Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция активности первого компонента комплемента эффекторами из прострела раскрытого PULSATILLA PATENS

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности первого компонента комплемента эффекторами из прострела раскрытого PULSATILLA PATENS"

р- МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ "I »ЧИТИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

на правах рукописи

КАЛЬЧЕНКО Вячеслав Владимирович

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЭФФЕКТОРАМИ ИЗ ПРОСТРЕЛА РАСКРЫТОГО PULSATILLA PATENS

03.00.04- Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Чита -1998

Работа выполнена на кафедре биохимии Читинской государственной медицинской академии

Научные - . Заслуженный деятель науки Российски

руководители: Федерации, академик РАМН, докто|

медицинских наук, профессо| В.Н.Иванов;

Кандидат химических нау>

Б.Б.Шойбонов

Официальные оппоненты:

Лауреат премии Совета Министро СССР, доктор медицинских нау профессор Н.Н.Цыбиков Доктор биологических наук, профессор Л.В.Козлов

Ведущая организация

Московский научно-исследовательскг институт эпидемиологии

микробиологии им. Г.Н.Габричевского

Защита диссертации состоится "0£" 1998 г.

в /¿7часов на заседании диссертационного совета Д 84.74.01 пр| Чигчнской государственной медицинской академии по адресу 672090, г. Чите, ул. Горького, 39-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Читинской государственной медицинской академии по адресу: 672090, г. Чита,ул. Горького, 39-А.

Автореферат разослан " г^^^л-, 1998 г. Ученый секретарь диссертационного

совета Д 84.74.01 к:б.н., с.н.с. А.Н.Ложкини

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важных проблем современной физико-химической биологии является выяснение молекулярных механизмов инициации каскада ферментативных протеолитических реакций в процессах функционирования сложных биологических систем. Примером такой системы является совокупность белков комплемента, представляющая собой часть иммунной системы организма и играющая важную роль как на ранних стадиях иммунного ответа, так и на завершающих этапах борьбы организма с чужеродными и патологическими клетками, вирусами и токсинами. Исследования последних лет все больше убеждают в участии этой системы, а иногда и в ответственности ее за развитие патологических процессов, при аутоиммунных заболеваниях (Frank, Fries, 1991; Asghar , 1995; Baldwin , 1995; Uszewski et al., 1996). Как оказалось, не только дефициты отдельных компонентов комплемента, но в ряде случаев и гиперфункция системы входят в перечень причин развития как аутоиммунного, так и опухолеродного процессов (Morgan , 1995; Weizer et al., 1996; Nishikawa et al., 1996). Система комплемента активируется в результате каскада реакций ограниченного протеолиза. В последнее время в число участников системы включают также клеточные рецепторы фрагментов компонентов и мембранные белки-регуляторы. К функциям системы комплемента в настоящее время относят не только литическую (открытую первой и представляющую собой атаку клеточной стенки с последующим лизисом клетки), но и медиаторную, поскольку фрагменты отдельных компонентов комплемента, освобождающиеся в ходе ферментативного каскада активации, являются медиаторами многих реакций организма (Ross, Medof , 1985;' Barel et al., 1995; Bjarne et al., 1995; Gustavsson et al., 1995; Takabayashi et al., 1995; Croix et al., 1996).

Ключевым моментом инициации классического пути комплемента является активация его первого компонента - Cl. Знание механизмов и специфичности "узнавания", лежащих в основе "запуска" комплемента, позволит осуществлять контроль за функционированием системы на самых ранних этапах нормальных и патологических процессов (Silvestri et al., 1981; Cjjper , 1985; Schumaker, 1987; Davis , 1988; Gregorek et ai, 1991).

