Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная культура княжика сибирского (Atragene speciosa weinm.) in vitro

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Клеточная культура княжика сибирского (Atragene speciosa weinm.) in vitro"

На правах рукописи

Дорофеев Вячеслав Юрьевич

КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА КНЯЖИКА СИБИРСКОГО (A TRAGENE SPECIOSA WEINM.) IN VITRO

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Томский государственный университет» Федерального агентства по образованию

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Карначук Раиса Александровна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ильинских Николай Николаевич доктор биологических наук Уразова Людмила Николаевна

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится « 9 » июня 2005 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.03 при Сибирском государственном медицинском университете по адресу: г. Томск, Московский тракт, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « » с. ¿¿О. Л_2005 г.

диссертационного совета

Ученый секретарь

Герасимов А. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Более 25% всех применяемых в медицине лекарств содержат соединения растительного происхождения. Это различные вторичные соединения: алкалоиды, стероиды, тритерпеновые гликозиды и другие. Однако, природные источники лекарственного сырья имеют ограниченные ареалы, либо запасы их быстро оскудевают вследствие антропогенного воздействия.

Поэтому возможный путь получения ценного и дефицитного сырья для медицинской промышленности - это метод культуры тканей и клеток лекарственных растений. Так, успешно культивируются в качестве источников алкалоидов - Atropa belladonna L., Symphytum officinale, Aconitum sp; алкалоидов и сапонинов - Nigella sp, витамина E - Carthamus tinctorius L.; эфирных масел - Lavandula sp и многие другие растения (Shoyama Y. and al., 1991; Schmaauder H.-P. and al., 1991). Известно о способности генетически трансформированных культур «бородатых корней» (hairy root) к биосинтезу вторичных соединений (Yamamoto Н. et al., 1986, 1991; Кузовкина И.Н., 1992). Например, в трансформированных корнях шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi.) обнаружены флавоноидьг байкапин и байкалеин (Гусева A.B. и др., 1999).

Технология in vitro позволяет увеличить выход биологически активных веществ и регулировать их накопление в культуре, получая экологически чистые продукты. Данный метод имеет ряд преимуществ перед использованием интактного растения. Он позволяет получать сырьё независимо от климатических условий, трудностей сбора сырья, даёт возможность поддерживать рост растений круглый год, что важно для имеющих в цикле своего развития периоды покоя.

На основе изучения биосинтетических процессов можно получить наиболее богатые тканевые клоны биологически действующих веществ, а также заменить интактные растения, природный ареал которых недостаточен для использования в практических целях.

К таким растениям относится княжик сибирский - Atragene speciosa Weinm. (A. sibirica L.), семейство Лютиковые (Ranunculaceae). Княжик сибирский - это ценное лекарственное растение, показано анксиолитическое, антистрессовое, противоневротическое, противоишемическое и антиоксидантное действие экстрактов из травы княжика. Основными группами веществ, ответственными за фармакологическую активность являются тритерпеновые гликозиды (сапонины), высокополярные О-гликозиды органических кислот и производные фенилэтанола. Однако, Atragene speciosa Weinm. - вид с азиатским ареалом, природные заросли которого разрежены и занимают небольшие площади. Поэтому, введение Atragene speciosa Weinm. в асептическую культуру in vitro позволяет, во-первых, сохранить и поддерживать данный вид, во-вторых, получать в стабильных условиях культивирования стандартную биомас " "" )Ственном

университете на кафедре физиологии

впервые

получена каллусная культура этого вида in vitro (Карначук P.A. и др., 1997). Но для промышленного использования имеет интерес введение княжика сибирского в условия стерильной суспензионной культуры, разработка способов ее полдержания и определение условий получения продуктивной биомассы клеток. Кроме того, особое внимание должно быть уделено продуктам вторичного метаболизма, в качестве источников физиологически активных веществ, а также способов регулирования их синтеза в суспензии.

Цель и задачи исследования Целью нашей работы было получение суспензионной культуры клеток княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.), оптимизация режимов культивирования каллусной и суспензионной культур, и исследование влияния условий выращивания на накопление биологически активных веществ.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1) получить суспензионную культуру клеток княжика сибирского (.Atragene speciosa Weinm.) и подобрать оптимальный состав питательной среды и режим культивирования;

2) изучить динамику роста клеточных (каллусной и суспензионной) культур Atragene speciosa Weinm на модифицированных нами питательных средах в темноте и на свету;

3) исследовать влияние экзогенных гормонов и ростстимулирующих веществ (жасмоновая кислота, 24-эпибрассинолид, гуминовые кислоты и препарат «Силк») на ростовую активность клеточных культур (каллусной и суспензионной) Atragene speciosa Weinm.;

4) изучить динамику накопления физиологически активных веществ (гритерпеновые гликозиды, флавоноиды) в клеточных культурах Atragene speciosa Weinm.

5) исследовать влияние экзогенных гормонов и ростстимулирующих веществ (жасмоновая кислота, 24-эпибрассинолид, гуминовые кислоты и препарат «Силк») на накопление физиологически активных веществ (тритерпеновые гликозиды, флавоноиды) в клеточных культурах Atragene speciosa Weinm.

Научная новизна Впервые нами получена суспензионная культура клеток княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) и оптимизированы условия ее культивирования. Показана способность клеточной культуры к активному росту, высокой продуктивности и возможности синтеза тритерпеновых гликозидов (сапонинов), состав которых соответствует таковому в интактном растении. Получен новый штамм каллусной культуры, у которого изучены продукционная способность и динамика накопления сапонинов и флавоноидов

Впервые исследовано влияние ряда физиологически активных веществ: жасмоновой кислоты. 24-эпибрассинолида, гуминовых кислот и препарата «Силк» на рост и накопление тритерпеновых гликозидов и флавоноидов клеточными культурами (каллусной и суспензионной) княжика сибирского.

Изучены динамика роста и морфометрические характеристики клеточных культур (каллусной и суспензионной) княжика сибирского при культивировании иа модифицированных нами питательных средах Проведена

оценка содержания фотосинтетических пигментов каллусной культуры княжика сибирского при выращивании на свету и в темноте.

Практическая значимость. Полученная нами суспензионная культура княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) может служить основой для коммерческого производства физиологически активных веществ и создания на их основе препарата ноотропного действия.

Результаты исследований используются при чтении курсов «Биотехнология», «Клеточная культура растительных тканей» для студентов -биологов Томского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые получена суспензионная культура княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) путем введения каллусных клеток на модифицированную питательную среду.

2. Показано, что клеточная культура княжика сибирского является продуцентом тритерпеновых сапонинов и флавоноидов.

3. Физиологически активные соединения (жасмоновая кислота, 24-эпибрассинолид, гуминовые кислоты и препарат «Силк») и свет (белый и красный) активно влияют на рост каллусной и суспензионной культур Atragene speciosa Weinm. и накопление высокополярных тритерпеновых гликозидов, суммы флавоноидов in vitro, ассортимент которых увеличивается при длительности культивирования. Обнаруженные соединения соответствуют таковым интактного растения.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском совещании «Физиология и биотехнология растений», посвященном 120-летию Томского государственного университета (Томск, 1998); IV съезде Общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва, 1999); Городской конференции молодых учёных и специалистов «Региональные проблемы экологии и природопользования» (Томск, 1999); Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); IV Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2001); Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001); LX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002); I, II и III Московских Международных Конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005); VI Общероссийской межвузовской конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Наука и образование» (Томск, 2002); VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003); V съезде Общества физиологов растений России и международной конференции «Физиология растений -основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); II Международной научно-

практической конференции «Актуальные проблемы экологии» (Караганда, 2003).

Пубпикации По теме диссертации было опубликовано 19 печатных работ, из них 2 - в реферируемых изданиях.

Объем и структура работы Диссертационная работа изложена на 142 страницах, содержит 34 рисунка и 35 таблиц Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка используемой литературы, включающего 166 источников, из них 131 отечественных и 35 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования Княжик сибирский - Atragene speciosa Weinm. (семейство Лютиковые - Ranunculaceae) - лекарственное растение лесной зоны и горнолесного пояса Западной, Средней и Восточной Сибири. Материалом для исследования являлась культура клеток княжика сибирского, полученная на кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета при использовании в качестве экспланта сегментов черешков молодых листьев интактных растений А speciosa Weinm. из республики Хакасия (Ширинский район) в 1996 году Е.А. Пироговой и Т.В. Клепиковой (штамм 1ПК) и в 2003 году - В Ю. Дорофеевым (штамм 2Д).

