Регуляция активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени крыс при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов

Цветикова, Любовь Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени крыс при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени крыс при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов"

На правах рукописи

А //

00460705И

Цветикова Любовь Николаевна

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ НАД- И НАДФ-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗ В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ

Специальность 03.01.04.- Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж 2010

004607050

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель доктор биологических наук,

профессор Попова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Пашков Александр Николаевич;

кандидат биологических наук, Лущик Марина Валерьевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 29 июня 2010 года в 15й часов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, биолого-почвенный факультет, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан « 27 » мая 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В ряде исследований было показано, что фактор некроза опухоли-a (ФНО-а) стимулирует генерирование активных форм кислорода (АФК) и индуцирует апоптоз различных типов клеток (Скулачев В.П., 2001; Droge W., 2002; David J., 1992; Rôle...2000). Полагают, что ФНО-а-опосредованный апоптоз лежит в основе развития болезней печени (Nietsch Н.Н., 1999; David J., 1992; Mechanisms of hepatotoxicity.., 2002). Необходимо подчеркнуть, что индукция ФНО-зависимого апоптоза в клетках печени требует сенситизации гепатоцитов, например, такими ингибиторами транскрипции как галактозамин-N (Гал-N) или актиномицин-D (Akt-D) (Effect of hepatocyte.., 2000; Hepatocytes Sensitized.., 2000). Так, было показано, что совместное воздействие Akt-D и ФНО-а вызывает активацию каспаз-3; -8; -9, выход цитохрома С из митохондрий, снижает уровень НАДФН и повышает концентрацию АФК в гепатоцитах (Disruption of redox.., 2000).

Подавлению интенсивности свободнорадикального окисления (СО) биомолекул может способствовать изменение функционирования ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) (Tretter L., 2000, СкулачевВ.П., 2001;). В этой связи вызывает интерес изучение каталитического действия НАД-изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41; НАД-ИДГ), одного из ключевых ферментов ЦТК. Актуальность изучения регуляции активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ, К.Ф. 1.1.1.42.) обусловлена генерированием в ходе ферментативной реакции НАДФН, необходимого для функционирования глутатионредуктазной/ глутатионпероксидазной (ГР/ГП) антиоксидантной системы (АОС) (Lee S.M., 2002; Structures of human.., 2004). Показано, что митохондриальная НАДФ-ИДГ может вносить определенный вклад в снижение степени развития апоптоза (Control of mitochondrial...2001; Lee JH., 2007). При индукции апоптоза и оксидативного стресса (ОС) происходит истощение АОС (Саприн А.Н., 1999; Шульпекова Ю.О., 2004). Интересно отметить, что продукт ИДГ-реакции, 2-оксоглутарат (2-ОГ) , способен оказывать антиоксидантный эффет при развитии ОС (Tulsawani R., 2006; Alpha-ketoglutarate.., 2009; Acute toxicity.., 2009; Oxidative stress.., 2009).

В настоящее время убедительно доказано, что тиоктовая кислота (ТК) и мелатонин (М) не только обладают самостоятельным антиоксидантным потенциалом, но и обеспечивают мощную поддержку работы других звеньев АОС в организме (Protective effect.., 2005; Melatonin protects.., 2007). Ряд данных свидетельствует, что эти вещества являются эффективными гепатопротекторами (Козачок Н.Н., 2003; Макеева А.В., 2007; Попов С.С., 2008).

В связи с этим вызывает интерес изучение регуляции активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ, выделенных из печени крыс в норме, при развитии апоптоза и действии ТК и M на фоне апоптоза.

введением Акт-О и ФНО-а, а также при действии ТК и М на фоне развития патологического состояния. В связи с целью были поставлены следующие задачи: 1) оценка антиоксидантного статуса в крови и печени крыс при индукции апоптоза и действии ТК и М на фоне развития патологии; 2) исследование степени фрагментации ДНК печени крыс в условиях развития апоптоза и при введении ТК и М; 3) исследование субклеточной локализации и активности НАД- и НАДФ -зависимых изоцитратдегидрогеназ в гепатоцитах крыс при введении Акт-В и ФНО-а и действии гепатопротекторов; 4) получение высокоочищенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-ИДГ из печени крысы при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов на фоне развития апоптоза; 5) определение кинетических свойств НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ из печени крысы при индукции апоптоза и действии ТК и М на фоне развития апоптоза; 6) исследование регуляции активности ИДГ из печени крыс некоторыми метаболитами цикла Кребса и глутаматом, при апоптозе и действии гепатопротекторов на фоне развития апоптоза; 7) исследование регуляции активности ИДГ, выделенной из печени крыс при введении Акт-Б и ФНО-а и действии протекторов на фоне развития апоптоза компонентами ГП/ ГР системы; 8) исследование регуляции активности ИДГ из печени крыс компонентами реакции Фентона и ионами некоторых металлов, при индукции апоптоза, а также при действии гепатопротекторов на фоне развития апоптоза; 9) исследование влияния адениннуклеотидов на активность НАД- и НАДФ-ИДГ из печени крыс экспериментальных групп животных; 10) создание гипотетической модели участия НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ в регуляции процессов СО в гепатоцитах с учётом особенностей функционирования данных ферментов при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов на фоне развития патологии.

Научная новизна. Впервые изучены особенности функционирования НАД- и НАДФ- ИДГ при развитии апоптоза, индуцированного Акт-Б и ФНО-а, и при действии гепатопротекторов на фоне патологического процесса. Показана адаптивная роль ИДГ в условиях индукции апоптоза, проявляющаяся в изменении их активности и регуляторных свойств по отношению к ряду метаболитов. Выявлены механизмы, обеспечивающие модификацию активности НАД- и НАДФ-ИДГ в условиях развития апоптоза. Исследована роль различных метаболитов в изменении активности исследуемых ферментов.

На основе анализа особенностей регуляции активности НАД- и НАДФ-ИДГ при апоптозе и действии гепатопротекторов на фоне развития патологии, впервые разработана гипотетическая схема участия ИДГ в снижении темпов апоптотических и свободнорадикальных процессов при патологических изменениях в печени экспериментальных животных.

Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о функционировании НАД- и НАДФ-ИДГ в условиях индукции апоптоза и действия гепатопротекторов. Особенности регуляции активности данных ферментов при развитии апоптоза способствуют пониманию развития патологических изменений в печени и

поиску путей их коррекции в медицинской практике. Разработанные способы получения высокоочищенных ферментных препаратов изоцитратдегидрогеназ могут применяться в научно-исследовательской практике.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых, дипломных работ и магистерских диссертаций студентами.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 5-й научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» ( Воронеж, 2007), международной научной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2008), международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины» (Москва, 2008), VIII съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, 2008), на Всероссийской заочной электронной научной конференции «Медицинские технологии» (Москва, 2008), на общероссийской научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2009), III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на -Дону, 2009), III Всероссийской научно-практической конференции «Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования» (Нижний Тагил, 2010), на 14-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, 2010).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 16 публикациях - 7 статьях и 9 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. При развитии апоптоза, вызванного введением крысам Акт-D и ФНО-а, происходит интенсификация свободнорадикальных процесссов и активация АОС, что сопровождается повышением уровня диеновых конъюгатов, параметров биохемилюминесценции, возрастанием активности аминотрансфераз, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени и сыворотке крови, а также фрагментацией ДНК в гепатоцитах крыс. При действии ТК и М на фоне развития апоптоза наблюдается сдвиг ряда исследуемых параметров в сторону контрольных значений.

2. Субклеточная локализация, молекулярная масса и электрофоретическая подвижность НАД- и НАДФ-ИДГ не изменяются при увеличении активности ферментов в условиях индукции апоптоза, а также при снижении ферментативной активности при введении гепатопротекторов.

3. Исследования, проведённые с использованием гомогенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-ИДГ, выделенных из печени крыс

контрольной группы и животных с индуцированным апоптозом, а также крыс, которым вводили ТК и М, свидетельствуют о существенных модификациях механизмов метаболитной регуляции активности и ряда кинетических параметров каталитического действия различно локализованных форм ИДГ при развитии апоптоза и действии веществ-протекторов.

4. На основе анализа функционирования НАД- и НАДФ-ИДГ при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов предложена гипотетическая схема, отражающая участие данных ферментов в печени крыс в ограничении темпов свободнорадикальных процессов и особенностей регуляции их активности.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 175 страницах основного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (7 глав), заключения, выводов, списка литературы (407 источника) и на 52 страницах приложения. Иллюстративный материал включает 33 рисунка и 14 таблиц. В приложении содержатся 57 рисунков и 3 таблицы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали самцов белых лабораторных крыс (Ra/tus raííus L.) массой 180-200 г, которые содержались на стандартном режиме вивария. Для проведения исследований были сформированы 4 группы крыс: 1) интактные крысы (п=20); 2) животные с индуцированным апоптозом, вызванным введением Акт-D и ФНО-а (п=30); 3) крысы, подвергнутые введению ТК на фоне развития апоптоза (п=20); 4) животные, подвергнутые введению М на фоне развития апоптоза (п=25).

Создание экспериментальной модели. Для индукции апоптоза крысам вводили Акт-D внутрибрюшинно (20 мкг/кг веса животного), а затем через 20 мин - ФНО-а (1 мкг/кг) ( Tumor necrosis.., 1995; Activation of caspases.., 1999; Disruption of redox.., 2000). Материал забирали через 6, 9, 12, 16, 18 и 24 часа после введения Акт-D и ФНО-а.

ТК (16 мг/кг) (Метаболизм а-липоевой кислоты.., 2001) и М (2 мг/кг) (Melatonin inhibits.., 2004) после индуцирования апоптоза вводили внутрибрюшинно, троекратно, с интервалом 3 часа. Материал забирали через 12 часов после индукции апоптоза. Контрольным животным вводили соответствующую аликвоту физиологического раствора. Печень извлекали и использовали для дальнейшего исследования.

Оценка антиоксидантного статуса в крови и печени крыс. Оценку антиоксидантного статуса в сыворотке крови и гомогенате печени крыс осуществляли путем определения параметров биохемилюминесценции (БХЛ), содержания диеновых конъгатов (ДК, Х.=233 нм) (Владимиров Ю.А., 1973; Орехович В.Н., 1977), восстановленного глутатиона (GSH, )=412 нм) (Бузлама B.C.,, 1997) и активностей ГП и ГР.

Определение активности ферментов Активности ГП, ГР, НАД- и НАДФ-ИДГ, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) определяли спектрофотометрически при 340нм (Кочетов Г.А., 1980), сукцинатдегидрогеназы (СДГ) - при бООнм (Cooper T.G., 1969). Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) определяли при 537нм (Лившиц В.М., 1995). Общий белок определяли по методу Лоури и биуретовым методом (Lowry О., 1951; Tietz N.W., 1976).

Определение степени фрагментации ДНК. ДНК из печени крыс исследуемых групп выделяли фенольно-хлороформным методом (Влияние тиоктовой кислоты.., 2008). Электрофорез (ЭФ) ДНК проводили в блоке агарозного геля (Харрингтон Дж., 1999).

Выделение и очистка исследуемых ферментов. Для выделения НАД- и митохондриальной НАДФ-ИДГ (мНАДФ-ИДГ) проводили разделение субклеточных фракций гепатоцитов методом дифференциального центрифугирования; для цитоплазматической НАДФ-ИДГ (цНАДФ-ИДГ) после гомогенизации материала использовали фракционирование белков сульфатом аммония. Далее очистку ферментов осуществляли с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-25, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрации на Тойоперл HW-65 (Кочетов Г.А., 1980). Все операции проводили в холодной камере при 0-4°С.

Определение молекулярной массы ферментов. Молекулярную массу (Mr) ферментов определяли методом гель-фильтрации через Тойоперл HW-65. Определение субъединичной (СЕ) молекулярной массы проводили с помощью ЭФ по методу Лэммли (Laemmli U.K., 1970).

Аналитический электрофорез. ЭФ проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) при 4°С по Дэвису (Дэвис Г., 1970). Контроль гомогенности ферментных препаратов осуществляли путем универсального окрашивания на белок с использованием нитрата серебра (Nesterenko M.V., 1994). Окраску на специфическую активность проводили с использованием нитросинего тетразолия (Кочетов Г.А., 1980).

Исследование кинетических и регуляторных свойств. Кинетические и регуляторные свойства ИДГ исследовали с использованием гомогенных ферментных препаратов. Определение констант Михаэлиса (Км), активации (Ка) и ингибирования (Ki) осуществляли по Диксону и Уэббу (Диксон М., 1982), коэффициента Хилла (пн) и рК ферментов - по Курганову (Курганов Б.И., 1978; 1992).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили не менее чем в 8-ми кратной биологической повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в 2 повторностях. Обработку результатов опытов проводили с использованием стандартных методов. Обсуждаются различия при Р<0,05 (Ллойд Э., 1990).

ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА В КРОВИ И ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ

Исследование динамики развития патологического состояния на 6, 9, 12, 16, 18 и 24 час после индукции апоптоза выявило интенсификацию свободнорадикальных процессов, о чем свидетельствовали не только возрастание содержания ДК, глутатиона, параметров БХЛ (1тах, Б, tga), но и увеличение активности АлАТ, АсАТ, ГП, ГР, НАД-ИДГ, НАДФ-ИДГ в печени и в сыворотке крови крыс (табл. 1-2, рис. 1). Наиболее выраженные изменения происходили на 12 час развития патологии. В это же время отмечалась фрагментация ДНК печени крыс (рис. 2). Полученные данные свидетельствовали о развитии апоптоза после введения Акт-О и ФНО-а. При этом удельная активность НАДФ-ИДГ и НАД-ИДГ в печени крыс становилась в 1,4 и 1,3 раза выше показателей контрольной группы животных, в сыворотке крови - в 2,1 и 1,4 раза. В связи с этим, было изучено действие ТК и М при развитии апоптоза через 12 часов после введения Акт-Э и ФНО-а.

Таблица 1

Содержание ДК, вБН и параметры БХЛ в печени и сыворотке крыс в норме (1), на 6 ч -{2); 9 ч -{3); 12 ч- (4); 16 ч- (5); 18ч- (6); 24 ч -{1) развития апоптоза и при

действии ТК (8) и М (9) на фоне индукции апоптоза

№ ДК, мкмоль/г ОЙН, ммоль/г 1тах,тУ Б, тУ *сек

Печень

1 9,10±0,36 0,210±0,01 42,00±1,80 92,00±3,80 8,00±0,35

2 13,71±0,54* 0,281±0,01* 48,33±2,12* 91,80±3,81 16,13±0,65*

3 11,28±0,45* 0,176±0,01* 43,75±1,90 92,19±3,60 13,73±0,59*

4 17,60±0,70* 0,407±0,01* 56,67±2,58* 122,60±4,94* 17,20±0,70*

5 15,05±0,60* 0,240±0,01* 55,42±2,30* 121,61±4,99* 15,06±0,63*

6 11,24±0,44* 0,392±0,01* 36,25±1,68* 82,38±3,54* 12,53±0,59*

7 9,94±0,39 0,351±0,01* 36,25±1,20* 81,73±3,29* 12,26±0,43*

8 10,50±0,41* 0,310±0,01* 55,41±2,17* 114,94±4,98* 10,46±0,43*

9 12,00±0,48* 0,233±0,01* 50,63±2,25* 110,72±4,29* 9,40±0,38*

Сыворотка крови крыс

N ДК, мкмоль/л ОБН, ммоль/л 1тах,тУ Б, тУ *сек

1 0,755±0,03 0,370±0,02 35,00±1,5 305,0±12,2 13,00±0,52

2 1,983±0,08* 0,797±0,03* 40,86±1,7* 292,5±11,7 21,62±0,68*

3 2,408±0,09* 0,797±0,03* 36,77±1,8 210,9±8,9* 23,72±0,89*

4 2,990±0,13* 1,214±0,04* 47,09±1,8* 310,9±12,4 31,23±1,49*

5 3,053±0,13* 0,949±0,04* 41,29±1,9* 279,2±11,6* 18,02±0,81*

6 1,951±0,08* 1,152±0,08* 28,81±1,8* 193,2±7,2* 16,37±0,55*

7 2,078±0,08* 1,265±0,08* 20,00±1,2* 177,2±7,3* 9,91±0,39*

8 0,802±0,03 0,531±0,01* 16,77±0, 8* 102,6±4,2* 9,23±0,36*

9 1,040±0,03* 0,683±0,01* 15,80±0,5* 110,8±4,5* 8,24±0,37*

*в данной и последующих таблицах отличия от контроля достоверны (уровень значимости -р<0,05)

Действие гепатопротекторов, как перехватчиков свободных радикалов, по-видимому, тормозило процесс СО, в результате чего происходило

изменение в сторону нормы параметров БХЛ, содержания ДК, наблюдалось снижение активности ГР/ГП системы, аминотрансфераз, что в определенной степени могло отражаться и на активности НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ. При действии ТК и М активность НАД-ИДГ в печени снижалась в 1,3 и 1,1 раза, НАДФ-ИДГ в печени в 1,4 и 1,1 раза, НАДФ-ИДГ в сыворотке крови в 1,7 и 1,9 раза по сравнению с условиями апоптоза.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 1. Активность ГП (А), ГР (Б), НАДФ-ИДГ (В) и НАД-ИДГ (Г) в печени крыс в норме (1), на 6 ч -(2); 9 ч 43); 12 ч- (4); 16 ч- (5); 18 ч- (6); 24 ч -(7) развития апоптоза и при действии ТК (8) и М (9).

1 2 3 4 5

Рис. 2. Электрофореграмма ДНК из печени крыс в условиях нормы (2), индукции апоптоза (3), при действии тиоктовой кислоты (4) и мелатонина (5) на фоне развития апоптоза. На треке 1 -маркерная ДНК. Стрелкой показано направление движения ДНК.

СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ОЧИСТКА НАД- И НАДФ-ЗАВИСИМЫХ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗ

Наибольшее количество НАД-ИДГ в печени крыс исследуемых групп содержится в митохондриях (MTX) (-96-98,0%), на долю цитоплазматической (ЦТП) фракции приходится не более 4,0% от общей активности. Активность НАДФ-ИДГ в ЦТП фракции составляет 73-75,0% от общей активности фермента и 25-27,0% - в митохондриальной. Локализация ферментов была подтверждена методом ЭФ в ПААГ с проявлением на специфическую активность (рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма ИДГ из MTX (I) и ЦТП (II) фракций гепатоцитов крыс в норме (а), при индукции апоптоза (б), при введении ТК (в) и М (г) после специфического проявления на активность. Зоны локализации: 1 -НАД-ИДГ, 2 - мНАДФ-ИДГ, 3- цНАДФ-ИДГ, 4 - маркера (бромфеноловый синий). Стрелкой показано направление движения белка при электрофорезе

Таблица 2

Активность аминотрансфераз, ГП, ГР и ИДГ в сыворотке крови крыс в норме (1), на 6 ч -(2); 9 ч -(3); 12 ч - (4); 16 ч - (5); 18 ч- (6); 24 ч -(7) развития апоптоза и при действии ТК (8) и М (9)_

Активность ферментов в сыворотке крови крыс

№ An AT, мккат/л АсАТ, мккат/л ГП, Е/мл ГР, Е/ мл НАДФ-ИДГ, Е/ мл НАД-ИДГ, Е/ мл

1 0,257 ±0,01 0,250 ±0,01 0,160±0,01 0,040±0,001 0,028±0,001 0,040±0,002

2 0,345 ±0,01* 1,547 ±0,09* 0,409±0,010* 0,040±0,001 0,057±0,001* 0,042±0,002

3 0,397 ±0,01* 2,022 ±0,11* 0,553±0,02* 0,041±0,001 0,057±0,001* 0,051±0,002*

4 0,456 ±0,01* 1,606 ±0,10* 0,570±0,02* 0,062± 0,002* 0,064±0,001* 0,050±0,002*

5 0,345 ±0,01* 1,428 ±0,07* 0,409±0,01* 0,059±0,002* 0,052±0,001* 0,036±0,002

6 0,313 ±0,01* 1,308 ±0,12* 0,303±0,01* 0,032± 0,001* 0,026±0,001 0,027±0,001

7 0,230 ±0,01* 1,428 ±0,05* 0,310±0,01* 0,035±0,001* 0,021±0,001* 0,038±0,001

8 0,323 ±0,01* 1,189 ±0,06* 0,187±0,01* 0,025±0,001* 0,032±0,001* 0,028±0,001*

9 0,344 ±0,01* 1,309 ±0,08* 0,198±0,01* 0,022±0,001* 0,037±0,001* 0,033±0,001*

Результаты очистки НАД- и НАДФ-ИДГ из печени контрольных крыс и животных, которым вводили Акт-О и ФНО-а, а также ТК и М на фоне развития апоптоза представлены в таблицах 3 и 4. Гомогенность ферментных препаратов ИДГ из печени животных исследуемых групп была подтверждена ЭФ в ПААГ с последующим проявлением на белок (рис. 4) При этом белок проявлялся в виде одной полосы с идентичными величинами электрофоретической подвижности (Я!): -0,18 для НАД-ИДГ, -0,46 для мНАДФ-ИДГ и -0,55 для цНАДФ-ИДГ. Значения ЯГ совпадали при окрашивании гелей на белок и при специфическом проявлении на активность.