Перспективным направлением в изучении системы комплемента являются поиск и создание искусственных регуляторов системы, могущих, по видимому, играть не последнюю роль в терапии ряда иммунных, опухолевых и инфекционных заболеваний (Rubin et al., 1990; Weisman et al., 1990; Sugifa , Masuho , 1995; Amsterdam et al., 1995; Chavez-Cartaya et al., 1995). В последние годы значительный интерес иммунологов, медиков и фармакологов направлен на изучение эффекторов растений, обладающих противовоспалительным, противоопухолевым эффектами. Показано, что в

таких растениях содержатся эффекторы, оказывающие воздействия н систему комплемента (Yamada et al., 1986; Kloareg , Quartrano , 198i Mabeau et al., 1990; Chaubet et al., 1992; Patankar et al, 1993).

Цель и зпдпчи исследования. Настоящая работа является часты исследований химии системы комплемента человека, проводимых на кафедр биологической химии Читинской государственной медицинской академи! Целью работы являлось изучение механизмов воздействия эффекторов v прострела раскрытого Pulsatilla Patens на систему комплемента. В связи этим решались следующие задачи:

1. Исследование механизма воздействия настойки прострела раскрытого н систему комплемента.

2. Разработка метода выделения эффекторов из прострела раскрытого н аффинном сорбенте.

3. Установление химической природы эффекторов комплемента из прострел раскрытого.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы бы впервые исследован механизм воздействия эффекторов из прострел раскрытого на систему комплемента, разработан оригинальный микромето исследования связывания и диссоциации ингибиторов субкомпонента Clq составе комплекса EAClq, разработан аффинный метод выделени эффекторов субкомпонента Clq с использованием принципиально новог подхода - двойного аффинного сорбента - естественно связанног субкомпонента Clq первого компонента на сорбенте - lgG-стекле, изучен физико-химические свойства ингибитора.

Разработанные методы создают научные и методические предпосылк для дальнейшего исследования системы комплемента и ее эффекторов. Новы пептидные специфические эффекторы комплемента из препарато растительного происхождения представляют удобныеь инструменты дл исследований в области комплементологии для регуляции ключевой стадии инициации каскада активации системы комплемента. Материал! диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры биохими ЧГМА, лаборатории иммунологии МНИИ эпидемиологии и микробиологии ил Г. Н. Габричевского. По результатам представленных исследований подан* заявка на изобретение: "Способ получения вещества, регулирующей активность компонента С1 комплемента".

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Эффекторы из прострела раскрытого Pulsatilla Patens влияют на стадию инициации активации системы комплемента в зависимости от функционального состояния субкомпонента Clq.

2. Разработанный микрометод исследования связывания и диссоциации ингибиторов субкомпонента Clq в составе комплекса EAClq позволяет подобрать оптимальные условия для фракционирования эффекторов аффинной хроматографией.

3. Использована в целях препаративной биохимии естественно иммобилизованная молекула Clq на аффинном сорбенте lgG-стекло. Отработаны оптимальные условия элюции Clq-ингибитора из прострела раскрытого.

4. Получен в гомогенном состоянии Clq-ингибитор из препарата прострела раскрытого. Исследованы физико-химические свойства препарата.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции "Экологические интоксикации: биохимия, фармакология, клиника* (Чита, 1996), на I региональной конференции "Сохранение биологического разнообразия в Байкальском регионе: проблемы, подходы, практика* (Улан-Удэ, 1996), на Втором научном конгрессе "Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты" (Чебоксары, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы.

Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 рисунками и 8 таблицами. Список цитированной литературы включает 215 наименований, из них 37 - отечественных и 178 -зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение сенсибилизированных эритроцитов (ЕА), изотонического вероналового буфера, рН 7,4 (VBS), содержащего ионы Са2+ и Mg2t (VBS2*) проводили по методу Кэбота и Мейера (1968). Гемолитическую активность комплемента оценивали по степени лизиса ЕА сывороткой человека

(классический путь активации) и по гемолизу эритроцитов кролике (альтернативный путь активации).

