Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция апоптоза и пролиферации клеток эпидермоидной карциномы А431 при действии эпидермального фактора роста
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Регуляция апоптоза и пролиферации клеток эпидермоидной карциномы А431 при действии эпидермального фактора роста"
На правах рукописи
ГРУДИНКИН ^ Павел Сергеевич
РЕГУЛЯЦИЯ АПОПТОЗА И ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК ЭПИДЕРМОИДНОЙ КАРЦИНОМЫ А431 ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА
03 00 25 - гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ООЗ177223
Санкт-Петербург 2007
003177223
Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург
Научный руководитель доктор биологических наук, академик
Никольский Николай Николаевич, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор
Поспелов Валерий Анатольевич, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
кандидат биологических наук Филатов Михаил Валентинович,
Санкт-Петербургский институт ядерной физики им Б П Константинова РАН, Санкт-Петербург
Ведущая организация Санкт-Петербургский государственный
университет, Санкт-Петербург
Защита состоится 7 декабря 2007 года в 12 ч на заседании диссертационного совета Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр, д 4 Электронный адрес се11Ью@та11 су1БрЬ гээ! ги
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии
РАН
Автореферат разослан 6 ноября 2007 г
Ученый секретарь /¡/й^' ' кандидат биологических наук
диссертационного совета ¿Щ ЕВ Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Одной из важнейших задач клеточной биологии и медицины является изучение механизмов опухолевой трансформации клеток Понимание процессов, лежащих в основе превращения нормальной клетки в трансформированную, является базисом для поиска новых методов противораковой терапии Особое значение имеют случаи, когда опухолевая клетка при трансформации приобретает особенности, позволяющие селективно индуцировать ее гибель Примером является линия эпидермоидной карциномы человека А431, чувствительная к действию эпидермального фактора роста (epidermal growth factor, EGF)
Клеточная линия А431 - наиболее популярный объект исследований ученых, занимающихся передачей сигнала от EGF Причиной этого служит повышенная экспрессия рецептора EGF (несколько миллионов молекул на клетку) вследствие амплификации кодирующего его гена (Haigler et al, 1978) Показано, что именно повышенное количество рецептора в сочетании с аутокринной секрецией одного из его лигандов, TGFa, является причиной бесконтрольной пролиферации клеток А431 (Van de Vijver et al, 1991) В то же время, повышенная экспрессия рецептора EGF приводит к нетипичному ответу на EGF в высоких (наномолярных) концентрациях - ингибированию клеточного роста и гибели клеток Подобное действие EGF известно для ряда линий трансформированных клеток, экспрессирующих повышенное количество рецептора EGF, и редко встречается среди других клеток Исследование механизмов ответа клеток А431 на EGF позволит лучше понять механизмы опухолевой трансформации, пути возникновения "слабых мест" сигнальных систем опухолевых клеток, которые с необходимостью возникают в процессе трансформации и могут помочь в уничтожении опухоли, а также механизмы приобретения опухолевыми клетками вторичной устойчивости при селекции на противоопухолевом агенте
Причины ингибирующего эффекта EGF не вполне ясны - в литературе указывается на значение остановки клеточного цикла (MacLeod et al, 1986, Fan et al, 1995, Jakus, Yeudall, 1996, Ohtsubo et al, 1998) или апоптотической гибели клеток (Gulli et al, 1996, Chin et al, 1997, Smida Rezgui et al, 2000, Anto et al, 2003; Morazzani et al, 2004) в этом процессе He до конца выяснены и сигнальные пути, приводящие к реализации EGF-зависимого ингибирования прироста популяции клеток А431 Известно, что EGF передает сигнал за счет стимуляции тирозинкиназной активности рецептора EGF и последующей активации ряда сигнальных путей, включая ГТФазы семейств Ras и Rho, МАР-киназы, фосфо-липазу Су и различные изоформы протеинкиназы С, PI-3-киназу и PKB/Akt, ти-розинкиназы семейств Src, JAK и FAK, транскрипционные факторы STAT1, STAT3, STAT5 и NF-кВ (Schlessinger, 2000) Различные элементы передачи сигнала могут оказывать разное, подчас противоположное, действие на пролиферацию или выживание клеток, и совокупный ответ определяется степенью активации сигнальных путей и их сочетанием Имеются различные и достаточ-
но противоречивые данные о роли этих компонентов верхних сигнальных путей в реализации эффектов, вызываемых высокими концентрациями EGF на клетки А431 Так, есть сведения о значении киназы РКС 5 (Toyoda et al, 1998) и NF-кВ (Ohtsubo et al, 2000), однако наибольшее внимание исследователей привлекает транскрипционный фактор STAT1
STAT-белки активируются фосфорилированием по тирозину и дополнительным фосфорилированием по серину, после чего димеризуются, транспортируются в ядро и активируют транскрипцию генов-мишеней (Bromberg, 2001) STAT1 чаще всего передает проапоптотический и антипролиферативный сигнал (Battle, Frank, 2002) Эксперименты с использованием доминантно-негативных конструкций (Bromberg et al, 1998) и олигонуклеотидных "ловушек" (Ohtsubo et al, 2000), а также корреляция между ингибирующим клеточный рост эффектом EGF и активацией STAT1 (Chin et al, 1996, 1997, Bromberg et al, 1998) показали участие STAT1 в вызываемом EGF ингибировании прироста популяции клеток А431 Тем не менее, использованные методы не позволили четко доказать роль STAT1, отделить его от других представителей семейства STAT и установить мишени действия STAT-белков, приводящие к реализации клеточного ответа в данной системе Дифференциальный подход к изучению транскрипционных факторов семейства STAT важен еще и потому, что для другого представителя семейства, STAT3, доказана центральная роль в зависимой от рецептора EGF супрессии апоптоза, являющейся необходимым компонентом трансформированного фенотипа разнообразных опухолей, экспрессирующих повышенные количества рецептора EGF (Karni et al, 1999, Garcia et al, 2001, Rubin Grandis et al, 1998) Проверка универсальности данной модели и ее применимости к клеткам А431 также является неисследованной и актуальной задачей Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в изучении регуляции апоптоза и пролиферации клеток эпидермоидной карциномы А431 эпидермальным фактором роста
В работе были сформулированы следующие экспериментальные задачи
1 установить биологические эффекты, вызываемые эпидермальным фактором роста на клетки эпидермоидной карциномы А431,
2 идентифицировать сигнальные пути, необходимые для проявления проапоп-тотического эффекта эпидермального фактора роста,
3 определить механизмы формирования устойчивости клеток к проапоптотиче-
скому действию эпидермального фактора роста,
4 методом РНК-интерференции установить роль транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в ответе клеток А431 на действие эпидермального фактора роста,
5 исследовать участие STAT1 и STAT3 в накоплении регуляторов клеточного цикла и апоптоза при действии эпидермального фактора роста на клетки А431
Основные положения, выносимые на защиту.
1 Эпидермальный фактор роста вызывает остановку клеточного цикла и дальнейшую апоптотическую гибель клеток эпидермоидной карциномы А431
2 Рецептор эпидермального фактора роста, киназы Src-семейства, МАР-киназа
р38 и транскрипционный фактор STAT1, но не STAT3, необходимы для проявления проапоптотического эффекта эпидермального фактора роста
3 Приобретенная в результате селекции устойчивость клональных вариантов клеток А431 к действию эпидермального фактора роста вызвана уменьшением количества транскрипционного фактора STAT1
4 В накоплении ингибитора циклин-зависимых киназ р21waf 1 и ингибитора апоптоза Bcl-XL при действии эпидермального фактора роста в клетках А431 участвует транскрипционный фактор STAT3
Научная новизна работы.
В работе впервые проведен подробный анализ причин ингибирования прироста популяции клеток А431 при действии EGF и показана основополагающая роль апоптотической гибели клеток с последующим откреплением от субстрата в этом процессе При помощи РНК-интерференции впервые однозначно доказана роль транскрипционного фактора STAT1 (но не STAT3) в проведении проапоптотического сигнала Впервые показан механизм приобретения клетками устойчивости к действию EGF за счет снижения экспрессии STAT1, а также возможность реверсии EGF-устойчивого фенотипа за счет экспрессии STAT1 Впервые показано значение STAT3 в накоплении p21wafl при действии на клетки EGF Впервые отмечена роль МАР-киназы р38 в EGF-зависимой индукции гибели клеток А431
Теоретическое и практическое значение работы.
В работе показано, что апоптотическая гибель является основным результатом действия EGF на клетки А431 Для этого ответа необходима интеграция множественных сигнальных путей и молекул, в том числе тирозинкиназы рецептора EGF, транскрипционного фактора STAT1, нерецепторных тирозинки-наз Src-семейства, МАР-киназы р38 STAT3 не нужен для проведения проапоптотического сигнала после обработки EGF, но участвует в накоплении белков с антиапоптотической функцией - Bcl-XL и p21wafI Доказано, что приобретение устойчивости трансформированных клеток с повышенной экспрессией рецептора эпидермального фактора роста к высоким дозам EGF может быть связано со снижением содержания STAT1 Чувствительность к действию EGF возвращается при повышении экспрессии STAT1
Полученные результаты закладывают основу для дальнейшего изучения молекулярных механизмов проапоптотического действия EGF при трансформации клеток, вызванной повышенной экспрессией рецептора EGF Данные по механизмам индукции апоптоза могут быть полезны в разработке методов противоопухолевой терапии, а анализ причин устойчивости клональных вариантов позволяет прогнозировать возможные осложнения Новые клеточные линии, полученные в работе, можно использовать в дальнейших исследованиях пере-
дачи сигнала с участием STAT-белков Материалы диссертации могут быть использованы в учебных лекционных курсах по клеточной биологии
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 4 статьи и сделано 5 стендовых сообщений на всероссийских конференциях Основные положения диссертации были доложены и обсуждались на научных семинарах Отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта, Лаборатории молекулярных основ дифференциров-ки клеток и Отдела клеточных культур Института цитологии РАН
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 165 ссылок Материалы диссертации изложены на 138 страницах текста и иллюстрированы 37 рисунками
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Культивирование клеток.
В работе использованы клетки эпидермоидной карциномы человека А431 (Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН), а также клональные варианты 1а, 8а и 11а, полученные Гудковой и Сорокиным (1989) путем селекции обработанных 1-метил-З-нитро-1-нитрозогуанидином клеток А431 в присутствии EGF Клетки культивировали в среде ДМЕ (Панэко, Россия), содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров (РАА, Австрия) и 80 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения) Для экспериментов клетки рассевали на чашки в плотности 1,1x104 клеток в 0,18 мл среды на 1 см2 Через 16-18 ч добавляли 200 нг/мл EGF Ингибиторы киназ добавляли за 40 мин до стимуляции EGF При длительных экспериментах ингибиторы добавляли через каждые сутки, чтобы компенсировать их деградацию
Плазмиды.
Плазмиды, кодирующие кДНК STAT1 и STAT1(Y701F), и вектор pCAGGS-neo были любезно предоставлены д-ром Т Хирано (Университет Осаки, Япония) Вектор mU6pro был подарен д-ром Д JI Тернером (Университет Мичигана, США) Ген устойчивости к неоми-цину амплифицировали из плазмиды pRc-CMV и субклонировали между сайтами рестрикции Apal и HmdIII вектора mU6pro с использованием ПЦР-праймеров TAC CGG GCC CGA ATT CTG TGG AATGTG и TTTAAG CTT CCG GCT CGT ATG TTG TGT G Следующие синтетические олигонуклеотиды длиной 49 п н , кодирующие миРНК, отжигали попарно и клонировали между рестрикционными сайтами Bbsl и Xbal ТТТ GAT ACT ТСА GGG GAT ТСТ CAG GGA GAA ТСС ССТ GAA GTA ТСТ ТТТ Т и СТА GAA AAA GAT ACT ТСА GGG GAT ТСТ CCC TGA GAA ТСС CCT GAA GTA T для STAT1 человека (соответствует 2332-2350 п н последовательности GenBank NM_007315), ТТТ GAA GGC GTG ATT CTT CCC АСА GTG GGA AGA АТС ACG CCT ТСТ ТТТ T и СТА GAA AAA GAA GGC GTG ATT CTT CCC ACT GTG GGA AGA АТС ACG CCT T для STAT3 человека (соответствует 568-586 пн последовательности GenBank NM_139276), ТТТ GAA GAA GTC GTG CTG CTT CAT GGA AGC AGC ACG ACT ТСТ ТСТ ТТТ T и СТА GAA AAA GAA GAA GTC GTG CTG CTT CCA TGA AGC AGC ACG ACT ТСТ T для отсутствующего в клетках А431 белка EGFP (enhanced green fluorescent protem - улучшенный зеленый флуоресцентный белок медузы) (последовательность по Yu et al, 2002) Нукяеотидные последовательности полученных конструкций проверяли секвенированием с использованием праймеров GCT АСА ТТТ TAC ATG ATA GGC TTG G (U6-forward) и CAC AGG AAA CAG СТА TGA CCA T (M13-rev)
Трансфекции.
Для проведения трансфекций клетки рассевали в плотности 3,5х 10' клеток на лунку 24-луночной платы в 500 мкл среды Трансфекции проводили с помощью реагента Липо-фектамин2000 (Invitrogen, США) согласно протоколу изготовителя Через 12-16 ч после трансфекции среду меняли на свежую, еще через сутки клетки рассевали и селектировали стабильные линии на 1 мг/мл антибиотика G-41В (Invitrogen, США)
Электрофорез и иммуноблоттинг.
Клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и лизировали в течение 10 мин в PBS с добавлением 1 % Тритона Х-100, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaF, 1 мМ Na3VC>4 и коктейля протеазных ингибиторов (Sigma, США) При выявлении активной каспазы 3 плавающие клетки лизировали вместе с прикрепленными Белки разделяли методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, а затем проводили их электроперенос на нитро-целлюлозную мембрану Окрашивание антителами проводили в соответствии со стандартными протоколами Bio-Rad Laboratories с использованием коньюгированных с пероксида-зой хрена вторичных антител и реакции усиленной хемилюминесценции Для контроля равного количества белка в пробах проводили окрашивание антителами против тубулина или ß-актина
Антитела.
В работе были использованы первичные антитела против следующих эпитопов рецептор EGF (клон 29 1, Sigma), фосфотирозин (clone PY-20, BD Pharmmgen, США), pY1045 рецептор EGF (Cell Signaling Technology, США), STAT1 (моноклональные, BD Pharmmgen), STAT3 (моноклональные, BD Pharmmgen), STAT5 (поликлональные, Cell Signaling Technology), pY701 STAT1 (Cell Signaling Technology), pY705 STAT3 (Cell Signaling Technology), pY694 STAT5 (Cell Signaling Technology), pS727 ST ATI (любезно предоставлены д-ром А Ларнером (Институт Лернера, Кливленд, США), pS727 STAT3 (Cell Signaimg Technology), ERK 1, 2 (Santa Cruz Biotechnologies, США), pT202/pY204 ERK 1,2 ("pERK", поликлональные, Cell Signaimg Technology), активная (расщепленная по Asp 175) каспаза 3 (Cell Signaling Technology), тубулин (клон В-5-1-2, Sigma), ß-актин (клон АС-74, Sigma)
Оценка жизнеспособности клеток (МТТ).
Количественную оценку жизнеспособности клеток проводили с использованием реагента МТТ (Sigma, США), который в живых клетках восстанавливается митохондриальны-ми гидрогеназами до формазана пурпурного цвета Для экспериментов клетки выращивали на 96-луночных платах и инкубировали 2 ч в 50 мкл 0,715 мг/мл раствора МТТ в среде ДМЕ с сывороткой в С02-инкубаторе По истечении этого времени среду заменяли на ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора при 570 нм на приборе UNIPLAN ("Пикон", Россия) В каждом опыте использовали 5-6 повторностей для каждой точки Среднее значение оптической плотности лунок нормализовали к среднему значению оптической плотности лунок на момент добавления EGF По результатам 2-5 независимых экспериментов были вычислены средние значения относительной оптической плотности и стандартные отклонения
Подсчет числа клеток.