Полученные гомогенные ферментные препараты были использованы для исследования кинетических параметров каталитического действия и регуляторных свойств НАД- и НАДФ- ИДГ.

Таблица 3

Очистка цитоплазматической НАДФ-ИДГ из печени крыс в норме (1), _при индукции апоптоза (2), действии ТК (3) и М (4)__

Стадия очистки Условия опыта Общая активность, Е Количество бежа, мг Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

Гомогснат 1 6,956*0,322 77,327±3,930 0,090±0,010 (100) (1)

2 10,539±0,543* 76,257±3,721 0,138±0,010*

3 7,835±0,254* 73,335±3,530 0,107±0,010

4 9,271±0,420* 73,248±3,732 0,127^0,011*

Фракционирование (N114)2504 1 5,681±0,278 18,815±0,961 0,302±0,024 81,67 3,36

2 8,621±0,330* ¡9,001 ±0,852 0,454Щ021* 81,80 3,29

3 5,922±0Д40 18,109±0,904 0,327±0,024 75,58 3,06

4 8,012±0,305* 18,457^,920 0,434±0,02* 86,42 3,42

Гель-фильтрация на сефадексе С-25 1 5,645±0Д45 15,256±0,251 0,370±0,020 81,15 4,11

2 8,724±0,350* 15,646±0,241 0,558±0,020* 82,78 4,04

3 6,002±0,274 14,044±0,250* 0,427±0,020* 76,60 3,99

4 7,910*0,320* 14,646±0,422 0,540±0,031* 85,32 4,25

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 1 3,034±0,163 1,952±0,089 1,554±0,067 43,62 17,27

2 4,814±0,250* 2,338±0,100* 2,059±0,100* 45,68 14,92

3 3,251 ±0,173 2,459±0,141* 1,322±0,070* 41,49 12,36

4 3,744±0,13* 2,049^,100 1,827^,081* 4038 14,39

Гель-фильтрация на Тоуорег! Н\\Ч>5 1 0,906±0,040 0,105±0,010 8,629±0,400 13,02 95,88

2 1,349±0,051* 0,126±0,010* 10,706±0,500* 12,80 77,58

3 1,254±0,005* 0,134±0,010* 9,358=0,500 16,01 87,46

4 1Д58±0,06* 0,115±0,01* 10,939±0,51* 13,57 86,13

Таблица 4

Результаты очистки митохондриальиой НАД- и НАДФ-ИДГ из печени рыс в норме (1), при индукции апоптоза (2), действии ТК (3) и М (4)

Фермент Условия опыта Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

НАД-ИДГ 1 3,615±0,142 17,57 73,77

2 4,414±0,178* 17,09 71,19

3 3,692±0,146 22,43 68,37

4 3,690±0,149 20,00 68,33

мНАДФ-ИДГ 1 13,375±0,250 18,19 77,3!

2 17,222±0,374* 17,40 71,78

3 13,968±0,321* 22,49 76,33

4 12,458±0,285* 17,15 70,38

Рис. 4. Электрофореграмма изоцитратдегидрогеназы из печени крыс в норме (а), при индукции апоптоза (б), при введении тиоктовой кислоты (в) и мелатонина (г) на фоне индукции апоптоза. Зоны локализации: 1 -НАД-ИДГ, 2 -мНАДФ-ИДГ, 3- цНАДФ-ИДГ , 4 -маркера (бромфеноловый синий). Стрелкой показано направление движения белка при ЭФ

Рис. 5. Электрофореграмма ИДГ из печени крыс в норме (а), при индукции апоптоза (б), введении ТК (в) и М (г) после ЭФ в присутствии ДДС-Ыа. Зоны локализации: 1- НАД-ИДГ, 2- мНАДФ-ИДГ, 3- цНАДФ-ИДГ , 4- фронта маркера (бромфеноловый синий). Стрелкой показано направление движения белка при ЭФ. Маркерные белки: 5- фосфорилаза Ь (97 кДа), 6 -яичный альбумин (45 кДа), 7— карбоангидраза (30 кДа), 8- ингибитор трипсина (20,1 кДа), 9- а-лактоальбумин (14,4 кДа)

При развитии апоптоза и действии гепатопротекторов не происходит образования новых изоформ, а также изменения значений Мг ( ~159,0; 96,0 и ~ 112,0 кДа) и Мг СЕ (-38,0; -46,5 и -55,5 кДа, рис. 4) для НАД-, мНАДФ- и цНАДФ-ИДГ из печени крыс соответственно.

Очевидно, выявленное увеличение ферментативной активности не связано с реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции активности ферментов.

КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА НАД- и НАДФ-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ

Кинетика протекания ферментативной реакции, катализируемой НАД-ИДГ, имеет аллостерический характер в отношении изоцитрата (ИЦ). Однако, зависимости скорости реакции от концентрации кофактора и кофермента подчиняются кинетике Михаэлиса-Ментен. Коэффициент Хилла при развитии апоптоза в 1,3 раза больше, чем в условиях нормы, что говорит об увеличении числа центров связывания субстрата, и, вероятно, может приводить к возрастанию активности фермента. При действии гепатопротекторов происходит снижение коэффициента Хилла. Км по НАД возрастает, а по ионам Мп2+падает в патологическом состоянии (табл.5).

Зависимость скорости ферментативной реакции, катализируемой НАДФ-ИДГ, от концентрации изоцитрата, НАДФ и ионов Мп2+ подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. При развитии апоптоза наблюдается уменьшение Км относительно кофакторов для цитоплазматической НАДФ-ИДГ по сравнению с нормой (табл. 5).

Значения оптимума рН и рК ионогенных групп НАД- и НАДФ-ИДГ представлены в таблице 5.

Константа ингибирования НАД-ИДГ 20Г и оксалоацетом (ОА) по ИЦ возрастает в условиях развития апоптоза. Введение ТК приводит к увеличению, а введение М - к уменьшению степени ингибирования фермента 20Г (табл.6). 2-ОГ и ОА также снижают активность НАДФ-ИДГ в печени крыс всех исследуемых групп. И фермента 2-ОГ возрастает при индукции апоптоза и и действии протекторов (табл. 6). Кг по ОА для НАДФ-ИДГ и цитрату для мНАДФ-ИДГ уменьшаются при развитии апоптоза и введении гепатопротекторов.

Константа активации цитратом НАД- и цНАДФ-ИДГ в условиях развития апоптоза возрастает по сравнению с нормой (табл.7). Глутамат также активирует НАД-ИДГ и цитоплазматическую форму НАДФ-ИДГ.

Малат в концентрациях от 0,7 до 1,0 мМ ингибирует НАД-ИДГ из печени крыс в норме и при действии мелатонина, однако не оказывает достоверного влияния на активность цНАДФ-ИДГ.

активирует НАД-ИДГ и цНАДФ-ИДГ в большей степени при развитии апоптоза, в то время как в условиях нормы подавляет активность НАД-ИДГ и достоверно не влияет на ход цНАДФ-ИДГ-реакции (рис.6).

Таблица 5

Кинетические параметры НАД-, митохондриальной и цитоплазматической НАДФ-ИДГ в норме (1), при индукции апоптоза (2) и

ИДГ ^^^(ЭпЫТ 1 2 3 4

пн, мМ ИЦ 1,712±0,19 2,274±0,23* 1,849±0,15 2,093+0,16*

Км, НАД 0,093+0,01 0,294±0,01* 0,192 ±0,01* 0,144±0,01*

мМ Мй" 0,025±0,001 0,019±0,001* 0,021±0,001 0,024+0,001

Ушах/ НАД 45,87±2,2 23,42±1,1* 26,67+1,5* 33,56+1,4*

и И Км Мп2г 625±25 1000+47* 833±29* 833±24*

? рН0Р, 7,12±0,20 6,91+0,20 6,96+0,22 7,05+0,21

рКа рК, 6,52±0,21 6,316+0,24 6,37±0,24 6,45±0,22

№ рк2 7,72+0,23 7,51 ±0,27 7,56±0,25 7,64±0,26

Км, мМ ИЦ 0,070±0,012 0,135±0,014* 0,101+0,015* 0,124±0,014*

НАДФ 0,054+0,005 0,048±0,004 0,032+0,005« 0,043±0,005*

Мп2+ 0,267+0,021 0,285±0,020 0,278+0,023 0,276+0,022

и § 1 е Ушах/ Км ИЦ 199,30+7,2 131,58±6,8* 144,93±6,7* 108,70±5,7*

НАДФ 333,34+16,2 434,78+16,7* 526,3 ±17,2* 333,34+15,9

55,87±2,6 64,94+2,9* 55,25±2,8* 51,02+2,5

рН0„1 7,55±0,26 7,49+0,25 7,43+0,26 7,53±0,29

< № рКа рК, 6,94+0,21 6,88+0,22 6,83±0,22 6,93±0,25

г рК2 8,15±0,31 8,09±0,30 8,04+0,29 8,13+0,29

Км, ИЦ 0,125±0,012 0,130±0,011 0,127±0,009 0,124+0,01

мМ НАДФ 0,151±0,025 0,061+0,024* 0,113±0,012* 0,132+0,01

0,493±0,024 0,395+0,019* 0,412+0,025 0,508+0,03

Ушах/ ИЦ 72,46±3,4 88,50±3,2* 86,20±2,7 95,23+2,9*

и ч: Км НАДФ 121,95+4,1 227,27±5,8* 133,34+4,5* 131,58+5,1*

к 1 20,12±1,4 31,65+1,7* 25,06±1,6* 24,45+1,5*

а = рКа рК, 7,12+0,22 6,81±0,26 7,06±0,24 6,99±0,27

рК2 8,60+0,30 8,28±0,31 8,26±0,28 8,31±0,32

Стимулирующий эффект в8Н на активность НАД- и цНАДФ-ИДГ при индукции апоптоза, вероятно, может быть связан с повышенной потребностью клетки в 2-ОГ, который является основным поставщиком углеродных скелетов для синтеза глутамата, связанного с синтезом различных аминокислот и С8Н [Рахманова Т.Н., 2002]. В то же время, при патологии происходит снижение значений Кд мНАДФ-ИДГ 08Н по сравнению с нормой.

Таблица 6

Константы ингибирования (К1) и тип ингибирования (ТИ) НАД-, НАДФ-ИДГ из печени крыс в условиях нормы (1), при индукции апоптоза (2), действии тиоктовой кислоты (3) и мелатонина (4)**

Ингибитор Условия опыта НАД-ИДГ мНАДФ-ИДГ цНАДФ-ИДГ

Ki, мМ ТИ Ki, мМ ТИ Ki, мМ ТИ

2-ОГ 1 0,152±0,007 Бк 0,381±0,012 к 0,228±0,014 К

2 1,691 ±0,067* Бк 1,294±0,052* См 0,490±0,013* К

3 1,489±0,039* Бк 0,947±0,038* См 0,522±0,014* к

4 2,329±0,20* Бк 0,859±0,034* См 0,112±0,014* к

ОА 1 0,045±0,021 К 1,440±0,057 К 1,721±0,058 к

2 0,068±0,007 К 0,777±0,037* См 0,748±0,023* к

3 0,146±0,005* к 0,146±0,009* См 1,252±0,085* к

4 0,262±0,015* См 0,242±0,011* См 1,176±0,091 * Бк

г- 5+ Fe 1 1,177±0,047 См 0,086±0,004 Нк 0,067±0,003 Нк

2 1,193±0,049 Бк 0,054±0,002* См 0,036±0,002* К

3 1,237±0,050 См 0,029±0,002* См 0,039±0,002* К

4 1,249±0,050 См 0,102±0,004* См 0,030±0,001* К

ЬЬОз 1 0,407±0,020 См 0,182±0,007 См 0,530±0,027 См

2 0,514±0,025* См - - - -

3 0,432±0,012 См 0,134±0,005* См 1,587±0,070* См

4 0,431±0,012 См - - 1,742±0,070* См

*'Примечание: Типы ингибирования:

См-смешанный, К- конкурентный, Бк-Бесконкурентный, Нк-Неконкурентный

Константа активации окисленным глугатионом (GSSG) НАД-ИДГ и активирующий эффект данного метаболита на активность митохондриальной формы НАДФ-ИДГ (Ка 0,285±0,017) при развитии апоптоза возрастает по сравнению с нормой (табл.7). При введении гепатопротекторов под действием GSSG происходит снижение активности мНАДФ-ИДГ по сравнению с условиями развития патологического состояния.

При развитии апоптоза происходит возрастание Ki НАД-ИДГ ионами Fe3+ и пероксидом водорода. При этом Ki для ионов Fe2+ и Са2+ снижаются для мНАДФ-ИДГ (табл. 6). Наблюдается также уменьшение значения Ki цНАДФ-ИДГ ионами Fe2+ по сравнению с нормой, при этом ионы Fe3+ не оказывают достоверного воздействия на активность фермента. Можно предполагать, что механизм ингибирующего действия двухвалентного железа связан с модификацией SH-групп цистеина в активном центре фермента (Свободнорадикальные процессы.., 2008).

Вместе с тем, интересно заметить, что ионы Fe3+ и Н2О2 оказывают наименее выраженный ингибирующий эффект на активность мНАДФ-ИДГ, ионы Са2+ и Н2О2 - на активность цНАДФ-ИДГ в патологическом состоянии, что может является физико-химическим механизмом адаптационной реакции к повышению концентрации АФК при индукции апоптоза, и, вероятно, может способствовать поддержанию уровня образования НАДФН, который необходим для функционирования глутатионовой системы.

НАД-ИДГ

Ч--I

мНАДФ-ИДГ

1-:т

а - --г з 1

0,2 0.4 0.6 0.8

« 14

УО 12

X 3 10

3 8

>" 6

цНАДФ-ИДГ

• I - - - -I

0,2 0,4 0,6 0,8 1

[(КЦ, МИ

Рис. 6. Влияние востановленного глутатиона на активность НАД-ИДГ, мНАДФ-ИДГ и цНАДФ-ИДГ из печени крыс в условиях нормы (1), индукции апоптоза (2), действии тиоктовой кислоты (3) и мелатонина (4) на фоне развития апоптоза

Введение гепатопротекторов на фоне развития апоптоза оказывает в различной степени выраженное воздействие на регуляцию активности ферментов ионами исследуемых металлов и пероксидом водорода.

Наибольший активирующий эффект ионов Са2+ на активность НАД-ИДГ наблюдается в условиях развития апоптоза. При этом ионы активируют, а ионы Си2+ в меньшей степени ингибируют цНАДФ-ИДГ. Ингибирующий эффект ионов Си2+ и Са2+ (рис.7) на активность мНАДФ-ИДГ выражен сильнее при патологии, чем в группе контрольных животных.

Исследование влияния АТФ, АДФ и АМФ, играющих основополагающую роль в энергетическом обмене клетки показало, что данные соединения оказывают различное действие на НАД- и НАДФ-ИДГ из печени крыс исследуемых групп. Так, для НАДФ-ИДГ при индукции апоптоза характерно снижение ингибирующего влияния, оказываемого АТФ и АДФ, тогда как АДФ - актививирует, а АТФ ингибирует НАД-ИДГ.

Таблица 7

Константы активации НАД- и цНАДФ-ИДГ из печени крыс рядом метаболитов в условиях нормы (1), при индукции апоптоза (2), действии ТК (3) и М (4) на фоне развития патологии

Активатор Условия НАД-ИДГ цНАДФ-ИДГ

эксперимента Ка, мМ Ка, мМ

Цитрат 1 0,600±0,022 0,229±0,009

2 0,667±0,024* 0,667±0,030*

3 0,634±0,027 0,400±0,014*

4 0,700±0,021* 0,500±0,021*

1 0,487±0,130 0,212±0,008

ОББв 2 1,00±0,034* 0,181±0,008*

3 0,265±0,011 * -

4 0,500*0,023 -

1 0,066±0,002 -

АДФ 2 0,077±0,002* -

3 0,050±0,002* -

4 0,050±0,002* -

1 0,052±0,002 0,061±0,002

2 0,050±0,002 0,063±0,002

3 0,066±0,002* 0,074±0,003*

4 0,026±0,001* 0,090±0,003*

Глутамат 1 - 0,200±0,019

2 - 0,210±0,011

3 - 0,214±0,012

4 - 0,220±0,010

Рис. 7. Определение типа и константы ингибирования мНАДФ-ИДГ из печени крыс в условиях развития апоптоза ионами Са2+ методом Диксона (А) и Корниш-Боудена (Б) при фиксированных концентрациях изоцитрата: 1,5 мМ (а) и 3 мМ (б)

Выявленные изменения функционирования НАД- и НАДФ-ИДГ в условиях индукции апоптоза и действия гепатопротекторов могут быть сопряжены с окислением тиоловых групп цистеина, а также карбонилированием остатков пролина, аргинина, лизина и треонина в условиях оксидативного стресса (Requena J.R., 2001). Нами были получены значения рК ионогенных групп, позволяющих говорить о возможности наличия остатков цистеина, гистидина, метионина, триптофана в активных центрах исследуемых ферментов, которые могут быть подвержены модификации (табл. 5).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время считают, что нарушение регуляции апоптоза приводит к возникновению различных заболеваний (Скулачев В.П., 2001; John Р., 2001), в том числе, патологии печени (Nietsch H.H., 1999; Iocca А.Н., 2003). Стимуляция рецепторов различных типов клеток цитокинами, индуцирующими апоптоз, в частности ФНО-а, может приводить к возрастанию внутриклеточного уровня АФК (David J., 1992; Droge W., 2002). В норме аэробная клетка располагает специальными механизмами предотвращения избыточного образования прооксидантов, обеспечивающих функционирование АОС (Кулинский В.И., 1999; Turrens J. F., 2003). Клетки, имеющие дефекты АОС, являются наиболее чувствительными к воздействиям, вызывающим апоптоз (Methods.., 1996; Regulation.., 1999; Carmody R.J., 2001).

