Регуляция активности глутатионредуктазы из печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов

Агарков, Александр Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция активности глутатионредуктазы из печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности глутатионредуктазы из печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов"

На правах рукописи

Агарков Александр Алексеевич

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ

03.00.04. - Биохимия

5 ко я ¿ссз

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2009

003482454

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Попова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ковалева Тамара Андреевна;

кандидат биологических наук, Лущик Марина Валерьевна

Ведущая организация

ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский ветеринарный институт

патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии»

Защита состоится 27 ноября 2009 года в 14-00 час. на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 390006, Воронеж, Университетская пл., 1, биолого-почвенный факультет, конференц-зал учебного корпуса 1А.

С диссертацией можно ознакомится в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета

Автореферат разосланоктября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Известно, что большинство патологических процессов протекает на фоне образования активных форм кислорода (АФК) и усиления свободнорадикального окисления (СРО) биосубстратов. В ответ на это происходит активизация антиоксидантной системы (АОС) клетки. АОС представлена низкомолекулярными соединениями, к которым относят витамины А, С, Е и К, биофлавоноиды, низкомолекулярные тиолы, а также антиоксидантными ферментами (супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП), глутатионредуктаза (ГР), каталаза и т.д.). Учитывая то, что большинство патологических состояний сопровождается усилением СРО, повреждающим белковые структуры, молекулы ДНК и липидов [Ланкин В.З., 2001; Bakker S.J., 2000; Kowaltowski A.J., 1999] и ослаблением активности АОС, весьма актуальной представляется оценка состояния этих систем с целью ранней диагностики и обоснованного лечения заболеваний.

ГР (КФ 1.6.4.2) - распространенный фермент, катализирущий обратимое НАДФН-зависимое восстановление окисленного глутатиона (GSSG) [Карпищенко A.C., 1999]. Биологическая роль ГР - поддержание высокой внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона (GSH) без увеличения его синтеза. В последнее время значительное внимание уделяется созданию специфических ферментных биотест-систем с использованием ГР для оценки целевой биологической активности антиоксидантной направленности в фармакологически активных веществах [Бродов М.С., 2004].

В настоящее время в литературе имеются данные относительно некоторых каталитических свойств фермента из тканей животных [Gutterer J.M., 1999, Boggaram V., 1979] и человека [Untucht-Grau R., 1981; Krauth-Siegel R.L., 1982] в условиях нормы. Однако особенности функционирования данного фермента при патологии печени остаются не исследованными.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование каталитических свойств и регуляции активности ГР из печени крыс в норме, при экспериментальном токсическом гепатите (ЭТТ) и введении веществ — протекторов: тиоктовой кислоты (ТК) и GSH, при патологии. В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Определение активности и субклеточной локализации ГР из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и действии ТК и GSH;

2. Получение гомогенных ферментных препаратов ГР из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту животных, а также крыс, которым при патологии вводили вещества-протекторы;

3. Сравнительная характеристика кинетических параметров каталитического действия ГР из печени крыс в норме, в условиях развития патологического процесса, вызванного введением ССЦ, и действия веществ, обладающих протекторными свойствами при патологии;

4. Исследование регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении веществ - протекторов под действием метаболитов цикла Кребса;

5. Изучение участия интермедиатов пентозофосфатного пути (ПФП) в регуляции активности ГР из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК и GSH при патологии;

6. Изучение участия ионов металлов и нуклеотидфосфатов в регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК и GSH;

7. Изучение количественной экспрессии гена ГР в печени крыс в норме, при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов при патологии.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование особенностей регуляции активности ГР в условиях развития оксидативного стресса при ЭТГ у крыс. Разработаны способы очистки и получены гомогенные препараты ГР из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым при развитии патологии вводили вещества-протекторы. Выявлены особенности экспрессии фермента и дана сравнительная характеристика его каталитических и регуляторных свойств в норме, патологическом состоянии и при введении тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона при токсическом поражении печени. Впервые установлено, что введение протекторов сопровождается изменением активности и уровня экспрессии фермента, возрастающих при токсическом гепатите, в сторону значений в норме. Полученные данные представляют собой интерес с точки зрения регуляции образования АФК за счет изменений активности ГР, взаимосвязанных с модификацией экспрессии, а также кинетических и регуляторных свойств фермента под действием ионов металлов, интермедиатов цикла Кребса, пентозофосфатного пути, нуклеотидфосфатов. Проведенные исследования способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений о механизмах регуляции образования АФК с помощью одного из ключевых ферментов антиоксидантной системы в условиях развития токсического гепатита и действия протекторов.

Практическая значимость.

использовании ГР, могут применяться как в медицине, так и в фармации [Бродов М.С., 2004]. Результаты исследования регуляции активности глутатионзависимых ферментов, к числу которых относится ГР, могут использоваться для контроля за состоянием антирадикальной защиты, дифференциальной диагностики, объективизации контроля эффективности терапии, прогнозирования течения некоторых заболеваний.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», «Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами Воронежского госуниверситета.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены в межрегиональном сборнике научных работ «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2006), на научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» Ростов-на-Дону, 2006), на 20-м съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова при РАН (Москва, 2007), на 3-ей Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2007), на международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Сапожниковой (Саранск, 2008), в материалах Всероссийской научной конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболевай человека» Российской академии естествознания (Москва, 2008), на Международной студенческой биологической конференции, посвященной 90-летию Ереванского государственного университета и 75-летию факультета биологии (Ереван, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных «Актуальные вопросы медицинской науки», (Ярославль, 2009), на Всероссийской научной конференции учащихся, студентов и молодых ученых "Научное творчество XXI века", (Красноноярск, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик», (Курск, 2009), на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз, Россия - 2009", (Пермь, 2009), на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), на Международной научно-практической конференции «Современные проблемы гуманитарных и естественных наук» (Москва, 2009), на Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009), а также на ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 18 публикациях - в 5 статьях и 13 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В условиях интенсификации СРО при ЭТГ происходит увеличение активности и уровня экспрессии ГР в печени крыс, которые снижаются при введении животным ТК и вЗН при патологии. При этом субклеточная

локализация, молекулярная масса, рН-оптимум и электрофоретическая подвижность фермента не изменяются.

2. С использованием гомогенных ферментных препаратов выявлена модификация некоторых кинетических и физико-химических параметров каталитического действия ГР: Км, Е^ температурного оптимума, термостабильности. Введение гепатопротекторов приводит к изменению значений исследованных параметров в сторону нормальных величин.

3. При ЭТТ происходят изменения регуляции активности ГР интермедиатами пентозофосфатного пути и цикла Кребса, нуклеотидфосфатами, ионами некоторых металлов. Ряд модификаций регуляторных свойств ГР, характерных для фермента из пораженной гепатотоксином печени, такие как уменьшение чувствительности к ингибирующему действию изоциграта, ионов Fe2+ и Fe3+, усиление активирующих эффектов цитрата и АМФ, очевидно, могут способствовать увеличению активности фермента при патологии.

4. С учётом полученных данных по исследованию функционирования ГР в печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов предложена гипотетическая схема, отражающая регуляцию активности исследуемого фермента, принимающего участие в контроле интенсивности СРО в патологическом состоянии.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 222 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (6 глав), заключения, выводов, списка литературы (343 источника) и приложения. Иллюстративный материал включает 59 рисунков и 9 таблиц. В приложении содержится 26 рисунков.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали взрослых лабораторных белых крыс (Rattus rattus L), самцов, массой 150 - 200 г, содержащихся на стандартном рационе питания в виварии. Животные были разделены на 4 экспериментальные группы: 1 - интактные животные; 2 - крысы, подвергнутые интоксикации CCI4; 3 - животные, которым на фоне развития патологии вводили внутрибрюшинно ТК в дозе 35мг/кг, ежедневно, однократно, в течение 4-х дней эксперимента; 4 —крысы, которым на фоне развития патологии вводили внутрибрюшинно восстановленный глутатион в дозе 150 мг/кг, ежедневно, однократно, в течение 4-х дней эксперимента.

Создание модели токсического гепатита. Моделирование ЭТГ осуществляли пероральным введением 33% раствора ССЦ в вазелиновом масле из расчета 64 мкл СС14 на 100 г веса животного (Федорова Н.Ю., 1999). Забой животных производили на 4 сутки после введения гепатотоксина. Контрольным животным вводили соответствующую аликвоту вазелинового масла.

Определение активности ферментов. Активность ГР определяли спектрофотометрически на СФ-56 при 340 нм. О скорости реакции судили по падению оптической плотности в результате окисления НАДФН. Реакцию начинали внесением ферментного препарата. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта за 1 мин при 25°С. Активность ферментов выражали в ферментативных единицах (Е) на 1 мг белка или Е в расчете на 1 г сырой массы материала. Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) определяли при

600 нм (Cooper, 1969); активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ)- при 340 нм (Кочетов, 1980). Общий белок определяли по методу Лоури (Lowry, 1951).

Получение субклеточных фракций гепатоцитов. Для разделения цитоплазматической и митохондриальной фракций клеток печени использовали метод дифференциального центрифугирования. Митохондрии разрушали с помощью детергента тритона Х-100. Степень перекрестного загрязнения определяли с помощью маркерных ферментов: для митохондрий- СДГ, для цитоплазмы использовали ЛДГ. Выделение и очистка исследуемого фермента. Для получения ферментных препаратов ГР использовали схему очистки, включающую 6 стадий. В ходе выделения ГР после гомогенизации материала и фракционирования белков с помощью сульфата аммония фермент отделяли от низкомолекулярных соединений с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-25. Далее использовали колоночную ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Для концентрирования фракций фермента использовали ультрафильтрацию на ячейке Amicon. Завершающий этап очистки представлял собой гель-хроматографию на Toyopearl HW-65. Все операции проводились в холодной камере при 0...4*С.

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента. Кинетические и регуляторные свойства ГР в норме, при ЭТТ и при введении веществ-протекторов на фоне патологии исследовали на гомогенных препаратах фермента. Определение констант Михаэлиса и ингибирования осуществляли по Диксону и Уэббу (Диксон, 1982).

Аналитический электрофорез. Электрофорез проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) при 4°С по Дэвису (Дэвис Г., 1970).

Определение молекулярной массы фермента. Молекулярную массу ГР определяли методом гель — фильтрации. Определение субъединичной молекулярной массы проводили с помощью электрофореза по методу Лэммли (Laemmli U.K., 1970).

Экстракция тотальной РНК. Для выделения тотальной РНК использовали тризоловый метод.

Электрофорез РНК и ДНК. Электрофорез РНК и ДНК проводили в агарозном геле. Для окрашивания использовали бромистый этидий.

Обратная транскрипция. На матрице выделенной РНК с помощью обратной транскрипции получали кДНК, используемую для ПЦР-амплификации в режиме реального времени.

ПЦР-амплификация в режиме реального времени. ПЦР-амппификацию в режиме реального времени проводили на приборе АНК-32. В ходе работы использовали праймеры для определения уровня транскриптов ГР и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГДФДГ (референсный ген)). В ходе эксперимента использовали набор, содержащий интеркалирующий краситель SYBR Green I.

Определение уровня экспрессии генов. Определение относительного уровня экспрессии генов проводили с применением сравнительного метода пороговых циклов, полученных в пезультате ПЦР-амплификации и программы «qgene» [Muller P. Y., 2002].

Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 7-8-х кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в двух повторностях. Результаты опытов сравнивали с контролем. В таблице и на рисунках приводятся средние арифметические значения активностей фермента и их стандартные ошибки. Полученные данные обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента, обсуждаются статистически достоверные результаты при р<0,05(Ллойд, Ледерман, 1990).

СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ОЧИСТКА ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ГРУПП

Изучение субклеточной локализации ГР из печени контрольных и подвергнутых ЭТТ животных, а также крыс, которым вводили при патологии вещества-протекторы показало, что активность фермента из печени всех исследованных групп животных на 95% связана с цитоплазмой. При этом на митохондриальную фракцию приходится около 4 % активности. Степень перекрёстного загрязнения цитоплазматической фракции гомогената печени составила 15±0,5% и митохондриальной существенно не различалась в исследуемых группах животных и составляла около 11±0,4%. Полученные результаты согласуются с литературными данными. В ряде работ отмечено, что в клетках животных ГР является типичным цитоплазматическим ферментом [Guo Z., 2003; Lukasik I., 2007; Ermler U., 1991].

Результаты очистки ГР из печени крыс исследуемых групп животных представлены в таблице 1. С помощью разработанной схемы очистки были получены электрофоретически гомогенные препараты ГР из печени крыс контрольной группы, животных подвергнутых ЭТГ, а также крыс, которым на фоне развития патологии вводили вещества-протекторы с 108-, 105- 109- и 112 - кратной степенью очистки и удельной активностью, равной 1,19, 2,42, 1,64 и 1,90 Е/мг белка; выход фермента составил 9,3%, 9,5%, 9,6% и 10,1%,

соответственно.

Показано, что исследуемый фермент был гомогенен. В ходе окрашивания пластинок ПААГ после электрофореза белок проявлялся в виде одной полосы с одинаковой для всех экспериментальных групп элекгрофоретической подвижностью, Rf = 0,23±0,01 (рис. 1).

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ В НОРМЕ, ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ВЕЩЕСТВ-ПРОТЕКТОРОВ

Молекулярная масса ГР из печени контрольных и подвергнутых ЭТГ животных, а также крыс, которым вводили при патологии вещества-протекторы, определенная с помощью калибровочного графика элюции белков-метчиков при гель-хроматографии на Toyopearl HW-65, не различалась и составила 104±5,2 кДа (рис. 2). Субъединичная молекулярная масса ГР, определенная методом электрофореза в присутствии ДЦС-Na, (рис. 3) составила 52±2 кДа (рис. 4).

Это позволяет сделать заключение о димерной четвертичной структуре фермента. Поскольку значения молекулярной массы были сходны для фермента, полученногоиз печени крыс всех исследуемых групп, то, вероятно, изменения активности ГР, наблюдаемые при интоксикации крыс гепатотропным агентом, а также при введении веществ-протекторов, не сопряжены с реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции, связанного с изменением субъединичного состава. Полученная величина молекулярной массы ГР

Таблица 1

Результаты очистки глутатионредуктазы из печени крыс исследуемых групп*

Стадия очистки Условия опыта Общая активность Еобщ Количество белка, мг Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

Гомогенат норма 2,67+0,11 243,21±9,66 0,011±0,001 100 1

гепатит 6,410,29* 276,1219,98* 0,02310,001* 100 1

Гспатит+ ТК 4,2510,18* 283,14±9,87* 0,01510,001* 100 1

Гепатит+ 08Н 4,7410,21* 279,24±9,84* 0,01710,001* 100 1

Фракционирование (ЫН4)2804 норма 2,44±0,09 198,15+9,85 0,01310,001 91 1,2

гепатит 6,1010,27* 203,11±8,18 0,03710,001* 95 1,6

Гепатит^ ТК 3,8410,15* 142,13±7,09* 0,02710,001* 90,4 1,8

Гепатит+ вВН 4,10+0,19* 121,01±6,07* 0,03410,001* 86,5 2

Гель-фильтрация на сефадексе 0-25 норма 2,29±0,08 115,05±5,77 0,02110,001 86 1,82

гепатит 5,44+0,25* 109,03±5,48 0,05210,002* 85 2,2

Гепатит+ ТК 3,23±0,13* 90,07±4,45* 0,03610,001* 76 2,4

Гепатит^ вБИ 3,68±0,15* 84,12±4,17* 0,04410,001* 78 2,6

Хроматография наДЭАЭ-целлюлозе норма 1,21±0,04 1,98±0,08 0,62110,027 45 54,5

гепатит 1,85±0,08* 1,65±0,06* 1,12110,051* 29 49

Гепатит+ ТК 1,35±0,05* 1,63+0,07* 0,83110,031* 31,8 55,3

Гепатит+ взн 1,46±0,06* 1,47+0,05* 0,99310,038* 30,8 58

Ультрафильтрация с помощью ячейки Аписоп норма 0,94+0,04 1,23±0,05 0,76210,034 35 69

гепатит 1,79±0,07* 1,25+0,04 1,431Ю,059* 28 62

Гепатит+ ТК 1,12±0,04* 1,17±0,05 0,96410,035* 26 71

ГепатшН-вВН 1,46±0,07* 1,24±0,05 1,18210,049* 31 74

Хроматография на Тоуореаг1 Н\У-65 норма 0,25±0,01 0,21+0,01 1,19310,049 9,3 108

гепатит 0,61+0,02* 0,25±0,01* 2,42110,113* 9,5 105

Гепатит+ ТК 0,41 ±0,01* 0,25+0,01* 1,64210,065* 9,6 109

Гепатит+ ОБН 0,45+0,02* 0,24±0,01* 1,90110,075* 10,1 112

♦Примечание: отличия достоверны (уровень значимости - р<0,05) согласуется с данными литературы для фермента, выделенного из других источников. Так, ГР из печени мышей ДВАШ [КгаиЛ-81е§е1 Я., 1982],

печени цыпленка А., 2000] и Escherichia coli [Lukasik I., 2007] имеет молекулярную массу 105 кДа, 100 кДа и 109 кДа соответственно.

Рис. 1. Электрофореграмма ферментного препарата

глутатионредуктазы из печени крысы в норме (а), при введении ССЦ (б), тиоктовой кислоты (в) и восстановленного глутатиона (г) на фоне развития патологии, после окрашивания на белок: 1 глутатионредуктаза; 2 - фронт маркера (бромфеноловый синий). Направление движения белка указано стрелкой.

С использованием полученных гомогенных препаратов ГР были исследованы кинетические и регуляторные свойства фермента в норме, при развитии ЭТГ, действии тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона на фоне патологии.

