Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов рецептор-управляемого входа ионов кальция в клетках А431

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов рецептор-управляемого входа ионов кальция в клетках А431"

Г),

)

РОССИЙСКАЯ ЛКАДЕЛ1ИЯ НАУК ИНСТИТУТ цитологии

На правах рукописи УДК 577,352.465

КУРЫШЕВ Юрий Анатольевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗЛЮВ РЕЦЕПТОР-УПРАВЛЯЕМОГО ВХОДА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В КЛЕТКАХ А431

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Диссертационная работа выполнена в лаборатории ионных каналов клеточных мембран Института цитологии РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук Г. Н. Можаева; доктор биологических наук А. П. Наумов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. Б. Каулнн; доктор биологических наук Г. А. Наследов.

Ведущее учреждение — Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского Государственного университета.

Защита состоится «¿¿^» 1992 года в « часов

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан «лГо?» (^О^/С-Х-^ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук Л. Н. Писарева

(С) Институт цитологии РАН

- з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Ак?Ха2ьность_темы. Связывание гормонов и ростовых факторов с соответствующими мембранными рецепторами приводит к запуску в клетке цепи биохимических событий, имеющих своим следствием либо специфический для данного типа дифференцированных клеток ответ, либо увеличение синтеза ДНК и деление клеток. Важная роль в передаче сигнала с наружной мембраны к внутриклеточным структурам принадлежит ионным событиям (СМ., например, Moolenaar, de Laat, 1983). СреДИ этих событий особая роль принадлежит кальциевому сигналу, т.е. временному увеличению концентрации свободного цито-плазматического Са2+ (1Са2+,ц;1Т)' Восприятие и преобразована кальциевого сигнала осуществляется ферментами, транспортными белками, внутриклеточными модуляторами, активность которых зависит ОТ [Са2+Гвдг CRasmussen, Barret, 1984; Berridge, 1983; Hesketh et al., 198S; Abdel-Latif 19C63 .

Рост уровня 1Са2+1циТ может быть обеспечен как за счет выброса Сал+ из внутриклеточных источников, так и за счет входа Са2+ из внеклеточной среды через плазматическую

мембрану (Putney, 1987, 1989; Berridge, Irvine, 1989;

Tsien, Tsien, 1990). В НврВШХ, МЫШвЧНЫХ И ДРУГОЙ ЭЛвКТрО-

возбудимых клетках вход ионов Са2+ . происходит через потенциал-управляемые Са2+ каналы (см., например, Reuter,

1986). Менее ясно, какие механизмы обеспечивают рецептор-

pi.

зависимый вход Ca в невозбудимых клетках. Изучение

о.

ПОТОКОВ ИОНОВ Ca (Johns ot al., 1987; Nishimoto et al.,

1987) и измерение уровня tCa,2+I ВД1Т с помощью Са2+-чувстви-

тельных ЗОНДОВ (Volpi, Berlin, 1988; АВДОНИН И С0ЭВТ., 1990; Grohovaz et al., 1991) ДЭЮТ ОСНОВЭНИЯ ПОЛаГЭТЬ, ЧТО В

плазматической мембране различных тшов клеток имеются Са2+- проницаемые каналы, отличные по своим свойствам от потенциал-управляемых Са2+ каналов. Однако, к началу выполнения настоящей работы сообщения о регистрации одиночных Са^+~проницаемых каналов в мембранах невозбудимых клеток НОСИЛИ фрагментарный характер (Von Tscharner et al., 1986;

Kuno, Gardner, 1087; Benham, Tslen, 1087; Penner et a!.,

1988). Исходя из сказанного выше, можно сделать вывод о том, что дальнейшее детальное исследование рецептор-управляемого входа ионов, Са2+ через плазматическую мембрану невозбудимых клеток необходимо для получения целостного представления о механизмах внутриклеточной сигнализации как в норме, так и при патологических процессах.

Клетки эпидермоидной карциномы человека A43I являются' удобным объектом для изучения рецептор-управляемого входа Са2+, т.к. мембрана этих клеток имеет большое число различных рецепторов, и кальциевый сигнал в них в значительной степени определяется входом Са2+ из внеклеточной среды

(Hacar-a, 1986; Moolenaar et al., 1988).

Цели_2_зааачи_исслеадвания. Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов, обеспечивающих вход ионов Са2+ через плазматическую мембрану клеток эпидермоидной карциномы человека A43I в процессе их активации ■эпидермальным фактором роста (ЭФР). Были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать и охарактеризовать Са2+-проницаемые каналы плазматической мембраны клеток A43I.

2. Выявить связь между стимуляцией клеток эпидермальным фактором роста и активностью Са2+-проницаемых каналов плазматической мембраны.

3. Исследовать механизмы регуляции активности Са2+-проницаемых каналов плазматической мембраны клеток A43I.