Исследование динамики развития патологического состояния на 6, 9, 12, 16, 18 и 24 час после индукции апоптоза выявили наибольшую интенсификацию свободнорадикальных процессов на 12 час после введения крысам Акт-D и ФНО-а. В это время наблюдается наиболее выраженная фрагментация ДНК в печени крыс. В соответствии с современными воззрениями, полученные данные свидетельствуют о развитии апоптоза (Role of tumor necrosis.., 2002; Пальцев M.А., 2002). Действие гепатопротекторов приводит к сдвигу исследуемых параметров антиоксидантного статуса в крови и печени крыс в сторону значений контрольной группы. Данные изменения, по-видимому, вызваны способностью ТК и M связывать свободные радикалы и некоторые прооксиданты (ионы Fe2+, Cu2+), в результате чего происходит нормализация свободнорадикальных процессов (Protective effect of melatonin.., 1997; Wollin S.D., 2003).

Выявлено, что при патологии компартментализация и ряд физико-химических свойств ферментов не изменяются по сравнению с нормой. Значения молекулярной массы и электрофоретической подвижности для НАДи НАДФ-зависимых ИДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс совпадают. Полученные данные позволяют предполагать, что изменения ферментативной активности, наблюдаемые при развитии патологии, не сопряжены с реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции, связанного с изменением субъединичного состава, а

также с появлением новых изоформ ферментов. Действие гепатопротекторов на фоне развития апоптоза также не приводит к изменениям данных параметров.

В то же время при интоксикации крыс наблюдаются изменения как кинетических параметров каталитического действия, так и регуляторных свойств, что было показано нами с использованием очищенных ферментных препаратов.

Выявлено, что НАД-ИДГ, выделенная из печени крыс с индуцированным апоптозом, менее чувствительна к ингибирующему действию 2-ОГ, ионов Fe3+ и Н2О2, более чувствительна к активирующему влиянию GSH, ионов Са2+. Особенности регуляции активности одного из ключевых ферментов ЦТК, очевидно, взаимосвязаны с модификацией конформационного состояния НАД-ИДГ, происходящего при развитии патологии вследствие нарушения биохимических процессов в клетке и изменения концентрации внутриклеточных метаболитов.

ТК и М на фоне развития апоптоза оказывают в разной мере выраженный нормализующий эффект на чувствительность фермента к действию эффекторов. Вероятно, это может быть обусловлено способностью данных гепатопротекторов участвовать в окислительно-восстановительных реакциях, а также проявлением ими антиоксидантных свойств. В результате действия гепатопротекторов происходит не только снижение интенсификации СО, но и, вероятно, коррекция функционирования ЦТК в печени крыс.

Исходя из полученных данных, можно предполагать, что в условиях развития апоптоза происходит усиление синтеза НАДН и 2-ОГ. Имеются сведения, что 2-ОГ способен оказывать антиоксидантный эффет при развитии ОС (Tulsawani R., 2006; Alpha-ketoglutarate.., 2009; Oxidative stress.., 2009). Как известно, при развитии апоптоза происходит затрата энергетических эквивалентов (Самуилов В.Д., 2001; Ипатова О.М., 2005). НАДН необходим для пополнения пула восстановительных эквивалентов, функционирования лизосом (Элиот В., 2000), что может способствовать мобилизации защитных механизмов клетки в ответ на интоксикацию. Как известно, глутамат синтезируется под действием фермента глутаматдегидрогеназы из NH4+ и 2-ОГ. Данная реакция имеет фундаментальное значение в азотистом обмене. Немаловажным является тот факт, что глутамат и глицин принимают участие в синтезе глутатиона (Аминокислоты.., 1983, Ней Д., 2001), играющего значительную роль в антиоксидантной защите гепатоцитов при развитии оксидативного стресса (Макеева А.В., 2007; Шульгин К.К., 2008, Агарков А.А., 2009). Для рециркуляции глутатиновой антиоксидантной системы гепатоцитов необходим НАДФН, образующийся в ходе реакций, катализируемых НАДФН-зависимыми ферментами (Андреещева Е. М., 2003; Макеева А.В., 2007). В связи с этим, нами была исследована регуляция активности НАДФ-зависимой ИДГ при интенсификации свободнорадикальных процессов при индукции апоптоза, а также при действии гепатопротекторов.

Эффекторы

< X

Условные обозначения:

- ингибитор НАД- и НАДФ-ИДГ;

- активатор НАД- и НАДФ-ИДГ;

- эффектор, ингибирующий (и) либо активирующий (а) ферменты.

——«. усиление воздействия эффектора при индукции апоптоза по сравнению с нормой и снижение - при введении гепагопрогекторов по сравнению с патологией, „ _ —> ослабление воздействия эффектора при индукции апоптоза по сравнению с нормой и усиление - при введении гепатопротекторов по сравнению с патологией, ■-•-■•-•-■—> сходное воздействие эффектора при индукции апоптоза и при введении гепатопротекторов по сравнению с нормой.

Рис. 8. Гипотетическая схема, отражающая участие НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ в печени крыс в снижении темпов свободнорадикальных процессов и особенности регуляции их активности при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов

Следует отметить, мНАДФ-ИДГ играет важнейшую роль в пополнении пула НАДФН в митохондриях (Kim H.J., 2005; Lee J.H., 2007; Shin S.W., 2008). Установлено, что при индукции апоптоза наименее выражено ингибирующее воздействие 2-ОГ, Н202, АТФ, АДФ и НАДФН на мНАДФ-ИДГ, GSSG активирует фермент. Выявленные особенности регуляции мНАДФ-ИДГ, по всей видимости, имеют физиологическое значение, в частности, для поддержания уровня НАДФН, необходимого для функционирования глутатионовой системы митохондрий.

При индукции апоптоза снижается подавляющие действие 20Г, ионов Cu2+, Са2+, Н2О2, АТФ и АДФ на активность цНАДФ-ИДГ, активирующее действие GSH, напротив, повышается по сравнению с нормой. Изменение чувствительности цНАДФ-ИДГ к действию данных метаболитов при развитии апоптоза, очевидно, может способствовать повышению уровня НАДФН в цитозоле гепатоцитов крыс, что позволяет предполагать возможность возрастания вклада данного фермента в АОС защиты клетки.

Анализ полученных данных позволяет сделать предположение, что повышение активности НАД- и НАДФ-ИДГ может способствовать усиленному образованию не только восстановительных эквивалентов в форме НАД(Ф)Н, но и 2-ОГ и глутамата, которые, по-видимому, могут оказывать позитивный эффект при развитии патологического состояния (рис.8). Очевидно, определенные особенности регуляции активности ИДГ в условиях развитии апоптоза могут являться физико-химическим механизмом адаптационного характера, направленного на снижение степени интенсификации свободнорадикальных процессов и поддержание клеточного гомеостаза. Введение ТК и М сопровождается изменением ряда показателей каталитического действия НАД-ИДГ, митохондриальной и цитоплазматической формы НАДФ-ИДГ в сторону нормальных значений, что, по всей видимости, связано с уменьшением степени интенсификации СО в связи с антиоксидантными свойствами данных веществ-протекторов.

ВЫВОДЫ

1. При введении крысам Акт-D и ФНО-а увеличивается интенсивность свободнорадикальных процессов (возрастает содержание ДК, глутатиона, параметров БХЛ, а также активностей АлАТ, АсАТ, ГП, ГР) и происходит фрагментация ДНК печени крыс, что свидетельствует о развитии апоптоза, наиболее выраженном на 12 час после индуцирования. Действие гепатопротекторов, как перехватчиков свободных радикалов, подавляет процессы СО, в результате чего происходит изменение большинства исследуемых параметров в сторону нормы.

2. Активности НАД-ИДГ, митохондриальной и цитоплазматической НАДФ-ИДГ в печени крыс при индукции апоптоза возрастают в 1,3; 1,4 и 1,5 раза по сравнению с контрольной группой животных. Под действием протекторов на фоне развития апоптоза происходит снижение активности ИДГ по сравнению с патологическими условиями.

3. С использованием гомогенных ферментных препаратов показано, что НАД-ИДГ и НАДФ-ИДГ из печени контрольных и экспериментальных крыс наряду со сходными физико-химическими свойствами (молекулярная масса, субъединичная структура, электрофоретическая подвижность), характеризуются различиями ряда кинетических и регуляторных свойств.

4. Обнаружено, что при введении Акт-0 и ФНО-а, а также ТК и М на фоне развития апоптоза происходит возрастание значений коэффициента Хилла, Км по НАД для НАД-ИДГ, при этом величина Км для ионов Мп2+ снижается. Для цНАДФ-ИДГ наблюдается уменьшение Км по НАДФ ионам Мп2+ при индукции апоптоза по сравнению с нормой.

5. Выявлены особенности регуляции активности различных форм ИДГ при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов под влиянием ряда метаболитов: 20Г, ОА, цитрата, малата, глутамата.

6. В регуляции активности НАД- и НАДФ-ИДГ могут принимать участие ионы ряда металлов (Ре2+, Ре3+, Мд2+, Си2+, Са2+) и пероксид водорода. Ионы Си2', Са2+ оказывают различный эффект на исследуемые ферменты, ионы М§2+ - активирующии, ионы Ре2+, Бе3* И Н2О2 -ингибирующий.

7. Установлено, что в условиях развития апоптоза и при действии ТК и М происходит изменение чувствительности НАД- и НАДФ-ИДГ из печени крыс к действию восстановленного и окисленного глутатиона.

8. Выявлены различия в регуляции активности НАД- и НАДФ-ИДГ с помощью АТФ, АДФ, АМФ и НАД(Ф)Н в норме, при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов.

9. На основании результатов исследования функционирования НАД- и НАДФ-зависимых ИДГ предложена гипотетическая схема, отражающая участие данных ферментов в печени крыс в торможении свободнорадикальных процессов и особенности регуляции их активности при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Очистка и некоторые каталитические свойства НАД-изоцитратдегидрогеназы из гепатоцитов печени крысы в норме и в условиях экспериментального токсического гепатита / Л.Н. Цветикова, М.С. Чурсина, Е.В.Михайлова, Л.В. Матасова // Организация и регуляция физико-биологических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Воронеж. 2006.-Вып. 8.-С. 226-229.

2. Регуляция активности ЫАО-зависимой изоцитратдегидрогеназы из

печени крысы в норме и при токсическом гепатите под действием интермедиатов цикла Кребса и глутатиона / Л.Н. Цветикова, Л.В. Матасова, Т.Н. Попова, А.В. Лахин И Пути и формы совершенствования фармацевтического образования, создание новых физиологически активных веществ: мат. 5-й научно-метод. конф, Воронеж, 22-24 марта 2007 г. -Воронеж, 2007,- С.382-384.

3. Очистка и некоторые каталитические параметры НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы из печени крысы в норме и в условиях экспериментального токсического гепатита / Л.Н. Цветикова, Л.В. Матасова, Т.Н. Попова // Вестник Воронеж, гос. унив. Серия: химия, биология, фармация. -2007.-№2.-С. 119-122.

4. Очистка и некоторые кинетические параметры NADP-зависимой изоцитратдегидрогеназы из печени крысы в норме и при введении фактора некроза опухоли-а / Л.Н. Цветикова, Т.И.Рахманова, Т.Н. Попова // Владикавказский медико-биологический вестник,- 2007. -Т.8,вып.13. С. 336339.

5. Влияние глутатиона на активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы из печени крыс в норме и при вбедении фактора некроза опухоли-а / Л.Н. Цветикова, Т.Н. Попова, Т.И.Рахманова // Биология: теория, практика, эксперимент: сборник мат. междунар. научной конф. Саранск, 2008г. - Мордов. гос. универ. Им. Н.П.Огарева. 2008. - С. 137-138.

6. Сравнительная характеристика некоторых кинетических свойств НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы из печени крыс в норме и при развитии апоптоза / Л.Н. Цветикова, Т.Н.Попова, Т.И.Рахманова // Вестник Воронеж, гос. унив. Серия: химия, биология, фармация. - 2008. - № 1. - С. 123127.

7. Влияние глутатиона на активность НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы из печени крыс в норме, при введении фактора некроза опухоли-а и действии тиоктовой кислоты / Л.Н. Цветикова, Т.Н.Попова, Т.И.Рахманова, С.С. Чиховская // Международный симпозиум «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины» (14-16 мая 2008).- Рос. Универ. Дружбы народов., 2008.- С. 466-467.

8. Некоторые кинетические и регуляторные свойства НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы из печени крыс в норме, при введении фактора некроза опухоли-а и действии тиоктовой кислоты / Л.Н. Цветикова, Т.Н.Попова, Т.И.Рахманова, С.С. Чиховская // Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" VIII съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков 25 - 27 июня 2008 г. Минск, Беларусь, 2008. - С. 155-157.

9. Влияние компонентов реакции Фентона на активность НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из печени крыс в норме, при введении фактора некроза опухоли-а и действии тиоктовой кислоты / Л.Н. Цветикова, Т.Н.Попова, Т.И.Рахманова // Фундаментальные исследования. -2008. -№ 7. -С. 40-41.

10. *Цвстикова Л.Н. Применение методов хроматографии для очистки НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы из печени крыс в норме, при введении фактора некроза опухоли -а и действии тиоктовой кислоты / Л.Н. Цветикова, Т.Н. Попова // Сорбционные и хроматографические процессы.-2008,- Т.8, вып 6,- С. 1018-1026.

11. Физико-химические особенности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из печени крысы в норме, при введении фактора некроза опухоли-а и действии мелатонина / JI.H. Цветикова, Т.Н. Попова // Общероссийская научная конференция Актуальные вопросы науки и образования 13-15 мая 2009 г. / Успехи современного естествознания. - 2009. - № 8.- С. 101-102.

12. Цветикова JI.H. Сравнительная характеристика некоторых кинетических параметров НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из печени крысы в норме, при введении фактора некроза опухоли-а и действии мелатонина / J1.H. Цветикова, Т.Н. Попова // Организация и регуляция физико-биологических процессов: Межрегиональный сборник научных работ.- Воронеж. 2009.- Вып. 11.-С.238-241.

13. Влияние тиоктовой кислоты на экспрессию гена глюкозо -6-фосфатдегидрогеназы в печени крыс при индукции апоптоза ФНО-а / И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова, JI.H. Цветикова, С.С. Чиховская, О.С. Мушарова // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины: Материалы III Международной научно-практической конференции Ростов-на -Дону, 1-4 октября 2009 г. - Ростов -на -дону, 2009.- С. 46.

14. Исследование воздействия ионов железа и пероксида водорода на активность NAD-зависимой изоцитратдегидрогеназы из печени крыс в норме и при оксидативном стрессе /JI.H. Цветикова, Т.Н. Попова, Е.В. Мамука, Е.И. Склярова // Сборник материалов III Всероссийской научно-практической конференции «Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования», 1-5 марта 2010 г.- Нижний Тагил. 2010.- С. 335-337.

15. Компартментализация и некоторые физико-химические параметры НАДФ- изоцитратдегидрогеназы из печени крыс при введении фактора некроза опухоли-а и действии гепатопротекторов / Л.Н.Цветикова, И.Ю.Искусных, Е.И.Склярова, М.П. Пронина // 14-ая международная пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» (19 - 23 апреля 2010 года).- Пущино 2010. - С. 191.

16. *Экспрессия и каталитические свойства NADP-изоцитратдегидрогеназы из печени крысы в норме, при введении фактора некроза опухоли-а и действии тиоктовой кислоты / Л.Н. Цветикова, Т.Н.Попова, Т.И Рахманова, И.Ю.Искусных // Биомедицинская химия. - 2010. -Т. 56, вып. 2,- С. 220-229.

Статьи №* 10, 16-издания, входящие в перечень ВАК

Подписано в печать 24.05.10. Формат 60'84 1б. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 80 экз. Заказ 710

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цветикова, Любовь Николаевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Свойства, биологическое значение и роль в развитии апоптоза фактора некроза опухоли-а.

1.1.1. Общая характеристика фактора некроза опухоли-а и его участие в апоптотических процессах.

1.1.2. Механизм развития ФНО-а-индуцированного апоптоза.

1.1.3. Роль апоптоза в развитии различных заболеваний.

1.1.3.1. Развитие оксидативного стресса при апоптозе.

1.2. Биохимические изменения в печени при токсическом воздействии.

1.3. Гепатопротекторы.

1.3.1. Тиоктовая кислота: биологические и антиоксидантные свойства.

1.3.2. Мелатонин: характеристика и антиоксидантные свойства.

1.4. Изоцитратдегидрогеназы.

1.4.1. Катализируемая реакция. Участие в физиолого-биохимических процессах.

1.4.2. Характеристика НАД- зависимой изоцитратдегидрогеназы.

1.4.2.1. Очистка, структура и молекулярная масса НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы.

1.4.2.2. Кинетические свойства и регуляция активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы.

1.4.2.2.1. Зависимость активности НАД-изоцитратдегидрогеназы от концентрации субстрата и коферментов.

1.4.2.2.2. Активаторы и ингибиторы НАД-изоцитратдегидрогеназы.

1.4.2.2.3. Влияние рН и температуры на активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы.

1.4.2.2.4. Другие механизмы регуляции НАД-изоцитратдегидрогеназы

1.4.3. Характеристика НАДФ-изоцитратдегидрогеназы.

1.4.3.1. Очистка, структура и молекулярная масса НАДФ- зависимой изоцитратдегидрогеназы.

1.4.3.2. Кинетические свойства и регуляция активности НАДФзависимой изоцитратдегидрогеназы.

1.4.3.2.1. Зависимость активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы от концентрации субстрата и коферментов.

1.4.3.2.2. Активаторы и ингибиторы НАДФ- изоцитратдегидрогеназы.

1.4.3.2.3. Влияние рН и температуры на активность НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы.

1.4.3.2.4. Другие механизмы регуляции НАДФизоцитратдегидрогеназы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект.исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Создание модели индукции апоптоза.

2.2.2. Введение гепатопротекторов на фоне развития апоптоза.

2.2.3. Определение активности ферментов.

2.2.3.1. Определение активности оксидоредуктаз.

2.2.3.2. Определение активности аминотрансфераз.

2.2.4. Определение содержания белка.

2.2.5. Оценка антиоксидантного статуса в крови и печени крыс.

2.2.5.1. Оценка интенсивности свободнорадикальных процессов методом хемилюминесценции.

2.2.5.2. Определение содержания диеновых конъюгатов.

2.2.5.3. Определение содержания восстановленного глутатиона.

2.2.6. Определение степени фрагментации ДНК.

2.2.7. Выделение и очистка НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ.

2.2.7.1. Получение субклеточных фракций гепатоцитов и выделение

НАД-и митохондриальной НАДФ-изоцитратдегидрогеназ.

2.2.7.2. Экстракция цитоплазматической НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы.

2.2.7.3. Фракционирование белков сульфатом аммония.

2.2.7.4. Гель-фильтрация на колонке с сефадексом С-25.

2.2.7.5. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.

2.2.7.6. Гель-хроматография на Тоуорег1 Н\¥"-65.

2.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов.

2.2.9. Аналитический электрофорез.

2.2.10. Определение молекулярной массы ферментов.

2.2.11. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА В КРОВИ И ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ, ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ.

3.1. Сравнительная характеристика активности аминотрансфераз в сыворотке крови крыс.

3.2. Содержание диеновых коньюгатов и параметры хемилюминесценции в печени и сыворотке крови крыс.