Mr- кДа 160 140 120 too

Mr. кДа 160 140 120 100

Рис. 2. Определение молекулярной массы глутатионредуктазы из печени крысы в норме 1 (А), при экспериментальном токсическом гепатите 2 (А), при введении тиоктовой кислоты при патологии 1 (Б), при введении восстановленного глутатиона при токсическом поражении печени 2 (Б) методом гель-фильтрации через Тоуореаг1 Н\¥-65. Маркерные белки: 3 - фосфорилаза Ь (97 кДа), 4 - бычий сывороточный альбумин (66 кДа), 5 - яичный альбумин (45 кДа), 6 -карбоангидраза (30 кДа).

Установлено, что кинетика ферментативной реакции, катализируемой ГР, подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Выявлено, что при патологии происходит снижение сродства фермента к субстрату и к коферменту, однако эти показатели возрастают при введении протекторов (табл. 2). Несмотря на этот факт, активность фермента при патологии по сравнению с нормой увеличивается. Возрастает и отношение Утах/Км, отражающее эффективность функционирования фермента. Данный параметр незначительно снижается при введении ТК и ввН (табл. 2). Таким образом, концентрация субстратов является важным аспектом в регуляции активности фермента

Проведено исследование зависимости скорости ГР-реакции от концентрации ионов Н+ в норме, при патологии и действии веществ-

протекторов. Выявлено, что оптимальным значением для проявления ферментативной активности ГР из печени контрольных крыс является значение рН 7,42. При токсическом гепатите и при введении веществ-протекторов значительных изменений значений рН оптимума не выявлено.

Рис.3. Электрофореграмма ГР в присутствии ОБ-Ыа (I): 1 - зона локализации фермента, 7 - фронт маркера - бромфенолового синего (стрелкой показано направление движения белка при электрофорезе); определение субъединичной молекулярной массы фермента (II) в норме (А), при экспериментальном токсическом гепатите (Б), при введении тиоктовой кислоты (В) и восстановленного глутатиона (Г) крысам с патологией. Маркерные белки : 2 - фосфорилаза Ь (97 кДа), 3 - яичный альбумин (45 кДа), 4 - карбоангидраза (30 кДа), 5 - ингибитор трипсина (20,1 кДа), 6 - а-лактоальбумин (14,4 кДа).

Исследование термостабильности ГР выявило, что при длительном воздействии высоких температур на фермент, выделенный из печени животных с токсическим гепатитом, он проявляет меньшую устойчивость по сравнению с ГР из печени контрольных животных.

Таблица 2

Некоторые кинетические параметры глутатионредуктазы из печени крыс

исследуемых групп*

Норма ЭТГ Введение ТК при ЭТГ Ведение 08Н при ЭТГ

Значения Км, мМ 0880 0,23±0,001 0,71+0,025* 0,43+0,017* 0,32±0,011*

НАДФН 0,21+0,001 1,73±0,079* 0,59±0,019* 0,41±0,012*

Значения Утах/Км 3,95±0,171 7,04±0,291* 6,00±0,244* 6,42±0,224*

НАДФН 2,29+0,112 4,81+0,212* 4,15±0,161* 4,61+0,213*

РН от. 7,42+0,351 7,37+0,321 7,39+0,292 7,38+0,332

рКа рК1 6,97+0,339 6,95+0,328 7,01+0,245 7,83+0,301

рК2 7,84+0,382 7,75+0,284 7,41+0,284 7,48+0,279

^ОПТ> С 35,01+1,681 40,02+1,141* 37,04+1,291 39,03+1,012*

Еакт КДЖ 26,71+1,251 6,62+0,212* 11,12+0,432* 9,91+0,411*

*Примечание: отличия достоверны (уровень значимости - р<0,05)

Введение ТК и ввН способствует увеличению термостабильности фермента. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что введение веществ-протекторов способствует стабилизации молекулы фермента. Значения температурного оптимума, энергии активации для ГР из печени крыс исследуемых групп представлены в табл. 2.

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ

КРЫСЫ В НОРМЕ, ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ

Одним из основных постановщиков НАДФН для ГР-реакции является пентозофосфатный путь (ПФП). В связи с этим, нами была исследована зависимость протекания ГР-реакции от концентрации интермедиатов данного метаболитического пути.

Показано, что глюкозо-6-фосфат в концентрациях до 0,5 мМ в норме, до 0,75 мМ при ЭТТ и до 0,4 мМ при введении 08Н при патологии оказывает активирующее действие на ГР (рис. 4А). Дальнейшее увеличение концентрации метаболита приводило к снижению активности фермента. В то же время при введении ТК на фоне ЭТГ последний активирует ГР во всем диапазоне исследуемых концентраций.

Исследование влияния 6-фосфоглюконата на активность ГР, выделенной из печени интактных крыс и животных с ЭТГ, а также крыс, которым вводили ТК и ОБН при патологии показало, что данный метаболит выступает в качестве активатора фермента из печени всех исследуемых групп (рис 4Б).

При изучении влияния рибозо-5-фосфата на активность ГР из печени крыс в норме, при токсическом гепатите и введении ОБН на фоне патологии был выявлен сходный стимулирующий эффект (рис. 4В). При введении ТК на фоне патологического процесса при концентрации рибозо-5-фосфата свыше 0,1 мМ выявлен ингибирующий эффект. Установлен неконкурентный тип ингибирования (табл. 3).

Имеются данные, свидетельствующие, что образование восстановительных эквивалентов для функционирования ГР/ГП системы в условиях интенсификации СРО наряду с ферментами ПФП могут осуществлять НАДФ-зависимые изоцитратдегидрогеназа и малатдегидрогеназа [Медведева Л.В., 2002; Попова Т.Н., 2009]. В этой связи с целью выявления возможных путей координации функционирования ГР и НАДФН-генерирующих ферментов было проведено исследование влияния субстратов и продуктов данных реакций на активность ГР в норме, при патологии и действии веществ-протекторов.

Исследование влияния изоцитрата на активность ГР показало, что активация фермента имеет место до 0,80 мМ и 0,55 мМ концентрации в условиях нормы и при патологии соответственно (рис. 5А). При дальнейшем повышении концентрации данного метаболита имеет место ингибирование ГР-активности из печени обеих групп животных. Степень ингибирования выше для фермента из печени крыс контрольной группы. В данном случае показан конкурентный тип ингибирования (табл. 3). При токсическом гепатите ингибирование имело смешанный характер (табл. 3). Изоцитрат слабо активировал фермент из печени крыс, которым вводили ОБН. При введении ТК на фоне патологии неконкурентное

ингибирование наблюдалось во всем диапазоне исследованных концентраций (табл. 3).

0,4 0,6 0,8 1

[1'люкозо-6-фосфат], мМ

п i*

•1

0,4 0.6 0,8 I 1,2 [б-фосфогягокопат], мМ

ff-

0,4 0,6 0,8 1 1,2 ¿г [Рибозо-5-фосфат], мМ

Рис. 4. Влияние глкжозо-6-фосфата (А), 6-фосфоглюконата (Б) и рибозо-5-фосфата (В) на активность глутатионредуктазы из печени крысы в норме (1), при экспериментальном токсическом гепатите (2), при введении тиоктовой кислоты на фоне развития токсического гепатита (3) и при введении восстановленного глутатиона при патологии (4)

Цитрат активирует ГР при ЭТГ и при введении ТК на фоне развития патологии во всём диапазоне исследуемых концентраций. Причем, по отношению к ГР из печени интактных животных в концентрациях до 0,10 мМ данный метаболит выступает в качестве ингибитора фермента. Однако в диапазоне концентраций от 0,15 до 0,40 мМ активность фермента возрастает, но при дальнейшем увеличении концентрации интермедиата наблюдается снижение степени активирующего воздействия. При введении GSH выявлено ингибирование ГР-активности (рис. 5Б) по смешанному типу (табл. 3).

При исследовании влияния малата (рис. 5В) и 2-оксоглутарата (рис. 5Г) на активность ГР из печени крыс в норме, при токсическом гепатите и введении GSH на фоне развития патологии были выявлены сходные тенденции. Однако при введении ТК на фоне ЭТГ 2-оксоглутарат в отличие от малата выступает как ингибитор ферментативной активности во всем диапазоне исследуемых концентраций. Установлен неконкурентный тип ингибирования (табл. 3).

0,4 0,6 0,8 1 1,2

[2-окс«)гаугарах], нМ

0,6 0,8 I 1Л [Оксалоацетат], мМ

Рис. 5. Влияние некоторых интермедиатов цикла Кребса: изоцитрата (А), цитрата (Б), маната (В), 2-оксоглутарата (Г), оксалоацетата (Д), на активность глутатионредуктазы из печени крысы в норме (1), при токсическом гепатите (2), при введении тиоктовой кислоты на фоне развития токсического гепатита (3) и при введении восстановленного глутатиона при патологии (4)

При исследовании влияния оксалоацетата на активность ГР было выявлено, что до 0,45 мМ концентрации данный метаболит вызывает ингибирование фермента во всех условиях эксперимента. Увеличение концентрации интермедиата приводит к снижению степени ингибирующего эффекта (рис. 5Д).

Поскольку вещества из группы нуклеотидфосфатов выступают в роли индикаторов энергетического потенциала клетки, нами было исследовано их влияние на активность ГР в условиях нормы, при токсическом гепатите и при введении веществ-протекторов на фоне развития патологии.

Выявлено, что в условиях нормы АТФ активирует фермент во всем диапазоне исследованных концентраций (рис. 6А). При токсическом гепатите при концентрациях АТФ более 0,5 мМ наблюдалось снижение ферментативной активности. Показан неконкурентный тип ингибирования (табл. 3). Установлено, что АТФ вызывает ингибирование фермента из печени крыс, которым вводили ТК и БвН на фоне патологии, при концентрациях свыше 0,5 и 0,8 мМ по смешанному и неконкурентному типу соответственно (табл. 3).

Исследование влияния АДФ на скорость протекания ферментативной реакции выявило активацию ГР из печени всех экспериментальных групп (рис. 6Б). Однако, увеличение содержания АДФ более 0,3 мМ при введении ОЭН при патологии ведет к ингибированию ГР-активности, характеризующемуся смешанным типом (табл. 3).

[ЛМФ], мМ гнлдщ.мм

Рис. 6. Влияние некоторых нуклеотидфосфатов: АТФ (А), АДФ (Б), АМФ (В), НАДН (Г) на активность глутатионредуктазы из печени крысы в норме (1), при экспериментальном токсическом гепатите (2), при введении тиоктовой кислоты на фоне развития токсического гепатита (3) и при введении восстановленного глутатиона при патологии (4)

Установлено, что АМФ в условиях нормы оказывает стимулирующее действие на активность фермента. Сходная динамика выявлена и в отношении ГР из печени крыс с ЭТГ. При введении ТК при патологии АМФ практически не влияет на активность ГР. При введении вБИ данный метаболит при 0,1 мМ концентрации вызывает снижение ГР-активности, которая возрастает до исходного уровня при увеличении его концентрации (рис. 6В).

Исследование влияния НАДН на скорость протекания ГР-реакции показало, что данный метаболит оказывает ингибирующее действие во всех условиях эксперимента (рис. 6Г)- Для фермента из печени контрольной группы животных и крыс, которым вводили ТК и 08Н на фоне развития ЭТГ, установлен конкурентный тип ингибирования, в то время как при патологии выявлено ингибирование ГР-активности по бесконкурентному типу (табл. 3).

В связи с тем, что ионы таких металлов как железо, медь, кальций играют значительную роль в инициации и развитии процессов СРО, нами было проведено изучение влияния данных ионов на функционирование ГР, выделенной из печени интактных крыс, животных, подвергнутых воздействию ССЦ, и крыс, которым на фоне развития патологии вводили ТК и ОБН.

Ионы Mg2+ принимают участие в регуляции активности ГР, активируя фермент как в норме и при ЭТГ, так и при введении ТК и ОБН на фоне развития патологии. Было выявлено, что ионы Са2+ также оказывают активирующее действие на фермент из печени крыс в норме, при развитии ЭТГ и ведении ТК на фоне патологии. Однако при введении ¿БН на фоне развития патологического процесса ионы Са2+ оказывают ингибирующее действие по бесконкурентному типу (табл. 4).

Исследование влияния ионов меди выявило их ингибирующее действие на фермент из печени крыс всех исследуемых групп животных. Установлено, что в

условиях нормы проявляется наиболее выраженное подавляющее действие. Во всех условиях эксперимента ингибирование носит смешанный характер (табл. 4).

Таблица 3

Константы и тип ингибирования глутатионредуктазы из печени крыс экспериментальных групп некоторыми метаболитами*

Интермедиаты Условия опыта КьмМ Тип ингибирования

Рибозо - 5 -фосфат Норма 1,10±0,041 Смешанное

Гепатит - -

Гепатит+ ТК 0,43±0,018* Неконкурентное

Гепатит+ОБН 0,60±0,021* Смешанное

Глюкозо- 6 -фосфат Норма - -

Гепатит - -

Гепатит+ ТК - -

Гепатит-К^Н 0,23±0,008 Смешанное

Изоцитрат Норма 0,25±0,008 Конкурентное

Гепатит 1,20±0,044* Смешанное

Гепатит+ ТК 0,60±0,019* Неконкурентное

ГепатитНЗЗН - -

Цитрат Норма - -

Гепатит - -

Гепатит+ ТК - -

ГепатитК^И 0,30±0,012 Смешанное

2-оксоглутарат Норма - •

Гепатит - -

Гепатит+ ТК - ■

Гепатит+ОЭН 0,50±0,014 Неконкурентное

НАДН Норма 0,26±0,007 Конкурентное

Гепатит 0,45±0,019* Бесконкурентное

Гепатит!- ТК 0,7(Ы),021* Конкурентное

Гепатит-ЮБН 1,80±0,081* Конкурентное

АТФ Норма -

Гепатит 0,24±0,004 Неконкурентное

Гепатит+ ТК 1,90±0,084 Смешанное

ГепатитН^Н 0,30±0,005 Неконкурентное

АДФ Норма - -

Гепатит - -

Гепатит+ ТК - -

ГепатитКЗЗН 1,20±0,044 Смешанное

♦Примечание: отличия достоверны (уровень значимости - р<0,05)

Исследование влияния ионов Ре2+ на активность ГР из печени животных экспериментальных групп показало, что данные ионы оказывают ингибирующее действие во всем диапазоне исследуемых концентраций. Наиболее выраженное

подавление активности фермента выявлено в условиях нормы. Для ГР в данных условиях и при ЭТГ характерен неконкурентный тип ингибирования, тогда как при введении ТК и йЗН на фоне патологии - смешанный (табл. 4).

Таблица 4.

Константы и тип ингибирования глутатионредуктазы из печени крыс _экспериментальных групп ионами металлов*_

Интермедиаты Условия опыта К„ мМ Тип ингибирования

Fe2+ Норма 0,40±0,01 Неконкурентное

Гепатит 0,45±0,01* Неконкурентное

Гегтатит+ ТК 0,80±0,03* Смешанное

ГепатитЮЗН 0,75±0,02* Смешанное

Fe3+ Норма 0,80±0,03 Смешанное

Гепатит 1,45±0,06* Смешанное

Гепатит+ ТК 0,25±0,01* Смешанное

Гегтатит+ОЯН 2,50±0,07* Смешанное

Cu2+ Норма 1,00±0,04 Смешанное

Гепатит 0,49±0,1* Смешанное

Гепатит+ ТК 0,40±0,01* Смешанное

Гепатит+С8Н 0,70±0,02* Смешанное

Са2+ Норма - -

Гепатит - -

Гепатит+ ТК - -

*Примечание: отличия достоверны (уровень значимости - р<0,05)

Зависимость активности ГР от концентрации ионов Fe3+ имеет сходный характер. Однако, в условиях нормы выявлен более значительный ингибирующий эффект ионами Fe3+, чем Fe2+. Так, при 0,04 мМ концентрации Fe3+ активность фермента составила~20%. Константа ингибирования в норме составила 0,8 мМ, при ЭТТ - 1,45 мМ, при введении ТК на фоне патологии - 0,25 мМ и при введении GSH животным с токсическим гепатитом - 2,5 мМ. Во всех случаях установлен смешанный тип ингибирования (табл. 4).

ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫСЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ ПРИ ПАТОЛОГИИ

На первом этапе нами была успешно проведена экстракция тотальной РНК из печени крысы с последующей обратной транскрипцией мРНК. В результате была получена одноцепочечная кДНК. Для амплификации участка гена в работе использовались праймеры, подобранные с помощью программы «Primer Express». После получения кДНК были оптимизированы условия проведения полимеразной цепной реакции.

Расчет разницы экспрессии ГР с учетом порогового цикла для ГДФДГ и значений эффективности амплификации показал, что при ЭТГ происходит

увеличение уровня транскриптов с гена ГР в печени крыс в 3,0 раза относительно нормы (рис. 7, табл. 5).

Таблица 5

Изменения уровня транскриптов гена глутатионредуктазы в печени крыс в норме, при экспериментальном токсическом гепатите и при действии тиоктовой кислоты и

восстановленного глутатиона при патологии

Группы животных Значения порогового цикла гена-мишени, Й (ГР) Значения порогового цикла референсного гена, Й (ГДФДГ) Разность значений пороговых циклов гена-мишени и референсного гена, да

Норма 25,95±1,25 17,33±0,74 8,62±0,38

ЭТГ 24,71± 1,21 17,69±0,77 7,02±0,32

ЭТГ + ТК 25,82±1,17 17,76±0,73 8,06±0,34

ЭТТЮЗН 26,31±1,20 17,68±0,68 8,63±0,36

При введении ТК и ОЭН животным с ЭТТ происходило уменьшение экспрессии гена ГР более чем в 2,0 раза по сравнению с уровнем при патологии в первом случае, и на 98% - во втором. Вероятно, благодаря антиоксидантному действию использованных протекторов снижение интенсивности свободнорадикальных процессов приводило к уменьшению степени индукции ГР, возрастающей при интенсификации СРО при патологии.