Функциональную активность отдельных компонентов комплемента (Clq С1-С5, факторов В, D) определяли методом гемолитического титровани! (Козлов и соавт., 1982) при добавлении к нативной сыворотке крови доноро! специальных реагентов (производства Кировского НИИ гематологии к переливания крови). Использование этих реагентов в гемолитической систем« дает линейные зависимости активности соответствующих компонентов о" величины z, которая определяется по формуле

z = In [(Н - Rj/(H - X)], где Н, R, и X - величины оптической плотности npv 405 нм соответственно гемолитической системы при полном лизисе, е контроле (без титруемого компонента) и в опытной пробе.

Субкомпоненты Clq , Clr и Cls первого компонента комплементе получали аффинной хроматографией на lgG-стекле (Козлов и соавт., 1989).

Исследование ингибирования связывания Clq проводили гемолитическим методом в два этапа: сначала выдерживали ЕА с Clq в присутствик изучаемого эффектора или без него, после этого осаждали, декантировали, с ресуспендированные эритроциты инкубировали с подобранным количеством реагента Rlq и после центрифугирования определяли оптическую плотноси супернатанта при 405 нм (Козлов и соавт., 1986).

Для приготовления настойки прострела раскрытого Pulsatilla Patens (ПП брали наземную часть растения, собранную в окрестностях г. Читы. ПГ собирали в период цветения - начала плодоношения и сушили в тени Высушенную наземную часть заливали 5 объемами 40° спирта и настаивал)' при комнатной температуре 7-10 дней. Полученную настойку диализовалк против VBS и использовали в наших экспериментах.

Для выделения регуляторов субкомпонента Clq в качестве аффинногс сорбента использовали lgG-стекло с естественно иммобилизованнымк молекулами Clq (Clq-lgG-стекло). Аффинный сорбент готовили следующие образом. На колонку с lgG-стеклом, уравновешенную 0,01 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М NaCI и 0,01 М ЭДТА (рН 7,4), наносилк сыворотку крови человека. После полного внесения сыворотки протекание через колонку останавливали и инкубировали с сывороткой 30 минут при 4°С для полного связывания субкомпонента Clq первого компонента системь комплемента. Колонку промывали стартовым буфером, собирая белковые фракции и определяя в них остаточную активность Clq. Фракцик "несвязавшихся" белков использовали в дальнейшем в качестве реагента Rlq.

Аффинную хроматографию на Clq-lgG-стекле проводили следующим образом. На колонку с аффинным сорбентом, уравновешенную 0,01 М трио

HCI-буфером, содержащим 0,15 М NaCI, ионы Са2* и Мд2* (рН 7,4), наносили раствор прострела раскрытого после диализа против стартового буфера, выдерживали 40 минут для полного связывания эффекторов с молекулами Clq. Затем колонку промывали стартовым буфером, собирая фракции несвязавшихся веществ -'проскок*. После выхода 'проскока* колонку продолжали промывать стартовым буфером до А280 = 0 и проводили элюцию 0,01 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М NaCI, 0,01 М ЭДТА. При промывании колонки хелатирующим агентом с колонки снималась фракция (ПП-1).

Для элюирования Clq-ингибитора использовали 0,01 М трис-НО-буфер, содержащий 0,15 М NaCI, 5,48 мМ лизин (рН 7,4). Фракцию ПП-2 в дальнейшем подвергали гель-фильтрации.

Гель-фильтацию Clq-ингибитора (ПП-2) осуществляли на колонке (2,5 х 40 см) с сефадексом G-50 (superfine), уравновешенной 0,01 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М NaCI (рН 7,4). Для определения молекулярной массы в качестве стандартов использовали химотрилсиноген, РНК-азу ('Serva*, ФРГ), окситоцин, глутатион ('Sigma', США).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию под давлением (HPLC) проводили на колонке Macrosphere GPS 60 7U (Alltech) (4,6 x 250 мм], используя хроматографическую систему LKB 2135 UltroPax (Швеция). Колонка была уравновешена в 0,04 М фосфатном буфере, содержащем 0,2 М NaCI и 10% этанола, рН 6,8 при 20°. Элюируемые пептиды определялись измерением поглощения при 220 нм. На колонку наносили 100 мкл препарата ПП-2.

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах Kieselgel 60 ¡Merck) в системе изопропанол-вода-уксусная кислота (90:16:4). Зоны обнаруживали с помощью нингидрина и серной кислоты после прогревания при 100° в течение 5 минут (Ахрем , Кузнецова, 1965).

Содержание белка определяли по модифицированному методу Бредфорд (Appenroth, Augsfen, 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Регуляция системы комплемента эффекторами из прострела раскрытого Pulsatilla Patens

Препарат прострела (ПП) дозозависимо ингибирует классический путь активации системы комплемента. Преинкубация сыворотки с препаратом существенно не влияет на результаты, что свидетельствует либо об отсутствии прямой инактивации какого-либо компонента комплемента, либо об активации системы в целом (рис.1).

Рис.1. Влияние препарата ПП на классический путь активации комплемента: 1 - без преинкубации сыворотки с ПП; 2 -преинкубация сыворотки с ПП 20 мин при 37°.

Для выяснения механизма действия ПП на комплемент изучено влияни! на отдельные стадии каскада активации комплемента. Было исспедоваж влияние ПП на связывание субкомпонента СЦ на ЕА. Количество комплексе ЕАСТя, образующегося при инкубации ЕА с функционально чистыд субкомпонентом С^, зависело от количества добавленного в систему ПП Данные о количестве С^ на ЕА приведены в таблице 1

Влияние ПП на связывание субкомпонента Clq на ЕА

Состав системы ПП, мкл/мл Количество Clq на ЕА после 30 мин инкубации, %

ЕА+ Clq 0 100

ЕА + Clq 20 131

ЕА + Clq 30 275

ЕА + Clq 40 309

ЕА + Clq 60 415

ЕА + Clq 80 534

В то же время ПП не оказывал влияния на связывание Clq и С4Ь из реагента R2 при инкубации с ЕА. Данный эффект препарата ПП обусловлен, по-видимому, тем, что в сыворотке субкомпонент Clq преимущественно находится в виде комплекса Clq-(Clr2, Cls2), а для стимулирующего действия ПП, вероятно, требуется свободная коллагеноподобная часть молекулы Clq. Как указывалось в обзоре (Colomb et al., 1984), в физиологических условиях Cl в кровотоке при концентрации 1,8 х 10'7 M диссоциирован на 30%. В нашей модельной системе с функционально чистым Clq при инкубации 30 минут при 37° только 7% молекул Clq успевает связаться на ЕА, в то время как в присутствии препарата ПП связывание Clq в 5 раз выше. Аналогичных данных в литературе мы не обнаружили.

Учитывая то, что препарат ПП оказывал ингибирующий эффект на классический путь активации комплемента, нами проведены исследования последующих стадий каскада.

Было обнаружено выраженное тормозящее действие после посадки Clq на ЕА (рис. 2). В присутствии различных концентрации ПП получали разные значения z (z0 - в отсутствии ингибитора). Константу ингибирования К, расчитывали по линейному уравнению 1/z от . концентрации ПП При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению Кг По данным, приведенным на рис. 2, была оценена константа ингибирования -13,3 мкл/мл.

Поскольку нами был сделан вывод об отсутствии инактивации отдельных компонентов комплемента, то ингибирование может быть обусловлено какой-либо стадией, связанной либо с формированием комплекса Cl, [Clq(Clr2Cls2)], либо активацией компонента С4 ферментом Cl s, либо последующей посадкой и функционированием иммобилизованного С4Ь. Препарат ПП не оказывал влияния на расщепление компонента С4, посадку С4Ь и последующие этапы комплементарного каскада.

Рис.2. Ингибирование ПП формирования С1 комплекса на ЕАСЦ.

Для исследования воздействия ПП на стадии сборки С1 комплекса был проведены следующие эксперименты. Комплекс ЕАС1я предварительна инкубировали с препаратом ПП и центрифугировали. Контрольными сериям служили пробы, в которых ЕА инкубировали с препаратом ПП или ЕАС^ бе него. Количество оставшихся гемолитически активных молекул С1ц на Ъ определяли после ресуспендирования в системе с Ц. Полученные данны убедительно доказывают, что препарат прострела связывается с С^ составе комплекса ЕАС1я и связывание достаточно прочно. Для локализаци места связывания ПП с С1р, с одной стороны, и для подбора оптимально концентрации раствора лизина для диссоциации комплекса ЕАСЦ-ПП, другой стороны, были проведены следующие эксперименты. После связывани ПП с комплексом ЕАСЦ систему центрифугировали и осадок с ЕАС1я-ПГ ресуслендировали в буфере (УББ), содержащем возрастающие концентраци лизина. Тщательно перемешивали и повторно инкубировали для диссоциаци:

Диссоциация комплекса ЕАС^-ПП в зависимости от концентрации лизина в системе

Активность С1 я

Состав Содержание после инкубации и

системы лизина, мМоль/л ресуспендирования, %

ЕАС1Ч 0 100

ЕАСЦ-ПП 0 34

ЕАС1я-ПП 2,74 9

ЕАС1Ч-ПП 5,48 97

ЕАС1д-ПП 8,07 30

Таблица 3

Диссоциация комплекса ЕАСЦ-ПП в зависимости от

концентрации маннозы в системе

Активность С1 я

Состав Содержание после инкубации и

системы маннозы, мМоль/л ресуспендирования, %

ЕАС1я 0 100

ЕАС1Ч-ПП 0 65

ЕАС1Ч-ПП 2,2 44

ЕАС1Ч-ПП 4,4 123

ЕАС1д-ПП 6,5 70

комплекса ЕАОц-ПП. Количество регенерированных ЕАС1я определяли после ресуспендирования в системе с Данные о восстановлении

активности ЕАС1 q после диссоциации ингибитора приведены в таблице 2.

Аналогичные исследования были проведены и с маннозой. Данные о влиянии разных концентраций маннозы на диссоциацию комплекса ЕАС^-ПП приведены на таблице 3.

Приведенные в таблицах 2 и 3 данные показывают, что диссоциация эффектора из комплекса ЕАС1я зависит как от наличия в системе лизина, так и от маннозы. Причем при высоких концентрациях данных компонентов в среде наблюдается элюирование самих молекул С1 я с иммунного комплекса, -что было доказано позже методом хроматографии.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что препарат прострела содержит регуляторы субкомпонента С1я первого

компонента комплемента. Разработка метода выделения эффекторов Clq и: ПП явилась логическим продолжением работы.

2. Выделение регуляторов субкомпонента Clq первого компонента комплемента из настойки прострела раскрытого Pulsatilla Patens

Для выделения регуляторов субкомпонента Clq в качестве аффинноп сорбента использовали lgG-стекло с естественно иммобилизованным! молекулами Clq с целью получения двойного аффинного комплекса Clq-IgG стекло. Ранее сорбент использовали для выделения субкомпонентов Clq, С1 и Cls (Козлов и соавт., 1989) и блокатора Clq - связывающего участка Сн! домена тяжелой цепи IgG из пептидного препарата сердца (Бадмаева соавт., 1996). Для приготовления Clq-lgG-стекла на колонку с lgG-стекло* уравновешенную 0,01 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М NaCI и 0,0 М ЭДТА (рН 7,4), наносили сыворотку крови человека. После полной введения сыворотки протекание буфера через сорбент прекращали выдерживали 30 минут при 4°С для полного связывания субкомпонента Cli первого компонента комплемента с иммуноглобулином. Далее колонк промывали стартовым буфером, собирая белковые фракции и определяя них остаточную активность Clq. Фракции 'несвязавшихся* белко использовали в дальнейшем в качестве реагента Rlq.