3.4. Исследование степени фрагментации ДНК в гепатоцитах крыс.

3.4. Активность глутатионовой антиоксидантной системы, НАД- и

НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени и сыворотке крови крыс.

ГЛАВА 4. СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ, ОЧИСТКА И МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА НАД- И НАДФ-ЗАВИСИМЫХ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗ.

4.1. Компартментализация и активность НАД- И НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в субклеточных фракциях гепатоцитов крыс.

4.2. Очистка НАД- и НАДФ- изоцитратдегидрогеназ из печени крыс

4.3. Молекулярная масса НАД- и НАДФ- изоцитратдегидрогеназ.

ГЛАВА 5. КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА НАД

ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ . 85 5.1. Исследование кинетических параметров каталитического действия НАД-изоцитратдегидрогеназы.

5.2. Исследование влияния рН среды на активность НАДизоцитратдегидрогеназы

5.3. Регуляторные свойства НАД- изоцитратдегидрогеназы.

5.3.1. Влияние некоторых метаболитов цикла Кребса и глутамата на активность НАД-изоцитратдегидрогеназы.

5.3.2. Регуляция активности НАД-изоцитратдегидрогеназы под действием глутатиона.

5.3.3. Исследование регуляции активности НАД-изоцитратдегидрогеназы из печени крысы компонентамии реакции Фентона и ионами некоторых металлов.

5.3.4. Воздействие адениннуклеотидов на активность НАДизоцитратдегидрогеназы

ГЛАВА 6. КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ НАДФ-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ.

6.1. Кинетические параметры митохондриальной НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из печени крыс.

6.2. Исследование влияния рН среды на активность митохондриальной НАДФ-изоцитратдегидрогеназы.

6.3. Регуляторные свойства митохондриальной НАДФизоцитратдегидрогеназы из гепатоцитов крыс.

6.3.1. Регуляция активности митохондриальной НАДФизоцитратдегидрогеназы метаболитами цикла Кребса и глутаматом.

6.3.2. Исследование регуляции активности митохондриальной НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из печени крысы ионами некоторых металлов и пероксидом водорода.

6.3.3. Воздействие компонентов глутатионовой системы на активность митохондриальной НАДФ-изоцитратдегидрогеназы.

6.3.4. Влияние адениннуклеотидов на активность митохондриальной

НАДФ-изоцитратдегидрогеназы.

ГЛАВА 7. КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ НАДФ-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И ДЕЙСТВИИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ.

7.1. Исследование кинетических параметров каталитического действия цитоплазматической НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из печени крыс

7.2. Регуляторные свойства цитоплазматической НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из печени крыс.

7.2.1. Регуляция активности цитоплазматической НАДФ-изоцитратдегидрогеназы некоторыми метаболитами цикла Кребса и глутаматом.

7.2.2. Исследование регуляции активности цитоплазматической НАДФ-изоцитратдегидрогеназы глутатионом.

7.2.3. Влияние ионов некоторых металлов и компонентов реакции Фентона на активность цитоплазматической НАДФ-изоцитратдегидрогеназы

7.2.4. Действие адениннуклеотидов на активность цитоплазматической

НАДФ-изоцитратдегидрогеназы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени крыс при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов"

Актуальность проблемы. В ряде исследований было показано, что фактор некроза опухоли-а (ФНО-а) стимулирует генерирование активных форм кислорода (АФК) и индуцирует апоптоз различных типов клеток [79, 167, 176]. Полагают, что ФНО-а-опосредованный апоптоз лежит в основе развития болезней печени [98, 167, 279]. Необходимо подчеркнуть, что индукция ФНО-зависимого апоптоза в клетках печени требует сенситизации гепатоцитов, например, такими ингибиторами транскрипции, как галактозаминЧЧГ (Гал-М) или актиномицин-0 (Акт-О) [98, 179,184, 205, 214, 377]. Так, было показано, что совместное воздействие Акт-О и ФНО-а вызывает активацию каспаз-3, -8, -9, выход цитохрома С из митохондрий, снижает уровень НАДФН и повышает концентрацию АФК в гепатоцитах [174].

Подавлению интенсивности свободнорадикального окисления (СО) может способствовать изменение функционирования ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) [78, 385]. В этой связи вызывает интерес изучение каталитического действия НАД- изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41, НАД-ИДГ), одного из ключевых ферментов ЦТК. Актуальность изучения регуляции активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ, К.Ф. 1.1.1.42.) обусловлена генерированием в ходе ферментативной реакции НАДФН, необходимого для функционирования глутатионредуктазной/ глутатионпероксидазной (ГР/ГП) антиоксидантной системы (АОС) [93, 250, 298, 367]. Показано, что митохондриальная НАДФ-ИДГ может вносить определенный вклад в снижение степени развития апоптоза [153, 249, 295, 342]. Уменьшение экспрессии НАДФ-ИДГ в клетках НеЬа приводит к увеличению степени развития апоптоза [360, 361, 362]. При индукции апоптоза и оксидативного стресса (ОС) происходит истощение АОС [94, 73]. Интересно отметить, что продукт ИДГ-реакции, 2-оксоглутарат (2-ОГ) способен оказывать антиоксидантный эффет при развитии ОС [102, 101,218, 386].

В настоящее время убедительно доказано, что тиоктовая кислота (ТК) и мелатонин не только обладают самостоятельным антиоксидантным потенциалом, но и обеспечивают мощную поддержку работы других звеньев АОС в организме [288, 333]. Ряд данных свидетельствует, что эти вещества являются эффективными гепатопротекторами [36, 47, 65].

В связи с этим вызывает интерес изучение регуляции активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ, выделенных из печени крыс при развитии апоптоза и действии ТК и мелатонина на фоне апоптоза.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы -исследование регуляции активности НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ из печени крыс при индукции апоптоза, вызванном введением Акт-О и ФНО-а, а также действии ТК и мелатонина на фоне развития патологического состояния. В связи с целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценка антиоксидантного статуса в крови и печени крыс при индукции апоптоза и действии ТК и мелатонина на фоне развития патологии,

2. Исследование степени фрагментации ДНК печени крыс в условиях развития апоптоза и при введении ТК и мелатонина,

3. Исследование субклеточной локализации и активности НАД- и НАДФ -зависимых изоцитратдегидрогеназ в гепатоцитах крыс при введении Акт-О и ФНО-а и действии гепатопротекторов,

4. Получение высокоочищенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-ИДГ из печени крысы при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов на фоне развития апоптоза,

5. Определение кинетических свойств НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ из печени крысы при индукции апоптоза и действии ТК и мелатонина на фоне развития апоптоза,

6. Исследование регуляции активности ИДГ из печени крыс некоторыми метаболитами цикла Кребса и глутаматом в условиях развития апоптоза и действия гепатопротекторов на фоне апоптоза,

7. Исследование регуляции активности ИДГ, выделенной из печени крыс при введении ФНО-а и действии протекторов на фоне развития апоптоза, компонентами ГП/ ГР системы,

8. Исследование регуляции активности ИДГ из печени крыс компонентами реакции Фентона и ионами некоторых металлов в условиях нормы, при введении антибиотика и цитокина, а также при действии гепатопротекторов на фоне развития апоптоза,

9. Исследование влияния адениннуклеотидов на активность НАД- и НАДФ-ИДГ из печени крыс всех экспериментальных групп животных,

10. Создание гипотетической модели участия НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ в регуляции процессов СО в гепатоцитах с учётом особенностей функционирования данных ферментов при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов на фоне развития патологии.

Научная новизна. Впервые изучены особенности функционирования НАД- и НАДФ- ИДГ при развитии апоптоза, индуцированного Акт-О и ФНО-а и действии гепатопротекторов на фоне патологического процесса. Показана адаптивная роль ИДГ-реакции в условиях индукции апоптоза, проявляющаяся в изменении их активности и регуляторных свойств по отношению к ряду метаболитов. Выявлены механизмы, обеспечивающие модификацию активности НАД- и НАДФ-ИДГ в условиях развития апоптоза. Исследована роль различных метаболитов в изменении активности исследуемых ферментов.

На основе анализа особенностей регуляции активности НАД- и НАДФ-ИДГ при апоптозе и действии гепатопротекторов на фоне развития патологии, впервые разработана гипотетическая схема участия ИДГ в ограничении апоптотических и свободнорадикальных процессов при патологических изменениях в печени экспериментальных животных.

Особенности регуляции активности данных ферментов при индукции апоптоза способствуют пониманию развития патологических изменений в печени и поиску путей их коррекции в медицинской практике.

Разработанные способы получения высокоочищенных ферментных препаратов изоцитратдегидрогеназ могут применяться в научно-исследовательской практике.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 5-й научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» ( Воронеж, 2007), международной научной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2008), международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины» (Москва, 2008), VIII съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, 2008), на Всероссийской заочной электронной научной конференции «Медицинские технологии» (Москва, 2008), на общероссийской научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2009), III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» ( Ростов-на -Дону, 2009), III Всероссийской научно-практической конференции «Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования» (Нижний Тагил, 2010), на 14-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» ( Пущино, 2010).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 16 публикациях — 7 статьях и 9 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. При развитии апоптоза, вызванного введением крысам Акт-Б и ФНО-а, происходит интенсификация свободнорадикальных процесссов и активация АОС, что сопровождается повышением уровня диеновых конъюгатов, параметров биохемилюминесценции, возрастанием активности аминотрансфераз, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени и сыворотке крови, а также фрагментацией ДНК в гепатоцитах крыс. При действии ТК и М на фоне развития апоптоза наблюдается сдвиг ряда исследуемых параметров в сторону контрольных значений.

3. Исследования, проведённые с использованием гомогенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-ИДГ, выделенных из печени крыс контрольной группы и животных с индуцированным апоптозом, а также крыс, которым вводили ТК и М, свидетельствуют о существенных модификациях механизмов метаболитной регуляции активности и ряда кинетических параметров каталитического действия различно локализованных форм ИДГ при развитии апоптоза и действии веществ-протекторов.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 175 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Цветикова, Любовь Николаевна

выводы

1. При введении крысам Акт-О и ФНО-а увеличивается интенсивность свободнорадикальных процессов (возрастает содержание ДК, глутатиона, параметров БХЛ, а также активностей АлАТ, АсАТ, ГП, ГР) и происходит фрагментация ДНК печени крыс, что свидетельствует о развитии апоптоза, наиболее выраженном на 12 час после начала индукции. Действие гепатопротекторов, как перехватчиков свободных радикалов, подавляет процессы СО, в результате чего происходит изменение большинства исследуемых параметров в сторону нормы.

2. Активности НАД-ИДГ, митохондриальной и цитоплазматической НАДФ-ИДГ в печени крыс при индукции апоптоза возрастают в 1,3, 1,4 и 1,5 раза по сравнению с контрольной группой животных. Под действием протекторов на фоне развития апоптоза происходит снижение активности ИДГ по сравнению с патологическими условиями.

4. Обнаружено, что при введении Акт-В и ФНО-а, а также ТК и М на фоне развития апоптоза происходит возрастание значений коэффициента Хилла, Км по НАД для НАД-ИДГ, при этом величина Км для ионов Мп2+ снижается. Для НАДФ-ИДГ наблюдается уменьшение Км по НАДФ, а для цНАДФ-ИДГ снижение Км по Мп2+ при индукции апоптоза по сравнению с нормой.

6. В регуляции активности НАД- и НАДФ-ИДГ могут принимать участие ионы ряда металлов (Бе , Бе , Mg , Си , Са ) и пероксид водорода. Ионы Си2+, Са2+ оказывают различный эффект на исследуемые ферменты, ионы - активирующии, ионы и Н2О2 -ингибирующий.

7. Установлено, что в условиях развития апоптоза и при действии ТК и М происходит изменение чувствительности НАД- и НАДФ-ИДГ из печени крыс.

8. Выявлены различия в регуляции активности НАД- и НАДФ-ИДГ с помощью АТФ, АДФ, АМФ и НАД[Ф)Н в норме, при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время считают, что нарушение регуляции апоптоза приводит к возникновению различных заболеваний [80, 238], в том числе, патологии печени [98, 167, 233, 279]. Стимуляция рецепторов различных типов клеток цитокинами, индуцирующими апоптоз, в частности ФНО-а, может приводить к возрастанию внутриклеточного уровня АФК [81, 129, 167, 176]. В норме аэробная клетка располагает специальными механизмами предотвращения избыточного образования прооксидантов, обеспечивающих функционирование АОС [40, 393]. Клетки, имеющие дефекты АОС, являются наиболее чувствительными к воздействиям, вызывающим апоптоз [138, 341].

Исследование динамики развития патологического состояния на 6, 9, 12, 16, 18 и 24 час после введения крысам Акт-Б и ФНО-а выявило интенсификацию свободнорадикальных процессов, о чем свидетельствовали возрастание содержания ДК, глутатиона, параметров БХЛ, а также активности АлАТ, АсАТ, ГП, ГР, НАД-ИДГ, НАДФ-ИДГ в печени и в сыворотке крови крыс. Наиболее выраженные изменения происходили на 12 час после индуцирования апоптоза. Так, активность АлАТ увеличивается в сыворотке крови крыс в 1,8, уровень ДК - в 4,0 раза по сравнению с нормой. В печени происходит возрастание параметров 1шах и 8 в 1,4 и 1,3 раза. При этом величина tga становится выше контрольных значений в печени в 2,2 раза и сыворотке крови в 2,4 раза, что указывает на мобилизацию защитных систем организма в ответ на активацию свободнорадикальных процессов при индукции апоптоза, вызванного введением Акт-О и ФНО-а. Это сопряжено с возрастанием активности ГП и ГР в печени крыс и сыворотке крови по сравнению с нормой. При этом удельная активность НАДФ-ИДГ и НАД-ИДГ в печени крыс становится в 1,4 и 1,3 раза выше показателей контрольной группы животных, в сыворотке крови - в 2,1 и 1,4 раза. На 12 час после введения животным Акт-Б и ФНО-а происходит фрагментация ДНК в печени крыс. Согласно литературным данным, это свидетельствует о развитии апоптоза [62, 184, 351].

Действие гепатопротекторов приводит к сдвигу исследуемых параметров антиоксидантного статуса в крови и печени крыс в сторону значений контрольной группы, что, вероятно, в определенной степени отражается на активности НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ. Данные изменения, по-видимому, вызваны способностью ТК и М связывать свободные радикалы и некоторые прооксиданты [ионы Ре2+, Си2+], в резульзате этого происходит нормализация свободнорадикальных прцессов [92, 324, 333,334, 402].

Выявлено, что при патологии компартментализация и ряд физико-химических свойств фермента не изменяются по сравнению с нормой. Так, около 97,0% активности НАД-ИДГ и 26,0% активности НАДФ-ИДГ содержится в митохондриях, в цитоплазматической фракции активность НАДФ-ИДГ составляет примерно 74,0% от общей активности фермента. Значения молекулярной массы и электрофоретической подвижности для НАДи НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс совпадают. Полученные данные позволяют предполагать, что изменения ферментативной активности, наблюдаемые при развитии патологии, не сопряжены с реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции, связанного с изменением субъединичного состава и появлением новых изоформ ферментов. Действие гепатопротекторов на фоне развития апоптоза также не приводит к изменениям данных параметров.

В то же время, при интоксикации крыс наблюдаются изменения как кинетических параметров каталитического действия, так и регулягорных свойств, что было показано нами с использованием очищенных ферментных препаратов. Обнаружено, что при индукции апоптоза происходит возрастание значений коэффициента Хилла, Км по НАД для НАД-ИДГ в 1,3 и 1,5 раза, а величина Км для ионов Мп2+ падает в 1,3 раза по сравнению с нормой. Для мНАДФ-ИДГ наблюдается уменьшение Км по НАДФ на 11,0%, а для цНАДФ-ИДГ - снижение Км по НАДФ и Мп2+ в 2,6 и 1,2 раза.

Выявлено, что НАД-ИДГ, выделенная из печени крыс с индуцированным апоптозом, менее чувствительна к ингибирующему действию 2-ОГ, ионов Бе , Н2С>2, однако, более чувствительна к активирующему влиянию ионов Са . Согласно литературным данным, активный центр НАД-ИДГ содержит остаток лизина, метионина, гистидина, цистеина [66]. Можно предполагать, что механизм ингибирующего действия железа и пероксида водорода связан с модификацией БН-групп цистеина в активном центре фермента [76]. 08Н ингибирует НАД-ИДГ в условиях нормы, однако, при развитии патологии - активирует фермент.

Особенности регуляции активности одного из ключевых ферментов ЦТК, очевидно, взаимосвязаны с модификацией конформационного состояния НАД-ИДГ, происходящего при развитии патологии вследствие нарушения биохимических процессов в клетке и изменения концентрации внутриклеточных метаболитов.

Исходя из полученных данных, можно предполагать, что в условиях развития апоптоза происходит усиление синтеза НАДН и 2-ОГ. Имеются сведения, что 2-ОГ способен оказывать антиоксидантный эффет при развитии ОС [101, 102, 218, 386]. Как известно, при развитии апоптоза происходит затрата энергетических эквивалентов [32, 72, 98]. НАДН необходим для пополнения пула восстановительных эквивалентов, функционирования лизосом [93], что может способствовать мобилизации защитных механизмов клетки в ответ на интоксикацию. Как известно, глутамат синтезируется под действием фермента глутаматдегидрогеназы из ЫН4+ и 2-ОГ. Глутаматдегидрогеназа локализована в митохондриальном матриксе, в том числе, в митохондриях гепатоцитов крыс [30]. Данная реакция имеет фундаментальное значение в азотистом обмене [4, 30, 95]. Глутамат является донором аминогрупп при биосинтезе всех белковых аминокислот, в частности, пролина, глутамина, аспартата и аланина. Кроме того, глутамат является промежуточным метаболитом в синтезе серина - предшественника глицина и у-аминомаслянной кислоты [4, 30]. Показано, что глутамат, введенный пациентам, перенесших операцию на сердце, усиливает восстанавление метаболической и гемодинамической функции сердца [291], а введение пациентам 2-оксоглутарата благоприятно воздействует на почечную деятельность [346] и повышает защиту миокарда [103] после коронарных операций. Предполагается, что добавление глутамина в пищу может оказывать благоприятное действие на больных, находящихся в критическом состоянии [57].

Немаловажным является тот факт, что глутамат и глицин принимают участие в синтезе глутатиона [4, 57], играющего значительную роль в антиоксидантной защите гепатоцитов при развитии оксидативного стресса [3, 47, 90]. Для рециркуляции глутатиновой антиоксидантной системы гепатоцитов необходим НАДФН, образующийся в ходе реакций, катализируемых НАДФН-зависимыми ферментами [5, 44, 47, 54]. В связи с этим, нами была исследована регуляция активности НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы при интенсификации свободнорадикальных процессов при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов.

Известно участие АФК в развитии апоптоза [78, 131, 176, 254]. Следует отметить, мНАДФ-ИДГ играет важнейшую роль в пополнении пула НАДФН в митохондриях [153, 240, 249, 342, 360].

Установлено, что при индукции апоптоза наименее выражено ингибирующее воздействие 2-ОГ, Н202, АТФ, АДФ и НАДФН на мНАДФ-ИДГ, при этом малат и глутамат не оказывают существенного влияния на ферментативную активность. СББО активирует фермент, выделенный из печени крыс, в условиях развития апоптоза. Выявленные особенности регуляции мНАДФ-ИДГ, по всей видимости, имеют физиологическое значение, в частности, для подержания уровня НАДФН, необходимого для функционирования глутатионовой системы митохондрий.