Прикрепленные клетки снимали раствором химотрипсина в растворе Версена При необходимости подсчета открепившихся клеток их осаждали из среды культивирования и подсчитывали отдельно Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева каждые 24 ч в течение 3 сут В каждом опыте использовали 2 повторности для каждой точки Среднее значение числа клеток нормализовали к среднему значению числа клеток на момент добавления EGF По результатам 2-3 независимых экспериментов были вычислены средние значения относительного числа клеток и стандартные отклонения
Микроскопия.
Клетки, выращенные на покровных стеклах, а также открепленные клетки фиксировали 4 %-ным формалином, окрашивали DAPI (1 мкг/мл) Препараты фотографировали на микроскопе Leica DMRE (Германия) фотоаппаратом Nikon Coolpix в режимах флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии
Анализ олигонуклеосомной фрагментации ДНК.
Апоптотическую гибель клеток оценивали электрофоретически по появлению фракции экстрахромосомной ДНК Для этого прикрепленные клетки трипсинизировали, объединяли с открепленными и подсчитывали в камере Горяева Равные количества клеток (2,5x105) лизировали на льду в течение 15 мин в гипотоническом буфере следующего состава 5 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,5 % Тритона Х-100 и 100 мМ ЭДТА Клеточные лизаты центрифугировали, надосадочную жидкость отбирали в отдельные пробирки, в которые добавляли NaCl до конечной концентрации 0,15 М и РНКазу А до 100 мкг/мл, а затем инкубировали 1 ч при 37 °С После этого в пробы добавляли SDS до конечной концентрации 0,5 % и протеиназу К до 200 мкг/мл и инкубировали 2 ч при 56 °С Затем осуществляли депротеини-зацию хлороформом и осаждение ДНК Электрофорез проводили в 2 %-ном агарозном геле в трис-боратном буфере, рН 8,0 После электрофореза гель окрашивали бромидом этидия и фотографировали при ультрафиолетовом освещении Проточная цитометрия.
Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре ACR1400 (Bruker, Франция) Вычисления были проведены с использованием программ WinList и ModFit LT (Verity Software House, США) Во всех случаях использовался фильтр по параметрам фронтальное светорассеяние - боковое светорассеяние
а: Распределение клеток по фазам клеточного цикла (окраска иодидом пропидия) Прикрепленные клетки трипсинизировали, соединяли с плавающими (если указано), фиксировали 50 %-ным этанолом при -20 °С и промывали PBSE (PBS, содержащий 1 мМ ЭДТА) дважды Фиксированные клетки ресуспендировали в PBSE, содержащем 50 мкг/мл иодида пропидия и 50 мкг/мл РНКазы А, и инкубировали 30 мин при 37 °С б. Количество пройденных клеточных циклов (мечение CFDA-SE) Перед посевом трипсинизированные клетки инкубировали 5 мин в суспензии в бессывороточной среде ДМЕ, содержащей 2,5 мкМ сукцинимидного эфира диацетата карбок-сифлуоресцеина (CFDA-SE, Invitrogen, США) После двух промывок в среде ДМЕ с сывороткой клетки рассевали в плотности 1,1 х 104 клеток в 0,18 мл среды на 1 см2 Через 12-14 ч добавляли 200 нг/мл EGF Через 2 сут прикрепленные клетки трипсинизировали, фиксировали 50 %-ным этанолом при -20 °С и дважды промывали PBSE в: Поздние стадии апоптоза (реакция TUNEL)
Прикрепленные клетки трипсинизировали, соединяли с плавающими, фиксировали 50 %-ым этанолом при -20 °С и промывали PBSE дважды Сайты неспецифического связывания блокировали инкубацией в 5 %-ном растворе БСА в PBSE в течение 2 ч, а затем снова промывали PBSE и преинкубировали в буфере для TDT (terminal deoxynucleotidyl transferase - терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза) (Fermentas, Литва) 30 мин После этого клетки инкубировали в буфере для TDT, содержащем 25 мкМ биотинилированного dUTP (Sigma), 250 мкМ dATP (Сибэнзим, Россия) и 0,5 ед/мкл TDT (Fermentas) 2,5 ч при 37 °С Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 15 мМ После этого промывали PBSE и добавляли смесь, содержащую 50 мг/мл БСА, авидин, конъюгированный с FITC, и 100 мкг/мл РНКазы A (Sigma) в PBSE на 1 ч при комнатной температуре
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. EGF индуцирует остановку клеток А431 в фазах клеточного цикла G2 и G1 и последующую апоптотическую гибель (Бурова и др.. 2001; Гру-динкин и др.. 2003: Grudinkin et al.. 2007).
Известно, что EGF в достаточно высоких концентрациях (более 1 нг/мл) вызывает торможение прироста популяции и гибель клеток А431 (Gill and Lazar, 1981) Различные авторы объясняли это явление индукцией блоков клеточного цикла (MacLeod et al, 1986, Fan et al, 1995, Jakus and Yeudall, 1996, Ohtsubo et al, 1998) или стимуляцией апоптоза (Gulli et al, 1996, Chin et al, 1997, Smida Rezgui et al, 2000, Anto et al, 2003, Morazzani et al, 2004), при этом ни в одной из работ не были одновременно изучены оба процесса Нами был проведен анализ пролиферации клеток методом проточной цитофлуориметрии Мечение клеток флуоресцентным красителем CFDA-SE позволяет отделить пролиферирующие клетки, интенсивность флуоресценции которых уменьшается вдвое при каждом делении (и, соответственно, пик распределения на гистограмме флуоресценция-количество смещается влево по сравнению с только что помеченными клетками), от блокированных или задержанных в цикле клеток (Lyons, 2000) В нашем случае воздействие EGF приводило к задержке деления большей части популяции клеток А431 (рис 1А) Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла показал, что при действии EGF уменьшается доля клеток А431 в фазе S и увеличивается доля клеток в фазах G2/M и (в меньшей степени) G1 (рис 1Б), что в совокупности с данными мечения CFDA-SE позволяет говорить о блоке клеточного цикла в фазах G2 и G1 В то же время EGF вызывал значительное увеличение доли клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, что свидетельствует о стимуляции клеточной гибели При действии EGF наблюдалось уменьшение числа клеток, детектируемое как прямым подсчетом (рис 1В), так и методом МТТ (рис 1Г) При действии EGF клетки теряли характерную эпителиальную морфологию и округлялись (рис 1Д) Тем не менее, окраска ДНК клеток реагентом DAPI выявила только незначительное количество апоптотических клеток (с ядрами, содержащими фрагменты конденсированного хроматина) среди клеток, остающихся прикрепленными, в то время как практически все клетки, открепившиеся от подложки, имели ядра с характерной апоптотической морфологией (рис 1Е) Мы полагаем, что апоптоз, вызываемый EGF в клетках А431, сопровождается быстрым откреплением клеток В этих условиях число открепившихся клеток должно коррелировать с интенсивностью апоптотической гибели клеток Действительно, процент открепившихся клеток А431 резко возрастал при воздействии EGF (рис 1Ж) Индукция апоптоза при обработке клеток А431 EGF была также подтверждена методами детекции экстрахромосомной ДНК (рис 13), иммуноблотом с использованием антител против активной (расщепленной) каспазы 3 (рис 1И) и проточной цитофлуори-метрией с использованием реакции TUNEL, позволяющей обнаружить апопто-тические клетки путем детекции образующихся при апоптозе разрывов ДНК (рис 1К)
Таким образом, в использованных в работе условиях EGF вызывает в клетках А431 остановку клеточного цикла в фазах G2 и G1, но конечным результатом действия EGF является индукция апоптоза, сопровождающегося откреплением клеток от субстрата
А
В
Контроль БиЬСИ 3.93%
1}ф1ми1:
СО-С1 36.76 % Я 411.15% С5-2-М 23.09 %
ЕСК
8и1)-С1 27.96 %
|» 1« ► 1II:
«1-С,1 54.26% 8 15.20 % G2.N1 30.55 %
Контроль
Я!—.......
ЕвР
0 12 3 Время, сут
д
^ Контроль
ЕбР
0 12 3 Время, сут
БезЕСР г
ш л
' ЕСЗр - «, ж *» ?
* Л
1 2 3 Время, сут
ЕОР
И
БЭР - +
Контроль
81,2% 18,8%
Типе1-
1 поапивные к.
КС
49,5% 50,5%
Рис. 1. EGF вызывает апоптотическую гибель клеток А431 Клетки А431 рассевали в плотности 1,1x1 о4 клеток на см2 и через 16-24 ч (1214 ч для панели А) добавляли 200 нг/мл EGF А Проточная цитофлуориметрия разбавление метки CFDA-SE Показано распределение по флуоресценции CFDA-SE клеток, фиксированных непосредственно после мечения ("Исходно"), и клеток, культивировавшихся в течение 2,5 сут ("EGF" - из них 2 сут в присутствии EGF) Б Проточная цитофлуориметрия распределение по фазам клеточного цикла Через 2 суток культивирования в отсутствие ("Контроль") или в присутствии ("EGF") EGF клетки (вместе с открепившимися) окрашивали иодидом пропидия Показан прок_ цент гиподиплоидных (Sub-Gl) клеток и распределение диплоидных клеток по фа/ зам клеточного цикла В Ежедневный подсчет количества клеток Г: Количество V—' жизнеспособных клеток оценивалось каждые сутки при помощи реакции МТТ Д Микрофотографии клеток в фазово-контрастном режиме через 2 сут после добавления EGF Е Типичная морфология ядер прикрепленных и открепившихся клеток при окраске DAPI Показаны микрофотографии флуоресценции ядер обработанных EGF клеток через 3 сут после добавления EGF Ж Ежедневный подсчет процента открепившихся клеток 3: Детекция экстрахромосомной ДНК через 2 сут после обработки EGF И: Иммуноблоттинг тотальных лизатов клеток через 2 сут после обработки EGF, выявление активной (расщепленной) каспазы 3 К Проточная цитофлуориметрия реакция TUNEL Показано распределение клеток по интенсивности флуоресценции, отражающей результат реакции TUNEL, через 2 сут культивирования в отсутствие ("Контроль") или в присутствии ("EGF") EGF
2. Исследование клональных вариантов клеток А431, устойчивых к действию EGF.
Перспективным методом исследования проведения сигнала, вызывающего снижение численности популяции лиганд-чувствительных клеток, является использование клональных вариантов, устойчивых к действию лиганда Путем селекции клеток в присутствии EGF или антител против рецептора EGF (Buss et al, 1982, Behzadian and Shimizu, 1985, Fan et al, 1995) возможно выделить клоны клеток А431, устойчивых к действию EGF В настоящей работе мы использовали клональные варианты 1а, 8а и 11а, полученные Гудковой и Сорокиным селекцией в присутствии EGF и 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидина (Гудкова и Сорокин, 1989) Все три линии демонстрировали значительно меньшую чувствительность к EGF по сравнению с материнской линией А431 (рис 2)
2.1. В клетках клональных вариантов 1а, 8а и 11а снижено количество и фосфорилирование транскрипционного фактора STAT1 (Грудинкин и др., 2003).
Анализ различных сигнальных белков методом иммуноблоттинга показал, что основным отличием устойчивых клональных вариантов 1а, 8а и 11а от исходной линии А431 является значительно меньшее содержание транскрипционного фактора STAT1 в клональных вариантах (рис 3) EGF-зависимое фосфорилирование STAT1 по тирозину практически не детектировалось в клональных вариантах Экспрессия и фосфорилирование других белков не были пред-
- - в - - Контроль
—ér— - EGF
0123012301230123
Время, сут
Рис. 2. Клональные варианты I а, 8а и 11а клеток А431 устойчивы к действию EGF. Клетки А431 и их селектированные в присутствии EGF клональные варианты 1а, 8а и 11а культивировали без EGF или в присутствии 200 нг/мл EGF. Количество жизнеспособных клеток оценивалось каждые сутки при помощи МТТ.
Рис. 3. В клетках клопальных вариантов 1а, 8а и
I 1а, устойчивых к действию EGF, снижено количество и фосфорилирование транскрипционного фактора STAT1.
Клетки А431 и их клональные варианты 1а, 8а и
11а рассевали в плотности 8х IО4 клеток на см2 и через 20
ч добавляли 200 нг/мл EGF на срок 10 мин. Тотальные лизаты клеток анализировали при помощи иммуноблот-тинга.
метом столь больших различий, хотя количества STAT3 и рецептора EGF тоже были снижены (рис. 3). Можно предположить, что наблюдаемое в клональных вариантах снижение количества и фосфорилирования STAT1 является механизмом приобретения устойчивости клеток к действию EGF и свидетельствует о важности STAT1 в проведении от EGF сигнала, направленного на индукцию гибели клеток А431.
2.2. Трансфекция STAT1 возвращает клеткам клонального варианта 8а чувствительность к действию EGF (Grudinkin et al., 2007).
С целью доказать важность снижения количества STAT1 в устойчивых к действию EGF клональных вариантах мы стабильно трансфици-ровали клетки одного из клональных вариантов,
А431 1а 8а 11а
Фосфотирознн (рецептор EGF)
pY701 STAT I
М щ
PY705 STAT3
PY694 STAT 5
pT202/pY204 ERK
(5-актин
СЛ
ч
>
Ч1 со
EGF
40 Ш ш Ж Ж ••""Ч
• ....... : :: ......
заЫМкДШ ***
pY701 STAT1
ß-actin
'■Я - 'I
Рис. 4. Экспрессия STAT1 в клональ-ном варианте 8а.
Клетки А431, 8а, а также 8а, трансфи-цированные пустым вектором pCAGGS (8а-mock), STAT1 дикого типа (8a-STATl) или STAT1 с мутацией Y701F (8a-STATlF) обрабатывали и анализировали, как на рис. 3.
8а, плазмидами, кодирующими STAT1 дикого типа или доминантно-негативный STAT1 (STATIF; тирозин 701 заменен на фенилаланин), или пустым вектором в качестве контроля. Полученные линии далее обозначены 8a-STATl, 8a-STATlF и 8а-mock соответственно. Методом им-муноблоттинга доказано увеличение количества STAT1 в клетках 8а-STAT1 и 8a-STATlF при неизменном уровне экспрессии дру гих белков, при этом фосфорилирование STAT1 увеличивалось в клетках 8a-STATl и еще сильнее подавлялось в клетках 8a-STATlF (рис. 4). Анализ количества жизнеспособных клеток при действии EGF показал, что клетки 8а-mock и 8a-STATlF сохранили устойчивость к действию EGF, характерную для клеток линии 8а, в то время как клетки, трансфицированные STAT1 дикого типа, оказались EGF-чувствительными (рис. 5). Таким об-
_. © - - контроль
EGF
о 1
3 О 1
301 2301 230123 Время, сут
Рис. 5. Экспрессия STATI в клональном варианте 8а возвращает клеткам чувствительность к действию EGF.
Клеточные линии, как на рис. 4. Эксперимент, как на рис. 2.