Научная_новизна. В результате проведенной работы впервые зарегистрированы, охарактеризованы и классифицированы Са2+-проницаемые каналы плазматической мембраны клеток эпидермоидной карциномы человека, активирующиеся при стимуляции клеток эпидермальным фактором роста. Установлено, что активность данного типа каналов регулируемся через gtp-зависимый механизм, по-видимому, через gtp-связывэющий белок. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что Са2+-проницаемые каналы, активируемые через gtp-зэвисимый механизм, вносят существенный вклад в ЭФР-индуцируемый

кальциевый вход., в клетках А431.

Теоретотвское^_практическо0_значещ Полученные в

настоящей работе результаты важны для конкретизации представлений о механизмах, генерирующих кальциевый сигнал в невозбудимых клетках."Обнаружение нового типа Са2+-проница-8мых каналоЕ является существенным дополнением к имеющимся знаниям о функциональной роли ионных каналов клеточных мембран. Тот факт, что индуцируемая эпидермальным фактором роста стимуляция активности обнаруженных Са2+-проницаемых каналов осуществляется, по-видимому, через етр-связываюпщй белок, во-первых, подтверждает складывающееся к' настоящему времени мнение о том, что этр-связывающие белки являются универсальными модуляторами активности различных ионных каналов, а во-вторых, существенно расширяет- наши представления о разнообразии путей ""передачи сигнала от рецепторов, обладающих собственной тирозинкиназной активностью.

Полученные данные о механизмах регуляции Са2+-проница-емых каналов, участвующих в генерации ЭФР-индуцированного кальциевого сигнала, могут быть использованы при разработке и тестировании лекарственных препаратов, влияющих на клеточную пролиферацию.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Пущино, 1989 г.). Всесоюзном симпозиуме "Ионные каналы" (Пущино, 1990 г.). Втором советско-испанском симпозиуме по физико-химической биологии "Биологические мембраны: структура и функции" (Киев, 1990 г.). Советско-германском симпозиуме "Возбудимые' мембраны" (Киев, 1991 г.).

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуздения результатов, выводов и списка литературы, содержащего

источника. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована 25 рисунками и I таблицей.

МАТЕРИМ И МЕТОДЫ

05Мкт_исследоващяЛ Работа проводилась на культуре клеток эпидермоидной карциномы человека A43I, полученной из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН' (С.Петербург). Культура велась на среде Мгла модификации Дальбекко (dme) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота.

Измерение концентрации свободного внутриклеточного Са2+ производилось с помощью флуоресцентного зонда indo-i по стандартному методу (Grynkiewicz et al., 1Q85). ДЛЯ НЭГруЗ-ки зондом стекла с клеточным монослоем помещались в среду dme с 2,5 мкМ хndo-isAM на 40 мин при 37°С. Измерения производились в среде а следующего состава: 140 мМ nací, 5.3 MM кс1, I MM MgClg, I мМ мангр04, 20 MM hepes- na, 0.1 мМ egta, 20 мкМ aici3, 5 мМ глюкоза, рН 7,4. Добавка в среду caci2 и стимулирующих агентов производилась в зависимости от постановки эксперимента. Нагрузка зондом суспензионных клеток производилась в среде due без сыворотки (5*10® клеток/мл) с 2,0 мкМ indo-i^am в течение 30 мин при 37°С.. Как при работе с клеточным монослоем, так и с суспензией измерительная кювета термостатировалась при 37°С.

Измерение уровня флуоресценции производилось на спектро-флюориметре Hitachi eso при -длинах волн возбуждения и испускания 340 и 400 нм, соответственно, и при спектральной ширине щелей 20 нм - при измерениях на клеточных монослоях и 5 нм - при измерениях на клеточной-суспензии.

Для исследования действия фторида алюминия клетки инкубировались 3-5 мин в среде А без Са2+ (0 мМ сасаг, o.i egta) в присутствии 20 мкМ aici3, после чего в среду добавлялся NaF (ДО 10 мМ).

Регистрация токов через.одиночные ионные каналы произво-

далась с использованием метода локальной фиксации потенциала на изолированном фрагменте мембраны (patch-ciamp метод) В конфигурациях cell-attached И inside-out (Hamill et al.„ 19SU. Мембранный потенциал внеклеточного раствора в пипетке принимался за нулевой. Электрическое сопротивление контакта пипетка-мембрана состозляло не менее 20 ГОм. Опыты проводились либо при температуре 20-23°с, либо 30 - 33°С.

Состав.внеклеточных и искусственных "внутриклеточных" растворов приведен в таблице I.

NaC 1 KC1 — ~ Г MgCl JTris L i -HC1 HEPES •KOH HEPES-Ca(OH)2 EGTA CaCl2 PH

I .140 ' 5 1 10 _ - - 2 7.4

II 140 1 10 _ _ _ 2 7.4

III

- - - - 2 - 100 7.4

IV - 145 1 - 20 - 4 - 7.3

V - 145 1 - 20 - * * 7.3

* - в растворе v требуемое значение рса задавалось соотношением EGTA И СаС1г.

Для регистрации токов через к+-каналы пипетка заполнялась раствором II. При регистрации токов через Са2+-прони-цаемые каналы для увеличения амплитуды токов регистрирующая пипетка заполнялась раствором III, содержащем 100 мМ саС12. Для заполнения рабочей камеры при работе в конфигурации cen-attached использовались внеклеточные растворы I ' и II. Для отрыва мембранного фрагмента (при переходе к конфигурации inside-out) камера заполнялась раствором iv (рСа=8). Во "внутриклеточном" растворе v в качестве " основной соли использовался или кс1 или к-аспартат или к-глутамат. ЭФР добавлялся либо в раствор III (в регистрирующую пипетку), либо в наружний калиевый раствор II. Растворы, содержащие gtp^s или gppnhp приготовлялись на основе "внутриклеточного" раствора iv (рСа 8). Фторид подавался на основе растворов II и iv в виде: 10 мМ kf + 20 мкМ aici3.

- э -

Регистрируемый аналоговый сигнал, записывался на магнитную ленту с частотной полосой записи 0-2,5 кГц. При дальнейшей обработке аналоговый сигнал фильтровался с помощью 6-далюснйго фильтра Бесселя с "частотой среза от ОД до 0,5 кГц, которая выбиралась в зависимости от амплитуды токов, кинетических характеристик каналов и фонового шума мембранного фрагмента. Ввод сигнала в компьютер производился через 12 разрядный аналого-цифровой преобразователь рсх-718.

Вероятность пребывания канала в открытом состоянии Р0 вычислялась по формуле:

р0 = <1>/-с1*ю ,

где <1> - средний ток через каналы для заданного временного интервала; а- амплитуда тока через одиночный канал; и - число "работающих" каналов в данном мембранном фрагменте, которое принималось раьным максимальному числу одновременно открывавшихся каналов за время проведения эксперимента.

Для оценки стимулирующего действия агонистов сравнивались максимальные значения вероятности открытого состояния канала в течение определенного временного интервала для кавдого из условий: в контроле (фоновая активность) и в присутствии агонистов. Обычно Р0 вычислялась на 20 секундном интервале

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ

I. Исследование активности-одиночных ионных каналов плазматической мембраны.

Активац2Я_Са^=зашсшых_К

ростал Как было показано ранее ( Можаева с соавт., 1989), в плазматической мембране клеток А431 имеются Са2+-зависи-' мые К+ каналы (далее к* . ). Главная особенность данных

( со}

каналов, представляющая интерес с точки зрения настоящей работы,- их зависимость от концентрации свободного Са2+ во

внутриклеточном растворе (искусственном, если измерения производятся В конфигурации inslde-out, или нативном, при измерениях в конфигурации ceii-attached). Регистрируя активность этих каналов на изолированных фрагментах мембраны наткзной клетки, можно судить об уровне ССа2+,цит в примембранной области цитоплазмы (напр. suzuki et ai.,

1985; Sauve et al., 1937, 19Q1).

3 настоящей работе отслеживание активности к* , каналов

г ( Са)

. использовалось для регистрации кальциевого сигнала, индуцируемого ЭФ?, а также для оценки значимости внеклеточного - Са2+ в генерации данного сигнала. В этой серии экспериментов регистрирующая пипетка всегда заполнялась раствором II, а все активирующие или блокирующие агенты подавались к . наружней стороне клеточной ^дембраны вне области изолирован. ного мембранного фрагмента.

Регистрация токов через одиночные к*са) каналы в мембране нативных клеток в конфигурации ceii-attached показала, что в том случае, когда клетка омывалась нормальным раствором XV, фоновая активность (частота открывания) к*Са) каналов была очень мала. Однако их активность могла быть резко усилена подачей в наружный внеклеточный .раствор ЭФР (рис. I). В этих опытах до подачи ЭФР какой-либо существенной фоновой активности к*Са) каналов не наблюдалось (время регистрации до подачи ЭФР не менее 5 мин ). Такого рода, активация к*Са) каналов эпидермальным фактором роста наблюдалась в 42 экспериментах из 77 (54 %; в расчет взяты только те опыты в.которых достоверно зарегистрировано наличие^ К(са) KaHaJI0B в "пэтчевом" фрагменте). Следует отметить, что как уровень активации, так и время ее начала и продолжительности сильно различались от опыта к опыту. Задержка между подачей ЭФР к клетке и появлением первых токов через кГса) каналы варьировала от 5 до 50 с и в среднем составила 20 с, а время достижения максимума активности (максимум PQ) - от 10 до 80 с, в среднем - 36 с.

ЭФ^

р.

0.4.

0.2.

0 J

ЭФР СаГ

с«г

53

100

150

,2+_

мальным фактором+роста; подавление ЭФР-индуцирован-ной активности к каналов при удалении внеклеточ-2+

ного Са и подаче са (5 мМ).

Результаты данных экспериментов однозначно указывают на то, что стимуляция клеток ЭФР вызывает повышение гсаг+]цит до уровня, достаточного для активации к*Са) каналов (отсутствие ЭФР в регистрирующей пипетке исключает возможность их непосредственного взаимодействия с к*Со1) каналами).

Как известно, повышение уровня гсаг+1цит может быть достигнуто двумя путями: за счет выброса Са2+ из внутриклеточного депо и за счет входа Са2+ из наружной среды через плазматическую мембрану. Для оценки роли входа внешнего Са2+ был проведен ряд дополнительных экспериментов. Так, в ряде опытов после развития устойчивой активности к*Са) каналов наружная среда заменялась на Оескальциевую (0 мМ СаС12, 4 мМ е(»тл) и, как правило, через несколько секунд активность к*Са) каналов затихала (рис. I). Однако их работа возобновлялась практически сразу после возвращения Са2+ в наружную среду. В ряде опытов было установлено, что подача во внеклеточную среду 5 мМ са2+ подавляла активность

- и -

кГса) каналов. Этот эффект носил обратимый характер, после удаления са2+ из внеклеточного раствора активность к*Са) каналов восстанавливалась.

• Таким образом, эксперименты по наблюдению одиночных к*Са) каналов с использованием patch-ciamp метода на натив-ной клетке не только дали возможность регистрировать рост уровня 1Саг+]цит в ответ на стимуляцию клеток ЗФР, но также показали, что этот индуцированный рост в значительной степени обусловлен входом СаЛ+ из внешней среды. Это влечет за собой предположение о том, что в мембране клеток A43I имеются каналы, пропускающие ионы Са2+, и эта Са2+-проница-емые каналы управляются каким-то образом от рецепторов ЭФР. Опыты с са24 подтверждают это предположение, так как саг+ является типичным блокатором различных Са2+-проницаемых' каналов (Костюк, 1986). **

^тивация_Са2^гпрощцаещх_каналов_плаз it? и_фтори£ом_в_нативной_клетке^ Для поиска и исследования характеристик Са^+-пронкцаемых каналов, активирующихся при стимуляции клеток ЭФР, был использован

patch-clamp М6ТОД В КОНфИГураЦИИ cell-attached (ТОО ММ

caci2 в пипетке). Были зарегистрированы Са2+-проницаемые каналы с проводимостью от 2,1 до 2,9 пСм (среднее 2,41 пСм) в опытах, проведенных при 30-34°С, с экстраполированным потенциалом реверсии +20...+30 мВ. Амплитуда токов через эти каналы и их проводимость не изменялась при переходе в конфигурацию inside-out. Кроме того, при измерениях в конфигурации insxde-out амплитуда токов через каналы не зависела от замены ci~ на asp_, giu~ или во "внутриклеточном" растворе. Все это свидетельствует о катионной природе зарегистрированных каналов. Единственный катион в регистрирующей пипетке - са2+.

На рис. 2 иллюстрируется пример активности данного типа канала. В этом опыте регистрация токов проводилась сначала в конфигурации cell-attached, а зэтвм в inside- out.

Проводимость составила 2,5 пСм, потенциал реверсии -около +30 мЗ, каких-либо токов выходящего направления зарегистрировано не было. Внутршвшеточный раствор содержал ЭФР (50 нг/мл), что, по-видимому, и обеспечило относительно высокую степень активности Са2+-проницаемых каналов, как в

cell-attached КОНфИГУрЭЦИИ, T8K И При Последующем ШреХОДв

в inside-out. в опытах, проведенных на нативных клетках при наличии ЭФР в пипетке, среднее значение Рто* составило

А О 120}

0,17 - 0,05 ( n=I6 ). В то же время, в контрольных опытах (без ЭФР в пипетке) значение 'составило менее ' 0,01

(n»i7 э. Тот факт, что при наличии ЭФР в пипетке активность

„2+ 1

Са -проницаемых каналов значительно выше фоновой, однозначно указывает на то, что эти каналы активируются при стимуляции клеток ЭФР с наружной стороны мембраны.

а ф -40 мв

©

200 мо

6

ф

Р.1

0.1 -

о J

-40, ■ ' ' ' '_I_L.

0 и, мВ

C-fl

ф.

2.5 пСм

-0.2 I , пй

20 о

Рио.2.

2+

Активация Са -проницаемых каналов в нативной клетке (50 нг/мл ЭФР в пипетке); а - примеры токов через одиночные каналы; б - вольт-амперная характеристика одиночного канала; в - активность каналов, выраженная как изменение Р во времени.

- 1Э -

Следует также отметить, что в диапазоне -30...-100 мВ , активность этих каналов не зависит от потенциала.

Из многочисленных работ целого ряда авторов следует, что существует несколько внутриклеточных мессенжеров, потенциально способных принимать участие в передаче сигнала от рецепторов ка Са2+~прошщае.\ме каналы плазматической мембраны (СМ. напр. обзоры: Meldolesi, Pozzan, 1987; Brown,

1991). Среди них: етр-связывающие белки, продукты фосфокно-зитольного цикла, протеинкиназк. В условиях острого опыта на нативной клетке имеется возможность избирательной модуляции активности некоторых из указанных мессенжеров. Одним из доступных приемов является активация GTP-связывающих белков фторидом алюминия - aif^ с далее фторид). Фторид является неспецифическим .активатором всех GTP-связывающих

беЛКОВ (Bigay et al., 1985;"Gl1man, 19873, КОТСрЫЙ ОТНОСИтельно быстро проникает через плазматическую' мембрану в клетку.

На рис. 3 приводится пример одного из опытоз, в котором омывание клетки фторидом индуцировало активацию Са2+-проницаемого канала с проводимостью 2,5 пСм и потенциалом реверсии около +35 мВ (100 мМ caci2 в г}шетке). До подачи фторида не было зарегистрировано ни одного открывания канала, первые признаки активности канала появились примерно через четыре минуты после стимуляции клетки фторидом (рис. Зв). Такая, относительно продолжительная задержка развития активности работы канала после подачи фторида, по-видимому, определяется скоростью проникновения фторида через мембрану и скоростью активации Grp-связыва-ющих белков фторидом. Всего активация Са2+-пронкцаемых каналов с проводимостью от 2,1 пСм до 2,6 пСм и экстраполированным потенциалом рэверсии около +30 мВ при стимуляции нативных клеток фторидом, подаваемым в омывающий клетку раствор, была зарегистрирована в 8 опытах. Фторид вызывал увеличение Р™*о) с 0,006 - 0,003 (фоновая активность) до 0,151 - 0,034 (п - 8э.

-50 мВ

-100-60 -60 -40 -20 О 20 «В

"ТТЛ-4

"пг

-70 и В

-I_I_I_I_I_I_I_1—1_I-

'ГмиДШ/-----------ии

2.5 пСм

-V

-90 м В

шж

0.4 па| 200 л«е НаГ

'-0.1

-0.3

-0.5 пА

240

300

аво

420 о

„2+

Рис.З. Активация Са -проницаемых каналов в нативной клетке . фторидом; а - примеры токов через одиночные каналы; б - вольт-амперная характеристика; в' - развитие активности канала (Р0) во времени.

Таким образом, обобщая результаты, полученные в опытах на нативной клетке, можно сделать выводы о том, что в плазматической мембране клеток.А431 имеются Са2+-проницае-мые каналы, с проводимостью около 2,4 пСм и, что каналы данного типа активируются при стимуляции клеток как ЭФР, так и фторидом.

Актшзация_Са^гпроотуаешх_канал^ аналогами ?тр. Помимо исследования свойств Са^+-проницаемых

каналов на нативной клетке, проводились исследования на изолированном фрагменте мембраны, когда ко внутренней стороне мембраны подавался искусственный внутриклеточный раствор (inside-out конфигурация). На рисунке 4 показаны результаты одного из наиболее полных опытов, в котором сначала в конфигурации cell-attached (в пипетке 50 нг/мл ЭФР) была зарегистрирована активность двух Са2+-проницаемых каналов с проводимостью около 2,3 пСм, активность этих же каналов сохранилась при переходе к конфигурации inside-out и, наконец, подача к внутренней стороне мембраны раствора v с 100 мкМ gppnhp (негидролизуемый аналог gtp:>, вызвала резкое усиление активности работы данных каналов.

2+

Рис.4. Активация Са -проницаемых каналов негидролизуемкм аналогом втР; а - примеры токов через одиночные каналы, соответствующие разным фазам опыта; б -изменение активности канала (Р ) во времени.

Всего активация подобных Са2+-проницаемых каналов посредством подачи "внутриклеточного" раствора с негидролизу-емыми аналогами стр, была зарегистрирована в 24 опытах. Их проводимость при 29°-33°С составляла от 2,0 до 2,9 пСм

(средней 2,39 ± 0,07 пСм (п=24)). Подача отр-аналогов повышала от 0,019 ± 0,004 до 0,200 - 0,030 (п=24). В

ряде экспериментов к внутренней стороне мембраны подавался фторид. Эффект фторида на Са2+-проницаемые каналы с проводимостью от 2,1 до 2,5 пСм был зарегистрирован в 5 опытах. Фоновая активность Р™"*0) составляла менее 0,01, а после подачи фторида возрастала до 0,061 + 0,014'

(п-5).

В ряде опытов, в которых было достоверно зарегистрировано наличие Са2+-проницаемых каналов, активирующихся вррмнр, во "внутриклеточный" раствор подавался инозитол 1,4,5-трисфосфат (1Р3) в концентрации от Ю-7 до 5*Ю~6 М, но никакого влияния на активность данного типа Са2+-проницаемых каналов зарегистрировано не было.

Таким образом, основываясь на результатах экспериментов, проведенных с использованием "ра1сь-с1атр" метода, можно сделат^вывод о том, что в плазматической мембране клеток А431 имеются Са2+-проницаемые каналы, активирующиеся при стимуляции клеток ЭФР или при подаче негидролизуемых аналогов этр ко внутренней стороне мембраны (далее Б-каналы). Одной из характерных черт данного типа каналов является их относительно низкая проводимость. По данному параметру к ним наиболее близки Са2+-проницаемые каналы из эндото-лиальных клеток - 2,5 пСм (в 100 мМ мл2+) (1-искЬогг, оарьат, 199г>, а также 1Р3-чувствительные Са2+-проницаемые каналы плазматической мембраны клеток А431 - 3,5 пСм (в 100

ММ Са2+) (МогЬаувха еЪ а1., 1990).

Тот факт, что активность е-каналов может быть вызвана (или усилена) подачей ко внутренней стороне мембраны негидролизуемых аналогов етр или фторида, дает основания полагать, что эти каналы регулируются отр-связывающим белком. Имеется целый ряд работ, в которых показана прямая модуляция работы ионных каналов различными типами отр- связывающих белков (СМ. напр. обзор С1г1>Ьли>№эг о!. а1., 1990).

■ 2. Флюорсметрические исследования агонист-индуцимван-ного повышения свободного внутриклеточного Са2+.

Приведенные выше результаты дают основания предполагать, что обнаруженные Са2+-проницаемые каналы, активируемые через gtp-зэвисимый механизм (g-каналы), принимают участие в обеспечении ЭФР-индуцируемого входа Са2+ в клетках A43I. Однако в плазматической мембране клеток A43I имеются также И 1р3-Зависимые Са2+- проницаеше каналы „(Mozhayeva et al., 1990), которые, по-видимому, могут активироваться при стимуляции клеток агонистами, вызывающими наработку внутриклеточного хр3. ЭФР, так же как гистамин и брадикинин,

ОТНОСИТСЯ К га числу (Moolenaar et al., 198В). КрОМв ТОГО,

результаты, свидетельствующие о возможности участия какого-либо отр-связывающего белка в передаче сигнала от рецептора ЭФР являются достаточно нетривиальными (Ullrich, Schiessinger, 19Q0) и требуют дальнейшего исследования.

Для получения дополнительных данных о возможности участия GTp-связывающего белка в передаче сигнала от ЭФР рецептора на Са2+-проницаемые каналы плазматической мембраны были проведены эксперименты с использованием Са2+-чуствительного зонда indo-i. Во всех случаях, если не оговорено особо, речь идет о результатах, полученных на клеточном монослое.

Э$фект_фторидал Фоновый уровень 'Са2+1цит в клетках, находящихся в бескальциевой наружной среде (0 мМ CaCig, 20 мкМ Aici3; o,i мМ egtаз, составлял 47 - 9 нМ (п=4). Добавление в наружную среду фторида (в виде 10 мМ NaF3 вызывало относительно медленный, преходящий рост уровня [Са2+]цит (рис. 5а). Отсутствие Са2+ во внеклеточной среде позволяет однозначно объяснить данный эффект тем, что фторид индуцирует выброс Са2+ из внутриклеточных депо. После 10 - 0,5 минут инкубации клеток с фторидом, в среду добавлялся 1мМ CaCi2, что приводило к быстрому подъему уровня 'Са2+1циТ (см.рис. 5а). В среднем приращение уровня ica2+j

составляло 106 ± 7 НМ (п-45. В контрольных опытах 1мМ СаС12 подавался в наружную среду без предварительной обработки фторидом (см. рис 56). В этом случае уровень [Са2+,щ1Т возрастал только на 13 - 4 нМ (п=4э. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в клетках A43I фторид вызывает как выброс Са2+ из внутриклеточных депо, так и вход наружного Са2+ через плазматическую мембрану.

В тех же самых экспериментах, в которых клетки инкубировались в среде,•содержащей фторид с последующим добавлением Са2+, после спада 1Са2+'цит до стационарного уровня, клетки последовательно стимулировались ЭФР, гистамином и брадшдашном (см. рис. 5а). Во всех трех случаях повышение уровня ica2+] было очень незначительным (единицы нМ) и, следовательно, можно сделать вывод, что обработка клеток фторидом блокирует действие данных агонистов. В контрольных экспериментах (без предварительной обработки фторидом (рис. 56) те же агонисты индуцировали нормальный Са2+ ответ. В этом случае ЭФР вызывал подъем уровня 1Саг+,цлТ на 118 - 17 нм (п«4э,. брадикинин на 153 - 43 нМ (n-з) и гистамин на 127 ~ 46 НМ (п=45 .

Серия аналогичных экспериментов была проведена с клеточной суспензией и были получены качественно сходные результаты.

Действие форболового эфира на фторид-индуцированный Са ответл Известно, что 4р форбол 12п миристат 13а-ацетат (рка), активатор эндогенной протенкиназы С (ркс), подавляет ЭФР- зависимый Са2+ сигнал В клетках A43I (Pike, Eakes, 1987). Исследование влияния рмд на фторид-индуцированный Са2+ ответ в клетках A43I показало, что инкубация клеток в течение 5 мин в присутствии 5 I0~® М рма полностью подавляет выброс Са2+ из внутриклеточных депо и снижает Са2+ вход более чем в 3 раза. По-видимому, данный эффект обусловлен ркс-зависимым фосфорилированием етр-связывающих белков (Бочков с соавт., 1989).

i-i 100-+

IU

й ^

NaF

¡

в

Ca+1

ЭФР

г" 16

24 мин

200.

+ 100-OJ O

u »j

Ca+J

ЭФР

ГИСТ

0

I

16

—I-

24 мин

2+

Рис.5. Действие фторида (NaF) на уровень tea ) т и

блокирование эффектов ЭФР (100 туил), брадикинина (I мкМ) и гистамина (10 мкМ) после стимуляции клеток фторидом (а); кальциевые ответы при последовательной подаче агонистов в контрольном опыте

(б). Исходно в среде 20 мкМ Alci фторид подавался

?+

вался В виде 10 ММ NaF, Са. - I ММ СаС1

Эффект_бактериальных_токсшовл Инкубация клеток с ЛХШ1НЫМ токсином (РТ) (24 ч, I мкг/мл) не влияла на Са1 ответ, индуцированный ЭФР или фторидом. Следовательно,

кок-2+

можно уверенно полагать, что в передаче сигнала от ЭФР рецептора не'участвуют g1- или gq- белки. Инкубация клеток в течение 4 ч в присутствии холерного токсина (СТ)«, (3 мкг/мл) вызывала ингибирование ЭФР-индуцированного Са2+-ответа. Кроме того,в клетках, обработанных СТ, фоновый уровень 1Са2+1одТ составлял 89 - 12 нМ (п=«, в то же время, в серии контрольных экспериментов фоновый уровень' 1саг+)цит достигал только 44 - 12 НМ (п=«.

Для выяснения того факта, что подавление ЭФР-индуциро-ванного ответа холерным токсином не является следствием активации аденилатциклазы, была проведена серия опытов с использованием форсколина (прямого активатора аденилатциклазы). Было установлено, что инкубация клеток с форско-лином (100 мкМ) не влияет на ЭФР-индуцированный Са2+ ответ. Эти результаты указывают на отсутствие прямой связи между активацией холерным токсином аденилатциклазы и ингибирова-нием Са2+ ответа.

Из результатов экспериментов, проведенных с использованием Са2+-чувствительного зонда, следует, что вход Са2+, индуцируемый фторидом, сравним по величине с кальциевым ответом на стимуляцию клеток ЭФР и, что стимуляция клеток ЭФР после их обработки фторидом не вызывает дополнительного кальциевого ответа. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что ЭФР и фторид действуют через общий механизм передачи сигнала, по-видимому, через етр-связывающий белок.

Сопоставляя эти результаты с данными, полученными с использованием patch-clamp МеТОДЭ, МОЖНО С ДОСТЭТОЧНОЙ УВЭ-ренностью полагать, что фтррид-индуцируемый вход Са2+ осуществляется через Са2+-проницаемые каналы g-типа, охарактизованные ранее и, следовательно, можно сделать вывод о том, что g-каналы вносят существенный вклад в генерацию ЭФР-индуцированного входа Са в клетках A43I.

Останавливаясь на типе gtp-связывающего белка, который может принимать участие в передаче сигнала с рецептора ЭФР на каналы плазматической мембраны, следует в первую очередь

отметить Ras белок. Установлено, что стимуляция клеток ЭФР приводит к повышению уровня активированного Ras белка

(Saloh et al., 19Э0). С ДРУГОЙ СТОрОНЫ, ПОКаЗЭНО, ЧТО Ras

белок активирует кальциевые каналы в нервных клетках

(Heschler et al., 1991). ОДНЭКО реЗуЛЬТЗТЫ, ПОЛуЧвШШв С

холерным токсином, указывают на возможность участия какого-либо GTP-Связывающего бежа С5-ТИПа (Gllman, 1987).

ВЫВОДЫ

1. Методом локальной фиксации потенциала на изолированном фрагменте мембраны установлено, что эпйдермальный фактор роста, поданный во внеклеточный раствор, вызывает активацию Са2+-зависимых калиевых каналов плазматической мембраны клеток A43I. Данная активация определяется наличием во внеклеточной среде ионов Са2+, что свидетельствует в пользу того, что эпйдермальный фактор роста индуцирует вход ионов Са2+ через плазматическую мембрану.

2. Измерения с использованием Са2+-чувствителыюго зонда показали, что фторид алюминия (неспецифический активатор GTP-связывающих белков) индуцирует вход Са2+ через плазматическую мембрану клеток A43I, последующая стимуляция клеток эпидермалышм фактором роста, брадикинином и гиста-мином не вызывает дополнительного Са2+ ответа. Бактериальный ТОКСИН ИЗ Vibrio cholera ингибирует вход Са2+, индуцируемый эпйдермальный фактором роста, токсин из Bordetella pertussis не- влияет на фторид-индуцированный вход Са2+.

Полученные результаты позволяют предполагать, что . ЭФР-индуцированшй вход Са2+ осуществляется через gtp-зэвисимый механизм, по-видимому, через GTp-связывающий белок.

3. Методом локальной фиксации потенциала на изолированном фрагменте мембраны зарегистрирован и охарактеризован новый тип Са2+-проницаемых каналов плазматической мембраны клеток A43I. Показано, что эпйдермальный фактор роста активирует

каналы данного типа.

4. Активность обнаруженных Са2+-проницаемых каналов усиливается при подаче ко внутренней стороне изолированного фрагмента мембраны негидролизуемого аналога отр или фторида алюминия; по-видимому, активность каналов этого типа регулируется непосредственно етр-связывающим белком.

5. Сопоставление результатов, полученных при регистрации' активности одиночных каналов, с результатами, полученными при измерении концентрации свободного внутриклеточного Са2+, позволяет сделать вывод о том, что при стимуляции клеток A43I эпидермальным фактором роста основной вклад в кальциевый вход дают Са2+-проницаемые каналы, активируемые через GTP-зависимый механизм.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Г.Н.Можаева, А.П.Наумов, Ю.А.Курышев. Активация кальций-чувствительных калиевых каналов клеток A43I эпидермальным фактором роста и гистамином // Биологические мембраны. 1989 -Т.6 (6), -С.629- 636.

2. О. N.'Hozhayeva, A.P.Naumov, Yu. A. Kuryshev. Epidernal growth factor activates calcium-permeable channels in A431 eel Is // Biophys. Biochem. Acta. 1989. -V.1011 p. 171-175.

3. А.П.Наумов, Г.Н.Можаева, Ю.А.Курышев. Рецептор-управ-ляемые кальциевые каналы клеток эпидермальной карциномы A43I // Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" Пущино. -1989, -С.73. . .

4. Г.Н.Можаева, А.П.Наумов, Ю.А.Курышев. Кальций-зависимые калиевые каналы клеток карциномы A43I и их активация эпидермальным■фактором роста и гистамином // Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" Пущино. -1989, -С.71.

5. Г.Н.Можаева, А.П.Наумов, Ю.А.Курышев. Активация кальциевых каналов клеток A43I'эпидермальным фактором роста

//'Цитология. 1989, -Т.31 (9) -C.I064-I073.

6. Г.Н.Можаева, А.П.Наумов, Ю.А.Курышев. Два типа рецептор-управляемых кальциевых каналов в клетках эпидермоидной карциномы A43I // Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических мембранах" Пущино. -1990, -С.59.

7. G.N.Mozhayeva, A.P.Naumov, Yu.A,Kuryshev, Receptor-operatedT calcium channels in human .carcinoma cells // Second soviet-spaniah symposium on physical chemical biology. Biologycal membranes! structure and functions.' -Kiev. -1990, p.25.

8. G.N. Hozhayeva, A.P.Haumov, Yvi. A. Kuryshev. Calcium-permeable channels activated via guanine nucleotide-dapendent mechanism in human carcinoma cells // FEB3 Letters. 1990. -V.277 (1,2) p.227-229.

9. Ю.А.Курышев, Г.А.Савохина, П.В.Авдонин, А.П.Наумов. Исследование роли ГТФт-связываицих белков в генерации кальциевого ответа эпидермальным фактором роста в клетках A43I. Действие фторида и бактериальных токсинов. Ш91 Биологические мембраны. -Т.8 ню, -C.I082-I087.

10. 0.N.Hozhayeva, A.P.Naumov, Yu.A.Kuryshev. Variety of Ca2+- permeable channels in human carcinoma A431 cells // J. of Membrane Biology. 1991. -V.124 (2), -F. 113-12B.