Культивирование клеточных культур княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm) Культивирование каллусной культуры княжика сибирского проводили на модифицированных нами средах но прописи Мурасиге - Скуга, Шенка - Хильдебрандта в условиях белого и красного света (интенсивность 1500 лк, фотопериод 12 ч) и в темноте. Культивирование на свету проводили на среде с уменьшенным в два (1,5%) и три (1%) раза количеством сахарозы (Карначук P.A. и др., 1999). Концентрацией регуляторов роста (ауксины и цитокинины) варьировали в пределах от 0,6 до 3 мг/л, получив, таким образом, девять вариантов сред. Количество пробирок для одного варианта равно десяти. Суспензионную культуру выращивали на модифицированной среде Мурасиге - Скуга, но без добавления агара. Выращивание проводили в колбах на перемешивающем устройстве при 70-100 об/мин. Использовали конические колбы объёмом 50 мл для индукции суспензии (1-й пассаж), затем колбы Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащие 60 мл среды. Культивирование проводили в темноте при температуре 26°С и влажности 67-70%. Для получения 100 мл клеточной суспензии брали 2-3 г каллусных клеток. В экспериментах использовали не менее 10 сосудов для каждого варианта. Субкультивирование проводили через 20-30 дней, в зависимости от скорости роста биомассы. При пересадках вели поддерживающий отбор по признаку «темп роста», визуально отбирая для дальнейшего культивирования колбы с лучшим ростом. Исключение из питательной среды ионов кальция (СаС12) облегчало суспендирование Жизнеспособность культуры определяли по стандартной методике, путём окрашивания клеток метилеиовым синим (Паушева З.П., 1988; Мигранова И Г. и др., 2000). Ростовые характеристики

суспензии определяли, измеряя сухую и сырую биомассу, подсчитывая количество клеток в камере Горяева (Головацкая И.Ф., Карначук P.A., 1999; Папамарчук И. А., Веселова Т.Д., 1969).

Сухую массу определяли, высушивая клетки при температуре 50 - 55°С до воздушно-сухого состояния. Микроскопический анализ крупноагрегированной суспензии проводили после мацерации в смеси 0,2% целлюлазина и 0,2% пектиназы (1:1) в течение 1 часа при 26°С. Для получения изотонического раствора добавляли маннит (90 г/л) и СаС12 (1,480 г/л).

Прирост сырой биомассы оценивали по общепринятому показателю -ростовой индекс в %. Определяли средний конечный и средний начальный вес клеток культуры.

Исследования вторичных метаболитов Atragene speciosa Weinm.

Сапонины. Для обнаружения тритерпеновых гликозидов (сапонинов) была использована каллусная и суспензионная культуры княжика сибирского разного возраста и условий выращивания. Навеску сырья (1,0 г) экстрагировали метанолом при температуре 60 - 65°С на водяной бане с обратным холодильником в течение часа. Затем отгоняли растворитель под вакуумом при температуре 40 - 60°С. Обнаружение сапонинов осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol UV - 254», используя в качестве подвижной фазы системы растворителей: н-бутанол - этанол - вода (7:2:5, 10:2:5). В качестве детектора использовали 25%-ный спиртовый раствор фосфорно- вольфрамовой кислоты. Хроматограммы проявляли при нагревании в течение 5-10 минут при температуре 100 105°С.

Флавоноиды Количественное определение суммы флавоноидов в экстракте из клеток культуры (извлечении 70% спиртом) производили спектрофотометрически в присутствии комплсксообразователя А1С13 в виде 2% спиртового раствора при длине волны 415 нм с использованием в качестве стандарта рутина (Минаева В.Г., 1991).

Фотосинтетические пигменты каллусной культуры Atragene speciosa Weinm Исследовали влияние света на накопление фотосинтетических пигментов, которые определяли количественно спектрофотометрически в навеске свежей клеточной массы 30-50 мг (Шлык A.A., 1971).

Морфометрические исследования клеточных культур Atragene speciosa Weinm Для определения размеров клеток каллуса использовали световую микроскопию, предварительно прибегая к условиям мацерации (Фурет Г.Г., 1979). Для достижения точности измеряли с помощью окуляр-микрометра. Объём клеток вычисляли по формуле Ю.А. Цельникер и А.Т. Мокроносова с учётом К = L / D, где L - длина клетки, D - ширина клетки (Мокроносов А.Т. и др., 1978). Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась на персональном компьютере, с помощью электронных таблиц Excel. В таблицах и на рисунках приведены данные в виде средних арифметических с доверительными интервалами.

РОСТОВАЯ АКТИВНОСТЬ КАЛЛУСНОЙ И СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУР А ТЯЛОЕЫЕ БР ЕС ¡ОБА WEINM

После анализа роста были отобраны компоненты питательной среды Мурасиге - Скуга, которые оказывали наиболее эффективное действие на пролиферацию клеток каллуса княжика сибирского: мезоинозит - 100 мг/л; 2,4— дихлорфеноксиуксусная кислота - 0,5 мг/л; 6-бензиламинопурин - 0,3 мг/л; сахароза - 30 г/л; агар - 9 г/л. Наши наблюдения показали, что наибольший прирост сырой биомассы каллуса (100%) наблюдался в темноте при культивировании на средах Мурасиге - Скуга, Шенка - Хильдебрандта (рис. 1).

500

15 20 25 30 35 40 Возраст культуры, сутки

- Мурасиге - Скуга

- Шенка -Хильдебрандта

Рисунок 1. Динамика роста каллусной культуры А зресюш У/етт. (штамм 1ПК) 10-15-го субкультивирований на питательных средах Мурасиге - Скуга и

Шенка - Хильдебрандга

Примечание: * - различия достоверны при р<0,05

Замечено, что культивирование на среде Гамборга (В5) вело к некрозу ткани уже на 6 - 7 сутки после пересадки культуры. Максимальный прирост биомассы каллуса получен на среде, содержащей 3 % сахарозы.

Белый свет вызывал активное зеленение культуры княжика сибирского. В клетках каллуса княжика сибирского 18 - 19-го субкультивирований (штамм 1ПК) в темноте, обнаружены следовые количества карошноидов. Белый и красный свет вызывали синтез хлорофиллов а и Ь. При этом происходило увеличение содержания пигментов по сравнению с предыдущим пассажем.

На 10, 20 и 30 сутки 13-го субкультивирования наблюдались достоверные различия в средних объемах мелких клеток на среде Мурасиге - Скуга с 2,4--дихлорфеноксиуксусной кислотой и 6-бензиламинопурином. К концу субкультивирования на среде Мурасиге - Скуга с а-нафтилуксусной кислотой и 6-бензиламинопурином объем мелких клеток уменьшался, а на среде с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и 6-бензиламинопурином - увеличивался (рис. 2).

□ НУК, БА П И2,4-Д,БАП

Дата измерения

Рисунок 2. Объем мелких клеток каллусной культуры А эрвсШа ЧУетт 13-го субкультивирования на питательной среде Мурасиге - Скуга

Примечания: здесь и в табл. 1 НУК - а-нафгилуксусная кислота; БАП - 6-бензиламинопурин; * - различия достоверны с «16.10.03» при р<0,05

Переход к периодическому культивированию (суспензионным культурам) в первую очередь был вызван тем, что при таком режиме культивирования, как правило, происходит интенсификация ростовых процессов, а в ряде случаев увеличивается биосинтетический потенциал культур. Суспензионные культуры сохраняют ряд свойств, характерных для исходного организма. И одним из таких свойств является способность к синтезу вторичных метаболитов (Бттопск И. й а!., 1983; Бео \У.Т. е1 а1., 1993). Быстрое получение биомассы растительных клеток суспензионных культур позволяет использовать для культивирования крупномасштабное промышленное оборудование (ферментеры) ^уаюэ А., Масек Т., 1994). Поскольку суспензионная культура клеток этого вида получена впервые, начальным этапом работы было оптимизация условий выращивания, изучение её цитологических и

физиологических характеристик, в частности, размера клеток, агрегированности, скорости роста суспензии, оптимального времени субкультивирования.

Время, необходимое для роста клеточной суспензии после 5-го субкультивирования, составило 20 суток. При отборе быстрорастущей фракции это время может быть сокращено до 16 суток (табл. 1).

Таблица 1

Основные ростовые характеристики суспензионной культуры Atragene яресю5а

\Уе1пт. (X ± т)

Характеристики Среда с 2,4-Д и БАП Среда с НУ К и БАИ

3-й пассаж 5-й пассаж 3-й пассаж 5-й пассаж

1) Жизнеспособность клеток, % 63+3 76+2* 58+2 61+4*

2) Плотность клеток, кл./мл 3,5-104 4,8-106* 2,3 104 2,7-105*

3) Содержание сухой массы в клетках, % 4,5+0,3 5,2+0,2* 3,8+0,2 4,5+0,2

4) Время максимального накопления массы, сутки 20+3 16±3* 30+2 27+3*

Примечание: * - различия достоверны с «3-ий пассаж» при р<0,05

ВЛИЯНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РОСТ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР А ТЯЛСЕШ БРЕСЮБА \VEINM.