Без
ингибитора Compound 56 AG1478 5jjM AG1478 ЮрМ CGP77675 LY294002 SB2035S0
. . s - . Без EGF
-Й— - EGF
0 1 2 3 0 1 2 3
0 1 2 3 0 1 2 3 Время, сут
0123 0123 0123
LY294002
pYS94 STAT 5 ERK
SB203S80
pT202/pY204
AG1478 5цМ
AG1478 10(jM
С GP77675
Sub-Gl: 13.04% Diploid
G0-G1: 59.68% S: 19.43% 20.89%
Б Без EGF EGF
Без ингибитора
Compound 56
Sub-Gl: 6.91% J Diploid GO-Gl:
S:
16.8544
Sub-Gl: <1.36% Diploid
GO-Gl: 67.57% S: 9.0794 G2-M: 23.35%
Рецептор EGF
Фосфотироэин (рецептор EGF)
STAT1
pY701 STAT1 STAT3
PY705 STAT3 STATS
Контрапъ
Sub-Gl: 6.20% Diploid:
G0-G1: 45.45% S: 42.15% !-M: 12.40%
Рис. 6. Ингибиторы рецептора EGF, киназ Src-семейства и р38 МАР-киназы предотвращают индукцию клеточной гибели при действии EGF на клетки А431 А: Клетки А431 рассевали в плотности 1,1x104 клеток на см2 и через 20 ч добавляли ингибиторы киназ, а еще через 40 мин - 200 нг/мл EGF Для компенсации деградации ингибиторов те же количества добавляли дополнительно каждые 24 ч Количество жизнеспособных клеток оценивалось ежедневно при помощи реакции МТТ Б: Клетки рассевали и обрабатывали, как в А, и через 2 сут после добавления EGF фо-Ь_ тографировали в фазово-контрастном режиме В: Клетки А431 рассевали в плотно/ ста 8x104 клеток на см2 и через 20 ч добавляли киназные ингибиторы, а еще через \—' 40 мин - 200 нг/мл EGF на 10 мин Тотальные лизаты клеток анализировали при помощи иммуноблоттинга Г: Проточная цитофлуориметрия разбавление метки CFDA-SE Показано распределение по флуоресценции CFDA-SE клеток, фиксированных непосредственно после мечения ("Исходно"), и клеток, культивировавшихся в течение 2,5 сут (из них 2 сут в присутствии EGF и (или) ингибиторов киназ) Д Проточная цитофлуориметрия распределение по фазам клеточного цикла Клетки А431 рассевали и обрабатывали, как в А Через 2 сут клетки окрашивали иодидом пропидия Показан процент гиподиплоидных (Sub-Gl) клеток и распределение диплоидных клеток по фазам клеточного цикла
разом, устойчивость клональных вариантов клеток А431 к действию EGF может быть обращена за счет введения способного фосфорилироваться по тирозину STAT1 Это доказывает, что уменьшение количества и фосфорилирования STAT1 является механизмом приобретения устойчивости клеток А431 к действию EGF и свидетельствует о важности STAT1 в проведении от EGF сигнала, направленного на снижение численности популяции клеток А431
3. Ингибирование тирозинкиназы рецептора EGF и тирозинкиназ семейства Src защищает клетки А431 от действия EGF. а ингибирование МАР-киназы р38 блокирует EGF-индуцируемый апоптоз при сохранении блоков клеточного цикла (Василенко и др., 2001; Grudinkin et al.. 2007).
Для проверки роли различных сигнальных путей в выживании и пролиферации клеток А431 мы использовали ингибиторный анализ Известно, что блокирование функции рецептора EGF химическим ингибитором или антителами может нейтрализовать действие EGF на клетки А431, но большие дозы блокирующего агента приводят к гибели клеток независимо от действия EGF вследствие ингибирования необходимой для выживания клеток А431 передачи сигнала от аутокринно-секретируемого TGFa (Gulli et al, 1996, Busse et al, 2000) В наших экспериментах ингибиторы тирозинкиназы рецептора EGF compound 56 (2мкМ) и тирфостин AG 1478 (5 мкМ) спасали клетки А431 от гибели и предотвращали изменение морфологии клеток при действии EGF (рис 6А, Б), однако AG1478 в концентрации 10 мкМ индуцировал гибель клеток даже без EGF, что соответствует описанной выше концепции
В то время как киназная активность рецептора EGF важна для активации всех EGF-стимулируемых путей, активность тирозинкиназ семейства Src необходима для EGF-зависимой активации транскрипционных факторов семейства STAT, но не других сигнальных путей (Olayioye et al, 1999) В наших экспери-
ментах compound 56 и тирфостин AG 1478 ингибировали фосфорилирование рецептора EGF, ERK, STAT1, STAT3 и STAT5, в то время как ингибитор киназ семейства Src CGP77675 супрессировал фосфорилирование только STAT1 и, в мньшей степени, STAT3 (рис. 6В). Подобно ингибиторам рецептора EGF, CGP77675 предотвращал гибель и морфологические изменения клеток А431 при действии EGF (рис. 6А, Б), что свидетельствует о важности киназ Src-семейства и подтверждает гипотезу об участии STAT1 (или STAT3) в EGF-индуцируемой гибели клеток А431.
Кроме того, мы показали влияние на клетки А431 ингибиторов еще двух сигнальных путей - PI-3 киназы и МАР-киназы р38. Ингибитор PI-3 киназы LY294002 тормозил рост клеток без EGF и не препятствовал EGF-индуцируемой гибели. В отличие от EGF или высоких концентраций AG1478,
LY294002 вызывал не уменьшение, а стабилизацию количества клеток, не инициировал округление, способствовал замедлению деления клеток и накоплению клеток в фазе G1 (рис. 6 А, Б, Г, Д). Таким образом, Р1-3 кина-за является необходимой для пролиферации клеток А431, и ее ингибирование вызывает блок клеточного цикла в фазе Gl, что соответствует данным литературы (Busse et al., 2000).
Ингибитор МАР-киназы р38 SB203580 сам по себе не оказывал влияния на клетки А431, но в комбинации с EGF он частично обращал эффект EGF, вызывая стабилизацию количества клеток, способствовал уменьшению количества межклеточных контактов и появлению отростков клеток (рис. 6 А, Б). При этом задержка деления клеток (рис. 6 Г) и падение доли клеток, находящихся в S-фазе, были еще более выражены по сравнению с действием EGF без ингибитора, а накопления гиподиплоидной популяции клеток не происходило (рис. 6 Д). Исходя из этого,
Рис. 7. Снижение количества STAT1 или STAT3 в клетках А431 методом РНК-интерференции.
Клетки А431, нетрансфицированные или стабильно трапсфицированные плазмида-ми, экспрессирующими миРНК против белков STAT1 ("sh-STATl"), STAT3 ("sh-STAT3") и контрольного белка EGFP ("sh-EGFP"), рассевали в плотности 1,1x104 клеток на см2 и ли-зировали через 16-24 ч или после дополнительного культивирования 2 сут в присутствии 200 нг/мл EGF. Тотальные лизаты клеток анализировали при помощи иммуноблоттинга.
Контроль EGF _
^Тт 7 Э 7 *
'ИМ ' Со (Я
toJiíoS^
Рецептор EGF
Фосфотирозин (рецептор EGF)
pY1045 EGFR STAT1
pY701 STAT1 PS727STAT1
STAT3 PY705 STAT3
pS727 STAT3 Тубулин
-VHWWX ЩЦГЖ
о; s гг vo
CL
о о ю го
K £ 1 -Q
СЦ ф
t-
о о
X б
0123012301230123
Время, сут
Рис. 8. Уменьшение количества STAT1, но не STAT3, снижает чувствительность клеток А43] к EGF.
Клеточные линии, как на рис. 7. Эксперимент, как на рисунке 2.
можно сделать вывод о том, что из событий, индуцируемых EGF в клетках А431, апоптоз, но не блоки клеточного цикла, требует передачи сигнала через МАР-киназу р38.
4. Исследование роли транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в EGF-индуцируемом аноитозе клеток А431 методом РНК-интерференции
Совокупность изложенных выше данных указывает на роль STAT1 или STAT3 в регуляции апоптоза клеток. Для того чтобы достоверно установить значение каждого из транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в клетках А431, мы сконструировали плазмиды на основе вектора mU6pro (Yu et al., 2002), экспрессирующие малые интерферирующие РНК (миРНК), направленные против STAT1 или STAT3, а также против EGFP (зеленого флуоресцентного белка, отсутствующего в человеческих клетках) в качестве контроля. Способность полученных конструкций направленно снижать уровень соответствующего STAT-белка была показана в экспериментах по временной трансфек-ции в клетках НЕК293 (см. дисс.). Поскольку эффективность трансфекции в клетках А431 мала, мы получили постоянные клеточные линии (далее обозначены sh-STATl, sh-STAT3 и sh-EGFP). Методом иммуноблоттинга доказано снижение количества (и, соответственно, фосфорилирования) целевого STAT-белка при отсутствии изменений в уровне другого STAT-белка или рецептора EGF (рис. 7). Таким образом была продемонстрирована пригодность полученных клонов для изучения роли STAT1 и STAT3 в клетках А431.
4.1. Направленное снижение количества STAT1, но не STAT3, значительно уменьшает чувствительность клеток А431 к нроанонготическому действию EGF (Grudinkin et al., 2007).
Используя два различных метода, реакцию МТТ (рис. 8) и подсчет клеток (см. дисс.), мы исследовали рост клеток со сниженным количеством STAT1 или
Рис. 9. Уменьшение количества STAT1, но не STAT3, снижает долю гипо-диплоидных клеток А43! при действии 1 EGF.
Клеточные линии, как на рис. 7. Клетки культивировали 2 сут в присутствии ("EGF") или в отсутствие ("Контроль") EGF. Прикрепленные и открепившиеся клетки объединяли, фиксировали, окрашивали иодидом пропидия и анализировали методом проточной цитофлуо-риметрии. Процент гиподиплоидных клеток (Sub-GI) и распределение диплоидных клеток по фазам клеточного цикла вычисляли в программе ModFit LT.
STAT3 в контроле и в присутствии EGF. Оба метода дали одинаковые результаты: уменьшение количества STAT1 или STAT3 не влияло на прирост клеток в контроле, а при действии EGF клетки sh-STATl, но не sh-STAT3 или sh-EGFP, приобретали устойчивость к EGF - клетки sh-STATl продолжали делиться в присутствии EGF. Методом проточной цитофлуориметрии не было выявлено различий в распределении клеток разных линий по циклу в контроле, однако при действии EGF мы наблюдали отсутствие характерного для линии А431 накопления гиподиплоидных клеток у линии sh-STATl (рис. 9), что говорит об уменьшении EGF-зависимой гибели клеток при снижении количества STAT1. Процент открепившихся клеток при действии EGF также был значительно меньше в линии sh-STATl (рис. 10А). Наконец, методами детекции экстрахромосомной ДНК (рис. 10Б) и иммуноблотом с использованием антител против активной каспазы 3 (рис. 10В) мы показали отсутствие EGF-зависимого апопто-за в клетках sh-STATl. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости транскрипционного фактора STAT1 для индукции апоптоза в клетках А431 при действии EGF и об отсутствии влияния STAT3 на пролиферацию и выживание клеток А431 как в контроле, так и в присутствии EGF.
4.2. В EGF-зависимое накопление ингибитора циклии-зависимых ки-наз p2T,vafl и ингибитора апоптоза Bcl-Хь в клетках А431 вовлечен транскрипционный фактор STAT3, но не STAT1.
Транскрипционные факторы семейства STAT регулируют апоптоз и пролиферацию путем индукции транскрипции ряда генов, включающих другие транскрипционные факторы, члены семейства Вс1-2, прокаспазы, Fas и FasL, циклины, ингибиторы циклин-зависимых киназ (Bromberg, 2001; Battle, Frank, 2002). Мы проанализировали EGF-зависимую индукцию антиапоптотического белка Bc1-Xl (Cory, Adams, 2002) и ингибитора циклин-зависимых киназ p21watl, способного также проявлять антиапоптотические свойства (Dotto, 2000). Гены обоих белков известны как непосредственные мишени транскрипционных
А-431
sh-EGFP sh-STAT1 sh-STAT3
О х н
x!
0
1 сг
Sub-GI 3.93 % Diploid:
GO-G1 36.76 °/а 40.15 % G2-M 23.09 %
Sub-GI 3.07 % Diploid:
GO-G1 36.37 °/о S 41.17 Vo
G2-M 22.46 °/a
Sub-GI 3.02% Diploid:
GO-G1 33.26 % S 47.50 %
G2-M 19.24 %
Sub-GI 2.66% Diploid:
GO-G1 32.97% S 44.05 %
G2-M 22.9B %
Sub-GI 27.96 % Diploid:
GO-Gl 54.26 % 15.20 % G2-M 30.55 %
Sub-GI 39.20 % Diploid:
GO-Gl 33.67% 5 24.20 %
G2-M 42.13 %
Sub-GI 3.84% Diploid:
GO-Gl 50.62 %
S 29.44 %
G2-M 19.94 %
Sub-GI 55.86 % Diploid: GO-Gl 37.41 S 18.30 %
G2-M 44.22 %
Рис. 10. Уменьшение количества STAT1, но не STAT3, ингибиру-ет EGF-индуцируемый апоптоз клеток А431.
Клеточные линии, как на рис. 7. А: Клетки культивировали в присутствии ("EGF") или отсутствии ("Контроль") EGF. Прикрепленные и открепившиеся клетки подсчитывали ежедневно. Б: Детекция экстрахромосомной ДНК необработанных клеток и клеток, обработанных 200 нг/мл EGF в течение 2 сут. В: Иммунологическое выявление активной (расщепленной по Asp 175) каспазы 3. В качестве положительного контроля апоп-тоза использовали клетки А431, обработанные 1 мкМ ставроспорина в течение 5 ч.
факторов семейства STAT, при этом Bcl-XL обычно индуцируется фактором STAT3 (Grad et al., 2000), a p21wafl в большинстве случаев - белком STAT1 (Chin et al., 1996), но известны случаи его индукции и при участии STAT3 (Sinibaldi et al., 2000; Barre et al., 2003). Методом иммуноблоттинга мы показа-
I wafl
Контроль _À_
Y
EGF
S tjj
со
-i
>
со
—I со
СО
-I
>
со
—I
>
->. "о
Вс1-Х,_
р21™
Тубуяин
Рис. 11. Уменьшение количества STAT3, но не STAT1, ингибирует EGF-зависимую экспрессию р21"аП и Bcl-XL. См. подпись к рис. 7.
ли, что как Bcl-XL, так и р21..... в клетках А431 накапливается при стимуляции EGF (рис. 11 ). Исследование клеточных линий, экспрессирующих миРНК, выявило снижение накопления обоих белков в клетках sh-STAT3, но не в клетках sh-STATl (рис. 11). Таким образом, в клетках А431 в EGF-индуцируемом накоплении как Bcl-XL, так и p21watl участвует транскрипционный фактор STAT3. Роль STAT3 в накоплении p21wa" может показаться неожиданной, так как обычно считается, что его экспрессия в клетках А431 зависит от STAT1 (Chin et al., 1996; Ohtsubo et al., 2000). Тем не менее, последнее не было доказано для действия EGF (в отличие от интерферона у), и применение метода РНК-интерференции позволило точно установить, какой именно транскрипционный фактор семейства STAT индуцирует накопление р2 lwafl в этом случае.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе показано, что EGF вызывает в клетках А431 как блоки клеточного цикла в фазах G2 и G1, так и апоптоз, причем индукция апоптоза оказывается определяющей для ингибирующего влияния EGF. Нами продемонстрировано участие рецептора EGF, тирозинкиназ Src-семейства, МАР-киназы р38 и транскрипционного фактора STAT1 (но не STAT3) в EGF-зависимой стимуляции апоптоза в клетках А431. Можно предположить, что все эти сигнальные молекулы являются компонентами одного пути: рецептор EGF через кина-зы семейства Src индуцирует фосфорилирование STAT1 по тирозину (Olayioye et al., 1999), а МАР-киназа р38 способна фосфорилировать STAT1 по серину (Goh et al., 1999). В отсутствие активности МАР-киназы р38 ингибируется про-апоптотический эффект EGF, но при этом сохраняется способность EGF вызывать остановку в клеточном цикле. Нижележащими компонентами проапопто-тического сигнального пути могут являться Fas и FasL, экспрессия которых индуцируется белком STAT1 (Xu et al., 1998). Подробно описанные в литературе механизмы независимой от фосфорилирования по тирозину индукции апоптоза транскрипционным фактором STAT1 (Kumar et al., ¡997; Battle and Frank, 2002) вряд ли реализуются при действии EGF на клетки А431, поскольку эксперименты с ингибитором Src-киназ и отсутствие эффекта трансфекции STAT 1F в клетки 8а говорят о важности фосфорилирования STAT1 по тирозину в данной системе.