Рис. 7. Относительный уровень экспрессии гена глутатионредуктазы в печени крысы в норме ( 0> ПРИ экспериментальном токсическом гепатите (П) и действии тиоктовой кислоты (¡и ) и восстановленного глутатиона (; .) на фоне патологии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно полученным результатам при токсическом гепатите происходит увеличение удельной активности ГР в печени крыс более чем в 2,0 раза по сравнению с контрольной группой животных. Введение ТК и вБН животным с патологией способствует снижению удельной активности ГР в 1,5 ив 1,4 раза соответственно по сравнению с группой животных с токсическим гепатитом, приближая ее к уровню активности фермента в норме.

Наряду с этим, установлено, что при ЭТТ происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГР в печени крыс в 3 раза относительно нормы. Введение ТК и ОБН животным с ЭТГ приводит к уменьшению экспрессии гена ГР более чем в 2,0 раза по сравнению с уровнем при патологии в первом случае и на 98% — во втором, что, очевидно, связано с проявлением антиоксидантного действия использованных

ОтносэтеЛЫгьЕЙ уровень экспрессии Э.ООЕ-ОЗ.

7.00Е-03-6.00Е-03 5.00Е-03-4.00Е-03 З.ООП-СЭ 2.00К-СЭ 1.00Е-03 О.ООЕ-НХ

I ру жажтшх

гепатопротекторов, проявляющемся в торможении интенсивности свободнорадикальных процессов при ЭТГ и снижении степени индукции гена ГР.

С использованием электрофоретически гомогенных ферментных препаратов ГР выявлено, что ряд физико-химических свойств фермента при патологии и действии протекторов не меняется: рН-оптимум, молекулярная масса, субъединичная структура, электрофоретическая подвижность, субклеточная локализация. Однако при экспериментальном токсическом гепатите выявлена модификация как некоторых кинетических параметров каталитического действия, так и регуляторных свойств фермента. При токсическом гепатите наблюдалось снижение сродства фермента и к субстрату, и к коферменту в 3 и 8 раз соответственно по сравнению с ферментом, выделенным из печени интакгных крыс. Введение протекторов на фоне патологии сопровождалось изменением значений Км в сторону контрольных значений. Несмотря на тот факт, что наряду с увеличением активности фермента при патологии по сравнению с нормой наблюдается снижение сродства фермента к субстрату, отношение Vmax/Км, отражающее эффективность функционирования фермента, возрастает. Данный параметр незначительно снижается при введении ТК и GSH.

Установлены различия в температурных оптимумах действия ГР: оптимальная температура действия фермента сдвигается в сторону более высоких значений при токсическом гепатите и введении веществ-протекторов крысам с патологией по сравнению с интактными животными. Показана меньшая термоустойчивость ГР при ЭТГ по сравнению с ферментом из печени контрольной группы крыс. Однако, введение протекторов способствовало увеличению устойчивости к действию высоких температур. Кроме того, величина энергии активации ГР существенно снижается при патологии, что может иметь значение для повышения активности фермента. Введение веществ-протекторов, по всей видимости, способствует стабилизации структуры ГР, что отражается на значениях Ещ^, а также термоустойчивости, возрастающих в этих условиях. Изменения регуляции активности ГР, наблюдаемые в условиях интенсификации СРО, по отношению к интермедиатам пентозофосфатного пути и цикла Кребса, нуклеотидфосфатам, ионам некоторых металлов свидетельствует о модификации ряда регуляторных свойств фермента при патологии печени. Можно предположить, что изменение регуляции активности ГР может рассматриваться в рамках реализации физико-химического механизма адаптационной реакции к повышению концентрации АФК, сопровождающем развитие патологии. Введение веществ, обладающих протекторными свойствами, животным с патологией ведет к изменению многих исследованных параметров в сторону нормы, что может являться следствием снижения данными соединениями уровня свободнорадикальных процессов.

На основании результатов проведенных исследований предложена гипотетическая схема (рис. 8), отражающая регуляцию активности ГР, обеспечивающей контроль интенсивности СРО при патологии и действии веществ-протекторов. Согласно данной схеме, представленной на рис. 8 ССЦ, проникая в печень, инициирует развитие свободнорадикальных процессов, приводящих к повреждению клеточных структур [Lee G.P., 2005]. Вместе с тем, при токсическом гепатите происходит мобилизация АОС организма, в которой важное место занимает ГР/ГП система. Очевидно, активация ГР некоторыми метаболитами может способствовать повышению его активности при патологии.

Условные обозначения:

□ (И >-активирующий (ингибирующий) чф<(м.-«г|- в норме:.

О (Ф ) " активирующий (ингибирующий) эффект при экспериментальном токсическом гепатите: О () - активирующий (ингибирующий) эффект при введении тиоктовой кислота при токсическом гепатите; Сф - активирующий {ингибирующий) эффект при введении »остановленного глутагжша яри гттологип.

Рис. 8. Гипотетическая схема, отражающая регуляцию активности глутатионредуктазы при патологии и действии веществ протекторов.

м о

Согласно полученным данным ионы кальция оказывают более выраженное активирующее влияние на фермент при патологии, чем в норме и при введении ТК животным с токсическим гепатитом. Однако, при введении GSH выявлен ингибирующий эффект. Ионы железа ингибируют ГР-активность во всех условиях эксперимента. Обнаружено, что ионы Си2+ снижают активность ГР, причем большее торможение ферментативной активности наблюдается для фермента, выделенного из печени контрольных крыс.

Таким образом, для ГР, выделенной из печени животных в норме, при токсическом гепатите и введении ТК и GSH при патологии характерно существование разнообразных механизмов регуляции активности под действием ряда физико-химических факторов и интермедиатов клеточного обмена, способных обеспечивать изменение ферментативной активности при токсическом гепатите и, вероятно, играть роль в реализации адаптивных процессов на клеточном уровне в условиях изменения уровня генерирования АФК. Введение протекторов способствует нормализации процессов, протекающих в патологически измененной печени, что также может отражаться на каталитических свойствах и регуляции активности ГР. Полученные данные позволяют предполагать, что изменение скорости ГР-реакции при патологии и введении протекторов может влиять на интенсивность свободнорадикальных процессов за счёт модификации параметров каталитического действия, а также механизмов регуляции активности и экспрессии данного фермента.

ВЫВОДЫ

1. Удельная активность ГР в печени крыс, возрастающая более чем в 2,0 раза при ЭТГ, снижается при введении животным ТК и вЗН в 1,5 и 1,4 раза соответственно.

2. С использованием гомогенных ферментных препаратов выявлено, что для ГР из печени контрольных, подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым вводили гепатопротекгоры при патологии, характерны одинаковые значения электрофоретической подвижности (0,23±0,01), молекулярной массы (104±5,2 кДа), рН-оптимума (7,42±0,31), а также гомодимерная субъединичная структура.

3. Значение температурного оптимума ГР в норме составило 35°С, в то время как фермент из печени крыс, подвергнутых ЭТГ, и животных, которым вводили ТК и 08Н на фоне патологии, характеризуется температурным оптимумом, составляющим 40°С.

4. Значение Е^ для фермента из печени интакгных животных составляет 26,7 кДж/моль, из пораженной гепатотоксином печени - 6,2 кДж/моль. Введении ТК и ОБН на фоне патологии сопровождалось изменением данного параметра в сторону нормы и характеризовалось значениями 11,1 кДж/моль и 9,9 кДж/моль соответственно.

5. Обнаружено, что значения Км по субстрату и коферменту возрастают для фермента, выделенного из печени крыс с токсическим гепатитом в 3 и 8 раз соответственно по сравнению с контрольной группой животных. Введение гепатопротекторов приводит к изменению значений в сторону нормальных величин.

6. В регуляции активности ГР могут принимать участие ионы ряда металлов

Са2+, Си2+, Ге2+, Ге3+). Ионы М^* оказывают активирующий эффект на

фермент. Ионы Са2+ в норме, при ЭТГ и введении ТК на фоне патологии активируют фермент, а при введении 08Н крысам с ЭТГ - ингибируют по бесконкурентному типу (К;=0,2 мМ). Действие ионов Ре2+ на ГР из печени крыс в норме и при токсическом гепатите характеризуется неконкурентным типом ингибирования, в то время как при введении ТК и вЗН - смешанным. Для фермента из печени всех исследованных групп животных характерен смешанный тип ингибирования ионами Ре3+.

7. Выявлены особенности регуляции активности фермента в условиях нормы, при токсическом гепатите и при введении ТК и вЗН под действием ряда метаболитов ЦТК: изоцитрата, цитрата, оксалоацетата.

8. Показано участие АТФ, АМФ, АДФ, НАДН в регуляции ГР-активности в норме, при токсическом гепатите и при введении веществ-протекторов. Установлено, что в условиях развития ЭТГ и введения протекторов происходит изменение чувствительности фермента к действию данных метаболитов.

9. Обнаружены различия в регуляции активности фермента интермедиатами пентозофосфатного пути: глюкозо-6-фосфатом, рибозо-5-фосфатом, в норме, при токсическом гепатите и введении протекторов на фоне развития патологии.

10. Установлено, что при ЭТГ происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГР в печени крыс в 3 раза относительно нормы. При действии протекторов при патологии имеет место уменьшение экспрессии гена ГР. Введение ТК приводит к снижению экспрессии гена ГР более чем в 2 раза, при введении вБИ уровень экспрессии снижается на 98%.

11. На основании результатов исследования функционирования ГР предложена гипотетическая схема, отражающая особенности регуляции активности фермента при патологии и действии веществ-протекторов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Агарков А А. Роль трикарбоновых кислот в регуляции активности глутатионредуктазы из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс / A.A. Агарков, О.В. Анохина, A.B. Семенихина, Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова И Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Вып.8. ВГУ. - 2006. - 52-55.

2. Агарков A.A. Исследование влияния некоторых сахарофосфатов на активность глутатионредуктазы в норме и при токсическом гепатите / A.A. Агарков, A.B. Семенихина, Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин // Материалы научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)», - Ростов-на-Дону, 2006. — С.14.

3. Агарков A.A. Кинетические свойства глутатионредуктазы из печени крыс в норме и при экспериментальном токсическом гепатите / A.A. Агарков, A.B. Семенихина, Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин // Вестник ВГУ. Серия: химия, биология, фармация. - 2007. - №2. - С. 59-63.

4. Агарков A.A. Исследование влияния некоторых органических кислот на активность глутатионредуктазы в норме и при токсическом гепатите / A.A. Агарков, A.B. Семенихина, Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин // Тезисы докладов 20-го съезда физиологического общества им. И.П. Павлова при РАН. - Москва, 2007. - С. 115.

5. Агарков A.A. Влияние окисленного и восстановленного глутатиона на активность глутатионредуктазы в печени крыс / A.A. Агарков, A.B. Семенихина, Т.И. Рахманова, Т.Н. Попова, A.A. Веревкина // Материалы 3-ей Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ. Часть 1. —Воронеж, 2007. — С. 29-32.

6. Агарков A.A. Исследование влияния аденозинфосфатов на активность глутатионредуктазы из печени крыс в условиях нормы и при экспериментальном токсическом гепатите / АА Агарков, Т.Н. Попова, A.B. Семенихина, К.К Шульгин // Сборник материалов Международной научной конференции. Том 2.-Саранск, 2008.-С-89-91.

7. Агарков A.A. Применение ионообменной хроматографии для очистки глутатионредуктазы из печени крысы в условиях нормы, при токсическом гепатите и введении тиоктовой кислоты / АА. Агарков, Т.Н. Попова, A.B. Семенихина // Сорбционные и хроматографические процессы. — 2008. - Т.8, Вып.5. - С.835-841.

8. Агарков A.A., Шульгин Исследование влияния ионов железа на активность глутатионредуктазы из печени крыс в норме и при токсическом гепатите / АА. Агарков, Т.Н. Попова, A.B. Семенихина, К.К. // Фундаментальные исследования. Материалы Всероссийской научной конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболеваний человека». №7, Вып.8. - Москва, 2008.-С.29-30.

9. Агарков A.A. Очистка, некоторые кинетические и регуляторные свойства глутатионредуктазы из печени крысы в норме и при развитии токсического гепатита / A.A. Агарков, Т.Н. Попова, A.B. Семенихина // Биомедицинская химия. — 2009. - Т.55, Вып.2.-С. 169-176.

10. Агарков А А. Субклеточная локализация глутатионредуктазы из печени крысы в условиях нормы, при токсическом гепатите и введении веществ-протекторов / A.A. Агарков, И.А. Тюрин / Сборник тезисов Международной студенческой биологической конференции. - Ереван, 2009. - С. 107.

11. Агарков А.А Физико-химические аспекты регуляции активности глутатионредуктазы в норме, при токсическом гепатите и действии протекторов / A.A. Агарков, Т.Н. Попова Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии—2009.—Вып.5.-С. 3-9.

12. Агарков A.A. Влияние ионов магния и кальция на активность глутатионредуктазы в норме и при токсическом гепатите / АЛ. Агарков // Материалы Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных «Актуальные вопросы медицинской науки». - Ярославль, 2009. - С. 22-23.

13. Агарков A.A. Кинетика ферментативной реакции, катализируемой глутатионредуктазой из печени крыс при введении тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона на фоне токсического гепатита / A.A. Агарков, Т.Н. Попова, Е. Ю. Жбанчикова // Сборник трудов Ежегодной Всероссийской научной конференции учащихся, студентов и молодых ученых "Научное творчество XXI века". В 2-х томах. Том 2. - Красноярск: Научно-информационный издательский центр, 2009. - С. 255-256.

14. Агарков A.A. Исследование влияние изоцитрата и цитрата на активность глутатионредуктазы при введении тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона при токсическом гепатите у крыс / A.A. Агарков, Т.Н. Попова, P.A. Малин // Сборник трудов Всероссийской научно-практической конференции • «Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик». - Курск, 2009.-С. 99-101.

15. Агарков A.A. Исследование влияния некоторых органических кислот на активность глутатионредуктазы при введении тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона при токсическом гепатите у крыс / A.A. Агарков, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.А. Сущенко // Материалы П Всероссийского с Международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз, Россия - 2009". - Пермь, 2009. - С. 184-185.

16. Агарков A.A. Влияние глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата на активность глутатионредуктазы из печени крысы при введении веществ-протекторов на фоне токсического гепатита / АЛ. Агарков, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, ИЛ. Тюрин // Материалы российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». - Челябинск, 2009. — С. 41-42.

17. Агарков A.A. Влияние рибозо-5-фосфата на активность глутатионредуктазы при введении тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона при экспериментальном токсическом гепатите / A.A. Агарков, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, ЕЛ. Сущенко // Материалы 13-ой Международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века».-Пущино, 2009.-С.58-59.

18. Агарков A.A. Влияние ионов меди и восстановленного глутатиона на активность глутатионредуктазы из печени крысы в норме, при токсическом гепатите и действии веществ-протекторов / A.A. Агарков, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин // Современные проблемы гуманитарных и естественных наук. Материалы докладов международной научно-практической конференции. Том1. -Москва, 2009. -С.37-38.

Статьи № 7, 9, 11 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК.

Подписано в печать 16.10.09. Формат 60x84 '/iS. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 1639

Отпечатано с готового оригинала-махета в типографии Издатедьско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Агарков, Александр Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Токсическое поражение печени

1.1.1. Общая характеристика гепатитов

1.1.2. Механизм токсического поражения печени четыреххлористым 14 углеродом

1.2. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная система 16 1.2.1. Образование свободных радикалов

1.2.2. Образование активных форм кислорода и пероксидное 17 окисление липидов

1.2.3. Роль свободнорадикального окисления в норме и при 21 патологии

1.2.4. Антиоксидантная система защиты

1.3. Антиоксидантные свойства тиоктовой кислоты

1.4. Восстановленный глутатион, как компонент антиоксидантной 25 системы

1.5. Характеристика глутатионредуктазы из различных источников

1.5.1. Катализируемая реакция

1.5.2. Исследование генов, кодирующих глутатионредуктазу, и ее 29 субклеточное распределение

1.5.3. Исследование структуры глутатионредуктазы

1.5.4. Распространение и очистка глутатионредуктазы

1.5.5. Молекулярная масса глутатионредуктазы

1.5.6. Зависимость активности глутатионредуктазы от концентрации 39 субстрата и кофермента

1.5.7. Влияние рН и температуры на скорость реакции, 39 катализируемой глутатионредуктазой

1.5.8. Регуляция активности глутатионредуктазы

1.5.9. Активность глутатионредуктазы при действии 46 неблагоприятных факторов и патологии

1.5.10. Перспективы практического применения глутатионредуктазы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Создание модели экспериментального токсического гепатита

2.2.2. Определение активности ферментов

2.2.3. Получение субклеточных фракций гепатоцитов

2.2.4. Определение количества белка

2.2.5. Выделение и очистка глутатионредуктазы из печени крыс

2.2.5.1. Экстракция фермента

2.2.5.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония

2.2.5.3. Гель-фильтрация на сефадексе G

2.2.5.4. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

2.2.5.5. Концентрирование фракций фермента

2.2.5.6. Гель-хроматография на Toyopearl HW

2.2.6. Исследование кинетических характеристик и регуляции 56 активности фермента

2.2.7. Аналитический электрофорез

2.2.8. Определение молекулярной массы фермента

2.2.9. Экстракция тотальной РНК тризоловым методом

2.2.10. Электрофорез РНК

2.2.11. Обратная транскрипция

2.2.12. ПЦР-амплификация в режиме реального времени

2.2.13. Определение уровня экспрессии генов

2.2.14. Электрофорез ДНК

2.2.15. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. АКТИВНОСТЬ, СУБКЛЕТОЧНАЯ 63 ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ОЧИСТКА

ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ В НОРМЕ, ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ

3.1. Исследование активности глутатионредуктазы из печепи крыс в норме, при токсическом гепатите и введении протекторов при патологии

3.2. Исследование субклеточной локализации глутатионредуктазы

3.3. Очистка глутатионредуктазы из печени крыс исследуемых 65 групп

ГЛАВА 4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ В НОРМЕ, ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ВЕЩЕСТВ-ПРОТЕКТОРОВ

4.1. Молекулярная масса глутатионредуктазы

4.2. Исследование кинетических параметров каталитического 74 действия глутатионредуктазы в норме, при экспериментальном токсическом гепатите и действии гепатопротекторов

4.3. Влияние концентрации ионов водорода на активность 82 глутатионредуктазы из печени крыс в норме, при экспериментальном токсическом гепатите и при введении гепатопротекторов

4.4. Исследование влияния температуры на активность 84 глутатионредуктазы из печени крыс в норме, при патологии и при введении гепатопротекторов

ГЛАВА 5. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ 91 ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ В НОРМЕ, ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ 5.1. Влияние интермедиатов пентозофосфатного пути на активность глутатионредуктазы

5.2. Влияние интермедиатов цикла Кребса на активность 99 глутатионредуктазы

5.3. Влияние нуклеотидфосфатов на активность 112 глутатионредуктазы

5.4. Участие ионов металлов в регуляции активности 123 глутатионредуктазы в норме, при токсическом поражении печени и введении гепатопротекторов на фоне развития патологии

5.4.1. Влияние ионов магния на активность глутатионредуктазы

5.4.2. Влияние ионов Са , Си" на активность глутатионредуктазы

5.4.3. Влияние ионов железа на активность глутатионредуктазы

5.5. Влияние тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона 140 на активность глутатионредуктазы в норме, при токсическом гепатите и при введении гепатопротекторов

ГЛАВА 6. ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В 143 ПЕЧЕНИ КРЫСЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ДЕЙСТВИИ

ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ ПРИ ПАТОЛОГИИ

6.1. Выделение тотальной РНК из печени крысы

6.2. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

6.3. Оценка уровня экспрессии с гена глутатионредуктазы в норме, 145 при токсическом гепатите и при введении гепатопротекторов при патологии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция активности глутатионредуктазы из печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов"

Актуальность работы. Известно, что большинство патологических процессов протекает на фоне образования активных форм кислорода (АФК) и усиления свободнорадикального окисления (СРО) биосубстратов. В ответ на это происходит активизация антиоксидантной системы (АОС) клетки. АОС л представлена низкомолекулярными соединениями — ловушками радикалов, к которым относят витамины А, С, Е и К, биофлавоноиды, низкомолекулярные тиолы, а также антиоксидантными ферментами (супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП), глутатионредуктаза (ГР), каталаза и т.д.). Учитывая то обстоятельство, что большинство известных патологических состояний сопровождаются усилением СРО, повреждающим белковые структуры, молекулы ДНК и липидов [62, 150, 223] и ослаблением активности АОС, весьма актуальной представляется оценка состояния этих систем с целью ранней диагностики и обоснованного лечения заболеваний.

Действие многочисленных химических веществ на организм человека сложно и многообразно. К числу ксенобиотиков с наиболее высокой степенью избирательной гепатотоксичности относятся хлорированные углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан (СС14). Имеющиеся данные свидетельствуют, что развитие СС14-гепатита сопряжено с интенсификацией СРО [5, 63]. Организм человека и животных располагает целым рядом сложных биохимических систем (метаболизма ксенобиотиков, антирадикальной защиты и т.д.), во многом определяющих чувствительность к действию токсинов разного строения. К их числу относится и глутатионовая система. Она принимает участие в реализации целого ряда важнейших физиологических процессов. Так, глутатион, являющийся компонентом данной системы, выступает в качестве резерва цистеина в клетке и воздействует на функциональную активность лимфоцитов, обеспечивая иммунный ответ организма. Кроме того, данный тиол оказывает влияние на синтез белков теплового шока, а также на биохимические превращения витаминов С, Е, липоевой кислоты и убихинона. Регуляция тиол-дисульфидного равновесия, углеводного, липидного, белкового и нуклеинового обменов, а также поддержание гемоглобина эритроцитов в восстановленном состоянии — неотъемлемые функции глутатионовой АОС. Последняя может принимать участие и в поддержании оптимального состояния биологических мембран, в реализации механизмов программируемой клеточной гибели и, что немаловажно, в процессах детоксикации и аптиоксидантной защите [58]. Глутатионредуктазная/глутатионпероксидазная (ГР/ГП) система является важнейшим компонентом антиоксидантной защиты организма (АОЗ) [16], поддерживающим на стационарном уровне интенсивность протекания свободнорадикального окисления (СРО) [16, 20, 103]. Благодаря функционированию ГР/ГП системы в клетках млекопитающих обеспечивается детоксикация гидроперекисей и перекисей, являющихся основным источником гидроксильпого радикала, образующегося в реакции Фентона в присутствии ионов Fe2+ [73, 314].

ГР (КФ 1.6.4.2) - распространенный флавиновый фермент, катализирущий обратимое НАДФН-зависимое восстановление окисленного глутатиона (GSSG) [46]. Биологическая роль ГР заключается в поддержании высокой внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона (GSH) без увеличения его синтеза. В последнее время значительное внимание уделяется созданию специфических ферментных биотест-систем с использованием ГР для оценки целевой биологической активности адаптогенной и антиоксидантной направленности в фармакологически активных веществах [12].

В настоящее время в литературе имеются данные относительно некоторых каталитических свойств фермента из тканей животных [283, 284] и человека [188, 189] в условиях нормы. Однако, особенности функционирования данного фермента при патологии печени остаются не исследованными.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование каталитических свойств и регуляции активности ГР из печени крыс в норме, при экспериментальном токсическом гепатите (ЭТГ) и введении веществ - протекторов: тиоктовой кислоты (ТК) и GSH, при патологии.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи: ' 1. Определение активности и субклеточной локализации ГР из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и действии ТК и GSII;

3. Сравнительная характеристика кинетических параметров каталитического действия ГР из печени крыс в норме, в условиях развития патологического процесса, вызванного введением СС14, и действия веществ, обладающих протекторными свойствами при патологии;

4. Исследование регуляции • активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении веществ — протекторов под действием метаболитов цикла Кребса;

7.Изучение количественной экспрессии гена ГР в печени крыс в норме, при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов при патологии.

Практическая значимость.

Разработанные способы очистки ГР могут применяться для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Специфические ферментные биотест-системы in vitro, основанные на использовании ГР, могут применяться как в медицине, так и в фармации [12, 76]. Результаты исследования регуляции активности глутатионзависимых ферментов, к числу которых относится ГР, могут использоваться для контроля за состоянием антирадикальной защиты, дифференциальной диагностики, объективизации контроля эффективности терапии, прогнозирования течения некоторых заболеваний [12].

Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами Воронежского госуниверситета.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены в межрегиональном сборнике научных работ «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2006), на научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» Ростов-на-Дону, 2006), на 20-м съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова при РАН (Москва, 2007), на 3-ей Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2007), на международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Сапожниковой (Саранск, 2008), в материалах Всероссийской научной конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболевай человека» Российской академии естествознания (Москва, 2008), на Международной студенческой биологической конференции, посвященной 90-летию Ереванского государственного университета и 75-летию факультета биологии (Ереван, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных «Актуальные вопросы медицинской науки», (Ярославль, 2009), на Всероссийской научной конференции учащихся, студентов и молодых ученых "Научное творчество XXI века", (Красноноярск, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик», (Курск, 2009), на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз, Россия - 2009", (Пермь, 2009), на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2009), на Международной научно-практической конференции «Современные проблемы гуманитарных и естественных наук» (Москва, 2009), на Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009), а также на ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы.изложены в 18 публикациях - в 5 статьях и 13 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В условиях интенсификации СРО при ЭТГ происходит увеличение активности и уровня экспрессии ГР в печени крыс, которые снижаются при введении животным ТК и GSH при патологии. При этом субклеточная локализация, молекулярная масса, рН-оптимум и электрофоретическая подвижность фермента не изменяются.

2. С использованием гомогенных ферментных препаратов выявлена модификация некоторых кинетических и физико-химических параметров каталитического действия ГР: Км, EdK.,, температурного оптимума, термостабильности. Введение гепатопротекторов приводит к изменению значений исследованных параметров в сторону нормальных величин.

3. При ЭТГ происходят изменения регуляции активности ГР интермедиатами пентозофосфатного пути и цикла Кребса, нуклеотидфосфатами, ионами некоторых металлов. Ряд модификаций регуляторных свойств ГР, характерных для фермента из пораженной гепатотоксином печени, такие как уменьшение чувствительности к ингибирующему действию изоцитрата, ионов Fe2+ и Fe3+, усиление активирующих эффектов цитрата и АМФ, очевидно, могут способствовать увеличению активности фермента при патологии.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 222 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (6 глав), заключения, выводов, списка литературы (343 источника) и приложения. Иллюстративный материал включает 59 рисуноков и 9 таблиц. В приложении содержится 26 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Агарков, Александр Алексеевич

ВЫВОДЫ

1. Удельная активность ГР в печени крыс, возрастающая более чем в 2,0 раза при ЭТГ, снижается при введении животным ТК и GSH в 1,5 и 1,4 раза соответственно.

2. С использованием гомогенных ферментных препаратов выявлено, что для ГР из печени контрольных, подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым вводили гепатопротекторы при патологии, характерны одинаковые значения электрофоретической подвижности (0,23±0,01), молекулярной массы (104±5,2 кДа), рН-оптимума (7,42±0,31), а также гомодимерная субъединичная структура.

3. Значение температурного оптимума ГР в норме составило 35°С, в то время как фермент из печени крыс, подвергнутых ЭТГ, и животных, которым вводили ТК и GSH на фоне патологии, характеризуется температурным оптимумом, составляющим 40°С.

4. Значение Еакт для фермента из печени интактных животных составляет 26,7 кДж/моль, из пораженной гепатотоксином печени - 6,2 кДж/моль. Введении ТК и GSH на фоне патологии сопровождалось изменением данного параметра в сторону нормы и характеризовалось значениями 11,1 кДж/моль и 9,9 кДж/моль соответственно.

6. В регуляции активности ГР могут принимать участие ионы ряда

•у j | ^ | | 9+ 3+ 2+ металлов (Mg , Са , Cu~ , Fe , Fe ). Ионы Mg оказывают активирующий эффект на фермент. Ионы Са в норме, при ЭТГ и введении ТК на фоне патологии активируют фермент, а при введении GSH крысам с ЭТГ -ингибируют по бесконкурентному типу (Kj=0,2 мМ). Действие ионов Fe2+ на

ГР из печени крыс в норме и при токсическом гепатите характеризуется неконкурентным типом ингибирования, в то время как при введении ТК и GSH — смешанным. Смешанный тип ингибирования ионами Fe характерен для фермента из печени всех исследованных групп животных.

7. Выявлены особенности регуляции активности фермента в условиях нормы, при токсическом гепатите и при введении ТК и GSH под действием ряда метаболитов ЦТК: изоцитрата, цитрата, оксалоацетата.

9. Обнаружены различия в регуляции активности фермента интермедиатами пентозофосфатного пути: глюкозо-6-фосфатом, рибозо-5-фосфатом, в норме, при токсическом гепатите и введении веществ-протекторов на фоне развития патологии.

10. Установлено, что при ЭТГ происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГР в печени крыс в 3 раза относительно нормы. При действии протекторов при патологии имеет место уменьшение экспрессии гена ГР. Введение ТК приводит к снижению экспрессии гена ГР более чем в 2 раза, при введении GSH уровень экспрессии снижается на 98%, по сравнению со значением при ЭТГ.

158

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно полученным результатам при токсическом гепатите происходит увеличение удельной активности ГР печени крыс более чем в 2,0 раза по сравнению с контрольной группой животных. Известно, что возрастание интенсивности свободнорадикального окисления при патологии может приводить к изменению структуры и каталитических свойств многих ферментов [53] в том числе, вероятно, и ГР. Введение ТК и GSH животным с патологией способствует снижению удельной активности ГР в 1,5 и в 1,4 раза соответственно по сравнению с группой животных с токсическим гепатитом, приближая ее к уровню активности фермента в норме.

Наряду с этим, установлено, что при ЭТГ происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГР в печени крыс в 3 раза относительно нормы. Введение ТК и GSH животным с ЭТГ приводит к уменьшению экспрессии гена ГР более чем в 2,0 раза по сравнению с уровнем при патологии в первом случае и на 98% — во втором, что, очевидно, связано с проявлением антиоксидантного действия использованных гепатопротекторов, проявляющемся в торможении интенсивности свободнорадикальных процессов при ЭТГ и снижении степени индукции гена ГР.

С использованием электрофоретически гомогенных ферментных препаратов ГР выявлено, что ряд физико-химических свойств фермента при патологии и действии протекторов пе меняется: рН-оптимум, молекулярная масса, субъединичная структура, электрофоретическая подвижность, субклеточная локализация. Полученные данные позволяют предполагать, что изменения активности фермента, выделенного из печени крыс при патологии, а также при введении веществ-протекторов животным с токсическим гепатитом не сопряжены с изменением распределения активности ГР между цитоплазматической и митохондриальной фракциями клетки и реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции активности, связанного с изменением субъединичного состава. Однако, при экспериментальном токсическом гепатите выявлена модификация как некоторых кинетических параметров каталитического действия, так и регуляторных свойств фермента. При токсическом гепатите наблюдалось снижение сродства фермента и к субстрату, и к коферменту в 3 и 8 раз соответственно по сравнению с ферментом, выделенным из печени интактных крыс. Введение протекторов на фоне патологии сопровождалось изменением значений констант Михаэлиса-Ментен в сторону контрольных значений. Несмотря на тот факт, что наряду с увеличением активности фермента при патологии по сравнению с нормой наблюдается снижение сродства фермента к субстрату, отношение Vmax/Км, отражающее эффективность функционирования фермента, возрастает. Данный параметр незначительно снижается при введении ТК и GSH. Необходимо отметить, что ингибирование субстратом было характерно только для фермента из печени крыс с токсическим гепатитом и при введении протекторов на фоне патологии. Ингибирующий эффект НАДФН выявлен для ГР из печени крыс всех исследованных групп.

Установлены различия в температурных оптимумах действия ГР: оптимальная температура действия фермента сдвигается в сторону более высоких значений при токсическом гепатите и введении веществ-протекторов крысам с патологией по сравнению с интактными животными. Исследование воздействия высоких температур на ГР, выделенную из печени животных с токсическим гепатитом показывает ее меньшую термоустойчивость по сравнению с ферментом из печени контрольной группы крыс. Вероятно, это может быть связано со структурными изменениями молекулы фермента, происходящими вследствие ишемического повреждения ткани печени, вызванного экспериментальным токсическим гепатитом. Однако, введение протекторов способствовало увеличению устойчивости к действию высоких температур по сравнению с ГР, выделенной из печени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом. Кроме того, величина энергии активации ГР существенно снижается при патологии, что может иметь значение для повышения активности фермента. Введение веществ-протекторов, по • всей видимости, способствует стабилизации структуры ГР, что отражается на значениях Еакт, а также термоустойчивости возрастающих в этих условиях. Изменения регуляции активности ГР, наблюдаемые в условиях интенсификации СРО, по отношению к интермедиатам пентозофосфатного пути и цикла Кребса, нуклеотидфосфатам, ионам некоторых металлов свидетельствует о модификации ряда регуляторных свойств фермента при патологии печени. Можно предположить, что изменение регуляции активности ГР' может рассматриваться в рамках реализации физико-химического механизма адаптационной реакции к повышению концентрации АФК, сопровождающем развитие патологии. Введение веществ, обладающих протекторными свойствами, животным с патологией ведет к изменению многих исследованных параметров в сторону нормы, что может являться, следствием снижения данными соединениями уровня свободнорадикальных процессов, реализующегося как за счет их прямого антиоксидантного действия, так и участия в стимулировании компонентов антиоксидантных систем организма. Изменение активности ГР и ряда свойств фермента, возможно,- происходит за счет перестроек в структуре молекулы фермента.

На основании результатов проведенных исследований предложена гипотетическая схема (рис. 59), отражающая регуляцию активности ГР , обеспечивающей контроль интенсивности СРО при патологии и действии веществ-протекторов. Согласно данной схеме, представленной на рис. четыреххлористый углерод, проникая в печень, инициирует развитие свободнорадикальных процессов, приводящих к повреждению клеточных структур. Интенсификация СРО приводит к нарушению функционального состояния клеточных мембран и увеличению их проницаемости и как следствие к повреждению гепатоцитов печени [47, 160]. Вместе с тем, при токсическом гепатите происходит мобилизация АОС организма, в которой важное место занимает ГР/ГП система. Очевидно, активация ГР некоторыми метаболитами может способствовать повышению его активности при патологии.

Известно, что при развитии оксидативного стресса происходит изменение концентраций метаболитов, участвующих в реализации функционирования центральных метаболических процессов в клетке за счет снижения интенсивности их протекания [260]. В данных условиях, изменение регуляторных свойств фермента может быть следствием модификации его микроокружения. Так, нами была выявлена большая степень чувствительности ГР к ингибирующему действию рибозо-5-фосфата в условиях нормы чем при патологии. При этом в норме константа ингибирования составила 1,1 мМ. Введение веществ-протекторов сопровождалось изменением значений константы ингибирования в сторону нормальных величин. Обнаружено более интенсивное ингибирование фермента изоцитратом в норме, чем при патологии. В первом случае константа ингибирования составила 0,25 мМ, тип ингибирования -конкурентный, во втором - ингибирование имело смешанный характер, Ki — 1,20 мМ. При введении ТК на фоне патологии данный метаболит ингибировал ГР-активность во всем диапазоне исследованных концентраций, в то время как при введении GSH животным с токсическим гепатитом изоцитрат не оказывал значительного влияния. По-видимому, особенности регуляции активности ГР субстратом ИДГ - реакции могли бы способствовать повышению активности фермента в патологическом состоянии. Установлено, что цитрат при интоксикации крыс СС14 и при введении ТК на фоне патологии активирует ГР во всем диапазоне исследованных концентраций, что, вероятно, может иметь регуляторное значение в условиях повышения содержания цитрата в клетке при развитии оксидативного стресса, сопровождающего развитие токсического гепатита [180]. Причем, по отношению к ГР из печени интактных животных и крыс, которым вводили GSH на фоне патологии, цитрат выступает в качестве ингибитора фермента. При концентрациях оксалоацетата более 0,45 мМ наблюдается активация ГР из печени крыс контрольной группы и при введении GSH на фоне патологии более чем на 20%, в то время как для фермена из пораженной гепатотоксином печени и при введении ТК животным с токсическим гепатитом характерно ингибирование ферментативной активности. Очевидно, особенности регуляции активности фермента при развитии патологии могут иметь определенное значение для сопряжения его функционирования с другими метаболическими путями.

Выявлено, что в условиях нормы АТФ активирует фермент во всем диапазоне исследованных концентраций. Однако, при экспериментальном токсическом гепатите и при введении ТК и GSH животным с патологически измененной печенью данный метаболит оказывал ингибирующее действие. Исследование влияния АДФ на скорость протекания ферментативной реакции выявило активацию ГР как в условиях нормы и токсического гепатита, так и при введении ТК и GSH на фоне патологического процесса. Однако, наибольший активирующий эффект характерен для фермента из печени крыс контрольной группы. Напротив, АМФ оказывает больший стимулирующий эффект на ГР-активность в условиях патологии по сравнению с нормой. При введении протекторов животным с токсическим гепатитом данный интермедиат практически не оказывал влияния. НАДН в условиях нормы и при введении ТК и GSH на фоне токсического гепатита оказывает ингибирующее действие. Однако, данный метаболит активирует фермент из печени крыс, подвергнутых экспериментальному токсическому гепатиту в концентрациях до 0,42 мМ более чем на 40%, хотя дальнейшее увеличение концентрации интермедиата также вызывает ингибирование ГР-активности по бесконкурентному типу.

Таким образом, для ГР, выделенной из печени животных в норме, при токсическом гепатите и введении ТК и GSH при патологии характерно существование разнообразных механизмов регуляции активности под действием ряда физико-химических факторов и интермедиатов клеточного обмена, способных обеспечивать изменение ферментативной активности при токсическом гепатите и, вероятно, играть роль в реализации адаптивных процессов на клеточном уровне в условиях изменения уровня генерирования АФК. Введение протекторов может способствовать нормализации процессов, протекающих в патологически измененной печени, что также может отражаться на каталитических свойствах и регуляции активности ГР. Полученные данные позволяют предполагать, что изменение интенсивности протекания ГР-реакции, при патологии и введении веществ-протекторов может влиять на интенсивность СРО путём регуляции уровня восстановленного глутатиона за счёт модификации параметров каталитического действия и механизмов метаболитной регуляции активности и регуляции экспрессии данного фермента.

Июцнтрят

Оксйлогщетят

НАДФ-ИД1>

6- ф о с фогл мкон ят

НАДФ

2-о кс о глут я р Я1.

НАДФ

НАДФ!

НАДФ

Рнбоэо-5-фосф;

Снижение эффекта

НАДФ

НАДН

О-фос фогл!т: озолактон

ГбФДГ СНк ► I л ю козо-6-фосфаг юцитряп^ НАДФН' и vt-ген с и фнкяци я СРО

Усиление генерации АФК

Нарушение метаболически* процессов п клетке

АТФ

Гибель клетки

ОН + ОН + Fe*-*-. f Реакция Фел^оля )

НгО: + Кс*

Условные обозначения: ( П )- активирующий (ингибирующий) эффект в норме; О (О ) - активирующий (ингибирующий) эффект при экспериментальном токсическом гепатите-О ( ф ) - активирующий (ингибирующнй) эффект при введении тиоктовой кислоты при токсическом гепатите; активирующий (ингибирующий) эффект при введении «остановленного глутатиона при патологии.

Рис. 59. Гипотетическая схема, отражающая регуляцию активности глутатионредуктазы при патологии и действии веществ - протекторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Агарков, Александр Алексеевич, Воронеж

1. Абдулаев Н.Х. Печень при интоксикации гепатотропными ядами / Н.Х.Абдулаев, Х.Я.Каримов. - Ташкент: Медицина УзСССР, 1989. - 25 с.

2. Активированные кислородные метаболиты в монооксидазных реакциях / В.В. Ляхович и др. // Бюллетень СО РАМН. 2005. - Т. 4, № 118. -С. 7-12.

3. Александров В .Я. Клетки, макромолекулы и температура / В.Я. Александров. Л.: Наука, 1975.-293 с.

4. Александров В.Я. Функциональные изменения конформации белков и денатурация / В.Я. Александров // Реактивность клеток и белки. Л., 1985.-С. 127-139.

5. Антиоксидантные системы в тканях мышей линии SAM (Senescence Accelerated Mice), характеризующейся ускоренным процессом старения / А.А. Болдырев и др. // Биохимия. 2001.-Т.66, №10. - С.1430-1437.

6. Арчаков А.И. Окисление чужеродных соединений и проблемы токсикологии /А.И.Арчаков, И.И.Карузина // Вест.АМН СССР. 1988. -№.1.-С. 14-24.

7. Бактерицидная активность и хемилюминесценция мононуклеарных фагоцитов животных (Обзор) / В. С. Гуткин и др. // Сельскохозяйственная биология. 1986, № 6. - С.78-86.

8. Биленко М.В. Ишемическое и реперфузионное повреждение органов /М.В. Биленко. М.: Медицина, 1989. - 368 с.

9. Ю.Бойко Е.Р. Показатели рибофлаиновой обеспеченности организма и активность глутатионоредуктазы у жителей европейского Севера России / Е.Р. Бойко, О. Нильсен, С.Г.Бойко // Физиология человека. -2004. Т.30, №2. - С. 122 - 128.

10. П.Болдырев А.А. Окислительный стресс и мозг / А.А. Болдырев // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т. 7, № 4. - С. 21-28.

11. Бустаманте Д. Метаболизм а-липоевой кислоты в печени при различных формах патологии / Д. Бустаманте, Д. Лодж, Л. Маркоччи // Международный медицинский журнал. 2001. — № 2. - С. 133-142.

12. Н.Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и незапрограммированная смерть клетки / Ю.А. Владимиров // Соросовский Образовательный Журнал. 2000.-Т.6, №9,- С.2-9.

13. Владимиров Ю.А. Кальциевые насосы живой клетки / Ю.А. Владимиров // Соросовский Образовательный журнал. 1998. - №3.-С.20-27.

14. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972. - 252с.

15. П.Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах / Ю.А. Владимиров // Соросовский Образовательный Журнал. 2000. -Т.6, №12. - С.13-19.

16. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова, А.И Деев // Итоги науки и техники. Серия Биофизика. ВИНИТИ, 1991. - Т. 29. - С. 1-252.

17. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран / Ю.А. Владимиров // Биофизика. 1987.-Т.32, №5.-С.830-844.

18. Влияние витамина D3 и экдистероиа на свободно радикальное окисления липидов / А.И. Кузьменко и др. // Биохимия. - 1997. - Т.62, вып.6. -С.712-715.,

19. Влияние гранулоцит-колониестимулирующего фактора "Granocyte" на генерацию активных форм кислорода нейтрофилами in vitro / Е.И. Коваленко и др. // Биополимеры и клетка. 1998. - Т. 14, №6. - С.544-548.

20. Влияние мелатонина на оксидативный статус, содержание цитрата и активность аконитатгидратазы в печени крыс при токсическом гепатите / А.Н. Пашков и др. II Проблемы эндокринологии. 2005. -Т. 51, №6.-С. 41-43.

21. Гродзинский A.M. Краткий справочник по физиологии растений / A.M. Гродзинский, Д.М. Гродзинский. Киев: Наукова думка, 1973. - 273 с.

22. Губский Ю.И. Коррекция химических поражений печени / Ю.И. Губский. Киев: Здоровье, 1989. - 156с.

23. Девяткина Т.А. Особенности процессов перекисного окисления липидов в различных тканях при остром стрессе и его коррекция пирацетамом и церебролизином / Т.А. Девяткина, Е.М. Важничая, Р.В. Луценко // Биохимия. 2000. - Т.4. - С. 38-41.

24. Деримедведь JI. В. Антиоксиданты в кардиологии: характеристика наиболее применяемых средств / Л.В. Деримедведь // Провизор. 1998. -№ 13. - С.64-67.

25. Делянин Н.В. Механизмы антиоксидантной защиты организма при изменении режима кислородного обеспечения / Н.В. Делянин, A.M. Герасимов // Материалы международной научной конференции. -Гродно, 1993.-С. 18-19.

26. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. -М.: Мир, 1970. 252 с.

27. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 2. - 515 с.

28. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 3. - 605 с.

29. Донцов В.И. Галавит — новый иммуномодулятор с биоактивирующим и регенерирующим эффектом / В.И. Донцов, А. А. Подколзин // Ежегодник национального геронтологического центра. 2001. - Вып. 4.-С. 70-80.

30. Досон Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот. М: Мир, 1991. -462 с.

31. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анионрадикала и супероксиддисмутазы в тканях организма / Е.Е. Дубинина // Успехи современной биологии. 1989. - Т. 108, №1. — С.3-12.

32. Дэвис Г. Электрофорез / Г. Дэвис. М.: Мир. - 1970. - 56 с.

33. Еремин А.Н. Влияние полидисульфида галловой кислоты на активность и стабильность каталазы в разных средах / А.Н. Еремин, Ю.П. Лосев, Д.И. Метелица // Биохимия. 2000. - Т.65, №2.-С.298-308.

34. Журавлев А. И. Развитие идей Б. Н. Тарусова о роли цепных процессов в биологии / А. И. Журавлев // Биоантиокислители в регуляцииметаболизма в норме и при патологии: Труды МОИП. М., 1982. -T.LVII. - С.3-36.

35. Зайцев В.Г. Методологичесикие аспекты исследований свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма / В.Г. Зайцев, В.И. Закревский // Вестник Волгоградской медицинской академии. 1998. - Вып.4. — С.49-53

36. Иванов М. Инактивация глутатионредуктазы хинонами и нитрозокарбомидами / М. Иванов, И. Липчук // Укр. биохимия животных 1993. -№56. - С.97-100.

37. Интенсивность свободнорадикальных процессов и регуляция активности цитоплазматической N AD Р и з о цитр атд е гидр о ге н аз ы в кардиомиоцитах крысы в норме и при ишемии / Л.В. Медведева и др. // Биохимия. - 2002. - Т. 67, № 6. - С. 838-849.

38. Каган В.Е. Проблема анализа эндогенных продуктов пероксидного окисления липидов / В.Е. Каган, О.Н. Орлов, JI.JI. Прилипко // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1986. - Т. 18, №4. - С. 136.

39. Карпищенко А.С. Медицинская технология и лабораторная диагностика: Справочник в 2 т. Т. 1. Медицинские и лабораторные технологии / А.С. Карпищенкою СПб: Интермедика, 1999. - 650 с.

40. Карташова О .Я. Моделирование патологических процессов в печени /

41. Я. Карташова; под ред. А.Ф. Блюгер. Рига: Звайгзне, 1975. - 180 с.

42. Кахговер Н. Б. Глутатион-Б-трансферазы ферменты детоксикации / Н. Б. Кахговер, Ю. В. Хмелевский // Укр. биохим. журн. - 1983. - Т. 55 ,№1. С. 86-92

43. Кения М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кения, А.И. Лукаш, Е.П. Гуськов // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, вып. 4. - С. 456-469.

44. Козачок Н.Н. Применение липоевой кислоты (берлитиона) в клинической практике / Н. Н. Козачок, М. Н. Селюк. (http://m-l.com.ua/issues.php?aid=124).

45. Козлов Ю.П. Свободнорадикальное окисление липидов в биомембранах в норме и патологии / Ю.П. Козлов // Биоантиокислители. М., 1975. - С. 5-14.

46. Козлов Ю.П. Свободные радикалы и их роль в нормальных и патологических процессах / Ю.П. Козлов. М.: Наука, 1973. - 174 с.

47. Колесниченко Л.С. Изменение активности ферментов метаболизма глутатиона при иммобилизованном стрессе и их возможное значение / Л.С. Колесниченко, Н.С. Манторова, Л.А. Шапирова // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1990. - №4. — С. 9-13.

48. Кондрашова М.Н. Отрицательные аэроионы и активные формы кислорода / М.Н. Кондрашова // Биохимия. 1999. - Т. 64, №3. - С. 430432.

49. Косенко Е.А. Активность антиокислительных ферментов в печени и мозге снижается в ранние сроки диабета, и это снижение зависит от функционирования NMDA-рецепторов / Е.А. Косенко, А.Ю. Каминский, Ю.Г. Каминский. (http://www.medi.ru/).

50. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. М.: Высш. шк., 1980. - 272 с.

51. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита / В.И. Кулинский // Соросовский Образовательный Журнал. 1999. -Т.38, №1. - С.2-7.

52. Кулинский В.И. Биологическая роль глутатиона / В.И. Кулинский, Л.С. Колесниченко // Успехи совр. биол. 1990. - Т.110, №1(4). - С.20-33.

53. Кулинский В. И. Структура, свойства, биологическая регуляция глутатионпероксидазы / В.И. Кулинский, JI. С. Колесниченко // Успехи совр. биол.-1993. Т. 113, №1. - С. 107-122.

54. Курганов Б.И. Анализ колоколообразных рн-зависимостей скоростей ферментативных реакций / Б.И. Курганов, Е.В. Петушкова // Биохимия. 1992. - Т. 57,№3. - С. 348-361.

55. Кухтина Е.Н. Влияние железа, цинка, меди на процессы перекисного окисления липидов / Е.Н. Кухтина, Н.Н. Глущенко // Биохимия. 1996. -Т. 61, №6.-С. 993-997.

56. Панкин В.З. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях : пособие для врачей / В.З. Ланкин, А.К.Тихазе, Ю.Н. Беленков. 2-е изд. -М.: Мир, 2001. - 78 с.

57. Левенкова М.В. Свойства и регуляция активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс: дис. . к-та биол. наук / М.В. Левенкова. Воронеж, 2006. - 180 с.

58. Ллойд Э. Справочник по прикладной статистике / Э. Ллойд, У. Ледерман. М.: Финансы и статистика, 1990. - С. 493-513.

59. Лукьянова Л. Д. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние / Л.Д. Лукьянова, Б.С. Балмуханов, А.Т. Уголев. -М.: Наука, 1982. 301 с.

60. Любицкий О.Б. Определение антиоксидантной активности биологических жидкостей хемилюминесцентным методом: Автореф. дис. . канд. биол. наук / О.Б. Любицкий Воронеж, 1996. - 25 с.

61. Мауэр Г. Диск-электрофорез / Г. Мауэр. М.: Мир, 1971. - 222 с.

62. Метаболизм а-липосвой кислоты в печени при различных формах патологии/ Д. Бустаманте и др. // Международный медицинский журнал.-2001.-№2-С. 133 -142.

63. Метаболические предикторы гепатоксического действия тетрахлорметана у крыс / Г.И. Блажиевская и др. // Токсикол. вести. -1998. -№ 1.-С.21 -22.

64. Мешкова Н.П. Практикум по биохимии / Н.П. Мешкова, С.Е. Северин. М.: Мир, 1979.-430 с.

65. H2O2 ингибирует рост цианобактерий / В.Д. Самуйлов и др. // Биохимия. 1999. - Т.64, №1. - С.60-67.

66. Об участии свободных активных форм кислорода в ферментативном перекисном окислении липидов в биомембранах / В. Е. Каган и др. // Биофизика. 1979. - Т.44, №3. - С.482-489.

67. Пат. 94026117 РФ, МКИ G09B23/28. Способ создания модели гепатита и цирроза печени млекопитающих / Я.В. Кауров, Г.А. Бояринов, В.П. Смирнов. 1996.

68. Пат. 2194077 Российская Федерация. Способ выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью in vitro с применением НАДФН-оксидазной тест-системы. / В.А. Быков, М.Ф. Минеева, Н.Б. Попова. — 2002.

69. Передача клеточного сигнала и модуляция свободно радикального окисления новым пептидомиметиком у глутамил - гистамином / М.А. Бабижаев и др. // Биохимия. - 1999. - Т64, №5. - С.612-627.

70. Перекисное окисление и стресс / В.А. Барабой и др.. СПб.: Наука, 1992.- 148 с.

71. Пострецепторное образование активных форм кислорода в клетках, не являющихся профессиональными фагоцитами / И. А. Гамалей и др. // Цитология. 1999. - Т. 41, № 5. - С.394-399.

72. Прайер У. Свободные радикалы в биологии: в 2-х т. / У. Прайер. М.: Мир, 1979.-Т. 1.-311 с.

73. Протас А.Ф. Активность антиоксидантных ферментов и уровень свободнорадикальных процессов в ядрах клеток нейронов при низких дозах облучения / А.Ф. Протас // Биополимеры и клетка. 1996. -Т.12,№ 3 — С.47-53.

74. Прохорова М.И. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / М.И. Прохорова. JL: Ленинградский университет. - 1982. - 272 с.

75. Роль глутатионзависимых пероксидаз в регуляции утилизации липопероксидов в злокачественных опухолях / Э.Г. Горожанская и др. //Биохимия.-2001.-Т.66, вып. 2.-С. 273-278.

76. Роль процессов свободнорадикалыюго окисления в патогенезе инфекционных болезней / А.П. Шепелев и др. // Вопросы медицинской химии. 2000. - № 2. - С. 156-167.

77. Саванина Я.В. Накопление тиоловых соединений и изменения активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в клеткахцианобактерии Anacystis nidulsns / Я.В.Саванина, А.Ф. Лебедева, Е.Л. Барский // Вестник МГУ. 2004. - Сер. 16, № 2. - С.30-34.

78. Сидорова В.Ф. Регенерация печени у млекопитающих / В.Ф. Сидорова, З.А. Рябинина, Е.М. Лейкина. Л.: Медицина, Ленинградское отд-ние, 1966.-210 с.

79. Система глутатиона в эритроцитах и плазме крови при вирусных гепатитах / В.И. Кулинский и др. // Биомед. химия. 2007. - № 1, Т.53. -С.91-98.

80. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло / В.П. Скулачев // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. - №3. - С.4-16.

81. Скулачев В.П. Пероксид водорода сенсор легких и кровеносных сосудов и их роль в антиоксидантной защите организма / В.П. Скулачев//Биохимия. - 2001. - Т. 66, №10. - С. 1425-1429.

82. Скулачев В.П. Снижение внутриклеточной концентрации 02 как особая функция дыхательных систем клетки / В.П. Скулачев // Биохимия. 1994. - Т.59, №12.-С.1910-1912.

83. Старикович Л.С. Исследование эффекта последствия малых доз ионизирующих излучений на активность ферментов антиоксидантной защиты эритрона белых крыс / Л.С. Старикович, Т.В.Выговская, Г.Я. Клевета // Радиационная Биология. 2004. - № 7. - С. 103-105.

84. Уайт А. Основы биохимии: в 2 т. / А. Уайт, Ф. Хендлер, Э. Смит ; перевод с англ. -М.: Мир, 1981. Т. 1. -468.

85. Федорова Н.Ю. Состояние системы глутатионпероксидазы-глутатионредуктазы в стимулированном к регенерации органе и еероль в клеточной пролиферации: дис. . канд. биол. наук / Н.Ю. Федорова. Воронеж, 1999. - 186 с.

86. Фильченков А.А. Апоптоз и рак / А.А.Фильченков, Р.С.Стоика. Киев: Морион, 1999.- 184 с.

87. Хайлова JI.C. Липоевая кислота / Л.С. Хайлова, A.M. Юркевич, С.Е. Северин. (http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2337.html).

88. Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов и системы, регулирующие его интенсивность / Н.Г. Храпова// Биохимия липидов и их роль в обмене веществ, 1981. С.147-155.

89. Чернов Н.Н. Латентная форма глутатионредуктазы в печени крыс // Биохимия. 1986. - Т. 51, вып. 5. - С. 762-769.

90. Чеснокова Н.П. Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Успехи современного естествознания. 2006. - № 7. - С. 29-36.

91. Шаронов Б.П. Окисление церулоплазмина гипохлоритом, потеря голубой окраски и сохранение оксидазной активности / Б. П. Шаронов, Н. Ю. Говорова // Биохимия. 1990. - Т.55, №6. - С.1145-1148.

92. Шишкина Л.Н. Связь повреждения мембраны с процессом перекисного окисления липидов при слабых воздействиях / Л.Н. Шишкина, М.А. Смотряева // Биохимия. 2000. - Т.45, №5. - С.844-852.

93. Щербак А.В. Метаболическая терапия: доказуемые перспективы, оправдавшиеся надежды / А. В. Щербак // Здоровье Украины. 2002. -№ 10.-С. 37-59.

94. A comparison of glutathione reductase and glutathione peroxidase activities in patients with rheumatoid arthritis and healthy adults / J. Braven et al. //British J. of Rheumatology. 1989. - V.8. - P. 212-215.

95. A critical revaluation of some assay methods for superoxide dismutase activity / S. Goldstein et al. // Free Radic. Biol. And Med. 1988. - V.4, №5. - P.295-303.

96. Adibhatla R.M. Effects of citicoline on phospholipid and glutathione levels in transient cerebral ischemia / M.R. Adibhatla, J.F. Hatcher, RJ. Dempsey // The J. of the American Heart Association. 2001. - V.32. -P.2376-2381.

97. Altering kinetic mechanism and enzyme stability by mutagenesis of the dimer interface of glutathione reductase / A. Bashir et al. // Biochem. J. 1995. -V. 312.-P. 527-533.

98. Analyses of glutathione reductase hypomorphic mice indicate a genetic knockout / K. Lynette et al. // Toxicological Sciences. 2004. -V.82.-P. 367-373.

99. Anderson N. Oxiding and restore semireactions glutathionereductase from E.coli / N.Anderson, G. Nerski // Biochemistry. 1994. - V.35,№23. -P.5727-5732.

100. Anderson N. The structure NADPH-bind motive. Effect is determined by evolution / N.Anderson, G. Nerski // Biochemistry. 1994. - V.33,№54. -P.13888-13895.

101. An insulin sensitizer improves the free radical defense system potential and insulin sensitive in high fructose fed rats / P. Faure et al. // Diabetes. 1999. - V.48, №2. - P.353-357.

102. A study of the kinetic mechanism followed by glutathione reductase from mycelium of Phycomyces blakesleeanus / S. Montero et al. // Biochim Biophys Acta. 1982. - V.3,№ 705. - P. 348-356.

103. A study of the kinetic mechanism followed by glutathione reductase from mycelium of Phycomyces blakesleeanus / S. Montero et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1990. - V. 278. - P. 52-59.

104. Attenuation of hyperoxia-induced growth inhibition in H441 cells by gene transfer of mitochondrially targeted glutathione reductase / J. Donough et al. // Cell Mol. Biol. 2000. - V. 22. - P. 732-738.

105. Balance between oxidative damage and proliferative potential in an experimental rat model of CCI4 induced cirrhosis: protective role of adenosine administration / R. Hernandez-Vunoz et al. // Hepatology. -1997. - V.26, №5. -P.l 100-1110.

106. Balz F. Molecular and biological mechanisms of antioxidant action / F. Balz // The FASEB Journal. 1999. - V. 13. - P. 963-964.

107. Barrett J. Moniezia expansa glutathione reductase: Purification and properties / J. Barrett, M.J. McCallum // The Hague. 1992. - № 7. - P. 183.

108. Berkson В. M. A conservative triple antioxidant approach to the treatment of hepatitis C. Combination of alpha lipoic acid (thioctic acid), silymarin, and selenium: three case histories / В. M. Berkson // Med. Klin. -1999.-V. 94.-P. 84-89.

109. Becker K. Glutathione reductase of Plasmodium falciparum: Structural comparison with the human hosts'enzyme / K. Becker, S. Muller, B. Bergmann // Ann. Trop. Med. and Parasitol. 1996,- V.90, № 4. - P.431.

110. Becker К. Inhibition of human glutathione reductase by S-nitrosoglutathione / K. Becker, M.Gui, R.Schirmer // Biochem. 1995. -V.234, № 2. - P.472-478.

111. Biochemical response in intestine and gills of Carassius auratus gibelio to acute manganese (II) intoxication / S. Paraschiv et al. // Rev. Roum. Chim. 2006.-T.51,№ 12. - P. 1175-1179

112. Bishop G.M. Zinc stimulates the production of toxic reactive oxygen species (ROS) and inhibits glutathione reductase in astrocytes / G.M. Bishop, R. Dringen, S.R. Robinson // Free Radic. Biol. Med. 2007. - V. 42, №8.-P. 1222-1230.

113. Blumenthal S.A. Inhibition of gluconeogenesis in rat liver by lipoic acid. Evidence for more than one site of action / S.A. Blumenthal // Biochem. J. 1984. - V. 219, № 3. p. 773-780.

114. Bohme C.C. Kinetic characterization of glutathione reductase from the malarial parasite Plasmodium falciparum. Comparison with the human enzyme / C.C. Bohme, L. D Arscott., K. Becker // J. Biol. Chem. 2000. -V.275, №48. - P. 37317-37323.

115. Burt A.D. Diagnostic and interpretation of steatosis and steatohepatitis / A.D.Burt, A. Mutton, C.P. Day // Semin. Diagn. Pathol. 1998. -№ 15. -P. 246-258.

116. Carcia-Femandez A.J. Changes in glutathione-redox balance induced by hexachlorocyclohexane and lindane in CHOK1 cells / A.J. Carcia-Fernandez, A.E. Bayoumi, Y. Perez Pertejo // Xenobiotica. 2000. - No.l 1. -C. 240-250.

117. Carlberg I. Purification and characterization of glutathione reductase from calf liver. An improved procedure for affinity chromatography on 2, 5-ADP-Sepharose 4B / I. Carlberg, B. Mannervik // Anal. Biochem. — 1981. — V. 116.-P.531-536.

118. Carlberg I. Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver / I. Carlberg , B. Mannervik // J. Biol. Chem. 1975. - V. 14,№ 250. - P.5475-5480.

119. Carreau J.P. Biosynthesis of lipoic acid via unsaturated fatty acids / J.P. Carreau // Meth. Enzmol. 1979. - № 62. - P. 152-158.

120. Catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase activities in various rat tissues afier carbon tetrachloride intoxication / S. Szymonik-Lesiuk et al. // J. Hepatobiliaru Pancreat. Surg. 2003. - V.10, №4. -P.309-315.

121. Cettns N. Distribution of the multiple forms of glutathione reductase in plant pea leaves / N. Cettns // Planta. 1990. - V. 186, №1. - P.278-284.

122. Characterization of glutathione amide reductase from Chromatium gracile (Identification of a novel thiol peroxidase (Prx/Grx) fueled by glutathione amide redox cycling) / V. Bjorn et al. // The J. of Biol. Chem. -2001. V. 276, № 24. - P. 20890-20897.

123. Characterization of glutathione reductase from Chromatium gracile / V. Bjorn et al. // The J. of Biol. Chem. 2002. - V. 275, № 29. - P. 20825-20827.

124. Characterization and physiological function of glutathione reductase in Euglena gracilis / S. Shigeoka et al. // Biochem. J. 1987. - V. 242. -P. 511-515.

125. Charles E. M. Hepatic glutathione reductase I. Purification and general kinetic properties / E. M. Charles, G.R. Langdon // The J. of Biol. Chem. 1962. - V. 237, № 5. -P.1589-1595.

126. Charles E. M. Hepatic Glutathione Reductase II. PHYSICAL PROPERTIES AND MECHANISM OF ACTION / E. Mize Charles, E.T. Thompson, G.R. Langdon // The J. of Biol. Chem. 1962. - V. 237, № 5. -P.1596-1600.

127. С. K. Tuggle glutathione reductase is not required for maintenance of reduced glutathione in Escherichia coli K-12 / K.C. Tuggle, A J. Fuchs // J. of Bacteriology. 1985.-V. 162, № l.-P. 448-450.

128. Chrungoo V.J. Differential biochemical response of freshly isolated rat hepatocites to paracetamol, carbon tetrachloride and D-galactosamine toxicity / V.J.Chrangoo, K. Singh, J. Singh // Indian J. Exp. Biol. 1997. -V.35, № 6. - P.603-610.

129. Chung P. M. Inhibition of glutathione disulfide reductase by glutathione / P. M. Chung, R. E. Cappel, H. F. Gilbert // Arch Biochem. Biophys. 1991. -V. 288. - P. 48-53.

130. Clifford A. Effect of prolonged storage on the activities of superoxide dismutase, glutathione reductase, and glutathione peroxidase / A. Clifford, F. Al-Awadi, S. Olusi // Clin. Chem. 2000. - V.46, № 4. - P.566-567.

131. Cloning, sequencing and regulation of the glutathione reductase gene from the Cyanobacterium Anabaena PCC 7120 / J. Fanyi et al. // The J. of Biol. Chem. 1995. - V. 270, № 39. - P. 22882-22889.

132. Colman R. F. On the role of flavin adenine dinucleotide and thiol groups in the catalytic mechanism of yeast glutathione reductase / R. F Colman, S. Black // J. Biol. Chem. 1965. - V. 240, № 4. - P. 1796-1803.

133. Conn E. E. Glutathione reductase of wheat germ / E. E. Conn, B. Vennesland // J. Biol. Chem. 1951. - V. 21. - P. 17-28.

134. Cooper T.G. Mitochondria and glyoxysomes from castor been endosperm / T.G. Cooper, И. Beevers // J. Biol. Chem. 1969. - V. 244, №13.-P. 3507-3513.

135. Crystal structure of the antioxidant enzyme glutathione reductase inactivated by peroxynitrite / N. Savvides Savvas et al. // The J. of Biol. Chem. 2002. - V. 277, № 4. - P. 2779-2784.

136. Cytosolic triglycerides and oxidative stress in central obesity: the missing link between excessive atherosclerosis, endothelial dysfunction, and beta-cell failure. I S.J. Bakker et. al. // Atherosclerosis. 2000. - V. 148, № I. - P. 17-21.,

137. Das U.N. Beneficial effect(s) of n-3 fatty acids in cardiovascular diseases: but, why and how / U.N. Das // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2000. - V. 63, №6. -P. 351-362.

138. Denaturation and reactivation of dimeric human glutathione reductase an assay for folding inhibitors / A. Nordhoff et al. // Eur. J. of Biochem. -1997.-V. 245.-P. 273-282.

139. De novo synthesis of glutathione is required for both entry into and progression through the cell cycle / M. Poot et. al. // J. Cell. Physiol. -1995.-V. 163.-P. 555-560.

140. Deonarain M.P. Escherichia coli. Engineering suface charge. 2 A method for purifying heterodimers of E. coli glutathione reductase / M.P. Deonarain, N.S. Scrutton, N.R. Perham // Biochemistry. 1992. - № 5. -P.1498-1504.

141. Deonarain M.P. Directed mutagenesis of the redox-active disulphide bridge in glutathione reductase from Escherichia coli / M.P. Deonarain, N.S. Scrutton, A. Berry // Proc. Biol. Sci. 1990. - V. 241, № 1302. - 1990. -P. 179-186.

142. Depressed erythrocyte glutathione reductase activity in sickle cell disease / N. V. Raj et al. // The American J. of Clinical Nutrition. 1983. -V. 38. - P.884-887.

143. Detection of glutathione reductase after electrophoresis on native or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels / W.-C. Hou et al. // Electrophoresis. 2004. - V. 25. - P. 2926-2931.

144. Diagnostic evaluation of carbon tetrachloride- induced rat hepatic cirrhosis model / G.P. Lee et al. // Anticancer Res. 2005. - V.25, № 2A.- P.1029-1038.

145. Differential expression of glutathione reductase and cytosolic glutathione peroxidase, GPX1, in developing rat lungs and kidneys / T. Fujii et al. // Free Radic. Res. V. 36, №10. - 2002. - P. 1041-1049.

146. Different responses of cytosolic and mitochondrial glutathione in rat livers after ethylene oxide exposure / T. Katoh et al. // Toxicology Letters.- 1990.-V. 54, №2-3.-P. 235-239.

147. Dinitrosyl-dithiol-iron complexes, nitric oxide (NO) carriers in vivo, as potent inhibitors of human glutathione reductase and glutathione-S-transferase / M. A. Keese et al. // Arch, of Biochem. and Biophys. 2000.- V. 378,1. l.-P. 123-130.

148. Duzova H. Neutrophil superoxide anion production, and CAT and GSSGR activity in patients with tuberculosis / H. Duzova, D. Asma, M.H. Emre //New Microbiol. 2003. - V.3.№ 26. - P. 289-298.

149. Early midsonal oxidative stress preceding cell death in hypoperfused rat liver / M. Suematsu et al. // Gastroenterology. 1992. - V.103,№ 3. -P.994-1001.

150. Effects of chronic variable stress on oxidative stress in rat cerebral cortex / L. Manoli et al. // Rev. Farm, e bioquim. Univ. Sao Paulo. 1998. -№34. - P. 188.

151. Effect of oral dosing vehicles on the subchronic hepatotoxicity of carbon tetrachloride in the rat / K. P. Koporec et al. // J. Toxicol. Environ.Health. 1995. - V.44,№ 1. - P. 13-27.

152. Effect of route and pattern of exposure on the pharmacokinetics and acute hepatotoxicity of carbon tetrachloride / U.Y. Sanzgiri et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1995.- V. 134,№ 1. - P. 148-154.

153. Endotoxin induces glutathione reductase activity in lungs of mice / D. C. Hamburg et al.//Pediatr Res. 1994. - V. 35. - P. 311-315.

154. Erat M. Purification and characterization of glutathione reductase from bovine erythrocytes. / M. Erat, H. Sakiroglu, M. Ciftci // J. Biol. Chem. /- 1998.-V. 10, № 273. P.5744-5751.

155. Erat M. Purification of glutathione reductase from chicken liver and investigation of kinetic properties / M. Erat, H. Demir, H. Sakiroglu // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005 - V.2, № 125. - P. 127-138.

156. Evaluation of oxidative stress during apoptosis and necrosis caused by carbon tetrachloride in rat liver / F. Sun et al. // Biochim. Biophys. Acta. -2001. V.1535, № 2. - P.186-191.

157. Evidence of hepatocyte apoptosis in rat liver after the administration of carbon tetrachloride / J. Shi et al. // Am. J. Pathol. 1998. - V.153. -P.515-525.

158. Expression and enzyme activity of glutathione reductase is upregulated by Fe-deficiency in graminaceous plants / K. Bashir et al. // Plant Mol. Biol. V. 65. - 2007. - P. 277-284.

159. Expression of recombinant human glutathione reductase in eukaryotic cells after DNA-mediated gene transfer / S. Cholin et al. // Biochem. Med. Metab. Biol. 1993. - V. 49. - P. 108-113.

160. Evidence for a novel mechanism of time-resolved flavin fluorescence depolarization in glutathione reductase / A. W. van den Berg Petra et al. // Biophys. J. 2004. - V.87. - P.2577-2586.

161. Fairlamb A. Pathways to drug discovery / A. Fairlamb // Biochemist.-1996. -V. 18, № 1. -P.ll-16.

162. Farber P.M. Recombinant Plasmodium falciparum glutathione reductase is inhibited by the antimalarial dye methylene blue / P.M. Farber, L.D. Arsott , C.H. Williams // FEBS Lett. 1998. - V.422, № 3. - P.311-314.

163. Flavin Fluorescence Dynamics and Photoinduced Electron Transfer in Escherichia coli Glutathione Reductase / A. W. van den Berg Petra et al. // Biophysical Journal. 1998. - V. 74. - P 2046-2058.

164. Freminet A. Carbohydrate and acid metabolism during acute hypoxia in rats blood and heart metabolites / A. Freminet // Сотр. Biochem. and Physiol. 1981. - V.70, №3. - P.427-430.

165. Gene cloning and expression of cytosolic glutathione reductase in rice (Oryza Sativa L.) / Kaminaka Hironori et al. // Plant. Cell Physiol. 1998. - V.39,№ 12.-P. 1269-1280.

166. Gene structure for mouse glutathione reductase, including a putative mitochondrial targeting signal / T. Tamura et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - V. 237. - P. 419-422.

167. Gene transfer of mitochondrially targeted glutathione reductase protects H441 cells from t-butyl hydroperoxide-induced oxidant stresses / J. Donough et al. // Cell Mol. Biol. 1999. - V. 20. - P. 256-263.

168. Gerard-Monnier D. Metabolism and antioxidant function of glutathione / D. Gerard-Monnier, J. Chaudiere // Pathol. Biol. (Paris). -1996.-V. 44.-P. 77-85.

169. Ghibelli L. Non-oxidative loss of glutathione in apoptosis via GSH extrusion / L. Ghibelli, S. Coppola, G. Ratilio // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - V. 216. - P. 313-320.

170. Glutathione reductase activity and isoforms in leaves and roots of wheat plants subjected to cadmium stress / G.G. Yannarelli et al. // Phytochemistry. 2007. - V. 68, № 4. -P.505-512.

171. Glutathione reductase: comparison of steady-state and rapid reaction primary kinetic isotope effects exhibited by the yeast, spinach, and Escherichia coli enzymes / Vanoni M.A. et all. // Biochemistry. 1990. -V. 29. - P. 5790-5796.

172. Glutathione reductase from human erythrocytes: ammo-acid sequence of the structurally known FAD-binding domain / R. Untucht-Grau et al. // Eur. J. Biochem. 1981,-V. 120.-P. 407-419.

173. Glutathione reductase from human erythrocytes. The sequences of the NADPH domain and of the interface domain / R.L. Krauth-Siegel et al. // Eur. J. Biochem. 1982. - V. 121. - P. 259-267.

174. Glutathione reductase from pea leaves: response to abiotic stress and characterization of the peroxisomal isozyme / M.C. Romero-Puertas et al. // New Phytol. 2006. - V. 170. - P. 43-52.

175. Glutathione reductase inhibition and methylated arsenic distribution in Cdl mice brain and liver / V. M. Rodry'guez et al. // Toxicolog. sciences. -2005.-V.84.-P. 157-166.

176. Glutathione reductase in leaves of cowpea: cloning of two cDNAs, expression and enzymatic activity under progressive drought stress, desiccation and abscisic acid treatment / D. Contour-Ansel et al. //Annals, of Botany.-2006.-V. 98.-P. 1279-1287

177. Glutathione reductase in wheat grain. 1. Isolation and characterization / F. De Lamotte et al. // J. Agric. Food Chem. 2000. - V. 48. - P. 49784983.

178. Glutathione reductase is expressed at high levels in pancreatic islet cells / Yuki Nagaoka et al. // Redox Report. 2004. - V. 9, № 6. - P. 11791183.

179. Greer S. Glutathione reductase from Escherichia coli: cloning and sequence analysis of the gene and relationship to other flavoprotein disulfide oxidoreductases / S.Greer, R.N. Perham // Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 2736-2742.

180. Guo Z. Spontaneous hypomorphic mutations in antioxidant enzymes of mice / Z. Guo, K.Higuchi, M.Mori // Free Radic. Biol. Med. 2003. - V. 35.-P. 1645-1652.

181. Gutierrez-Correa J. Inactivation of yeast glutathione reductase by Fenton systems: effect of metal chelators, catecholamines and thiol compounds / J. Gutierrez-Correa, A.O. Stoppani // Free Radic. Res. 1997. -V. 27, №6.-P. 543-555.

182. Halliwel B. Free radicals, reactive oxygen species, and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis / B. Halliwel // Br. J. Exp. Pathol. 1989. - V. 70. - P. 737-757.

183. Hernandes A. Stability to ozone in grades of tobacco / A. Hernandes, U. Moony // Agr. and Biochem. 1990. - V.54, № 51. - P. 1062-1065.

184. Hikiche N. A molecular dynamics study of glutathione reductase / N. Hikiche, M. Paulin, M. Hanst // J. Mol. Struct. Theochem. 1995. - № 5. -P.243-254.

185. Hinson J.A. Phase II enzymes and bioactivation / J.A.Hinson, P.G.Forkert // Can. J. Physiol Pharmacol. 1995. - V.73, № 10. - P.1407-1413.

186. Hirichi N. A molekular dynamics study of glutathione reductase // N. Hirichi, M. Pauliko, M. Hansz // S. Mol. Stuct. Theochem. 1995. - V.335. - P. 243-254.

187. Horse-liver glutathione reductase: purification and characterization / C. Garcia-Alfonso et al. // Int. J. Biochem. 1993. - V.l,№ 25.- P.61-68.

188. Huang J. Distribution of glutathione and glutathione-related enzyme systems in mitochondria and cytosol of cultured cerebellar astrocytes and granule cells / J. Huang, M.A. Philbert // Brain Res. V.680, № 1-2. - 1995. -P. 16-22.

189. Hwavg C. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum / C. Hwavg, A.J. Sinsky, H.F. Lodish // Science. 1992. - № 257. -P. 1496-1502.

190. Immunohistochemical study of glutathione reductase in rat ocular tissues at different developmental stages / T. Fujii et al. // The Histochemical Journal. V.33. - 2001. - P. 267-272.

191. Increase of lipid hydroperoxides in liver mitochondria and inhibition of cytochrome oxidase by carbon tetrachloride intoxication in rats / K. Ikeda et al. //Free. Radic. Res. 1998. - V.28,№ 4. -P.403-410.

192. Increased oxidative stress in the RAW 264.7 macrophage cell line is partially mediated via the S-nitrosothiol-induced inhibitionof glutathione reductase / U. Butzer et al. // FEBS. 1999. -1. 445. - P. 274-278.

193. Inhibition of glutathione reductase by dinitrosyl-iron-dithiolate complex / Boese Matthias et al. // Biochem. and Mol. Biol. 1997. - V. 272, №35.-P. 21767-21773.

194. Inverted tandem duplication of 8pl2 p23.1 in a child with increased activity of glutathione reductase / N.C. Nevin et al. // Journal of Medical Genetics. - 1990. - V. 27. - P. 135-136.

195. Jimenez A. Role of the ascorbate-glutathione cycle of mitochondria and peroxisomes in the senescence of pea leaves./ A Jimenez, J. A. Hernandez, G. Pastori // Plant Physiol. 1998. - V. 118, № 4. - P. 1327-1335.

196. Johnston D.E. Mechanism of early carbon tetrachloride toxicity in cultured rat hepatocytes / D.E.Johnston, C. Kroening // Pharmacol. Toxicol. 1998.-V.83,№ 6.-P.231-239.

197. Johnson A.S. Antioxidant enzyme response to hypericin in EMT6 mouse mammary carcinoma cells / A.S. Johnson, R. Pardini // Free Radic. Biol, and Med. 1998. - V.24, № 5. - P. 817-826.

198. Karplus P. A. A crystallographic study of the glutathione binding site of glutathione reductase at 0.3-nm resolution / P. A. Karplus, E. F. Pai, G. E. Schulz // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 178. - P. 693-703.

199. Karplus P.A. Refined structure of glutathione reductase at 1,54 A resolution / P.A. Karplus, G.E. Schulz // J. Mol. Biol. -1987. V. 195. - P. 701-729.

200. Karplus P. A. Substrate binding and catalysis by glutathione reductase as derived from refined enzyme: substrate crystal structures at 2 A resolution / P. A. Karplus, G. E. Schulz// J. Mol. Biol. 1989. - V. 210. - P. 163-180.

201. Kinase activation via a glutathione reductase-mediated mechanism -terminal 2 fluid shear stress attenuates hydrogen peroxide-induced c-jun NH / Yamamoto Kei et al. // The J. of the American Heart Association. 2002. -V.91.-P. 712-718.

202. Kinetic characterization of glutathione reductase from the malarial parasite Plasmodium falciparum comparison with the human enzyme / C.C. Bome et al. // The J. of Biol. Chem. 2000. - V. 275, № 48. - P. 3731737323.

203. Kliukiene R. Photoinactivation of tiypanothione reductase and glutathione reuctase by Al-phthalocyanine tetrasulfonate and hematoporphyrin / R. Kliukiene, A. Maroziene, N. Cenas // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1996. - V.218, № 2. - P.629-632.

204. Kowaltowski A.J. Mitochondrial damage induced by conditions of oxidative stress / A.J. Kowaltowski, A.E. Vercesi // Free Radical Biology & Medicine. 1999. -V. 26. - P. 463-471.

205. Krauth-Siegel R. Glutathione reductase from human erythrocytes / R. Krauth-Siegel, R. Blatherpicl, H. Salch // Eur. J. Biochem.- 1982. V. 121, № 2. - P. 259-267.

206. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature.-1970.-V. 227.-P. 680-685.

207. Lawrense A. Micromethods in signale muscle tibeis / A. Lawrense, A. Helen, M. Deniese // Anal. Biochem.- 1988. V.172, № 2. - P. 575-579.

208. Lee W.M. Drug-induced hepatotoxicity / W.M. Lee // New England Journ. Med. 1995,-V.333,№ 17.-P. 1118-1127.

209. Le Trang N. Purification of glutathione reductase from gerbil liver in two steps / N. Le Trang, K.K. Bhargava, A. Cerami // Anal. Biochem. -1983.-V. 133.-V. 94-99.

210. Liberos V. Purification and characteristic glutathione reductase from Rodospirillum rubrum / V. Liberos, J. Padro // Arch. Biochem. Biophys. -1992.-№ 1. P.234-253.

211. Lipoic and dihydrolipoic acid as antioxidants: a critical evaluation / B.C. Scott et al.//Free Rad Res.-V. 1994. V.20. - P. 119-133.

212. Long-term ethanol administration enhances age-dependent modulation of redox state in different brain regions in the rat: Protection by acetyl carnitine / V. Calabrese et al. // S. Mol. Stuct. Theochem. 1995. - V. 335. - P. 243-254.

213. Long-trem ethanol administraion enhances age-dependent modulation of redox state in brain and peripheral organs of rat: Protection by acetyl carnitine / G. Scapagnini et al. // Int. J. Tissue React. 2002. - № 3. - P.89-96.

214. Lopez-Barea J. Mouse-liver glutathione reductase. Purification, kinetics, and regulation. / J. Lopez-Barea, C.Y. Lee // Eur. J. Biochem. -1979. V.2,№ 98 - P.487-499.

215. Low activity of superoxide dismutase and high activity of glutathione reductase in erythrocytes from centenarians / Helle R. Andersen et al. // Age and Ageing. 1998. - V.27. - P.643-648.

216. Lower antioxidant capacity and elevated p53 and p21 may be a link between gender disparity in renal telomere shortening, albuminuria, and longevity / J.L. Tarry-Adkins et al. // Am. J. Physiol. Renal Physiol-2006. -V. 290, №2. -P. 509-516.

217. Low red blood cell glutathione reductase and pyridoxine phosphate oxidase activities not related to dietary riboflavin: selection by malaria / B. B. Anderson et al. // The American J. of Clinical Nutrition. 1993. - V.57. -P. 666-672.

218. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin-Phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chem. -1951. V.194, №1. - P.265-271.

219. Lukasik I. Activity of Se-independent glutathione peroxidase and glutathione reductase within cereal aphid tissues / I. Lukasik, S. Golawska // Biol. Lett. V. 44, № 1.- 2007.- P. 31-39.

220. Mahtab S. S Hepatic glutathione reductase and riboflavin concentrations in experimental deficiency of thiamin and riboflavin in rats / S.S. Mahtab, D. Bamji // J. Nutr. 1972. - V. 102. - P. 443-448.

221. Malshet V.G. Fluorescent products of lipid peroxidation. I. Structural requirement for fluorescence in conjugated schiff bases / V.G. Malshet, A.L. Tappel // Lipids. 1973. - V.8, №4. - P. 194-198;

222. Mannervik B. A branching reaction mechanism of glutathione Reductase / B. Mannervik // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. - V. 53.-P. 1151-1158.

223. Mapson L. W. Glutathione reductase from germinated peas / L. W. Mapson, F. A. Isherwood //Biochem. J. 1963. -V. 54. - P. 173-191.

224. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide / A. Shevchenco et al. // Anal. Chem. 1996. - V.68. -P.850-858.

225. Massey V. On the reaction mechanism of yeast glutathione Reductase / V. Massey, C.H. Jr. Williams // J. Biol. Chem. 1965. - V. 240. - P. 4470-4480.

226. Mata A.M. Purification by affinity chromatography of glutathione reductase (EC 1.6.4.2) from Escherichia coli and characterization of suchenzyme / A.M. Mata, M.C. Pinto, J. Lopez-Barea // J. Naturforsch. 1984. -V. 39, №9-10. -P. 908-915.

227. Mbemba F. Subcellular localization modification with ageing of glutathione, glutathione reductase activities in human fioblasts / F. Mbemba, A. Houbion, M. Raes // Biochim. and Biophys. acta: Gen-Sulj. 1985. -V.838, №4.-P. 211-220.

228. McCallum M.J. The purification and properties of glutathione reductase from the cestode Moniezia expansa / M.J. McCallum, J. Barrett // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1995. -V. 27. - P. 393-401.

229. Mechanistic studies on a novel, highly potent gold-phosphole inhibitor of human glutathione reductase / M. Deponte et al. // J. Biol. Chem. -2005. V. 280,1. 21. - P.20628-20637.

230. Mechanisms of caemloplasmin biosynthesis in normal and cooperdeficient rats / J. D. Gitlin et al. // Biochem. J. 1992. - V.282, №23. -P.835-839.

231. Metals are directly involved in the redox interconversion of Saccharomyces cerevisiae glutathione reductase / J. Peinado et al. // Molecular and Cellular Biochem. 1991. - V. 101, № 2. - P. 175-187.

232. Miki T. Oxidative stress response in yeast: purification and characterization of glutathione reductase from Hansenula mrakii / T. Miki, Y. Tsujimoto, S. Miyabe // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1996. -V.60,№ 7.-P. 1207-1209.

233. Millerand H. peroxide modification of monoalkylated glutathione reductase stabilization of an active-site cysteine-sulfenic acid / H. Millerand, A. Claibornej // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266, № 29. - P. 19342-19350.

234. Mitochondrial targeting of glutathione reductase requires a leader sequence / Tamura Toshiya et al. // Biochem. And Biophys. Res. Commun. 1996. - V.222, № 3. - P.659-663.

235. Molecular characterization and expression of Onchocerca volvulus glutathione reductase / S. Muller et al. // Biochem. J. V. 325. - 1997. - P. 645-651.

236. Molecular organization of the glutathione reductase gene in Drosophila melanogaster / M. Candas et al. // Arch, of Biochem. and Biophys. V. 339, № 2. - 1997. - P. 323-334.

237. Molecular responses to photooxidative stress in Pinus sylvestris II. differential expression of Cu,Zn-superoxide dismutases and glutathione reductase / S. Kaipinski et al. // Plant Physiol. 1993. - V.103. - P. 13851391.

238. Morgan P.E. Inhibition of glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase by peptide and protein peroxides generated by singlet oxygen attack / P.E. Morgan, T.D. Roger, M.J. Davies // Eur. J. Biochem. -2002.-V. 269.-P. 1916-1925.

239. Ng M.C. Purification and properties of glutathione reductases from bovine ciliary body / M.C. Ng, H. Shichi // Exp. Eye Res. 1986. - V. 43. -P. 477- 489.

240. Nitric oxide inhibits phtofrin(R)-induced lipid peroxidation in murine leukemia cells / Eric E. Kelley et al. // Photochem. and Photobiol. 1999. -V.69.-P10.

241. Nuclear and nucleolar glutathione reductase, peroxidase, and transferase activities in liver of male and female fischer-344 rats / K. Rogers Lynette et al. // Tozicological sciences. 2002. - V. 69. - P. 279-285.

242. Ochalska-Czepulis M. Glutathione reductase activity of chromatin isolated from mouse spleen nuclei / M. Ochalska-Czepulis, S.Bitny-Szlachto //Int J Biochem. 1981.-V. 13.-P. 519-521.

243. Ogus H. Human jejunal glutathione reductase: purification and evaluation of the NADPH- and glutathione-induced changes in redox state / H. Ogus, N. Ozer // Biochem. Med. Metab. Biol. 1991. - V.l, № 45. -P.65-73.

244. Ookhtens M. Role of the liver in interorgan homeostasis of glutatione and cystine / M. Ookhtens, N. Kaplowitz // Sem. Liver Dis. 1998. -№ 18. -P. 313-329.

245. Oxidative stress response in yeast: purification and characterization of glutathione reductase from Hansenula mrakii / T. Miki et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996. - V.7, № 60. - 1207-1209.

246. Pai E.F. The catalytic mechanism of glutathione reductase as derived from x-ray diffraction analyses of reaction intermediates / E.F. Pai , G.E. Schulz // J. Biol. Chem. 1983. - V. 3,№ 258. - P. 1752-1757.

247. Pajovic S.B. Effects of progesterone and estradiol benzioate on glutathione dependent antioxidant enzyme activities in the brain of female rats / S.B. Pajovic, Z.S. Saicic, M.B. Spasic // Gen. Physiol, and Biophys. -1999.-V.l8, № 1. -P.35-44.

248. Pantili E. Distribution of glutathione peroxidases and glutathione reductase in rat brain mitochondria / E. Pantili, G. Sandri, L. Ernster // FEBS Lett. 1991.-V.290,№ 12.-P. 35-37.

249. Passwater R.A. Lipoic Acid / R.A. Passwater // The Metabolic Antioxidant. New Canaan, CT: Keats Publishing, Inc. - 1995. - P. 1-47.

250. Patel M. P. Enterococcus faecalis glutathione reductase: purification, characterization and expression under normal and hyperbaric 02 conditions / M. P. Patel, J. Marcinkeviciene, J. S. Blanchard // FEMS Microbiol. Lett. -1998.-V. 166.-P. 155-163

251. Paulikova H. Effect of heparin and dextran sulfate on the activity of glutathione reductase from yeast / H. Paulikova, I. Petrickova, M. Antalik // Biochem. and Mol. Biol. Int. 1996. - V.38, № 6. - P. 1117-1126.

252. Pelkonen О. Inhibition and induction of human cytochrome P450 (CYP) enzymes / O.Pelkonen, J.Maenpaa, P.Taavitsainen // Xenobiotica. -1998. — V.28, № 12.-P. 1203-1253.

253. Perham R.N. New enzymes for old: redesigning the coenzyme and substrate specificities of glutathione reductase / R.N. Perham, N.S. Scrutton, A. Berry//Bioessays V. 3, № 10. - 1991. -P. 515-525.

254. Peroxynitrite modification of glutathione reductase: modeling studies and kinetic evidence suggest the modification of tyrosines at the glutathione disulfide binding site / D. Francescutti et al. // Protein Engineering. 1996. -V. 9, №2.-P. 189-194.

255. Pick U. Glutathione reductase and lipoamide dehydrogenase have opposite stereospecificities for a-lipoiacid enantiomeus / U. Pick, N. Haramaki, A. Constantinescu // Biochem. and Biophys. Res. Commun. -1995. V.206, № 2. -P. 724-730.

256. Plastidial glutathione reductase from Haynaldia villosa is an enhancer of powdery mildew resistance in wheat {Triticum aestivum) / Ya-Ping Chen et al. // Plant Cell Physiol. V. 48, № 12. - 2007. - P. 1702-1712.

257. Platelet surface glutathione reductase-like activity / David W. Essex et al. // J. Hemostasis, Thrombosis, And Vascular Biology. 2004. - V. 104, № 5. - P. 1383-1385.

258. Processing of Gene Expression Data Generated by Quantitative RealTime RT-PCR / P. Y. Muller at al. // BioTechniques. 2002. - V. 32, №6. — P.354-360.

259. Purification and characterization of glutathione reductase from Rhodospirillum rubrum / C.A. Libreros-Minotta et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1992. - V. 298. - P. 247-253.

260. Purification of glutathione reductase from bovine brain, generation of an antiserum, and immunocytochemical localization of the enzyme in neural cells / J.M. Gutterer et al. // J. Neurochem. 1999. - V. 73. - P. 14221430.

261. Purification of glutathione reductase from porcine erythrocytes by the use of affinity chromatograpHy on 2',5'-ADP-sepHarose 4B and crystallization of the enzyme / V. Boggaram et all. // Anal. Biochem. -1979.-V. 98.-P. 335- 340.

262. Purification of multiple forms of glutathione reductase from pea (Pisum sativum L.) seedlings and enzyme levels in ozone-fumigated pea leaves / N.R. Madamanchi et al. // Plant Physiology. 1992. - V. 100, №1. -P. 138-145.

263. Purification, properties, and oligomeric structure of glutathione reductase from the cyanobacterium Spirulina maxima / J.L. Rendon et al. // Arch Biochem. Biophys.- 1986. V.l,№248. - P.215-223.

264. Rachdan D. Glutathione Reductase from Human Cataract Lenses can be Revived by Reducing Agents and by a Molecular Chaperone, alpha -Crystallin / D. Rachdan, M.F. Lou, J.J. Harding // Curr Eye Res. 2005. -№30V.10. - P. 919-925.

265. Rail T. W. Glutathione reductase of animal tissues / T. W. Rail, A.L. Lehninger // J. Biol. Chem. 1952. - V. 9. - P. 119-130.

266. Rao P. Oxygen radicals and their scavenging systems / P. Rao. M. Cohen, H. Mueller.-N.Y.: Elsevier. 1983.-V. 15. - P. 357-360/

267. Ray S.D. A hepatotoxic dose of acetaminophen modulates expression of BCL 2, BCL - X (L), and BCL - X(S) during apoptotic and necrotic death of mouse liver cells in vivo / S.D.Ray, N.A.Jena // Arch.Toxicol. -2000. - V.73, № 10-11.-P. 594-606.

268. Ray L.E. Isolation and some characteristics of glutathione reductase from rabbit erythrocytes (38548) / L.E. Ray, J.M. Prescott // Exp. Biol, and Med. 1975. - V. 148. - P.402-409.

269. Reduced cellular glutathione reductase activity and increased adhesion molecule expression in endothelial cells cultured with maternal plasma from women with preeclampsia / Y. Zhang et al. // J. Soc. Gynecol. Investig. — 2006. V. 13, № 6. - P.412-417.

270. Reed D. J. Glutathione: toxicological implications / D. J. Reed // Ann. Rev. Pharmacol. Tox. 1990. - V. 30. - P. 603-663.

271. Refined mapping of the gene for glutathione reductase on human chromosome 8 / W. Gutensohn et al. // Hum. Genet. V. 43. - 1978. - P. 221-224.

272. Regulation of horse-liver glutathione reductase / C. Garcia-Alfonso et al. // Int. J. Biochem. 1993. - V. 25, № 4. -P.513-520.

273. Robert E. A glutathione reductase from Escherichia coli / E. A. Robert // The Journal, of Biol. Chem. 1955. - V. 26. - P. 77-85.

274. Robin J. Mockett overexpression of glutathione reductase extends survival in transgenic Drosophila melanogaster under hyperoxia but not normoxia / J.R. Mockett, S.S. Rajindar, C.O. William // The FASEB J. -1999.-V. 13. P. 1733-1742.

275. Role of active site tyrosine residues in catalysis by human glutathione reductase / R. L. Krauth-Siegel et all. // Biochemistry. 1998. - V. 37. -P. 13968-13977

276. Rosenburg H.R. Effects of a-lipoic acid on vitamin С and vitamin E deficiencies / H.R. Rosenburg, R.Culik // Arch Biochem Biophys. 1959. -V.80.-P. 86-93.

277. Rost M. Luminol and lucigenin amplified chemiluminescence and lipid-peroxidation with brain microsomes from rats during ontogenic development / M. Rost, E. Karge, W. Klinger // Experimental and Toxicol. Pathol. 1998. - T.50, №3. - P.253-255.

278. Salfur F. Induction of selenium glutathione reductase at Chlamidomonas / F. Salfur, V. Sisian, N. Vertub // Mol. Biol. 1992. -V.67, №16. - P.439-444.

279. Savvides Savvas N. Kinetics and crystaiiographic analysis of human glutathione reductase in complex with a xanthene inhibitor / N. Savvas Savvides, S. Karplus, P. Andrew // J. Biol. Chem. 1996. - V.271, № 12. -P. 8101-8107.

280. Schaedle M. Chloroplast glutathione reductase / M. Schaedle, A.J. Bassham // Plant Physiol. 1977. - V. 59. - P. 1011-1012.

281. Schirmer R.H. Structural compassion of the flavoenzyme glutathione reductase with other proteins / R.H. Schirmer // Biomol. Struct. 1978. -V.l, № 6. -P.33-38.

282. Scholich H. Antioxidant activity of dihydrolipoate against microsomal lipid peroxidation and its dependence on a-tocopherol / H. Scholich, M.E. Muiphy, H. Sies //Biochem. Biophys. Acta.- 1989. V.l001. - P. 256-261.

283. Schulr G.E. High resolution structure and catalytieaction of human glutathione reductase / G.E. Schulr, A. Karplus // Biochem. Soc. Trans. -1988.-V.12,№2.-P.81-84.

284. Schulz G.E. FAD-binding site of glutathione reductase / G.E. Schulz, R.H. Schirmer, E.F. Pai // J. Mol. Biol. 1982. - V. 160. - P. 287-308.

285. Scott E. Purification and properties of glutathione reductase of human erytrocytes / E. Scott, I.W. Duncan, V. Eksrand // J. Biol. Chem. — 1963. — V. 238.-P. 3928-3933.

286. Sergeev P. V. // Effects of sex hormones and antihormones on the activity of redox system enzymes of human erythrocyte glutathione / P. V. Sergeev, S. A. Chukaev, Yu. A. Korovkina // Bull, of Experim. Biol, and Med. 1997. - V. 124, № 2. - P. 786-788.

287. Serrano A. Occurrence of two isoforms of glutathione reductase in the green alga Chlamydomonas reinhardtii / A. Serrano, A. Llobell // Planta. -1993. -V. 190, № 2. -P. 199-205.

288. Serrano A. Purification and properties of glutathione reductase from the Cyanobacterium anabaena sp. strain 7119 / A. Serrano, J. Rivas, M. Losada // J. Bacteriol. 1984. - V. 158. - P.317-324.

289. Sharma S. P. Existence of bluish-with fluorescing agepidment-prlipofuscin / S. P. Sharma, T. J. James // Free Radic. Biol. And Med.1991. V. 10, №6.-P.443-444.

290. Skulachev V.P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation / V.P. Skulachev // Bioscience Reports. 1997. - V.17. - P.347-366.

291. Staal G.E. The reaction mechanism of glutathione reductase from human erythrocytes / G.E. Staal, C. Veeger // Biochim Biophys Acta. -1969.-V. 185. — P.49-62.

292. Stelmaszynska T. Possible involvement of mieloperoxidese in lipid peroxidation / T. Stelmaszynska, E. Kukovetz, G. Egger // Int. J. Biochem.1992. V.24, № 1. -P.121-128.

293. Stoll V.S. Glutathione reductase turned intj trypanothione reductase: Structural analysis of an engineered change in substrate specificity /V.S. Stoll, S.J. Simpson, L.R. Krauth-Siegel // Biochemistry. 1997. - V.36, № 21. - P.6437-6447.

294. Structural, spectroscopic and catalytic activity studies on glutathione reductase reconstituted with FAD analogues / U. Ermler et al. // European J. of Biochem. 1991. -V. 199. - P. 133-138.

295. Stuart R.L. Isoniazid toxicity in health care workers / R.L. Stuart, J.Wilson, M.L.Grayson // Clin. Infect. DIS. 1999. - V.28, № 4. - P. 895897.

296. Studies of the mechanism of the UVA light-dependent loss ofglutathione reductase activity in human lenses / М/ Linetsky et al. //

297. Pediatric Research. 1994. - V. 35. - P. 311-315.

298. Styblo M. In vitro inhibition of glutathione reductase by arsenotriglutatione / M. Styblo, D. Thomas // Biochem. Pharmacol. 1995. -V. 49, № 7. - P.971-977.

299. Sugiyama K. Inhibition of glutathione reductase chinones / K.Sugiyama, A. Tyasy // Planta. 1993'. - V.45,№ 4. - P.1456-1463.

300. Sundari P.N. Does oxidative stress damage play role in the pathogenesis carbon tetrachloride-indused liver injury in the rat / P.N. Sundari, G. Wilfred, B. Ramakrishna // Biochim. Biophys. Acta. 1997. -Y.1362, № 2-3. — P.169-176.

301. Suttle N.F. Cooper olificienci in ruminants; recent developments / N.F. Suttle // Yet. Res. 1986. - V.l 19, №21. - P.519-522.

302. Taniguchi M. Similarities between rat liver mitochondrial and cytosolic glutathione reductases and their apoenzyme accumulation in riboflavin deficiency / M. Taniguchi, Т. Hara, FI. Honda // Biochem Int. -1986.-V. 13. -P.447-454.

303. Tayarani I. Enrymatic Protection against peroxidative damage in isolated brain capillaries / I. Tayarani, H. Chaediere, H. Lefancennier // J. Neurochem.- 1987. V.48, № 5. - P. 1399-1402.

304. The antioxidant effect of DL-alpha-lipoic acid on copper-induced acute hepatitis in Long-Evans Cinnamon (LEC) rats / H. Yamamoto et al. //Free Radic Res.-2001.-V. 34, № l.-P. 69-80.]

305. The role of iron in the inactivation of bovine lactate dehydrogenase (LDH) and yeast glutathione reductase (GR) / L.A. Cardoso et al. // Rev. Farm. Bioquim. Univ. Sao Paulo. 1998. - V.34. - P. 108.

306. Theodore W. R. Glutathione reductase of animal tissues / W. R. Theodore, L.A. Lehninger // The J. of Biol. Chem. 1952. - V.3. - P. 119130.

307. The unique glutathione reductase from Xanthomonas campestris: gene expression and enzyme characterization / S. Loprasert et al.. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. - V. 331. - P.1324-1330.

308. Picaud T. Electrostatic Control of the Isoalloxazine Environment in the Two-electron Reduced States of Yeast Glutathione Reductase / T. Picaud, A. Desbois // The J., of Biol. Chem.- 2002. V. 277, № 35 - P. 31715-31721.

309. Thicme K. Three-dimensionae structure of glutathione reductase / K. Thicme, E. Pai, R. Schirmer // J. Mol. Biol. 1981. - V. 152, № 4. - P.763-782.

310. Three-dimensional structure of glutathione reductase at 2 A resolution / R. Thieme et al.//J. Mol. Biol. 1981. - V. 152.-P. 763-782.

311. Ulusu N. N. Purification and kinetic properties of glutathione reductase from bovine liver / N. N. Ulusu B. Tandogean // Mol. Cell Biochem. 2007. - V. 303. - P. 45-51.

312. Vander J.D. Inactivation of glutathione reductase by 4-hydroxynonenal and other endogenous aldehydes / J.D. Vander, L.A. Hunsaker, J.T. Vander // Biochem. Pharmacol. 1997. - V.5, № 8. -P.l133-1140.

313. Williams A.C. Functional significance of the pentose phosphate pathway and glutathione reductase in the antioxidant defenses of humansperm / A.C. Williams , W.C.L. Ford // Biology of reproduction. 2004. -V.71. - P.1309-1316.

314. Willmore W.G. Purification and properties of glutathione reductase from liver of the anoxia-tolerant turtle, Trachemys scripta elegans / W.G. Willmore, K.B. Storey // Mol. Cell Biochem. 2006. - V. 297. - P. 139149.

315. Wingsle G. Differential redox regulation by glutathione of glutathione reductase and Cu,Zn-superoxide dismutase gene expression in Pinus sylvestris L. needles / G. Wingsle, S. Karpinski // Planta. 1996. - V.198, № 1. -P.151-157.

316. Wingsle G. Regulation of gene glutathione reductase in Pinus sylvestris / G. Wingsle, S. Karpinski // Pianta. 1997. - V.168, №5. -P.191-195.

317. Wolz P. Neuroprotective effects of alpha-lipoic acid and its enantiomers demonstrated in rodent models of focal cerebral ischemia / P. Wolz, J. Krieglstein // Neuropharmacology. 1996. - V. 35. - P. 369-375.

318. Woods J.S. Up-regulation of glutathione synthesis in rat kidney by methyl mercury / J.S. Woods, M.E. Ellis // Biochem. Pharmacol. 1995. -№ 50. — P.1719-1724

319. Wong K.K. Glutathione reductase: solvent equilibrium and kinetic isotope effects / K.K. Wong , M.A. Vanoni, J.S. // Blanchard Biochemistry. -1988. V.18,№27. - P.7091-7096.

320. Yoshino К. Ингибирование ферментных активностей алифатическими альдегидами, образованными из липидных пероксидов / К. Yoshino // Numazu kogyo koto senmon gakko kenkyu hokoku. 1995. - V.45, № 30. - P.l 11-115.

Информация о работе

Агарков, Александр Алексеевич
кандидата биологических наук
Воронеж, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Регуляция активности глутатионредуктазы из печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы