболее частым фактором передачи возбудителя псевдотуберкулеза человеку (Кузнецов и др., 19756; Рожкова, 1977; Сомов, 1979; Кузнецов, Багрянцев, 1998; Сомов, Литвин, 1988). Как нами установлено, бактерии с первых суток интенсивно и длительно размножались (до 60 сут) в ассоциации с клетками капусты В. oleracea, повреждая их. Такой характер взаимодействия свидетельствует о том, что патоген не распознается растительными клетками и это согласуется с эпидемиологическими данными об этом растении как важном природном резервуаре Y. pseudotuberculosis и факторе передачи возбудителя человеку.

В культуре клеток воробейника L. erythrorhizon, синтезирующей большое количество антимикробных фитоалексинов (штамм ВК-39). (Bulgakov et al., 2001), увеличение количества иерсиний начинало выявляться только после нескольких суток ко-культивации, и характеризовалось постепенным возрастанием числа микроорганизмов в течение 30 сут, превосходя в этот период первоначальное количество почти на 5 lg КОЕ/г. Начальное ослабление роста бактерий, скорее, всего, было связано с адаптацией к новым условиям существования и, по-видимому, с наличием фитоалексинов. Лишь ко времени старения растительной культуры (более 30 сут), число Y. pseudotuberculosis стало снижаться.

В каллусах кирказона A. manshuriensis обнаружена несколько иная динамика размножения Y. pseudotubercidosis и гибели клеток растения. Если в капусте наблюдался взрывной рост к 3 сут с 2 до 8 lg КОЕ/г, то в кирказоне в этот период прирост бактерий составил лишь 2 lg КОЕ/г. С первых дней совместного культивирования, иерсинии вызывали гибель растительных клеток. С 3 сут отмечено постепенное нарастание числа микроорганизмов в системе до 9,5 lg КОЕ/г, которое удерживалось до 11 сут. Однако когда вся культура кирказона визуально была некротизирована, наблюдалось неуклонное снижение числа бактерий псевдотуберкулеза вплоть до их гибели к 21 сут.

Клетки женьшеня P. ginseng (линия R1) проявили выраженную ответную реакцию на вторжение патогена, вследствие которой они быстро погибали в процессе этой реакции, уничтожали инфицирующие их бактерии. Первоначальное, увеличение количества бактерий более чем на два порядка прекратилось к четвертому дню ко-культивации, когда Y pseudotuberculosis вызвали гибель более половины клеток P. ginseng. Затем происходило быстрое снижение показателя численности иерсиний, и к моменту совместного культивирования, когда число некротизированных растительных клеток составило 100%, микроорганизмы в системе не обнаружены. Эта реакция по динамике напоминала гиперчувствительный ответ (hr-синдром), реализуемый фитопатогенными микроорганизмами X. campestris, P. aeruginosa и Е. chrysanthemi посредством R-Avr взаимодействия с устойчивыми растениями (Alfano and Collmer, 1996; Baker et al., 1997; Orth et al., 2000; Staskawicz et al., 2001).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что Y. pseudotuberculosis, взаимодействуя с растениями, могут осуществлять разные формы симбиотических отношений. По-видимому, во взаимодействии с L. erythrorhizon, Y. pseudotuberculosis выступают в роли комменсала, используя растительную культуру для регуляции своих контактов с внешней средой, и не вступают с клетками воробейника в тесные отношения. С клетками же капусты, кирказона и женьшеня бактерии псевдотуберкулеза ведут себя как паразит, который приводит к гибели этих культур. Сами иерсинии длительно размножаются в каллусах воробейника и капусты, но быстро погибают в культурах женьшеня и кирказона.

Следующим этапом исследования явилось изучение клеточных механизмов «паразит-хозяйных» отношений бактерий псевдотуберкулеза с растительными культурами В. oleracea и. P. ginseng. Методом электронной микроскопии ультратонких срезов установлено что Y pseudotuberculosis в течение первых 4 часов после нанесения на клетки проникали с поверхности культур капусты и женьшеня в межклеточные пространства растений. Вначале и в последующие двое-трое суток в межклетниках обнаружены делящиеся особи иерсиний, что свидетельствует о размножении бактерий.

Кроме того, микроорганизмы контактировали с клеточной стенкой, проникали и повреждали ее. При этом выявлены сгустки электронно-плотного вещества в местах контакта и проникновения иерсиний в клеточную стенку. Ввиду существенных различий мембран клеток растений и клеток эндотермных организмов, очевидно, что механизмы проникновения Y. pseudotuberculosis в клетки растений могут отличаться от таковых при проникновении их в клетки теплокровных животных и человека (Тимченко и др., 2004). После контакта бактерий с растительными клетками мы не наблюдали событий, которые обычно развиваются после контакта иерсиний с эпителиоподобными клетками теплокровных организмов, а именно, инвагинации клеточной мембраны, последующего смыкания псевдоподий вокруг бактерий, образования фагосом. Многие фитопатогенные бактерии, проникшие в растение, обычно живут и размножаются в межклеточном пространстве. Здесь они могут ферментативно, токсически разрушить клетки, вызволяя их содержимое, либо использовать свои секреторные системы, в том числе и третью секреторную систему (T3SS), обеспечивающие ввод бактериальных белков в цитозоль. Такой механизм секреции приводит к нарушению либо перестройке метаболизма растительной клетки с выгодой для патогена (Громов, Павленко, 1989; Staskawicz, 2001; Не et al., 2004; Saad et al., 2008). Поскольку Y.pseudotuberculosis используют T3SS при контакте с клетками теплокровных организмов, то не исключена роль цитопатогенных эффекторных (Yop) белков бактерий псевдотуберкулеза при взаимодействии с растительными клетками.

Эффект повреждения клеточной стенки может быть связан с продукцией бактериями псевдотуберкулеза литических ферментов. Возможно, через эти повреждения бактерии заселяли цитоплазму клеток. Однако мы не исключаем и другие механизмы, задействованные в этих процессах. В дальнейшем бактерии псевдотуберкулеза выявлены как в частично разрушенных клетках капусты и женьшеня, так и в среде с мертвыми растительными клетками. Различия проявлялись в том, что в значительно поврежденной культуре В. oleracea иерсинии имели строение типичное для S-форм грамотрицательных бактерий, тогда как в системе с P. ginseng, наряду с разрушенными клетками растений, выявлялись и поврежденные Y. pseudotuberculosis.

Факт внутриклеточной локализации Y.pseudotuberculosis в растительных клетках, несомненно, важен также для развития начальных этапов псевдотуберкулеза. Находясь в пищевом комке и внутри растительной клетки, бактерии в определенной мере защищены от действия неблагоприятных факторов желудочно-кишечного тракта (ферменты полости рта и желудка, перистальтика кишечника, действие индигенной микрофлоры и другие), которые встречаются на их пути. Поэтому, можно сказать, что клетка растений является «носителем» патогена, который достигает тонкую кишку, где происходит наиболее интенсивное и окончательное переваривание пищи и всасывание. После этого вирулентные бактерии проникают в эпителий и внутрь организма человека и животного, размножаются в органах и тканях, развивается болезнь.

Известно, что фитопатогенные бактерии обладают разными факторами патогенности (факторы адгезии, литические ферменты, фитотоксины), позволяющие им преодолевать защитные барьеры растения (Walton, 1994; Hammond-Kosack, Jones, 1996; Bender et al., 1999; Brencic, Winans, 2005; Abramovitch et al., 2006; Toth et al., 2006). Проведенные нами исследования показали, что, при взаимодействии с растениями, бактерии псевдотуберкулеза используют факторы патогенности, помогающие им проникнуть в межклеточные пространства, прикрепиться к клеточной стенке, проникнуть в нее и цитоплазму, повредить растительные клетки женьшеня и капусты.

Токсины играют существенную роль в патогенезе псевдотуберкулеза (Тимченко и др., 2004). Попадая в теплокровный организм, Y. pseudotuberculosis наряду с инвазией оказывают токсическое воздействие. Достаточно хорошо изучены термостабильный летальный токсин и термолабильный летальный токсин - видоспецифические белки Y. pseudotuberculosis, которые способны вызывать полиорганные поражения у животных.

Нами установлено, что термостабильный летальный токсин Y. pseudotuberculosis, продукция которого значительно выражена при пониженной температуре (6-12°С), влияет на рост и развитие клеточных культур женьшеня и кирказона, вызывая морфологические повреждения и некроз растительных клеток. Показано также, что одним из механизмов действия токсина на клетки женьшеня, может являться ингибирование процессов биосинтеза ДНК растительных клеток, поскольку TCTYp влиял на снижение скорости включения экзогенного нуклеозида в ДНК клеток женьшеня. Вследствие проведенных наблюдений показано, что TCTYp и TJITYp белковые токсины Y. pseudotuberculosis, в дозах, вызывающих 100%-ную гибель мышей, не влияли на жизнедеятельность растений табака сортов* Самсун и Ксанти нк. TJITYp в дозе 8 мкг вызывал локальный некроз растительных клеток в опытных листьях табака сорта Самсун.

Таким образом, установлено, что Y. pseudotuberculosis при взаимодействии с клетками растений помимо адгезивно-инвазивных свойств могут использовать и факторы патогенности с токсической функцией.

Характер взаимодействия бактерий псевдотуберкулеза с культурой клеток капусты свидетельствует о развитии типичного фитопатогенеза, где «хозяином» выступают клетки капусты, а «паразитом» - клетки Y. pseudotuberculosis, приводящие к полной гибели растения. Однако на модели «паразит-хозяин» в случае с клетками кирказона и женьшеня мы установили гибель как растительных, так и бактериальных клеток. Такая картина напоминает взаимодействие авирулентных штаммов фитопатогенных микроорганизмов с устойчивыми растениями, когда молекулярное распознавание фитопатогенов в растениях происходит посредством взаимодействия белковых продуктов генов R-Avr, где R является геном устойчивости растений, a Avr представляет ген патогенного микроорганизма (Hammon-Kosack, Jones, 1996). Результатом таких взаимодействий является запуск каскадного механизма защиты в растении, в том числе развитие гиперчувствительного ответа, приводящего к гибели клетки растения и патогена, в местах проникновения последнего.

Для дальнейшей характеристики взаимоотношений бактерий псевдотберкулеза и растений мы исследовали ответную реакцию растительных клеток на действие патогена. Для этого в работе использовали штамм культуры женьшеня GV, схожий со штаммом R1, и линии клеток женьшеня 2с2 и 2cR2, отличающиеся от контрольной векторной культуры GV наличием низкого или высокого уровня экспрессии гена rolC, соответственно (Булгаков и др., 2000). Экспрессия гена rolC в этих культурах приводит к созданию устойчивого защитного статуса клеток, проявляющегося в высоком уровне биосинтеза вторичных метаболитов (Bulgakov et al., 1998) и конститутивной экспрессии генов фенилаланин аммиак-лиазы {PAL) и Р-1,3-глюканазы (Kiselev et al., 2006).