Центральная роль STAT1 в индукции EGF-зависимой гибели кле* сана и для других опухолевых клеток различного происхождения с повь. л-ным содержанием рецептора EGF (Bromberg et al, 1998, Watanabe et al, 2001) В то же время нами установлено, что в клетках А431 не реализуется характерный для многих EGF-зависимых опухолевых клеток (Rubin Grandis et al, 1998, Kami et al, 1999, Garcia et al, 2001) механизм супрессии апоптоза через активацию STAT3 Следует подчеркнуть, что STAT3-зависимая индукция двух анти-апоптотических белков, Bcl-XL и p21wafl, не оказывает влияния на общую регуляцию апоптоза в клетках А431 Возможно, STAT3 индуцирует в клетках А431 также и проапоптотические пути, уравновешивающие антиапоптотические, приводя к отсутствию изменений в интегральном эффекте EGF в линии sh-STAT3 Мы полагаем, что биологический эффект активации STAT3 в клетках А431 может выражаться в явлениях, отличных от регуляции пролиферации и апоптоза - например, в регуляции адгезии или миграции клеток
ВЫВОДЫ
1 Эпидермальный фактор роста вызывает в клетках эпидермоидной карциномы А431 блоки клеточного цикла в фазах G2 и G1 и дальнейшую апоптоти-ческую гибель
2 Ингибирование активности МАР-киназы р38 приводит к супрессии апоптоза, вызываемого эпидермальным фактором роста в клеток А431, при сохранении блоков клеточного цикла
3 Для гибели клеток А431 в ответ на действие эпидермального фактора роста необходима активность тирозинкиназ семейства Src
4 Устойчивость к действию эпидермального фактора роста в клональных вариантах клеток А431 сопряжена с уменьшением количества и фосфорилиро-вания транскрипционного фактора STAT1 и утрачивается при эктопической экспрессии STAT1
5 Транскрипционный фактор STAT1, но не STAT3, необходим для проявления проапоптотического действия эпидермального фактора роста на клетки А431
6 В накоплении ингибитора циклин-зависимых киназ p21wafl и ингибитора апоптоза Bcl-XL при действии эпидермального фактора роста в клетках А431 участвует транскрипционный фактор STAT3
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Василенко К П , Грудинкин П.С., Арнаутов A M , Бурова Е Б , Никольский H H Динамика взаимодействия транскрипционного фактора STAT1 с интерна-лизованным рецептором ЭФР и кариоферинами а в ответ на стимуляцию клеток эпидермальным фактором роста Цитология 2001 43(2) 204-211
2. Бурова Е Б , Грудинкин П.С., Бардин А А , Гамалей И А , Никольский H H Нг02-индуцируемая активация транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 роль рецептора EGF и тирозинкиназы JAK2 Цитология 2001 43(12) 11531161
3. Грудинкин П.С., Багаева В В , Никольский H H EGF-индуцируемая переда-
ча сигнала в клонах клеток эпидермоидной карциномы линии А431 Цитология 2003 45(2) 158-161
4. Grudinkin P.S., Zemn V V , Kropotov А V , Dorosh V N , Nikolsky N N EGF-mduced apoptosis in A431 cells is dependent on STAT1, but not on STAT3 Eur J Cell Biol 2007 86(10) 591-603
Тезисы сообщений на конференциях
5. Арнаутов А М , Грудинкин П.С., Никольский Н Н Получение и характеристика антител к различным участкам кариоферина альфа Цитология 2000 42(3) 259
6. Василенко К П , Арнаутов А М , Грудинкин П.С., Бурова Е Б , Никольский Н Н ЭФР-зависимое образование комплексов фосфорилированного STAT1 с кариоферином альфа Цитология 2000 42(3) 269-270
7. Грудинкин П.С., Багаева В В , Никольский Н Н Морфологические особенности ядер апоптотических клеток А431 Цитология 2002 44 (9) 872-873
8. Грудинкин П.С., Никольский Н Н Подавление экспрессии транскрипционных факторов семейства STAT в клетках А431 при помощи малых интерферирующих РНК Цитология 2005 47(9) 806
9. Грудинкин П.С., Никольский Н Н Различная роль транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 при стимуляции клеток А431 эпидермальным фактором роста. Цитология 2006 48(9) 760
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Бурова Е Б , Грудинкин П С , Бардин А А , Гамалей И А , Никольский Н Н Н202-индуцируемая активация транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 роль рецептора EGF и тирозинкиназы JAK2 Цитология 2001 43(12) 1153-1161
Василенко К П , Грудинкин П С , Арнаутов А М, Бурова Е Б , Никольский Н Н Динамика взаимодействия транскрипционного фактора STAT1 с интернализованным рецептором ЭФР и кариоферинами а в ответ на стимуляцию клеток эпидермальным фактором роста Цитология 2001 43(2) 204-211
Грудинкин П С , Багаева В В , Никольский Н Н EGF-индуцируемая передача сигнала в клонах клеток эпидермоидной карциномы линии А431 Цитология 2003 45(2) 158-161
Гудкова Д А, Сорокин А Б Клеточные штаммы эпидермоидной карциномы А-431 с измененной рецепцией эпидермального фактора роста Цитология 1989 31(3) 319-323
Anto R J , Venkatraman М , Karunagaran D Inhibition of NF-кВ sensitizes A431 cells to epidermal growth factor-induced apoptosis, whereas its activation by ectopic expression of RelA confers resistance J Biol Chem 2003 278 25490-25498
Barre В, Avnl S , Coqueret О Opposite regulation of myc and p21wafl transcription by STAT3 proteins J Biol Chem 2003 278 2990-2996
Battle T E , Frank D A The role of STATs m apoptosis Curr Mol Med 2002 2 381-92 Behzadian MA , Shimizu N Variant of A431 cells isolated by ricm A-conjugated monoclonal antibody directed to EGF receptor phosphorylation of EGF receptor and phosphatidylinosi-tol Somat Cell Mol Genet 1985 11 579-591
Bromberg J F , Fan Z, Brown С , Mendelsohn J , Darnell J E Jr Epidermal growth factor-mduced growth inhibition requires Statl activation Cell Growth Differ 1998 9 505-512
Bromberg J F Activation of STAT proteins and growth control BioEssays 2001 23 161169
Buss J E , Kudlow J E, Lazar C S, Gill G N Altered epidermal growth factor (EGF-stimulated protein kinase activity in variant A431 cells with altered growth responses to EGF Proc Natl Acad Sci USA 1982 79 2574-2578
Busse D , Doughty R S , Ramsey T T , Russell W E , Price J O , Flanagan W M , Shawver L K, Arteaga C L Reversible G, arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27K,PI independent of MAPK activity J Biol Chem 2000 275 6987-6995
Chin Y E, Kitagawa M, Kuida K, Flavell R A, Fu X -Y Activation of the STAT signaling pathway can cause expression of caspase 1 and apoptosis Mol Cell Biol 1997 17 5328-5337
Chin Y E , Kitagawa M, Su W -C S , You Z -H , Iwamoto Y, Fu X -Y Cell growth arrest and induction of cyclin-dependent kinase inhibitor p21WAF,/CIP1 mediated by STAT Science 1996 272 719-722
Cory S , Adams J M The Bcl-2 family regulators of the cellular life-or-death switch Nature Rev Cancer 2002 2 647-656
DottoGP p21WAF1/Clpl more than a break to the cell cycle? Biochim Biophys Acta 2000 1471 M43-56
Fan Z, Lu Y, Wu X, DeBlasio A, Koff A , Mendelsohn J Prolonged induction of p21 Clp"WAFI/CDK2/PCNA complex by epidermal growth factor receptor activation mediates ligand-induced A431 cell growth inhibition J Cell Biol 1995 131 235-242
Garcia R , Bowman T L , Niu G , Yu H, Mmton S , Muro-Cacho C A , Cox C E , Falcone R , Fairclough R, Parsons S , Laudano A , Gazit A , Levitzki A , Kraker A , Jove R Constitutive activation of Stat3 by the Src and JAK tyrosine kinases participates in growth regulation of human breast carcinoma cells Oncogene 2001 20 2499-2513
Gill G N , Lazar C S Increased phosphotyrosine content and inhibition of proliferation in EGF-treatedA431 cells Nature 1981 293 305-307
Goh K C, Haque S J, Williams B R p38 MAP kinase is required for STAT1 serine phosphoiylation and transcriptional activation induced by interferons EMBO J 1999 18 56015608
Grad J M , Zeng X R , Boise L H Regulation of Bcl-XL a little bit of this and a little bit of STAT Curr Opin Oncol 2000 12 543-549
Grudinkin P S , Zemn V V, Kropotov A V , Dorosh V N, Nikolsky N N EGF-induced apoptosis in A431 cells is dependent on STAT1, but not on STAT3 Eur J Cell Biol 2007 86 591-603
Gulli L F , Palmer K C , Chen Y Q , Reddy K B Epidermal growth factor-induced apoptosis in A431 cells can be reversed by reducing the tyrosine kinase activity Cell Growth Differ 1996 7 173-178
Haigler H , Ash J F , Singer S J , Cohen S Visualization by fluorescence of the binding and internalization of epidermal growth factor in human carcinoma cells A-431 Proc Natl Acad Sci USA 1978 75 3317-3321
Jakus J, Yeudall W A Growth inhibitory concentrations of EGF induce p2lWAF1/Clpl and alter cell cycle control in squamous carcinoma cells Oncogene 1996 12 2369-2376
Kami R, Jove R, Levitzki A Inhibition of pp60°"Src reduces Bcl-XL expression and reverses the transformed phenotype of cells overexpressing EGF and HER-2 receptors Oncogene 1999 18 4654-4662
Kumar A , Commane M , Flickinger T W, Horvath C M , Stark G R Defective TNF-a-mduced apoptosis in STATl-null cells due to low constitutive levels of caspases Science 1997 278 1630-1632
Lyons A B Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement ofCFSE dye dilution J Immunol Methods 2000 243 147-54
MacLeod C L , Luk A , Castagnola J , Cronin M , Mendelsohn J EGF induces cell cycle arrest of A431 human epidermoid carcinoma cells J Cell Physiol 1986 127 175-182
Morazzani M, de Carvalho D D, Kovacic H, Smida-Rezgui S, Briand C, Penel C Monolayer versus aggregate balance in survival process for EGF-mduced apoptosis in A431 carcinoma cells Implication of ROS-p38 MAPK-integnn a2pi pathway Int J Cancer 2004 110 788-799
Ohtsubo M, Gamou S, Shimizu N Antisense oligonucleotide of WAF1 gene prevents EGF-mduced cell-cycle arrest in A431 cells Oncogene 1998 16 797-802
Ohtsubo M , Takanagi A , Gamou S , Shimizu N Interruption of NFkB-STATI Signaling Mediates EGF-Induced Cell-Cycle Arrest J Cell Physiol 2000 184 131-137
Olayioye M A , Beuvink I, Horsch K , Daly J M , Hynes N E ErbB receptor-induced activation of stat transcription factors is mediated by Src tyrosine kinases J Biol Chem 1999 274 17209-17218
Rubin Grandis J, Drenning S D , Chakraborty A, Zhou M Y, Zeng Q , Pitt A S , Tweardy D J Requirement of Stat3 but not Statl activation for epidermal growth factor receptor-mediated cell growth in vitro J Clin Invest 1998 102 1385-1392
Schlessinger J Cell signaling by receptor tyrosine kinases Cell 2000 103 211-225 Smibaldi D , Wharton W, Turkson J, Bowman T , Pledger W J, Jove R Induction of p2jWAFi/cipi an(j CyC|in pi expressl0n by the Src oncoprotein m mouse fibroblasts role of activated ST AT3 signaling Oncogene 2000 19 5419-5427
Smida Rezgui S , Honore S , Rognoni J B , Martin P M , Penel C Up-regulation of a2pi m-tegnn cell-surface expression protects A431 cell from epidermial growth factor-induced apoptosis Int J Cancer 2000 87 360-367
Toyoda M , Gotoh N, Handa H , Shibuya M Involvement of MAP kinase-mdependent protein kinase C signaling pathway in the EGF-induced p21WAF1/Clpl expression and growth inhibition of A431 cells Biochem Biophys Res Commun 1998 250 430-435
Van de Vijver M J, Kumar R, Mendelsohn J Ligand-mduced activation of A431 cell epidermal growth factor receptors occurs primarily by an autocrine pathway that acts upon receptors on the surface rather than intracellularly J Biol Chem 1991 266 7503-7508
Watanabe G , Kaganoi J , Imamura M, Shimada Y , Itami A , Uchida S , Sato F , Kitagawa M Progression of esophageal carcinoma by loss of EGF-STATI pathway Cancer J 2001 7 132139
Yu J -Y , DeRuiter S L , Turner D L RNA interference by expression of short-mterfermg RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells Proc Natl Acad Sci USA 2002 99 6047-6052
Лицензия J1P №020593 от 07 08 97
Подписано в печать 31 10 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 2206Ь
Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грудинкин, Павел Сергеевич
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.
ГЛАВА I. ВВЕДЕНИЕ.
1.1. АКТУ алы юсть проблемы. ф 1.2. Цель и задачи исследования.
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Передача сигнала от рецептора EGF.
2.1.1. Факторы роста и их рецепторы.
2.1.2. Эпидермальный фактор роста (EGF), другие факторы EGF-семейства и рецепторы семейства ЕгЪВ.И
2.1.3. Пути передачи сигнала от рецепторов факторов роста.
2.1.3.1. Ras и МАР-киназа ERK.
2.1.3.2. Стрессорные МАР-киназы.
2.1.3.3. Фосфатидилинозитол-З-киназа (PI-3-киназа).
2.1.3.4. Фосфолииаза С у.
2.1.3.5. Малые регуляторные ГТФазы семейства Rho.
2.1.3.6. Нерецепторные тирозинкиназы.
2.1.3.7. Транскрипционные факторы семейства NF>cB/ReI.
2.1.3.8. Активные формы кислорода.
2.1.3.9. Негативная регуляция передачи сигнала от факторов роста.
2.1.4. Активация сигнальных путей рецептором EGF.
2.1.5. Механизмы регуляции пролиферации клеток при действии факторов роста.
2.1.5.1. Клеточный цикл.
2.1.5.2. Методы исследования клеточного цикла.
2.1.5.3. Сигнальные пути регуляции клеточного цикла факторами роста.
2.1.6. Механизмы регуляции апоптоза при действии факторов роста.
И 2.1.6.1. Апоптоз.
2.1.6.2. Методы исследования апоптоза.
2.1.6.3. Сигнальные пути регуляции апоптоза факторами роста.
2.1.7. Рецепторы семейства Erb В в онкогенезе.
2.2. Транскрипционные факторы семейства STAT.
2.2.1. Строение и активация транскрипционных факторов семейства STA Т.
2.2.2. Действие транскрипционных факторов семейства STA Т на клетку и транскрипционные мишени STAT-белков.
2.2.3. Дополнительные механизмы регуляции активности STA Т-белков.
2.2.3.1. Активация фосфорилированием по тирозину.
2.2.3.2. Регуляторное фосфорилирование по серину.
2.2.3.3. Димеризация, взаимодействие с ДНК, активация транскрипции.
2.2.3.4.1 [егагивная регуляция STAT-нути.
2.2.3.5. Другие механизмы регуляции.
2.2.4. Механизмы активации транскрипционных факторов семейства STA Трецептором EGF.
2.2.5. Регуляция пролиферации и апоптоза транскрипционными факторами семейства STA Т.
2.3. Клетки эпидермоидной карциномы А431.
2.3.1. Характеристика клеток А431.
2.3.2. Действие EGF на клетки А431.
2.3.3. Клональиые варианты клеток А431, устойчивые к действию EGF.
2.3.4. Другие EGF-чувствительные клеточные линии.
2.4. Исследование функций белков методом РНК-интерференции.
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Культивирование клеток.
3.2. плазмиды.
3.3.Трансфекци и.
3.4. Электрофорез и иммуноблоттинг.
3.5. Антитела.
3.6. Оценка жизнеспособности клеток (МТТ).
3.7. Подсчет числа клеток.
3.8. Микроскопия.
3.9. Анализ олигонуклеосомной фрагментации ДНК.
3.10. Проточная цитометрия.
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. EGF индуцирует остановку клеток A431 в фазах клеточного цикла G2 и G1 и последующую апоптотическую гибель (Бурова и ДР., 2001; Грудинким и др., 2003; Grudinkin et al., 2007).