Основным недостатком биотехнологических методов синтеза фитопродуктов является низкая продуктивность культур клеток-продуцентов. В последнее время в некоторых работах показана возможность существенного увеличения выхода производных шиконина и алканнина в культурах клеток растений сем. Boraginaceae с помощью жасмоновой кислоты. Эффект жасмонатов проявляется специфически в каждой конкретной культуре клеток в зависимости от вида растения, линии или штамма клеток, питательной среды и других условий культивирования (РапЫег В., 1991).

Анализировали данные 2, 6, В, 12-го субкультивирований (шгамм 2 Д) и 70, 73-го субкультивирований (штамм 1 ПК) культуры А хреаоха \Veinm. Показан эффект стимуляции роста каллуса (штамм 2Д) с жасмоновой кислотой в низкой концентрации (10* - 10*8 М). Начиная с 14-17 суток 70 и 73-го субкультивирования, происходила активация роста штамма ШК, но уже к концу субкультивирования (30 сутки) наблюдалось ингибирование роста клеточной культуры (рис. 3).

и

возраст культуры, сутки

Рисунок 3. Динамика роста клеточной культуры А1^епе хресюха Weinm. (штамм 1ПК) 70-го субкультивирования с жасмоновой кислотой Примечания: ЖК - жасмоновая кислота; * - различия достоверны с контролем при р<0,05

Жасмоновая кислота влияла на прирост биомассы суспензионной культуры 2-го и 6-го субкультивирований спустя 7 суток от начала культивирования (табл. 2).

Таблица 2

Ростовые характеристики суспензионной культуры Atragene нрес'юъа \\'етт. на среде с жасмоновой кислотой (X ± т)

Параметры роста и номер пассажа контроль Концентрация жасмоновой кислоты, М

10" 10'4

Индекс росга 5 1,58±0,07 0,86±0,03* 1,34±0,04*

6 2,04±0,03 0,95±0,07* 1,27±0,07*

Сухая масса, 5 5,22±0,05 1,53±0,12* 2,63±0,13*

мг 6 5,71±0,02 1,58±0,07* 2,74±0,07*

Примечание: * - здесь и в табл. 3, 4 различия достоверны с контролем при р<0,05

Также было исследовано влияние экзогенного 24-эпибрассинолида в концентрациях на рост клеток княжика сибирского Стимуляция

роста происходила при добавлении в среду 24-эпибрассинолида в низких концентрациях

(10'9 - Ю-12 М). На 25-30 сутки 8-го субкультивирования каллусной культуры (штамм 2Д) прирост биомассы достигал 130% (табл 3).

Таблица 3

Индекс роста каллусной культуры Аь-а^ет хресюха Weiшn. (штамм 2Д) 8-го субкультивирования (X ± ш)

Концентрации ЭБ, М Сутки, индекс роста, %

5 10 15 20 25 30

Когароль 54,3243,27 21,1244,38 122#Ш2£0 150,83422^0 155,55*47,58 526,48±86,76

ю-7 34,31+4,96* — 42,04±12,95* — — —

10"' 24,8844,69* — 23,90*5,18* 41^9±3,71* 26,6944,88* 63,77±21,67*

Ю-9 3,07±1,07* — — 1230*233* — 56,92*5,69*

10 10 41,3042,28* 7,03±1,01* 87,17±5^4* 114,8247,10* 163,13124,67 79437425,14*

10-" 24,85+30,56* 49,8045,19* 166,66±Л2£7* 212,88410,02* 350,44±6,69* 1016£3±7735*

ю-12 61^2±438 16,40£0,03* 216,00±81,72* 228,73x14,44* 358,05±23,76* 1131,00483,27*

Примечания: ЭБ - 24-эпибрассинолид; * - различия достоверны с контролем при р<0,05

Более высокие концентрации 24-эпибрассинолида (107 - 10~8 М) ингибировали рост культуры 6-го субкультивирования.

В практике растениеводства сравнительно недавно начали использовать гуминовые кислоты и препарат «Силк». Исследовали динамику роста и морфометрические характеристики клеток каллусной культуры Atragene зрес'юйа У/етт. (штамм 2Д), культивируемой на модифицированных питательных средах Мурасиге - Скуга с добавлением гуминовых кислот и препарата «Силк». Наши наблюдения показали, что наибольший прирост сырой биомассы каллуса был на среде с добавкой гуминовых кислот в концентрациях Ю""1 и 10"4 % (табл. 4).

Таблица 4

Ростовой индекс Atragene ¡реаояа У/ешт. (штамм 2Д) 15-го субкультивирования на среде с гуминовыми кислотами и препаратом «Силк»

(Х±ш)

Вариант выращивания' Компонент питательной среды, ростовой индекс, %

контроль ПС (1а3%) ПС (1(г% ПС (1(Г5%) "Силк" (0,04 мл/л) "Силк" (0,08 мл/л)

в пробирках 14510,4 ЗЗЙД2* 332Ш,5* 16ШЗ* 278±0,4* 247±0Д*

в чашках Пегри 23*0,1 3*0,1* 35±0,1* 2(Ш),1* 2±Д2* 31±0,1*

в пробирках на среде без БАП 251±0,5 63±03* 15&Ш* — — —

Примечания: ГК - гуминовые кислоты; БАП - 6-бензиламинопурин; * - различия достоверны с контролем при р<0,05

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА КАЛЛУСНОЙ И СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУР А ТКЛСЕМЕ ЯРЕСЮХА WEINM.

Для обнаружения тритерпеновых гликозидов (сапонинов) были использованы каллусная и суспензионная культуры княжика сибирского разного возраста и условий выращивания. В клетках 32-го субкультивирования, выращенных на белом свету обнаружено десять фракций высокополярных тритерпеновых гликозидов с тГ 0,02; 0,04; 0,07; 0,09; 0,11; 0,14; 0,16; 0,18; 0,22; 0,24, а в темноте - восемь тритерпеновых гликозидов. Выход из 1 г сухого сырья 25-26-го (белый свет), 32-го (темнота и белый свет) субкультивирований при экстрагировании 10 мл метанола составил 10, 25 и 15%, соответственно. Во всех вариантах культивирования каллусной, суспензионной культур преобладает накопление высоко полярных тритерпеновых гликозидов, состав которых соответствует таковому интактного растения.

В каллусных клетках 2-го и 6-го субкультивирований, выращенных на питательной среде без добавления гормонов и с добавкой жасмоновой кислоты 10"8 М, обнаружено девять фракций тритерпеновых гликозидов. В каллусе, выращенном на среде с добавлением жасмоновой кислоты 10'7 М обнаружено шесть тритерпеновых гликозидов, а с добавкой жасмоновой кислоты в концентрации 10"9М - пять фракций тритерпеновых гликозидов с гГ 0,03; 0,08; 0,19; 0,58; 0,91.

В каллусе 2-го и 6-го субкультивирований, выращенном с добавлением 24-эпибрассинолида в концентрациях 10"8 и 10"9 М обнаружено восемь фракций тритерпеновых гликозидов с гГ 0,06; 0,16; 0,27; 0,35; 0,52; 0,88, а с добавкой 24-эгшбрассинолида в концентрации 101М - одна фракция тритерпеновых гликозидов с гГ0,95.

Выход из 1 г сухой культуры клеток 2-го и 6-го субкультивирований составил 14%, а с добавлением жасмоновой кислоты в концентрации 10"9М - 24%.

В каллусе 15-го субкультивирования на среде с добавлением гуминовых кислот 10"3%, выявлено одиннадцать тритерпеновых гликозидов, а в клетках, на среде с добавлением гуминовых кислот 10"*%, обнаружили двенадцать тритерпеновых гликозидов.

Следует отметить, что добавление в среду жасмоновой кислоты и 24-эпибрассинолида в концентрации 10"* M стимулирует образование высокополярных тритерпеновых гликозидов, а препарата «Силк» - накопление малополярных сапонинов.

В результате исследования было показано, что в стимуляции биосинтеза флавоноидов (5,15%) в каллусной культуре 2 - 6-го субкультивирований наиболее эффективен 24-эпибрассинолид в концентрации 10"6 М. Известно, что в листьях княжика сибирского содержание флавоноидов составляет около 6%, в стеблях - около 1,5% и в корнях - около 1%.

Полученные нами данные показьюают, что синтез тритерпеновых гликозидов и флавоноидов в каллусной и суспензионной культурах клеток на единицу сухой массы сопоставим с содержанием этих веществ в интактном растении.

Таким образом, интерес к введению княжика сибирского в асептическую культуру in vitro вызван возможностью получения физиологически активных веществ (тритерпеновых гликозидов (сапонинов), феноло-спиртов и их гликозидов, О-гликозидов органических кислот, флавоноидов, кумаринов, аминокислот) для создания ноотропного и адаптогенного фитопрепарага.

Впервые нами получена суспензионная культура, обладающая высокой и стабильной скоростью роста, для которой была подобрана среда и оптимизирован режим культивирования. Время максимального накопления биомассы суспензионной культуры составляло 16-20 суток, а плотность суспензии - 4,8'106 клеток/мл.