Показано, что после добавления Y. pseudotuberculosis к культуре каллусов женьшеня линии GV, в каллусах отмечается увеличение экспрессии генов фенилаланин аммиак-лиазы PgPALl, PgPAL2, PgPALS и Р-1,3-глюканазы Pg-glul уже в первый день совместного культивирования. Этот факт свидетельствует о быстром распознавании патогена и индукции защитного ответа клетками женьшеня. Общая динамика взаимодействия такова, что уже через 7 сут ко-культивирования жизнеспособные бактерии в системе не обнаруживались, а клетки женьшеня прекращали рост. Описанные события соответствуют тем, которые развивались бы при внесении типичного патогена растений (например, P. aeruginosa) при индукции реакции гиперчувствительного ответа. Полученные данные ясно указывают на то, что происходит распознавание иерсиний клетками женьшеня и развитие в них иммунного ответа на внесение патогена. Заключение о типе реакции на этом этапе исследования сделать не представляется возможным, поскольку для этого необходимо идентифицировать ген резистентности женьшеня R и фактор патогенности иерсиний Avr и показать их взаимодействие. Это предмет будущих исследований.

В последние годы существенные успехи достигнуты в понимании факта, что некоторые факторы патогенности бактерий, вызывающих заболевания у растений и животных, имеют общее древнее происхождение и функционально сходны (Baker et al., 1997; Rahme et al., 2000; Staskawicz et al., 2001). Многие фитопатогенные микроорганизмы могут колонизировать поверхность листьев растений, не вызывая заболевания. При определенных условиях, бактерии проникают внутрь растения через устьица или при механическом повреждении, размножаясь в апопласте и устанавливая первый контакт с клетками. Первичный локус в бактериях, индуцируемый при таком контакте - это Нгр локус, состоящий из кластера генов, которые кодируют III тип секреторной системы бактерий (Staskawicz et al., 2001). Активность многих генов Avr зависит от активности локуса Нгр. В свою очередь, локус Нгр сходен с соответствующими локусами, кодирующими III тип секреторной системы патогенов человека, таких как Yersinia, Shigella и Salmonella (Scofield et al., 1996). Впервые общность механизмов патогенеза была показана на примере Р. aeruginosa, когда клинический изолят этого патогена человека вызывал заболевание растений, нематод, насекомых и мышей (Rahme et al., 2000; Staskawicz et al., 2001). По-видимому, P. aeruginosa является естественным природным патогеном растений (Rahme et al., 2000). Полная гибель инфильтрованных листьев арабидопсиса наблюдалась через 4-5 сут после обработки растений суспензией бактерий. Общие эволюционно-консервативные детерминанты патогенности - это ген dsbA, имеющий гомологи у патогенов человека {Shigella flexneri и Vibrio cholera) и растений (P. aeruginosa и Erwinia chrysanthemi), а также гены hrpM, gacS и gacA. О функции генов группы hrp мы уже упомянули; gacS кодирует двухкомпонентную сенсорную киназу, продукт gacA регулирует активность этой киназы. Другим важным фактором патогенности являются белки семейства YopJ (изолированные первоначально из Yersinia), гомологи которых обнаруживаются в фитопатогенах (Erwinia, Pseudomonas и Xanthomonas) и даже в симбиотических бактериях Rhizobium (Staskawicz et al., 2001). Общая функция этих белков, действующих как цистеиновые протеазы, . заключается в разрушении сигнальных систем хозяина, обеспечивающих защиту от патогенов (Orth et al., 2000). В комплексе, эти гены эволюционировали в древних грамотрицательных организмах, как адаптеры бактерий к окружающей среде, и именно они позволяют современным бактериям инфицировать столь широкий круг хозяев. При этом следует учесть, что у патогенов животных и растений многие факторы патогенности не совпадают (Staskawicz et al., 2001).

В случае внесения бактерий в каллусы женьшеня с системной иммунной устойчивостью, индуцированной экспрессией гена rolC, бактерии погибали со сходной динамикой, а клетки женьшеня развивались нормально. Это свидетельствует о том, что индуцированная устойчивость, маркерами которой является экспрессия генов PAL и Р-1,3-глюканазы, является достаточной для защиты клеток женьшеня от бактерий псевдотуберкулеза. По какому пути происходит гибель каллусов женьшеня линии GV при взаимодействии с иерсиниями (некротическому или программируемому), пока неизвестно и выяснение этих путей является предметом будущих исследований.

Токсины ТСТУр и TJITYp индуцировали сходный ответ клеток, как и Y. pseudotuberculosis. Это наблюдение указывает на то, что взаимодействие иерсиний с растениями может происходить посредством секретируемых токсинов. К сожалению, молекулярная структура TCTYp и TJITYp неизвестна, поэтому соотнести эти токсины с известными токсинами Yersinia spp. на этом этапе не представляется возможным. Предметом будущих исследований может стать секвенирование этих токсинов, или соответствующих им генов, что помогло бы идентифицировать ген(ы) Avr бактерий псевдотуберкулеза, участвующий во взаимодействии с растениями. Например, белки Ill-системы секреции иерсиний семейства YopT имеют семь гомологов белков Avr в растительных патогенах P. syringae и Ralstonia, и три гомолога в растительных симбиотических бактериях Rhizobium и Bradyrhizobium (Zhu et al., 2004). В P. syringae pv. tomato, линия DC3000, обнаружены Avr протеазы HopPtoN и HopPtoC, принадлежащие к тому же семейству белков (YopT) иерсиний (Zhu et al., 2004). Белок Ill-системы секреции иерсиний YopJ/P, вызывающий апоптоз макрофагов, сходен с фактором авирулентности AvrRxv растительного патогена Xanthomonas campestris, цитотоксический белок YopE, гомологичен цитотоксину ExoS, секретируемому P. aeruginosa, а гомолог YopM найден в sym-плазмидах Rhizobium (Hueck, 1998).

По-видимому, грань между животными и растительными патогенами будет стираться и далее. Недавно показано, что патоген растений Agrobacterium tumefaciens способен трансформировать культивируемые клетки человека (Kunik et al. 2001; Lacroix et al. 2006) и эмбрионы морских ежей (Bulgakov et al., 2006), используя факторы патогенности IV секреторной системы.

Дальнейшим этапом наших исследований явилось установление влияния Y. pseudotuberculosis и их токсинов на жизнедеятельность растений табака сорта Ксанти нк, имеющих ген устойчивости N к вирусу табачной мозаики (ВТМ), и чувствительного к этому вирусу сорта Самсун. Нам было интересно узнать поведение иерсиний во взрослых растениях. Известно, что при заражении чувствительных растений вирус распространяется из первично зараженных клеток по всему растению, где он хорошо размножается и вызывает разнообразные симптомы заболевания (посветление жилок, мозаичная и хлоротичная окраска листьев, изменение формы и размеров листьев) (Мэтьюз, 1973). В чувствительных растениях, пораженных вирусом, развиваются защитные реакции, направленные на ограничение репродукции и транспорта вируса, но они не обеспечивают защиту от него. В устойчивых растениях вирус локализуется в первично зараженных и соседних клетках, которые погибают вместе с ним, образуя локальные некрозы, тогда как остальные части растения остаются здоровыми (Sela, 1981). Образование локальных некрозов является типичным симптомом сверхчувствительной реакции, за которую ответственны R гены устойчивости в растениях, в ответ на заражение фитопатогенами (Meier, Slusarenko, 1993; Dangl et al., 1996; Hammond-Kosack, Jones, 1996; Greenberg, Yao, 2004).

Нами установлено, что инъекция в листья табака бактерий о псевдотуберкулеза в высоких дозах (10 мк/лист) вызывала гибель растений как чувствительного к ВТМ сорта Самсун, так и устойчивого сорта КсантИ' нк. Меньшие дозы Y pseudotuberculosis (106 мк/лист) у растений обоих сортов вызывали заболевание инфицированных листьев и расположенных под ними, либо только зараженных листьев табака. Устойчивость табака к малым дозам иерсиний (103 мк/лист), возможно, была обусловлена механизмами первичной защиты растений от проникновения патогена, которая достаточна, чтоб локализовать инфекцию в опытном листе. Так известно, что инъекция суспензий ВТМ вызывает у растений табака обоих сортов увеличение активности протеиназ и РНКаз в межклеточной жидкости, что приводит к инактивации вируса (Малиновский, 1998). Рассуждать о причинах заболеваемости растений N. tabaccum при высоких концентрациях Y. pseudotubercidosis мы не вправе, так как наши исследования не раскрывают механизмы этих взаимодействий на тканевом и клеточном уровнях.

Механическая инокуляция в листья табака бактерий псевдотуберкулеза в о высокой концентрации (10 мк/мл) вызывала болезнь во всем растении обоих сортов, выраженность симптомов, которой зависела от месторасположения инфицированных листьев. Тогда как меньшие концентрации микроорганизмов (106 мк/мл) приводили к слабовыраженным симптомам заболевания части растения-либо только инфицированных листьев.

Важно отметить, что Y. pseudotuberculosis, экспериментально инъецированные в растения сорта Ксанти нк и Самсун, размножались только в зараженных листьях табака, и не распространялись, по всему растению. С появлением «мозаичности» инфицированных- листьев- и по мере их отмирания количество жизнеспособных бактерий снижалось, и уже в отмерших листьях иерсинии не обнаруживались.

Таким образом, растения табака (устойчивые и восприимчивые к ВТМ) в равной.степени инфицировались иерсиниями. Эти данные указывают на то, что иерсинии взаимодействуют с табаком по пути, отличному от пути их взаимодействия с фитовирусами растений. Взаимодействие иерсиний и растений может носить не только характер быстрого ответа (реакция гиперчувствительности, как показано на примере культуры клеток- женьшеня, глава-5), но и медленного системного ответа.

Известно, что поверхность растений, как ризо- так и> филлосфера, заселена- большим количеством- микроорганизмов; однако^ немногие из- них способны вызвать заболевания, поскольку. должны иметь специализированные биомолекулы, чтоб проникнуть через кутикулу листьев; корней либо плодов, преодолевая- структурные преграды, обеспечивающие механический барьер, а также противостоять различным соединениям, продуктам, вторичного метаболизма с токсической и антибиотической активностями (Hammond-Kosack, Jones, 1996; Gomez-Gomez, 2004). Нами установлено, что Y. pseudotubercidosis не проникали в растения- с неповрежденной поверхностью листьев. Поэтому мы предположили, что у иерсиний могут отсутствовать ферменты, разрушающие поверхностные структуры растений табака.

Результаты наших исследований по взаимодействию иерсиний с растительными культурами показали, что иерсинии, вызывая- гибель каллусов женьшеня, погибали и сами. Это привело к мысли о том, что клеткиженьшеня могут содержать бактерицидные вещества, либо синтезировать таковые в ответ на воздействие патогенов, либо они высвобождаются из погибших растительных клеток. Для этого мы проверили действие водного экстракта из растительных клеток женьшеня на бактерии псевдотуберкулеза.

Выявлено, что нативный растительный экстракт ингибировал рост Y. pseudotuberculosis. Так при дозе заражения чуть более 2 lg КОЕ/мл иерсинии бактериологически не выявлялись уже ко 2-м сут культивирования. Экстракт, разведенный в 100 и более раз, наоборот стимулировал размножение бактерий псевдотуберкулеза: уже через сутки число микроорганизмов возросло на 2 lg КОЕ/мл, а ко 2-м сут - на 4 lg КОЕ/мл, в сравнении с заражающей дозой. Численность иерсиний постоянно увеличивалась в течение 19 сут наблюдений, и превосходила таковую в стерильной воде на 3 и более lg КОЕ/мл на всем сроке эксперимента. Стимулирующий эффект разведенного водного экстракта женьшеня позволил нам создать на его основе среду накопления R1, которая в короткие сроки культивирования способствовала большему росту численности Y. pseudotuberculosis, чем ФБР Петерсона-Кука, и не уступала индикаторной среде. Экспериментальная апробация среды R1 при выделении бактерий псевдотуберкулеза из кала человека, в короткие сроки (не более недели) дала положительные результаты. Возможно, применение среды R1 при диагностике псевдотуберкулеза сократит сроки выделения бактерий из внешней среды, и в частности с. растительных субстратов, но это предмет дальнейших исследований.

Настоящие исследования осветили только некоторые стороны взаимоотношений растений и бактерий псевдотуберкулеза, патогена для человека и животных, широко распространенных во внешней среде (почве, воде). Дальнейшие исследования в этом направлении позволят раскрыть молекулярно-генетические и молекулярно-биологические механизмы жизнедеятельности этой группы микроорганизмов - возбудителей сапронозов при сапрофитическом способе существования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Персиянова, Елена Викторовна, Владивосток

1. Аксенов М.Ю., Мисуренко Е.Н., Шустрова Н.М., Гаровникова Ю.С., Гинцбург А.Л., Литвин В.Ю. Выявление и изучение некультивируемых форм Yersinia pseudotuberculosis во внешней среде при использовании полимеразной цепной реакции // ЖМЭИ. 1995. № 2. С. 80-83.

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1963.- 177 с.

3. Беляков В.Д., Голубев Д.Б., Каминский Г.Д. Саморегуляция паразитарных систем. Л.: Медицина, 1987. 240 с.

4. Беляков В.Д., Ряпис Л.А. Сапрофиты медицинского значения и природа их полипатогенности на примере псевдомонад // Экология возбудителей сапронозов. М., 1988. С. 7-20.

5. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. М.: Медицина, 1990. 224 с.

6. Беляков В.Д., Литвин В.Ю., Емельяненко Е.Н, Пушкарева В.И. Патогенные-бактерии, общие для человека и растений // Патогенные бактерии в сообществах. М.: Росагросервис, 1994. С. 11-23.

7. Беседнов А.Л., Венедиктов B.C. Изучение хемотаксиса бактерий псевдотуберкулеза // Психрофильность патогенных микроорганизмов. Новосибирск, 1986. С. 56-57.

8. Бисага Л. В., Недашковская Е.П. Выделение, очистка и некоторые свойства токсинов Yersinia pseudotuberculosis // Сб. науч. трудов молодых ученых НИИЭМ СО РАМН. Новосибирск, 1992. С. 21-28.

9. Боев Б.К., Литвин В.Ю., Пушкарева В.И. Динамическая модель популяционных взаимодействий иерсиний с инфузориями // Потенциально патогенные бактерии в природе. М., 1991. С. 60-68.

10. Борисова М.А. Клиника эпидемического псевдотуберкулеза // Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. Владивосток, 1974. С. 165-172.

11. Брезгунов В.Н., Завальский Л.Ю., Лазарев А. В., Попов В. Г. Хемотаксис бактерий // Успехи микробиологии. 1989. Т. 23. С. 3.

12. Бренева Н.В., Марамович А.С., Климов В.Т. Экологические закономерности существования патогенных иерсиний в почвенных экосистемах // ЖМЭИ. 2005. № 6. С. 82-88.

13. Бузолева Л.С., Пручкина З.В., Сомов Г.П. Биологическая активность гуминовых кислот бентонитовых глин в зависимости от их химического состава // Экология патогенных бактерий. Сб. науч. трудов. Новосибирск, 1994а. С. 158-163.

14. Бузолева Л.С., Гришин Ю.И., Сомов Г.П. Особенности размножения Yersinia pseudotuberculosis при высокой и низкой температуре // Экология патогенных бактерий. Сб. науч. трудов. Новосибирск, 19946. С. 144-150.

15. Бузолева Л.С., Морозова О.А., Быстрова А.Н., Юрченко Е.Н. Бактериальное и вирусное загрязнение городских сточных вод, сбрасываемых в Амурский залив // Инфекц. патология в приморском крае. Владивосток: Дальнаука, 1994в. С. 6-7.

16. Бузолева Л.С., Чумак А.Д., Дзадзиева М.Ф., Эпштейн Л.М., Сомов Г.П. Газотрофия патогенных бактерий // ЖМЭИ. 1997. № 5. С. 63-67.

17. Бузолева Л.С., Сомов Г.П. Об эпидемиологической опасности хранения пищевых продуктов при низкой температуре // Гигиена и санитария. 2000. №3. С. 31-34.

18. Булгаков В.П. и Журавлев Ю.Н. Получение каллусных культур ткани Aristolochia manshuriensis Кот. // Растительные ресурсы. 1989. Т. 25. Вып. 2. С. 266-270.

19. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М. Содержание даммарановых гликозидов в различных каллусных линиях Panax ginseng С.А. Меу. //Растительные ресурсы. 1991. Т. 27, № 3. С. 94-100.

20. Булгаков В.П., Лауве JI.C., Чернодед Г.К., Ходаковская М.В., Журавлев Ю.Н. Хромосомная вариабельность клеток женьшеня, трансформированных растительным онкогеном rolC II Генетика. 2000. Т. 36, №2. С. 209-216.

21. Бурцева Т.И., Бузолева JI.C., Сомов Г.П. Секретируемая трипсиноподобная протеиназа из Yersinia pseudotuberculosis II Биохимия. 1995. Т. 60, № 10. С. 1589-1595.

22. Бурцева Т.И., Бузолева JI.C., Сомов Г.П. Биохимическая характеристика продуктов жизнедеятельности Yersinia pseudotuberculosis в зависимости от температуры культивирования // ЖМЭИ. 1997. № 5. С. 29-33.

23. Вандерпланк Я. Генетические и молекулярные основы патогенеза у растений. М.: Мир, 1981. 236 с.

24. Варвашевич Т.Н., Сидорова В.Е., Потапова И.Ю. Ферменты нейраминидаза и гиалуронидаза как модель для изучения механизмов адаптации иерсиний //Иерсиниозы. Новосибирск, 1983. С. 12-19.

25. Варвашевич Т.Н. Эколого-биохимические подходы к изучению бактериальных инфекций // Бюллетень СО АМН СССР. 1986. № 4. С. 57-62.

26. Варвашевич Т.Н., Никифорова JI.C., Траценко А.Ф., Богомазова Т.В. Механизмы. низкотемпературной регуляции метаболизма у бактерий // Психрофильность патогенных микроорганизмов. Новосибирск, 1986. С. 714.

27. Венедиктов B.C., Тимченко Н.Ф., Степаненко В.И. Взаимодействие с эпителием и подвижность бактерий псевдотуберкулеза // Психрофильность патогенных микроорганизмов. Новосибирск, 1986. С. 50-55.

28. Венедиктов B.C. Влияние температуры культивирования на биологические свойства псевдотуберкулезного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Владивосток, 1988. 23 с.

29. Гвоздяк Р.И., Яковлева JIM. Об особенностях патогенности Pseudomonas aeruginosa IIЖМЭИ. 1987. № 3. С. 3-6.

30. Гершун В.И. Экология листерий и пути их циркуляции в природном очаге // Экология возбудителей сапронозов. Москва, 1988. С. 80-85.

31. Глаголев А.Н. Таксис у бактерий // Успехи микробиологии. 1983. Вып. 18. С. 163-192.

32. Головачева В.Я. О длительности выживания псевдотуберкулезного микроба в почве // Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (псевдотуберкулез человека). Ленинград, 1978. С. 188-189.

33. Громашевский Л.В. Общая эпидемиология. Медгиз, 1949. 290 с.

34. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. Л.: Изд-во Ленинградского университета, 1989. 248 с.

35. Грунин Й.И., Сомов Г.П., Залмовер И.Ю. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка // Военно-медицинский журнал. 1960. № 8. С. 62-66.

36. Денисов К.А., Усенко А.Д., Слюсарь Л.И., Ванханен В.В., Беседина Е.И., Ванханен В.Д., Мельник В.А. Механизмы передачи возбудителей и естественнонаучная классификация инфекционных болезней // Вестник гигиены и эпидемиологии. 2000. Том 4, №2. С. 219-223.

37. Дзадзиева М.Ф., Васильева В.Н., Толкач A.M. Синтез биополимеров псевдотуберкулезного микроба при ассимиляции углерода из углекислого газа // Экология патогенных бактерий. Сб. науч. трудов. Новосибирск, 1994. С. 25-30.

38. Диндиенко В.Н., Оберт А.С., Кордубайлов А.А., Попов В.П. Характеристика псевдотуберкулеза в Алтайском крае // Иерсиниозы (микробиология, эпидемиология, патогенез, иммунология). Тез. докл. Владивосток, 1986. С. 109-111.

39. Долматова Л.С., Шиткова О.А., Долматов И.Ю., Тимченко Н.Ф. Термостабильный летальный токсин Yersinia pseudotuberculosis индуцирует апоптоз и ингибирует экспрессию рецепторов иммуноцитов голотурии к лектинам // ЖМЭИ. 2006. № 3. С. 23-28.

40. Дьяков Ю.Т., Багирова С.Ф. Что общего в иммунитете растений и животных? // Природа. 2001. № 11. С. 52-58.

41. Журавлев Ю.Н., Булгаков В.П., Мороз JI.A. Накопление гинзенозидов в культуре клеток женьшеня Panax ginseng С.А. Меу., трансформированных с помощью Agrobacterium rhizogenes II Доклады АН СССР. 1991. Т. 311. С. 1017-1019.

42. Завальский Л.Ю. Хемотаксис бактерий // Соровский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 9. С. 23-29.

43. Исачкова JI.M., Жаворонков А.А., Антоненко Ф.Ф. Патология псевдотуберкулеза // Владивосток: Дальнаука, 1994. 190 с.

44. Каландадзе Е.П., Ющенко Г.В., Храмова Л.П. Обсемененность птицеводческого комплекса иерсиниями разных видов и их эпидемиологическое значение // VI Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. Тез. докл. 1991. Т. 1. С. 85-86.

45. Карасева Е.В., Зайцев C.B., Чернуха Ю.Г., Пискунова JI.A. Некоторые особенности экологии патогенных лептоспир в естественных условиях природного очага // ЖМЭИ. 1974. № 5. с. 36-40.

46. Козыренко М.М. Регуляция биосинтеза эфиров шиконина в клеточной культуре воробейника краснокорневого: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Владивосток, 1994. 24 с.

47. Колесникова В.В., Варвашевич Т.Н. Динамика размножения иерсиний псевдотуберкулеза при различных температурных режимах // Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (псевдотуберкулез человека). Сб. науч. трудов. Ленинград, 1978. С. 72-79.

48. Колесникова В.В. Новые факты в эпидемиологии псевдотуберкулеза // Иерсиниозы. Новосибирск, 1983. С. 50-55.

49. Колесникова В.В. Роль почвы в экологии псевдотуберкулезного микроба // Психрофильность патогенных микроорганизмов. Новосибирск, 1986. С. 6873.

50. Кузнецов В.Г., Раковский В.И., Гребенщиков JI.A., Лоскутов А.Н., Дагаева А.Р., Сомов Г.П. Изучение эпидемиологии Дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки в Приморском крае // ЖМЭИ. 1975а. № 10. С. 34-38.

51. Кузнецов В.Г., Раковский В.И., Гребенщиков Л.А., Дагаева А.Р. О роли овощей в эпидемиологии дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки //Военно-медицинский журнал. 19756. № 6. С. 49-52.

52. Кузнецов В.Г. Новые данные к эпидемиологии и профилактике Дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки // Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (псевдотуберкулез человека). Сб. науч. трудов. Ленинград, 1978а. С. 24-31.

53. Кузнецов В.Г. Об условиях и факторах, способствующих зараженности овощей, корне- и клубнеплодов псевдотуберкулезным микробом Yersinia pseudotuberculosis П Гигиена и санитария. 19786. № 7. С. 38-41.

54. Кузнецов В.Г. Пути распространения в очагах инфекции псевдотуберкулезного микроба Y. pseudotuberculosis II Гигиена и санитария. 1980а. №9. С. 81-83.

55. Кузнецов В.Г. Транспортная среда для выделения псевдотуберкулезного микроба // Лабораторное дело. 1980б. № 9. С. 555-557.

56. Кузнецов В.Г. Выделение бактерий рода Yersinia из различных водоисточников в Приморском крае // Гигиена и санитария. 1983. № 2. С. 72-74.

57. Кузнецов В.Г. Характеристика антропургических очагов дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки (псевдотуберкулеза) // Природно-очаговые болезни Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1984а. С. 58-64.

58. Кузнецов В.Г. Модификация щелочного метода обработки материала для выделения бактерий рода Yersinia II Лабораторное дело. 19846. № 10. С. 622-624.

59. Кузнецов В.Г. Температурный фактор в экологии бактерий рода Yersinia // Психрофильность патогенных микроорганизмов. Новосибирск, 1986. С. 6268.

60. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Распространение бактерий рода Yersinia в окружающей среде и источники заражения человека // Юбилейный сб. НИИЭМ, посвящ. 50-летию со дня основания. Владивосток, 1991. С. 93-96.

61. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Пастеризованное молоко как фактор передачи возбудителей иерсиниозов // ЖМЭИ. 1992. № 4. С. 22-26.

62. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н., Гудков А.В. Бактерии рода Yersinia в источниках питьевой воды Владивостока // ЖМЭИ. 1994. № 6. С. 50-51.

63. Кузнецов В.Г. Биотические и абиотические местонахождения Yersinia pseudotuberculosis II Экология патогенных бактерий. Сб. науч. трудов. Новосибирск, 1994. С. 107-121.

64. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Экология иерсиний и иерсиниозы // Окружающая среда и здоровье населения Владивостока. Владивосток: Дальнаука, 1998. С. 154-164.

65. Кузнецов В.Г., Тимченко Н.Ф., Образцов Ю.Г., Андрюков Б.Г. Вспышка псевдотуберкулеза в Южном Приморье. Бактериологическая диагностика и характеристика возбудителя // Здоровье. Экология. Наука. 2001. № 3. С. 5053.

66. Кузнецов В.Г., Тимченко Н.Ф. Рост и взаимодействие в смешанных культурах возбудителей некоторых сапронозов в водной среде при низкой температуре // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002а. № 1. С. 3236.

67. Кузнецов В .Г., Тимченко Н.Ф. Взаимодействия возбудителей некоторых сапронозов в смешанных культурах на плотной среде при разных температурах // ЖМЭИ. 20026. № 1. С. 11-16.

68. Кузнецов В.Г., Лаженцева Л.Ю., Елисейкина М.Г., Шульгина Л.В., Тимченко Н.Ф. Распространение бактерий рода Yersinia в морской воде и гидробионтах // ЖМЭИ. 2006. № 3. С. 117-120.

69. Литвин В.Ю. Сапрофитическая фаза в экологии возбудителей инфекционных заболеваний // ЖМЭИ. 1985. № 6. С. 98-103.

70. Литвин В.Ю. Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах // Экология возбудителей сапронозов. М., 1988. С. 20-34.

71. Литвин В.Ю., Максименкова И.А., Пушкарева В.И., Шустрова Н.М. Анализ факторов, определяющих существование Yersinia pseudotuberculosis в сапрофитической фазе // Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. 1990. Т. 34, № 3. С. 319-329.

72. Литвин В.Ю. Потенциальная патогенность и случайный паразитизм микроорганизмов // Потенциально патогенные бактерии в природе. Сб. науч. трудов. Москва, 1991. С. 9-30.

73. Литвин В.Ю., Шустрова Н.М., Гордейко В.А., Пушкарева В.И., Мисуренко E.H. Экспериментальное изучение иерсиний в растениях // ЖМЭИ. 1991. № 9. С. 5-7.

74. Литвин В.Ю., Пушкарева В.И. О возможном механизме формирования эпидемических вариантов возбудителей сапронозов в почве или воде // ЖМЭИ. 1994. № 5. С. 89-95.

75. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М., Боев Б.В Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: Фармус-Принт, 1998. -256 с.

76. Литвин В.Ю. Приро дно очаговые инфекции: ключевые вопросы и новые позиции //ЖМЭИ. 1999. № 5. С. 26-33.

77. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М. Обратимый переход патогенных бактерий в покоящееся (некультивированное) состояние: экологические и генетические механизмы // Вестник РАМН. 2000. № 1. С. 7-13.

78. Литвинова Е.А., Недоросткова Н.М., Ян М.А. Эктопаразиты мышевидных грызунов возможные переносчики возбудителей иерсиниозов // Иерсиниозы (микробиология, эпидемиология, патогенез, иммунология). Тез. докл. Владивосток, 1986. С. 118-119.

79. Магарламов Т. Ю. Целомоциты иглокожих и их роль в защитных реакциях: Дис. канд. биол. наук. Владивосток, 2004. 133 с.

80. Максименкова И.А., Литвин В.Ю. Влияние некоторых почвенных факторов на динамику численности псевдотуберкулезного микроба // Вопросы микробиологии, патогенеза и лабораторной диагностики иерсиниозов. Новосибирск, 1985. С. 29-33.

81. Максименкова И.А., Бондаренко В.М., Шустрова Н.М., Литвин В.Ю. Применение генетически маркированного штамма для анализапопуляционной динамики псевдотуберкулезного микроба в естественных почвах // ЖМЭИ. 1988. № 5. С. 22-27.

82. Малиновский В.И. Механизмы устойчивости сверхчувствительных растений табака к вирусу табачной мозаики: Автореф. дис. . док. биол. наук. Владивосток, 1998. 45 с.

83. Марамович • А.С., Пинигин А.Ф., Ганин ВС., Осауленко О.В. Сапрофитическая фаза в экологии холерного вибриона // Экология возбудителей сапронозов. Москва, 1988. С. 52-64.

84. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Игумнова Е.К., Саляев Р.К. Растения как возможные резервуары бактерий, патогенных для человека и животных // Доклады АН. 2002. Т. 386, № 2. С. 277-279.

85. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Духанина А.В. Выделение бактерий семейства Enterobacteriaceae из растительных тканей // Микробиология. 2005. Т. 74, № 4. С. 1-4.

86. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Климов В.Т., Чеснокова М.В. Взаимодействие Yersinia pseudotuberculosis с пробирочными растениями картофеля // Журнал стресс-физиологии растений. 2006. Т. 2, № 1. С. 22-27.

87. Мэтьюз Р. Вирусы растений. М.: Мир, 1973. 600 с.

88. Недашковская Е.П., Тимченко Н.Ф., Беседнов А.Л., Вертиев Ю.В. Термостабильный токсин Yersinia pseudotuberculosis: выделение, очистка, характеристика свойств // ЖМЭИ. 1995. № 4. С. 5-9.

89. Никулыпин С.В., Онацкая Т.С., Луканина Л.М. Изучение ассоциаций почвенных амеб Hartmannella rhysodes с бактериями возбудителями чумы и псевдотуберкулеза в эксперименте // ЖМЭИ. 1992. № 9-10. С. 2-5.

90. Пашин А.Ю. Совершенствование методов выделения и идентификации экзотоксина псевдотуберкулезного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1986.

91. Покровский В.И., Ющенко Г.В. Псевдотуберкулез // Руководство по инфекционным болезням. М.: Медицина, 1986. С. 148-158.

92. Пушкарева В.И., Константинова Н.Д., Литвин В.Ю., Попов B.JL, Корн М.Я., Карманов Д.П. Анализ механизмов межпопуляционных взаимодействий иерсиний с инфузориями Tetrahymena pyriformis на клеточном и субклеточном уровнях // ЖМЭИ. 1990. № 1. С. 3-8.

93. Пушкарева В.И. Дафнии потенциальные хозяева псевдотуберкулезного микроба // VI Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. Тез.докл. 1991. Т. 1. С. 121-122.

94. Пушкарева В.И., Константинов Н.Д., Попов В.А., Литвин В.Ю. Инфузории как хозяева иерсиний и псевдомонад // Потенциально патогенные бактерии в природе. М., 1991. С. 50-60.

95. Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. Усиление вирулентности Yersinia enterocolitica в процессе пассирования через макрофаги и инфузорий // ЖМЭИ. 1991. №7. С. 2-5.

96. Пушкарева В.И. Методы экспериментального изучения хозяев и путей циркуляции возбудителей инфекций в водных (почвенных) экосистемах // Патогенные бактерии в сообществах. М.: Росагросервис, 1994а. С. 35-42.

97. Пушкарева В.И. Миграция псевдотуберкулезного микроба по трофическим цепям сообщества (экспериментальные данные) // Патогенные бактерии в сообществах. М.: Росагросервис, 19946. С. 84-88.

98. Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Шустрова Н.М. Гидробионты как хозяева псевдотуберкулезного микроба: экспериментальное исследование // Патогенные бактерии в сообществах. М.: Росагросервис, 1994. С. 74-84.

99. Юб.Пушкарева В.И., Боев Б.В. Потенциальные хозяева и пути циркуляции патогенных бактерий в водных (почвенных) экосистемах // Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: Фармус-принт, 1998. С. 80-109.

100. Пушкарева В.И., Величко В .В., Солохина Л.В., Литвин В.Ю. Изменчивость клональной структуры популяции Yersinia pseudotuberculosis в разных условиях существования // ЖМЭИ. 2004. № 4. С. 31-35.

101. Рожкова Л.П. О выживаемости псевдотуберкулезного микроба на некоторых овощах // Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. Владивосток, 1974. С. 35-38.

102. Рожкова Л.П. Эпидемиология дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки (псевдотуберкулеза человека) на Дальнем Востоке: Дис. . канд. мед. наук. Владивосток, 1977.

103. ПО.Рожкова Л.П., Шарапова Т.А. Дальнейшее изучение эпидемиологии Дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки // Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (псевдотуберкулез человека) // Сб. науч. трудов. Ленинград, 1978. С. 13-24.

104. П.Ряпис Л.А. Биология возбудителя миелиоидоза // ЖМЭИ. 1986. № 4. С. 96100.

105. Серов Г.Д., Вишняков А.К., Знаменский В.А. Методика выделения псевдотуберкулёзного микроба // Лабораторное дело. 1967. № 12. С. 694696.

106. Серов Г.Д., Игнатович В.О., Вишняков А.К. , Знаменский В.А. Некоторые данные о выживаемости псевдотуберкулезного микроба в объектах внешней среды и биологических субстратах // ЖМЭИ. 1968а. № 7. С. 131135.

107. Серов Г.Д., Знаменский В.А., Вишняков А.К. Дифференциальная среда для выделения микроба псевдотуберкулеза // ЖМЭИ. 19686. № 6. С. 146-149.

108. Сидорова В.Е., Варвашевич Т.Н, Никифорова JI.C., Богомазова Т.В. Влияние температуры культивирования на функциональное состояние псевдотуберкулезного микроба // Психрофильность патогенных микроорганизмов. Новосибирск, 1986. С. 14-19.

109. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиниоза и близкие к нему микроорганизмы // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004. Т. 6, № 1.С. 10-21.

110. Солохина JI.B., Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. Образование покоящихся форм и изменчивость Yersinia pseudotuberculosis под действием сине-зеленых водорослей (цианобактерий) и их экзометаболитов // ЖМЭИ. 2001. № 1.С. 17-22.

111. Солохина JLB. Ассоциация Yersinia pseudotuberculosis с цианобактериями (популяционный и ультраструктурный анализ): Автореф. дис. . канд. мед. наук. Спб., 2002.-20 с.

112. Сомов Г.П. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. М., Медицина, 1979.-184 с.

113. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н. Ферментативные механизмы психрофильности псевдотуберкулезного микроба // ЖМЭИ. 1984. № 2. С. 42-47.

114. Сомов Г.П. Еще раз о сапронозах // ЖМЭИ. 1985. № 5. С. 98-103.

115. Сомов Г.П. Значение феномена психрофильности патогенных бактерий для обоснования возможности их размножения в окружающей среде // Экология возбудителей сапронозов. М., 1988. С. 35-46.

116. Сомов Г.П., Литвин В.Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий. Экологические аспекты. Новосибирск: Наука, 1988. -208 с.

117. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н. Влияние низкой температуры на вирулентность некоторых патогенных бактерий // ЖМЭИ. 1992а. № 4. С. 62-66.

118. Сомов Г.П., Бузолева JI.C. Об особенностях метаболизма возбудителей сапронозов // Инфекц. патология в приморском крае. Владивосток: Дальнаука, 1994. С. 22-23.

119. Сомов Г.П. Экология патогенных бактерий // Экология патогенных бактерий. Сб. науч. трудов. Новосибирск, 1994. С. 3-17.

120. Сомов Г.П., Бузолева Л.С., Черкасова С.А. О хемолитоавтотрофии возбудителей сапронозов // Экология патогенных бактерий. Сб. науч. трудов. Новосибирск, 1994а. С. 18-24.

121. Сомов Г.П., Бузолева Л.С., Черкасова С.А., Никитин Д.И., Слабова О.И. О, миксотрофии патогенных бактерий // ЖМЭИ. 19946. № 5. С. 3-6.

122. Сомов Г.П., Тимченко Н.Ф. Основные итоги изучения психрофильности патогенных бактерий // ЖМЭИ. 1997. № 5. С. 12-16.

123. Сомов Г.П., Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды. Владивосток: Примполиграфкомбинат, 2004. -168 с.

124. Соркин Ю.И., Родзиковский A.B. Экология сибиреязвенного микроба в естественных биоценозах почв различных природных зон СССР // Экология возбудителей сапронозов. Москва, 1988. С. 65-79.

125. Степура Г.С., Сидоренко П.Г. Использование флуорохромов для прижизненных исследований культур тканей и клеток. Культура изолированных органов, тканей и клеток растений // Труды I Всесоюзн. конф. 22-26 янв. 1968. М.: Наука, 1970. С.187-191.

126. Тартаковский И.С., Прозоровский C.B. Экология легионелл // Экология возбудителей сапронозов. Москва, 1988. С. 47-52.

127. Терентьева Н.А. Действие 2', З'-дидезокси-З'-аминонуклеозидов и 2', 5'-дидезокси-5'-аминонуклеозидов на биосинтез ДНК в эмбрионах морского ежа: Автореф. дис. канд. биол. наук. Владивосток, 1987.

128. Терских В.И. Сапронозы. (О болезнях людей и животных, вызываемых микробами, способными размножаться вне организма во внешней среде, являющейся для них местом обитания) // ЖМЭИ. 1958. № 8. С. 118-122.

129. Тимченко Н.Ф., Вертиев Ю.В., Недашковская Е.П., Барбул Е.А. Способ получения термостабильного экзотоксина Yersinia pseudotuberculosis II Авт. свид-во. № 1489185. 1987.

130. Тимченко Н.Ф. Патогенетическое значение психрофильности Yersinia pseudotuberculosis: Дис. . докт. мед. наук. Ленинград, 1989. 318 с.

131. Тимченко Н.Ф., Долматов И.Ю., Найденко Т.Х. Изучение патогенности бактерий рода Yersinia для морских организмов типа иглокожих // Инфекц. патология в приморском крае. Владивосток: Дальнаука, 1994а. С. 24-25.

132. Тимченко Н.Ф., Долматов И.Ю., Найденко Т.Х. Поведение популяции бактерий псевдотуберкулеза в морской экосистеме // Экология патогенных бактерий. Сб. науч. трудов. Новосибирск, 19946. С. 89-93.

133. Тимченко Н.Ф., Долматов И.Ю., Недашковская Е.П., Найденко Т.Х. Патогенность бактерий рода Yersinia для иглокожих // Экология патогенных бактерий. Сб. науч. трудов. Новосибирск, 1994в. С. 94-99.

134. Тимченко Н.Ф., Долматов И.Ю., Найденко Т.Х. Yersinia pseudotuberculosis в модельной морской экосистеме (экспериментальное исследование) // ЖМЭИ. 1995. № 5. С. 84-88.

135. Тимченко Н.Ф. Факторы патогенности Yersinia pseudotuberculosis и некоторые аспекты патогенеза псевдотуберкулеза // ЖМЭИ. 1997. № 5. С. 25-29.

136. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Долматова JI.C., Сомова-Исачкова JI.M. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток: Приморский полиграфкомбинат, 2004. — 220 с.

137. Троицкая В.В., Четина Е.В., Аляпкина Ю.С., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л. Некультивированные формы Yersinia pseudotuberculosis в почвах природного очага псевдотуберкулеза // ЖМЭИ. 1996. № 5. С. 13-15.

138. Туманский В.М. Псевдотуберкулез. М.: Медгиз, 1952. 84 с.

139. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир, 1975. 324 с.

140. Федореев С.А., Денисенко В.А., Кулеш Н.И., Козыренко М.М. и др. Исследование химического состава хиноидных пигментов из клеточной культуры ВК-39 Lithospermum etythrorhizon Sieb. et Zucc. // Химико-фармацевтический журнал. 1993. № 6. C.33-37.

141. Ценева Г.Я.; Дятлов Ф.Г., Идина М.С., Курова Г.Я. Жидкая питательная среда для выделения иерсиний // Лабораторное дело. 1990. № 5. С. 66-68.

142. Ценева Г.Я., Воскресенская Е.А., Солодовникова Н.Ю., Васильева В.И., Стебунова Т.К. Биологические свойства иерсиний и лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсиниоза. Пособие для врачей. СПб., 2001.60 с.

143. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002. Т. 4, № 3. С. 248-266.

144. Чеснокова М.В., Климов В.Т., Иванова JI.K., Попов А.В. Эпидемиологические аспекты псевдотуберкулеза и иерсиниоза в России // Иерсинии и иерсиниозы. СПб., 2006. С. 7-34.

145. Шубин Ф.Н. Экологические и молекуляно-генетические механизмы функционирования природного очага псевдотуберкулеза // Экология патогенных бактерий. Сб. науч. трудов. Новосибирск, 1994. С. 62-74.

146. Шурыгина И.А., Чеснокова М.В., Климов В.Т., Малов И.В., Марамович А.С. Псевдотуберкулез. Новосибирск: Наука, 2003. 320 с.

147. Ющенко Г.В. Современное состояние проблемы иерсиниозов // Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1998. № 6. С. 8-11.

148. Abramovitch R. B., Kim Y.-J., Chen S., Dickman M.B., Martin G. B. Pseudomonas type III effector AvrPtoB induces plant disease susceptibility by inhibition of host programmed cell death // EMBO J. 2003. Vol. 22. No. 1. P. 6069.

149. Abramovitch R. B., Martin G. B. Strategies used by bacterial pathogens to suppress plant defenses // Curr. Opin. Plant Biology. 2004. Vol. 7. P. 356-364.

150. Abramovitch R. B., Anderson J. C., Martin G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity //Nature reviews. 2006. Vol. 7. P. 601-614.

151. Ade J., De Young B J., Golstein C., Innes R.W. Indirect activation of a plant nucleotide binding site-leucine rich repeat protein by a bacterial protease // Proc. Natl. Acad. Sci. 2007. Vol. 104. P. 2531-2536.

152. Aepfelbacher M., Zumbihl R., Ruckdeschel K., Jacobi C.A., Barz C., Heesemann J. The tranquilizing injection of Yersinia proteins: a pathogen s strategy to resist host defense // Biol. Chem. 1999. Vol. 380. P. 795-802.

153. Aldova E., Brezinova A., Sobotkova J. A Finding of Yersinia pseudotuberculosis in well water // Zentralblatt Bacteriol. Microbiol. Hygiene. 1979. Vol. 169. P. 265-270.

154. Alfano J.R., Collmer A. Bacterial pathogens in plants: life up against the wall // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 1683-1698.

155. Alfano J. R, Collmer A. The type III (Hrp) secretion pathway of plant pathogenic bacteria: trafficking harpins, Avr proteins, and death // J. Bacteriology. 1997. Vol. 179. No. 18. P. 5655-5662.

156. Alfano J.R., Collmer A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense // Annu. Rev. Phytopathol. 2004. Vol. 42. P. 385-414.

157. Angot A., Vergunst A., Genin S., Peeters N. Exploitation of eukaryotic ubiquitin signaling pathways by effectors translocated by bacterial type III and type IV secretion systems // PLoS Pathogens. 2007. Vol. 3 (1). P. 1-13.

158. Asai T., Tena G., Plotnikova J., Willmann M.R., Chiu W.L., Gomez-Gomez L., Boiler T., Ausubel F.M., Sheen J. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity // Nature. 2002. Vol. 415. P. 977-983.

159. Axtell M.J., Staskawicz B.J. Initiation of RPS2- specified disease resistance in Arabidopsis is coupled to the AvrRpt2-directed elimination of RIN4 // Cell. 2003. Vol. 112. P. 369-377.

160. Ausubel F.M. Are innate immune signaling pathways in plants and animals conserved? //Nat. Immunol. 2005. Vol. 6 (10). P. 973-979.

161. Baker B., Zambryski P., Staskawicz B., Dinesh-Kumar S.P. Signaling in plant-microbe interactions // Science. 1997. Vol. 276. P. 726-733.

162. Beffa R.S., Hofer R.-M., Thomas M., Meins Jr F. Decreased susceptibility to viral disease of P-l,3-glucanase-deficient plants generated by antisense transformation // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 1001-1011.

163. Bender C.L., Alarcon-Chaidez F., Gross D.C. Pseudomonas syringae phytotoxins: mode of action, regulation, and biosynthesis by peptide and polyketide synthetases // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. Vol. 63. P. 266-292.

164. Bent A.F. Plant disease resistance genes: Function meets structure // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 1757-1771.

165. Bhattacharjee S. Reactive oxygen species and oxidative burst: Roles in stress, senescence and signal transduction in plants // Current Science. 2005. Vol. 89. No. 7. P. 1113-1121.

166. Bogdanove A. J. Protein-protein interactions in pathogen recognition by plants // Plant Molecular Biology. 2002. Vol. 50. P. 981-989.

167. Bolwell G.P., Butt V.S., Davies D.R., Zimmerlin A. The origin of the oxidative burst in plants // Free Rad. Res. Comm. 1995. Vol. 23. P. 517-532.

168. Bowles D.J. Defense-related proteins in higher plants // Annu. Rev. Biochem. 1990. Vol. 59. P. 873-907.

169. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 86. P. 248-254.

170. Brencic A., Winans S.C. Detection of and response to signals involved in host-microbe interactions by plant-associated bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005. Vol. 69. No. 1. P. 155-194.

171. Britigan B.E., Hayek M.B., Doebbeling B.N., Fick R.B. Jr. Transferrin and lactoferrin undergo proteolytic cleavage in the Pseudomonas aeruginosa-infected lungs of patients with cystic fibrosis // Infect Immun. 1993. Vol. 61 (12). P. 5049-5055.

172. Brown J.A., West W.L., Balourdas Jh.A., Banks W.M., Marshall J.J. Some possible mechanisms of action of heat-stable toxin from Pasteurella pseudotuberculosis II Cytobiol. 1971. Vol. 3. No. 9. P. 25-32.

173. Bulgakov V.P., Zhuravlev Yu.N., Radchenko S.V., Fedoreyev S.A., Denisenko V.A. et al. Constituents of Aristolochia manshuriensis cell suspension culture possessing cardiotonic activity // Fitoterapia. 1996. Vol. LXVII. No. 3. P.238-240.

174. Bulgakov V.P., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.V., Chernoded G.K., Zhuravlev Y.N. The impact of plant rolC oncogene on ginsenoside production by ginseng hairy root cultures // Phytochemistry. 1998. Vol. 49. No. 7. P. 19291934.

175. Bulgakov V.P., Kiselev K.V., Yakovlev K.V., Zhuravlev Y.N., Gontcharov A.A., Odintsova N.A. Agrobacterium-mediated transformation of sea urchin embryos // Biotechnol. J. 2006. Vol. 1. P. 454-461.

176. Buttner D., Bonas U. Getting across bacterial type III effector proteins on their way to the plant cell // EMBO J. 2002. Vol. 21. No. 20. P. 5313-5322.

177. Buttner D., Nennstiel D., Kliisener B., Bonas U. Functional analysis of HrpF, a putative type III translocon protein from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria II J. Bacteriology. 2002. Vol. 184. No. 9. P. 2389-2398.

178. Cao H., Baldini R.L., Rahme L.G. Common mechanisms for pathogens of plants and animals // Annu. Rev. Phytopathol. 2001. Vol. 39. P. 259-84.

179. Cheville N.F., Rimire R.B. A protein toxin from Pasteurella multocida type D causes acute and chronic hepatic toxicity in rats // Vet. Path. 1989. Vol. 286. P. 148-157.

180. Chiesa C., Pacifico L., Cianfranco V. Sources of 2883 strains of Yersinia enterocolitica and related species isolated in Italy: clinical, ecological and epidemiological features //Microecol. Ther. 1989. Vol. 18. P. 331-334.

181. Chinchilla D., Bauer Z., Regenass M., Boiler T., Felix G. The Arabidopsis receptor kinase FLS2 binds flg22 and determines the specificity of flagellin perception //Plant Cell. 2006. Vol. 18. P. 465-476.

182. Chisholm S., Coaker G., Day B., Staskawicz B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response // Cell. 2006. Vol. 124. P. 803-814.

183. Cianciotto NP. Type II secretion: a protein secretion system for all seasons // Trends Microbiol. 2005. Vol. 13. P. 581-88.

184. Cochrane F.C., Davin L.B., Lewis N.G. The Arabidopsis phenylalanine ammonia lyase gene family: kinetic characterization of the four PAL isoforms // Phytochemistry. 2004. Vol. 65. P. 1557-1564.

185. Collmer A. Determinants of pathogenicity and avirulence in plant pathogenic bacteria // Current Opinion in Plant Biology. 1998. Vol. 1. P. 329-335.

186. Collinge D.B., Kragh K.M., Mikkelsen J.D., Nielsen K.K., Rasmussen U., Vad K. Plant chitinases // Plant J. 1993. Vol. 3. P. 31-40.

187. Cornelis G.R., Wolf-Watz H. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eukaryotic cells // Mol. Microb. 1997. Vol. 23 (5). P. 861-867.

188. Cornelis G.R. The Yersinia Deadly"Kiss // J Bacteriol. 1998. Vol. 180 (21). P. 5495-5504.

189. Cornells G.R. Type III secretion: a bacterial device for close combat with cells of their eukaryotic host // Philos. Trans. R Soc. Lond. B. 2000. Vol. 355 (1397). P. 681-693.

190. Cramer C.L., Edwards K., Dron M., Liang X., Dildine S.L., Bolwell G.P., Dixon R.A., Lamb C.J., Schuch W. Phenylalanine ammonia-lyase gene organization and structure // Plant Mol. Biol. 1989. Vol. 12. P. 367-383.

191. Croft K.P.C., Juttner F., Slusarenko A.J. Volatile products of the lipoxygenase pathway evolved from Phaseolus vulgaris (L.) leaves inoculated with Pseudomonas syringae pvphaseolicola II Plant Physiol. 1993. Vol. 101. P. 1324.

192. Dangl J. L., Dietrich R. A., Richberg M. H. Death don't have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions // The Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 1793-1807.

193. Dangl J.L., Jones J.D. Plant pathogens and integrated defence responses to infection //Nature. 2001. Vol. 411. P. 826-833.

194. Dangl J., McDowell J. Two modes of pathogen recognition by plants // PNAS. 2006. Vol.103. No. 23. P. 8575-8576.

195. DeYoung B. J., Innes R. W. Plant NBS-LRR proteins in pathogen sensing and host defense II Nat. Immunol. 2006. Vol. 7. No. 12.

196. Dickman M. B., Park Y. K., Oltersdorf T., Li W., Clemente T., French R. Abrogation of disease development in plants expressing animal antiapoptotic genes // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. Vol. 98. No. 12. P. 6957-6962.

197. Dominovska C., Mallotke R. Survival of Yersinia in water samples originating from various sources // Bull. Inst. Med. Mor. Gdansku. 1971. Vol. 22. No. 3. P. 173-182.

198. Durner J., Klessig D. Salicilic acid is a modulator of plant and mammalian catalases //J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. No. 45. P. 28492-28501.

199. Dwyer S., Legendre L., Low P.S., Leto T. Plant and human neutrophil oxidative burst complexes contain immunologically related proteins // Biochimica et Biophysica Acta. 1996. Vol. 1289. P. 231-237.

200. Eliseikina M., Timchenko N., Bulgakov A., Magarlamov T., Petrova I. Influence of Yersinia pseudotuberculosis on the immunity of Echinoderms // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. Vol. 529. P. 173-175.

201. Epple P., Apel K., Bohlmann H. An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis-related proteins //Plant Physiol. 1995. Vol. 109. P. 813-820.

202. Falkao D.P., Correa E.F., Falkao G.P. Yersinia spp. in the environment: epidemiology and virulence characteristics // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. Vol. 529. P. 341-343.

203. Farmer E.E., Ryan C.A. Octadecanoid precursors of jasmonic acid activate the synthesis of wound-inducible proteinase inhibitors // Plant Cell. 1992. Vol. 4. P. 129-134.

204. Felix G., Boiler T. Molecular sensing of bacteria in plants. The highly conserved RNA-binding motif RNP-1 of bacterial cold shock proteins is recognized as an elicitor signal in tobacco //J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 6201-6208.

205. Fenselau S., Balbo I., Bonas U. Determinants of pathogenicity in Xanthomonas campestris pv. vesicetoria are related to proteins involved in secretion in bacterial pathogens of animals // Mol. Plant-Microbe Interact. 1992. Vol. 5. P. 390-396.

206. Francetic O, Belin D, Badaut C, Pugsley AP. Expression of the endogenous type II secretion pathway in Escherichia coli leads to chitinase secretion // EMBO J. 2000. Vol. 19. P. 6697-703.

207. Fritz-Laylin L.K., Krishnamurthy N., Tor M., Sjolander, K.V., Jones J.D. Phylogenomic analysis of the receptor-like proteins of rice and Arabidopsis // Plant Physiology. 2005. Vol. 138. P. 611-623.

208. Fukushima H., Gomyoda M., Shiozawa K. Kaneko S., Tsubokura M. Yersinia pseudotuberculosis infection contracted through water contaminated by a wild animal // J. Clin. Microbiol. 1988. Vol. 26. No 3. P. 584-585.

209. Fukushima H., Gomyoda M. Intestinal carriage of Yersinia pseudotuberculosis by wild birds and mammals in Japan // Applied and Environmental Microbiology. Apr. 1991. Vol. 57 (4). P. 1152-1155.

210. Fukushima H., Gomyoda M., Tsubokura M., Aleksic S. Isolation of Yersinia pseudotuberculosis from river waters in Japan and Germany using direct KOH and HeLa cell treatments // Zentralbl Bacteriol. Jan 1995. Vol. 282 (1). P. 40-49.

211. Gachomo E. W., Shonukan O. O., Kotchoni S. O. The molecular initiation and subsequent acquisition of disease resistance in plants // African J. Biotechnology. 2003. Vol. 2 (2). P. 26-32.

212. Galan J. E., Collmer A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells // Science. 1999. Vol. 284. P. 1322-1328.

213. Galan J. E. Bacterial toxins and the immune system: show me the in vivo targets // JEM. 2005. Vol. 201. No. 3. P. 321-323.

214. Gauthier A., Thomas N. A., Finlay B. B. Bacterial injection machines // J. Biological Chemistry. 2003. Vol. 278. No. 28. P. 25273-25276.

215. Gelvin S. B. Agrobacterium and plant genes involved in t-DNA transfer and integration. Annu. Rev. Plant Physiol. 2000. Vol. 51. P. 223-256.

216. Gomez-Gomez L., Boiler T. FLS2: an LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis II Mol. Cell. 2000. Vol. 5. P. 1003-1011.

217. Gomez-Gomez L. Plant perception systems for pathogen recognition and defence // Mol. Immunology. 2004. Vol. 41. P. 1055-1062.

218. Greenberg J.T. Programmed cell death: A way of life for plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 12094-12097.

219. Greenberg J. T., Yao N. The role and regulation of programmed cell death in plant-pathogen interactions // Cell Microbiol. 2004. Vol. 6 (3). P. 201-211.

220. Hammond-Kosack K.E. and Jones J. D. G. Resistance gene-dependent plant defense responses // The Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 1773-1791.

221. Hannu T., Mattila L., Nuorti J., Ruutu P., Mikkola J., Siitonen A., Leirisalo-Repo M. Reactive arthritis after an outbreak of Yersinia pseudotuberculosis serotype 0:3 infection // Ann Rheum Dis. 2003 Sept. Vol. 62 (9). P. 866-869.

222. Hardt W.-D., Galan J.E. A secreted Salmonella protein with homology to an avirulence determinant of plant pathogenic bacteria // PNAS. 1997. Vol. 94 (18). P. 9887-9892.

223. He S.Y., Nomura K., Whittam Th. S. Type III protein secretion mechanism in mammalian and plant pathogens // Biochem. Biophys. Acta. 2004. Vol. 1694. P. 181-206.

224. He P., Shan L., Sheen J. Elicitation and suppression of microbe-associated molecular pattern-triggered immunity in plant-microbe interactions // Cellular Microbiology. 2007. Vol. 9(6). P. 1385-1396.

225. Heath M.C. Hypersensitive response-related death // Plant Mol. Biol. 2000. Vol. 44. P. 321-334.

226. Heesemann J., Sing A., Trulzsch K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense // Current Opinion in Microbiol. 2006. Vol. 9. P. 5561.

227. Holt B.F., Mackey D., Dangl J.L. Recognition of pathogens by plants // Curr. Biol. 2000. Vol. 10. P. 5-7.

228. Holub E.B., Beynon J.L., Crute I.R. Phenotypic and genotypic characterization of interactions between isolates of Pemnospora parasitica and accessions of Arabidopsis thaliana II Mol. Plant-Microbe Interact. 1994. Vol. 7. P. 223-239.

229. Hueck C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants //Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. Vol. 62. No. 2. P. 379-433.

230. Hunter M.D. Mixed signals and cross-talk: interactions between plants, insect herbivores and plant pathogens // Agricultural and Forest Entomology. 2000. Vol. 2. P. 155-160.

231. Hunter Ph. Comparisons between plant and animal immunity can benefit both research communities IIEMBO reports. 2005. Vol. 6. No. 6. P. 504-507.

232. Jackson A.O., Taylor C.B. Plant-microbe interactions: life and death at the interface //Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 1651-1668.

233. Jalava Katri, Hallanvuo S., Nakari U.-M., Ruutu P., Kela E., Heinasmaki T., Siitonen A., Nuorti J. P. Multiple outbreaks of Yersinia pseudotuberculosis infections in Finland // J. Clinical microbiology. 2004. Vol. 42. No. 6. P. 27892791.

234. Janeway C., Medzhitov R. Innate immune recognition // Annu Rev. Immunol.2002. Vol. 20. P. 197-216.

235. Janjusevic R., Abramovitch R.B., Martin G.B., Strebbins C.E. A bacterial inhibitor of host programmed cell death defenses is an E3 ubiquitin ligase // Science. 2005. Vol. 311. P. 222-226.

236. Jha A.K., Bais H.P., Vivanco J.M. Enterococcus faecalis mammalian virulence-related factors exhibit potent pathogenicity in the Arabidopsis thaliana plant model // Infection and Immunity. 2005. Vol. 73. No. 1. P. 464-475.

237. Jia Y., McAdams S.A., Bryan G.T., Hershey H.P., Valent B. Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice blast resistance // EMBO J. 2000. Vol. 19. P. 4004-4014.

238. Josenhans C., Suerbaum S. The role of motility as a virulence factor in bacteria // Int. J. Med. Microbiol. 2002. Vol. 291 (8). P. 605-14.

239. Kasprzewska A. Plant chitinases regulation and function // Cell. Mol. Biol.2003. Vol. 8. P. 809-824.

240. Keen N.T. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions // Annu. Rev. Genet. 1990. Vol. 24. P. 447-463.

241. Keen N. T. The molecular biology of disease resistance // Plant Mol Biol. 1992. Vol. 19(1). P. 109-22.

242. Keen N., Staskawicz B., Mekalanos J., Ausubel F., Cook R. J. Pathogens and hosts: The dance is the same, the couples are different // Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. Vol. 97. No. 16. P. 168752-168753.

243. Kempf V.A., Hitziger N., Riess T., Autenrieth I.B. Do plant and human pathogens have a common pathogenicity strategy? // Trends. Microbiol. 2002. Vol. 10(6). P. 269-75.

244. Keshavarzi M., Soylu S., Brown I., Bonas U., Nicole M., Rossiter J., Mansfield J. Basal defenses induced in pepper by lipopolysaccharides are suppressed by

245. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria II Mol. Plant Microbe. Interact. 2004. Vol. 17. P. 805-815.

246. Kim C.Y., Zhang S. Activation of a mitogen-activated protein kinase cascade induces WRKY family of transcription factors and defense genes in tobacco // Plant J. 2004. Vol. 38. P. 142-151.

247. Kim M. G., Kim S. Y., Kim W. Y., Mackey D., Lee S. Y. Responses of Arabidopsis thaliana to challenge by Pseudomonas syringae II Mol. Cells. 2008. Vol. 25. No. 3. P. 323-331.

248. Kiselev K.V., Kusaykin M.I., Dubrovina A.S., Bezverbny D.A., Zvyagintseva T.N., Bulgakov V.P. The rolC gene induces expression of a pathogenesis-related b-l,3-glucanase in transformed ginseng cells // Phytochemistry. 2006. Vol. 67. P. 2225-2231.

249. Klement Z. Hypersensitivity II In Phytopathogenic Prokaryotes. Edited by M. S. Mount & G. H. Lacy. New York: Academic Press. 1982. P. 149-177.

250. Klement Z., Bozso Z., Kecskes M. L., Besenyei E., Arnold C., Ott P.G. Local early induced resistance of plants as the first line of defence against bacteria // Pest. Manag. Sci. 2003. Vol. 59 (4). P. 465-474.

251. Klessig D.F., Malamy J. The salicylic acid signal in plants // Plant Mol. Biol. 1994. Vol. 26. P. 1439-1458.

252. Knapp W., Masshoff W. Etiology of suppurative reticulocytic lymphadenitis, a practically important disease frequently simulating acute appendicitis // Dtsch. Med. Wochenschr. 1954. Vol. 79 (35). P. 1266-1271.

253. Knapp W. Pasteurella pseudotuberculosis with special reference to its significance in human medicine // Ergeb. Mikrobiol. Immunitatsforsch Exp. Ther. 1959. Vol. 32. P. 196-269.

254. Kobe B., Kajava A.V. The leucine-rich repeat as a protein recognition motif // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. Vol. 11. P. 725-732.

255. Kunik T., Tzfira T., Kapulnik Y., Gafhi Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of Hela cells by Agrobacterium IIPNAS. 2001. Vol. 98. No. 4. P. 1871-1876.

256. Lacroix B., Tzfira T., Vainstein A., Citovsky V. A case of promiscuity: Agrobacterium's endless hunt for new partners // Trends Genet. 2006. Vol. 22. P. 29-37.

257. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.

258. Leach J.E., White F.F. Bacterial avirulence genes // Annu. Rev. Phytopathol. 1996. Vol. 34. P. 153-179.

259. Lehmann P. Structure and evolution of plant disease resistance genes // J. Appl. Genet. 2002. Vol. 43 (4). P. 403-414.

260. Leon J., Lawton M.A., Raskin I. Hydrogen peroxide stimulates salicylic acid biosynthesis in tobacco //Plant Physiol. 1995. Vol. 108. P. 1673-1678.

261. Leubner-Metzger G., Meins Jr.F. Functions and regulation of plant P-1,3-glucanases (PR-2) // In : Datta S.K., Muthukrishnan S. (Eds.). Pathogenesis-related proteins in plant. CRC Press, Boca Raton. 1999. P. 49-76.

262. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C. H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response // Cell. 1994. Vol. 79. P. 583-593.

263. Lindgren P.B., Peet R.C., Panopoulos NJ. Gene cluster of Pseudomonas syringae pv. "phaseolicola" controls pathogenicity of bean plants and hypersensitivity on nonhost plants // J. Bacteriol. 1986. Vol. 168. P. 512-522.

264. Lockman H.A., Gillespie R.A., Baker B.D., Shakhnovich E. Yersinia pseudotuberculosis produces a cytotxic necrotizing factor // Infect. Immun. 2002. Vol. 70. No. 70. P. 2708-2014.

265. Mackey D., Holt B.F., Wiig A., Dangl J.L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis II Cell. 2002. Vol. 108. P. 743-754.

266. Mackey D., McFall A. J. MAMPs and MIMPs: proposed classifications for inducers of innate immunity // Molecular Microbiology. 2006. Vol. 61 (6). P. 1365-1371.

267. Mauch-Mani B., Slusarenko A.J. Production of salicylic acid precursors is a major function of phenylalanine ammonia-lyase in the resistance of Arabidopsis to Pemnospora parasitica // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 203-212.

268. Meier B.M., Slusarenko A.J. Spatial and temporal accumulation of defense gene transcripts in bean (Phaseolus vulgaris) leaves in relation to bacteria-induced hypersensitive cell death // Mol. Plant-Microbe Interact. 1993. Vol. 6. P. 453466.

269. Menezes H., Jared C. Immunity in plants and animals: common ends through different means using similar tools // Comp. Biochem. Physiol. Toxicol. Pharmacol. 2002. Vol. 132. No. 1. P. 1-7.

270. Merilahti-Paolo R., Lahesmaa R., Granfors K., Gripenberg-Lerche C., Toivanen P. Risk of Yersinia infection among butchers // Scand. J. Infect. Dis. 1991. Vol. 23. No. l.P. 55-61.

271. Mittler R., Lam E. Sacrifice in the face of foes: Pathogen induced programmed cell death in plants // Trends Microbiol. 1996. Vol. 4. P. 10-15.

272. Mudgett M. B. New insights to the function of phytopathogenic bacterial type III effectors in plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2005. Vol. 56. P. 509-531.

273. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol, plantarum. 1962. Vol. 15. P. 473-497.

274. Newman M.A., von Roepenack-Lahaye E., Parr A., Daniels M.J., Dow J.M. Prior exposure to lipopolysaccharide potentiates expression of plant defenses in response to bacteria // Plant J. 2002. Vol. 29. P. 487-495.

275. Noel L, Thieme F, Gabler J, Buttner D, Bonas U. XopC and XopJ, two novel type III effector proteins from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria H J. Bacteriol. 2003. Vol. 185 (24). P. 7092-7102.

276. Nürnberger T., Brunner F., Kemmerling B., Piater L. Innate immunity in plants and animals: striking similarities and obvious differences // Immunol. Rev. 2004. Vol. 198. P. 249-266.

277. Ocampo C.A., Moerschbacher B., Grambow H.J. Increased lipoxygenase activity in the hypersensitive response of wheat leaf cells infected with avirulent rust fungi or treated with fungal elicitor // Z. Naturforsch. 1986. Vol. 41. P. 559-563.

278. Orth K., Xu Z., Mudgett M.B., Bao Z.Q., Palmer L.E., Bliska J.B., Mangel W.F., Staskawicz B.J., Dixon J.E. Disruption of signaling by Yersinia effector YopJ, a ubiquitin-like protein protease // Science. 2000. Vol. 290. P. 1594-1597.

279. Parker J.E. Plant recjgnition of microbial patterns // Trends Plant Sei. 2003. Vol. 8. P. 245-247.

280. Paterson J.S., Cook R.J. A method for the recovery of Pasteurella pseudotuberculosis from faeces II J. Path. Bact. 1963. Vol. 85 (1). P. 241-242.

281. Pedersen K., Nielsen I.S., Poulsen P.G., Kreiner H. Pseudotuberculose has farmhjortre in Danmark // Dan. Veterinaertidsskr. 1992. Vol. 75. No. 6. P. 213218.

282. Peng M., Kuc J. Peroxidase-generated hydrogen peroxide as a source of antifungal activity in vitro and on tobacco leaf disks // Phytopathology. 1992. Vol. 82. P. 696-699.

283. Pennell R., Lamb C. Programmed cell death in plant // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1157-1168.

284. Pieterse C., van Wees S. C. M., van Pelt J. A., Knoester M., Laan R., Gerrits H., Weisbeek P.J., van Loon L. C. A novel signaling pathway controlling induced systemic resistance in Arabidopsis //Plant Cell. 1998. Vol. 10. P. 1571-1580.

285. Pitzschke A., Hirt H. Mitogen-activated protein kinases and reactive oxygen species signaling in plants // Plant Physiology. 2006. Vol. 141. P. 351-356.

286. Plotnikova J.M., Rahme L.G., Ausubel F.M. Pathogenesis of the human opportunistic Pathogen Pseudomonas aeruginosa PA 14 in Arabidopsis // Plant Physiology. 2000. Vol. 124. P. 1766-1774.

287. Prithiviraj B., Weir T., Bais H.P., Schweizer H.P., Vivanco J.M. Plant models for animal pathogenesis // Cell Microbiology. 2005. Vol. 7. No. 3. P. 315-324.

288. Piihler A., Arlat M., Becker A., Gottfert M., Morrissey J. P., O'Gara F. What can bacterial genome research teach us about bacteria-plant interactions? Current Opinion in Plant Biology. 2004. Vol. 7. P. 137-147.

289. Rahme L.G., Ausubel F.M., Cao H., Drenkard E., Goumnerov B.C., Lau G.W., Mahajan-Miklos S., Plotnikova J., Tan Man-Wah, Tsongalis J., Walendziewicz

290. C.L., Tompkins R.G. Plants and animals share functionally common bacterial virulence factors //PNAS. 2000. Vol. 97. No. 16. P. 8815-8821.

291. Raskin I. Salicylate, a new plant hormone // Plant Physiol. 1992. Vol. 99. P. 799803.

292. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque strain in electron microscopy//J. Cell Biol. 1963. Vol. 17. No. 1. P. 208-212.

293. Romantschuk M., Roine E., Taira S. Hrp pilus reaching through the plant cell wall //Eur. J. Plant Pathol. 2001. Vol. 107. P. 153-160.

294. Rossier O., K. Wengelnik, Hahn K., Bonas U. The Xanthomonas Hrp type III system secretes proteins from plant and mammalian bacterial pathogens // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. Vol. 96. P. 9368-9373.

295. Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G., Molina A., Steiner H.-Y., Hunt M.D. Systemic acquired resistance // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 1809-1819.

296. Saad M., Staehelin Ch., Broughton W.B., Deakin W.J. Protein-protein interactions within type III secretion system-dependent pili of Rhizobium sp. strain NGR234 // J. Bacteriology. 2008. Vol. 190. No. 2. P. 750-754.

297. Salanoubat M, Genin S, Artiguenave F, Gouzy J, Mangenot S. et al. Genome sequence of the plant pathogen Ralstonia solanacearum // Nature. 2002. Vol. 415. P. 497-502.

298. Sato K., Komazawa M. Yersinia pseudotuberculosis infection in children due to untreated drinking water// Contrib. Microbiol. Immunol. 1991. Vol. 12. P. 5-10.

299. Schar M., Thai E. Comparative studies on toxin of «Pasteurella pestis» and «Pasteurella pseudotuberculosis» // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1955. Vol. 88. No. l.P. 39-42.

300. Schulze-Lefert P., Robatzek S. Plant pathogens trick guard cells into opening the gates II Cell. 2006. Vol. 126. P. 831-834.

301. Scofield S.R., Tobias C.M., Rathjen J.P., Chang J.H., Lavelle D.T., Michelmore R.W., Staskawicz B.J. Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato // Science. 1996. Vol. 274. P. 2063-2065.

302. Sela I. Plant-virus interactions related to resistance and localization of viral infections // Adv. Virus Res. 1981. V. 26. P. 201-237.

303. Shao F., Merritt P. M., Bao Z., Innes R. W., Dixon J. E. A Yersinia effector and a Pseudomonas avirulence protein define a family of cysteine proteases functioning in bacterial pathogenesis // Cell. 2002. Vol. 109. P. 575-558.

304. Shao F., Golstein C., Ade J., Stoutemyer M., Dixon J.E., Innes R.W. Cleavage of Arabidopsis PBS1 by a bacterial type III effector // Science. 2003. Vol. 301. P. 1230-1233.

305. Shao F., Innes R., Dixon J.E. The crystal structure of Pseudomonas avirulence protein AvrPphB: a papain-liked fold with a distinct substrate-binding site // PNAS. 2004. Vol. 101 (1). P. 302-307.

306. Silipo A., Molinaro A., Sturiale L., Dow J.M., Erbs G., Lanzetta R., Newman M.A., Parrilli M. The elicitation of plant innate immunity by lipooligosaccharide of Xanthomonas campestris II J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280. P. 33660-33668.

307. Solomon E.B., Yaron S., Matthews K.R. Transmission of Escherichia coli 0157:H7 from contaminated manure and irrigation water to lettuce plant tissue and its subsequent internalization // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68. No. l.P. 397-400.

308. Starr M. P., Chatterjee A. K. The genus Erwinia: enterobacteria pathogenic to plants and animals //Annu. Rev. Microbiol. 1972. Vol. 26. P. 389-426.

309. Staskawicz B.J., Ausubel F.M., Baker B.J., Ellis J.G., Jones J.D.G. Molecular genetics of plant disease resistance // Science. 1995. Vol. 268. P. 661-667.

310. Staskawicz B.J., Mudgett M.B., Dangl J.L., Galan J.E. Common and contrasting themes of plant and animal disease // Science. 2001. Vol. 292. P. 2285-2289.

311. Suzuki H., Xia Y., Cameron R., Shadle G., Blount J., Lamb C., Dixon R. A. Signals for local and systemic responses of plants to pathogen attack // J. Experimental Botany. 2004. Vol. 55. No. 395. P. 169-179.

312. Takken F.L., Albrecht M., Tameling W.I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence // Curr. Opin. Plant Biol. 2006. Vol. 9. P.383-390.

313. Tang X., Frederick R.D., Zhou J., Halterman D.A., Jia Y., Martin G.B. Initiation of plant disease resistance by physical interaction of AvrPto and Pto kinase // Science. 1996. Vol. 274. P. 2060-2063.

314. Tang X., Xiao Y., Zhou J.-M. Regulation of the type III secretion system in phytopathogenic bacteria // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2006. V. 19. No. 11. P. 1159-1166.

315. Taylor C.B. Defense responses in plants and animals—more of the same // Plant Cell. 1998. Jun. Vol. 10. No. 6. P. 873-876.

316. Timchenko N.F., Zahaleva V.A., Xodakova L.P., Veligorskaya E.V. Interaction between Yersinia pseudotuberculosis and Y. enterocolitica and fish cells // Microbios. 1994. Vol. 79. P. 215-222.

317. Toth I. K., Birch P. R. Rotting softly and stealthily // Curr. Opin. Plant Biol. 2005. Vol. 8. P. 424-429.

318. Toth I., Pritchard L., Birch P. R. J. Comparative Genomics of plant and animals pathogens //Annu. Rev. Phytopathol. 2006. Vol. 44. P. 305-336.

319. Tsuda K., Sato M., Glazebrook J., Cohen J., Katagiri F. Interplay between MAMP-triggered and SA-mediated defense responses // Plant J. 2008. Vol. 53 (5). P. 763-775.

320. Vincent P., Leclercq A., Martin L. Sudden onset of Pseudotuberculosis in humans, France, 2004-05 // Emerg. Infect. Dis. 2008. Vol. 14 (7). P. 1119-1122.

321. Walton J. Deconstructing the cell wall // Plant Physiol. 1994. Vol. 104. P. 11131118.

322. Yu I.-C., Parker J., Bent A. F. Gene-for-gene disease resistance without the hypersensitive response in Arabidopsis dndl mutant // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. Vol. 95. P. 7819-7824.

323. Zhu M., Shao F., Innes R.W., Dixon J.E., Xu Z. The crystal structure of Pseudomonas avirulence protein AvrPphB: a papain-like fold with a distinct substrate-binding site // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. Vol. 101 (1). P. 302-7.

324. Zipfel C., Robatzek S., Navarro L., Oakeley E.J., Jones J.D., Felix G., Boiler T. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception I I Nature. 2004. Vol. 428. P. 764-767.