4.2. Исследование клональных вариантов клеток А431, устойчивых к действию EGF.
4.2.1. В метках клональных вариантов 1а, 8а и 11а снижено количество и фосфорилирование транскрипционного фактора STAT1 (Грудинкин и др., 2003).
4.2.2. Трансфекция STAT1 возвращает клеткам клонального варианта 8а чувствительность к действию EGF (Grudinkin et al., 2007).
4.3. ингиьирование тирозинкиназы рецептора EGF и тирозинкиназ семейства src защищает клы ки А431 от действия EGF, а ингибирование МАР-киназы Р38 блокирует EGF-индуцируемый апоптоз при сохранении блоков клеточного цикла (василенко и др., 2001 б; grudinkin et al., 2007).
4.4. Исследование роли транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в EGF-индуцируемом апоптозе клеток А431 методом РНК-интерференции.
4.4.1. Направленное снижение количества STA Т1, но не STA ТЗ, значительно уменьшает чувствительность клеток А431 к проапоптотическому действию EGF (Grudinkin et al., 2007).
4.4.2. В EGF-зависимое накопление ингибитора циклин-зависимых кииаз р2Га/' и ингибитора апоптоза Bcl-XL в клетках А431 вовлечен транскрипционный фактор STA ТЗ, по не STA Т1.
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.
5.1. Индукция апоптоза и остановка клеточного цикла в клетках А431 при действии EGF.
5.2. Устойчивые к действию EGF клональные варианты клеток А431.
5.3. Действие ингибиторов киназ на клетки А431.
5.4. Уменьшение экспрессии транскрипционных факторов семейства STAT в клетках А431 методом РНК-интерференции.
5.5. Предполагаемые механизмы индукции апоптоза при действии EGF на клетки А431.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция апоптоза и пролиферации клеток эпидермоидной карциномы А431 при действии эпидермального фактора роста"
1.1. Актуальность проблемы
Одной из важнейших задач молекулярной биологии и медицины является изучение механизмов опухолевой трансформации клеток. Понимание процессов, лежащих в основе превращения нормальной клетки в трансформированную, является базисом для поиска новых методов противораковой терапии. Особое значение имеют случаи, когда опухолевая клетка при трансформации приобретает особенности, позволяющие селективно индуцировать ее гибель. Примером является линия эпидермоидной карциномы человека А431, чувствительная к действию эпидермального фактора роста (epidermal growth factor, EGF).
Клеточная линия А431 - наиболее популярный объект исследования ученых, занимающихся передачей сигнала от EGF. Причиной этого служит повышенная экспрессия рецептора EGF (несколько миллионов молекул на клетку) вследствие амплификации кодирующего его гена (Haigler et al., 1978). Показано, что именно повышенное количество рецептора в сочетании с аутокринной секрецией одного из его лигандов, TGFa, является причиной бесконтрольной пролиферации клеток А431 (van de Vijver et al., 1991). В то же время, повышенная экспрессия рецептора EGF приводит к нетипичному ответу на EGF в высоких (наномолярных) концентрациях - ингибированию клеточного роста и гибели клеток. Подобное действие EGF известно для ряда линий трансформированных клеток, экспрессирующих повышенное количество рецептора EGF, и редко встречается среди других клеток. Исследование механизмов ответа клеток А431 на EGF позволит лучше понять механизмы опухолевой трансформации, пути возникновения "слабых мест" сигнальных систем опухолевых клеток, которые с необходимостью возникают в процессе трансформации и могут помочь в уничтожении опухоли, а также механизмы приобретения опухолевыми клетками вторичной устойчивости при селекции на противоопухолевом агенте.
Причины ингибирующего эффекта EGF не вполне ясны - литературе ука- . зывается на значение остановки клеточного цикла (MacLeod et al., 1986; Fan et al., 1995; Jakus, Yeudall, 1996; Ohtsubo et al., 1998) или апоптотической гибели' клеток (Gulli et al., 1996; Chin et al., 1997; Smida Rezgui et al., 2000; Anto et al., 2003; Morazzani et al., 2004) в этом процессе. He до конца выяснены и сигнальные пути, приводящие к реализации EGF-зависимого ингибирования прироста популяции клеток А431. Известно, что EGF передает сигнал за счет стимуляции тирозинкиназной активности рецептора EGF и последующей активации ряда сигнальных путей, включая ГТФазы семейств Ras и Rho, МАР-киназы, фосфо-липазу Су и различные изоформы протеинкиназы С, PI-3-киназу и PKB/Akt, ти-розинкиназы семейств Src, JAK и FAK, транскрипционные факторы STAT1, STAT3, STAT5 и NF-кВ (Schlessinger, 2000). Различные элементы передачи сигнала могут оказывать разное, подчас противоположное действие на пролиферацию или выживание клеток, и совокупный ответ определяется степенью активации сигнальных путей и их сочетанием. Имеются различные и достаточно противоречивые данные о роли этих компонентов верхних сигнальных путей в эффектах, оказываемых высокими концентрациями EGF на клетки А431. Так, есть сведения о значении киназы РКС 8 (Toyoda et al., 1998) и NF-кВ (Ohtsubo et al., 2000), однако наибольшее внимание исследователей привлекает транскрипционный фактор STAT1.
STAT-белки активируются фосфорилированием по тирозину и дополнительным фосфорилированием по серину, после чего димеризуются, транспортируются в ядро и активируют транскрипцию генов-мишеней (Bromberg, 2001). STAT1 чаще всего передает проапоптотический и антипролиферативный сигнал (Battle, Frank, 2002). Эксперименты с использованием доминантно-негативных конструкций (Bromberg et al., 1998а) и олигонуклеотидов-ловушек (Ohtsubo et al., 2000), а также корреляция между ингибирующим клеточный рост эффектом EGF и активацией STAT1 (Chin et al., 1996, 1997; Bromberg et al., 1998a) показали участие STAT1 в этом процессе. Тем не менее, использованные методы не позволили четко доказать роль STAT1, отделить его от других представителей семейства STAT и установить мишени действия STAT-белков, приводящие к реализации клеточного ответа в данной системе. Дифференциальный подход к изучению транскрипционных факторов семейства STAT важен еще и потому, что для другого представителя семейства, STAT3, доказана центральная роль в зависимой от рецептора EGF супрессии апоптоза, являющейся необходимым компонентом трансформированного фенотипа разнообразных опухолей, экспрессирующих повышенные количества рецептора EGF (Karni et al., 1999; Garcia et al., 2001; Rubin Grandis et al., 1998). Проверка универсальности данной модели и ее применимости к клеткам А431 также является неисследованной и актуальной задачей.
1.2. Цель и задачи исследования
Цель работы состояла в изучении регуляции апоптоза и пролиферации клеток эпидермоидной карциномы А431 эпидермальным фактором роста.
В работе были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1. установить биологические эффекты, вызываемые эпидермальным фактором роста на клетки эпидермоидной карциномы А431 ;
2. идентифицировать сигнальные пути, необходимые для проявления про-апоп-тотического эффекта эпидермального фактора роста;
3. определить механизмы формирования устойчивости клеток к проапоп-тотиче-скому действию эпидермального фактора роста;
4. методом РНК-интерференции установить роль транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в ответе клеток А431 на действие эпидермального фактора роста;
5. исследовать участие STAT1 и STAT3 в накоплении регуляторов клеточного цикла и апоптоза при действии эпидермального фактора роста на клетки А431.
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Грудинкин, Павел Сергеевич
ВЫВОДЫ
1. Эпидермальный фактор роста вызывает в клетках эпидермоидной карциномы А431 блоки клеточного цикла в фазах в2 и и дальнейшую апоп-тотическую гибель.
2. Ингибирование активности МАР-киназы р38 приводит к супрессии апоптоза, вызываемого эпидермальным фактором роста в клетках А431, при сохранении блоков клеточного цикла.
3. Для гибели клеток А431 в ответ на действие эпидермального фактора роста необходима активность тирозинкиназ семейства Бгс.
4. Устойчивость к действию эпидермального фактора роста в кло-нальных вариантах клеток А431 сопряжена с уменьшением количества и фос-форилирования транскрипционного фактора БТАП и утрачивается при эктопической экспрессии 8ТАТ1.
5. Транскрипционный фактор 8ТАТ1, но не 8ТАТЗ, необходим для проявления проапоптотического действия эпидермального фактора роста на клетки А431.
6. В накоплении ингибитора циклин-зависимых киназ р21таП и ингибитора апоптоза Вс1-Хь при действии эпидермального фактора роста в клетках А431 участвует транскрипционный фактор 8ТАТЗ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю Николаю Николаевичу Никольскому, коллегам и друзьям по работе, жене Ане Нелюдовой и своей маме, которая в течение многих лет стимулировала работу над диссертацией. Автор благодарит А.Б. Сорокина, Т.В. Поспелову, докторов Грина, Дэвис, Ларнера, Тернера и Хирано за любезно предоставленные клеточные линии, антитела и ДНК-конструкции.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. К.П. Василенко, П.С. Грудинкин, A.M. Арнаутов, Е.Б. Бурова, Н.Н.Никольский. Динамика взаимодействия транскрипционного фактора STAT1 с интернализованным рецептором EGF и кариоферинами б в ответ на стимуляцию клеток эпидермальным фактором роста. Цитология. 2001. 43(2). Стр. 204-211.
2. Е.Б. Бурова, П.С. Грудинкин, A.A. Бардин, И.А. Гамалей, H.H. Никольский. НгОг-индуцируемая активация транскрипционных факторов STAT1 и STAT3: роль рецептора EGF и тирозинкиназы JAK2. Цитология. 2001, 43(12). Стр. 1153-1161.
3. П.С. Грудинкин, В.В. Багаева, H.H. Никольский. EGF-индуцируемая передача сигнала в клонах клеток эпидермоидной карциномы линии А431. Цитология. 2003.45(2). Стр. 158-161.
4. P.S. Grudinkin, V.V. Zenin, A.V. Kropotov, V.N. Dorosh, N.N. Nikolsky. EGF-induced apoptosis in A431 cells is dependent on STAT1, but not on STAT3. Eur. J. Cell Biol. 2007. 86(10):591-603.
Тезисы сообщений на конференциях
5. A.M. Арнаутов, П.С. Грудинкин, Н.Н.Никольский. Получение и характеристика антител к различным участкам кариоферина альфа. XIII Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра». Цитология. 2000. 42(3): 259.
6. К.П. Василенко, A.M. Арнаутов, П.С. Грудинкин, Е.Б. Бурова, Н.Н.Никольский. XIII Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра», 19-21 . EGF-зависимое образование комплексов фосфорилиро-ванного STAT1 с кариоферином альфа. Цитология. 2000. 42(3). Стр. 269-270.
7. П.С.Грудинкин, В.В.Багаева, Н.Н.Никольский. Морфологические особенности ядер апоптотических клеток А431. XIV Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра». Цитология. 2002. 44 (9). Стр. 872-873.
8. П.С.Грудинкин, Н.Н.Никольский. Подавление экспрессии транскрипционных факторов семейства STAT в клетках А431 при помощи малых интерферирующих РНК. XV Всероссийское совещание «Структура и функции клеточного ядра». Цитология. 2005. 47(9). Стр. 806.
9. П.С.Грудинкин, Н.Н.Никольский. Различная роль транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 при стимуляции клеток А431 эпидермальным фактором роста. Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре». Цитология. 2006.48(9). Стр. 760.
ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе показано, что EGF вызывает в клетках А431 как блоки клеточного цикла в фазах G2 и G1, так и апоптоз, причем индукция апоптоза, сопровождающаяся откреплением клеток от субстрата, оказывается определяющей для ингибирующего влияния EGF. Мы показали необходимость тиро-зинкиназной активности рецептора EGF и нерецепторных тирозинкиназ семейства Src (известных как активаторы транскрипционных факторов семейства STAT при действии EGF) для проявления проапоптотического и антипролифе-ративного эффекта EGF. Активность МАР-киназы р38 оказалась важна для EGF-зависимой стимуляции апоптоза клеток А431, но не для индукции блоков клеточного цикла при действии EGF. Анализ клональных вариантов клеток А431, устойчивых к EGF, показал, что механизмом приобретения клетками устойчивости к действию EGF является снижение экспрессии STAT1. Трансфек-ция функционально-активного STAT1 возвращала клеткам чувствительность к EGF.
При помощи РНК-интерференции мы однозначно доказали роль транскрипционного фактора STAT1 (но не STAT3) в проведении проапоптотического и антипролиферативного сигнала от EGF в клетках А431. STAT3 оказался не задействован ни в базальном выживании и пролиферации клеток А431, ни в проведении проапоптотического сигнала после обработки EGF, хотя он и участвовал в EGF-зависимом накоплении белков с антиапоптотической и антипро-лиферативной функцией, Bcl-XL и p21wafl, а также в разборке межклеточных контактов.
Полученные результаты закладывают основу для дальнейшего изучения молекулярных механизмов проапоптотического действия EGF при трансформации клеток, вызванной повышенной экспрессией рецептора EGF. Данные по механизмам индукции апоптоза могут быть полезны в разработке методов противоопухолевой терапии, а анализ причин устойчивости клональных вариантов позволяет прогнозировать возможные осложнения.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грудинкин, Павел Сергеевич, Санкт-Петербург
1. Бурова Е. Б, Гончар И.В, Никольский Н. Н. 2003. Активация транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 при окислительном стрессе в клетках А431 включает Sre-зависимую трансактивацию рецептора EGF. Цитология. 45(5): 466-477.
2. Бурова Е. Б, Грудинкин П. С, Бардин А. А, Гамалей И. А, Никольский Н. Н. 2001. НгОг-индуцируемая активация транскрипционных факторов STAT1 и STAT3: роль рецептора EGF и тирозинкиназы JAK2. Цитология 43 (12): 11531161.
3. Боярчук Е.Ю. 1999. Анализ методом проточной цитофлуориметрии лим-фобластоидных линий человека в процессе индуцированного апоптоза. Выпускная квалификационная работа бакалавра. Научный руководитель Зенин В.В. Санкт-Петербург, СПбГУ.
4. Бутылин П.А. 2001. Механизмы активации транскрипционного фактора STAT1. Выпускная квалификационная работа бакалавра. Научный руководитель Василенко К.П. Санкт-Петербург, СПбГУ.
5. Василенко К.П, Бутылин П.А, Арнаутов А.М, Никольский H.H. 2001а. Роль тирозинкиназы Src в активации транскрипционного фактора STAT1. Цитология. 43(11): 1031-1037.
6. Грудинкин П.С, Багаева В.В, Никольский H.H. 2003. EGF-индуцируемая передача сигнала в клонах клеток эпидермоидной карциномы линии А431. Цитология. 45(2): 158-161.
7. Гудкова Д.А, Сорокин А.Б. 1989. Клеточные штаммы эпидермоидной карциномы А-431 с измененной рецепцией эпидермального фактора роста. Цитология. 31 (3): 319-323.
8. Иванов Д.Б, Филиппова М.П, Ткачук В.А. 2001. Структура и функции классических кадгеринов. Биохимия. 66(10): 1450-1464.
9. Копнин., Б.П. 2000. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрес-соров. Биохимия. 65(1): 2-27.
10. Никольский Н.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. Эпидермальный фактор роста. 1987. Л. "Наука". 200 с.
11. Никольский Н.Н., Василенко К.П. 2000. STAT-путь внутриклеточной сигнализации. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 36: 502-506.
12. Соркин А.Д., Богданова Н.П., Сорокин А.Б., Тесленко Л.В., Никольский Н.Н. 1989. Рециклирование EGF-рецепторных комплексов. Цитология. 31 (3): 300-311.
13. Фильченков А.А. 2003. Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций. Биохимия, 68(4): 453-466.
14. Чумаков, П.М. 2000. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия. 65(1): 34-47.
15. Abram C.L., Courtneidge S.A. 2000. Src family tyrosine kinases and growth factor signaling. Exp. Cell. Res. 254: 1-13.
16. Adler V., Yin Z., Tew K.D., Ronai Z. 1999. Role of redox potential and reactive oxigen species in stress signaling. Oncogene. 18: 6104-6111.
17. Agrawal S., Agarwal M. L., Chatterjee-Kishore M., Stark G. R., Chisolm G. M. 2002. Stat 1-dependent, p53-independent expression of p21wafl modulates oxysterol-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 22: 1981-1992.
18. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter. Cell Communication. Chapter 15 in: Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York and London: Garland Publishing, 2002.
19. Andersen P, Pedersen MW, Woetmann A, Villingshoj M, Stockhausen MT, Odum N, Poulsen HS. 2008. EGFR induces expression of IRF-1 via STAT1 and STAT3 activation leading to growth arrest of human cancer cells. Int. J. Cancer. 122: 342-349.
20. Anto R.J., Venkatraman M., Karunagaran D. 2003. Inhibition of NF-kB sensitizes A431 cells to epidermal growth factor-induced apoptosis, whereas itsactivation by ectopic expression of RelA confers resistance. J. Biol. Chem. 278: 25490-25498.
21. Armstrong DK, Kaufmann SH, Ottaviano YL, Furuya Y, Buckley JA, Isaacs JT, Davidson NE. 1994. Epidermal growth factor-mediated apoptosis of MDA-MB-468 human breast cancer cells. Cancer Res. 54: 5280-5283.
22. Ashkenazi A., Dixit V.M. 1998. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281: 1305-1308.
23. Bach E.A., Aguet M., Schreiber R.D. 1997. The IFNy receptor: a paradigm for cytokine signaling. Annu. Rev. Immunol. 15: 563-591.
24. Bae Y.S., Kang S.W., Seo M.S., Baines I.C., Tekle E., Chock P.B., Rhee S.G. 1997. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. Role in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation. J. Biol. Chem. 272: 217-221.
25. Barré B., Avril S., Coqueret O. 2003. Opposite regulation of myc and p21wafl transcription by STAT3 proteins. J. Biol. Chem. 278: 2990-2996.
26. Battle, T.E., Frank, D.A. 2002. The role of STATs in apoptosis. Curr. Mol. Med. 2:381-92.
27. Bazley L.A., Gullick W.J. 2005. The epidermal growth factor receptor family. Endocr. Relat. Cancer. 12. Suppl. 1:S 17-27.
28. Beguinot, L., Lyall, R.M., Willingham, M.C., Pastan, I. 1984. Down-regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells is due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 23842388.
29. Behzadian M. A., Shimizu N. 1985. Variant of A431 cells isolated by ricin A-conjugated monoclonal antibody directed to EGF receptor: phosphorylation of EGF receptor and phosphatidylinositol. Somat. Cell. Mol. Genet. 11: 579-591.
30. Bienvenu F., Gasean H., Coqueret O. 2001. Cyclin D1 represses STAT3 activation through a Cdk4-independent mechanism. J. Biol. Chem. 276: 1684016847.
31. Biscardi J.S., Maa M.C., Tice D.A., Cox M.E., Leu T.H., Parsons S.J. 1999. c-Src-mediated phosphorylation of the epidermal growth factor receptor on Tyr845 and Tyr 1101 is associated with modulation of receptor function. J. Biol. Chem. 274: 8335-8343.
32. Bishop A.L., Hall A. 2000. Rho GTPases and their effector proteins. Biochem. J. 348:241-255.
33. Blagosklonny M.V. 2007. Mitotic arrest and cell fate: why and how mitotic inhibition of transcription drives mutually exclusive events. Cell Cycle. 6: 70-74.
34. Blobel C. 2005. ADAMs: key components in EGFR signalling and development. Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 6: 32-43.
35. Bromberg J. F., Fan Z., Brown C., Mendelsohn J., Darnell J. E. Jr. 1998a. Epidermal growth factor-induced growth inhibition requires Statl activation. Cell Growth Differ. 9: 505-512.
36. Bromberg J.F., Horvath C.M., Besser D., Lathem W.W., Darnell J.E. Jr. 1998b. Stat3 activation is required for cellular transformation by v-src. Mol. Cell. Biol. 18: 2553-2558.
37. Bromberg J.F., Wrzeszczynska M.H., Devgan G., Zhao Y., Pestell R.G., Al-banese C., Darnell J.E. Jr. 1999. STAT3 as an oncogene. Cell. 98: 295-303.
38. Bromberg JF, Horvath CM, Wen Z, Schreiber RD, Darnell JE, Jr. 1996. Transcriptionally active Statl is required for the antiproliferative effects of both IFN-a and IFN-y. Proc. Natl. Acad. Sci. USA;93: 7673-7678.
39. Bromberg, J.F. 2001. Activation of STAT proteins and growth control. BioEssays. 23: 161-169.
40. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. 2002. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296: 550-553.
41. Buchman T. 2005. RNAi. Crit. Care. Med. 33: S441-S443.
42. Buss J. E., Kudlow J. E., Lazar C. S., Gill G. N. 1982. Altered epidermal growth factor (EGF)-stimulated protein kinase activity in variant A431 cells with altered growth responses to EGF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 2574-2578.
43. Calin GA, Croce CM. 2006. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6:857-866.
44. Cao L., Yao Y., Lee V., Kiani C., Spaner D., Lin Z., Zhang Y., Adams M. E., Yang B. B. 2000. Epidermal growth factor induces cell cycle arrest and apoptosis of squamous carcinoma cells through reduction of cell adhesion. J. Cell. Biochem. 77: 569-583.
45. Carpenter G. 2003. Nuclear localization and possible functions of receptor tyrosine kinases. Curr. Opin. Cell. Biol. 15: 143-148.
46. Carpenter G., Ji Q. 1999. Phospholipase C-y as a signal-transducing element. Exp. Cell Res. 253: 15-24.
47. Chajry N., Martin P. M., Cochet C., Berthois Y. 1996. Regulation of p42 mitogen-activated-protein kinase activity by protein phosphatase 2A under conditions of growth inhibition by epidermal growth factor in A431 cells. Eur. J. Biochem. 235: 97-102.
48. Chajry N., Martin P. M., Pages G., Cochet C., Afdel K., Berthois Y. 1994. Relationship between the MAP kinase activity and the dual effect of EGF on A431 cell proliferation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 984-990.
49. Chang E.H., Ridge J., Black R., Zou Z.Q., Masnyk T., Noguchi P., Harford J.B. 1987. Interferon-gamma induces altered oncogene expression and terminal differentiation in A431 cells. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 186: 319-326.
50. Chatterjee-Kishore M., Wright K. L., Ting J. P., Stark G. R. 2000. How Statl mediates constitutive gene expression: a complex of unphosphorylated Statl and IRF1 supports transcription of the LMP2 gene. EMBO J. 19: 4111-4122.
51. Chawla-Sarkar M., Linder D.J., Liu Y.-F., Williams B.R., Sen G.C., Silverman R.H,, Borden E.C. 2003. Apoptosis and interferons: Role of interferon-stimulated genes as mediators of apoptosis. Apoptosis 8: 237-249.
52. Chen J.K., Lin S.S. 1993. Stimulation or inhibition of A431 cell growth by EGF is directly correlated with receptor tyrosine kinase concentration but not with PLC y activity. Life Sci. 53: 635-642.
53. Chen K.Y., Huang L.M., Kung H.J., Ann D.K., Shih H.M. 2004. The role of tyrosine kinase Etk/Bmx in EGF-induced apoptosis of MDA-MB-468 breast cancer cells. Oncogene. 23: 1854-1862.
54. Chen X., Zhao Y., Darnell J.E., Vinkemeier U., Jerusalmi D. D., Kuriyan J. 1998. Crystal structure of a tyrosine phosphorylated STAT1 dimer bound to DNA. Cell. 93: 827-839.
55. Chin Y. E., Kitagawa M., Kuida K., Flavell R. A. and Fu X.-Y. 1997. Activation of the STAT signaling pathway can cause expression of caspase 1 and apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17: 5328-5337.
56. Chin Y. E., Kitagawa M., Su W.-C. S., You Z.-H., Iwamoto Y., Fu X.-Y. 1996. Cell growth arrest and induction of cyclin-dependent kinase inhibitor p21WAF,/CIP1 mediated by STAT. Science. 272: 719-722.
57. Chung J., Uchida E., Grammer T.C., Blenis J. 1997. STAT3 serine phosphorylation by ERK-dependent and -independent pathways negatively modulates its tyrosine phosphorylation. Mol. Cell. Biol. 17: 6508-6516.
58. Ciemerych M.A., Sicinski P. 2005. Cell cycle in mouse development. Oncogene. 24:2877-2898.
59. Coffer P. J., Kruijer W. 1995. EGF receptor deletions define a region specifically mediating STAT transcription factor activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210: 74-81.
60. Cohen S. 1962. Isolation of a mouse submaxillary gland protein acceleration incisor eruption and eyelid opening in the newborn animal. J. Biol. Chem. 237: 15551562.
61. Cohen S., Levi-Montalcini R., Hamburger V. 1954. A nerve growth-stimulating factor isolated from sarcom AS 37 and 180. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 40: 1014-1018.
62. Coqueret O., Gascan H. 2000. Functional interaction of STAT3 transcription factor with the cell cycle inhibitor p21WAFl/CIPl/SDIl. J. Biol. Chem. 275: 1879418800.
63. Cory S., Adams J.M. 2002. The Bcl-2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nature Rev. Cancer. 2: 647-656.
64. Cox A.D., Der C.J. 2003. The dark side of Ras: regulation of apoptosis. Oncogene. 22:8999-9006.
65. Czauderna F, Santel A, Hinz M, Fechtner M, Durieux B, Fisch G, Leenders F, Arnold W, Giese K, Klippel A, Kaufmann J. 2003. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic Acids Res. 31:el27.
66. Danielsen AJ, Maihle NJ. 2002. The EGF/ErbB receptor family and apoptosis. Growth Factors. 20: 1-15.
67. Darnell J.E., Jr. STATs and gene regulation. 1997. Science. 277: 1630-1635.
68. Datta S.R., Brunet A., Greenberg M.E. 1999. Cellular survival: a play in three Akts. Genes Dev. 13(22): 2905-2927.
69. David M., Wond L., Flavell R., Thompson S. A., Wells A., Larner A. C., Johnson G. R. 1996. STAT activation by epidermal growyh factor (EGF) and am-phiregulin. J. Biol. Chem. 271: 9185-9188.
70. Dawson J.P., Berger M.B., Lin C.C., Schlessinger J., Lemmon M.A., Ferguson K.M. 2005. Epidermal growth factor receptor dimerization and activation require ligand-induced conformational changes in the dimer interface. Mol. Cell. Biol. 25: 7734-7742.
71. Decker T., Kovarik P. 2000. Serine phosphorylation of STATs. Oncogene. 19: 2628-2637.
72. Dikic I., Giordano S. 2003. Negative receptor signaling. Curr. Opin. Cell. Biol. 15: 128-135.
73. Dotto, G.P. 2000. p2lWAFI/cipI: more than a break to the cell cycle? Biochim. Biophys. Acta. 1471: M43-56.
74. Dowlati A., Nethery D., Kern J.A. 2004. Combined inhibition of epidermal growth factor receptor and JAK/STAT pathways results in greater growth inhibition in vitro than single agent therapy. Mol. Cancer. Ther. 3: 459-463.
75. Downward J. 1997. Cell cycle: Routine role for Ras. Curr. Biol. 7: R2581. R260.
76. Dragovich T., Rudin C.M., Thompson C.B. 1998. Signal transduction pathways that regulate cell survival and cell death. Oncogene. 17: 3207-3213.
77. Droge W. 2002. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82: 47-95.
78. Dutta J., Fan Y., Gupta N., Fan G., Gelinas C. 2006. Current insights into the regulation of programmed cell death by NF-kappaB. Oncogene. 25: 6800-68016.
79. Dutta P.R., Maity A. 2007. Cellular responses to EGFR inhibitors and their relevance to cancer therapy. Cancer Lett. 254: 165-177.
80. Dykxhoorn D.M., Novina C.D., Sharp P.A. 2003. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4: 457-467.
81. Ekholm S.V., Reed S.I. 2000. Regulation of G1 cyclin-dependent kinases in the mammalian cell cycle. Curr. Opin. Cell. Biol. 12: 676-684.
82. Evan C., Littlewood T. 1998. A matter of life and cell death. Science. 281: 1317-1322.
83. Evdonin A.L., Guzhova I.V., Margulis B.A., Medvedeva N.D. 2004. Phospholipase C inhibitor, U73122, stimulates release of Hsp-70 stress protein from A431 human carcinoma cells. Cancer Cell. Int. 4, 2.
84. Evdonin A.L., Martynova M.G., Bystrova O.A., Guzhova I.V., Margulis B.A., Medvedeva N.D. 2005. The release of Hsp70 from A431 carcinoma cells is mediated by secretory-like granules. Eur. J. Cell. Biol. 85: 443-455.
85. Faleiro L., Lazebnik Y. 2000. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J.Cell. Biol. 151:951-959.
86. Fan Z., Lu Y., Wu X., DeBlasio A., Koff A., Mendelsohn J. 1995. Prolonged induction of p21cipl/WAF,/CDK2/PCNA complex by epidermal growth factor receptor activation mediates ligand-induced A431 cell growth inhibition. J. Cell. Biol. 131: 235-242.
87. Fan Z., Lu Y., Wu X., Mendelsohn J. 1994. Antibody-induced epidermal growth factor receptor dimerization mediates inhibition of autocrine proliferation of A431 squamous carcinoma cells. J. Biol. Chem. 269: 27595-27602.
88. Fan Z., Shang B. Y., Lu Y., Chou J. L., Mendelsohn J. 1997. Reciprocal changes in p27KipI and p21Clpl in growth inhibition mediated by blockade or overstimulation of epidermal growth factor receptors. Clin. Cancer. Res. 3: 19431948.
89. Fang M., Liu B., Schmidt M., Lu Y., Mendelsohn J., Fan Z. 2000. Involvement of p21Wafl in mediating inhibition of paclitaxel-induced apoptosis by epidermal growth factor in MDA-MB-468 human breast cancer cells. Anticancer Res. 20: 103111.
90. Fantl W.J., Johnson D.E., Williams L.T. 1993. Signalling by receptor tyrosine kinases. Annu. Rev. Biochem. 62: 453-481.
91. Filmus J., Pollak M.N., Cairncross J.G., Buick R.N. 1985b. Amplified, overex-pressed and rearranged epidermal growth factor receptor gene in a human astrocytoma cell line. Biochem. Biophys. Res. Commun. 131: 207-215.
92. Fire A, Xu S, Montgomery M.K., Kostas S.A, Driver S.E, Mello C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391: 806-811.
93. Fischer O.M, Hart S, Gschwind A., Ullrich A. 2003. EGFR signal transactiva-tion in cancer cells. Biochem. Soc. Transact. 31: 1203-1208.
94. Fong W.F, Leung C.H, Lam W, Wong N.S, Cheng S.H. 2001. Epidermal growth factor induces Gadd45 (growth arrest and DNA damage inducible protein) expression in A431 cells. Biochim. Biophys. Acta. 1517: 250-256.
95. Fornace A.J. 1992. Mammalian genes induced by radiation; activation of genes associated with growth control. Annu. Rev. Genet. 26: 505-524.
96. Fritsche M, Mundt M, Merkle C, Jahne R, Groner B. 1998. p53 suppresses cytokine induced, Stat5 mediated activation of transcription. Mol. Cell. Endocrinol. 143:143-154.
97. Fu X.-Y. 1992. A transcription factor with SH2 and SH3 domains is directly activated by an interferon alpha-induced cytoplasmic protein tyrosine kinase(s). Cell. 70(2):323-35.
98. Fu X.-Y, Zhang J.J. 1993. Transcription factor p91 interact with the epidermal factor receptor and mediates activation of the c-fos gene promoter. Cell. 74: 11351145.
99. Gadina M., Hilton D., Johnston J.A., Morinobu A., Lighvani A., Zhou Y.-J., Visconti R., O'Shea J.J. 2003. Signaling by Type I and II cytokine receptors: ten years after. Curr. Opin. Immunol. 13: 363-373.
100. Garrido C., Kroemer G. 2004. Life's smile, death's grin: vital functions of apoptosis-executing proteins. Curr. Opin. Cell. Biol. 16: 639-646.
101. Gazit A., Yaish P., Gilon C., Levitzki A. 1989. Tyrphostins I: synthesis and biological activity of protein tyrosine kinase inhibitors. J. Med. Chem. 32: 23442352.
102. Gill, G.N., Lazar, C.S. 1981. Increased phosphotyrosine content and inhibition of proliferation in EGF-treated A431 cells. Nature. 293: 305-307.
103. Goh K.C., Haque S.J., Williams B.R. 1999. p38 MAP kinase is required for STAT1 serine phosphorylation and transcriptional activation induced by interferons. EMBOJ. 18:5601-5608.
104. Gomperts B., Kramer I., Tatham P. 2002. Signal Transduction. Academic1. Press.
105. Gosselin K., Abbadie C. 2003. Involvement of Rel/NF-KB transcription factors in senescence. Exp. Gerontol. 38:1271-1283.
106. Grad, J.M., Zeng, X.R., Boise, L.H. 2000. Regulation of Bcl-XL: a little bit of this and a little bit of STAT. Curr. Opin. Oncol. 12: 543-549.
107. Green, D.R., Reed, J.C. 1998. Mitochondria and apoptosis. Science. 281: 13091312.
108. Gregory R.I., Shiekhattar R. 2005. MicroRNA biogenesis and cancer. Cancer Res. 65:3509-3512.
109. Grovdal L.M., Stang E., Sorkin A., Madshus I.H. 2004. Direct interaction of Cbl with pTyr 1045 of the EGF receptor (EGFR) is required to sort the EGFR to lysosomes for degradation. Exp. Cell. Res. 300:388-395.
110. Grudinkin P.S., Zenin V.V., Kropotov A.V., Dorosh V.N., Nikolsky N.N. 2007. EGF-induced apoptosis in A431 cells is dependent on STAT1, but not on STAT3. Eur. J. Cell. Biol. 86: 591-603.
111. Gulli L.F., Palmer K.C., Chen Y.Q., Reddy K.B. 1996. Epidermal growth factor-induced apoptosis in A431 cells can be reversed by reducing the tyrosine kinase activity. Cell. Growth. Differ. 7: 173-178.
112. Habib A.A., Hognason T., Ren J., Stefansson K., Ratan R.R. 1998. The epidermal growth factor receptor associates with and recruits phosphatidylinositol 3-kinase to the platelet-derived growth factor (3 receptor. J. Biol. Chem. 273: 68856891.
113. Haigler H., Ash J. F., Singer S. J., Cohen S. 1978. Visualization by fluorescence of the binding and internalization of epidermal growth factor in human carcinoma cells A-431. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75: 3317-3321.
114. Heatwole V.M. 1999. TUNEL assay for apoptotic cells. Methods. Mol. Biol. 115: 141-148.
115. Heldin C.-H. 1995. Dimerization of cell surface receptors in signal transduction. Cell. 80: 213-223.
116. Herbst R.S. 2004. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59: suppl., 21-26.
117. Hirai M., Kobayashi M., Shimizu N. 1990. Reduced tyrosine phosphorylation and nonresponsiveness to EGF-mediated cytotoxicity in EGF receptor-hyperproducing UCVA-1 cells. Cell. Signal. 2: 245-252.
118. Hognason T., Chatterjee S., Vartanian T., Ratan R.R., Ernewein K.M., Habib A.A. 2001. Epidermal growth factor receptor induced apoptosis: potentiation by inhibition of Ras signaling. FEBS Lett. 491: 9-15.
119. Holbro T., Civenni G., Hynes N.E. 2003. The ErbB receptors and their role in cancer progression. Exp. Cell. Res. 284: 99-110.
120. Horvai A.E., Xu L., Korzus E., Brard G., Kalafus D., Mullen T.-M., Rose D.W., Rosenfeld M.G., Glass C.K. 1997. Nuclear integration of JAK/STAT and Ras/AP-1 signaling by CBP and p300. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 1074-1079.
121. Hoshino A., Saint Fleur S., Fujii H. 2006. Regulation of Statl expression by phelylalanine 172 in the coiled-coil domain. Biochem. Biophys. Res. Comm. 346: 1062-1066.
122. Hubbard S.R., Miller W.T. 2007. Receptor tyrosine kinases: mechanisms of activation and signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 19: 117-123.
123. Hubbard S.R., Till J.H. 2000. Protein tyrosine kinase structure and function. Annu. Rev. Biochem. 69: 373-398.
124. Jaattela M. 2004. Multiple cell death pathways as regulators of tumour initiation and progression. Oncogene. 23: 2746-2756.
125. Jain N., Zhang T., Fong S.L., Lim C.P., Cao X. 1998. Repression of Stat3 activity by activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK). Oncogene. 17: 3157-3167.
126. Jakus J., Yeudall W. A. 1996. Growth inhibitory concentrations of EGF induce p21WAFI/Cipl and alter cell cycle control in squamous carcinoma cells. Oncogene. 12: 2369-2376.
127. Jarpe M.B., Widmann C., Knall C., Schlesinger T.K., Gibson S., Yujiri T.,Fanger G.R., Gelfand E.W., Johnson G.L. 1998. Anti-apoptotic versus proapoptotic signal transduction: checkpoints and stop signs along the road to death. Oncogene. 17: 1475-1482.
128. Jimeno A., Hidalgo M. 2005. Blockade of epidermal growth factor receptor (EGFR) activity. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 53: 179-192.
129. Jin F., Reynolds A.B., Hines M.D., Jensen P.J., Johnson K.R., Wheelock M.J.1999. Src induces morphological changes in A431 cells that resemble epidermal differentiation through an SH3- and Ras-independent pathway. J. Cell. Sci. 112: 29132924.
130. Jo M., Stolz D.B., Esplen J.E., Dorko K., Michalopoulos G.K., Strom S.C.2000. Cross-talk between Epidermal Growth Factor Receptor and c-Met Signal Pathways in Transformed Cells. J. Biol. Chem. 275: 8806-8811.
131. Johnes S.M., Kazlauskas A. 2000. Connecting signaling and cell cycle progression in growth factor-stimulated cells. Oncogene. 19: 5558-5567.
132. Johnson M.R., Valentine C., Basilico C., Mansukhani A. 1998.FGF signaling activates STAT1 and p21 and inhibits the estrogen response and proliferation of MCF-7 cells . Oncogene. 16: 2647-2656.
133. Kaplan DH, Shankaran V, Dighe AS, Stockert E, Aguet M, Old LJ, Schreiber RD. 1998. Demonstration of an interferon gamma-dependent tumor surveillance system in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci USA. 95: 7556-7561.
134. Kami R., Jove R., Levitzki A. 1999. Inhibition of pp60c'Src reduces Bcl-XL expression and reverses the transformed phenotype of cells overexpressing EGF and HER-2 receptors. Oncogene. 18: 4654-4662.
135. Kaufmann A.M., Lichtner R.B., Schirrmacher V., Khazaie K. 1996. Induction of apoptosis by EGF receptor in rat mammary adenocarcinoma cells coincides with enhanced spontaneous tumour metastasis. Oncogene. 13: 2349-58.
136. Kawamoto T., Mendelsohn J., Le A., Sato G. H., Lazar C. S., Gill G. N. 1984. Relation of epidermal growth factor receptor concentration to growth of human epidermoid carcinoma A431 cells. J. Biol. Chem. 259: 7761-7766.
137. Keenan S.M., Bellone C., Baldassare J.J. 2001. CDK2 nucleocytoplasmic translocation is regulated by extracellular regulated kinase (ERK). J. Biol. Chem. 276:22404-22409.
138. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. 1972. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue. Br. J. Cancer. 26: 239-257.
139. Kim G.Y., Mercer S.E., Ewton D.Z., Yan Z., Jin K., Friedman E. 2002. The stress-activated protein kinases p38 alpha and JNK1 stabilize p21c,pl by phosphorylation. J. Biol. Chem. 277: 29792-29802.
140. Kim H.-H., Sierke S.L., Koland J.G. 1994. Epidermal growth factor-dependent association of phosphatidylinositol 3-kinase with the erbB3 gene product. J. Biol. Chem. 269: 24747-24755.
141. Kim J.-S., He L., Lemasters J.J. 2003. Mitochondrial permeability transition: a common pathway to necrosis and apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 304: 463-470.
142. Kim T.K., Maniatis T. 1996. Regulation of interferon-y-activated STAT1 by the ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273: 1717-1719.
143. King I.C., Sartorelli A.C. 1986. The relationship between epidermal growth factor receptors and the terminal differentiation of A431 carcinoma cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 140: 837-843.
144. Kjoller L., Hall A. 1999. Signaling to Rho GTPases. Exp. Cell. Res. 253: 166179.
145. Klemm J.D., Schreiber S., Crabtree G.R. 1998. Dimerization as a regulatory mechanism in signal transduction. Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592.
146. Kloth M.T., Laughlin K.K., Biscardi J.S., Boerner J.L., Parsons S.J., Silva C.M. 2003. STAT5b, a mediator of synergism between c-Src and the epidermal growth factor receptor. J. Biol. Chem. 278: 1671-1679.
147. Kortylewski M., Feld F., Krüger K.D., Bahrenberg G., Roth R.A., Joost H.G., Heinrich P.C., Behrmann I., Barthel A. 2003. Akt modulates STAT3-mediated gene expression through a FKHR (FOXOla)-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278: 5242-5249.
148. Krymskaya V., Hoffman R., Eszterhas A., Kane S., Ciocca V., Panettieri R.A.Jr. 1999. EGF activates ErbB-2 and stimulates phosphatidylinositol 3-kinase in human airway smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 276 (Lung Cell. Mol. Physiol. 20): L246-L255.
149. Kumar A., Commane M., Flickinger T.W., Horvath C.M., Stark G.R. 1997. Defective TNF-a-induced apoptosis in STATl-null cells due to low constitutive levels of caspases. Science. 278: 1630-1632.
150. Kumar Pal S., Pegram M. 2005. Epidermal growth factor receptor and signal transduction: potential targets for anti-cancer therapy. Anticancer Drugs. 16: 483— 494.
151. Kuninger D., Stauffer D., Eftekhari S., Wilson E., Thayer M., Rotwein P. 2004. Gene disruption by regulated short interfering RNA expression, using a two-adenovirus system. Hum. Gene. Ther. 15:. 1287-1292.
152. MacLeod C.L., Luk A., Castagnola J., Cronin M., Mendelsohn J. 1986. EGF induces cell cycle arrest of A431 human epidermoid carcinoma cells. J. Cell. Physiol. 127:175-182.
153. Maher S.G., Romero-Weaver A.L., Scarzello A.J., Gamero A.M. 2007. Interferon: Cellular Executioner or White Knight? Curr. Med. Chem. 14: 1279-1289.
154. Malphettes L., Fussenegger M. 2004. Macrolide- and tetracycline-adjustable siRNA-mediated gene silencing in mammalian cells using polymerase II-dependent promoter derivatives. Biotechnol. Bioeng. 88: 417-425.
155. Marshall C. 1999. How do small GTPase signal transduction pathways regulate cell cycle entry? Curr. Opin. Cell. Biol. 11: 732-736.
156. Martinez-Gac L, Alvarez B, Garcia Z, Marques M, Arrizabalaga M, Carrera A.C. 2004. Phosphoinositide 3-kinase and Forkhead, a switch for cell division. Bio-chem. Soc. Transact. 32: 360-361.
157. Masui H, Kawamoto T, Sato J. D, Wolf B, Sato G., Mendelsohn J. 1984. Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies. Cancer Res. 44: 1002-1007.
158. Matsukura S, Jones P.A, Takai D. 2003. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucl. Acid Res. 31: e77.
159. Mayo K.H. 1995. Epidermal growth factor from the mouse. Biochemistry. 24: 3783-3794.
160. Mercurio F., Manning A.M. 1999. NF-kB as a primary regulator of the stress response. Oncogene. 18: 6163- 6171.
161. Miyagishi M, Taira K. 2002. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotech. 19: 497-500.
162. Mowen K.A, Tang J, Zhu W, Schurter B.T, Shuai K, Herschman H.R, David M. 2001. Arginine methylation of STAT 1 modulates IFNalpha/beta-induced transcription. Cell. 104:731-741.
163. Nair J.S, DaFonseca C.J, Tjernberg A, Sun W, Darnell J.E. Jr, Chait B.T, Zhang J.J. 2002. Requirement of Ca2+ and CaMKII for Statl Ser-727 phosphorylation in response to IFN-gamma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 5971-5976.
164. Ndubuisi M.I., Guo G.G., Fried V.A., Etlinger J.D., Sehgal P.B. 1999. Cellular physiology of STAT3: Where's the cytoplasmic monomer? . J. Biol. Chem. 274: 25499-25509.
165. Nelson K.L., Rogers J.A., Bowman T.L., Jove R., Smithgall T.E. 1998. Activation of STAT3 by the c-Fes protein-tyrosine kinase . J. Biol. Chem. 273: 7072-7077.
166. Nichols J., Chambers I., Taga T., Smith A. 2001. Physiological rationale for responsiveness of mouse embryonic stem cells to gpl30 cytokines. Development. 128: 2333-2339.
167. Niu G, Bowman T, Huang M, Shivers S, Reintgen D, Daud A, Chang A, Kraker A, Jove R, Yu H. 2002. Roles of activated Src and Stat3 signaling in melanoma tumor cell growth. Oncogene. 21: 7001-10.
168. Niwa H., Burdon T., Chambers I., Smith A. 1998. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12: 20482060.
169. Norbury C.J., Zhivotovsky B. 2004. DNA damage-induced apoptosis. Oncogene. 23: 2797-2808.
170. Nunez G., Benedict M.A., Hu Y., Inohara N. 1998. Caspases: the proteases of the apoptotic pathway. Oncogene. 17: 3237-3245.
171. O'Shea J.J., Gadina M., Schreiber R.D. 2002. Cytokine signaling in 2002: new surprises in the Jak/Stat pathway. Cell. 109: S121-S131.
172. Ohtsubo M., Gamou S., ShimizuN. 1998. Antisense oligonucleotide of WAF1 gene prevents EGF-induced cell-cycle arrest in A431 cells. Oncogene. 16: 797-802.
173. Ohtsubo M., Takanagi A., Gamou S., Shimizu N. 2000. Interruption of NFkB-STAT1 signaling mediates EGF-induced cell-cycle arrest. J. Cell. Physiol. 184: 131137.
174. Olayioye M.A., Beuvink I., Horsch K., Daly J.M., Hynes N.E. 1999. ErbB receptor-induced activation of stat transcription factors is mediated by Src tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 274: 17209-17218.
175. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. 2000. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer. EMBO J. 19: 31593167.
176. Ormerod M.G., Paul F., Cheetham M., Sun X.M. 1995. Discrimination of apoptotic thymocytes by forward light scatter. Cytometry. 21: 300-304.
177. Ozcan F., Klein P., Lemmon M.A., Lax I., Schlessinger J. 2006. On the nature of low- and high-affinity EGF receptors on living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:5735-5740.
178. Paddison P.J., Caudy A.A., Bernstein E., Hannon G.J., Conklin D.S. 2002. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16: 948-958.
179. Paul C.P., Good P.D., Winer I., Engelke D.R. 2002. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotech. 19: 505-508.
180. Pawson T. 2004. Specificity in signal transduction: from phosphotyrosine-SH2 domain interactions to complex cellular systems. Cell. 116: 191-203.
181. Petersen H., Haldosen L.A. 1998. EGF modulates expression of STAT5 in mammary epithelial cells. Exp. Cell. Res. 243: 347-358.
182. Pfeffer L.M., Mullersman J.E., Pfeffer S.R., Murti A., Shi W., Yang C.H. 1997. STAT3 as an adapter to couple phosphatidylinositol 3-kinase to the IFNAR1 chain of the type I interferon receptor. Science. 276: 1418-1420.
183. Pine R. 1997. Convergence of TNFalpha and IFNgamma signalling pathways through synergistic induction of IRF-l/ISGF-2 is mediated by a composite GAS/kappaB promoter element. Nucleic. Acids. Res. 25: 4346-4354.
184. Plas D.R., Thompson C.B. 2005. Akt-dependent transformation: there is more to growth than just surviving. Oncogene. 24: 7435-7442
185. Pumiglia K.M., Decker S.J. 1997. Cell cycle arrest mediated by the MEK/mitogen-activated protein kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 448-452.
186. Quesnelle K.M., Boehm A.L., Grandis J.R. 2007. STAT-mediated EGFR signaling in cancer. J. Cell. Biochem. 102: 311-319.
187. Ramana C.V., Grammatikakis N., Chernov M., Nguyen H., Chuan Goh K., Williams B.R.G., Stark G.R. 2000. Regulation of c-myc expression by IFN-y through Stat 1-dependent and -independent pathways. EMBO J. 19: 263-272.
188. Ramsauer K., Sadzak I., Porras A., Pilz A., Nebreda A.R., Decker T., Kovarik P. 2002. p38 MAPK enhances STAT 1-dependent transcription independently of Ser-727 phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 12859-12864.
189. Reiss M., Brash D. E., Munoz-Antonia T., Simon J. A., Ziegler A., Vellucci V. F., Zhou Z. L. 1992. Status of the p53 tumor suppressor gene in human squamous carcinoma cell lines. Oncol. Res. 4: 349-357.
190. Ren Y., Meng S., Mei L., Zhao Z.J., Jove R., Wu J. 2003. Roles of Gab 1 and SHP2 in paxillin tyrosine dephosphorylation and Src activation in response to epidermal growth factor. J Biol Chem. 279: 8497-8505.
191. Ridge J., Muller J., Noguchi P., Chang E.H. 1991. Dynamics of differentiation in human epidermoid squamous carcinoma cells (A431) with continuous, long-term gamma-IFN treatment. In Vitro Cell. Dev. Biol. 27A: 417-424.
192. Rieber M., Rieber M.S. 2005. Cyclin D1 overexpression induces epidermal growth factor-independent resistance to apoptosis linked to BCL-2 in human A431 carcinoma. Apoptosis. 11: 121-129.
193. Riese D.J. 2nd, Gallo R.M., Settleman J. 2007. Mutational activation of ErbB family receptor tyrosine kinases: insights into mechanisms of signal transduction and tumorigenesis. BioEssays. 29: 558-565.
194. Rogers R.S., Horvath C.M., Matunis M.J. 2003. SUMO modification of STAT1 and its role in PIAS-mediated inhibition of gene activation. J. Biol. Chem. 278: 30091-30097.
195. Roninson I.B., Broude E.V., Chang B.-D. 2001. If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells. Drug. Resist. Updat. 4: 303-313.
196. Rosdy M. 1988. Opposite effects of EGF on involucrin accumulation of A431 keratinocytes and a variant which is not growth-arrested by EGF. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24: 1127-1132.
197. Rosdy M., Bernard B. A., Schmidt R., Darmon M. 1986. Incomplete epidermal differentiation of A431 epidermoid carcinoma cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 22: 295-300.
198. Rubin Grandis J., Drenning S.D., Chakraborty A., Zhou M.Y., Zeng Q., Pitt A.S., Tweardy DJ. 1998. Requirement of Stat3 but not Statl activation for epidermal growth factor receptor-mediated cell growth in vitro. J. Clin. Invest. 102: 1385-1392.
199. Saharinen P., Ekman N., Sarvas K., Parker P., Alitalo K., Silvennoinen O. 1997. The Bmx tyrosine kinase induces activation of the Stat signaling pathway, which is specifically inhibited by protein kinase C5. Blood. 90: 4341-4353.
200. Samuel, C.E. 2001. Antiviral actions of interferons. Clinical Microbiol. Rev. 14: 778-809.
201. Santon J.B., Cronin M.T., MacLeod C.L., Mendelsohn J., Masui H., Gill G.N. 1986. Effects of epidermal growth factor receptor concentration on tumorigenicity of A431 cells in nude mice. Cancer Res. 46: 4701-4705.
202. Sardi S.P., Murtie J., Koirala S., Patten B.A., Corfas G. 2006. Presenilin-dependent ErbB4 nuclear signaling regulates the timing of astrogenesis in the developing brain. Cell. 127: 185-197.
203. Sato K., Nagao T., Iwasaki T., Nishihira Y., Fukami Y. 2003. Src-dependent phosphorylation of the EGF receptor Tyr-845 mediates Stat-p21wafl pathway in A431 cells. Genes Cells. 8:995-1003.
204. Sato K., Nagao T., Kakumoto M., Kimoto M., Otsuki T.,Iwasaki T., Tokmakov A.A., Owada K., Fukami Y. 2002. Adaptor protein She is an isoform-specific direct activator of the tyrosine kinase c-Src. J. Biol. Chem. 277: 29568-29576.
205. Sato K., Sato A., Aoto M., Fukami Y. 1995a. Site-specific association of c-Src with epidermal growth factor receptor in A431 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210: 844-851.
206. Sato K., Sato A., Aoto M., Fukami Y. 1995b. c-Src phosphorylates epidermal growth factor receptor on tyrosine 845. Biochem. Biophys. Res. Commun. 215: 1078-1087.
207. Schiller M. 2006. Coupling receptor tyrosine kinases to Rho GTPases GEFs what's the link. Cell. Signal. 18: 1834-1843.
208. Schindler C., Shuai K., Prezioso V.R., Darnell J.E. Jr. 1992. Interferon-dependent tyrosine phosphorylation of a latent cytoplasmic transcription factor. Science. 257: 809-813.
209. Schlessinger J. 2000. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103: 211-225.
210. Schulze A., Lehmann K., Jefferies H.B.J., McMahon M., Downward J. 2001. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes Dev. 15: 981-994.
211. Schwartz M.A., Baron V. 1999. Interactions between mitogenic stimuli, or, a thousand and one connections. Curr. Opin. Cell. Biol. 11: 197-202.
212. Sekimoto T., Imamoto N., Nakajima K., Hirano T., Yoneda Y. 1997. Extracellular signal-dependent nuclear import of STAT1 is mediated by nuclear pore-targeting complex formation with NPI-1, but not Rchl. EMBO J. 16: 706777.
213. Shacka J.J., Roth K.A. 2005. Regulation of neuronal cell death and neurodegeneration by members of the Bcl-2 family: therapeutic implications. Curr. Drug. Targets. CNS. Neurol. Disord. 4: 25-39.
214. Shao H., Cheng H.Y., Cook R.G., Tweardy D.J. 2003. Identification and characterization of signal transducer and activator of transcription 3 recruitment sites within the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 63: 3923-3930.
215. Sherr C.J., Roberts J.M. 1999. CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression. Genes Dev. 13: 1501-1512.
216. Shi C.-S., Kehrl J.H. 2004. Pyk2 Amplifies Epidermal Growth Factor and c-Src-induced Stat3 Activation. J. Biol. Chem. 279: 17224-17231.
217. Shoenfelt J.L., Fenton M.J. 2006. TLR2- and TLR4-dependent activation of STAT1 serine phosphorylation in murine macrophages is protein kinase C-8-independent. J. Endotoxin. Res. 12: 231-40.
218. Silva C.M. 2004. Role of STATs as downstream signal transducers in Src family kinase-mediated tumorigenesis. Oncogene. 23: 8017-8023.
219. Silvennoinen O., Schindler C., Schlessinger J., Levy D. E. 1993. Ras-independent growth factor signaling by transcription factor tyrosine phosphorylation. Science. 261: 1694-1695.
220. Sinibaldi D., Wharton W., Turkson J., Bowman T., Pledger W.J., Jove R. 2000. Induction of p21WAF1/CIP1 and cyclin D1 expression by the Src oncoprotein in mouse fibroblasts: role of activated STAT3 signaling. Oncogene. 19: 5419-5427.
221. Smida Rezgui S., Honore S., Rognoni J. B., Martin P. M., Penel C. 2000. Up-regulation of a2pi integrin cell-surface expression protects A431cell from epidermial growth factor- induced apoptosis. Int. J. Cancer. 87: 360-367.
222. Soltoff SP. 2007. Rottlerin: an inappropriate and ineffective inhibitor of PKC8. Trends Pharmacol. Sci. 28: 453-458.
223. Song L., Turkson J., Karras J.G., Jove R., Haura E.B. 2003. Activation of Stat3 by receptor tyrosine kinases and cytokines regulates survival in human non-small cell carcinoma cells. Oncogene. 22(27): 4150-4165.
224. Sorkin A., Kornilova E., Teslenko L., Sorokin A., Nikolsky N. 1989. Recycling of epidermal growth factor-receptor complexes in A431 cells. Biochim. Biophys. Acta. 1011: 88-96.
225. Stancato L.F., David M., Carter-Su C., Larner A.C., Pratt W. B. 1996. Preassociation of STAT1 with STAT2 and STAT3 in separate signalling complexes prior to cytokine stimulation . J. Biol. Chem. 271: 4134-4137.
226. Stancato L.F., Yu C.R., Petricoin 3rd E.F., Lamer A.C. 1998. Activation of Raf-1 by IFNy and oncostatin M requires expression of the STAT1 transcription factor. J. Biol. Chem. 273(30): 18701-4.
227. Stephanou A., Latchman D.S. 2005. Opposing actions of STAT-1 and STAT-3. Growth Factors. 23: 177-182.
228. Stoschek C.M., Carpenter G. 1983. The biology of the A431 cell: a useful organism for hormone research. J. Cell. Biochem. 23: 191-202.
229. Stover D.R., Becker M., Liebetanz J., Lydon N.B. 1995. Src phosphorylation of the epidermal growth factor receptor at novel sites mediates receptor interaction with Src and P85 alpha. J. Biol. Chem. 270: 15591-15597.
230. Strasser A., O'Connor L., Dixit V.M. 2000. Apoptosis signaling. Annu.1. Rev. Biochem. 69: 217-245
231. Su W.C., Kitagawa M., Xue N., Xie B., Garofalo S., Cho J., Deng C., Horton W.A., Fu X.Y. 1997. Activation of Statl by mutant fibroblast growth-factor receptor in thanatophoric dysplasia type II dwarfism. Nature. 1997. 386: 288-292.
232. Sui G., Soohoo C., Affar El Bachir, Gay F., Shi Y., Forrester W.C., Shi Y. 2002. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 5515-5520.
233. Sun W.H., Pabon C., Alsayed Y., Huang P.P., Jandeska S., Uddin S., Platanias L.C., Rosen S.T. 1998. Interferon-y resistance in a cutaneous T-cell lymphoma cell line is associated with lack of STAT1 expression. Blood. 91: 570-576.
234. Tang J., Cross D.J. 2003. Regulated EGF receptor binding to F-actin modulatesreceptor phosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 312: 930-936.
235. Tang K., Nie D., Cai Y., Honn K.V. 1999. The (34 integrin subunit rescues A431 cells from apoptosis through a PI3K/Akt kinase signaling pathway. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 127-132.
236. Thornberry N.A., Lazebnik Y. 1998. Caspases: enemies within. Science. 281: 1312-1322.
237. Tice D.A., Biscardi J.S., Nickles A.L., Parsons S.J. 1999. Mechanism of biological synergy between cellular Src and epidermal growth factor receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 1415-1420.
238. Tikhomirov O., Carpenter G. 2005. Bax activation and translocation to mitochondria mediate EGF-induced programmed cell death. J. Cell. Sci. 118: 5681-5690,
239. Toyoda M., Gotoh N., Handa H., Shibuya M. 1998. Involvement of MAP kinase-independent protein kinase C signaling pathway in the EGF-induced p2.WAFi/cipi eXpression an£j gr0wth inhibition of A431 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 430-435.
240. Vanhaesebroeck B., Leevers S.J., Ahmadi K., Timms J., Katso R., Driscoll P. C., Woscholski R., Parker P.J., Waterfield M.D. 2001. Synthesis and function of 3-phosphorylated inositol lipids. Annu. Rev. Biochem. 70: 535-602.
241. Vignais M.L., Gilman M. 1999. Distinct mechanisms of activation of Statl and Stat3 by platelet-derived growth factor receptor in a cell-free system. Mol. Cell. Biol. 19: 3727-3735.
242. Wang Y., Wu T.R., Cai S., Welte T., Chin Y.E. 2000. Statl as a component of tumor necrosis factor alpha receptor 1-TRADD signaling complex to inhibit NF-kappaB activation. Mol. Cell. Biol. 20:4505-4512.
243. Statl and Stat3 requires both tyrosine and serine phosphorylation . Cell. 82: 241-250.
244. Widmann C., Gibson S., Jarpe B., Johnson G.L. 1999. Mitogen-activated protein kinase: conservation of a three-kinase module from yeast to human. Phys. Rev. 79:143-180.
245. Wong L.H., Sim H., Chatterjee-Kishore M., Hatzinisiriou I., Devenish R.J., Stark G., Ralph S.J. 2002. Isolation and characterization of a human STAT1 gene regulatory element. J. Biol. Chem. 277: 19408-19417.
246. Wu X., Rubin M., Fan Z., DeBlasio T., Soos T., Koff A., Mendelsohn J. 1996. Involvement of p27K1P1 in Gj arrest mediated by an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody. Oncogene. 12: 1397-1403.
247. Xi S., Zhang Q., Dyer K.F., Lerner E.C., Smithgall T.E., Gooding W.E., * Kamens J., Rubin Grandis J. 2003. Src kinases mediate STAT growth pathways insquamous cell carcinoma of the head and neck. J. Biol. Chem. 34: 31574-31583.
248. Xie B., Zhao J., Kitagawa M., Durbin J., Madri J.A., Guan J.L., Fu X.Y. 2001. B Focal adhesion kinase activates Statl in integrin-mediated cell migration andadhesion. J. Biol. Chem. 276: 19512-19523.
249. Xie W., Su K., Wang D., Paterson A.J., Kudlow J.E. 1997. MDA468 growth inhibition by EGF is associated with the induction of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21WAF1. Anticancer Res. 17: 2627-2633.
250. Xu X., Fu X.-Y., Plate J., Chong A. S. 1998. IFN-y induces cell growth inhibition by Fas-mediated apoptosis: requirement of STAT1 protein for upregulation of Fas and Fas-L expression. Canser Res. 58: 2832-2837.
251. Yang S., Park K., Turkson J., Arteaga C.L. 2007. Ligand-independent phosphorylation of Y869 (Y845) links mutant EGFR signaling to stat-mediated gene expression. Exp Cell Res. doi: 10.1016/j.yexcr.2007.09.002.
252. Yang S.-H., Sharrocks A.D., Witmarsh A.J. 2003. Transcriptional regulation by the MAP kinase signaling cascades. Gene. 320: 3-21.
253. Yuan J., Shaham S., Ledoux S., Ellis H.M., Horvitz H.R. 1993. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell. 75: 641-652.
254. Zhang X., Gureasko J., Shen K., Cole P.A., Kuriyan J. 2006. An allosteric mechanism for activation of the kinase domain of epidermal growth factor receptor. Cell. 125: 1137-1149.
255. Zhang Y., Turkson J., Carter-Su C., Smithgall T., Levitzki A., Kraker A., Krolewski J.J., Medveczky P., Jove R. 2000. Activation of Stat3 in v-Src-transformed fibroblasts requires cooperation of Jakl kinase activity. J. Biol. Chem. 275: 2493524944.
-
Грудинкин, Павел Сергеевич
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2007
-
ВАК 03.00.25
- Зависимость интенсивности транскрипции генов класса III от дополнительного фосфорилирования РНК-полимеразы III и физиологического состояния клетки
- Зависимость характера перераспределения поверностных рецепторов у клеток А431 от природы лиганда и организации актинового цитоскелета
- Взаимодействие протеасом и альфа-РНП частиц с фибрилярным актином
- Исследование механизмов рецептор-управляемого входа ионов кальция в клетках А431
- Миграция эпидермальных клеток человека в культуре