Нами также получен новый штамм (2Д) каллусной культуры княжика сибирского in vitro, для активного роста которой подобран и оптимизирован состав питательной среды. Динамика роста этого штамма была оптимальной при добавлении гормонов 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (0,5 мг/л), а-нафтилуксусной кислоты (0,6 мг/л) и 6-бензиламинопурина (0,3 мг/л). Продолжительность одного субкультивирования для каллусной культуры составляла 30-35 суток.

Максимальный прирост биомассы наблюдался при выращивании клеточной культуры в темноте. При культивировании на свету было показано, что белая часть спекгра снижала ростовую активность, а красная - вызывала полное ингибирование роста каллуса. Подобная тенденция наблюдалась другими авторами в работе с культурами Ficus elastica и Scozonera sp. (Гусев M.B. и др., 1992).

Показана способность клеточной культуры княжика сибирского как в каллусе, так и суспензии, синтезировать тритерпеновые гликозиды и флавоноиды в условиях m vitro.

Важным моментом при культивировании клеточных культур является оптимизация продукционного процесса добавлением физиологически активных соединений, в том числе, гормонов. Так, прирост биомассы каллусной (штамм 2Д) и суспензионной культур второго и шестого субкультивирований под действием жасмоновой кислоты замечен только на 7 сутки субкультивирования, при этом обнаружено не менее девяти фракций тритерпеновых гликозидов.

Стимуляция роста происходила при добавлении 24-эпибрассинолида в концентрациях 10"9 - 10"12 М. При этом прирост биомассы каллусной культуры через 25 суток составил 130%. Для суспензионной культуры пятого и шестого субкультивирований стимулирующий эффект наблюдался при добавлении 24-эпибрассинолида в концентрации 10~9 М. При этом изменялась динамика накопления тритерпеновых гликозидов и суммы флавоноидов Выявлено восемь высокополярных сапонинов в культуре княжика сибирского десятого субкультивирования.

Таким образом, нами получены суспензионная и каллусная (штамм 2Д) клеточные культуры княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) in vitro. Оптимизированы параметры их выращивания, изучены ростовые характеристики и накопление вторичных веществ. Полученные результаты позволяют говорить о получении перспективного продуцента физиологически активных веществ для создания фитопрепарата ноотропного действия.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизированы условия получения и выращивания суспензионной культуры княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) Получен новый штамм (2Д) каллусной культуры княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) в качестве экспланта для суспензионной культуры. Оптимизированы условия индукции каллусогенеза этого штамма.

2. Исследована динамика роста суспензионной культуры княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.). Свет (красный и белый) ингибировал рост каллусной культуры княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.).

3. Стимуляция роста каллусной и суспензионной культур княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) происходила при добавлении 24-эпибрассинолида в низких концентрациях 10~9 - 10"12 М. Жасмоновая кислота в концентрациях 10"7 - 10~8 М ингибировапа рост клеточных культур княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.).

4. Суспензионная и каллусная культуры княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) in vitro синтезируют высокополярные тритерпеновые гликозиды, ассортимент которых увеличивается при дальнейшем культивировании. Соединения соответствуют интактному растению.

5. Показано стимулирующее влияние экзогенных физиологически активных жасмоновой кислоты и 24-эпибрассинолида в концентрации 10~8 М на накопление тритерпеновых гликозидов (сапонинов) клеточных культур княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.). Биосинтез флавоноидов

суспензионной и каллусной культурами княжика сибирского {Atragene speciosa Weinm.) стимулировал 24-эпибрассинолид в высокой концентрации 10"6 М.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оптимизация среды и режима культивирования для каллусной культуры Atragene sibirica L. Материалы Всеросс. совещ., посвящ. 120-летию ТРУ «Физиология и биотехнология растений». - Томск: Изд-во ТГУ. - 1998. -С. 72-74 / Соавт.: Ю.В. Медведева.

2. Синтез сапонинов в культуре ткани Atragene sibirica L. Тезисы докладов IV съезда Общества физиологов растений России. Международная конференция «Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва, 4-9 октября 1999 г.). - М. - 1999. - Т. И. - С. 593 / Соавт.: P.A. Карначук, И.В. Шилова, Е.А. Краснов.

3. Роль света в образовании сапонинов клеточной культурой ткани княжика сибирского. Материалы городской конференции молодых учёных и специалистов «Региональные проблемы экологии и природопользования» (Томск, 25-26 ноября, 1999 г.). - Томск: Изд-во Томского государственного университета систем управления и радиовещания. - 2000. - С. 72-73.

4. Вторичные метаболиты культуры ткани княжика сибирского (Atragene sibirica L.). Материалы Мсждунар. научн. конф. «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 27-29 июня 2000 г.). - Томск: СГМУ. - 2000. - С. 33-34 / Соавт.: P.A. Карначук, И.В. Шилова, Е.А. Краснов.

5. Физиологически активные вещества каллусной культуры княжика сибирского. Труды IV Междунар. симпоз. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». - М.: Изд-во РУДН. - 2001. - С.117-119 / Соавт.: P.A. Карначук, И.В. Шилова, Е.А. Краснов.

6. Клеточная культура княжика сибирского - перспекгивный источник лекарственных средств. Материалы Междунар. научн. конф. «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 12-15 сентября 2001 г.). - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. - 2001. - С.182-183 / Соавт.: P.A. Карначук, Е.А. Краснов, И.В. Шилова.

7. Княжик сибирский {Atragene speciosa Weinm.) - клеточная культура in vitro как источник биологически активных веществ. Материалы LX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология. - Новосибирск: Изд-во Новосибирского государственного университета. - 2002. - С. 75-76.

8. Клеточная культура почечного чая (Orhtosiphon stamineus Benth.) -источник биологически активных веществ. Материалы LX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология. - Новосибирск: Изд-во Новосибирского государственного университета. - 2002. - С. 104 / Соавт.: Д.М. Старцева.

9. Atragene speciosa Weinm.: культура in vitro как источник тритерпеновых гликозидов Материалы I Междунар. конгресса «Биотехнология

- состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 октября 2002 г.). - М.: ЗАО «ПИК Максима», РХТУ им. Менделеева. - 2002. - С. 90 / Соавт.: P.A. Карначук.

10. Влияние условий выращивания на гормональный статус и урожайность высокорослой и карликовой линий пшеницы. Физиология растений. - 2003. - Т. 50. - № 2. - С. 1-6 / Соавт • P.A. Карначук, О.Б. Вайшля С.А. Ушакова, А.А.Тихомиров, X. JIaccep, Дж.-Б. Гро.

П. Княжик сибирский (Aíragene speciosa Weinm.) in vitro - источник физиологически активных веществ. Материалы VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 913 сентября 2003 г.). - Саратов. - 2003. - С. 134-135 / Соавт.: P.A. Карначук.

12. Введение в клеточную культуру Saussurea frolovii Ledeb. в качестве источника лекарственных веществ. Материалы II Московского международного Конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 10-14 ноября 2003 г.). - M : Изд-во ЗАО «ПИК Максима», РХТУ им. Менделеева. - 2003. - Ч. 1. - С. 280 / Соавт.: P.A. Карначук, Д.В. Анциферов, Р.И. Лещук.

13. Культура клеток княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) in vitro как источник биологически активных сапонинов. Материалы VI Общероссийской межвузовской конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Наука и образование» (Томск, 15-20 апреля 2002 г.). - Томск: Изд-во Томского государственного педагогического университета. - 2003. - С. 44-45 / И.В. Шилова.

14. Почечный чай (Orthosiphon stamineus Benth.) - источник лекарственных средств Материалы VI Общероссийской межвузовской конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Наука и образование» (Томск, 15-20 апреля 2002 г.). - Томск: Изд-во Томского государственного педагогического университета. - 2003. - С. 75-76 / Соавт.: Д.М. Старцева.

15. Влияние жасмоновой кислоты на рост миниклубней оздоровленного in vitro картофеля в условиях гидропоники. Тезисы докладов. V съезд общества физиологов растений России и Международной конф. «Физиология растений -основа фитобиотехнологии» (Пенза, 15-21 сентября 2003 г.). - Пенза. - 2003. -С. 397-398 / P.A. Карначук, ЮЕ. Якимов, М.В. Ефимова, В Имснов, И. Махачкова.

16. Клеточная культура княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) в контролируемых условиях in vitro. Материалы II Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии» (Караганда, 4-5 декабря 2003 г.) - Караганда: Изд-во Карагандинского государственного университета.-2003,-Ч. 1. - С. 261-263 / Соавт.: P.A. Карначук.

17. Регуляция роста клеточной культуры княжика сибирскою (Atragene speciosa Weinm.) in vitro. Вестник Томского государственного университета. Серия «Биологические науки» (биология, почвоведение, лесоведение) Приложение, (ноябрь 2003 г.). - Томск: Изд-во Томского государственного университета -2003. - № 8. - С. 68-70 / Соавт.: Р.А Карначук

18. Клеточная культура княжика сибирского (Atragene speaosa Weinm.) in vitro - продуцент сапонинов. Сборник статей «Ноосферные знания и технологии». - Томск: йзд-во Том. Ун-та. - 2004. - Вып. 1. - С. 71-76.

19. Суспензионная культура Atragene speciosa Weinm. как источник физиологически активных веществ. Материалы III Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта 2005). - М.: Изд-во ЗАО «ПИК Максима», РХТУ им. Менделеева. - 2005. - Ч. 1. - С. 73-74 / Соавт.: P.A. Карначук, О.В. Стронин, Е.А. Краснов, И.В. Шилова.

Автор выражает глубокую признательность заведующему кафедрой фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета, доктору фармацевтических наук, профессору Е.А. Краснову, старшему преподавателю кафедры фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета, кандидату фармацевтических наук И.В. Шиловой, начальнику отделения медикобиологических проблем Филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Томске «НПО Вирион», кандидату медицинских наук О.В. Стронину, заведующему кафедрой физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета, докгору биологических наук, профессору P.A. Карначук.

Тираж 100. Заказ 523. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

í- 9 5 9 5

РНБ Русский фонд

2006-4 6680

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дорофеев, Вячеслав Юрьевич

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточная культура княжика сибирского (Atragene speciosa weinm.) in vitro"

Цель и задачи исследования.6

Научная новизна.7

Практическая значимость работы.8

Положения, выносимые на защиту.8

Апробация работы.8

Публикации по теме диссертации.9

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Дорофеев, Вячеслав Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Оптимизированы условия получения и выращивания суспензионной культуры княжика сибирского (.Atragene speciosa Weinm.). Получен новый штамм (2Д) каллусной культуры княжика сибирского (.Atragene speciosa Weinm.) в качестве экспланта для суспензионной культуры. Оптимизированы условия индукции каллусогенеза этого штамма.

2. Исследована динамика роста суспензионной культуры княжика сибирского (.Atragene speciosa Weinm.). Свет (красный и белый) ингибировал рост каллусной культуры княжика сибирского (.Atragene speciosa Weinm.).

3. Стимуляция роста каллусной и суспензионной культур княжика сибирского (.Atragene speciosa Weinm.) происходила при добавлении о 1 п

24-эпибрассинолида в низких концентрациях 10 - 10" М. Жасмоновая кислота

7 R в концентрациях 10" - 10" М ингибировала рост клеточных культур княжика сибирского (.Atragene speciosa Weinm.).

4. Суспензионная и каллусная культуры княжика сибирского {Atragene speciosa Weinm.) in vitro синтезируют высокополярные тритерпеновые гликозиды, ассортимент которых увеличивается при дальнейшем культивировании. Соединения соответствуют интактному растению.

5. Показано стимулирующее влияние экзогенных физиологически о активных жасмоновой кислоты и 24-эпибрассинолида в концентрации 10 е М на накопление тритерпеновых гликозидов (сапонинов) клеточных культур княжика сибирского {Atragene speciosa Weinm.). Биосинтез флавоноидов суспензионной и каллусной культурами княжика сибирского {Atragene speciosa Weinm.) стимулировал 24-эпибрассинолид в высокой концентрации 10"6 М.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интерес к введению княжика сибирского в асептическую культуру in vitro вызван возможностью получения физиологически активных веществ (тритерпеновых гликозидов (сапонинов), феноло-спиртов и их гликозидов, О-гликозидов органических кислот, флавоноидов, кумаринов, аминокислот) для создания ноотропного и адаптогенного фитопрепарата.

Впервые нами получена суспензионная культура, обладающая высокой и стабильной скоростью роста, для которой была подобрана среда и оптимизирован режим культивирования. Время максимального накопления биомассы суспензионной культуры составляло 16-20 суток, а плотность суспензии - 4,8- 10б клеток/мл.

Нами также получен новый штамм (2Д) каллусной культуры княжика сибирского in vitro, для активного роста которой подобран и оптимизирован состав питательной среды. Динамика роста этого штамма была оптимальной при добавлении гормонов 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (0,5 мг/л), а-нафтилуксусной кислоты (0,6 мг/л) и 6-бензиламинопурина (0,3 мг/л). Продолжительность одного субкультивирования для каллусной культуры составляла 30-35 суток.

Максимальный прирост биомассы наблюдался при выращивании клеточной культуры в темноте. При культивировании на свету было показано, что белая часть спектра снижала ростовую активность, а красная - вызывала полное ингибирование роста каллуса. Подобная тенденция наблюдалась другими авторами в работе с культурами Ficus elastica и Scozonera sp. (Гусев М.В. и др., 1992).

Показана способность клеточной культуры княжика сибирского как в каллусе, так и суспензии, синтезировать тритерпеновые гликозиды и флавоноиды в условиях in vitro.

Важным моментом при культивировании клеточных культур является оптимизация продукционного процесса добавлением физиологически активных соединений, в том числе, гормонов. Так, прирост биомассы каллусной (штамм 2Д) и суспензионной культур второго и шестого субкультивирований под действием жасмоновой кислоты замечен только на 7 сутки субкультивирования, при этом обнаружено не менее девяти фракций тритерпеновых гликозидов.

Стимуляция роста происходила при добавлении 24-эпибрассинолида в концентрациях 1СГ9- 10"12М. При этом прирост биомассы каллусной культуры через 25 суток составил 130%. Для суспензионной культуры пятого и шестого субкультивирований стимулирующий эффект наблюдался при добавлении 24-эпибрассинолида в концентрации 10~9 М. При этом изменялась динамика накопления тритерпеновых гликозидов и суммы флавоноидов. Выявлено восемь высокополярных сапонинов в культуре княжика сибирского десятого субкультивирования.

Таким образом, нами получены суспензионная и каллусная (штамм 2Д) клеточные культуры княжика сибирского {Atragene speciosa Weinm.) in vitro. Оптимизированы параметры их выращивания, изучены ростовые характеристики и накопление вторичных веществ. Полученные результаты позволяют говорить о получении перспективного продуцента физиологически активных веществ для создания фитопрепарата ноотропного действия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дорофеев, Вячеслав Юрьевич, Томск

1. Ануфриева Э.Н. Ростовые и биосинтетические характеристики культур клеток Serratula coronata и Ajuga reptans продуцентов экдистероидов: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Э.Н. Ануфриева. - М. - 1997. - 26 с.

2. Атанасонов А. А. Биотехнология в растенево детве / А.А. Атанасонов. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН. - 1993. - 240 с.

3. Бокова B.C. Стероидные гликозиды Atragene sibirica L. / B.C. Бокова, Е.А. Краснов, Р.П. Вагнер // Растительные ресурсы. 1982. - Т.18. -Вып.З.-С. 374-377.

4. Болдырева Я.А. Влияние элементов минерального питания на рост каллусной ткани и синтез алкалоидов в культуре ткани катарантуса розового / Я.А. Болдырева, Н.А. Величко // Биотехнология. 2003. - № 1. - С. 53-62.

5. Болдырева Я.А. Повышение биосинтетической способности катарантуса розового (Catharanthus roseus L. Don) в условиях in vitro / Я.А. Болдырева, Н.А. Величко // Биотехнология. 2002. - № 6. - С. 35-40.

6. Болтенков Е.В. Получение и культивирование каллусной ткани Iris setosa Pall. Ex Link. / Е.В. Болтенков, H.B. Лабецкая, Ю.Н. Журавлев //Битехнология. 2000. - № 5.-С. 47-51.

7. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: Уч. Пособие / Р.Г. Бутенко. М.: ФБК - Пресс. -1999.- 160 с.

8. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р.Г. Бутенко.- М.: Наука.- 1964.- 272 с.

9. И. Бутенко Р.Г. Физиология клеточных культур, состояние и перспективы / Р.Г. Бутенко // Физиология растений. 1978. - Т. 25. - Вып. 5. -С. 1009-1024.

10. Бычкова С.В. Влияние условий выращивания каллусных культур Panax ginseng С.А. Meg. на продукцию ими панаксозидов / С.В. Бычкова, Р.Г. Бутенко // Физиология растений. 1974. - Т. 21. - Вып. 4. - С. 743-750.

11. Вардапетян P.P. Кинетические закономерности роста глобулярных структур в клеточных культурах зверобоя продырявленного Hypericum perforatum L. / P.P. Вардапетян, А.Б. Киракосян, А.Г. Чарчоглян // Биотехнология. 2000. - № 4. - С. 53-58.

12. Варлаков М.Н. Atragene sibirica L. (предварительное сообщение; из Сибирского филиала НИХФК) / М.Н. Варлаков // Хим-фарм. промышленность. № 6. - 1933. - С. 1-3.

13. Гамбург К.З. Ауксины в культурах клеток и тканей растений / К.З. Гамбург, Н.И. Рекославская, С.Г. Шевцов. М.: Наука. - 1990. - 243 с.

14. Гринкевич Н.И. Химический анализ лекарственных растений / Н.И. Гринкевич. Москва. - 1983. - С. 82-85.

15. Гюнтер Е.А. Получение каллусных культур Silene vulgaris (М.) G. / Е.А. Гюнтер // Биотехнология. 2002. - № 6. - С. 41-45.

16. Дасон Р. Справочник биохимика / Р. Дасон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. М.: Мир. - 1991. - С.200-209.

17. Дорофеев В.Ю. Клеточная культура княжика сибирского {Atragene speciosa Weinm.) in vitro продуцент сапонинов / В.Ю. Дорофеев // Ноосферные знания и технологии: Сборник статей. - Томск: Изд-во Том. унта. - 2004. - Вып. 1. - С. 71 -76.

18. Дорофеев В.Ю. Княжик сибирский {Atragene speciosa Weinm.) -клеточная культура in vitro как источник биологически активных веществ

19. В.Ю. Дорофеев // Материалы LX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология. Новосибирск: Изд-во Новосибирского государственного университета. 2002. -С. 75-76.

20. Максима», РХТУ им. Менделеева. 2002. - С. 90.

21. Евстигнеев В.Б. Методы исследования фотохимических реакций фотосинтеза in vitro и in vivo / В.Б. Евстигнеев. Пущино. - 1975. - С.34-56.

22. Еникеев А.Г. Сохранение культуры ткани козельца при низкой положительной температуре: эффект сахарозы / А.Г. Еникеев, К.З. Гамбург, JI.B. Гаманец и др. // Биотехнология. 2001. - № 6. - С. 25-30.

23. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм в культурах клеток и тканей растений: Культура клеток растений / М.Н. Запрометов. М.: Наука. -1981. - С. 37-51.

24. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях / М.Н. Запрометов. М.: Наука. - 1993. -272 с.

25. Иванова А.Б. Рострегулирующая способность жасмоноидов в каллусной культуре сои (Glycin max) / А.Б. Иванова, А.Ю. Ярин, JI.JL Анцыгина, А.Н. Гречкин // Вестник Башкирского университета. 2001.- № 2 (II).- С. 70-72.

26. Ишмуратова М.М. Влияние экстрактов родиолы розовой на развитие эксплантов родиолы розовой и иремельской в условиях in vitro / М.М. Ишмуратова // Биотехнология. 2002. - № 6. - С. 52-56.

27. Калашникова Е.А. Морфо-физиологические особенностипробирочных растений, каллусной ткани и суспензионной культуры картофеля, обусловленные действием экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani / Е.А. Калашникова // Биотехнология. 2003. - № 3. - С. 36-41.

28. Калашникова Е.А. Получение растений-регенерантов после клеточной селекции моркови на устойчивость к патогенному грибу Alternaria radicina М., Dr. Et Е. / Е.А. Калашникова // Биотехнология. 2003. - № 2. - С. 65-68.

29. Каллак Х.И. О морфологической и цитологической разнокачественности гороха / Х.И. Каллак, Л.Я. Ярвекюльч // Цитология и генетика. 1971. - Т.5. - № 3. - С.241-249.

30. Каранова Л.С. Индивидуальный мутагенез в культуре самотических клеток Diescorea deltoidea Wall.: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Л.С. Каранова. М. - 1977.

31. Карначук Р.А. Влияние условий выращивания на гормональный статус и урожайность высокорослой и карликовой линий пшеницы / Р.А. Карначук, О.Б. Вайшля, В.Ю. Дорофеев и др. // Физиология растений. -М-2003.-Т. 50-№2.-С. 1-6.

32. Кахнович JI.B. Фотосинтетический аппарат и световой режим / Л.В. Кахнович.- Минск.- 1980. С. 45-50

33. Китлаев Г.Б. Стимуляция слабым электрическим током регенерации растений в культуре тканей кукурузы / Г.Б. Китлаев, С. Диас, Т.Ю. Вера-Рамос и др. // Биотехнология. 2003. - № 5. - С. 58-63.

34. Клюшин А.Г. Изучение роста суспензионной культуры клеток Polyscias filicifolia Bailey в биореакторах / А.Г. Клюшин, А.В. Орешников, Н.Д. Черняк, A.M. Носов // Биотехнология. 2000. - № 3. - С. 67-72.

35. Козакова Н.Ф. Содержание биологически активных веществ в княжике сибирском. В кн.: Генетика, селекция, семеноводство и интродукция лесных пород. (Сб. науч. тр. ЦНИИЛГиС) / Н.Ф. Козакова, В.Б. Боева, Г.П. Колотилина и др. Воронеж.- 1978.- С. 106-108.

36. Козыренко М.М. Генетическая изменчивость каллусных линий женьшеня Panax ginseng / М.М. Козыренко, Е.В. Артюкова, Л.С. Лауве // Биотехнология. 2001. - № 1. - С. 19-26.

37. Комисарова И.Д. Применение гуминового препарата «Росток» / И.Д. Комисарова, И.В. Грехова // Материалы конференции «Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений» (12- 15 марта 2003 г.). 2003. - С. 131-135.

38. Косиченко Н.Е. Анатомическое строение стеблей Atragene sibirica L. и содержание в них алкалоидов и сердечных гликозидов / Н.Е. Косиченко, Н.Ф. Козакова // Растительные ресурсы. 1980. - Т. 16. - Вып.4.- С. 572-578.

39. Краснов Е.А. Алкалоиды Atragene sibirica / Е.А. Краснов,

40. B.C. Бокова// Химия природных соединений. 1981.

41. Крылов Г.В. Травы жизни и их искатели / Г.В. Крылов.- Томск. -1992.-С. 152-153.

42. Крылов Н.Ф. Экологические особенности и продуктивность княжика сибирского в Южном Алтае / Н.Ф. Крылов Новосибирск: Наука. -1974.- Вып.1.- №5. - С. 12-16.

43. Кузовкина И.Н. Культивирование генетически трансформированных корней: возможности, перспективы использования физиологии растений / И.Н. Кузовкина // Физиология растений. 1992. - Т. 39.- № 6.- С. 1208-1214.

44. Кузьмина Н.А. Влияние состава питательной среды на хромосомные числа твёрдой пшеницы (Triticum durum Desf.) in vitro / Н.А. Кузьмина, B.B. Внукова // Естественные науки и экология.- Омск: Ом ГПУ.- 1997.- Вып.2.- С. 28-31.

45. Кунах В.А. Особенности получения и продуктивность суспензионных культур и клеточных клонов раувольфии змениной Rauwolfia serpentina Benth. in vitro / В.А. Кунах, Л.П. Можилевская, С.И. Губарь // Биотехнология. 2001. - № 4. - С. 9-21.

46. Кунах В.А. Получение каллусных тканей и интродукция органогенеза у Pisum sativum / В.А. Кунах // Физиология растений. М.: Наука.- 1984.-Т.31.- Вып.З.-С. 46-51.

47. Кунах В.А. Продуктивность и генетическая структура клеточных популяций женьшеня Panax ginseng С. А. Меу в культуре in vitro / В.А. Кунах, Л.П. Можилевская, В.И. Адонин, С.И. Губарь // Биотехнология. 2003. - № 3.1. С.25-35.

48. Кунах В.А. Устойчивость к 5-метилтриптофану и накопление алкалоидов в каллусной культуре раувольфии змеиной Rauwolfia serpentina Benth. / В.А. Кунах, Л.П. Можилевская, Л.К. Алпатова, С.И. Губарь // Биотехнология. 2001. - № 3. - С. 3-10.

49. Куренина Л.В. Разработка способа быстрой регенерации клевера лугового Trifolium pratense L. / Л.В. Куренина, Л. А. Солодкая, Л.И. Лапотышкина, В.В. Мазин // Биотехнология. 2001. - № 6. - С. 19-24.

50. Ларионов Г.И. Влияние препарата «Силк» на урожайность пшеницы и ячменя / Г.И. Ларионов // Сельскохозяйственные вести. 2002. - № 1.-С. 55-59.

51. Лукаткин А.С. Скрининг клеточных культур огурца на повышенную холодоустойчивость / А.С. Лукаткин, А.В. Гераськина // Биотехнология. 2003. - № 3. - С. 65-73.

52. Ляпкова Н.С. Разработка методов культивирования тканей копеечника in vitro / Н.С. Ляпкова, Н.В. Хадеева, С.С. Шаин, А.Н. Майсурян // Биотехнология. 1999. - № 1. - С. 55-61.

53. Максютина Н.П. Растительные лекарственные средства / Н.П. Максютина.- Киев.- 1985.- С. 41-56.

54. Малахова Л.А. Изучение хромосом дикорастущих растений приобья. III. Сравнительный анализ кариотипов трёх видов борца Aconitum L. (Ranunculaceae) / Л.А. Малахова, А.А. Козлова, Н.Н. Карташова // Ботанический журнал. 1976. - Т. 61. - №8. - С. 1137-1141.

55. Мардамшин А.Г. Сравнительный анализ содержания эндогенных фитогормонов в морфогенной и неморфогенной каллусной ткани гороха посевного / А.Г. Мардамшин, А.Р. Мустафина // Биотехнология. 2001. - № 1. -С. 27-29.

56. Масловсий А.Н. Влияние различных стимуляторов роста растений на урожайность яровой пшеницы / А.Н. Масловсий, М.С. Давыдов

57. Материалы конференции «Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений» (12 15 марта 2003 г.).-2003.-С. 138-145.

58. Методическое пособие по организации и проведению работ по культивированию изолированных органов и тканей растений. / Под ред. JI.A. Першиной Новосибирск: Изд-во Института катализа СО АН СССР. -1991.-27с.

59. Мигранова И.Г. Сравнительный анализ жизнеспособности каллусных тканей, полученных из растений борца северного различных популяций / И.Г. Мигранова, Н.А. Уразбахтина, И.А. Лукичева и др. // Биотехнология. 2000. - № 2. - С. 42-44.

60. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири / В.Г. Минаева.-Новосибирск: Наука.- 1991.- 431с.

61. Мокроносов А.Т. Методика количественной оценки структуры и функциональной активности фотосинтезирующих тканей и органов. Пр. по прикл. ботанике, генетике и селекции / А.Т. Мокроносов, Р.А. Березенкова. -1978.- Т. 61. Вып.З. - С. 119-133.

62. Мотл О. Тонкослойная хроматография: Лабораторное руководство по хроматографическим смежным методам / О. Мотл, Л. Новотный.- М.: Мир. -1982.- 4.2.-С. 485-550.

63. Ничипорович А.А. Физиология фотосинтеза / А.А. Ничипорович. -М.: Наука.- 1982. С.23-40.

64. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений. Свет. (Институт физиологии растений им. Тимирязева АН СССР) / A.M. Носов // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука. - 1991. - С. 11-12.

65. Паламарчук И.А. Изучение растительной клетки / И.А. Паламарчук, Т.Д. Веселова. М.: Просвещение. - 1969. - 143 с.

66. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева.

67. М: Агропромиздат. 1988. - 271 с.

68. Перевалов Р.Г. Рост изолированных латеральных почек гвоздики Dianthus caryophyllus на средах с добавлением экзометаболитов Strptomyces canosus 71 var. 6 / Р.Г. Перевалов, И.О. Растимешина, С.А. Бурцева и др. // Биотехнология. 2001. - № 3. - С. 66-73.

69. Пленник Р.А. Полезные растения Хокасси: Ресурсы и интродукция / Р.А. Пленник, Э.М. Гонтарь, Е.В. Тюрина и др. Новосибирск: Наука. - 1989. -С. 39-41.

70. Растительные ресурсы СССР: В 6 т. Л.: Наука. - 1987. - Т.1. - С.54.55.

71. Ревина Т.А. Динамика содержания экдистерона в надземной части Serratula coronata L. и влияние на него света разного спектрального состава / Т.А. Ревина, Р.А. Карначук, Т.Я. Тайлашева // Растительные ресурсы. -1986. -Вып.1. С. 70-72.

72. Родькина И.А. Изменчивость морфологических признаков при вегетативном размножении андроклонов картофеля / И.А. Родькина, Г.А. Яковлева // Биотехнология. 2001. - № 2. - С. 31 -39.

73. Ростовцева Т.С. Хромосомные числа некоторых видов семейства Ranunculaceae Juss. / Т.С. Ростовцева // Ботанический журнал. 1976. - Т. 61. -№ 8. - С.1 133-1137.

74. Сафронич А.Н. Выделение и анализ природных биологическиактивных веществ / А.Н. Сафронич, Е.Е. Сироткина. Томск. - 1987. - С. 116137.

75. Сахобиддинов С.С. Дикорастущие лекарственные растения Средней Азии / С.С. Сахобиддинов. Ташкент. - 1948. - С.111.

76. Сдобникова Л.А. Содержание микроэлементов в княжике сибирском, произрастающем в Казахстане / Л.А. Сдобникова, Н.В. Ковалевич // Некоторые проблемы фармацевтической науки и практики. Алма-Ата.-1975. - С.118-119.

77. Секе Е. Влияние условий выращивания каллусных тканей соцветий ромашки лекарственной на образование в ней эфирного масла / Е. Секе,

78. A.Л. Шаварда, И.Н. Кузовкина // Физиология растений.- 1978,- Т.25.- Вып.4.- С. 743-749.

79. Скуратова Е.В. Влияние фитогормонов на процессы роста и синтеза вторичных веществ в культуре in vitro василистника малого / Е.В. Скуратова,

80. B.М. Гольд, Е.В. Юшкова, С.М. Репях // Биотехнология. 1999. - № 2. - С. 4652.

81. Слепиан Л.И. Каллусогенез в культуре изолированной ткани корня женьшеня / Л.И. Слепиан // Растительные ресурсы.- 1971.- Т.7.- Вып.2. С. 175186.

82. Смирнов А.В. Биотехнологическое получение берберина из клеточной культуры Thalictrum minus L. / А.В. Смирнов, Е.А. Урманцева, Е.А. Гукасова и др. // Биотехнология. 2000. - № 1. - С. 14-22.

83. Смирнов A.M. Рост и метаболизм изолированных корней в стерильной культуре / A.M. Смирнов. М.: Наука.- 1970. - 455 с.

84. Смолов А.П. Становление функций фотосинтетического аппарата в культуре тканей in vitro / А.П. Смолов, А.Р. Игнатьев, B.C. Полевая // Физиология растений: Институт фотосинтеза АН СССР. Пущино-на-Оке. -М.: Наука. - 1975.- Т.22.- Вып.2.- С. 428-429.

85. Смолов А.П. Физиологические аспекты утилизации сахарозыгетеротрофной и фотогетеротрофной культурой изолированных тканей / А.П. Смолов, B.C. Полевая // Физиология растений: Институт фотосинтеза АН СССР. Пущино-на-Оке.- 1980.- Т.27.- Вып.З.- С. 612-617.

86. Старцева Д.М. Клеточная культура почечного чая (Orhtosiphon stamineus Benth.) источник биологически активных веществ / Д.М. Старцева,

87. B.Ю. Дорофеев // Материалы LX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология. Новосибирск: Изд-во Новосибирского государственного университета. 2002.1. C. 104.

88. Строгов С.Е. Влияние условий культивирования клеток воробейника краснокорневого с метилжасмонатом на выход шиконина / С.Е. Строгов, Г.В. Зайцева, В.В. Туркин и др. // Биотехнология. 2003. - № 3. -С. 63-69.

89. Тарчевский И.А. Влияние жасмоновой, салициловой и абсцизовой кислот на включение 14С.лейцина в белки листьев гороха / И.А. Тарчевский, Н.Н. Максютова, В.Г. Яковлева // Биохимия. 2001. - Т.66. - Вып. 1. - С. 87-91.

90. Тимохина С.A. Portulaceae Ranunculaceae. Семейство Ranunculaceae / С.А. Тимохина // Флора Сибири., под ред. д-в б. н. Л.И. Малышева, Г.А. Пешкова. - Новосибирск. - Изд-во ВО «Наука». -1993. -С.155-156.

91. Тихомиров А,А. Газообмен и продуктивность растений выращенных на красном свету / А.А. Тихомиров, И.Р. Золотухин // Фотосинтез и фотобиотехнология, (тезисы докладов и сообщений Международной конференции). Пущино.- 1991. - С. 32-37.

92. Ш.Трофимова Н.А. Химический состав культуры изолированных тканей и интактного растения Orthosiphon stamineus Benth. / Н.А. Трофимова, Г.А. Романова, Н.А. Бенсон, С.Е. Дмитрук // Растительные ресурсы. 1985. - Т. XXI.-Вып. 1. - С. 90-95.

93. Уразалиев К.Р. Фотогетеротрофный рост и фотосинтез в каллусной культуре солодки голой / К.Р. Уразалиев, Е.С. Сванбаев // Известия Академии наук Казахской ССР.- Сер. биологическая.- Наука.- Вып.4 (154) (июль-август).-1989.-С. 23-30.

94. Урманцева В.В. Культивирование каллусных тканей на твёрдых питательных средах / В.В. Урманцева // Методы культивирования клеток. Л.: Наука.- 1981.-С. 5-16.

95. Фаулер М.В. Экономические аспекты промышленного культивирования клеток растений / М.В. Фаулер // Биотехнология сельскохозяйственных растений.- М.: Наука.- 1981.- С. 5-16.

96. Фиалков А.Я. Методы исследования лекарственных веществ / А.Я. Фиалков. Медгиз. - 1946. - С. 43-47.

97. Флора Западной Сибири. Томск. - 1931.- Вып.5. - С. 45.

98. Флора СССР / Под ред. акад. В.Л. Комарова.- М.- Л.: Изд-во АН СССР.-Т. 7.- 1937.

99. Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения / Под ред. Мокроносова.- М.: Агропромиздат.-1989. С. 76.

100. Фролова Л.В. Динамика клеточной популяции в культуре клеток V. faba / Л.В. Фролова, З.Б. Шамина // Культура клеток растений. М.: Наука. -1979.- 155с.

101. Фурет Г.Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей / Г.Г. Фурет. М.: Наука. - 1979.- 155 с.

102. Хромосомные числа цветковых растений. Академия наук СССР. Ботанический институт им В.Л. Комарова. Л.: Наука.-1966

103. Чайко А.Л. Культура клеток женьшеня японского Panax japonicusvar. repens): получение каллусной и суспензионной культуры, оптимизация роста и анализ панаксозидов / A.JI. Чайко, О.В. Решетняк, И.Е. Куличенко // Биотехнология. 1999. - № 6. - С. 51 -55.

104. Черникова З.В. Сапониноносные растения Сибири и свойства их сапонинов / З.В. Черникова // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты и применение. Новосибирск. - 1949. - С.41-67.

105. Шамина З.Б. Генетика и цитология культуры ткани и растений регенерантов / З.Б. Шамина // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений.- М.: Наука.-1970.- С.129-137.

106. Шестопалова Т. Княжик сибирский / Т. Шестопалова // ВосточноСибирская правда.-1999.-№ 102-103 (23467-23468).- СЛ.

107. Шилова И.В. Химико-фармакологическое изучение активной фракции Atragene speciosa Weinm. / И.В. Шилова, Е.А. Краснов, Н.И. Суслов // Бюллетень СО РАМН. Новосибирск. - 2001. - №3 (101). - С. 44-49.

108. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев / А.А. Шлык // Биохимические методы в физиологии растений. -М.: Наука, 1971.-С. 154-171.

109. Шрагер JI.H. Анализ кариотипов двух видов семейства

110. Ranunculaceae / JI.H. Шрагер, Л.А. Малахов // Ботанический журнал. 1979. - Т. 64. - № 5. - С.731-734.

111. Юшкова Е.В. Особенности роста каллусных тканей Catharanthus roseus L. в зависимости от способа культивирования / Е.В. Юшкова, Е.В. Скуратова, Н.А. Величко и др. // Биотехнология. 1998. - № 6. - С. 42-47.

112. Chemical Probes in Biology, Science at the Interface of Chemistry, Biology and Medicine / Ed by M.I. Schneider: NATO Science Scries, Part II. -Matematics, Physics and Chemistry. Kluwer Academic Publishers. Vol. 129. 1: Germany.-2003.-P. 123-130.

113. Debeljak N. Induction of Tuberisation In Vitro with Jasmonic Acid and Sucrose in an Australian Terrestrial Orchid, Pterostylis sanguinea / N. Debeljak, M. Regvar, K.W. Dixon, K. Sivasithamparam // Plant Growth Regulation 36. 2002.-P. 253-260.

114. Hayashi Hiroaki. Up-regulation of Soyasaponin Biosynthesis by Methyl Jasmonate in Cultured Cells of Glycyrrhiza glabra / Hiroaki Hayashi, Pengyu Huang, Kenichiro Inoue // Plant Cell Physiol. 2003. - V. 44(4). - P. 404-411.

115. Fujita Y. Industrial Production of Shikonin and Berberin / Y. Fujita // Application of Plant Cell and Tissue Culture. CIBA Foundation Symposium 137.- 1988.-P. 228-235.

116. Ikekawa N. Application of 24-Epibrassinolide in Agriculture / N. Ikekawa, Y. I. Zhao // J. Am. Chem. Soc. Meeting Abstracts. 1991. - V. 474. -P. 292.

117. Karnachuk R.A. Clematis Siberian {Atragene speciosa Weinm.) in Vitro- source of physiological active substances / R.A. Karnachuk, V.Yu. Dorofeev // Abstracts. VIII International Conference «The Biology of Plant Cells in Vitro and

118. Biotechology» (Saratov. September 9-13, 2003). Saratov. - 2003. - P. 134.

119. Khripach V.A. Brassinosteroids: a New Class of Plant Hormones / V.A. Khripach, V.N. Zhabiunskii, Groot Ae de. San Diego. - Academic Press. -1999.-456 p.

120. Kubigsteltig I.I. Novel Jasmonate Pathway Mutants in Arabidopsis ~^ • thaliana / I.I. Kubigsteltig, T. Basongen, E.W. Weiler // 13"th Congress of Federation

121. Societies of Plant Physiology. Crete, Greece. - 2002. - P. 229.

122. Mizukami H. Methyl Jasmonate-Induced Rosmarinic Acide Biosynthesis in Lithospermum erythrorhizon Cell Suspension Cultures / H. Mizukami, Y. Tabira and B.E. Ellis. 1993. - Plant Cell Rep. 12. - P. 706-709.

123. Morard Ph. Optimization of the Mineral Composition of In Vitro Culture Media / Ph. Morard, M. Henry // J. Plant Nutr. 1998. - V. 21. - № 8. - P. 15651576.

124. Murashige T. A Revised Medium for Rapid Grows and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. 1962. - V. 15. -№ 3. - P. 473-497.

125. Biotechnology in Agriculture and Forestry, vol. 11. Somaclonal Variation in Crop Improvement I. Edited byY.P.S. Bajaj. With 208 Figures.- Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York.- 1991.-printed in Germany.- 1991.- P.49-75.

126. Parthier B. Jasmonates, New Regulators of Plant Growth and Development: Many Facts and Few Hypotheses on Their Actions / B. Parthier // Bot.

127. Acta.-1991.-V. 104.-P. 446-454.

128. Pech J.C. Croissance In Vitro de Tissus et de Suspensions Cellulaires de Pomme / J.C. Pech, A. Latche, M. Austruy, J. Fallot // Bull.Soc. Bot. France. 1975.-V. 122.-№5/6.-P. 183-194.

129. Phillips R. Rapid Differentiation of Tracheary Elements in Cultured Explants of Jerusalem artichoke / R. Phillips, J.H. Dodds // Planta. 1977. - Bd. 135. -H. 2.-S. 207-212.

130. Roddick I.G. Developmental Effects of 24-Epibrassinolide in Excised Roots of Tomato Grown In Vitro / I.G. Roddick, A.L. Rintrberg, N. Ikekawa // Physiol. Plant. 1993. - V. 87. - P. 453-458.

131. Bajaj. With 208 Figures.- Springer-Verlag Berlin Heidelberg.- 1991. printed in Germany.- 1991.- P.68-73.

132. Higher Plants / B.D. Singh, E.T. Thomas, B.L. Harvey // Indian J. Exp. Biol. 1974. -V. 12. - № 3. - P. 213-215.

133. Skoog P. Chemical Regulation of Growth and Organ Formation in Plant Tissues Cultured In Vitro / P. Skoog, C. Miller // Symp. Soc. Exp. Biol. 1957. - V. 11.-P. 118-131.

134. Spollansky T.S. Effect of Jasmonic Acid and Aluminium on Production of Tropane Alkaloids in Hairy Root Cultures of Brugmancia Candida / T.S. Spollansky, S.I. Pitta-Alvarez, A.M. Giulietti // Plant Biotechnology. 2000. -Vol. 3.-№ l.-P. 72-75.

135. Svatos A. The Rate Production in Suspension Cultured Cells of the Fern Pteridium aquilinum / A. Svatos, T. Macek // Phytochem. 1994. - Vol. 35. - № 3. -P. 651-564.

136. Tabata M. Biotechnology in Plant Seience: Relevance to Agriculture in the Eighties./ M. Tabata, Y. Fujita / Eds M. Zaitlin, R. Day. Hollaender. - 1985. -P- 147

137. Verpoorte R. Plant Cell Culture Secondary Metabolism / R. Verpoorte F. Di Cosmo, M. Misava / Eds. Boca Raton. New York, London, and Tokio: The CRS Press. - 1996. - Chapter 9. - 660 p.

138. Yamamoto H. Flavonoid Production in Scutellaria baicalensis Callus Cultures / H. Yamamoto, N. Chatani, Z. Kitayama, T. Tomimori // Plant Cell Tissue Organ Culture. 1986. - V. 5. - P. 219-222.

139. Yoshikawa T. Saponin Production by Cultures of Panax ginseng Transformed with Agrobacterium rhizogenes / T. Yoshikawa, T. Furuya // Plant Cell Repts. 1987. - V. 6. - № 6. - P. 449-453.