При индукции апоптоза, подавляющее действие на активность цНАДФ-ИДГ 2-ОГ, ионами Си2+, Са2+, Н202, АТФ и АДФ снижается, активирующее действие ОБН, напротив, повышается по сравнению с нормой. Изменение чувствительности цНАДФ-ИДГ к действию 2-ОГ, цитрата, Н202, АТФ, АДФ, ОБН, и ионов Си2+, Са2+ при развитии апоптоза, очевидно, может способствовать повышению уровня НАДФН в цитозоле гепатоцитов крыс, что позволяет предполагать возможность возрастания вклада данного фермента в АОС защиты клетки.

Анализ полученных данных позволяет сделать предположение, что повышение активности НАД- и НАДФ-ИДГ может способствовать усиленному образованию не только восстановительных эквивалентов в форме НАД(Ф)Н, но и 2-ОГ и глутамата, которые, по-видимому, могут оказывать позитивный эффект при развитии патологического состояния (рис. 33). Это предположение согласуется с данными, полученными нами при оценке антиоксидантного статуса в крови и печени крыс через 16, 18 и 24 час после индукции апоптоза, когда наблюдается изменение некоторых параметров, характеризующих состояние свободнорадикального гомеостаза, в сторону контрольных значений. Очевидно, определенные особенности регуляции активности ИДГ в условиях развитии апоптоза могут являться физикохимическим механизмом адаптационного характера, направленного на снижение степени интенсификации свободнорадикальных процессов и поддержание клеточного гомеостаза. Введение ТК и М сопровождается изменением ряда показателей каталитического действия НАД-ИДГ, митохондриальной и цитоплазматической формы НАДФ-ИДГ в сторону нормальных значений, что, по всей видимости, связано с уменьшением степени интенсификации СО в связи с антиоксидантными свойствами данных веществ-протекторов.

Акт-Б и ФНО-а —> Интенсификация свободнорадикального окисления, активация каспаз —* Апоптоз 3 X

ЦТ Антиоксидантная система клетки

3Е

Изо ц итратде г идроге н аза гт

Эффекторы 2-оксогпутарат Ч

•-г

Глутамат

Оксалоацетат - \-------Цитрат и

Ус2' |

4©

НА н °5н1сээс

АТФ

АДФ

I© ^

Митохондриальная Н АДФ-нзоцнтратдег идроген аза I 1I

8 I I х

Условные обозначения;

- ингибитор НАД- и НАДФ-ИДГ,

- активатор НАД- и НАДФ-ИДГ,

- эффектор, ингибирующий (и) либо активирующий (а) ферменты, усиление воздействия эффектора при индукции алоптоза по сравнению с нормой и снижение - при введении гепатопротекторов по сравнению с патологией,

----- ослабление воздействия эффектора при индукции апоптоза по сравнению с нормой и усиление - при введении гепатопротекторов по сравнению с патологией, сходное воздействие эффектора при индукции апоптоза и при введении гепатопротекторов по сранению с нормой.

Рис. 33. Гипотетическая схема, отражающая участие НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ в печени крыс в снижении темпов свободнорадикальных процессов и особенности регуляции их активности при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цветикова, Любовь Николаевна, Воронеж

1. Абдулаев Н.Х. Печень при интоксикациях гепатотропными ядами / Н.Х. Абдулаев, Х.Я. Каримов. Ташкент: Медицина УзССР, 1989. - 25 с.

2. Абрамова Ж.И. Человек и противоокислительные вещества / Ж.И. Абрамова, Г.И. Оксенгендлер М.: Наука, 1985. - 230 с.

3. Аминокислоты, их производные и регуляция метаболизма / З.Г.Броновицкая и др.. Ростов: Изд-во Ростов, ун-та, 1983. - 112 с.

4. Анисимов В.Н. Физиологические функции эпифиза (геронтологический аспект) / В.Н. Анисимов // Российский физиол. ж. им. И.М.Сеченова. 1998. - Т.83. - С. 1-10.

5. Артюхов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. Воронеж: Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 2000. - 296 с.

6. Берберова И.А. Из жизни свободных радикалов / И.А. Берберова // Сорос, образ, журн. 2000. - Т.6, № 5. - С. 39-44.

7. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. — М.: Медицина, 1983. 752 с.

8. Ю.Болдырев A.A. Окислительный стресс и мозг / A.A. Болдырев // Сорос, образ, журн. . 2001. - Т.7, № 4. - С. 21-28.

9. П.Бузлама B.C. Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у животных / B.C. Бузлама. Воронеж, 1997. - 35с.

10. Бушаев C.B. Исследование некоторых каталитических свойств NADP-специфичной изоцитратдегидрогеназы из ряски Spirodela polyrhiza (L.) / C.B. Бушаев, Т.Н. Попова // Тр. биол. учеб.-науч. базы Воронеж, гос. унта "Веневитиново". 1998. - № 10.-С. 138-143.

11. Бышевский А.Ш. Биохимия для врача / А.Ш. Бышевский, O.A. Терсенов. Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. - 384 с.

12. Ванин А.Ф. Оксид азота как регулятор клеточного метаболизма / А.Ф. Ванин // Сорос, образ, журн. 2001. - Т.7, № 11. - С. 7-12.

13. Венгеровский А.И. Механизм действия гепатопротекторов при токсических поражениях печени / А.И. Венгеровский, A.C. Саратиков // Фармак. и токсикол. 1988. - №1. - С. 8-11.

14. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и ^запрограммированная клеточная смерть / Ю.А. Владимиров // Сорос, образ, журн. . 2000. - Т. 6, № 9. - С. 2-9.

15. Владимиров Ю.А. Оценка антиокислительной и антирадикальной активности веществ и биологических объектов / Ю.А. Владимиров, М.П. Шерстнев, Т.К. Азимбаев // Биофизика. 1992. - Т. 37. - С. 1041-1047.

16. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков- М.: Наука, 1973. 252 с.

17. Влияние железа, цинка, меди на процессы перекисного окисления липидов печени / E.H. Кухтина и др. // Биохимия. 1996. - Т. 61, вып.6. -С.993-997.

18. Влияние тиоктовой кислоты на оксидативный статус тканей крыс при хронической алкогольной интоксикации / O.A. Сафонова и др. // Наркология. 2008. - Т. 11, № 83. - С.44-48.

19. Воронина A.C. Трансляционная регуляция в раннем развитии / A.C. Воронина // Успехи биол. хим. 2002. - Т. 42. - С. 139-160.

20. Гордеева A.B. Взаимосвязь между активными формами кислорода и кальцием в живых клетках / A.B. Гордеева, P.A. Звягильская, Ю.А. Лабас // Биохимия. 2003. - Т. 68, вып. 10. - С. 1318-1322.

21. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. -М.: Мир, 1970. 252 с.

22. Диетические антиоксиданты увеличивают продолжительность жизни мышей, снижают частоту мутаций и увеличивают экспрессию защитных генов / А.И. Газиев и др. // Успехи геронтологии. 1997. - Вып. 1. - С. 80-84.

23. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 1.-392 с.

24. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 2.-515 с.

25. Довганский А.П. Печень при экстремальных состояниях / А.П. Довганский, Б.М. Курцер, Т.А. Зорькина. Кишинев: Шгиинца, 1989. - 135 с.

26. Дэвис Г. Электрофорез / Г. Дэвис. М.: Мир. - 1970. - 56 с.

27. Ипатова О.М. Фосфоглив: механизм действия и применение в клинике / О.М. Ипатова.- М.: ГУ НИИ Биомедхимия РАМН, 2005. 318 с.

28. Кветная Т.В. Мелатонин нейроиммуноэндокринный маркер возрастной патологии / Т.В. Кветная, И.В. Князькин, И.М. Кветной. - СПб.: ДЕАН, 2005. - 144с.

29. Кевра M.K. Фактор некроза опухолей: регуляция продукции в организме / М.К. Кевра // Медицинские новости. 1995. - № 6. - С. 12-25.

30. Князькин И.В. Экстрапинеальный мелатонин в процессе старения: автореф. дис. . д-ра мед. наук / И.В. Князькин. С.-Петерб. ин-т биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, 2008. — 40 с.

31. Козачок H.H. Применение липоевой кислоты (берлитиона) в клинической практике / H.H. Козачок, М.Н. Селюк // Мистецтво лжування. — 2003. №5. - С.75-77.

32. Королева JI.P. Современные гепатопротекторы / JI.P. Королева // Российский медицинский журннал. — 2005. №2. - С. 35-37.

33. Косолапов В. А. Хемилюминесцентные методы в оценке свободнорадикальных реакций / В.А. Косолапов, О.В. Островский, A.A. Спасов // Клиническая и лабораторная диагностика. 1999. — Т. 9. — 41 с.

34. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. М.: Высшая школа, 1980. — 270 с.

35. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита / В. И. Кулинский // Сорос, образ, журн. . Биология. 1999. - №1. - С. 2-7.

36. Курганов Б.И. Анализ колоколообразных pH- зависимостей скорости ферментативной реакции / Б.И. Курганов, Е.В. Петушкова // Боихимия .- 1992.-Т.57, вып. 3.- С.348-361.

37. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты / Б.И. Курганов. М. : Наука, 1978.-248с.

38. Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов / Б.И. Курганов М.: Наука, 1992. - 62 с.

39. Лившиц В.М. Биохимические анализы в клинике / В.М Лившиц, В.И.Сидельникова. Воронеж: Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 1996. — 277 с.

40. Ллойд Э. Справочник по прикладной статистике / Э. Ллойд, У. Ледерман. -М.: Финансы и статистика, 1990. С. 493-513.

41. Макеева A.B. Исследование воздействия тиоктовой кислоты на свободнорадикальный гомеостаз в тканях крыс при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом: автореф. дисс. . канд. биол. наук / A.B. Макеева. — Воронеж, 2007. 23 с.

42. Маньковская И.Н. Влияние инола на ферментативные процессы окислительного метаболизма гипоксии / И.Н.Маньяковская, О.О.Юрченко // Кислород, голодание и способы коррекции гипоксии. 1990. - С. 89-96.

43. Мауэр Г. Диск-электрофорез / Г. Мауэр. М.: Мир, 1971. - 22 с.

44. Медведев А.Е. Исследование механизма активации NADP-зависимой изоцитратдегидрогеназы при остром охлаждении / А.Е. Медведев // Биохимия.- 1981.-Т. 52, № 3. С.460-468.

45. Медведева Л.В. Функционирование NADP-изоцитратдегидрогеназы и аконитатгидратазы в миокарде крысы в условиях активации свободнорадикального окисления при ишемии: дис. канд. биол. наук / Л. В. Медведева. Воронеж, 2002. - 250 с.

46. Метаболизм а-липоевой кислоты в печени при различных формах патологии / Дж. Бустаманте и др. // Международный медицинский журннал.- 2001. —№ 2. С.133-141.

47. Нагоев Б.С. Показатели ПОЛ и свободнорадикального окисления у больных острыми и вирусными гепатитами / С.Б. Нагоев, М.Т. Абидов, М.Р.

48. Иванова // Бюллетень экспериментальной биологии и медецины. -2002. — Т.134, №12. С.654-657.

49. Наумов Е.В. Сератонин и мелатонин в регуляции эндокрииной системы / Е.В. Наумов, Н.К. Попова. Новосибирск: Наука, 1975. - 219 с.

50. Ней Д. Глутамин у плода и у находящихся в критическом состянии новорожденных с очень низким весом при рождении: метаболизм и механизм действия / Д. Ней //Журнал питания. 2001. - Т. 131. - С. 2585-2589.

51. Осипов А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов, Ю.А. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи биологической химии. — 1990. Т.31, №2. - С.180-208.

52. Пальцев М.А. Молекулярная медицина и прогресс фундаментальных наук / М.А. Пальцев // Вестник Российской Академии Наук. 2002. — Т. 72, №1. — С. 13-21.

53. Пескин A.B. Взаимодействие активного кислорода с ДНК / A.B. Пескин // Биохимия. 1997. - Т. 62. - С. 1571-1578.

54. Полторак О.М. Физико-химические основы ферментативного катализа / О.М. Полторак, Е.С. Чухрай. М.: Высшая школа, 1971. - 311 с.

55. Попов С.С. Клиническая эффективность мелатонина и его воздействие на свободнорадикальный гомеостаз при токсическом поражении печени : автореф. дис. канд. мед. наук / С.С. Попов. Воронеж, 2008. — 24 с.

56. Попова Т.Н. Изоцитратдегидрогеназы высших растений : Формы, локализация, свойства и регуляция : Дис. . д-ра биол. наук: 03.00.04 / Т.Н. Попова Воронеж, 1994. 338с.

57. Попова Т.Н. Изоцитратдегидрогеназы: формы, локализация, свойства и регуляция / Т.Н. Попова // Биохимия. 1993. - Т. 58, № 126. - С. 1861-1879.

58. Прохорова М.И. Методы биохимических исследований / М.И. Прохорова. СПб.: Изд-во ЛГУ, 1982. - 272 с.

59. Рахманова Т.И. Регуляция метаболизма 2-оксоглутарата с помощью НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы в клетках растений и животных: дис.на соискание уч. степ. к. б. н. / Т.И.Рахманова -Воронеж, 2002.- 207с.

60. Рейзис А.Р. Регуляция апоптоза новое направление в лечении вирусных гепатитов у детей и взрослых / А.Р. Рейзис // VII Российская научно-практическая конференция с международным участием, Москва, 29-31 мая 2007 г. : тез. докл. - М., 2007. - С. 38-39.

61. Роль перекисного окисления липидов в патогенезе ишемического повреждения и антиоксидантная защита сердца / Ф.З. Меерсон и др. // Кардиология. 1982. - № 2. - С. 81-92.

62. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных / В. Д. Самуилов // Сорос, образ, журн. — 2001. Т. 7, № 10.-С. 18-25.

63. Саприн А.Н. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов / А.Н. Саприн, Е.В. Калинина // Успехи биологической химии. 1999. - Т. 39. - С. 289-326.

64. Справочник биохимика / Р.Досон и др.. М.: Мир, 1991. - 543 с.

65. Свиридов М.М. Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс: автореф. дисс. . канд. биол. наук / М.М. Свиридов. Воронеж, 2006. - 24 с.

66. Свободнорадикальные процессы в биосистемах / Попова Т.Н. и др.. ИПК Кириллица.- 2008.-192 с.

67. Симбирцев A.C. Цитокины новая система регуляции защитных реакций организма / A.C. Симбирцев // Цитокины и воспаление. 2002. - № 1. — (www.cytokines.ru/Russian).

68. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло / В.П. Скулачев // Сорос, образ, журн. 1996. - № 3. - С. 4-10.

69. Скулачёв В.П. Кислород и явления запрограммированной смерти / В.П. Скулачёв. М.: ИБМХ РАМН, 2000. - 47 с.

70. Скулачев В.П. Старение организма — частный случай феноптоза /

71. B.П.Скулачев // Сорос, образ, журн. 2001. - Т.7, № ю. С.7-11.

72. Скулачев В.П. Явления запрограмированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода / В.П. Скулачев // Сорос, образ, журн. 2001. - Т.7, № 6. С.4 - 10.

73. Скулачев М.В. Внутренняя инициация трансляции разнообразие механизмов и возможная роль в жизнедеятельности клетки / М.В. Скулачев // Успехи биол. химии. - 2005. - Т. 45. - С. 123-172.

74. Сосунов A.A. Оксид азота как межклеточный посредник / A.A. Сосунов // Сорос, образ, журн. . 2000. - Т. 6, № 12. - С. 27-34.

75. Сравнение антиоксидантных свойств мелатонина, эпиталамина и глютатиона методом люминолзависимой хемилюминесценции in vitro / P.B. Дятлов и др. //Доклады РАН. 1997.- Т.356.- С. 129-131.

76. Струмило С. А. Очистка и некоторые свойства гиалоплазматической NADP-зависимой изоцитратдегидрогеназы из надпочечников кролика / С.А. Струмило, М.М. Викторович, В.В. Виноградов // Биохимия. 1984. - Т. 43, Вып. 2. - С.240-245.

77. Труфанова JI.B. Исследование механизма активации катехоламинами и циклическим 3', 5'-АМФ NAD-зависимой изоцитратдегидрогеназы печени мыши / Л.В. Труфанова // Обмен регуляторн. эффекты моноаминов. 1977.1. C. 11-15.

78. Хазанов В.А. Фармокологическая регуляция энергетического обмена / В.А. Хазанов // Междунар.науч.конф., посвящ. 80-лет. НАНБ, Гродно, 25-26 сентября 2008г. : тез. докл. Гродно, 2008. - С. 76-77.

79. Хаитов P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. -М.: Медицина, 2000. 432 с.

80. Харрингтон Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / вод ред. Дж. Харрингтона. М.: Мир, 1999. - 558 с.

81. Шульгин К.К. Регуляция активности глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени крыс и действии веществ-протекторов: автореф. дисс. . канд. биол. наук / К.К.Шульгин.- Воронеж, 2008.- 23 с.

82. Шульпекова Ю.О. Применение тиоктовой кислоты в гастроэнтерологии / Ю.О. Шульпекова, В.Т. Ивашкин // Российский медицинский журннал. 2000. — Т. 8. — С. 15—16.

83. Шульпекова Ю.О. Флавоноиды расторопши пятнистой в лечении заболеваний печени / Ю.О. Шульпекова // Российский медицинский журннал. -2004, №5.-С. 248-250.

84. Эллиот В. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот, Д. Элиот; Под ред. А.И. Арчакова. — М.: Изд-во НИИ Биомед. химии РАМН, 2000.— 366 с.

85. Яковенко Э.П. Хронические заболевания печени: диагностика и лечение / Э.П. Яковенко, П.Я. Григорьев // Русский медицинский журннал. — 2003. Т. 11, №5. - С.291-296.

86. Якубке Х.Д. Аминокислоты. Пептиды. Белки / Х.Д. Якубке, X Ешкайт. М.: Мир, 1985. - 456 с.

87. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion / S.M. Ronnebaum et al. // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281, № 41. - P. 30593-30602.

88. Activation of caspases in lethal experimental hepatitis and prevention by acute phase proteins / W.V. Molle et al. // J. Immunol.- 1999.- V.163.- P. 5235-5241.

89. Activation of potassium and chloride channels by tumor necrosis factor alpha. Role in liver cell death / H.H. Nietsch et al. // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, №27. -P. 20556-20561.

90. Activation of pro-death Bcl-2 famili proteins and mitochondria apoptosis pathway in tumor necrosis factor-a-indused liver injury / Yongge Zhao et al. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276, № 29. - P. 27432- 27440.

91. Activation of caspase 3 (CPP32)-like proteases is essential for TNF-ct-induced hepatic parenchymal cell apoptosis and neutrophil-mediated necrosis in a murine endotoxin shock model / H. Jaeschke et al. // J.Immunol. 1998. -Vol.160, №7. - P. 3480-3486.

92. Activity and gene expression profile of certain antioxidant enzymes in different organs of rats after subacute cyanide exposure: effect of alpha-ketoglutarate / J. Hariharakrishnan et al. // Drug Chem. Toxicol. 2009. - Vol. 32, № 3. - P. 268-276.

93. Acute toxicity of some synthetic cyanogens in rats and their response to oral treatment with alpha-ketoglutarate / R. Bhattacharya et al. // Food Chem. Toxicol.- 2009. Vol. 47, № 9. - P. 2314-2320.

94. Addition of a-ketoglutarate to blood cardioplegia improves cardioprotection / U. W. Kjellman et. al. // J. Thorac Cardiovase Surg. 1997. -Vol. 63.-P. 1625-1633.