Аффинную хроматографию на Clq-lgG-стекле проводили следующи* образом. На колонку с аффинным сорбентом наносили настойку прострел раскрытого после диализа против стартового буфера и выдерживали н колонке 40 минут для полного связывания эффекторов с иммобилизованным на lgG-стекле молекулами Clq. Затем колонку промывали стартовы, буфером, собирая фракции несвязавшихся веществ - 'проскок*. Общи объем этой фракции составлял 1,5 объема исходного препарата. В это фракции антикомплементарная активность не выявлялась, чт свидетельствовало о полном связывании активного начала с сорбентом.

После выхода 'проскока* колонку продолжали промывать стартовы буфером до А28О=0 и проводили элюцию буфером, содержащим ЭДТА качестве хелатирующего агента. При этом с колонки элюировалась фракци: обладающая стимулирующей активностью на связывание субкомпонента С1 с ЕА- пик-1 (ПП-1).

Для элюирования ингибитора Clq использовали буфер с подобранно концентрацией лизина в гемолитической системе (рис. 3).

Для проверки эффективности элюирования Clq-ингибитора с аффинного сорбента и адекватности концентрации лизина, подобранной в гемолитической системе, нами проведены сравнительные хроматографии на С1 q-lgG-стекле препарата прострела. Настойку прострела раскрытого после диализа против 0,01 М трис-НС1-буфера, содержащего 0,15 М NaCI и 0,01 М ЭДТА, pH 7,4 наносили на колонку с Clq-lgG-стеклом, уравновешенную тем же буфером. После промывания колонки стартовым буфером проводили элюцию Clq-ингибитора (ПП-2) при разных концентрациях лизина в буфере (рис. 4).

Как следует из приведенных на рис.4 хроматограмм, при концентрации лизина 2,74 мМ с аффинного сорбента элюируется около 20% Clq-ингибитора, а при концентрации 8,07 мМ происходит элюирование комплекса Clq-nn-2.

Таким образом, концентрация лизина для элюирования Clq-ингибитора (ПП-2), экспериментально подобранная в микрометоде, в гемолитической системе оказалась оптимальной, так как при большей концентрации лизина в буфере наблюдается диссоциация Clq вместе с ингибитором.

С целью проверки чистоты выделенного препарата ПП-2 и определения его молекулярной массы была проведена гель-фильтрация на сефадексе G-50 (superfine), где эффектор элюировался в виде одного пика, соответствующего значению М^БОО Д (рис. 5). Ингибирующее влияние выделенной фракции на комплементарный гемолиз комплекса EAClq реагентом Rlq подтвердило искомую активность. Константа ингибирования формирования комплекса С1 составила 10,6 мкл/мл (рис. 6). Фракцию ПП-2 в дальнейшем подвергали высокоэффективной жидкостной гель-хроматографии на колонке Macrosphere GPS 60 7U 4,6 х 250 мм (Alltech). Была показана гомогенность полученного препарата. Вещество представляет собой пептид с молекулярной массой 750-850 Д, N-конец которого неопределяется при тонкослойной хроматографии, дает положительную реакцию с биуретовым реактивом, не содержит углеводы, при сканировании максимальная экстинкция при 220 нм.

Выделенный эффектор ПП-2 проявляет свойства, аналогичные Clq-ингибитору. В организме животных ингибитором Clq является хондроитин-4-сульфат-протеогликан, который продуцируется лейкоцитами и тромбоцитами (Olsson, Gardel, 1967). Взаимодействие Clq с коллагеном осуществляется коллагеноподобной частью молекулы Clq. Ассоциация обусловлена взаимодействиями гидрофобной и электростатической природы. Связывание Clq с колагеном может иметь биологическое значение. В работе (Allan et al., 1975) показано, что коллаген стерически препятствует связыванию Clq с иммунными комплексами. Физиологически это может происходить в ситуациях, когда существуют Clq, растворимые коллагены и иммунные комплексы

(например, в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом). Наши данные согласуются с применением водочного настоя прострела раскрытого в народной медицине при радикулитах, полиартритах и при других воспалительных процессах.

Рис.3. Выделение эффекторов Clq из настойки прострела раскрытого Pulsatilla Patens аффинной хроматографией на колонке с Clq-lgG-стеклом (9,5 х 2,5 см), уравновешенной 0,01 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М NaCI, 1 мМ Са , рН 7,4. Обозначения: 1 ■ промывание колонки 0,01 М ЭДТА в стартовом буфере; 2 -промывание колонки 5,48 мМ лизином в трис-НС1-буфере, содержащем 0,15 М NaCI, рН 7,4; 3 - Aj80; 4 - влияние на связывание Clq, %; 5 - гемолитическая активность EAClq, %.

Pulsatilla Patens аффинной хроматографией на колонке с Clq-lgG-стеклом (9,5 х 2,5 см), уравновешенной 0,01 М трис-НС1-буфером, содержащим 0,15 М NaCI, 0,01 ЭДТА, рН 7,4. Обозначения: 1 -промывание колонки: (А - 2,74 мМ лизином; Б - 5,48 мМ лизином и В -8,07 мМ лизином) в трис-НС1-буфере, содержащем 0,15 М NaCI, рН 7,4; 2 - А^ 3 - влияние на связывание Clq, %.

е,м

3-

ПП-2

Н сррякции

Vv0

Рис. 5: а - гель-фильтрация на сефадексе G-50 (superfine) фракции прострела после аффинной хроматографии на Clq-lgG-стекле (ПП-2); б - определение молекулярной массы эффектора ПП-2 гель-фильтрацией: 1 - химотрипсиноген, 2 - РНК-аза, 3 - окситоцин, А -глутатион.

Другим проявлением биологической активности Clq после удаления С1-ингибитором ферментов С1г и Cls является взаимодействие коллагёноподобной области Clq с фибронектинами. Одной из функций фибронектинов является удаление циркулирующих иммунных комплексов (Blumenstock et al., 1978). Данные опсонины , возможно, ускоряют клиренс образующихся в крови ИК, покрытых Clq. Clq обладает способностью связываться с гепарином и гепариноподобными мукополисахаридами. Связывание с ними может ингибировать взаимодействие Clq с С1г и Cls (Bing , 1981). '

Белок Clq является лигандом для ряда клеточных рецепторов на В-лимфоцитах (Crockard et al., 1993), лимфобластоидных клетках (Chen et al., 1994), полиморфноядерных лейкоцитах (Daha et al., 1990, 1993; Young et al., 1991) и тромбоцитах (Peerschke et al., 1993). Clq может конкурировать с коллагеном за коллагенсвязывающие участки на поверхности тромбоцитов v тем самым ингибировать вызванную коллаген-индуцированную агрегации: тромбоцитов. Взаимодействие Clq с полиморфноядерными лейкоцитамк-стимулирует окислительный метаболизм в клетках (Ruiz et al., 1995).

Рис. 6. Ингибирование Г1П-2 формирования С1 комплекса на ЕАС1р.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Знание механизмов естественной регуляции системы комплемента, а также методов искусственного воздействия на нее позволило бы, во-первых, понять патогенетическую основу многих заболеваний, этиология которых неизвестна или спорна, а во-вторых, создать средства эффективной регуляции комплементостаза.

В проведенном исследовании удалось установить некоторые ранее неизвестные пути естественной регуляции системы комплемента. Так, возможность повышения аффинности субкомпонента к иммунным

комплексам в присутствии эффекторов из прострела раскрытого была продемонстрирована в модельной системе стадии инициации. Обнаруженный нами эффект стимуляции связывания субкомпонентаОя может иметь большое биологическое значение. Данный эффект не наблюдается, если для связывания С1 я на ЕА используется сыворотка или реагент 1?2. Наличие

эффектора, стимулирующего связывание Clq было подтверждено пр фракционировании настойки прострела раскрытого на аффинном сорбент Clq-lgG-стекло. Наработка в достаточных количествах данного эффектор* позволит на следующем этапе работы регулировать ключевую стадии комплементарного каскада.

Обнаружение в данном препарате другого эффектора, Clq-ингибиторс может объяснить противовоспалительное действие настоя прострела, которы используется в народной медицине. Это заключение вытекает из функци субкомпонента Clq после диссоциации С1 комплекса под действием Cl-INh Блокирование Clq-ингибитором из прострела коллагеноподобной част молекулы подавляет агрегацию тромбоцитов, фагоцитоз нейтрофилоЕ моноцитов/макрофагов, продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитам1< связывание иммунных комплексов эндотелиальными клетками, так как функци этих клеток реализуются через Clq-рецептор. Связывание Clq-ингибитор! коллагеноподобной части молекулы Clq также может приводить подавлению продукции супероксидов нейтрофилами.

В практическом плане наибольший интерес представляет седативны эффект прострела раскрытого. Последующая работа по исследовании влияния Clq-ингибитора из прострела раскрытого на нервную систему дас ответ на многие вопросы взаимосвязи систем в организме.

ВЫВОДЫ

1. Исследован механизм действия эффекторов из прострела раскрытой Pulsatilla Patens на систему комплемента. Показано, что эффект зависит о стадии активации: ПП стимулирует связывание Clq на иммунны комплексах; после иммобилизации Clq ингибирует формирование С комплекса.

2. Разработан микрометод исследования связывания и диссоциаци ингибиторов субкомпонента Clq в составе комплекса EAClq.

3. Разработан метод получения аффинного сорбента Clq-lgG-стеклс отработаны оптимальные условия препаративной работы на нем.

4. Разработан метод выделения регуляторов субкомпонента Clq и прострела раскрытого Pulsatilla Patens аффинной хроматографией н< Clq-lgG-стекле.

5. Получен в гомогенном состоянии Clq-ингибитор из прострела раскрытого. Показано, что вещество имеет пептидную природу, защищенный N-конец и не содержит углеводы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выделение регуляторов субкомпонента Clq из Pulsatilla Patens (L.) Miller // Экологическая интоксикация: биохимия, фармакология, клиника: Тез. докладов Всеросс. науч. конференции. - Чита. - 1996,- Т. 2. - С. 179 (Соавт.: Шойбонов Б.Б., Иванов В.Н.).

2. Особенности действия препарата из Pulsatilla Patens (L.) Mill, на систему комплемента человека // Сохранение биологического разнообразия в Байкальском регионе: проблемы, подходы, практика: Тез. докладов I региональной конференции. - Улан-Удэ. - 1996. - Т. II. - С. 128-130 (Соавт.: Шойбонов Б.Б., Дондоков В.Н., Иванов В.Н.).

3. Влияние ингибитора трипсина из сои и отвара прострела на кровь в условиях in vitro // Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты: Тез. докладов Второго научного конгресса. - Чебоксары. - 1996. - С. 115 (Соавт.: Шойбонов Б.Б., Ложкина А.Н., Черепанова Т.А.).

4. Регуляция системы комплемента препаратом прострела Pulsatilla Patens in vitro // Забайкальский медицинский вестник. - 1998. - Т. 1-3. - С.34-38 (Соавт.: Шойбонов Б.Б., Иванов В.Н., Зинченко A.A.).

5. Способ получения вещества, регулирующего активность компонента С1 комплемента // Заявка на изобретение. - № 97112328 от 15 июля 1997 (Соавт.: Шойбонов Б.Б., Иванов В.Н.).