95. Alpha-lipoic acid supplementation prevents symptoms of vitamin E deficiency / M. Podda et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. ~ Vol. 4, №.98.-P. 104.

96. Alpha-lipoic acid: effect on glucose uptake, sorbitol pathway, and energy metabolism in experimental diabetic Neuropathy / Y. Kishi et. al. // Diabetes. 1999. - Vol. 48, № 10. - P. 2045-2051.

97. Angermüller S. Pre-apoptotic Alterations in Hepatocytes of TNFVtreated Galactosamine-sensitized Mice / S. Angermüller, G. Künstle, G. Tiegs // J. of Histochem. and Cytochem. 1998.- V. 46.- P.l 175-1184.

98. Antibodies to tumor necrosis factor alfa attenuate hepatic necrosis and inflammation caused by chronic exposure to ethanol in the rat / Y. Iimuro et al. // Hepatology. 1997. - Vol. 26, № 6. - P. 1530-1537.

99. Antitumor effects of 2-oxoglutarate through inhibition of angiogenesis in a murine tumor model / K. Matsumoto et al. // Cancer Sei. 2009. - Vol. 100, №9.-P. 1639-1647.

100. Antonsson B. The Bcl-2 protein family / B. Antonsson, J.C. Martinou // Exp. Cell Res. 2000. - Vol. 256. - P. 50-57.

101. Apoptosis in myocardial ischemia and infarction / P.A. Krijen et al. // J. Clin. Pathol. -2002. Vol. 5. - P. 801-811.

102. Apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha in rat hepatocyte cell lines expressing hepatitis B virus / S. Guilhot et al. // Am. J. Pathol. 1996. — Vol. 148, №3.-P. 801-814.

103. Apoptosis induced in normal human hepatocytes by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand / M. Jo et al. // Nat. Med. 2000. — Vol. 6, № 5. - P. 564-567.

104. Apoptosis: a new mechanism of endothelial and Kupffer cell killing / Y. Takei et al. // J. Gastroenterol. Hepatol. 1995. - Vol.10. - P. S65-S67.

105. Arivazhagan P. Effect of DL-alfa-lipoic acid on tissue nucleic acid contents in aged rats / P. Arivazhagan, C. Panneerselvam // Pharmacol. Res. — 2000. -Vol. 42, № 3. P. 223-226.

106. Balakirev M. Lipoic acid-derived amphiphiles for redox controlled DNA delivery / M. Balakirev, G. Schoehn, T. Chroboczek // Chem. Biol. - 2000. -Vol. 7, № 10.-P. 813-819.

107. Barnes L.D. Yeast diphosphopyridine dinucleotide specific isocitrate dehydrogenase. Purification and some properties / L.D. Barnes, G.D. Kuchn, D.E. Atkinson // Biochemistry. 1971. - Vol. 10, № 6. - P 3939-3944.

108. Batinic-Haberle I. An SOD mimic protects NADP+ dependent isocitrate dehydrogenase against oxidative inactivation / I. Batinic-Haberle, L.T. Benov // Free Radic Res. - 2008. - Vol. 42, № 7. - P. 618-624.

109. Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondria / M. Narita et al. // Biochemistry. 1998. - Vol. 95, № 25. - P. 14681-14686.

110. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel / S. Shimizu et al. // VDAC. 1999. - Vol. 399. - P. 483-487.

111. Bid induces the oligomerization and insertion of bax into the outer mitochondrial membrane / R. Eskes et al. // Molecular and Cellular Biology. — 2000. Vol. 20, № 3. - P. 929-935.

112. Bid-induced cytochrome c release is mediated by a pathway independent of mitochondrial permeability transition pore and Bax / Tae-Hyoung Kim et al. // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, № 50. - P. 39474-39481.

113. Bingham R.J. Thioctic acid in milk / R.J. Bingham, J.D. Huber, L.W. Aurand // J. Dairy Sci. 1966. - Vol. 50, № 3. - P. 318-323.

114. Blocking the Ca (2+) activated cytotoxic mechanisms of cholinergic neuronal death: a novel treatment strategy for Alzheimer's disease / R. J.

115. Branconnier et al. // Psychopharmacol. Bull. 1992. - Vol. 28, № 2. - P. 175181.

116. Boer U. Sensitization by interleukin-6 of rat hepatocytes to tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis / U. Boer , A. Fennekohl, G.P. Puschel. // J. Hepatol. 2003. - Vol. 38, № 6. - P.728-735.

117. Borutaite V. Mitochondria in apoptosis of ischemic heart / V. Borutaite, G.C. Brown // FEBS. 2003. - Vol. 541, № 1-3. - P. 1-5.

118. Brain tissue responses to ischemia / J. Lee et al. // The J. of Clinical Investigation. 2000. - Vol. 106, № 6. - P. 723-731.

119. Bravi D. Dopamine agonists in the clinical management of Parkinson's disease: symptomatic or neuroprotective treatment / D. Bravi, V. Nohria, L.F. Megas //Eur. J. Neurol.- 1996.-Vol. 3,№ l.-P. 13-18.

120. Brune B. Cytokine and low-level nitric oxide prestimulation block p53 accumulation and apoptosis of RAW 264.7 macrophages / B. Brune, C. Golkel, A. Von-Knethen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - Vol. 229, № 2. - P. 396-401.

121. Bulos B.A. Calcium inhibition of the NAD+-linked isocitrate dehydrogenase from blowfly flight muscle mitochondria / B.A. Bulos, B.J. Thomas, B. Sacktor // J.Biochem. 1984. - Vol. 259, № 16. - P. 10232-10237.

122. Busciglio J. Apoptosis and increased generation of reactive oxygen species in Down's syndrome neurons in vitro / J. Busciglio, B.A. Yankner // Nature. 1995. - Vol. 378, № 6. - P. 776-779.

123. Buttke T.M. Oxidative stress as a mediator of apoptosis / T.M. Buttke, P.A. Sadstrom // Immunol. Today. 1994. - Vol. 15. - P. 7-14.

124. Bzymek K.P. Role of alpha-Aspl81, beta-Aspl92, and gamma-Aspl90 in the distinctive subunits of human NAD-specific isocitrate dehydrogenase / K.P. Bzymek , R.F. Colman // Biochemistry. 2007. - Vol. 46, № 18. - P. 5391-5397.

125. Calcitriol inhibits hepatocyte apoptosis in rat allograft by regulating apoptosis-associated genes / A. Zhang et al. // Int. Immunopharmacol. 2007. -Vol. 7, №8.-P. 1122-1128.

126. Carlier M.F. NADF linked isocitrate dehydrogenase from beef liver. Purification, guatermary structure and catalytic activity/ M.F. Carlier, D. Pantaioni // Eur. J. Biochem. - 1973. - Vol. 37, № 4. - P.341-354.

127. Carmody R.J. Signalling apoptosis a radical approach / R.J. Carmody, T.G. Cotter // Redox Rep. 2001. - V. 6. - P. 77-90.

128. Caspase 9-dependent killing of hepatic stellate cells by activated Kupffer cells / R. Fischer et al. // Gastroenterology. 2002. - Vol. 123, № 3. - P. 845-861.

129. Cennamo C. Anion and substrate inhibition and kinetic behavior of NAD+-specific isocitrate dehydrogenase from baker's yeast / C. Cennamo // Biochem. et Biophys. Acta. 1967. - Vol. 132, № 2. - P. 232-243.

130. Cennamo C. Kinetic behavior of NAD+-specific isocitrate dehydrogenase from baker's yeast and inhibition by AMP / C. Cennamo, L. Razzoli,

131. F. Ferari // Ital. J. Biochem. 1970. - Vol. 19, № 2. - P. 100-110.

132. Ceramide induces caspase-independent apoptosis in rat hepatocytes sensitized by inhibition of RNA synthesis / B.E. Jones et al. // Hepatology. 1999. -Vol. 30, № 1.-P. 215-222.

133. Chen R. Activation and inhibition of DPN-linked isocitrate dehydrogenase of heart by certain nucleotides / R. Chen, G. Plaut // Biochemistry. -1963. Vol. 2, № 5. p. 1023-1032.

134. Chen R. Structure, functions and regulation of NAD and NADP dependent isocitrate dehydrogenase in higher plants and in other organisms / R. Chen, P. Gadal // Plant. Physiol.Biochem. 1990. - Vol. 28, № 3. - P. 411-427.

135. Chinan C.F. Effects of temperature on diphosphopyridine nucleotide-dependent isocitrate dehydrogenase from bovine heart / C.F. Chinan, F.L. Jan-Ping,

136. G.W. Plaut // J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250, № 6. - P. 2022-2027.

137. CL-2 family members and the mitochondria in apoptosis / A.B. Gross et. al. // Genes & Development. 1999. - Vol. 13, № 15. - P. 1899-1911.

138. Clofibrate elevates enzyme activities of the tricarboxylic acid cycle in rat liver / C. Prager et al. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277, № 9. - P. 7066-7075.

139. C-Myc and caspase-2 are involved in activating Bax during cytotoxic drug-induced apoptosis / X. Cao et al. // J. Biol. Chem. 2008. - Vol. 10. - P. 1074.

140. Cohen P.F. Purification of NAD-specific isocitrate dehydrogenase from porcine heart / P.F. Cohen, R.F. Colman // Biochem. Biophys. Acta. 1971. - Vol. 242, №3. -P. 323-330.

141. Cohen P.F. Role of manganous ion in the kinetics of pig heart NAD-specific isocitrate dehydrogenase / P.F.Cohen, R.F.Colman // Eur. J. Biochem. -1974. Vol. 47, № 1. - P. 35-45.

142. Colman R.F. Binding of substrates by native and chemically modified isocitrate dehydrogenase / R.F. Colman // Biochem. et Biophys. Acta.1969.-Vol.191, №2. P.469-472.

143. Colman R.F. The role of suifydryl groups in the catalic function of isocitrate dehydrogenase / R.F. Colman, R. Chu // Biochem. et Biophys. Acta.1970.-Vol. 245, № 3. P. 608-615.

144. Control of mitochondrial redox balance and cellular defense against oxidative damage by mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase / S.H. Jo et al.//J Biol Chem. 2001. - Vol. 276, № 19.-P. 16168-16176.

145. Cook R.A. Isocitrate dehydrogenase (NAD-specific) from Neurospora crassa / R.A. Cook, B.D. Sanwal // Methods Enzymol. 1969. - № 13. - p. 42-47.

146. Cooper T.G. Mitochondria and glyoxysomes from castor been endosperm / T.G. Cooper, H. Beevers // J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 244, № 13. -P.3507-3513.

147. Cornu S. NAD(P)-dependent isocitrate dehydrogenase in mitochondria purified from Pecea abies seedlings / S. Cornu, I.C. Pireaux, J. Gerard // Physiol. Plant. 1996.-Vol. 96.-P. 312-318.

148. Correlation between sustained c-jun n-terminal protein kinase activation and apoptosis induced by tumor necrosis factor-a in rat mesangial cells / Yan-Lin Guo et al. // J. Biol. Chem.- 1998.- Vol. 273.- P. 4027-4034.

149. Cosubstrate and allosteric modities activities of structural analogues of NAD and ADP for NAD-specific isocitrate dehydrogenase from bovine heart / G.W.E. Plaut et al. //Biochemistry. 1979. - Vol. 18, № 15. - P. 3430-3438.

150. Cox G.F. Nicotinamideadenine dinucleotide-specific isocitrate dehydrogenase from pea mitochondria / G.F. Cox, D.D. Davies // Biochem. J. — 1967. Vol. 105, № 2. - P. 729-734.

151. Cox G.F The effects of pH and citrate on the activity of nicotinamideadenine dinucleotide-specific isocitrate dehydrogenase from pea mitochondria / G.F. Cox, D.D. Davies // Biochem. J. 1969. - Vol. 113, № 5. - p. 813-820.

152. Creation of human tumour cells with defined genetic elements / W.C. Hahn et al. // Nature. 1999. - Vol. 400. - P. 464-468.

153. Cupp J.R. Cloning and characterization of the gene encoding the IDH1 subunit of NAD+-dependent isocitrate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisia/ J.R. Cupp, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267, № 23 -P. 16417-16423.

154. Cytochrome c-dependent activation of caspase-3 by tumor necrosis factor requires induction of the mitochondrial permeability transition / M. Tafani et al. // Am. J. of Pathology. 2000. - Vol. 156. - P. 2111-2121.

155. Cytoprotective effects of melatonin on C6 astroglial cells exposed to glutamate excitotoxicity and oxidative stress / A. Das et al. // J. Pineal. Res. — 2008. Vol. 45, № 2. - P. 117-124.

156. Cytosolic NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase status modulates oxidative damage to cells / S.M. Lee et al. // Free Radic. Biol. Med. 2002. - Vol. 32,№ 11.-P. 1185-1196.

157. Cytosolic NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase. Isolation of rat cDNA and study of tissue-specific and developmental expression of mRNA / G.T. Jennings et al. //J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269, № 37. - P. 23128-23134.

158. Degradation of poly(A)-binding protein in apoptotic cells and linkage to translation regulation / W.E. Marissen et. al. // Apoptosis. 2004. - Vol. 9, № 1. - P. 67-75.

159. Diehl A.M. Effect of ethanol on tumor necrosis factor signaling during liver regeneration / A.M. Diehl // Clin. Biochem. 1999. - Vol. 32. № 7. - P. 571578.

160. DiPetrillo K. Urinary tumor necrosis factor contributes to sodium retention and renal hypertrophy during diabetes / K. DiPetrillo, B. Coutermarsh, F.A. Gesek // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2003. - Vol. 284, № 1. - P. F113-F121.

161. Diphosphopyridine nucleotide-linked isocitrate dehydrogenase from bovine heart / A.G. Nicholas at al. // J. Biol. Chem. 1970. - Vol. 245, № 20. - P. 5469-5477.

162. Direct inhibition of the mitochondrial permeability transition pore: a possible mechanism responsible for anti-apoptotic effects of melatonin / S.A. Andrabi et al. // FASEB J. 2004. - Vol. 18, № 7. - P. 869-871.

163. Disruption of redox homeostasis in tumor necrosis factor-induced apoptosis in a murine hepatocyte cell line / R.H. Pierce et al. // Am. J. of Pathology. 2000. - V.157. - P.221-236.

164. Does dietary ornithine alpha-ketoglutarate supplementation protect the liver against ischemia-reperfusion injury? / H. Schuster et al. // Clin. Nutr. 2005. - Vol. 24, № 3. - P. 375-384.

165. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function / W. Droge // Physiol. Rew. 2002. - Vol. 82. - P. 47-95.

166. Duggleby R.G. Nicotinamideadenine dinucleotide-specific isocitrate dehydrogenase from higher plant / R.G. Buggleby, D.T. Dermis // J. Biol. Chem. -1970.-Vol. 245, № 15.-P. 3745-3750.

167. Effect of diatery a-lipoic acid on growth, body composition, muscle pH, and AMP- cativated protein kinase phosphorilation in mice / Q.W. Shen et al. // J. Am. Sci. 2005. - Vol. 83. - P. 2611-2617.

168. Effect of hepatocyte apoptosis induced by TNF-a on acute severe hepatitis in mouse models / G.Q. Zang et al. // World. J. Gastroentero. 2000. -Vol. 6, №. 5. -P. 688-692.

169. Effect of melatonin on myocardial oxidative stress induced by experimental obstructive jaundice / A. Cruz et al. // Rev. Esp. Enferm. Dig. -2009. Vol. 101, № 7. - P. 460-463.

170. Effect of melatonin on oxidative status of rat brain, liver and kidney tissues under constant light exposure / G. Baydas et al. // Cell Biochem. Funct. -2001.-Vol.19, № l.-P. 37-41.

171. Effect of NF-kappaB and p38 МАРК in activated monocytes/macrophages on pro-inflammatory cytokines of rats with acute pancreatitis / H.S. Liu et al. // Gastroenterol. 2003. - Vol. 9, № 11. - p. 2513-2518.

172. Effect oa matrix metalloproteinase- 9 gene knouk-out on the proteolysis of blood -brain barrier and whitt mutter components after celebrar ischemia / M. Asahi // The J. Neuroscience. 2001. - Vol. 21, № 19. - P. 7724-7732.

173. Effects of baicalin on hepatocyte apoptosis induced by TNF-alpha and act D in rats / C. Hu et al. // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2001. - Vol. 26, № 2. -P. 124-127.

174. Effects of melatonin on proliferation, oxidative stress and Cx32 gap junction protein expression in primary cultures of adult rat hepatocytes / T. Kojima // Cell Struct. Funct. 1997. - Vol. 22, № 3. - P. 347-356.

175. El-Sokkary G.H. Inhibition of 2-nitropropane-induced cellular proliferation, DNA synthesis and histopathological changes by melatonin / G.H. El-Sokkary // Neuroendocrinol. Lett. 2002. - Vol. 23, № 4. - P. 335-340.

176. Ethanol increases tumor necrosis factor-alpha receptor-1 (TNF-R1) levels in hepatic, intestinal, and cardiac cells / D.A. Rodriguez et al. // Alcohol. — 2004. Vol. 33, № 1. - P. 9-15.

177. Evaluation by mutagenesis of the importance of 3 arginines in alpha, beta, and gamma subunits of human NAD-dependent isocitrate dehydrogenase. / S. Soundar et al. // J. Biol. Chem. 2003, - Vol. 278. № 52. - P. 52146-52153.

178. Expression and antioxidant function of liver fatty acid binding protein in normal and bile-duct ligated rats / G. Wang et al. // Eur. J. Pharmacol. 2007. -Vol. 560, № l.-P. 61-68.

179. Fan C.C. Functional groups of diphosphopyridine nucleotide-linked isocitrate dehydrogenase from bovine heart / C.C. Fan, W.E. Plaut // J.Biochem. — 1974.-Vol. 249, № 15.-P. 4839-4845.

180. Fatania H.R. Chemical modification of rat liver cytosolic NADP^-linked isocitrate dehydrogenase by N-ethlmaleimide. Evidence for essential sulphydryl groups / H.R. Fatania, K.E. al-Nassar, N. Thomas // J.FEBS. 1993. -Vol. 322, № 3. - P. 245-248.

181. Feron O. Pyruvate into lactate and back: from the Warburg effect to symbiotic energy fuel exchange in cancer cells / O. Feron // Radiother Oncol. -2009.-Vol. 92, №3.-P. 329-333.

182. Ffockenbery H. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death / H. Ffockenbery // Nature. 1990. - Vol. 348, № 3. - P. 334-336.

183. Fibrosis in patients with chronic hepatitis C: detection and significance / T. Poynard et al. // Semin Liver Dis. 2000. - Vol. 20. - P. 40—55.

184. Floyd A.R. Role of oxygen radicals in cancerjgenesis and brain ischemia /A.R. Floyd // FASEB J. 1990. - Vol. 4. - P. 2587-2597.

185. Fructose 1,6-bisphosphate reduced TNF-alpha-induced apoptosis in galactosamine sensitized rat hepatocytes through activation of nitric oxide and cGMP production / R. Calafell et al. // Eur. J. Pharmacol. 2009. - Vol. 610, № 1-3.-P. 128-133.

186. Galvez S. On the function of the NADP-dependent isocitrate dehydrogenase isoenzymes in living organisms / S. Galvez, P. Gadal // Plant. Sci. -1995.-Vol. 105.-P. 1-14.

187. Gastric emptying in patients with insulin dependent diabetes mellitus and bioavailability of thioctic acid-enantiomers / R. Hermann et al. // Eur. J. Pharm. Sci. 1998. - Vol. 6, № 1. - P. 27-37.

188. Genes related to apoptosis predict necrosis of the liver as a phenotype observed in rats exposed to a compendium of hepatotoxicants / L. Huang et al. // BMC Genomics. 2008. - Vol. 9. - 288 p.

189. Glutamate is the major anaplerotic substrate in the tricarboxylic acid cycle of isolated rumen epithelial and duodenal mucosal cells from beef cattle / S.W.

190. El-Kadi et al. // J. Nutr. 2009. - Vol. 139, № 5. - P. 869-875.

191. Glutathione regulation of neutral sphingomyelinase in tumor necrosis factor-a-induced cell death / H. Liu et al. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, № 18. -P. 11313-11320.

192. Glycati on-induced inactivation of NADP -dependent isocitrate dehydrogenase: implications for diabetes and aging / I.S. Kil et al. // Free Radic Biol. Med.-2004.-Vol. 37, № 11.-P. 1765-1778.

193. Granzyme B-mediated cytochrome c release is regulated by the Bcl-2 family members Bid and Bax / A. Jeffrey et al. // The Journal of Experimental Medicine.-2000.-Vol. 192, № 10.-P. 1391-1402.

194. Green D.R. Mitochondria and apoptosis / D.R Green, J.C. Reed // Science. 1998. - Vol. 281. - P. 1309-1312.

195. Hardeland R. Circadian rhythms, oxidative stress, and antioxidative defense mechanisms / R. Hardeland , A. Coto-Montes , B. Poeggeler // Chronobiol. Int. 2003. - Vol. 20, №> 6. - P. 921-962.

196. Haselbeck R.J. Function and expression of yeast mitochondrial NAD-and NADP-specific isocitrate dehydrogenases / R.J. Haselbeck, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268, № 16. - P. 12116-12122.

197. Hatano E. Tumor necrosis factor signaling in hepatocyte apoptosis / E. Hatano // J. Gastroenterol. Hepatol. 2007. - Vol. 1. - P. S43-S44.

198. Hathway J.A. The effects by adenylic acid on yeast nicotinamide adenine dinucleotide isocitrate dehydrogenase. A possible metabolic control centrol mechanism / J.A. Hathway, D.E. Atkinson // J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 238, № 8. -P. 2875-2881.

199. Hayman S. Reaction of essential lysyl residues of pig heart diphosphopyridine nucleotide dependent isocitrate dehydrogenase with 2,4-pentanedione / S. Hayman, R.F. Colman // Biochemistry. 1977. - Vol. 16, № 5. -P. 998-1005.

200. Hepatocytes sensitized to tumor necrosis factor-a cytotoxicity undergo apoptosis through caspase-dependent and caspase-independent pathways / B.E. Jones et al. //J. Biol. Chem.-2000.- Vol. 275, №> 1.- P.705-712.

201. Hinson J.A. Phase II enzymes and bioactivation / J.A. Hinson, P.G. Forkert // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1995. - Vol. 73, № 10. - P. 1407-1413.

202. Hofmann K.H. Regulation of NAD-+- and NADP+- linked isocitrate dehydrogenase in the obligate methylotrophic bacterium Pseudomonas W6 / K.H. Hotmann, W. Babel // Z. alld. Mikrobiol. 1980. - Vol. 20, № 6. - P. 399-404.

203. Hu G. Physiological consequences of loss of allosteric activation of yeast NAD-specific isocitrate dehydrogenase / G. Hu, A. Lin, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281, № 25. - P. 16935-16942.

204. Human NARP mitochondrial mutation metabolism corrected with alpha-ketoglutarate/aspartate: a potential new therapy / G. Sgarbi et. al. // Arch. Neurol. 2009. - Vol. 66, № 8. - P. 951-957.

205. Identification and functional characterization of a novel, tissue-specific NAD+-dependent isocitrate dehydrogenase (3 subunit isoform / K. Yong-Ou et al. // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, № 52. - P. 36866-36875.

206. Identification of Mn2+-binding aspartates from alpha, beta, and gamma subunits of human NAD-dependent isocitrate dehydrogenase / S. Soundar et. al. // J Biol Chem. 2006. - Vol. 281, № 30. - P. 21073-21081.

207. IDH1 gene transcription is sterol regulated and activated by SREBP-la and SREBP-2 in human hepatoma HepG2 cells: evidence that IDH1 may regulate lipogenesis in hepatic cells / I. Shechter et. al. // J. Lipid Research. 2003. - Vol. 44.-P. 2169-2180.

208. In vitro effect of melatonin on oxygen consumption in liver mitochondria of rats / C.F. Reyes-Toso et. al. // Neuroendocrinol. Lett. 2003. -Vol. 24, № 5.-P. 341-344.

209. Inactivation NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase by nitric oxide / E.S. Yang et al. // Free Radic. Biol. Med. 2002. - Vol. 33, № 7. - P. 927-937.

210. Increased cytochrome P-450 2E1 expression sensitizes hepatocytes to c-Jun-mediated cell death from TNF-alpha / H. Liu et. al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2002. - Vol. 282, № 2. - P. G257-G266.

211. Ingebretsen O.C. Mechanizm of the inhibitory effect of glyoxylate plus oxaloacetate and oxalomalate on the NADP-specific isocitrate dehydrogenase / O.C. Ingebretsen // Biochim. et Biophys. Acta. 1976. - Vol. 452, №2.-P. 302-303.

212. Inhibition of c-Myc expression sensitizes hepatocytes to tumor necrosis factor-induced apoptosis and necrosis / H. Liu et. al. // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275, № 51. P. 40155-40162.

213. Inhibition of TNFalpha in vivo prevents hyperoxia-mediated activation of caspase 3 in type II cells / F. Guthmann et. al. // Respir. Res. 2005. - Vol.6. -P. 10.

214. Investigations on the pharmacokinetics of alpha-lipoic acid in healthy volunteers / J. Teichert et. al. // Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 1998. - Vol. 36, № 12. -P. 625-628.

215. Involvement of p53 in DNA strand break-induced apoptosis in postmitotic CNS neurons / Y. Enokicdo et al. // Eur. J. Neurosci. 1996. - Vol. 8, №9.-P. 1812-1821.

216. Involvement of TNF-alpha in glutamate-induced apoptosis in a differentiated neuronal cell line / J. Kogo et. al. // Brain. Res. 2006. - Vol. 1122, № 1. - P. 201-208.

217. Iocca A.H. Tumor necrosis factor- acts as a complete mitogen for primary rat hepatocytes / H.A. Iocca, H.C. Isom // American. J. of Pathology. -2003. Vol. 163. - P. 465-476.

218. Irradiation leads to apoptosis of Kupffer cells by a Hsp27-dependant pathway followed by release of TNF-alpha / K. Tello et. al. // Radiat. Environ. Biophys. 2008. - Vol. 47, № 3. - P. 389-397.

219. Irradiation leads to susceptibility of hepatocytes to TNF-alpha mediated apoptosis / H. Christiansen et al. // Radiother. Oncol.- 2004.- Vol. 72, №3.-P.291-296.

220. Jacobson M.D. Programmed cell death in animal developmen / M.D. Jacobson, M. Weil, M.C. Raff// Cell. 1997. - Vol. 88. - P. 347-354.

221. Jenner P. Oxidative stress and the pathogenesis of Parkinson's disease / P. Jenner, C.W. Olanow // Neurology. 1996. - Vol. 47, № 6. - P. 161-170.

222. John P. Iredale hepatic stellate cell behavior during resolution of liver injury / P. John // Seminars in Liver Disease. 2001. - Vol. 21, № 3. - P. 427436.

223. Kelly J.H. Physical evidence for the dimerization of the triphosphopyridine -specific isocitrate dehydrogenase from pig heart / J.H. Kelly, G.W.E. Plaut // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256, № 1. - P. 330-334.

224. Kim H.J. Cellular defense against heat shock-induced oxidative damage by mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase / H.J. Kim, B.S. Kang, J.W. Park. // Free Radic. Res. 2005. - Vol. 39, № 4. - P. 441-448.95 97 78

225. Kim T. Ser , Asny', and Thr'° are important for the catalytic function of porcine NADP-dependent isocitrate dehydrogenase / T. Kim, R. Colman // Protein Science. 2005. - Vol. 14. - P. 140-147.

226. Kirlin W.G. Glutathione redox potential in response to differentiation and enzyme inducers / W.G. Kirlin, J.Cai // Free Radic. Biol. Med. 1999. - Vol. 27, № l.-P. 1208-1218.

227. Konrad T. Alpha-Lipoic acid treatment decreases serum lactate and pyrsuvate concentrations and improves glucose effectiveness in lean and obese patients with type 2 diabetes / T. Konrad, P. Vicini // Diabetes. Care. 1999. - Vol. 22, №2.-P. 280-287.

228. Kuehn G.D. Yest diphosphopyridine nucleotide specific isocitrat dehydrogenase. Binding of ligands / G.D. Kuehn, L.D Barnes., D.E. Atkinson // Biochemistry. 1971.-Vol. 10, №21. - P. 3945-3951.

229. Kyogo H. Generation of reactive oxygen species and decrease of liver catalase in Long-Evans. Cinnamon rats predisposed to hepatitis and hepatoma / H. Kyogo//Jap. J. Vet. Res. — 1998. — Vol. 46, №23.-P. 163.

230. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

231. LaPorte D.C. Compensatory phosphorylation oif socitrate dehydrogenase a mechanism for adaptation to the intracellular environment / D.C. LaPorte, P.E. Thorsness, D. Koshland // J. Biol. Chem. 1985. - Vol. 260, № 19. -P. 10563-10668.

232. Lee J.H. Inactivation of NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase by peroxynitrite. Implications for cytotoxicity and alcohol-induced liver injury / J.H. Lee, E.S. Yang , J.W. Park. // J Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, № 51. - P. 51360-51371.

233. Lee J.H. Oxalomalate regulates ionizing radiation-induced apoptosis in mice / J.H. Lee , J.W. Park // Free Radic. Biol. Med. 2007. - Vol. 42, № 1. - P. 44-51.

234. Lee S.M. Inactivation NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase by reactive oxygen species / S.M. Lee, T.L. Kil, J.Park // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 83, № 11-12.-P. 1057-1065.

235. Lemasters J.J. Mechanisms of hepatic toxicity V. Necrapoptosis and the mitochondrial permeability transition: shared pathways to necrosis and apoptosis / J.J. Lemasters // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1999. - Vol. 276. - P. G1-G6.

236. Lin A.P. Isocitrate binding at two functionally distinct sites in yeast NAD+-specific isocitrate dehydrogenase / A.P. Lin, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277, № 25. P. 22475-22483.

237. Lin A.P. Homologous Binding Sites in Yeast Isocitrate Dehydrogenase for Cofactor (NAD+) and Allosteric Activator (AMP) / A.P. Lin, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, № 15. - P. 12864-12872.

238. Lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity is inhibited by the antioxidant melatonin / E. Sewerynek et. al. // Eur. J. Pharmacol. 1995. - Vol. 293, №4.-P. 327-334.

239. Liu H. NF-kappa B inhibition sensitizes hepatocytes to TNF-induced apoptosis through a sustained activation of JNK and c-Jun / H. Liu , C.R. Lo , M.J. Czaja // Hepatology. 2002. - Vol. 35, № 4. - P. 772-778.

240. Locations of the regulatory sites for isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase / S.P. Miller et. al. // J. Biochem. 2000. - Vol. 275, № 2. - P. 833-839.

241. Lowry O. Protein measurement with the Folin Phenol reagent / O. Lowry, N. Rosembrought, A. Farret. // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 194, № 1. - P.265-271.

242. Ma M. Effect of tumor necrosis factor-alpha in rats with hepatic ischemia-reperfusion injury/ M. Ma, Z.H. Ma // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. -2008. Vol. 7, №. 3. p. 296-299.

243. Mactarlane N. The purification and propertiesof NADP-dependent isocitrate dehydrogenase from ox heart mitochondria / N. Mactarlane, B. Mathews, K. Dalziel //Em. J. Biochem. 1977. - Vol. 74, № 3. - P. 553-559.

244. Magar E. The subunits of porcine heart TPN-linked isocitrate dehydrogenase / E. Magar, J.E. Robbims // Biochim. et Biophys. Acta. 1969. — Vol. 191, № l.-P. 173-176.

245. Maharaj D.S. 6-Hydroxymelatonin converts Fe (III) to Fe (II) and reduces iron-induced lipid peroxidation / D.S. Maharaj, J.L. Limson, S. Daya // Life Sei. 2003. - Vol. 72, № 12. - P. 1367 -1375.

246. Marsh S.A. Vitamin E and a-lipoic acid supplementation increase bleeding tendency via an intrinsic coagulation pathway / S.A. Marsh, P. Coombes, J.S. Coombes // Clin. Appl. Thromb. Homeost. 2006. - Vol. 12, № 2. - P. 169-173.

247. Martinez-Rivas J.M. Purification and Characterization of NAD-Isocitrate Dehydrogenase from Chlamydomonas reinhardtii / J.M. Martinez-Rivas, J.M. Vega /Plant Physiol. 1998.-Vol. 118.-P. 249-255.

248. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained Polyacrylamide / A. Shevchenko et al. // Anal. Chem. 1996. - Vol. 68. - P. 850-858.

249. Maturation-dependent modulation of apoptosis in cultured cerebellar granule neurons by cytokines and neurotrophins / De Luca A. et al. // Eur. J. Neurosci. 1996. - Vol. 8, № 9. p. 1994-2005.

250. Mauck L. Alkylation of cysteinyl residues of pig heart NAD-specific isocitrate dehydrogenase by iodoacetate / L.Mauck, R.F.Colman // Biochim. et Biophys. Acta. 1976. - Vol. 429, № 2. - P. 301-315.

251. Mcintosh C.A. NAD-linked isocitrate dehydrogenase: isolation, purification and characterization of the protein from pea mitochondria / C.A. Mclntoch, D.J. Oliver // Plant Physiol. 1992. - Vol. 100 - P. 69-75.

252. Mechanism for obesity-induced increase in myocardial lipid peroxidation / H.K. Vincent et al. // Int. J. Obesity. 2001. - Vol. 25, № 3. - P. 378-388.

253. Mechanism of liver injury in severe acute pancreatitis rats and role of melatonin / Y. Ni et. al. // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2008. - Vol. 88, № 40. - P. 2867-2871.

254. Mechanisms of hepatic toxicity I. TNF-induced liver injury / C.A. Bradham et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1998. - Vol. 275, № 3. - P. 387-392.

255. Mechanisms of hepatotoxicity toxicological / H. Jaeschke et. al. // Sciences. 2002. - Vol. 65. - P. 166-176.

256. Melatonin ameliorates chronic renal failure-induced oxidative organ damage in rats / G. Sener et. al. // J. Pineal. Res. 2004. - Vol. 36, № 4. - P. 232-241.

257. Melatonin exerts a therapeutic effect on cholestatic liver injury in rats with bile duct ligation / Y. Ohta, M. Kongo, T. Kishikawa // J. Pineal. Res. 2003. -Vol. 34, №2.-P. 119-126.

258. Melatonin increases the activity of the oxidative phosphorylation enzymes and the production of ATP in rat brain and liver mitochondria / M. Martin et. al. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002. - Vol. 34, № 4. - P. 348- 357.

259. Melatonin inhibits lipid peroxidation and stimulates the antioxidant status of diabetic rats / H. Vural et. al. // J. Pineal. Res. 2001. - Vol. 31, № 3. - P. 193-198.

260. Melatonin inhibits nuclear factor kappa B activation and oxidative stress and protects against thioacetamide induced liver damage in rats / R. Bruck et. al. // J. Hepatol. 2004. - Vol. 40, № 1. - P. 86-93.

261. Melatonin prevents disruption of hepatic reactive oxygen species metabolism in rats treated with carbon tetrachloride / Y. Ohta et. al. // Pineal. Res. -2004.-Vol. 36, № 1. — P. 10-17.

262. Melatonin prevents oxidative stress and hepatocyte cell death induced by experimental cholestasis / F.J. Padillo et. al. // Free Radic. Res. 2004. — Vol. 38, №7.-P. 697-704.

263. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis / M.J. Jou et. al. // J. Pineal. Res. 2007. - Vol. 43, № 4. - P. 389-403.

264. Melatonin protects against renal oxidative stress after obstructive jaundice in rats / A. Cruz et. al. // Eur. J. Pharmacol. 2001. - Vol. 425, № 2. -P. 135-139.

265. Melatonin reduces apoptosis and necrosis induced ' by ischemia/reperfusion injury of the pancreas / F.C. Munoz-Casares et. al. // J. Pineal. Res. 2006. - Vol. 40, № 3. - P. 195-203.

266. Melatonin versus vitamin E as protective treatment against oxidative stress after extra-hepatic bile duct ligation in rats / P. Montilla et. al. // J. Pineal. Res. 2001. - Vol. 31, № 2. - P. 138-144.

267. Metabolic and homodynamic effects of intravenous glutamate infution early after coronary operations / R. Svedjeholm et. al. // J. Thorac. Cardiovase Surg.- 1996.-Vol. 112. — P. 1468-1477.

268. Miake F. Isolation and characterization of NADF-spesific isocitrate dehydrogenase from the pypa of Bombyx mori / F. Miake, T. Torikata, K. Koga // J. Biochim. 1977. - Vol. 82, №. 2. - P. 449-^54.

269. Midaoui A. Prevention of hypertension, Insulin resistance, and oxidative stress by a-lipoic acid / A. Midaoui, J. de Champlain // Hypertension. -2002. Vol. 39. - P. 303-307.

270. Milosevic N. Lead stimulates intercellular signalling between hepatocytes and Kupffer cells / N. Milosevic, P. Mai er // Eur. J. Pharmacol. 2000. -Vol. 401, №3.-P. 317-328.

271. Mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase protects cadmium-induced apoptosis / I.S. Kil et. al. // Mol. Pharmacol. 2006. - Vol. 70, № 3. - P.1053-1061.

272. Morel Y. Repression of gene expression by oxidative stress / Y. Morel, R. Barouki // J. Biochem. 1999. - Vol. 342. - P. 481-496.

273. Morris C.A. Purification and properties of a soluble nicotinamide-adenine dinucleotide-linked isocitrate dehydrogenase from Crithidia fasciculata / C.A. Morris, M.M. Weber//J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250, № 7 - P. 2681-2689.

274. Muller K. Gpl20 of HIV-1 induces apoptosis in rat cortical cell cultures: prevention by memantine. / K. Muller // Eur. J. Pharmacol. — 1992. Vol. 226, № 6. -P. 209-214.

275. Multiple protective effects of melatonin against maternal cholestasis-induced oxidative stress and apoptosis in the rat fetal liver-placenta-maternal liver trio / MJ. Perez et. al. // J. Pineal. Res. 2007. - Vol. 43, № 2. - P. 130-139.

276. Vol. 265, № 18. P. 10232-10237.

277. NAD+-dependent isocitrate dehydrogenase cloning, nucleotide sequence, and disruption of the idh2 gene from Saccharomyces cerevisiae / J.R. Cupp, L. McAlister-Hen // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266, № 33. - P. 22199-22205.

278. Nagata S. Apoptosis by death factor / S. Nagata // Cell. 1997. - Vol. 88.-P. 355-365.

279. Narayanan S. Laboratory markers as an index of aging / S. Narayanan // Ann. Clin. Lab. Sci. 1996. - Vol. 26, № 1. - P. 50-59.

280. Nealon D.A. Purification and subunit structure of nicotinamide adenine dinucleotide specific isocitrate dehydrogenase from Neurospora crassa / D.A. Nealon, R.A. Cook // Biochemistry. 1979. - Vol. 18, № 16. - P. 3617-3622.

281. Nesterenko M.V. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels / M.V. Nesterenko, M. Tilley, S.J. Upton // J. Biochem. Biophys. Methods. 1994. - Vol. 28. - P. 239-242.

282. Nitric oxide suppresses apoptosis via interrupting caspase activation and mitochondrial dysfunction in cultured hepatocytes / J. Li et. al. // J. Biol. Chem. — 1999. Vol. 274. № 24. - P. 17325-17333.

283. Observation on the urinary excreation of thioctic acide / E.L. Patterson et al. // The Am. J. of Clin. Nutr. 1956. - Vol. 4, № 3. - P. 269-274.

284. Oxidative damage in the liver induced by ischemia-reperfusion: protection by melatonin / E. Sewerynek et al. // Hepatogastroenterology. — 1996. -Vol. 43, № 10. P. 898-905.

285. Oxidative mitochondrial DNA damage and deletion in hepatocytes of rejecting liver allografts in rats: role of TNF-alpha / Y. Nagakawa et al. // Hepatology. 2005. - Vol. 42, № 1. - P. 208-215.

286. Oxidative stress in relation to surgery: is there a role for the antioxidant melatonin / B. Kucukakin et al. // J. Surg.Res. 2009. - Vol. 152, № 2. - P. 338347.

287. Oxidative stress in the aging rat heart is reversed by dietsry supplementation with (R)-a-lipoic acid / J.H. Soh et al. // FASEB J. 2001. - Vol. 15.-P. 700-706.

288. Packer L. a-Lipoic acid: ametobolic antioxidant. Witen reculates NF-kB signol transductions and protects against axidative injury / L. Packer // Drug. Matab. Rev. 1998. - № 30. - P. 245-275.

289. Panisko E.A. Subunit interactions of yeast NAD+-specifIc isocitrate dehydrogenase / E.A. Panisko, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276, №2.-P. 1204-1210.

290. Panson M.J. Isocitrate dehydrogenase of the Thermoacidophilic archaebacterium Sulpholobus acidocaldarius / M.J. Panson, P.A. Wood // Biochem. 1984. - Vol. 172, № 2. - P. 289-293.

291. Pantial purification and some kinetic properties of NAD-linked and NAD -linked isocitrate dehydrogenases from Candida tropicalis / S. Nabeshima at al. // Agr. and Biol. Chem. 1977. - Vol. 41, № 3. - P. 509-516.

292. Parker L. Alpha-lipoic acid as a biological antioxidant / L. Paeker, E.H. Witt, H.T. Tritschler // Free Radic. Biol. Med. 1995. - № 31. - P. 1287-1312.

293. Paus R. Neurobiologie der haut: Apoptose / R. Paus, A. Menrad, B. Czameizki // Hautarzt. 1995. - Vol. 46, № 3. - P. 285-303.

294. Pharmacokinetics of different formulations of tioctic (alpha-lipoic) acid in healthy volunteers / F. Amenta et al. // Clin. Exp. Hypertens. 2008. - Vol. 30, № 8.-P. 767-775.

295. Pharmacological utility of melatonin in reducing oxidative cellular and molecular damage / R.J. Reiter et al. // Pol. J. Pharmacol. 2004. - Vol. 56, № 2. -P. 159-170.

296. Plasma kinetics, metabolism, and urinary excretion of alpha-lipoic acid following oral administration in healthy volunteers / J. Teichert et al. // J Clin Pharmacol. 2003. - Vol. 43, № 11. - P. 1257-1267.

297. Plaut G.W. Isocitrate dehydrogenase (DPN-specific) from bovine heart / G.W. Plaut // Methods Enzymol. 1969. - Vol. 13, № 1. - P. 34-42.

298. Plaut G.W. a-Methylisocitrate a selective ingibitor of TPN-linked isocitrate dehydrogenase from bovine heart andrat liver / G.W. Plaut, R.L. Beach, T. Aogaichi // J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250, № 16. - P. 6351-6354.

299. Polymeric forms of yeast nicotinamide-adenine dinucleotide-specific isocitrate dehydrogenase in the presence of various ligands / G.Koning at al. // Ital. J. Biochem. 1977. - Vol. 26, № 6 - P. 473^86.

300. Popova T.N. Activity regulation of NAD- and NADP-specific isocitrate dehydrogenases from maize by some organic and amino acids / T.N. Popova, E.C.V. Kakanaku // Annu. Symp. Phys.-Chem. Basis Plant Physiol. -1996.-35 p.

301. Popova T.N. Citrate and isocitrate in plant metabolism / T.N. Popova, M.A.A. Pinheiro de Carvalho // Biochim. et Biophys. Acta 1998. - Vol. 1364, №3.-P. 307-325.

302. Porpacxy Z. Interection between NAD dependent isocitrate dehydrogenase, a-Ketoglutarate dehydrogenase complex, and NADH: ubiquinion oxidoreductase / Z. Porpacxy, B. Sumegi, I. Alkonyi // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262, №20.-P. 9509-9514.

303. Preventive effect of melatonin on the progression of carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats / Y. Ohta et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1999. - Vol. 467. - P. 327-332.

304. Protective effect of low dose of melatonin against cholestatic oxidative stress after common bile duct ligation in rats / M. Esrefoglu et al. // World J. Gastroenterol.-2005.-Vol. 11, № 13.-P. 1951-1956.

305. Protective effects of intracellular reactive oxygen species generated by 6-formylpterin on tumor necrosis factor-alpha-induced apoptotic cell injury in cultured rat hepatocytes / H. Ishi et al. // Life Sci.- 2005.- Vol.77, № 8. P. 858-868.

306. Protective effects of melatonin against formaldehyde-induced oxidative damage and apoptosis in rat testes: an immunohistochemical and biochemical study / O.A. Ozen et al. // Syst. Biol. Reprod. Med. 2008. - Vol. 54, № 4-5. - P. 169176.

307. Rafalowska V. NADP-dependent isocitrate dehydrogenase from rat brain cytosole/ V. Rafalowska, A. Pastuszko, A. Gromek // Bull. Acad. Pol. Sci. Ser. Sci. Biol. 1974. - Vol. 22, № 7-8. - P. 453-459.

308. Ramachandran N. Kinetic isotope effects in the NAD and NADP-specific isocitrate dehydrogenase of pig heart / N. Ramachandran, M. Durbano, R.F. Colman//FEBS Lett. 1974.-Vol. 49, № l.-P. 129-133.

309. Réévaluation of molecular waight of pig heart NAD-specific isocitrate dehydrogenas / R.S. Ehrlich at al. // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256, № 20. - P. 10560-10564.

310. Regulated targeting of BAX to mitochondria / I.S. Goping et al. // Cell Biol. 1998,- Vol. 143, № l.-P. 207-215.

311. Regulation of Hsp27 oligomerization, chaperone fanction and protective activity against oxidative stress, tumor necrosis factor a byphosphorilation / T. Rogalla et al. // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 277. - P. 1894718956.

312. Regulation of ionizing radiation-induced apoptosis by mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase / J.H. Lee et al. // J. Biol. Chem. — 2007. Vol. 282, № 18. - P. 13385-13394.

313. Regulation of singlet oxygen-induced apoptosis by cytosolic NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase / S.Y. Kim // Mol. Cell Biochem. 2007. - Vol. 302, № 1-2. - P. 27-34.

314. Regulation of tumor necrosis factor cytotoxicity by calcineurin / S.P. Kantrow et al. // FEBS Lett. 2000. - Vol. 483, № 2-3. - P. 119-124.

315. Regulatory of isocitrate dehydrogenase by phosphorylation involves no long-rang conformation change in the free enzyme / J.H. Hurley // J. Biochem. — 2005.-Vol. 280, № 11.-P. 10846-10854.

316. Renal effects of a-ketoglutarate early after coronary operations / A. Jeppsson et al. // J. Thorac Cardiovasc. Surg. 1998. - Vol. 65. - P. 684-690.

317. Requena J.R Glutamic and aminoadipic semialdehydes are the main carbonyl products of metal-catalyzed oxidation of proteins. / J.R. Requena et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. - Vol. 98. - P. 69-74.

318. Resveratrol ameliorates hepatic injury via the mitochondrial pathway in rats with severe acute pancreatitis / H. Sha et al. // Eur. J. Pharmacol. 2008. -Vol. 60, № l.-P. 136-142.

319. Robinson J.B. Organization of krebs tricarboxylic acid cycle enzymes inmitochondria / J.B. Robinson, P.A. Srere // J. Biol. Chem. 1985. - Vol. 260, № 19.-P. 10800-10805.

320. Role of anti-tumor necrosis factor-alpha in ischemia/reperfusion injury in isolated rat liver in a blood-free environment / Z. Ben-Ari et al. // Transplantation. 2002. - Vol. 73, № 12. - P. 1875-1880.

321. Role of NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase (NADP+-ICDH) on cellular defence against oxidative injury by gamma-rays / S.H. Lee et al. // Int. J. Radiat. Biol. 2004. - Vol. 80, № 9. - P. 635-642.

322. Role of tumor necrosis factor alpha and sphingomyelin cycle activation in the induction of apoptosis by ischemia/reperfusion of the liver / A.V. Alessenko et al. // Biochemistry (Mosc). 2002. - Vol. 67, № 12. - P. 1347-1355.

323. Role of tumor necrosis factor-alpha in the development of spontaneous hepatic toxicity in Long-Evans Cinnamon rats / R.N. Fong et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol.-2004.-Vol. 200, №2.-P. 121-130.

324. Roles for C16-ceramide and sphingosine 1-phosphate in regulating hepatocyte apoptosis in response to tumor necrosis factor-alpha / Y. Osawa et al. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280, № 30. - P. 27879-27887.

325. Sanwal B.D. Control of DPN-specific isocitrate dehydrogenase activity by precursor activation and end product inhibition / B.D. Sanwal, M.W. Zink, C.S. Stachow // Biochem. and Biophys. Res. Communs. 1963. - Vol. 12, № 6.-P. 510-515.

326. Schinoni M.I. Apoptosis and progression of hepatic fibrosis in liver diseases / M.I. Schinoni, R. Paraná // Acta Gastroenterol Latinoam. 2006. - Vol. 36, №4.-P. 211-217.

327. Serum malondialdehyde possible use for the clinical management of chronic hepatitis C patients / J.M. Romero et al. // Free Radie. Biol, and Med. -1998. Vol. 25, № 9. - P. 993-997.

328. Shedding of Fas ectodomain that affects apoptosis of hepatocytes occurring in regenerative liver / M. Xia et al. // J. Gastroenterol. 2002. - Vol. 37, № 12.-P. 1042-1047.

329. Shin S.W. Silencing of mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase by small interfering RNA enhances heat shock-induced apoptosis /

330. S.W. Shin, I.S. Kil, J.W. Park // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. - Vol. 366, №4.-P. 1012-1018.

331. Silencing of cytosolic NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase by small interfering RNA enhances the sensitivity of HeLa cells toward staurosporine / S.M. Lee et al. // Free Radic. Res. 2009. - Vol. 43, № 2. - P. 165-173.

332. Smyth G.E. Inactivation of pig heart NADP-specificisocitrate dehydrogenase by two affinity reagents is due reaction with acysteine not essential for function / G.E. Smyth, R.F. Colman // Arch. Biochem. and Biophys. 1992. -Vol. 293, №2. -P.356-361.

333. Solaini G. Biochemical dysfunctuion in heart mitoxondria exposed toischemia and reperfusion / G. Solaini, D.A. Harris // J. Biochem. 2005. - Vol. 390.*-P. 377-394.

334. Structures of human cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase reveal a novel self-regulatory mechanism of activity / Xiang Xu et al. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, № 32. - P. 33946-33957.

335. Studies on the isocitrate dehydrogenase. Some properties of beet heart muscle / I.Higashi et al. // Biochem. 1965. - Vol. 57, № 6. - P. 793-798.

336. Subcellular location and some properties of isocitrate dehydrogenase isozymes in Euglena gracilis / Y. Oda at al. // Arg. and Biol. Chem. 1981. - Vol. 45, № 11.-P. 2619-2621.

337. Suppression of inhibitory effects of copper on enzymatic activities by copper-binding substances from Athyrium yokosceuse assayed in vitro / H. Nishizono et al. // Plant and Cell Physiol. 1989. - Vol. 30, №4. - P. 565-569.

338. Tabatabaie T. Inhibition of the cytokine-meducible nitric oxide synthase expression in rat insulinoma cells by phenyl N-tert-bunylnitrone. / T. Tabatabaie, K.L. Graham // Nitric Oxide. 2000. - Vol. 4(2). - P. 157-167.

339. Tezuka T. Isolation and characterization of inner membrane-associated and matrix NAD-specific isocitrate dehydrogenase in potato mitochondria / T. Tezuka, G. Laties // Plant Physiol. 1983. - Vol. 72, № 6. - P. 959-963.

340. The effect of melatonin on liver superoxide dismutase activity, serum nitrate and thyroid hormone levels / G. Oztiirk et al. // Japanese Journal of Physiology. 2000. - Vol. 50. - P. 149-153.

341. The effects of antioxidant lipolic acid on beef longisimus bloom time / G. Rentfrow et al. // J. Amin. Sci. 2004. - Vol. - 82. - P. 3034-3037.

342. The mitochondrial permeability transition is required for tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis and cytochrome c release / C.A. Bradham et al. // Mol. Cell Biol. 1998. - Vol. 18, №. 11. - P. 6353-6364.

343. The mitogenic activity of the liver growth factor is mediated by tumor necrosis factor alpha in rat liver / J.J. Diaz-Gil et al. // J. Hepatol. 2003. - Vol. 38, № 5. - P. 598-604.

344. The plasma pharmacokinetics of R-(+)-lipoic acid administered g.s sodium R-(+)-lipoate to healthy human subjects / D.A. Carlson et al. // Altem. Med. Rev. 2007. - Vol. 12, № 4. - P. 343-351.

345. The sensory symptoms of diabetic polyneuropathy are improved with ex-lipoic acid / A.S. Amerov et al. // Emerging Treatments and Technologies. — 2003. Vol. 26, № 6. - P. 770-776.

346. Tietz N.W. Fundamentals of Clinical Chemistry / N.W. Tietz. -Philadelphia: W.B. Saundres Co, 1976.-235 p.

347. TNF-alpha induces apoptosis through JNK and Bax-dependent pathway in differentiated, but not naive PC12 cells / L. Zhang et al. // Cell Cycle. 2007. -Vol. 6, № 12. - P. 1479-1486.

348. TNF-alpha-induced impairment of mitochondrial integrity and apoptosis mediated by caspase-8 in adult ventricular myocytes / J. Zhu et al. // Cytokine. — 2006. Vol. 34, № 1-2. - P. 96-105.

349. Transforming growth factor beta and tumor necrosis factor alpha inhibit both apoptosis and proliferation of activated rat hepatic stellate cells / B. Saile et al. // Hepatology. 1999. - Vol. 30, № 1. - P. 196-202.

350. Tulsawani R. Effect of alpha-ketoglutarate on cyanide-induced biochemical alterations in rat brain and liver / R. Tulsawani, R. Bhattacharya // Biomed. Environ. Sci. 2006. - Vol.19, № l.-P. 61-66.

351. Tumor necrosis factor alpha produces insulin resistance in skeletal muscle by activation of inhibitor kappaB kinase in a p38 MAPK-dependent manner / C. de Alvaro et al. // J Biol Chem. 2004. - Vol. 279, № 17. - P. 17070-17078.

352. Tumor necrosis factor induces apoptosis in hepatoma cells by increasing Ca2+ release from the endoplasmic reticulum and suppressing Bcl-2 expression / B.C. Kim et al. // J. Biol. Chem. -2002. Vol. 277, № 35. - P. 31381-31389.

353. Tumor necrosis factor-a-indused activating protein-1 activity is modulated by nitric oxide-modulated proteine kinase G fctivation / N. Gertzberg // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2000. - Vol. 22. - P. 105-115.

354. Tumor necrosis factor-alpha induces c-jun during the regenerative response to liver injury / A.M. Diehl et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1994. - Vol. 267. - P. G552-G561.

355. Tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in hepatocytes in long-term culture / E.S. Bour et al. // Am. J. Pathol.- 1996.- V. 148, № 2.- P. 485-495.

356. Tumor necrosis factor-induced hepatocyte apoptosis precedes liver failure in experimental murine shock models / M. Leist // Am. J. of Pathology.1995.- V. 146.- P.1220-1234.

357. Turrens J.F. Mitohondrial formation of reactive oxygen spiecies / J.F. Turrerens // J. Physiol. 2003. - Vol. 552. - P. 335-344.

358. Two NAD-isocitrate dehydrogenase forms in Phycomyces blakesleeanus: induction in response to acetate and characterization, kinetics, and regulation of both enzyme forms / E. Alverez-Villatane et al. // Biochemistry.1996.-Vol. 35.-P. 4741-4752.

359. Vannucci S.J. Hypoxia-ischemia in immaturen brain / S.J. Vannucci, H. Harberg // The J. Exsper. Biol.Clin. Pathol. 2004. - Vol. 207. - P. 3139-3154.

360. Waetzig V. Context-specific inhibition of JNKs: overcoming the dilemma of protection and damage / V. Waetzig, T. Herdegen // Trends Pharmacol. Sci. 2005. - Vol. 26, № 9. - P. 455-461.

361. Wang J.Y. Hypoxia and reoxygenation induces nitric oxide and TNF-alpha release from cultured microglia but not astrocytes of the rat / J.Y. Wang et al. // Chin. J. Physiol. 2007. - Vol. 50, № 3. - P.127-134.

362. Willenborg M. Triggering and amplification of insulin secretion by dimethyl alpha-ketoglutarate, a membrane permeable alpha-ketoglutarate analogue / M. Willenborg, U. Panten, I. Rustenbeck // Eur. J. Pharmacol. 2009. - Vol. 607, № 1-3.-P. 41-46.

363. Willson VJ. The effect of ligands on the irreversible inhibition of the NAD+-dependent isocitrate dehydrogenase from ox brain / V.J. Willson, K.F. Tipton

364. Eur. J. Biochem. 1981. - Vol. 117. - P. 65-68.

365. Willson V.J. The effect of pH on the allosteric behavior of ox-brain NAD-dependent isocitrate dehydrogenase / V.J.Willson, K.F.Tipton // Eur. J.

366. Biochem. 1980. - Vol. 109, № 2. - P. 411-416.

367. Wollin S.D. a-Lipoic acid and cardiovascular disease / S.D. Wollin,

368. J.H. Jones // J. Nutr. 2003. - Vol. 133. - P. 3327-3330.

369. Yilmaz S. Effects of melatonin and vitamin E on oxidative-antioxidative status in rats exposed to irradiation / S. Yilmaz, E. Yilmaz //

370. Toxicology. 2006. - Vol. 222, № 1-2. - P. 1-7.

371. Zhang M. Tumor necrosis factor / M. Zhang, K.J. Tracey // The

372. Cytokine Handbook. 1998. - Vol. 3. -P. 515-548.

373. Zhao W. Affinity purification and kinetic analysis of mutant forms ofyeast NAD+-specific isocitrate dehydrogenase / W. Zhao, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, № 35. - P. 21811-21817.

Информация о работе

Цветикова, Любовь Николаевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Регуляция активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени крыс при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы