Свойства и регуляция активности НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ в условиях оксидативного стресса в миокарде крыс при ишемии

Сафонова, Ольга Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства и регуляция активности НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ в условиях оксидативного стресса в миокарде крыс при ишемии
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства и регуляция активности НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ в условиях оксидативного стресса в миокарде крыс при ишемии"

На правах рукописи

Сафонова Ольга Анатольевна

СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ НАД- И НАДФ-МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗ В УСЛОВИЯХ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В МИОКАРДЕ КРЫС ПРИ ИШЕМИИ

Специальность 03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2004

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Попова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ершова Антонина Николаевна;

кандидат биологических наук, доцент Наквасина Марина Александровна

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 29 декабря 2004 года в> Мчасов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, биолого-почвенный факультет

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан ноября 2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из важнейших проблем биохимии является исследование функционирования метаболических систем разного уровня в условиях развития патологического процесса. Согласно современным воззрениям, в основе патогенеза многих заболеваний, в том числе и заболеваний сердечно-сосудистой системы, лежит нарушение баланса между интенсивностью свободнорадикальных процессов и активностью антиокси-дантных систем (АОС) организма (Ланкин и др., 2000; Бурлакова, 1980; Меер-сон и др., 1982). Активные формы кислорода (АФК), выполняющие в организме ряд функций, при интенсификации их образования способны приводить к нарушению клеточного метаболизма и, как следствие, к гибели клеток (Кулин-ский, 1999). Интенсивность свободнорадикальных процессов, в которых принимают участие АФК, регулируется сложной, многоступенчатой системой ан-тиоксидантной защиты (Young, Woodside, 2001). Предполагается, что одним из механизмов подавления процессов СРО в митохондриях может служить инги-бирование ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) (Skulachev, 1996). В этой связи вызывает интерес функционирование НАД-зависимой малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37; НАД-МДГ), катализирующей в ЦТК обратимое превращение маната в оксалоацетат. Цитоплазматическая форма НАД-МДГ участвует в обеспечении транспорта метаболитов между клеточными компартментами. Имеются данные о значительной роли субстрата МДГ -малата - в биохимической адаптации организма к гипоксии (Глотов, Шмелева, 1973). Способность малата диффундировать в митохондрии, передавая восстановительные эквиваленты в электрон-транспортную цепь (ЭТЦ), и повышать коэффициент дыхательного контроля митохондрий сердца (Малюк, 1977), а также высокое содержание МДГ по сравнению с другими дегидрогеназами субстратов цикла Кребса (Pette et al., 1962) подчеркивают ее важное место в регуляции редокс-потенциала кардиомиоцитов. Все эти факты, наряду со способностью малата играть существенную роль в первичной реакции на стрессовые воздействия из-за возможности его быстрой утилизации, позволяют сделать предположение о возможном участии МДГ в регуляции образования АФК в условиях окислительного стресса. Кроме того, нельзя исключить, что НАДФН, образующийся в реакции обратимого превращения малата в оксалоацетат, катализируемой НАДФ-зависимой МДГ (КФ 1.1.1.82; НАДФ-МДГ), может использоваться при функционировании глутатионредуктазной / глутатионперок-сидазной системы - одной из важнейших ферментативных АОС организма. Хотя традиционно принято считать, что основным поставщиком НАДФН в клетке является пентозофосфатный путь, однако в кардиомиоцитах активность ферментов данного пути значительно ниже, чем в других органах (Диксон, Уэбб, 1982) и в качестве дополнительного источника НАДФН в клетках миокарда могут выступать другие ферменты, например, НАДФ-специфичная изоцитратде-гидрогеназа (Медведева, 2002).

Таким образом, иследование особенностей функционирования НАД- И НАДФ-зависимых МДГ при усилении

КИБЛИОТМА Г

! «ГЖЩ

ческого повреждения ткани миокарда может способствовать выяснению механизмов регуляции свободнорадикальных процессов и образования АФК, что может иметь значение для понимания развития патологического состояния организма и путей его коррекции.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось исследование кинетических свойств и регуляции активности НАД- и НАДФ-МДГ из сердца крысы при оксидативном стрессе, вызванном ишемическим повреждением ткачи миокарда. В связи с целью работы были поставлены следующие задачи: 1) определение интенсивности процессов СРО в субклеточных фракциях кардиомиоцитов крыс в норме и в динамике развития экспериментальной ишемии миокарда; 2) определение активностей и субклеточной локализации НАДи НАДФ-МДГ в клетках миокарда в норме и при ишемии; 3) получение высо-коочищенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-зависимых МДГ из нормального и ишемизированного миокарда крысы; 4) сравнительная характеристика кинетических параметров каталитического действия НАД- и НАДФ-МДГ из сердца контрольных животных и крыс, подвергшихся воздействию экспериментальной ишемии; 5) исследование регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ из сердечной мышцы крысы в норме и при патологии, 6) создание гипотетической модели участия НАД- и НАДФ-МДГ в регуляции интенсивности СРО в клетках миокарда в условиях ишемического повреждения ткани.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование функционирования НАД- и НАДФ-МДГ в кардиомиоцитах крысы в условиях увеличения интенсивности процессов СРО при ишемии. Разработаны процедуры выделения и очистки и получены гомогенные препараты различно локализованных изоформ НАД- и НАДФ-МДГ из нормального и ишемизированного миокарда крыс. Впервые дана сравнительная характеристика каталитических свойств и регуляции активности данных ферментов в сердечной мышце в норме и при экспериментальной ишемии миокарда. Выявлено изменение активности, кинетических и регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ в условиях окислительного стресса, вызванного ишемией. Предполагается участие НАД- и НАДФ-МДГ в регуляции генерирования АФК и интенсивности СРО в условиях ишемического повреждения ткани. Полученные данные свидетельствуют, что контроль образования АФК может осуществляться за счет изменения активности данных ферментов, происходящего в результате модификации кинетических свойств и регуляции активности под действием ионов металлов Fe2+, Ca2+, пероксида водорода, глутатиона, интермедиатов цикла Кребса и адениннуклео-тидов. Полученные данные способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений об организации, регуляции и механизмах сопряжения выработки АФК с функционированием ключевых ферментов клеточного метаболизма в условиях нормы и патологии сердца.

Практическая значимость. Исследование особенностей кинетических и регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ в условиях окислительного стресса, развивающегося при ишемии миокрада, способствует выяснению механизмов регуляции образования АФК что играет существенную роль в понимании раз-

вития патологического процесса и поиске путей его коррекции в медицинской практике.

Разработанные способы получения высокоочищенных препаратов НАДи НАДФ-МДГ из миокарда крысы могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», «Медицинская биохимия» (для студентов физического факультета), спецкурсов по энзимологии и аналитической биохимии. Кроме того, они используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 6ой, 7ой и 8ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2002, 2003, 2004), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2002), III Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2003), конференции молодых ученых ВГМА «Перспективы развития теоретической и практической медицины» (Воронеж, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 3-ей междисциплинарной конференции с международным участием "НБИТТ-21" (Петрозаводск, 2004), X Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов» (Воронеж, 2004), VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), VI Съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2004), ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2004).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 18 публикациях - 8 статьях и 10 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В условиях интенсификации СРО при экспериментальной ишемии миокарда происходит снижение активности НАД-МДГ в митохондриях и цитоплазме клеток миокарда и увеличение активности НАДФ-МДГ в цито-плазматической фракции клеток сердца крысы. С использованием гомогенных ферментных препаратов различно локализованных форм НАД-МДГ и цитоплазматической НАДФ-МДГ показано, что в условиях патологии изменяется ряд кинетических параметров каталитического действия и регуляции активности ферментов под действием ионов металлов Fe2+, Cu2+, Ca2+, пероксида водорода, глутатиона, интермедиатов цикла Кребса и адениннуклеотидов.

2. Ряд модификаций регуляторных свойств митохондриальной и цитоплаз-матической НАД-МДГ, характерных для фермента из ишемизированного миокарда, такие как повышение степени ингибирования ионами Fe2+, Cu2+, некоторыми интермедиатами цикла Кребса, ингибирование восста-

новленным глутатионом, могут приводить к снижению активности НАД-МДГ, сопровождающимся торможением ЦТК при ишемии и, как следствие, окислению ферментов ЭТЦ - восстановителей От до Оз

3. Имеет место ряд изменений регуляторных свойств НАДФ-МДГ из ише-мизированной ткани миокарда по сравнению с нормой (снижение чувствительности к ингибирующему действию пероксида водорода, отсутствие ингибирования окисленным глутатионом), которые могут способствовать стимуляции фермента. Это может отражаться на активности глутатион-редуктазной / глутатионпероксидазной АОС через изменение содержания НАДФН в клетке.

4. С учетом полученных данных по исследованию функционирования НАДи НАДФ-МДГ в миокарде крысы в условиях ишемии предложена гипотетическая схема, отражающая их возможное участие в регуляции интенсивности СРО.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 264 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы (383 источника) и приложения. Иллюстративный материал включает 38 рисунков и 14 таблиц. В приложении содержатся 37 рисунков и 3 таблицы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали взрослых лабораторных белых крыс (КаИш гайш Е.), самцов, массой 250-300 г. В опытах использовали здоровых крыс и крыс, подвергшихся воздействию экспериментальной ишемии миокарда.

Созданиемоделиэкспериментальной ишемии миокарда (ЭИМ)у крыс. Животным под общим наркозом в условиях спонтанного дыхания производили срединную торактомию. Ишемию миокарда моделировали путем окклюзии нисходящей ветви левой коронарной артерии (Браунвальд, 1975; Меерсон, 1984). Для этого после торактомии под левую коронарную артерию подводили лигатуру с шелковой нитью и пережимали ее на уровне левого ушка предсердия до полного прекращения кровоснабжения.

Оценка оксидативного статуса клеточныхорганоидов кардиомиоци-тов крысы. Для разделения цитоплазматической и митохондриальной фракций клеток миокарда использовали метод дифференциального центрифугирования (Прохорова, 1982). Для оценки интенсивности свободнорадикальных процессов в ткани миокарда в норме и при ишемии применяли метод индуцированной пе-роксидом водорода с сульфатом железа биохемилюминесценции (БХЛ), а также спектрофотометрически определяли содержание в ткани первичных и вторичных продуктов пероксидного окисления липидов - диеновых конъюгатов и малонового диальдегида. При использовании метода БХЛ регистрировали и анализировали следующие показатели: максимальную интенсивность сигнала (1тах) и светосумму медленной вспышки (8), а также тангенс угла падения кинетиче-

ской кривой (tga2) и коэффициент К, определяемый по отношению Imax/S. Содержание диеновых конъюгатов в субклеточных фракциях кардиомиоцитов определяли в экстрагированной гептановой фазе липидов при 233 нм. Определение концентрации малонового диальдегида проводили по качественной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Стальная, Гаришвили, 1977).

Определение активности ферментов. Активность НАД- и НАДФ-МДГ определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, определяемой скоростью образования или расходования НАДН или НАДФН соответственно. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмо-ля продукта реакции за 1 мин. при температуре 25 С. Активность ферментов выражали в ферментативных единицах (ФЕ) на 1 мг белка или ФЕ в расчете на 1 г массы материала. Активность СДГ определяли при 600 нм (Cooper, Beevers, 1969); активность ЛДГ - при 340 нм (Кочетов, 1980). Общий белок определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Выделение и очистка исследуемых ферментов. Для получения высоко-очищенных препаратов НАД- и НАДФ-МДГ были разработаны процедуры, включающие несколько стадий. В ходе выделения НАДФ-МДГ после гомогенизации материала проводили фракционирование белков сульфатом аммония. Для выделения НАД-МДГ проводили разделение субклеточных фракций миокарда методом дифференциального центрифугирования. От низкомолекулярных соединений ферменты отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25. После гель-фильтрации на сефадексе G-25 использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографию на сефадексе G-150. Контроль гомогенности ферментов осуществляли методом электрофореза в поли-акриламидном геле (ПААГ) по Дэвису (Davis, 1964). Все операции проводили в холодной камере при 0-4°С.

Определение молекулярной массы ферментов. Молекулярную массу ферментов определяли методом гель-фильтрации.

Исследование кинетических и регуляторных свойств. Кинетические и регуляторные свойства ферментов в норме и при ишемии изучали на высоко-очищенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, ингибирования и активации осуществляли по Диксону и Уэббу (1982). Коэффициент Хилла определяли по методу Курганова (1978).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-4-х кратной биологической повторности, аналитические определения для каждой пробы - в 2-х кратной повторности. Обработку результатов опытов проводили с использованием стандартных методов. Обсуждаются различия при Р<0,05 (Ллойд, Ледерман, 1990).

ОЦЕНКА ОКСИДАТИВНОГО СТАТУСА И АКТИВНОСТЕЙ НАД- И НАДФ-МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗ В МИОКАРДЕ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ

Полученные значения параметров БХЛ - 1тах, tg а2, в субклеточных фракциях клеток миокарда крыс в норме и при патологии представлены в таблице 1. Установлено, что в условиях ишемии наблюдается повышение значений 8 и 1тах как в цитоплазматической, так и в митохондриальной фракциях кар-диомиоцитов, причем степень их увеличения зависит от длительности ишемии. Так, после 40-минутной ишемии в цитоплазматической фракции кардиомиоци-тов значения 8 и 1тах увеличены в 2,5 и 2,9 раза по сравнению со значениями в норме соответственно. В митохондриальной фракции миокарда данные параметры возрастают в условиях 40-минутной коронароокклюзии в 1,8 и 2,1 раза соответственно. Данные изменения свидетельствуют об интенсификации процессов свободнорадикального окисления в миокарде в условиях оксидативного стресса, вызванного ишемическим повреждением ткани. При этом анализ величин, характеризующих антиоксидантный потенциал - тангенс угла падения кинетической кривой ^а2) и коэффициент к, определяемый по соотношению 1тах/8, свидетельствует о том, что в условиях оксидативного стресса происходит мобилизация компенсаторных механизмов, направленные на снижение уровня свободнорадикальных процессов в организме.

Таблица 1.

Параметры биохемилюминесценции в цитоплазматической (ЦТП) и митохондриальной (МТХ) фракциях кардиомиоцитов крысы в норме и при экспериментальной ишемии различной длительности_

Условия опыта Субклет. фракция Светосумма медленной вспышки (S), тУ*сек Интенсивность максимальной ВСПЫШКИ (I ). mV Тангенс угла падения кинетической кривой ^а?) Коэффициент к (Inm/S)

Норма ЦТП 5.15 ±0.23 0.89 ± 0.04 0.253 + 0 011 0,173 ±0007

МТХ 1.95 ±0,09 0.45 ±0,02 0.162 ±0,009 0.230 ±0.012

Ишемия 10 мин. ЦТП 6,42 ± 0.32* 1,15+0.04* 0,280±0,013* 0,179 ±0.006*

МТХ 2.1 ±0,1 0,50± 0.03 0.199±0,008* 0,238 ±0,015*

Ишемия 20 мин. ЦТП 8,05 ± 0,30* 1,92±0,08* 0,398±0,020* 0,239 ±0,014*

МТХ 2,84 ±0,15* 0,78 ±0,04* 0,264±0,013* 0,275 ±0,016*

Ишемия ЦТП 10,85±0,58* 2,22 ±0,09* 0,393 ±0,017* 0,205 ± 0,007*

30 мин. МТХ 3,22 ±0,17* 0,87±0,06* 0,252 ±0,014* 0,271 ±0,014*

Ишемия 40 мин ЦТП 13.05 ± 0,58* 2,58±0.11* 0,385 ±0.017* 0.200 ±0.011*

МТХ 3.53±0.15* 0,95 ±0,04* 0,246 ±0,012* 0,270 ±0,014*

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (уровень значимости Р<0,05)

Однако при тяжелых стрессорных и ишемических повреждениях мощность естественных антиоксидантных систем оказывается недостаточной - pea-

лизуется выраженная активация ПОЛ, что может приводить к накоплению продуктов данного процесса. Согласно полученным результатам, в условиях экспериментальной ишемии миокарда (ЭИМ) в кардиомиоцитах происходит увеличение содержания ДК и МДА, степень выраженности которого коррелирует с длительностью ишемического воздействия. Так, после 40-минутной ишемии в цитоплазматической фракции кардиомиоцитов крысы концентрация ДК и МДА возрастает в 5,8 и 4,6 раза, в митохондриальной фракции - в 3,3 и 2,7 раза соответственно (таблица 2). Таким образом, проведенные исследования показывают, что в миокарде крыс, подвергшихся воздействию экспериментальной ишемии, происходит значительное усиление свободнорадикальных процессов и накопление продуктов ПОЛ.

Таблица 2.

Содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ в субклеточных фракциях кардиомиоцитов крыс в норме и при экспериментальной ишемии

различной длительности

Фракция миокарда Условия опыта ДК, мкмоль/г сырой массы-10-5 МДА, мкмоль/г сырой массы-10-55 Соотношение МДА/ДК

Цитоплазма Норма 1,40 + 0.06 0.142 ±0,007 0,101 ±0,004

ЭИМ 10 мин. 2.79 + 0.12* 0.220 ±0,010* 0.079 ± 0.002*

ЭИМ 20 мин. 5,85 ±0.23* 0,390 ±0,016* 0,067 ± 0.003*

ЭИМ 30 мин. 7,10 + 0,36* 0,510 ±0.031* 0,072 ± 0.002*

ЭИМ 40 мин. 8,12 ±0.32* 0,650 ± 0,029* 0,080 ± 0,004*

Митохондрии Норма 0,45 ± 0.02 0.048 ± 0.003 0,107 ±0,005

ЭИМ 10 мин. 0,50 ± 0,02* 0,061 ± 0,003* 0,122 ±0.007*

ЭИМ 20 мин. 0,83 ± 0,04* 0,096 ± 0,004* 0,116 ±0,005*

ЭИМ 30 мин. 1,29 ±0.07* 0,110 ±0,005* 0,085 ± 0,004*

ЭИМ 40 мин. 1,47 ±0.05* 0.13 ±0.005* 0.088 ± 0,003*

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (уровень значимости Р<0,05.

Таблица 3.

Активность НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ в субклеточных фракциях кар-диомиоцитов крысы в норме и при ишемии различной длительности

Условия опыта Удельная активность. ФЕ/мг белка

Цитоплазматическая НАДФ-МДГ Цитоплазматическая НАД-МДГ Митохондриальная НАД-МДГ

Норма 0.20±0,01 0,0250±0,0010 0,90±0,04

Ишемия 10 мин. 0.22±0,01 0,0210±0.0022* 0,79±0,07

Ишемия 20 мин. 0.26±0,02* 0,0167±0,0009* 0,51±0,02*

Ишемия 30 мин. 0,29±0,02* 0.0119±0,0006* 0,40±0,03*

Ишемия 40 мин. 0,32±0.01* 0.0096±0,0005* 0,34±0,02*

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (уровень значимости Р<0,05)

Показано, что активность НАД-МДГ связана как с цитоплазматической, так и с митохондриальной фракциями. При этом основная доля активности НАД-МДГ клеток сердечной мышцы крысы (-75%) локализована в митохондриях, и около 25% от общей активности приходится на цитоплазматическую

фракцию. Выязлено, что активность НАД-МДГ снижается в 2,6 раза при ЭИМ длительностью 40 минут как в цитоплазматической, так и в митохондриальной фракциях. Необходимо отметить, что субклеточная локализация данного фермента в условиях ишемии не изменяется по сравнению с его распределением по клеточным фракциям в норме. Что касается НАДФ-зависимой МДГ, то было установлено, что в условиях 40-минутной ЭИМ происходит повышение активности данного фермента в 1,6 раза. Показано, что НАД Ф-МДГ как в норме, так и при ишемии локализована в цитоплазматической фракции кардиомиоцитов (таблица 3).

ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ И РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ НАД-ЗАВИСИМОЙ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ СЕРДЦА КРЫСЫ В НОРМЕ И ПРИ ИШЕМИИ

В результате применения разработанной процедуры очистки были получены очищенные в 91,4 и 95,5 ферментные препараты цитоплазматической НАД-МДГ с удельной активностью 2,29 и 0,92 ФЕ/мг белка из нормальных и ишемизированных кардиомиоцитов крысы соответственно. Выход при этом составил 25,2 и 24,4% для фермента из нормального и ишемизированного миокарда. Из митохондрий сердца здоровых крыс и животных, подвергшихся воздействию ЭИМ, была получена НАД-МДГ с удельной активностью 26,8 и 10,6 ФЕ/мг белка и выходом 13,0 и 13,6%. Степень очистки при этом была более чем 127- и 132-кратной соответственно. С помощью электрофореза было показано, что НАД-МДГ после хроматографии на сефадексе 0-150 во фракциях с максимальной активностью была гомогенна. Величина электрофоретической подвижности И, составляла 0,65 и 0,58 для цитоплазматической и митохондриаль-ной форм НАД-МДГ соответственно.

Молекулярные массы митохондриальной и цитоплазматической НАД-МДГ из сердца крысы, определенные методом гель-хроматографии на сефадексе 0-150, составили 73±3 кДа и 77±4 кДа соответственно. При определении молекулярных масс данных изоформ фермента из ишемизированного миокарда различий по сравнению с нормой не было обнаружено, что позволяет предполагать, что изменение активности НАД-МДГ при патологии не связано с ограниченным протеолизом или реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции.

С использованием очищенных ферментных препаратов было проведено исследование каталитических и регуляторных свойств цитоплазматической и митохондриальной НАД-МДГ из сердца крысы в норме и при патологии, В таблице 4 отражены кинетические параметры каталитического действия НАД-МДГ из нормального и ишемизированного миокарда. Согласно полученным результатам, в условиях ишемии наблюдается изменение сродства митохондри-альной и цитоплазматической НАД-МДГ к субстрату и коферменту. Небольшие сдвиги оптимального диапазона рН для изоформ фермента, выделенного из ишемизированного сердца крысы, в более кислую область могут быть следствием изменения рН в клеточных компартментах, происходящего при прекра-

щении кровоснабжения ткани, поскольку известно, что одной из характерных черт ишемии является ацидоз (Гацура, 1993). Согласно полученным результатам, величины рК функциональных групп для митохондриальной и цитоплаз-матической изоформ исследуемого фермента находятся в пределах рК а-аминогруппы, имидазольной группы гистидина и а-аминогруппы цистина. Изменение величины температурного оптимума в случае НАД-МДГ из ишемизи-рованного сердца по сравнению со значениями в норме может являться следствием конформационных перестроек в структуре фермента, что приводит к изменению его свойств.

Таблица 4.

Физико-химические параметры НАД- и НАДФ-зависимых малатдегидрогеназ из ^ субклеточных фракций кардиомиоцитов крысы в норме и при ишемии

Фермент

Фрак -ция

Опыт Коэфф-т Хилла поОА Значения Км, мМ К,, по ОА,мМ рНогтт чэпт»

ОА НАДФН надн

Норма - 0,051± 0,003 - 0,059± 0,003 0,20± 0,01 7,2-8,0 4С

ЭИМ - 0,030± 0,002* - 0,045± 0.002* 0.30± 0.02* 7,0-8,0* 50*

Норма - 0,040± 0.003 - 0,049± 0,003 0,25± 0.01 7,1-8,0 55

ЭИМ - 0.050± 0,004* - 0,074± 0,004* 0,18± 0.01* 6,9-8,0* 45*

Норма 1,83± 0.07 - 0,058± 0.003 - - 6,6-7,1 50

ЗИМ 1,50± 0.10* - 0,096± 0.004* - - 6,4-7,1* 50

МТХ

НАД-

мдг

НАДФ -МДГ

ЦТП

ДТП

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (уровень значимости Р<0,05)

Было исследовано влияние ионов Ре2+, Си2+, Са2+, играющих важную роль в развитии ишемического повреждения ткани, пероксида водорода, компонента антиоксидантной системы организма - глутатиона, интермедиатов ЦТК, а также таких энергетически важных соединений, как АТФ, АДФ, АМФ на функционирование НАД- и НАДФ-зависимых МДГ, выделенных из нормального и ише-мизированного миокарда. Изучение регуляции активности НАД-МДГ из нормального и ишемизированного миокарда показало, что митохондриальная НАД-МДГ при патологии более чувствительна к ингибирующему действию ионов Ре2+ (таблица 5, рис. 1). Для цитоплазматической формы фермента подобный эффект отмечен при концентрациях ионов Ре2+ до 0,1 мМ. Установлено, что для различно локализованных изоформ НАД-МДГ чувствительность фермента к ингибирующему влиянию Си2+ более выражена в случае фермента из сердца крысы при патологии. Ионы Са2+ оказывают разнонаправленное влияние на фермент из нормального и ишемизированного сердца крысы. Показано, что на митохондриальную НАД-МДГ пероксид водорода оказывает тормозящее влияние только при патологии, в то время как цитоплазматическая НАД-МДГ

оказывается устойчивой к действию данного соединения как в норме, так и при ишемии.

Таблица 5.

Константы ингибирования, К и тип ингибирования НАДФ- и НАД-зависимых малатдегидрогеназ из сердца крысы в норме и при ишемии ионами некоторых металлов, пероксидом водорода, глутатионом,

Ингибитор Форма МДГ Опыт Константы ингибирования, К1 мМ Тип ингибирования

Бе" НАДФ-МДГ Норма 0,510±0.024 неконкурентное

ЭИМ 0,058±0,003* неконкурентное

МТХ НАД-МДГ Норма 1,14±0,05 неконкурентное

ЭИМ 0,60±0,03* неконкурентное

ЦТП НАД-МДГ ЭИМ 0,52±0,02 неконкурентное

Си2+ НАДФ-МДГ Норма 0,470±0,019 неконкурентное

ЭИМ 0,600±0.028* неконкурентное

МТХ НАД-МДГ ЭИМ 0,47±0,02 неконкурентное

ЦТП НАД-МДГ Норма О,35±О.О1 неконкурентное

Н2О: НАДФ-МДГ Норма 1,500±0,067 смешанное

ЭИМ 2,510±0,110* смешанное

МТХ НАД-МДГ ОИМ 1.80±0 08 смешанное

Г-8Н ЦТП НАД-МДГ ЭИМ 0.38±0,02 смешанное

г-з-з-г МТХ НАД-МДГ Норма 2,46+0,11 смешанное

ЦТП НАД-МДГ Норма 1,52±0,06 смешанное

Цитрат ЦТП НАД-МДГ ЭИМ 0,57±0,03 конкурентное

Цис- аконитат МТХ НАД-МДГ Норма 1,14±0.05 конкурентное

ЦТП НАД-МДГ Норма 0.72±0,03 конкурентное

ЭИМ 2,00+0,09* конкурентное

Изоцит-рат НАДФ-МДГ Норма 0,45+0,02 конкурентное

ЭИМ 1,1 ±0,05* конкурентное

2-Оксо-глугарат ЦТП НАД-МДГ Норма 1.24+0,06 конкурентное

ЭИМ 1,12±0,04* конкурентное

Ф> марат ЦТ И НАД-МДГ Норма 1,43±0.07 конкурентное

ЭИМ 0,94±0,04* конкурентное

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (уровень значимости Р<0,05)

Согласно полученным результатам, окисленная и восстановленная формы глутатиона, оказывая разнонаправленное действие на фермент из нормального и ишемизированного миокарда, могут участвовать в регуляции активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы в субклеточных фракциях клеток сердечной мышцы крысы в условиях интенсификации свободнорадикальных процессов, происходящей при ишемическом повреждении ткани сердца.

Исследование влияния АТФ, АДФ и АМФ, играющих основополагающую роль в энергетическом обмене клетки, на функционирование НАД-малатдегидрогеназы из кардиомиоцитов крысы показало, что данные соединения оказывают неодинаковое действие на фермент из нормального и ишемизи-рованного миокарда. Модификация некоторых регуляторных свойств исследуемых ферментов под действием адениннуклеотидов при патологии может сказываться на изменении их активности. Так, например, для митохондриаль-ной формы фермента из патологически измененной ткани отмечено отсутствие активирования АДФ и АМФ.

Исследование влияния интермедиатов ЦТК, концентрация которых также может изменяться в условиях окислительного стресса, сопряженного с ишемией, на активность НАД-МДГ в норме и при патологии, свидетельствует об изменении регуляции данного фермента под действием этих клеточных метаболитов в условиях ЭИМ. Так, цитрат, изоцитрат, 2-оксоглутарат оказывают более выраженный ингибирующий эффект на цитоплазматическую и митохонд-риальную НАД-МДГ из ишемизированного миокарда по сравнению со значениями в норме; к действию цис-аконитата, напротив, фермент из патологически измененной ткани является менее чувствительным.

Рис. 1. Определение типа и констант ингибирования митохондриальной НАД-МДГ из нормального (а) и ишемизированного (б) миокарда крыс ионами Ре2+ в координатах Диксона при фиксированных концентрациях ОА: 1 - 0,05 мМ;2-0,1 мМ.

Таким образом, показано, что наряду со сходством некоторых характеристик различно локализованных форм НАД-МДГ из нормального и ишемизиро-ванного сердца крысы имеют место и различия ряда кинетических и регулятор-ных свойств. Это может отражаться на активности фермента и регуляции уровня свободнорадикальных процессов при ишемии.

КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА НАДФ-МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ СЕРДЦА КРЫСЫ В НОРМЕ И ПРИ ИШЕМИИ

-1,2 -0,8 -0,4 0 0,4 |Те2+], мМ

-0.8 -0.4 0 0.4 0,8

[Ре2+], мМ

Результаты очистки НАДФ-МДГ из нормальной и ишемизированной сердечной мышцы крысы представлены в таблице 6. Из нормального и ишемизированного миокарда были получены очищенные в 113 и 107 раз ферментные

препараты НАДФ-МДГ с удельной активностью 22,75 и 34,35 ФЕ/мг белка соответственно. При этом выход составил 9,2% и 10,5% в случае нормы и ишемии миокарда. Показана гомогенность полученных препаратов. После электрофореза в ПААГ в результате окрашивания на белок выявлялась одна белковая зона с Я, 0,61 (рис.2).

Молекулярная масса цито плазматической НАДФ-МДГ из миокарда крысы, определенная с помощью гель-хроматографии на сефадексе О-150, составила 68±4 кДа соответственно. Что касается фермента из ишемизированного сердца крысы, то при определении его молекулярной массы различий по сравнению с нормой не было обнаружено.

Таблица 6.

Очистка цитоплазматической НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы из нормального и ишемизированного миокарда крысы

Стадия очистки Условия опыта Активность, ФЕ Количество белка, мг Удельная активность, ФЕ/мг белка Выход, % Степень очистки

Гомогенат Норма 9,87±0,46 48,34±2,10 0,20±0,01 100 1

Ишемия 15,04±0,70* 47,70±2,12 0,32+0,01* 100 1

Фракционирование Норма 4,00±0,17 6,75±0,30 0,59±0,02 40,5 3,0

Ишемия 5,6010,22* 7,00±0,31 0,80±0,03* 37,2 2,5

Гель-фильтрация на сефадексе О-25 Норма 4.13+0,19 5.60±0.27 0,74±0,03 41,8 3,7

Ишемия 5,55±0,23* б,10±0,29 0,91 ±0,04* 36,9 2,8

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе Норма 2,80±0.10 0.45±0.02 6,22±0,22 28,4 31,1

Ишемия 4,42±0,16* 0,50±0,02* 8,84±0,31* 29,4 27.6

Гель-хроматография на сефадексе О-150 Норма 0,91 ±0,03 0,040±0.001 22,75±1,10 9,2 113,4

Ишемия 1,58±0.06* 0,046± 0,002* 34,35±1,58* 10,5 107,3

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (уровень значимости Р<0,05)

С использованием полученных очищенных ферментных препаратов НАДФ-МДГ были исследованы каталитические и регуляторные свойства фермента в норме и при патологии. Изучение зависимости активности фермента от концентрации субстрата - оксалоацетата, и кофермента - НАДФН, показало, что НАДФ-МДГ проявляет положительную кооперативность по отношению к оксалоацетату как в норме, так и при ишемии. Однако в условиях ишемии наблюдается снижение величины коэффициента Хилла, характеризующего связывание НАДФ-МДГ с оксалоацетатом, и изменение сродства фермента к кофер-

менту (таблица 4) Показано, что в условиях патологии наблюдается небольшой сдвиг оптимального диапазона рН для фермента в кислую сторону, что может быть следствием развивающегося в ткани миокарда при ишемии ацидоза Вето-чины рК функциональных групп для исследуемого фермента в норме и при патологии находятся в пределах рК имидазольной группы гистидина и а-аминогруппы цистина

Рис. 2 Электрофореграммы НАДФ-МДГ, выделенной из нормального (1) и ишемизированного (2) миокарда крысы 3 - фронт маркера (бром-феноловый синий), стрелкой показано направление движения белка

Рис 3 Влияние восстановленного и окисленного глутатиона на активность НАДФ-малатдегидрогеназы из нормального (1) и ишемизированного (2) миокарда крысы

Был также исследован ряд регуляторных свойств НАДФ-МДГ в норме и при оксидативном стрессе, развивающемся в условиях ишемии миокарда. Установлено, что ионы Ре2+ оказывают ингибирующее влияние неконкурентного типа на исследуемый фермент как в норме, так и при ЭИМ, однако степень ин-гибирующего воздействия выше в случае НАДФ-МДГ из патологически измененной ткани (таблица 5) Ионы Си2+ также оказывают сильное ингибирующее влияние неконкурентного типа на НАДФ-МДГ, выделенную из сердца крысы, как в норме, так и при ишемии При этом большее торможение активности наблюдается для фермента, выделенного из нормальных кардиомиоцитов крысы Показано, что ингибирование НАДФ-МДГ из ишемизированного миокарда характеризуется константой ингибирования, превышающей данную величину для

фермента в норме в 1,28 раза. Установлено, что ионы Са2+ подавляют активность фермента из сердца нормальных животных, причем наиболее сильное подавление активности наблюдается при концентрации Са2+ в среде до 0,1 мМ. Что касается НАДФ-МДГ из ишемизированного миокарда, то ионы данного металла в концентрации до 0,08 мМ оказывают незначительное активирующее влияние на фермент. Установлено, что пероксид водорода снижает активность фермента как в норме, так и при патологии, причем ингибирующий эффект

на активность фермента более выражен для НАДФ-МДГ, выделенной из сердца здорового животного. При патологии наблюдается возрастание К, в 1,67 раза по сравнению со значением в норме (таблица 5).

Показано, что глутатион восстановленный вызывает слабое ингибирова-ние исследуемого фермента из нормального миокарда в концентрациях выше 0,6 мМ, в то время как на фермент, выделенный из ишемизированного сердца, данный метаболит оказывает незначительное активирующее действие (рис. 3). Согласно полученным результатам, при патологии наблюдается снижение степени ингибирования активности НАДФ-МДГ окисленным глутатионом (рис. 3), что может иметь значение для сопряжения работы данного фермента с функционированием глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС.

Исследование регуляции активности НАДФ-МДГ под действием аденин-нуклеотидов также выявило изменения регуляторных свойств фермента при патологии. Так, например, при ишемии наблюдается активация НАДФ-МДГ под действием АТФ, тогда как в норме имеет место ингибирующий эффект. Выявлено также снижение ингибирующего действия АМФ на функционирование фермента из ишемизированного миокарда по сравнению с нормой.

Исследование влияния интермедиатов ЦТК на активность НАДФ-МДГ в норме и при патологии, показало, что при ЭИМ наблюдается снижение чувствительности фермента к ингибирующему действию большинства исследованных промежуточных метаболитов цикла Кребса.

Таким образом, при патологии наряду с некоторыми сходными чертами отмечается изменение ряда кинетических и регуляторных свойств НАДФ-зависимой МДГ из кардиомиоцитов крысы, что может свидетельствовать о возможном участии данного фермента в регуляции интенсивности СРО при развитии ишемического повреждения ткани миокарда.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ходит мобилизация АОС. Однако уровень компенсаторных механизмов, направленных на снижение интенсивности свободнорадикальных процессов, оказывается недостаточным и в клетках сердечной мышцы крысы в условиях ише-мического повреждения происходит увеличение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ.

Параллельно с интенсификацией СРО в субклеточных фракциях кардио-миоцитов после 40-минутной ишемии наблюдается снижение активности НДД-зависимой МДГ в 2,6 раза по сравнению с активностью фермента из нормального миокарда. Торможение активности митохондриальной НАД-МДГ, катализирующей одну из реакций ЦТК, по-видимому, может способствовать снижению образования АФК в ходе неполного восстановления кислорода в дыхательной цепи. Известно, что торможение ЦТК приводит к окислению ферментов ЭТЦ - восстановителей Огдо О2 - (8ки1асИеу, 1996). Понижение активности цитоплазматической НАД-МДГ, участвующей в переносе восстановительных эквивалентов в митохондрии, также может приводить к снижению поставки НАДН в электрон-транспортную цепь митохондрий и таким образом лимитировать процессы СРО. Наряду с этими изменениями, в цитоплазматической фракции клеток миокарда крыс при патологии происходит повышение активности НАДФ-МДГ в 1,6 раза, что согласуется с данными об активации данного фермента в легочной ткани кролика при острой гипоксии (Ананьева и др., 1983). Нельзя исключить, что дополнительный НАДФН, образующийся при стимуляции НАДФ-МДГ в миокарде крысы в условиях оксидативного стресса, может использоваться глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС.

Согласно данным, полученным при исследовании субклеточной локализации НАД- и НАДФ-МДГ в кардиомиоцитах крысы методами дифференциального центрифугирования и ионообменной хроматографии, изменение ферментативной активности после коронароокклюзии не связано с перераспределением их активностей между клеточными компартментами. Показано, что для НАД- и НАДФ-МДГ из ишемизированного миокарда некоторые физико-химические свойства не изменяются по сравнению со значениями в норме. Так, значения молекулярных масс и электрофоретической подвижности, а также хроматографические свойства для ферментов из ишемизированного миокарда совпадали с данными, полученными при исследовании НАД- и НАДФ-МДГ из сердца крыс контрольной группы. Это позволяет говорить о маловероятности индукции новых изоформ фермента, а также модификации субъединичной структуры ферментов при патологии. В то же время, наблюдается изменение ряда кинетических параметров каталитического действия и регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ из ишемизированного сердца крысы по сравнению с их свойствами в норме, что было показано с использованием высоко-очищенных ферментных препаратов. Согласно полученным результатам, при ишемии миокарда наблюдается изменение в величинах, отражающих сродство НАД- и НАДФ-МДГ к субстрату и коферменту, и воздействии, оказываемом рН и температурой, на ферментативную активность по сравнению с данными, полученными в норме.

Сравнительный анализ регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ из сердца крысы по отношению к ионам некоторых металлов, пероксиду водорода, глутатиону, интермедиатам ЦТК и адениннуклеотидам в норме и при ишемии свидетельствует о модификациях ряда механизмов метаболитной регуляции активности данных ферментов в условиях развития патологического процесса, сопряженного с интенсификацией СРО. Изменения функционирования НАД- и НАДФ-МДГ, вероятно, могут иметь значение в развитии адаптивной реакции метаболических систем клетки на активацию свободнорадикальных процессов, происходящую при ишемии. Усиление торможения активности ми-тохондриальной и цитоплазматической НАД-МДГ в условиях ишемии с помощью выявленных факторов (ионов Ре2+, Си2+, адениннуклеотидов, интермедиа -тов ЦТК) может являться одним из механизмов снижения генерирования АФК в ЭТЦ митохондрий кардиомиоцитов. Изменение функционирования НАДФ-МДГ под действием пероксида водорода, ионов Са2+, Си2+, глутатиона, интер-медиатов ЦТК также может сказываться на активности ряда ферментативных систем клетки. Не исключена возможность сопряжения работы данного фермента с функционированием глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС, требующей НАДФН для восстановления глутатиона. В то же время глу-татион может самостоятельно выступать в качестве эффективного антиокси-данта, перехватывая свободные радикалы, восстанавливая АФК и продукты ок-сидативной модификации (Кения и др., 1993).

На основании полученных данных можно предположить участие НАД- и НАДФ-МДГ в лимитировании уровня АФК и интенсификации СРО, происходящей при ишемическом повреждении ткани миокарда. На рис.4 представлена гипотетическая схема, отражающая возможный вклад НАД- и НАДФ-МДГ в регуляцию интенсивности свободнорадикальных процессов в кардиомиоцитах при ишемии. Согласно представленной схеме, в компартментах кардиомиоци-тов при развитии патологического процесса происходит интенсификация СРО, приводящая к повреждению клеточных структур. Вместе с тем на начальных этапах цепи патогенетического повреждения клеток происходит мобилизация антиоксидантных и сопряженных с ними систем. Одним из возможных механизмов снижения уровня АФК является торможение активности ключевых ферментов ЦТК, выполняющих роль поставщиков НАДН в электрон-транспортную цепь митохондрий, к числу которых относится НАД-МДГ. Вместе с тем, в клетке происходит также активация систем, утилизующих уже образовавшиеся АФК, среди которых важное место занимает глутатионредуктаз-ная / глутатионпероксидазная АОС, для функционирования которой необходим НАДФН. При недостаточном поступлении кислорода в клетки миокарда реализуется усиление генерирования АФК, что является пусковым механизмом для интенсификации СРО и, в частности, ПОЛ, результатом чего является нарушение структурного и функционального состояния многих метаболических систем клетки. Влияние АФК на биологические макромолекулы при ишемии во многом усугубляется повышением проницаемости биомембран для ионов Са2+, выступающих в качестве активаторов НАДФН-оксидазы - продуцента супероксидного радикала - и фосфолипаз (Меерсон, 1984), влияющих на состояние

клеточных мембран. Необходимо отметить, что ведущая роль в образовании наиболее реакционноспособной АФК - ОН - в реакции Фентона принадлежит ионам Ре2+. которые таким образом способствуют запуску цепных свободнора-дикальных процессов. В силу вышесказанного очевидно, что хелаторы ионов Ре2+, к числу которых принадлежит цитрат, будут выступать в качестве антиок-сидантов. Не исключена возможность усиления поставки цитрата в митохондрии при снижении активности НАД-МДГ и накоплении малата, поскольку существует предположение о наличии малат-стимулируемой системы переносчиков цитрата (ЗшегсгугаИ Ы а1., 1976).

Согласно результатам проведенных исследований, ионы Са2+, снижающие активность НАДФ-МДГ из сердца контрольных животных, в концентрациях до 0,1 мМ оказывают активирующее влияние на фермент из ишемизирован-ного миокарда. Выявленное изменение свойств НАДФ-МДГ по отношению к ионам этого металла может иметь значение для усиления его активности в условиях патологии и регуляции глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС. На различно локализованные формы НАД-МДГ из кардиомиоцитов крысы ионы Са2+ оказывают также разнонаправленное влияние в норме и при ишемии, что может быть следствием модификации конформации белка при изменении его микроокружения в условиях патологии.

Ионы Ре2+ оказывают более сильное ингибирующее воздействие на НАДФ-зависимую МДГ и митохондриальную НАД-МДГ из сердца крысы при ишемии по сравнению со значениями в норме. Активность цитоплазматической НАД-МДГ при концентрациях ионов Ре2+ до 0,1 мМ также сильнее снижена в случае фермента из патологически измененной ткани. Усилению свободнора-дикальных процессов могут способствовать и ионы меди (Реуте, 81а&тап, 2000). Ионы Си2+ также снижают активность исследуемых ферментов. Причем чувствительность НАДФ-МДГ к ингибирующему влиянию Си2+ более сильно выражена в случае нормы, а НАД-МДГ - при патологии.

Для НАДФ-МДГ из ишемизированного миокарда отмечено снижение чувствительности к ингибирующему действию пероксида водорода. Установлено, что на митохондриальную НАД-МДГ пероксид водорода оказывает тормозящее влияние только при патологии. Цитоплазматическая НАД-МДГ оказывается устойчивой к действию данного соединения как в норме, так и при патологии.

Согласно полученным результатам, НАДФ-МДГ из ишемизированного сердца оказывается более устойчивой к ингибирующему влиянию окисленного глутатиона, что может иметь значение для сопряжения работы данного фермента с функционированием глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС, когда для восстановления окисленного глутатиона необходим НАДФН. Восстановленная форма глутатиона оказывает слабое ингибирующее влияние на НАДФ-МДГ из сердца контрольных животных и активирует фермент из ишемизированного миокарда. На НАД-зависимую МДГ глутатион в окисленной и восстановленной форме также оказывает разнонаправленное действие в норме и при патологии, что может быть следствием перестроек в структуре белка.

Рис. 4. Гипотетическая схема участия НАД- и НАДФ-МДГ в регуляции интенсивности СРО при ишемии миокарда I этап - повышение интенсивности СРО, II -снижение активности НАД-МДГ и поставки НАДН в ЭТЦ митохондрий, повышение активности НАДФ-МДГ и уровня НАДФН, необходимого для функционирования ГР/ГП системы, III - снижение интенсивности СРО. Условные обозначения- ^»антиоксидантный эффект; а (и) - активирующий (ингибирующий) эффект в условиях ишемии при отсутствии эффекта в норме; а+ (и+) - усиление воздействия; а- (и-) - снижение воздействия. 1,2,3 - эффекты для НАДФ-, цтп НАД-, мтх НАД-МДГ соответственно.

г-в-я-г НАДФН

Н202 ^аспартат '

ОА

НАДН^^АД МДГ НАД малат-

цитоплазма

плазматическая мембрана

Известно, что при прекращении кровоснабжения в ткани происходят метаболические нарушения, приводящие к изменению содержания адениннуклео-тидов, играющих основополагающую роль в энергетическом обмене клетки. Исследование влияния АТФ, АДФ и АМФ на функционирование МДГ из кар-диомиоцитов крысы показало, что данные соединения оказывают различное действие на ферменты из нормального и ишемизированного миокарда. По-видимому, изменение некоторых регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ под действием адениннуклеотидов при патологии может сказываться на изменении их активности.

Исследование влияния интермедиатов ЦТК, концентрация которых также может изменяться в условиях окислительного стресса, сопряженного с ишемией, на активность МДГ в норме и при патологии, свидетельствует об изменении регуляции данных ферментов под действием этих клеточных метаболитов в условиях ЭИМ. Так, цитрат, изоцитрат, 2-оксоглутарат оказывают более выраженный ингибирующий эффект на цитоплазматическую и митохондриальную НАД-МДГ из ишемизированного миокарда по сравнению со значениями в норме. Для НАДФ-МДГ, напротив, наблюдается снижение чувствительности к ин-гибирующему действию большинства исследованных промежуточных метаболитов цикла Кребса.

Таким образом, активность данных ферментов в норме и при ишемии регулируется под действием комплекса клеточных метаболитов, концентрация которых может изменяться при патологии, и, вероятно, определяется конкуренцией между процессами активации и ингибирования под влиянием ионов некоторых металлов, пероксида водорода, глутатиона, адениннуклеотидов, интер-медиатов ЦТК. Торможение активности НАД-МДГ и возникновение или усиление ингибирующих эффектов под действием ряда факторов может иметь значение для снижения поставки НАДН в ЭТЦ митохондрий, что может предотвращать образование АФК в ходе неполного восстановления кислорода. Повышение активности НАДФ-МДГ может сказываться на функционировании глу-татионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС. В этой связи изменение функционирования исследуемых ферментов в присутствии ряда клеточных метаболитов может играть существенную роль в лимитировании процессов сво-боднорадикального окисления при их усилении в условиях патологии.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в условиях ишемии происходит интенсификация СРО в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток миокарда, сопровождающаяся мобилизацией АОС и накоплением продуктов ПОЛ, причем степень развития данных процессов зависит от длительности ишемического воздействия на ткань.

2. Установлено, что экспериментальная ишемия миокарда сопровождается повышением активности НАДФ-МДГ в 1,6 раза и снижением активности различно локализованных форм НАД-МДГ в 2,6 раза.

3. Исследования НАДФ- и НАД-МДГ из нормального и ишемизирован-ного миокарда, проведенные с использованием гомогенных ферментных препаратов, показывают, что наряду со сходными свойствами (молекулярные массы, электрофоретические подвижности и др.), для ферментов характерны изменения некоторых кинетических и регуля-торных свойств при патологии.

4. При экспериментальной ишемии происходит модификация кинетических параметров НАД- и НАДФ-МДГ, отражающих их сродство к субстратам, а также изменение рН- и температурных оптимумов.

5. Выявлено изменение чувствительности исследуемых ферментов к действию ионов металлов: Ре2+, Си2+, Са2+; и пероксида водорода при патологии.

6. Показано, что глутатион в окисленной и восстановленной форме может участвовать в регуляции активности НАДФ- и НАД-МДГ как в норме, так и при ишемии. Для НАДФ-МДГ при ишемии отмечен активирующий эффект восстановленного глутатиона и снижение ингиби-рующего воздействия окисленного глутатиона. Для НАД-МДГ также характерно разнонаправленное влияние данных метаболитов в норме и при патологии.

7. Установлено, что в условиях ишемии наблюдается изменение регуляции активности НАДФ- и НАД-зависимых МДГ под действием аде-ниннуклеотидов.

8. Выявлены изменения регуляторных свойств НАДФ- и НАД-МДГ из ишемизированного миокарда по отношению к интермедиатам ЦТК: цитрату, цис-аконитату, изоцитрату, 2-оксоглутарату, фумарату.

9. На основании полученных данных исследования функционирования НАДФ- и НАД-МДГ в условиях окислительного стресса, вызванного ишемией, предложена гипотетическая схема возможного участия данных ферментов в лимитировании интенсивности свободнорадикаль-ных процессов при патологии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Сафонова О. А. Активность различных форм малатдегидрогеназы в миокарде крысы в норме и при ишемии / О.А. Сафонова, Л.В. Матасова // Сборник тезисов 6-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века». - Пущино, 20 - 24 мая 2002 г. - С. 317.

2. Сафонова О. А. Изменение активностей НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназы в сердце крысы в условиях ишемии / О.А. Сафонова, Л.В. Матасова // Труды молодых ученых Воронеж, ун-та. - 2002. - Вып. 2.-С. 79-80.

3. Сафонова О. А. Содержание продуктов пероксидного окисления липидов и параметры биохемилюминесценции в кардиомиоцитах крысы при ок-сидативном стрессе / ОА Сафонова, Т.Н. Попова, Л.В. Матасова // «Состояние и проблемы экосистем Среднерусской лесостепи»: Труды биоло-

гического учебно-научного центра «Веневитиново» Воронежского государственного университета. - Воронеж, 2003. - Вып. XVI. — С. 145-148.

4. Сафонова О. А. Очистка и некоторые каталитические свойства НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы из сердца крысы в норме и при экспериментальной ишемии / О.А. Сафонова, Л.В. Матасова // Сборник трудов 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века». - Пущино, 14-18 апреля 2003 г. - С. 374.

5. Сафонова О. А. Оценка уровня свободно-радикального окисления в ткани миокарда крысы в процессе развития ишемии с помощью метода индуцированной хемилюминесценции / ОА Сафонова, Т.Н. Попова, Л.В. Мата-сова // Труды III Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». - Санкт-Петербург, 1 - 4 июля 2003 г.-С. 64.

6. Сафонова О. А. Применение ионообменной хроматографии для разделения изоформ малатдегидрогеназы / О.А. Сафонова, Т.Н. Попова, В.Г. Ар-тюхов, Л.В. Матасова // Труды Международного форума «Аналитика и аналитики». - Воронеж, 2-6 июня 2003 г. - Т. 1. - С. 189.

7. Сафонова О. А. Особенности функционирования НАДФ-зависимой ма-латдегидрогеназы в миокарде крысы в норме и при ишемии // «Перспективы развития теоретической и практической медицины»: Сборник трудов научной конференции молодых ученых ВГМА. - Воронеж, 15 мая 2003 г.-С. 133-136.

8. Сафонова О. А. Регуляция активности НАДФ-зависимой малатдегидро-геназы из миокарда крысы интермедиатами цикла трикарбоновых кислот / О.А. Сафонова, Л.В. Матасова // Сборник трудов 8-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века». - Пущино, 17 - 21 мая 2004 г. - С. 68.

9. Сафонова О. А. Применение различных видов хроматографии для очистки НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы из сердечной мышцы крысы / ОА. Сафонова, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов, Л.В. Матасова // Сорбцион-ные и хроматографические процессы. - 2004. - Т. 4, вып. 3. - С. 369-374.

Ю.Сафонова О. А. Применение ионообменной хроматографии для разделения митохондриальной и цитоплазматической изоформ НАД-зависимой малатдегидрогеназы из нормального и ишемизированного миокарда крысы / О.А. Сафонова, Т.Н. Попова, Л.В. Матасова, Е.В. Михайлова // Спец. выпуск журнала «Сорбционные и хроматографические процессы» по результатам X Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов» (на CD). - Воронеж, 2004. - Т. 4. - С. 300-304.

11 .Сафонова О. А. Некоторые каталитические свойства и регуляция активности НАДФ-малатдегидрогеназы из миокарда крысы в норме и при ишемии / О.А. Сафонова, Т.Н. Попова, Л.В. Матасова // Тезисы докладов III Съезда биофизиков России. -Воронеж, 24-29 июня 2004 г. - Т. 2. - С. 573-574.

12.Сафонова О. А. Некоторые кинетические параметры и регуляторные свойства НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы из кардиомиоцитов кры-

4 »26318

сы в норме и при ишемии / ОА Сафонова, Т.Н. Попова, Л.В. Матасова // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2004. - № 1. - С. 142-146.

13.Сафонова О.А. Особенности функционирования цитоплазматической НАД-зависимой малатдегидрогеназы из миокарда крыс в норме и при экспериментальной ишемии / О.А Сафонова, Т.Н. Попова, Л.В. Матасова // Материалы 3-ей междисциплинарной конференции с международным участием "НБИТТ-21". - Петрозаводск, 21-23 июня 2004 г. - С. 35.

14.Сафонова О.А. Устойчивость НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ из миокарда крысы к воздействию пероксида водорода в норме и при ишемии / О.А Сафонова, Т.Н. Попова, Л.В. Матасова // Материалы VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем». - Белгород, 27 - 29 сентября 2004 г.-С. 194-196.

15. Сафонова О.А. Исследование функционирования митохондриальной НАД-малатдегидрогеназы в сердце крысы при усилении свободноради-кальных процессов / О.А. Сафонова, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов, Л.В. Матасова // Сборник трудов VI Съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». - Минск, 6-8 октября 2004 г. - Т. 2.-С. 196-198.

16. Сафонова О.А. Интенсивность свободнорадикального окисления и регуляция активности цитоплазматической НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы в кардиомиоцитах крысы в норме и при ишемии / ОА. Сафонова, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов, Л В. Матасова // Биомедицинская химия. — 2005. - Т. 51, №2. (принята к печати).

П.Сафонова О.А. Особенности функционирования цитоплазматической НАД-малатдегидрогеназы из миокарда крысы в условиях ишемии / О.А. Сафонова, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов, Л.В. Матасова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. (в печати).

18. Сафонова О.А. Оксидативный статус и функционирование НАД-зависимой малатдегидрогеназы в митохондриях кардиомиоцитов крысы в норме и при ишемии / ОА Сафонова, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов, Л.В. Матасова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2005. (в печати).

Заказ № 764 от 25.11. 2004 г. Тир. 100 экз. Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сафонова, Ольга Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантные системы организма

1.1.1. Свободнорадикальное окисление биомолекул

1.1.2. Пероксидное окисление липидов и его роль в живых организмах

1.1.3. Активные формы кислорода

1.1.4. Антиоксидантные системы организма

1.1.4.1. Ферментативные антиоксиданты

1.1.4.2. Макромолекулярные неферментативные антиоксиданты

1.1.4.3. Низкомолекулярные неферментативные антиоксиданты

1.1.5. Роль ионов некоторых металлов в протекании свободнорадикальных процессов

1.2. Ишемия миокарда

1.2.1. Понятие об ишемической болезни сердца

1.2.2. Изменение метаболизма кардиомиоцитов в условиях ишемии

1.2.3. Роль пероксидного окисления липидов и активных форм кислорода в патогенезе ишемического повреждения сердца

1.2.4. Роль апоптоза в ишемическом повреждении ткани сердца

1.2.5. Диагностика инфаркта миокарда

1.3. Характеристика НАД- и НАДФ-зависимых малатдегидрогеназ

1.3.1. Ферменты, участвующие в метаболизме маната

1.3.2. Характеристика НАДФ-малатдегидрогеназы из различных организмов

1.3.2.1. Реакция, катализируемая ферментом

1.3.2.2. Внутриклеточное распределение НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы и ее участие в физиолого-биохимических процессах

1.3.2.3. Очистка фермента

1.3.2.4. Структурная организация и молекулярная масса НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы. Исследование активного центра фермента

1.3.2.5. Кинетическое поведение и регуляция активности НАДФ-малатдегидрогеназы

1.3.2.5.1. Сродство к субстрату и кофакторам.

Влияние температуры и рН среды на активность фермента

1.3.2.5.2. Регуляция активности НАДФ-малатдегидрогеназы 48 1.3.3. НАД-зависимая малатдегидрогеназа: локализация, очистка, структурная организация, свойства

1.3.3.1. Реакция, катализируемая ферментом

1.3.3.2. Распространение и участие в физиолого-биохимических процессах

1.3.3.3. Изоформы и внутриклеточная локализация

НАД-зависимой малатдегидрогеназы

1.3.3.4. Очистка НАД-зависимой МДГ из различных объектов

1.3.3.5. Структурная организация и молекулярная масса НАД-малатдегидрогеназы из различных объектов

1.3.3.6. Исследование активного центра фермента

1.3.3.7. Кинетическое поведение и регуляция активности НАД-малатдегидрогеназы

1.3.3.7.1. Сродство к субстратам и кофакторам.

Субстратная специфичность

1.3.3.7.2. Влияние температуры и рН среды на активность НАД-малатдегидрогеназы

1.3.3.7.3. Регуляция активности

НАД-зависимой малатдегидрогеназы

1.3.3.7.4. Аллостерические свойства НАД-малатдегидрогеназы 75 1.3.3.8. Перспективы практического применения

НАД-зависимой малатдегидрогеназы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования

2.2. Создание модели экспериментальной ишемии миокарда

2.3. Получение субклеточных фракций кардиомиоцитов

2.4. Определение интенсивности процессов СРО методом биохемилюминесценции

2.5. Определение содержания малонового диальдегида

2.6. Определение содержания диеновых конъюгатов

2.7. Определение активности ферментов

2.8. Определение количества белка

2.9. Выделение и очистка ферментов

2.9.1. Экстракция

2.9.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония

2.9.3. Гель-фильтрация

2.9.4. Ионообменная хроматография

2.10. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов

2.11. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.12. Определение молекулярной массы

2.13. Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ОКСИДАТИВНОГО СТАТУСА И АКТИВНОСТЕЙ НАД- И НАДФ-МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗ

В МИОКАРДЕ КРЫС В НОРМЕ И

ПРИ ЭКСПРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ 91 3.1. Измерение параметров биохемилюминесценции в субклеточных фракциях кардиомиоцитов крысы в норме и при ишемии различной длительности 3.2. Определение содержания первичных и вторичных продуктов пероксидного окисления липидов в субклеточных фракциях кардиомиоцитов крысы в норме и при ишемии

3.3. Активности и субклеточная локализация НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ в кардиомиоцитах крысы в норме и при патологии

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ И РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ НАД-ЗАВИСИМОЙ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ СЕРДЦА КРЫСЫ В НОРМЕ И ПРИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ

4.1. Очистка митохондриальной и цитоплазматической НАД-малатдегидрогеназы из нормального и ишемизированного миокарда крысы

4.2. Исследование некоторых кинетических свойств изоформ НАД-зависимой малатдегидрогеназы из нормального и ишемизированного миокарда крысы

4.3. Молекулярная масса изоформ НАД-малатдегидрогеназы из сердца крысы в норме и при патологии

4.4. Влияние pH среды на активность различно локализованных форм НАД-зависимой малатдегидрогеназы из нормального и подвергшегося ишемии сердца

4.5. Влияние температуры на функционирование

НАД-малатдегидрогеназы из сердца крысы в норме и при ишемии

4.6. Регуляторные свойства изоформ НАД-малатдегидрогеназы из сердечной мышцы крысы в норме и при патологии

4.6.1. Влияние ионов некоторых металлов на активность НАД-малатдегидрогеназы

4.6.2. Влияние пероксида водорода на функционирование НАД-малатдегидрогеназы в норме и при патологии

4.6.3. Регуляция НАД-зависимой малатдегидрогеназы под действием глутатиона

4.6.4. Регуляция активности НАД-малатдегидрогеназы из миокарда крысы в норме и при ишемии под действием интермедиатов цикла Кребса

4.6.5. Исследование регуляции активности НАД-малатдегидрогеназы из кардиомиоцитов крысы адениннуклеотидами

ГЛАВА 5. КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ И

РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА НАДФ-МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ СЕРДЦА КРЫСЫ В НОРМЕ И ПРИ ИШЕМИИ

5.1. Очистка НАДФ-малатдегидрогеназы из нормального и ишемизированного миокарда

5.2. Кинетические параметры НАДФ-малатдегидрогеназы из кардиомиоцитов крысы в норме и при ишемии

5.3. Молекулярная масса НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы из нормального и ишемизированного миокарда

5.4. Влияние рН среды на функционирование фермента в норме и при патологии

5.5. Исследование влияния температуры на активность НАДФ-малатдегидрогеназы из нормального и ишемизированного сердца крысы

5.6. Исследование регуляции активности

НАДФ-малатдегидрогеназы

5.6.1. Регуляция активности НАДФ-малатдегидрогеназы под действием ионов некоторых металлов

5.6.2. Влияние пероксида водорода на активность фермента

5.6.3. Регуляция НАДФ-малатдегидрогеназы под действием глутатиона

5.6.4. Исследование влияния интермедиатов цикла трикарбоновых кислот на активность НАДФ-малатдегидрогеназы из сердца крысы в норме и при ишемии

5.6.5. Исследование функционирования НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы из кардиомиоцитов крысы в норме и при патологии в присутствии адениннуклеотидов 166 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 169 ВЫВОДЫ 177 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 179 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

БХЛ - биохемилюминесценция

ДДС-№ - додецилсульфат натрия

ДК - диеновые конъюгаты

ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтил-целлюлоза

ИБС — ишемическая болезнь сердца

ИОХ - ионообменная хроматография

КК - креатинкиназа

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МДА — малоновый диальдегид

МДГ - малатдегидрогеназа

НАД-МДГ - НАД-зависимая малатдегидрогеназа НАДФ-МДГ - НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа ОА - оксалоацетат

ПОЛ — пероксидное окисление липидов

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

СОД — супероксиддисмутаза

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФЕП - фосфоенолпируват

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭТЦ — электрон-транспортная цепь

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства и регуляция активности НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ в условиях оксидативного стресса в миокарде крыс при ишемии"

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из важнейших проблем биохимии является исследование функционирования метаболических систем разного уровня в условиях развития патологического процесса. Согласно современным воззрениям, в основе патогенеза многих заболеваний, в том числе и заболеваний сердечно-сосудистой системы, лежит нарушение баланса между интенсивностью свободнорадикальных процессов и активностью антиоксидантных систем (АОС) организма (Панкин, 2000; Бурлакова, 1980; Меерсон, 1982). Активные формы кислорода (АФК), выполняющие в организме ряд функций, при интенсификации их образования способны приводить к нарушению клеточного метаболизма и, как следствие, к гибели клеток (Кулинский, 1999). Интенсивность свободнорадикальных процессов, в которых принимают участие АФК, регулируется сложной, многоступенчатой системой антиоксидантной защиты (Young, 2001). Предполагается, что одним из механизмов подавления процессов СРО в митохондриях может служить ингибирование ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) (Skulachev, 1996). В этой связи вызывает интерес функционирование НАД-зависимой малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37; НАД-МДГ), катализирующей в ЦТК обратимое превращение малата в оксалоацетат. Цитоплазматическая форма НАД-МДГ участвует в обеспечении транспорта метаболитов между клеточными компартментами. Имеются данные о значительной роли субстрата МДГ - малата - в биохимической адаптации организма к гипоксии (Глотов, 1973). Способность малата диффундировать в митохондрии, передавая восстановительные эквиваленты в электрон-транспортную цепь (ЭТЦ), и повышать коэффициент дыхательного контроля митохондрий сердца (Малюк, 1977), а также высокое содержание МДГ по сравнению с другими дегидрогеназами субстратов цикла Кребса (Pette, 1962) подчеркивают ее важное место в регуляции редокс-потенциала кардиомиоцитов. Все эти факты, наряду со способностью малата играть существенную роль в первичной реакции на стрессовые воздействия из-за возможности его быстрой утилизации, позволяют сделать предположение о возможном участии МДГ в регуляции образования АФК в условиях окислительного стресса. Кроме того, нельзя исключить, что НАДФН, образующийся в реакции обратимого превращения малата в оксалоацетат, катализируемой НАДФ-зависимой МДГ (КФ 1.1.1.82; НАДФ-МДГ), может использоваться при функционировании глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной системы - одной из важнейших ферментативных АОС организма. Хотя традиционно принято считать, что основным поставщиком НАДФН в клетке является пентозофосфатный путь, однако в кардиомиоцитах активность ферментов данного пути значительно ниже, чем в других органах (Диксон, 1982) и в качестве дополнительного источника НАДФН в клетках миокарда могут выступать другие ферменты, например, НАДФ-специфичная изоцитратдегидрогеназа (Медведева, 2002).

Таким образом, исследование особенностей функционирования НАД- и НАДФ-зависимых МДГ при усилении интенсивности СРО в условиях ишемического повреждения ткани миокарда может способствовать выяснению механизмов регуляции свободнорадикальных процессов и образования АФК, что может иметь значение для понимания развития патологического состояния организма и путей его коррекции.

1. Определение интенсивности процессов СРО в субклеточных фракциях кардиомиоцитов крыс в норме и в динамике развития экспериментальной ишемии миокарда.

2. Определение активностей и субклеточной локализации НАД- и НАДФ-МДГ в клетках миокарда в норме и при ишемии.

3. Получение высокоочищенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-зависимых МДГ из нормального и ишемизированного миокарда крысы.

4. Сравнительная характеристика кинетических параметров каталитического действия НАД- и НАДФ-МДГ из сердца контрольных животных и крыс, подвергшихся воздействию экспериментальной ишемии.

5. Исследование регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ из сердечной мышцы крысы в норме и при патологии.

6. Создание гипотетической модели участия НАД- и НАДФ-МДГ в регуляции интенсивности СРО в клетках миокарда в условиях ишемического повреждения ткани.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование функционирования НАД- и НАДФ-МДГ в кардиомиоцитах крысы в условиях увеличения интенсивности процессов СРО при ишемии. Разработаны процедуры выделения и очистки и получены гомогенные препараты различно локализованных изоформ НАД- и НАДФ-МДГ из нормального и ишемизированного миокарда крыс. Впервые дана сравнительная характеристика каталитических свойств и регуляции активности данных ферментов в сердечной мышце в норме и при экспериментальной ишемии миокарда. Выявлено изменение активности, кинетических и регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ в условиях окислительного стресса, вызванного ишемией. Предполагается участие НАД- и НАДФ-МДГ в регуляции генерирования АФК и интенсивности СРО в условиях ишемического повреждения ткани. Полученные данные свидетельствуют, что контроль образования АФК может осуществляться за счет изменения активности данных ферментов, происходящего в результате модификации кинетических свойств и регуляции активности под действием ионов металлов Бе2*, Са2+, пероксида водорода, глутатиона, интермедиатов цикла Кребса и адениннуклеотидов. Полученные данные способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений об организации, регуляции и механизмах сопряжения выработки АФК с функционированием ключевых ферментов клеточного метаболизма в условиях нормы и патологии сердца.

Практическая значимость. Исследование особенностей кинетических и регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ в условиях окислительного стресса, развивающегося при ишемии миокарда, способствует выяснению механизмов регуляции образования АФК, что играет существенную роль в понимании развития патологического процесса и поиске путей его коррекции в медицинской практике.

Разработанные способы получения высокоочищенных препаратов НАД- и НАДФ-МДГ из миокарда крысы могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», «Медицинская биохимия» (для студентов физического факультета), спецкурсов по энзимологии и аналитической биохимии. Кроме того, они используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 18 публикациях - 8 статьях и 10 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В условиях интенсификации СРО при экспериментальной ишемии миокарда происходит снижение активности НАД-МДГ в митохондриях и цитоплазме клеток миокарда и увеличение активности НАДФ-МДГ в цитоплазматической фракции клеток сердца крысы. С использованием гомогенных ферментных препаратов различно локализованных форм НАД-МДГ и цитоплазматической НАДФ-МДГ показано, что в условиях патологии изменяется ряд кинетических параметров каталитического действия и регуляции активности ферментов под действием ионов металлов Fe2+, Cu2+, Са2+, пероксида водорода, глутатиона, интермедиатов цикла Кребса и адениннуклеотидов.

2. Ряд модификаций регуляторных свойств митохондриальной и цитоплазматической НАД-МДГ, характерных для фермента из ишемизированного миокарда, такие как повышение степени ингибирования ионами Fe , Cu , некоторыми интермедиатами цикла Кребса, ингибирование восстановленным глутатионом, могут приводить к снижению активности НАД-МДГ, сопровождающимся торможением ЦТК при ишемии и, как следствие, окислению ферментов ЭТЦ - восстановителей 02 до 02"'.

3. Имеет место ряд изменений регуляторных свойств НАДФ-МДГ из ишемизированной ткани миокарда по сравнению с нормой (снижение чувствительности к ингибирующему действию пероксида водорода, отсутствие ингибирования окисленным глутатионом), которые могут способствовать стимуляции фермента. Это может отражаться на активности глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС через изменение содержания НАДФН в клетке. 4. С учетом полученных данных по исследованию функционирования НАД- и НАДФ-МДГ в миокарде крысы в условиях ишемии предложена гипотетическая схема, отражающая их возможное участие в регуляции интенсивности СРО.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сафонова, Ольга Анатольевна

ВЫВОДЫ

Показано, что в условиях ишемии происходит интенсификация СРО в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток миокарда, сопровождающаяся мобилизацией АОС и накоплением продуктов ПОЛ, причем степень развития данных процессов зависит от длительности ишемического воздействия на ткань. Установлено, что экспериментальная ишемия миокарда сопровождается повышением активности НАДФ-МДГ в 1,6 раза и снижением активности различно локализованных форм НАД-МДГ в 2,6 раза.

Исследования НАДФ- и НАД-МДГ из нормального и ишемизированного миокарда, проведенные с использованием гомогенных ферментных препаратов, показывают, что наряду со сходными свойствами (молекулярные массы, электрофоретические подвижности и др.), для ферментов характерны изменения некоторых кинетических и регуляторных свойств при патологии. При экспериментальной ишемии происходит модификация кинетических параметров НАД- и НАДФ-МДГ, отражающих их сродство к субстратам, а также изменение рН- и температурных оптимумов.

Выявлено изменение чувствительности исследуемых ферментов к действию ионов металлов: Ре2+, Си2+, Са2+; и пероксида водорода при патологии.

Показано, что глутатион в окисленной и восстановленной форме может участвовать в регуляции активности НАДФ- и НАД-МДГ как в норме, так и при ишемии. Для НАДФ-МДГ при ишемии отмечен активирующий эффект восстановленного глутатиона и снижение ингибирующего воздействия окисленного глутатиона. Для НАД

МДГ также характерно разнонаправленное влияние данных метаболитов в норме и при патологии.

Установлено, что в условиях ишемии наблюдается изменение регуляции активности НАДФ- и НАД-зависимых МДГ под действием адениннуклеотидов.

Выявлены изменения регуляторных свойств НАДФ- и НАД-МДГ из ишемизированного миокарда по отношению к интермедиатам ЦТК: цитрату, цис-аконитату, изоцитрату, 2-оксоглутарату, фумарату. На основании полученных данных исследования функционирования НАДФ- и НАД-МДГ в условиях окислительного стресса, вызванного ишемией, предложена гипотетическая схема возможного участия данных ферментов в лимитировании интенсивности свободнорадикальных процессов при патологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют об активации процессов СРО в митохондриях и цитоплазме кардиомиоцитов в условиях экспериментальной ишемии, причем степень выраженности данных процессов коррелирует с длительностью ишемии. Установлено, что параметры биохемилюминесценции - светосумма и интенсивность максимальной вспышки, отражающие интенсивность СРО, возрастают в цитоплазматической и митохондриальной фракциях клеток миокарда крысы при патологии по сравнению со значениями в норме. В то же время, согласно результатам измерения биохемилюминесценции, в субклеточных фракциях кардиомиоцитов при ишемии происходит мобилизация АОС. Однако уровень компенсаторных механизмов, направленных на снижение интенсивности свободнорадикальных процессов, оказывается недостаточным и в клетках сердечной мышцы крысы в условиях ишемического повреждения происходит увеличение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ.

Параллельно с интенсификацией СРО в субклеточных фракциях кардиомиоцитов после 40-минутной ишемии наблюдается снижение активности НАД-зависимой МДГ в 2,6 раза по сравнению с активностью фермента из нормального миокарда. Торможение активности митохондриальной НАД-МДГ, катализирующей одну из реакций ЦТК, по-видимому, может способствовать снижению образования АФК в ходе неполного восстановления кислорода в дыхательной цепи. Известно, что торможение ЦТК приводит к окислению ферментов ЭТЦ - восстановителей 02 до 02*- (8ки1асЬеу, 1996). Понижение активности цитоплазматической НАД-МДГ, участвующей в переносе восстановительных эквивалентов в митохондрии, также может приводить к снижению поставки НАДН в электрон-транспортную цепь митохондрий и таким образом лимитировать процессы СРО. Наряду с этими изменениями, в цитоплазматической фракции клеток миокарда крыс при патологии происходит повышение активности НАДФ-МДГ в 1,6 раза, что согласуется с данными об активации данного фермента в легочной ткани кролика при острой гипоксии (Ананьева, 1983). Нельзя исключить, что дополнительный НАДФН, образующийся при стимуляции НАДФ-МДГ в миокарде крысы в условиях оксидативного стресса, может использоваться глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС.

Согласно данным, полученным при исследовании субклеточной локализации НАД- и НАДФ-МДГ в кардиомиоцитах крысы методами дифференциального центрифугирования и ионообменной хроматографии, изменение ферментативной активности после коронароокклюзии не связано с перераспределением их активностей между клеточными компартментами. Показано, что для НАД- и НАДФ-МДГ из ишемизированного миокарда некоторые физико-химические свойства не изменяются по сравнению со значениями в норме. Так, значения молекулярных масс и электрофоретической подвижности, а также хроматографические свойства для ферментов из ишемизированного миокарда совпадали с данными, полученными при исследовании НАД- и НАДФ-МДГ из сердца крыс контрольной группы. Это позволяет говорить о маловероятности индукции новых изоформ фермента, а также модификации субъединичной структуры ферментов при патологии. В то же время, наблюдается изменение ряда кинетических параметров каталитического действия и регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ из ишемизированного сердца крысы по сравнению с их свойствами в норме, что было показано с использованием высокоочищенных ферментных препаратов. Согласно полученным результатам, при ишемии миокарда наблюдается изменение в величинах, отражающих сродство НАДи НАДФ-МДГ к субстрату и коферменту, и воздействии, оказываемом рН и температурой, на ферментативную активность по сравнению с данными, полученными в норме.

Усиление торможения активности митохондриальной и цитоплазматической

НАД-МДГ в условиях ишемии с помощью выявленных факторов (ионов Бе , Си , адениннуклеотидов, интермедиатов ЦТК) может являться одним из механизмов снижения генерирования АФК в ЭТЦ митохондрий кардиомиоцитов. Изменение функционирования НАДФ-МДГ под действием пероксида водорода, ионов Са2+, Си2+, глутатиона, интермедиатов ЦТК также может сказываться на активности ряда ферментативных систем клетки. Не исключена возможность сопряжения работы данного фермента с функционированием глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС, требующей НАДФН для восстановления глутатиона. В то же время глутатион может самостоятельно выступать в качестве эффективного антиоксиданта, перехватывая свободные радикалы, восстанавливая АФК и продукты оксидативной модификации (Кения, 1993).

На основании полученных данных можно предположить участие НАДи НАДФ-МДГ в лимитировании уровня АФК и интенсификации СРО, происходящей при ишемическом повреждении ткани миокарда. На рис. 38 представлена гипотетическая схема, отражающая возможный вклад НАД- и НАДФ-МДГ в регуляцию интенсивности свободнорадикальных процессов в кардиомиоцитах при ишемии. Согласно представленной схеме, в компартментах кардиомиоцитов при развитии патологического процесса происходит интенсификация СРО, приводящая к повреждению клеточных структур. Вместе с тем на начальных этапах цепи патогенетического повреждения клеток происходит мобилизация антиоксидантных и сопряженных с ними систем. Одним из возможных механизмов снижения уровня АФК является торможение активности ключевых ферментов ЦТК, выполняющих роль поставщиков НАДН в электрон-транспортную цепь митохондрий, к числу которых относится НАД-МДГ. Вместе с тем, в клетке происходит также активация систем, утилизующих уже образовавшиеся АФК, среди которых важное место занимает глутатионредуктазная / глутатионпероксидазная АОС, для функционирования которой необходим НАДФН. При недостаточном поступлении кислорода в клетки миокарда реализуется усиление генерирования АФК, что является пусковым механизмом для интенсификации СРО и, в частности, ПОЛ, результатом чего является нарушение структурного и функционального состояния многих метаболических систем клетки. Влияние АФК на биологические макромолекулы при ишемии во многом усугубляется повышением I проницаемости биомембран для ионов Са , выступающих в качестве активаторов НАДФН-оксидазы — продуцента супероксидного радикала - и фосфолипаз (Меерсон, 1984), влияющих на состояние клеточных мембран. Необходимо отметить, что ведущая роль в образовании наиболее реакционноспособной АФК - ОН* - в реакции Фентона принадлежит ионам Ре2+, которые таким образом способствуют запуску цепных свободнорадикальных процессов. В силу вышесказанного очевидно, что хелаторы ионов Ре2+, к числу которых принадлежит цитрат, будут выступать в качестве антиоксидантов. Не исключена возможность усиления поставки цитрата в митохондрии при снижении активности НАД-МДГ и накоплении малата, поскольку существует предположение о наличии малат-стимулируемой системы переносчиков цитрата (8лу1егс2упзк1, 1976).

Согласно результатам проведенных исследований, ионы

Са , снижающие активность НАДФ-МДГ из сердца контрольных животных, в концентрациях до 0,1 мМ оказывают активирующее влияние на фермент из ишемизированного миокарда. Выявленное изменение свойств НАДФ-МДГ по отношению к ионам этого металла может иметь значение для усиления его активности в условиях патологии и регуляции глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС. На различно локализованные формы НАД-МДГ из кардиомиоцитов крысы ионы Са оказывают также разнонаправленное влияние в норме и при ишемии, что может быть следствием модификации конформации белка при изменении его микроокружения в условиях патологии.

Ионы Бе оказывают более сильное ингибирующее воздействие на НАДФ-зависимую МДГ и митохондриальную НАД-МДГ из сердца крысы при ишемии по сравнению со значениями в норме. Активность цитоплазматической НАД-МДГ при концентрациях ионов ¥е2+ до 0,1 мМ также сильнее снижена в случае фермента из патологически измененной ткани. Усилению свободнорадикальных процессов могут способствовать и ионы меди ^асктап, 2000). Ионы Си2+ также снижают активность исследуемых ферментов. Причем чувствительность НАДФ-МДГ к ингибирующему влиянию Си более сильно выражена в случае нормы, а НАД-МДГ - при патологии.

Изменение метаболич' iL ких процессов в клетке

Нарушение барьерных и транспорты* свойств мембраны

Оксидативная Накопление модификация продуктов белков ПОЛ

X I

Интенсификация ПОЛ ГП X АФК — ^л о/-^ нго:-*он* фЛелаторы

MTX цитрат)

Fe У

Недостаток 02

Ca пируват малат f НАДФ-1 С5И

ФЕП МДГ Т -*НАДФН трат и зо цитрат 1 -^НДД плазматическая мембрана

Рис. 38. Гипотетическая схема участия НАД- и НАДФ-МДГ в регуляции интенсивности СРО при ишемии миокарда: I этап - повышение интенсивности СТО; II - снижение активности НАД-МДГ и поставки НАДН в ЭТЦ митохондрий, повышение активности НАДФ-МДГ и уровня НАДФН, необходимого для функционирования ГР/ГП системы; III - снижение интенсивности СЮ. Условные обозначения: антиоксидантный эффект; а (и) - активирующий (ингибируюший) эффект в условиях ишемии при отсутствии эффекта в норме; а+ (и+) - усиление воздействия при патологии; а- (и-) - снижение воздействия при ишемии

НАД*

Г^1 r-S-S-r, НАДФН Г-Str НАДФ*

HjO-, ^аспартат

ОА надн:;|^ад-мдг

НАД малат цитоплазма ппазмати ческая мембрана -С оказывает слабое ингибирующее влияние на НАДФ-МДГ из сердца контрольных животных и активирует фермент из ишемизированного миокарда. На НАД-зависимую МДГ глутатион в окисленной и восстановленной форме также оказывает разнонаправленное действие в норме и при патологии, что может быть следствием перестроек в структуре белка.

Известно, что при прекращении кровоснабжения в ткани происходят метаболические нарушения, приводящие к изменению содержания адениннуклеотидов, играющих основополагающую роль в энергетическом обмене клетки. Исследование влияния АТФ, АДФ и АМФ на функционирование МДГ из кардиомиоцитов крысы показало, что данные соединения оказывают различное действие на ферменты из нормального и ишемизированного миокарда. По-видимому, изменение некоторых регуляторных свойств НАД- и НАДФ-МДГ под действием адениннуклеотидов при патологии может сказываться на изменении их активности.

Исследование влияния интермедиатов ЦТК, концентрация которых также может изменяться в условиях окислительного стресса, сопряженного с ишемией, на активность МДГ в норме и при патологии, свидетельствует об изменении регуляции данных ферментов под действием этих клеточных метаболитов в условиях ЭИМ. Так, цитрат, изоцитрат, 2-оксоглутарат оказывают более выраженный ингибирующий эффект на цитоплазматическую и митохондриальную НАД-МДГ из ишемизированного миокарда по сравнению со значениями в норме. Для НАДФ-МДГ, напротив, наблюдается снижение чувствительности к ингибирующему действию большинства исследованных промежуточных метаболитов цикла Кребса.

Таким образом, активность данных ферментов в норме и при ишемии регулируется под действием комплекса клеточных метаболитов, концентрация которых может изменяться при патологии, и, вероятно, определяется конкуренцией между процессами активации и ингибирования под влиянием ионов некоторых металлов, пероксида водорода, глутатиона, адениннуклеотидов, интермедиатов ЦТК. Торможение активности НАД-МДГ и возникновение или усиление ингибирующих эффектов под действием ряда факторов может иметь значение для снижения поставки НАДН в ЭТЦ митохондрий, что может предотвращать образование АФК в ходе неполного восстановления кислорода. Повышение активности НАДФ-МДГ может сказываться на функционировании глутатионредуктазной / глутатионпероксидазной АОС. В этой связи изменение функционирования исследуемых ферментов в присутствии ряда клеточных метаболитов может играть существенную роль в лимитировании процессов свободнорадикального окисления при их усилении в условиях патологии.

177

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сафонова, Ольга Анатольевна, Воронеж

1. Абрамова Ж.И. Человек и противоокислительные вещества / Ж.И. Абрамова, Г.И. Оксенгендлер. Л.: Наука, 1985. - 230 с.

2. Азизова O.A. Хемилюминесцентная оценка антиоксидантного статуса больных атеросклерозом / O.A. Азизова, А.П. Пирязев, М.П. Шерстнев и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2001. - Т. 131, № 5. — С. 524-526.

3. Алкеперов М.А. Ишемическая болезнь сердца (метаболические процессы) / М.А. Алкеперов, И.И. Мамедов. Баку: Азербаджан. гос. изд-во, 1990.-142 с.

4. Алмазов В.А. Роль гиперпероксидации липидов в нарушении структурной организации тромбоцитарных мембран / В.А. Алмазов, B.C. Гуревич, Л.В. Шаталина и др. // Бюлл. экспер. биол. 1992. - № 9. -С. 265-267.

5. Ананьева Г.В. Роль цитоплазматических НАДФ-зависимых дегидроге-наз в регуляции пластического обмена легочной ткани в условиях гипоксии / Г.В. Ананьева, В.В. Поступаев, Е.Г. Рябцева // Эксперим. и клинич. энзимология. Хабаровск, 1983. - С. 8-11.

6. Артюхов В.Г. Биологические мембраны (структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами) / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 2000. - 296 с.

7. Артюхов В.Г. Биофизика / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалёва, В.П. Шмелёв. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1994. - 332 с.

8. Бабижаев М.А. Передача клеточного сигнала и модуляция свободнора-дикального окисления новым пептидомиметиком а-глутамилгистамином / М.А. Бабижаев, Ю.А. Семилетов, Ю.А. Люль-кин и др. // Биохимия. 1999. - Т. 64, вып. 5. - С. 612-627.

9. Барабой В. А. Перекисное окисление и стресс /В. А. Барабой, И. И. Брехман, В. Г. Голотин и др. СПб.: Наука, 1992. - 148 с.

10. Ю.Беленков Ю. Клиническая классификация ишемической болезни сердца / Ю. Беленков, Е. Чазов, В. Гасилин и др. // Кардиология, 1984. -Т. 5, № 10.-С. 111-113.

11. Бизюкин A.B. Эффекты ионов кальция на вне- и внутриклеточные процессы генерации активных форм кислорода в фагоцитирующих клетках крови / A.B. Бизюкин, З.Ф. Хараева, С.К. Соодаева и др. // Бюлл. экспе-рим. биол. и мед. 1998. - Т. 126, № 9. - С. 334-336.

12. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов / М.В. Биленко. М.: Медицина, 1989. - 368 с.

13. Большая медицинская энциклопедия / Под ред. Петровского Б.В. М.: Большая советская энциклопедия, 1978. - Т. 9. - С. 462-469.

14. Браунвальд Ю. Уменьшение размера инфаркта после коронарной окклюзии / Ю. Браунвальд, П.Р. Мароко, П. Либби // Метаболизм миокарда: материалы 1 сов.-амер. симпозиума, 4-6.11.1973, Америка / Науч. ред. Е.В. Чазов. М.: Медицина, 1975. - С. 391-397.

15. Бурлакова Е.Б. Молекулярные механизмы действия антиоксидантов при лечении сердечно-сосудистых заболеваний /Е.Б. Бурлакова // Кардиология. 1980. - № 8. - С. 48-52.

16. Буценко З.А. Хроматографическое разделение лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы из сердечной мышцы свиньи / З.А. Буценко, Т.А. Боднева, Р.К. Вайткавичюс // Производство и применение биореакторов. Вильнюс, 1987. - С. 81 -86.

17. Варфоломеев С.Д. Биокинетика: практический курс / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. М.: Фаир-пресс, 1999. - 720 с.

18. Варфоломеев С.Д. Простагландины новый тип биологических регуляторов / С.Д. Варфоломеев // Соросовский Образовательный Журнал. - 1996. -№ 1. - С. 40-47.

19. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах/ Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972. - 252 с.

20. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, O.A. Азизова, А.И. Деев и др. // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. - Т. 29. - С. 110-122.

21. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестник РАМН. 1998. - № 7. - С. 43-51.

22. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко М.: Высш. шк., 1985. — 199 с.

23. Владимиров Ю.А. Хемилюминесценция клеток животных / Ю.А. Владимиров, М.П. Шерстнёв // Биофизика. 1989. - Т. 24. - С. 176-185.

24. Воскресенский О.Н. Антиоксидантная система, онтогенез и старение / О.Н. Воскресенский, И.А. Жугаев, В.Н. Бобырев и др. // Вопр. мед. химии. 1982. - № 1. - С. 14-27.

25. Воскресенский О.Н. Биоантиоксиданты облигатные факторы питания / О.Н. Воскресенский, В.Н. Бобырев // Вопр. мед. химии. - 1992. - № 4. -С. 21-26.

26. Воскресенский О.Н. Перекиси липидов в живом организме / О.Н. Воскресенский, А.П. Левицкий // Вопр. мед. химии. 1970. - Т. 16, № 6. -С. 563-583.

27. Ганелина И.Е. Ишемическая болезнь сердца и индивидуальные особенности организма / И.Е. Ганелина Л.: Наука, 1975. - 43 с.

28. Гацура В.В. Фармакологическая коррекция энергетического обмена ишемизированного миокарда / В.В. Гацура. М.: Антекс, 1993. - 254 с.

29. Глотов H.A. Влияние гипоксии и глютаминовой кислоты на содержание кетокислот в миокарде и почках крыс / H.A. Глотов, Л.Т. Шмелева // Укр. биохим. журн. 1973. - № 5. - С. 605-608.

30. Горбунов Н.В. Влияние структурной модификации мембранных белков на липид-белковое взаимодействие в мембранах эритроцитов человека / Н.В. Горбунов // Бюлл. экспер. биол. 1993. - № 11. - С. 488-491.

31. Гордеева A.B. Взаимосвязь между активными формами кислорода и кальцием в живых клетках /A.B. Гордеева, P.A. Звягильская, Ю.А. Ла-бас // Биохимия. 2003. - Т. 68, вып. 10. - С. 1318-1322.

32. Гродзинский A.M. Краткий справочник по физиологии растений / A.M. Гродзинский, Д.М. Гродзинский. Киев: Наукова думка, 1973. - 273 с.

33. Гусев В.А. Супероксидный радикал и супероксиддисмутаза в свободнорадикальной теории старения / В.А. Гусев, Л.Ф. Панченко // Вопр. мед. химии. 1982. - № 4. - С. 8-25.

34. Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки. Ч. 1. классификация и структура. Ч. 2. Структура и механизм функционирования / Н.Б. Гусев // Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 5. — С. 2-16.

35. Гуткин Д.В. Активность антиоксидантных ферментов миокарда при его ишемии / Д.В. Гуткин, Ю.А. Петрович // Бюлл. эксперим. биол. и мед. -1982.-Т. 1.-С. 33-35.

36. Денисов JI.H. Антиоксидантные эффекты витаминов. Значение в ревматологии / Л.Н. Денисов, Л.С. Лобарева, Е.О. Якушева // Тер. арх. -1994. Т. 66, № 5.—С. 82-86.

37. Детерман Г. Гель-хроматография/Г. Детерман. -М.: Мир, 1970. 252 с.

38. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 3. - 605 с.

39. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 2.-515 с.

40. Долгов В.В. Лабораторная диагностика нарушений обмена железа / В.В. Долгов, С.А. Луговская, М.Е. Почтарь и др. СПб.: Витал Диагностике СПб, 2002. - 52 с.

41. Дубинина Е.Е. Антиоксидантная система плазмы крови / Е.Е. Дубинина // Укр. биохим. журн. 1992. - Т. 64, № 2. - С. 3-15.

42. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма / Е.Е. Дубинина // Успехи соврем, биологии. 1989. - Т. 108, № 1(4). - С. 3-12.

43. Евшина И. Активность малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы плазмы и эритроцитов у больных ИБС до и после хирургического лечения / И. Евшина, Л. Нагичева, А. Алке // Арян сирджанарутюн. Кровообращение. 1974. - № 7. - С. 30 - 35.

44. Емнова Е.Е. Препарат малатдегидрогеназы из термофильной водородной бактерии Pseudomonas thermophila / Е.Е. Емнова, А.К. Романова,

45. B.В. Котелев // Прикладн. биохим. и микробиол. 1982. - Т. 18, № 2.1. C. 221-224.

46. Журавлев А.И. Биохемилюминесценция / А.И. Журавлев. М.: Наука, 1983.-С. 222-240.

47. Иванищев Б.В. Кинетические свойства малатдегидрогеназы из хлоропластов хлопчатника / Б.В. Иванищев // Докл. АН Тадж. ССР. — 1990.— Т. 33, № 12.— С. 839—842.

48. Иванищев В. В. Ферменты метаболизма малата: характеристика, регуляция активности и биологическая роль/ В.В. Иванищев, Б.И. Курганов // Биохимия. 1992. - Т. 57, № 5. - С. 653 - 662.

49. Иванищев В.В. Выделение и кинетические свойства NAD-зависимой малатдегидрогеназы из хлоропластов листьев хлопчатника /В.В. Иванищев, Б.И. Курганов // Биохимия. 1993. - Т. 58, № 4. - С. 606-611.

50. Иванов В.В. Соотношение интенсивности перекисного окисления липидов и рецепции инсулина в адипоцитах /В.В. Иванов, М.П. Стенни-кова // Вопр. мед. химии. 1993. -№11.— С. 23-25.

51. Каган В.Е. Об участии свободных активных форм кислорода в ферментативном перекисном окислении липидов в биомембранах / В.Е. Каган, Л.Л. Прилипко, В.М. Саввов и др. // Биофизика. 1979. - Т. 44, № 3. -С. 482-489.

52. Капелько В.И. Работа сердца / В.И. Капелько // Соросовский образовательный журнал. 1999. - № 4. - С. 28-35.

53. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Т. Келети. М.: Мир, 1990.-350 с.

54. Кения М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кения, А.И. Лукаш, Е.П. Гуськов // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, № 4. - С. 456-470.

55. Клебанов Г.И. Антиоксидантные свойства производных 3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина / Г.И. Клебанов, О.Б. Любицкий, О.В. Васильева и др. // Вопросы мед. химии. 2001. -№ 3. - (http://medi.ru/doc/88.htm).

56. Клиническая оценка лабораторных тестов / Под ред. Н.У. Тица. М.: Медицина, 1986. - 480 с.

57. Коган А.Х. Свободнорадикальное перекисное окисление липидов и патогенез коронароокклюзионного инфаркта миокарда / А.Х. Коган, А.Н. Кудрин, С.М. Николаев // Свободнорадикальное окисление в норме и патологии. М., 1976. - С. 68-78.

58. Кожевников Ю.Н. О перекисном окислении липидов в норме и патологии / Ю.Н. Кожевников // Вопр. мед. химии. 1985. - № 5. - С. 2-7.

59. Констатинов В. Связь новых случаев ИБС с основными факторами риска / В. Констатинов // Кардиология. 1994. - № 2. - С. 135-136.

60. Косолапов В.А. Хемилюминесцентные методы в оценке свободноради-кальных реакций / В.А. Косолапов, О.В. Островский, A.A. Спасов // Клиническая и лабораторная диагностика. 1991. - Т. 9. - С. 41.

61. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. М.: Высш. шк., 1980. - 272 с.

62. Красновский А.А. Системы генерации и тушения синглентного кислорода в биомембранах / А.А. Красновский // V всесоюзный биохимический съезд, Москва. М.,1985. - 194 с.

63. Краткая медицинская энциклопедия / Под ред. В.И. Покровского. М.: Медицинская энциклопедия, 1994. - 544 с.

64. Круглякова К.Е. Общие представления о механизме действия антиок-сидантов / К.Е. Круглякова, JI.H. Шишкина // Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo: Сб. научн. статей. — М., Наука, 1992. С. 4-9, 20-56.

65. Кудрин А. Атеросклероз и факторы риска / А. Кудрин, В. Смоленский, А. Коган //Кардиология. 1988. -Т. 28, № 7. - С. 115-121.

66. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул / В.И. Кулинский // Соросовский образовательный журнал. 1999. - № 1. - С. 2-8.

67. Кулинский В.И. Биологическая роль глутатиона / В.И. Кулинский, JI.C. Колесниченко // Успехи соврем, биологии. 1990. - Т. 110, № 1(4). - С. 20-33.

68. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты / Б.И. Курганов. — М.: Наука, 1978.-248 с.

69. Кучеренко Н.Е. Липиды / Н.Е. Кучеренко, А.Н. Васильев. Киев: Вища школа, 1985. - 248 с.

70. Ламблич И.С. Стенокардия / И.С. Ламблич, С.П. Стожинич; Под ред. И.С. Ламблича. М.: Медицина, 1990. - 432 с.

71. Ланкин В.З. Роль перекисного окисления липидов в этиологии и патогенезе атеросклероза / В.З. Ланкин, A.M. Вихерт, А.К. Тихазе и др.// Вопр. мед. химии. 1989. - № 3. - С. 18-24.

72. Ланкин В.З. Свободнорадикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы / В.З. Ланкин, А.К. Тихазе, Ю.Н. Беленков // Кардиология. 2000. - Т. 7. - С. 48-57.

73. Ланкин В.З. Ферментативное перекисное окисление липидов (ФПОЛ) / В.З. Ланкин // Укр. биохим. журн. 1984. - Т. 56, № 3. - С. 317-331.

74. Ллойд Э. Справочник по прикладной статистике / Э. Ллойд, У. Ледер-ман. М.: Финансы и статистика, 1990. - С. 493-513.

75. Лукомская И.С. Нейтральная глюкозидаза мочи человека как маркер повреждений почек / И.С. Лукомская, Т.П. Лавренева, H.A. Томилина и др.// Вопр. мед. химии. 1984. - № 4. - С. 74-76.

76. Маликов В.Ф. Ферментные системы обмена глутаминовой и яблочной кислот сухих семян пшеницы / В.Ф. Маликов, В.Р. Шатилов// Физиол. раст. наука 3-го тысячелетия: Междунар. конф., Москва, 4-9 октября 1999 г.-М., 1999.-С. 627.

77. Малюк В.И. Энергетический обмен миокарда при пороках сердца и метаболическая коррекция его нарушений: автореф. дисс. . д-ра мед. наук / В.И. Малюк. Киев, 1977. - 46 с.

78. Мартынов И.В. Безболевая ишемия миокарда /И.В. Мартынов, А.Л. Верткин, B.C. Гасилин. М.: Тетрафарм. - 1995. - 103 с.

79. Мачарашвили Д.А. О взаимозависимости ультраструктуры и биохимического статуса сердечной мышцы при экспериментальном инфаркте миокарда / Д.А. Мачарашвили, Р.Г. Лемонджава, З.Г. Хапава и др. //

80. Клеточные механизмы межорган, и межсистем, взаимоотношений. — Ташкент, 1989. С. 84-87.

81. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. Новосибирск: Наука, 1983. - 264 с.

82. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы): справочник / Под ред. А.И. Карпищенко. — СПб.: Интермедика, 1997. — С. 21-29.

83. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемиче-ских повреждений сердца / Ф.З. Меерсон. М.: Медицина, 1984. - 272 с.

84. Меерсон Ф.З. Роль перекисного окисления липидов в патогенезе ише-мического повреждения и антиоксидантная защита сердца / Ф.З. Меерсон, В.Е. Каган, Ю.П. Козлов и др. // Кардиология. 1982. - № 2. -С. 81-92.

85. Метаболизм миокарда: материалы 1 сов.-амер. симпозиума, 46.11.1973, Америка/Под ред. Е.В. Чазова. М.: Медицина, 1975. - 432 с.

86. Мешкова Н.П. Практикум по биохимии / Н.П. Мешкова, С.Е. Северин. -М.: Мир, 1979.-430 с.

87. Миллер Ю.И. Связывание ксенобиотиков альбумином сыворотки крови / Ю.И. Миллер // Клин. лаб. диагностика. 1993. - № 1. - С. 34-40.

88. Муравьев Р.А. Химические основы неспецифического иммунитета / Р.А. Муравьев, В.В. Роговин // Известия АН. Серия биологическая. -2001. -№3.-С. 284-292.

89. Непомнящих J1.M. Количественное взаимоотношение паренхимы и стромы миокарда млекопитающих при ишемии миокарда / J1.M. Непомнящих, JI.B. Колесникова // Бюлл. экспер. биол. 1977. - № 8. — С. 247-250.

90. Обухова JI.K. Токсические продукты метаболизма миокарда и возрастная утрата функциональной активности / JI.K. Обухова // Надёжность и элементарные события процессов старения биологических объектов. Киев, 1986. - С.89-96.

91. Орлов Л.П. Сократительная функция и ишемия миокарда / Л.Л. Орлов, A.M. Шилов, Г.Е. Ройтберг. М.: Наука, 1987.-247 с.

92. Осипов А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов, О А. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи биологической химии. 1990. - Т. 31, № 2. - С. 180-208.

93. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 с.

94. Пат 4591555 США, МКИ С 12 Q 1/32, VKU 435/26. Malate dehydrogenase method / L.H. Bernstain. № 488693; заявл. 27.04.1983; опубл. 27.05.1986.

95. Пат. 0152359 ГДР, МКИ С 12 N 9/04. Verfahren zur Reinigung von Lactatdehydrogenase und Malatdehydrogenase / Bittner R., Boehme H.-J., Koppenschlaeger G. № 223083; заявл. 04.08.80; опубл. 25.11.81.

96. Пентюк A.JI. Изучение новых функциональных свойств альбумина / А.Л. Пентюк, P.A. Мусин, Г.П. Марченко // Вопр. мед. химии. -1995.-№3.-С. 11-13.

97. Персанов В.М. Локализация цикла С4 дикарбоновых кислот в клеточных структурах ассимиляционных тканей листа кукурузы / В.М. Персанов, Л.Г. Кузнецова, Ю.С. Карпилов и др. // Физиология растений. - 1975. - Т. 22. - С. 479-483.

98. Петрович Ю.А. Глутатионпероксидазы в системе антиоксидант-ной защиты мембран / Ю.А. Петрович, Д.В. Гуткин // Пат. физиол. -1981.-№5.-С. 76-78.

99. Петрович Ю.А. Свободно-радикальное окисление и роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса / Ю.А. Петрович, Д.В. Гуткин // Пат. физиол. 1986. - № 5. - С. 85-92.

100. Пинейру де Карвалью М.А.А. Малатдегидрогеназа высших растений / М.А.А. Пинейру де Карвалью, A.A. Землянухин, А.Т. Еприн-цев. Воронеж: Изд-во Воронеж, госун-та, 1991. - 216 с.

101. Поберёзкина Н.Б. Биологическая роль супероксиддисмутазы / Н.Б. Поберёзкина, Л.Ф. Осинская // Укр. биохим. журн. 1989. - Т. 61, № 2. - С. 14-27.

102. Попов В.Н. Индукция пероксисомальной изоформы малатдегид-рогеназы в печени крыс при пищевой депривации / В.Н. Попов, C.B. Волвенкин, Т.А. Косматых // Биохимия. 2001. — Т. 66, вып. 5. -С. 617-623.

103. Попов В.Н. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в различных тканях голодающих крыс / В.Н. Попов, C.B. Волвенкин, А.Т. Епринцев и др. // Изв. РАН. Сер. биол. 2000. - № 6. - С. 672-678.

104. Попова И.В. Функционирование различных ветвей цикла Кребса в растениях в условиях солевого стресса / И.В. Попова, В.В. Сидоренко

105. Откр. гор. науч. конф. мол. ученых, Пущино, 23-25 апреля 1997 г. -Пущино, 1997. С. 24.

106. Прайер У. Свободные радикалы в биологии: в 2-х т. / У. Прайер. -М.: Мир, 1979. Т. 1. - 318 е.; Т. 2. - 328 с.

107. Практическая кардиология / Под ред. В.В. Горбачёва. Минск: Высш. шк., 1997. - Т. 1.- 311 с.

108. Прохорова М.И. Методы биохимических исследований / М.И. Прохорова. Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. - 272 с.

109. Розенберг В.Д. Патоморфологические особенности миокардиаль-ных мостиков и их роль в патогенезе ишемической болезни сердца / В.Д. Розенберг, Л.М. Непомнящих // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2002. -Т. 132, №2.-С. 685-689.

110. Рудько И.А. Состояние прооксидантной и антиоксидантной систем эритроцитов у больных с хронической почечной недостаточностью / И.А. Рудько, Т.С. Балашова, A.A. Кубатиев и др. // Тер. арх. 1995. -Т. 67, № 8. - С. 7-9.

111. Рыжова Д.П. Особенности ингибирования избытком субстрата различных олигомерных форм лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы / Д.П. Рыжова, М.В. Иванов // 2 Съезд Биохим. общества РАН, Москва, 19-23 мая 1997 г.: тез. докл. М., 1997. - С. 63.

112. Санина O.JI. Биологическая роль церулоплазмина и возможности его клинического применения / O.J1. Санина, Н.К. Бердинских // Вопросы мед. химии. 1986. - Т. 32, № 5. - С. 7-14.

113. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: Добро и зло / В.П. Ску-лачев // Соросовский Образовательный Журнал. — 1996. — № 3. — С. 4-10.

114. Скулачев В.П. Снижение внутриклеточной концентрации 02 как особая функция дыхательных систем клетки / В.П. Скулачев // Биохимия. 1994. - Т. 59, № 12. - С. 1910-1912.

115. Скулачев В.П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма / В.П. Скулачев // Биохимия. 1999. - Т. 64, вып. 12. - С. 1679-1688.

116. Соколовский В.В. Тиолдисульфидное соотношение крови как показатель состояния неспецифической резистентности организма: учебное пособие / В.В. Соколовский. СПб., 1996. - 30 с.

117. Спиричев В.Б. Жирорастворимые витамины и мембраны / В.Б. Спиричев, И.Л. Коль //Журн. Всесоюз. хим. общ-ва им. Д.И. Менделеева. 1978. - Т. 23, № 4. - С. 425-434.

118. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот / И.Д. Стальная // Современные методы в биохимии / Под ред. Ореховича В.Н. М.: Медицина, 1977. - С. 63-64.

119. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью 2-тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии / Под ред. Ореховича В.Н. — М.: Медицина, 1977. С. 66-68.

120. Стрелакакк Н. Физиология и патофизиология сердца / Н. Стрела-какк. М.: Медицина, 1990. - Т. 1. - 622 с.

121. Ткемаладзе Г.Ш. Кинетические свойства малатдегидрогеназы растений / Г.Ш. Ткемаладзе // Биохимия. 1981. - Т. 46, № 6. - С. 1133—1141.

122. Ткемаладзе Г.Ш. Стабильность малатдегидрогеназы и NADP-глутаматдегидрогеназы чайного растения и виноградной лозы./ Г.Ш. Ткемаладзе // Сообщ. АН ГССР. 1984. - Т. 116, № 3. - С. 605-608.

123. Турков М.И. Супероксиддисмутаза: свойства и функции / М.И. Турков // Успехи соврем, биологии. 1976. - Т. 81, № 3. - С. 341-354.

124. Ферментная диагностика острого инфаркта миокарда: методические рекомендации Министерства здравоохранения России. Саратов, 1992. - 24 с.

125. Фетисова Т.В. Биохимия инфаркта миокарда / Т.В. Фетисова, P.A. Фролькис. Киев: Здоров'я, 1976. - 166 с.

126. Хитров Н.К. Адаптация сердца к гипоксии / Н.К. Хитров, B.C. Пауков. М.: Медицина, 1991. - 238 с.

127. Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов и системы, регулирующие его интенсивность / Н.Г. Храпова // Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. -М., 1981. С. 147-155.

128. Цитология ферментов / Под ред. Покровского. М.: Мир, 1971. -89 с.

129. Шапиро А.З. Свойства малатдегидрогеназы мышц мидий Mytilus galloprovincialis / А.З. Шапиро // Ж. эволюц. биохимии и физиол. — 1984. Т. 20, № 2. - С. 135—139.

130. Шурыгин Д. Динамика изменения содержания миоглобина и активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови больных инфарктом миокарда и стенокардией / Д. Шурыгин, Ю. Шишмарев, А. Грачев // Терапевт, архив. 1983. - Т. 15, № 5. - С. 7-11.

131. Шхвацбая И. Ишемическая болезнь сердца / И.Шхвацбая. М.: Медицина, 1975. - 399 с.

132. Эмеретли И.В. Влияние гипоксии различной продолжительности на активность малат- и лактадегидрогеназы в тканях мидии / И.В. Эмеретли // Гидробиол. ж. 2001. - Т. 37, № 2. - С. 81-85.

133. Allen L.M. Malicdehydrogenase. IX. Primary structure of tryptic peptides from pig heart supernatant enzyme / L.M. Allen, J. Vanecek. // Arch. Biochem. andBiophys. 1971. - V. 143, № 1. - P. 166-174.

134. Anderson L.E. Extraction of a membrane bound factor and a reconstitution of light activation of NADP-malate dehydrogenase / L.E. Anderson // 5th Int. Congr. Photosynth. 1980. - V. 52, № 7. - P. 332-335.

135. Anversa P. Apoptosis and myocardial infarction / P. Anversa, W. Cheng, Y. Liu et al. // Basic Res. Cardiol. 1998. - V. 93, Suppl. 3. -P. 8-12.

136. Appels M.A. Identification of cytoplasmic nodule-associated forms of MDG involved in the symbiosis between Rhizobium leguminosarum and Pisum sativum / M. A. Appels, H. Hanker // Eur. J. Biochem. 1988. - V. 171, №3.- P. 515-522.

137. Arai T. Decrease in malate dehydrogenase activities in peripheral leucocytes of type 1 diabetic dogs / T. Arai, M. Nakamura, E. Magori et al. // Res. Vet. Sci. 2003. - V. 74, № 2.-P. 183-185.

138. Arrigo A.P. Gene expression and the thiol redox state / A.P. Arrigo // Free Radic. Biol. Med. 1999. - V. 27. - P. 936-944.

139. Bannister J.V. The generation of hydroxyl radicals following superoxide production by neutrophil NADPH oxidase / J.V. Bannister // FEBS Lett. 1982. - V. 150. - P. 300-302.

140. Belfiore F. Enzyme activities NADPH-forming metabolic pathways in normal and leukemic leukocymes / F. Belfiore, V. Borzi, L. Lo Vecchio et al. // Clin. Chem. 1975. -V. 21, № 7. - P. 880-883.

141. Bell J.K. Structural analyses of a malate dehydrogenase with a variable active site / J.K. Bell, H.P. Yennawar, S.K. Wright et al. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276, № 33. - P.31156-31162.

142. Bessho M. NAD and NADH values in rapidly sampled dog heart tissues by two different extraction methods / M. Bessho, T. Tajima, S. Hori et al. // Anal. Biochem. 1989. - V. 162, № 2. - P. 304-308.

143. Bidlack W.R. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation / W.R. Bidlack, A.L. Tappel // Lipids. 1973. - V. 8, № 4. -P. 203-207.

144. Biemond P. Superoxide dependent release from ferritin in inflamatory disease / P. Biemond, A.J.G. Swaak, H. Van Eigjk et al. // Free Radic. Biol. Med. 1988.-V. 4, № l.-P. 185-198.

145. Birktoft J.J. Refined crystal structure of cytoplasmic malate dehydrogenase at 2.5 A resolution / J.J. Birktoft, G. Rhodes, L.J. Banaszak // Biochemistry. — 1989. — V. 28, № 14. — P. 6065—6081.

146. Birktoft J.J. Structure of porcine heart cytoplasmic malate dehydrogenase: combining X-ray diffraction and chemical sequence data in structural studies / J.J. Birktoft, R.A. Bradshaw / Biochemistry. 1987. - V. 26. - P.2722-2734.

147. Bishop S.P. Regional myocardial blood flow during acute myocardial infarction in the conscious / S.P. Bishop, F.C. White, C.M. Bloor // Girc. Res. 1976. - V. 38. - P. 429-438.

148. Bjork A. Electrostatic interactions across the dimer-dimer interface contribute to the pH-dependent stability of a tetrameric malate dehydrogenase / A. Bjork, D. Mantzilas, R. Sirevag et al. // FEBS Lett. 2003. -V. 553, №3.-P. 423-426.

149. Bjork A. Stabilization of a tetrameric malate dehydrogenase by introduction of a disulfide bridge at the dimer-dimer interface / A. Bjork, B. Dal-hus, D. Mantzilas et al. // J. Mol. Biol. 2003. - V. 334, № 4. - P. 811-821.

150. Boernke W.E. Stringency of substrate-specificity of Escherichia coli malate dehydrogenase / W.E. Boernke, C.S. Millard, P.W. Stevens et al. // Arch. Biochem. and Biophys. 1995. - V. 322, № 1. - p. 43-52

151. Bracht A. Mitochondrial L-malate dehydrogenase: substrate inhibition in the coenzyme / A. Bracht, A.P. Campello // Arg. Biol, et Technol. 1980. -V. 23, №3.-P. 337—341.

152. Brzeznicka E.A. Tissue origin of MDH isozymes in blood serum of rats exposed to alkylmercurials / E.A. Brzeznicka, J. Chmielnicka, L. Wo-jcikiewicz-Herma // J. Appl. Toxicol. 1983. - V. 3, № 4. - P. 180—184.

153. Bullen J.J. The critical role of iron in some clinical infections / J.J. Bullen, C.G. Ward, H.S. Rogers // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. 1991. -V. 10, № 8.-P. 613-617.

154. Burchell A. Human mitochondrial malic enzyme variants properties of the different polymorphic forms / A. Burchell, A. Crosby, T. Cohen et al. // Ann. Hum. Genet. 1977. - V. 41. - P. 1-7.

155. Bush R.S. Malate dehydrogenase from bovine tissues / R.S. Bush // Can. J. Anim. Sci. 1985. - V. 65, № 2. - P. 383-390.

156. Buzila L. Immunochemical and enzymatic alterations of malate dehydrogenase (MDH) after trypsin hydrolysis / L. Buzila // Rev. Roum. Bio-chim. 1982. - V. 19, № 4. - P. 253—262.

157. Cadenas E. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging / E. Cadenas, K. Davies // Free Radic. Biol, and Med. 2000. - V. 29, № 3. - P. 222-230.

158. Carr P.D. Chloroplast NADP-malate dehydrogenase: structural basis of light-dependent regulation of activity by thiol oxidation and reduction / P.D. Carr, D. Verger, A.R. Ashton // Structure Fold Des. 1999. - V. 7, № 4.-P. 461-475.

159. Chapelle J.P. Akuter myokardinfarkt: diagnose und uberwachung durch myoglobin-bestimmung / J.P.Chapelle // Diagn. und Lab. 1989. - V. 39, №4.-P. 171-177.

160. Charalampos M. Purification and properties of the cytosolic and mitochondrial forms of aspartate aminotransferase and malate dehydrogenase from rat heart / M. Charalampos, N. Guylaine // Biochem. and Cell Biol. -1987. V. 65, № 3. - P. 239-244.

161. Chen J. Amide hydrogen exchange shows that malate dehydrogenase is a folded monomer at pH 5 / J. Chen, D.L. Smith // Protein Sci. 2001. -V. 10, №5.-P. 1079-1083.

162. Chi-Ming W. Cooperation of yeast peroxiredoxins Tsalp and Tsa2p in the cellular defense against oxidative and nitrosative stress / W. Chi-Ming, Z. Yuan, W.M. Raymond et al. // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277, Issue 7. -P. 5385-5394.

163. Cohen M.S. Application of spin trapping to human phagocytic cells: in sight into conditions for formation and limitation of hydroxyl radical / M.S. Cohen, B.E. Britigan, S. Pou et al. // Free Radic. Res. Commun. -1991.-V. 12/13, № l.-P. 17-25.

164. Cooper T.G. Mitochondria and glyoxysomes from castor been endosperm / T.G. Cooper, H. Beevers // J. Biol. Chem. 1969. - V. 244, № 13. -P. 3507-3513.

165. Crow K.E. Human liver cytosolic malate dehydrogenase: purification, kinetic properties, and role in ethanol metabolism / K.E. Crow, T.J. Brag• gins, M.J. Hardman // Arch. Biochem. and Biophys. 1983. - V. 225, № 2. -P. 621—629.

166. David H. Qualitative and quantitative changes in the ultrastructure of• the heart after temporary ischemia and coronary reperfusion / H. David, R. Lindenau, J. Bohm et al. // Exp. Path. 1977. - V. 14. - P. 141-156.

167. Davis B.J. Disk electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins / B.J. Davis // Ann. NY Acad. Sci. 1964. - V. 121. -P. 404-407.

168. Dhaudayuthapani S. Partial purification and properties of cytoplasmic malate degydrogenase from the fish parasite / S. Dhaudayuthapani, K. Ramolingani // Proc. Indian Nat. Acad. B. V. 5, № 5-6. - P. 325-334.

169. Dobson G.P. Enzymatic determination of total CO2 in freeze-clamped animal tissues and plasma / G.P. Dobson, R.L. Veech, H. Ulrich et al. // Anal. Biochem. 1991. — V. 195, № 2. — P. 232—237.

170. Dordal A. Factors affecting L-malate activation of mitochondrial malate dehydrogenase from chicken liver / A. Dordal, A. Mazo, J. Gelpi //• Biochem. Int. 1990. - V. 20, № 1. - P. 177 - 182.

171. Drmota T. Purification and characterization of cytosolic malate dehydrogenase from Trichomonas vaginalis / T. Drmota, J. Kulda, J. Tachezy // J. Eukaryot. Microbiol. 1996. - V. 43, № 1. - P. 11.

172. Du Val G. Some kinetic characteristics of mitochondrial malate dehydrogenase / G. Du Val, H. Swaisgood, H. Horton // Biochemistry. 1985. -V. 24, № 8. - P. 2067 - 2072.

173. Elduque A. Intramitochondrial location of the molecular forms of chi-ken liver mitochondrial malate dehydrogenase / A. Elduque, F. Casado, A. Cortes et al. // Int. J. Biochem. 1982. - V. 14, № 3. - P. 221 - 229.

174. Eprintsev A.T. Isolation, purification, and properties of malate dehydrogenases from sulfur bacteria Beggiatoa leptomitiformis / A.T. Eprintsev, M.I. Falaleeva, I.Iu. Stepanova et al. // Izv. Akad. Nauk Ser. Biol. 2003. -№ 3. - P. 301-305.

175. Eprintsev A.T. Purification and physicochemical properties of malate dehydrogenase from bacteria of the genus Beggiatoa / A.T. Eprintsev, M.I. Falaleeva, I.Y. Stepanova et al. // Biochemistry (Mose). 2003. - V. 68, № 2.-P. 172-176.

176. Etlik O. The effects of sulfur dioxide inhalation and antioxidant vitamins on red blood cell lipoperoxidation / O. Etlik, A. Tomur, M.N. Kutman et al // Environ. Res. 1995. - V. 71, № 1. - P. 25-28.

177. Ferte N. Molecular properties and thioredoxin-mediated activation of spinach chloroplastic NADP-malate dehydrogenase / N. Ferte, J.-C. Meunier, J. Ricard et al. // FEBS Lett. 1982. - V. 146, № 1. - P. 133-138.

178. Fickenscher K. Amino acid sequence similarity between malate dehydrogenases (NAD) and pea chloroplast malate dehydrogenase (NADP) / K. Fickenscher, R. Scheibe, F. Marcus // Eur. J. Biochem. 1987. - V. 168, № 3. - P. 653-658.

179. Fickenscher K. Limited proteolysis of inactive tetrameric chloroplast NADP-malate dehydrogenase produces active dimer / K. Fickenscher, R. Scheibe // Arch. Biochem. and Biophys. 1988. - V. 260, № 2. - P. 771779.

180. Fickensher K. Purification and properties of NADP-dependent malate dehydrogenase from pea leaves / K. Fickensher, R. Scheibe // Biochem. et Biophys. Acta. 1983. - V. 749, № 3. - P. 249-254.

181. Fliss H. Apoptosis in ischemic and reperfused rat myocardium / H. Fliss, D. Gattinger // Circ. Res. 1996. - V. 79. - P. 949-956.

182. Frankel J.S. Comparison of the spatial and temporal expression of supernatant malate dehydrogenase in Barbus hybrids (Cypriniformes, Teleo-stei) / J.S. Frankel, R.V. Wilson // Biochem. and Physiol. 1984. - V. 78, № l.-P. 175—182.

183. Fridovich J. Superoxide dismutase / J. Fridovich // Prog. Nucleic Acid Res. 1991. - V. 40. - P. 220-231.

184. Frieden C. Kinetic studies on pig heart cytoplasmic malate dehydrogenase / C. Frieden, J. Fernandex-Sousa // J. Biol. Chem. 1975. - V. 250, №6.-P. 2106-2113.

185. Ganguly N.K. Free radicals in myocardial injury: experimental and clinical studies / N.K. Ganguly, K. Nalini, S. Wahi // Mol. Cell Biochem. -1992.-V. 111.-P. 71-76.

186. Genowefa Kubik-Dobosz. The intracellular localization of malate dehydrogenase isoenzymes in Pisum arvense roots / Kubik—Dobosz Genowefa // Acta soc. Bot. Pol. 1986. - V. 55, № 4. - P. 621 - 627.

187. Gibson D.G. GSH-dependent inhibition of lipid peroxidation: properties of a potent cytosolic system which protects cell membranes / D.G. Gibson, J. Hawrylko, P.B. McCay // Lipids. 1985. - V. 20. - P. 704-710.

188. Glatthoar B. The preparation of the cytoplasmic and mitochondrial forms of malate dehydrogenase form pig heart by a single procedure / B. Glatthoar, G. Darbarash, B. Noyes // Anal. Biochem. 1974. - V. 57, № 2. -P. 432-451.

189. Gotow K. Light activation of NADP-malate dehydrogenase in guard cell protoplasts from Vicia faba L. / K. Gotow, K. Tanaka, N. Kondo et al. // Plant Physiol. 1985. - V. 79, № 3. - P. 829-832.

190. Goyer A. Sites of interaction of thioredoxin with sorghum NADP-malate dehydrogenase / A. Goyer, P. Decottignies, E. Issakidis-Bourguet et al. // FEBS Lett. 2001. - V. 505, № 3. - P. 405-408.

191. Grootveld M. Measurement of allantoin and uric acid in human body fluids. A potential index of free-radical reactions in vivo? / M. Grootveld, B. Halliwell // Biochem. J. 1987. - V. 243. - P. 803-808.

192. Grossebuler W. Purification and properties of malate dehydrogenase from the thermoacidophilic archaebacterium Thermoplasma acidophilum / W. Grossebuler, T. Hartl, H. Gorisch et al. // J. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. -1986. V. 367, № 6. - P. 457—463.

193. Gutierrez M. Localization of the C4 and C3 pathways of photosynthesis in the leaves of pennisetum purpureum and other C4 species / M. Gutierrez, S.B. Ku, G.E. Edvards et al. // Planta. 1974. - V. 119. -P. 267-278.

194. Gutteridge J.M.C. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damages / J.M.C. Gutteridge // Clin. Chem. 1995. - V. 41, № 12b.-P. 1819-1828.

195. Hand S.C. Purification and properties of cytoplasmic malate dehydrogenase isolated from a larval crustacean, Artemia salina / S.C. Hand, M.M. Becker, F.P. Conte // J. Exp. Zool. 1981. - V. 217, № 2. - P. 119—212.

196. Harris D.G. Kinetic and molecular modeling of nucleoside and nucleotide inhibition of malate dehydrogenase / D.G. Harris, D.P. Marx, J.M. Anderson et al. // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids. 2002.- V. 21, № 11-12.-P. 813-823.

197. Hartl T. Crystalline NAD/NADP-dependent malate dehydrogenase; the enzyme from the thermoacidophilic archaebacterium Sulfolobus acido-caldarius / T. Hartl, W. Grossebuter, H. Gorisch et al. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1987. -V. 368, №3.-P. 259-267.

198. Hartl T. Die malat-dehydrogenase des archebacteriums Sulfolobus acidocaldarius. Reinigung, kristallisation und charakterisierung: diss. dokt. naturwis. Fak. Chem. Univ. / T. Hartl. Stattgart, 1987. - 169 c.

199. Hatch M.D. Assosiation of NADP and NAD-linked malic enzyme activities in Zea mays: relation to C4 pathway photosynthesis. / M.D. Hatch, Mau Shaio-Lim // Arch. Biochem. and Biophys. 1977. - V. 179, № 2. -P. 361-369.

200. Hayes M.K. Mitochondrial malate dehydrogenase from corn. Purification of multiple forms / M.K. Hayes, M.H. Luethy, T.E. Elthon // Plant Physiol. — 1991. V. 97, № 4. — P. 1381—1387.

201. Hitomi Y. Liver-specific induction of NADPH-generating enzymes by polychlorinated biphenyls in rats / Y. Hitomi, M. Wakayama, H. Oda et al. // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1993. - V. 57, № 7. - P. 1134-1136.

202. Hodges C. Investigation of the relation of the pH-dependent dissotia-tion of malate dehydrogenase to modification of the enzyme by N-ethyl• maleimide / C. Hodges, J. Wiggins, J. Harrison // J. Biol. Chem. 1977. -V. 252, № 17.-P. 6038-6041.

203. Hordur K. Purification and properties of malate dehydrogenase from the extreme thermophile Bacillus caldolyticus / K. Hordur, P. Cyril // Limits Life. 1980. - V. 67, № 6. - P. 47-54.

204. Huhn M. Ability of SOD to protect the ischemic and reperfusion injured heart / M. Huhn, E. Ostling, E. Fellenius // Acta Physiol. Scand. -1985. V. 124, Suppl. № 542. - P. 340.

205. Hunter G.R. Tetrameric and dimeric malate dehydrogenase isoenzymes in Trypanosoma cruzi epimastigotes / G.R. Hunter, U. Hellman, J.J. Cazzulo et al. // Mol. Biochem. Parasitol. 2000. - V. 105, № 2. -P. 203-214.

206. Irwin J.A. Characterization of alanine and malate dehydrogenases from a marine psychrophile strain PA-43 / J.A. Irwin, H.M. Gudmundsson, V.T. Marteinsson et al. // Extremophiles. 2001. - V. 5, № 3. - P. 199-211.

207. Jacguot J.P. Evidence for chloroplastic localization of spinach leaf NADP-malate dehydrogenase activating factors / J.P. Jacguot, J. Vidal, P. Gadal et al. // Planta. 1977. - V. 137, № 1. - P. 89-90.

208. Janda J. Влияние мышечной работы на активность некоторых энзимов скелетной мышцы при хронической мышечной ишемии / J. Janda, D. Urbanova, О. Mrhova. 1972. - P. 301 - 309.

209. Janichen F. Influence of superoxide dismutase and iloprost on ischemia-induced arrhythmias and postishemic myocardial function / F. Janichen,

210. U. Zelck, R. Wulkow et al. // Radic. Ions, and Tissue Damage: 3th Oxygen Radic., Szeged, 12-14 Jan., 1989. Budapest, 1990. - P. 109-116.

211. Janiczek O. Purification and properties of malate dehydrogenase from Paracoccus denitrificans / O. Janiczek, J. Kovar, Z. Glatz // Prep. Biochem. 1993. - V. 23, № 3. - P. 285—301.

212. Janse M.J. Electrophysiological mechanisms of ventricular arrhythmias resulting from myocardial ischemia and infarction / M.J. Janse, A.L. Wit // Physiol. Rev. 1989. - V. 69, № 4. - P. 1049-1169.

213. Jawalia N. NADP-malate dehydrogenase from leaves Zea mays. Chemical and kinetical properties / N. Jawalia // Plant Physiol. 1988. - V. 263, №7.-P. 677-692.

214. Jeffery D. Citrate synthase and malate dehydrogenase from tomato fruit / D. Jeffery, P.W. Goodenougt, P.D. Weltzman // Phytochemistry. -1988.-V. 27, № 1. -P. 41-44.

215. Jelic-Ivanolic J. Kinetic characteristics of human erythrocyte malate dehydrogenase / J. Jelic-Ivanolic, N. Majkic-Singh // Biochem. Soc. Tranc. -1981.-V. 9, №2.-P. 321.

216. Jialal I. Physiologic levels of ascorbate inhibit the oxidative modification of low density lipoprotein / I. Jialal, G.L. Vega, S.M. Grundy // Atherosclerosis. 1990.-V. 82.-P. 185-91.

217. Joh T. Cloning and sequence analysis of cDNAs encoding mammalian mitochondrial malate dehydrogenase / T. Joh, H. Takeshima, T. Tsuzuki // Biochemistry. 1987. - V. 26. - P. 2515-2520.

218. Johansson K. Structural basis for light activation of a chloroplast enzyme: the structure of sorghum NADP-malate dehydrogenase in its oxidized form / K. Johansson, S. Ramaswamy, M. Saarinen // Biochemistry. 1999. -V. 38, № 14.-P. 4319-4326.

219. Junker L. Prognosee-inschatzung des akuten myokardinfarktes aufgrund zeitlicher Veränderungen von isoenzymaktivitaten / L. Junker, C. Wagenknecht, E. Schüler et al. // Z. Med. Laboratoriumsdiagn. 1990. - V. 31, № l.-P. 39-45.

220. Kagawa T. NADP-malate dehydrogenase from leaves of Zea mays: purification and physiological, chemical and kinetical properties / T. Kagawa // Arch. Biochem. and Biophys. 1988. - V. 260, № 2. - P. 674-695.

221. Kagawa T. Regulation of C4 photosynthesis: characterization of protein factor mediating the activation and inactivation of NADP-malate dehydrogenase / T. Kagawa, M.D. Hatch // Arch. Biochem. and Biophys. 1977. -V. 184, № l.-P. 290-297.

222. KaKo K.L. Radical effects on membrane protein in myocardial is-chaemia (reperfiision injury) / K.L. Kako // Mol. and Cell Cardiol. 1987. -V. 19, №2.-P. 209-211.

223. Kalir A. The effect of salts on malate dehydrogenase from leaves of Zea mays / A. Kalir, T.J. Flowers // Phytochemistry. 1982. - V. 21, № 9. -P. 2189—2193.

224. Karihtala P. Peroxiredoxins in Breast Carcinoma / P. Karihtala, A. Mantyniemi, S. Won Kang et al. // Clinical Cancer Research. 2003. - V. 9. -P. 3418-3424.

225. Karlsson K. Pharmacokinetics of extracellular superoxide dismutase in the vascular system / K. Karlsson, J. Sandstrom, A. Edlund et al. // Free Radic. Biol. Med. 1993. - V. 14. - P. 185-190.

226. Kaul S. Reversal of changes of lipid peroxide, xanthine oxidase and superoxide dismutase by cardio-protective drugs in isoproterenol induced myocardial necrosis in rats / S. Kaul, N.K. Kapoor // Indian J. Exp. Biol. -1989. V. 27, № 7. - P. 625-627.

227. Kazutaka M. Purification and immunological properties of NAD-linked malate dehydrogenase isozymes from Euglena gracilis / M. Kazutaka, W. Koji, Y. Akiho et al. // Agr. and Biol. Chem. 1986. - V. 50, № 10.-P. 2651—2653.

228. Kirkman H.N. The function of catalase-bound NADPH / H.N. Kirk-man, S. Galiano, G.F. Gaetani // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262.• P. 660-665.

229. Klebanoff S.J. The neutrophil: function and clinical disorders / S.J. Klebanoff, R.A. Clark. Amsterdam: North-Holland, 1978. - 313 p.

230. Kook P.I. Effects of NAD or NADP on the stability of liver and pectoral muscle enzymes in 3-acetylpyridine treated quail by heat and trypsin / P.I. Kook, K.J. Young // Int. J. Biochem. and Cell Biol. 1998. - V. 30, № 11.-P. 1223-1234.

231. Koster J. De rol van vrije zuurstofradicalen fijdens het hartinfarct / J. Koster, A. M. van der Kraaji // Pharm. Weekbl. 1990. - V. 125, № 21. -P. 519-522.

232. Kulkarni A.P. Estimation of molecular parameters of proteins by gel chromatography on Sephadex G-150 / A.P. Kulkarni, K.N. Mehrotra // Anal. Biochem. 1970. - V. 38, № 1. - P. 285-288.

233. Labrou N.E. Dye-affinity labelling of bovine heart mitochondrial malate dehydrogenase and study of the NADH-binding site / N.E. Labrou, E. Eliopoulos, Y.D. Clonis // J. Biochem. 1996. - V. 315. - P. 687-693.

234. Labrou N.E. L-malate dehydrogenase from Pseudomonas stutzeri: purification and characterization / N.E. Labrou, Y.D. Clonis // Arch. Biochem. and Biophys.- 1997. V. 337, № l.-P. 103-114.

235. Lamaire S. Chilliny and light effect son photosynthetic enzymes of sorghum and maize / S. Lamaire et al. // Plant Physiol. 1974. — V. 54, № 7. -P. 723-734.

236. Lance C. The central role of malate in plant metabolism / C. Lance, P. Rustin // Physiolveg. 1984. - V. 2215. - P. 625-641.

237. Langelandsvik A.S. Properties and primary structure of a thermostable L-malate dehydrogenase from Archaeoglobus fulgidus / A.S. Langelandsvik, I.H. Steen, N.-K. Birkeland et al. // Arch. Microbiol. 1997. - V. 168, № 1. -P. 59-67.

238. Levine M. Criteria and recommendations for vitamin C intake / M. Levine, S.C. Rumsey, R. Daruwala et al. // JAMA. 1999. - V. 281. -P. 1415-1423.

239. Li-Bin C. Purification and molecular properties of NADP-dependent malate dehydrogenase from sorghum leaves / C. Li-Bin, D. Chen, J. Shi et al. // Acta phythophysiol. sin. 1987. - V. 13, № 2. - P. 113-121.

240. Liou W. Distribution of CuZn superoxide dismutase in rat liver / W. Liou, L.-Y. Chang, H.J. Geuze et al. // Free Rad. Biol. Med. 1993. - V. 14. -P. 201-207.

241. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin-Phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr et al. // J. Biol. Chem. 1951. - V. 194, № l.-P. 265-271.

242. Lu P. Studies on MDH und ADH isoenzymes in Neophocaena pho-caenoides writh electrophoretic technique/ P. Lu, D. Yu, Y. Ma // Acta Theriol. Sin. 1988. - V. 8, № 2, - P. 117-121.

243. Ma I. Malate dehydrogenase isoenzymes in Aspergillus niger / I. Ma, C.P. Kubicek, M. Rohr // FEMS Microbiol. Lett. 1981. - V. 12, № 2. -P. 147—151.

244. Mahendra K. Serum malate dehydrogenasein portal hypertensionits value as a diagnostic and prognostic indicator / K. Mahendra, K. Ajay, S. Srinivasan // Indian J. Med. Sci. 1991. -V. 45, № 2. - P. 31 - 34.

245. Mahmond J. A.-G. Purification and characterization of malate dehydrogenase from Cryptococcus neoformins / J. A.-G. Mahmond, S.S. Abuel, W.G. Niehaus // Arch. Biochem. and Biophys. 1995. - V. 322, № 1. -P. 116-120.

246. Mahmond M. Lipoic acid inhibition of mitohondrial malate dehydrogenase / M. Foster, J.H. Harrison // Biochem. and Biophys. Res. Commus. -1975. V. 6, № 2. - P. 528-534.

247. Makoto N. Enhancement of the turnover number of thermostable malate dehydrogenase by deteting hydrogen bonds around the catalytic site / N. Makoto, K. Mayumi, K. Hiromi et al. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1996. - V. 225, № 3. - P. 844-848.

248. Malshet V.G. Fluorescent products of lipid peroxidation. I. Structural requirement for fluorescence in conjugated Shiff bases / V.G. Malshet, A.L. Tappel // Lipids. 1973. - V. 8, № 4. - P. 194-198.

249. Mansini E. Effects of temperature on the mitochondrial malate dehydrogenase of adult muscle of Toxocara canis II E. Mansini, E. G. Oestrei-cher, L. P. Ribeiro // Arch. Lat. Physiol, et Biochim. 1989. - V. 97, № 6.1. P. 447—453.

250. Mansini F. Purification and properties of mitochondrial malate dehydrogenase of Toxocara canis muscle / F. Mansini, E.G. Oestreicher, L.P. Ribeiro // Comp. Biochem. and Physiol. 1986. - V. 85, № 1. - P. 223-228.

251. Marklund S. Human copper-containing superoxide dismutase of high molecular weight / S. Marklund // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. -V. 79.-P. 7634-7638.

252. Martinoia E. Malate compartmentation responses to a complex metabolism / E. Martinoia, D. Rentsch // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 1994. - V. 45. - P. 447-467.

253. May J.M. Protection and recycling of alpha-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid / J.M. May, Z.C. Qu, S. Mendiratta // Arch. Biochem. Biophys. 1998. - V. 349. - P. 281-289.

254. Mclntyre M. Endothelial function hypertension the role of superoxide anion / M. Mclntyre, D.F. Bohr, A.F. Dominiczak // Hypertension. -1999.-V. 34.-P. 539-545.

255. Mernik N. Characterization and crystallisation of the malate dehydrogenase from Streptomyces aureofaciens / N. Mernik, R. Lewis, M. Kolla-rova et al. // Gen. Physiol, and Biophys. 1998. - V. 17, № 1. - P. 49-51.

256. Mihajlovic R. Proizvodnja superoksidnog anjona u ishemicnoj bolesti miokarda / R. Mihajlovic, D. Micic, M. Jovanovic et al. // Jugosloven. med. biohem. -1996. T.15, № 4. - P. 288.

257. Millar A.H. The cytotoxic lipid peroxidation product, 4-hydroxy-2-nonenal, specifically inhibits decarboxylating dehydrogenases in the matrix of plant mitochondria / A.H. Millar, C.J. Leaver // FEBS Lett. 2000. - V. 481, №2.-P. 117-121.

258. Minarik P. Malate dehydrogenases structure and function / P. Minarik, N. Tomaskova, M. Kollarova et al. // Gen. Physiol. Biophys. -2002. - V. 21, № 3. P. 257-265.

259. Moldoveanu N. Purificanea si unela propiietali fizico-chimice cinetice ale malate dehydrogenazei mitochondriale / N. Moldoveanu, A. Radu // Stud, si Cere. Biochem. 1977. - V. 20, № 2. - P. 169-175.

260. Mueggler P.A. Kinetic studies of substrate activation of supernatant malate dehydrogenase by L-malate / P.A. Mueggler, R.G. Wolfe // Biochem. 1978. - V. 17, № 22. - P. 4616-4620.

261. Mullianax T.R. Regulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Evidence for an allosteric citrate binding site / T.R. Mullianax, J.N. Mock, A.J. McEvily et al. // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257, № 22. -P. 13233— 13239.

262. Musrati R.A. Malate dehydrogenase: distribution, function and properties / R.A. Musrati, M. Kollarova, N. Mernik et al. // Gen. Physiol. Bio-phys.- 1998.-V. 17, №3.-P. 193-210.

263. McGuire J.P. Studies of enzyme inhibition. The interaction of some platinum(II) complexes with fumarase and malate dehydrogenase / J.P. McGuire, M.E. Friedman, C.A. McAulifie // Inorg. Chim. Acta. 1984. -V. 91, №3.-P. 161—165.

264. Narayan P. Annexin V staining during reperfusion detects cardiomyo-cytes with unique properties / P. Narayan, R.M.J. Mentzer, R.D. Lasley // Am. J. Physiol.-2001.-V. 281.-P. 1931-1937.

265. Neuzil J. Requirement for, promotion, or inhibition by alpha-tocopherol of radical-induced initiation of plasma lipoprotein lipid peroxidation / J. Neuzil, S.R. Thomas, R. Stocker // Free Radic. Biol. Med. 1997. -V. 22.-P. 57-71.

266. Noda Y. Hydroxyl and superoxide anion radical scavenging activities of natural source antioxidants using the computerized JES-FR30 ESR spectrometer system / Y. Noda, K. Anzai, A. Mori et al. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. - V. 42, № 1. - P. 35-44.

267. Ocheretina O. Light modulated NADP-malate dehydrogenases from mossfern and green algae: insights into evolution of the enzyme's regulation / O. Ocheretina, I. Haferkamp, H. Tellioglu et al. // Gene. 2000. - V. 258, № 1-2.-P. 103-110, 147-154.

268. Okabayashi K. Purification and properties of mitochondrial malate dehydrogenase from unfertilized eggs of the seaurchin Anthocidaris cras-sispina / K. Okabayashi, E. Nakano // J. Biochem. 1984. - V. 95, № 6. -P. 1620—1632.

269. Olivetti G. Acute myocardial infarction in humans is associated with activation of programmed myocyte cell death in the surviving portion of theheart / G. Olivetti, F. Quaini, R. Sala et al. // J. Mol. Cell Cardiol. 1996. -V. 28.-P. 2005-2016.

270. Opie L.H. Reperfusion injury and its pharmacologic modification / L.H. Opie // Circulation. 1989. - V. 80, № 4. - P. 1049-1062.

271. Pette D. Comparable and specific proportions in the mitochondrial en-2yme activity / D. Pette, M. Klingenberg, T. Bucher // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962. -V. 7. - P. 425-429.

272. Pietri S. Ascorbyl free-radical a noninvasive marker of oxidative stress in human open heart surgery / S. Pietri, J.R. Seguin, P. Darbigny et al. // Free Radic. Biol. Med. - 1994. - V. 16. - P. 523-528.

273. Piro F.R. Is apoptosis a diagnostic marker of acute myocardial infarction? / F.R. Piro, C.R. di Gioia, P. Gallo et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. -2000.-V. 124.-P. 827-831.

274. Puppo A. Formation of hydroxy 1 radicals from hydrogen peroxide in the presence of iron. Is hemoglobin a biological Fenton reagents / A. Puppo, B. Halliwell // Biochem. J. 1988. - V. 249, № 1. - P. 185.

275. Rainer J. Quaternary structure, subunit activity and in vitro association of porcine mitochondrial malic dehydrogenase / J. Rainer, R. Rainer, H. Ingrid // Biochemistry. 1979. - V. 18, № 7. - P. 1217 - 1223.

276. Rainer J. Structure-function relationship of mitochondrial malate dehydrogenase at high dilution and in multicomponent systems / J. Rainer / Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1987. - V. 368, № 7. - P. 871-878.

277. Roderick S.L. The three-dimensional structure of porcine heart mitochondrial malate dehydrogenasa at 3,0-A° resolution / S.L. Roderick, L.J. Banaszak // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261, № 20. - P. 9461-9464.

278. Rommel Т.О. Purification and N-terminal amino-acid sequences of bacterial malate dehydrogenases from six actinomycetales strains and from

279. Ryan T.R. The role of iron in oxygen-mediated toxicities / T.R. Ryan, S.D. Aust // Crit. Rev. Toxicol. 1992. - V. 22, № 1. - P. 119.

280. Sanchez S.A. Aggregation states of mitochondrial malate dehydrogenase / S.A. Sanchez, T.L. Hazlett, J.E. Brunei et al. // Protein Sei. 1998.• -V. 7, № 10.-P. 2184-2189.

281. Sanyal S.C. The folding of dimeric cytoplasmic malate dehydrogenase. Equilibrium and kinetic studies / S.C. Sanyal, D. Bhattacharyya, C. Das Gupta // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269, № 15. - P. 3856-3866.

282. Saraste A. Apoptosis in human acute myocardial infarction / A. Saraste, K. Pullki, M. Kallajoki et al. // Circulation. 1997. - V. 95. -P. 320-323.

283. Scheibe R. NADP-malate dehydrogenase activity during photosynthesis in illuminated spinach chloroplasts / R. Scheibe, D. Wagenpfeil, J. Fischer // J. Plant Physiol. 1986. - V. 124, № 1-2. - P. 103-110.

284. Scheibe R. NADP-malate dehydrogenase in C3-plants: regulation and a role of a light-activated enzyme / R. Scheibe // Physiol. Plant. 1987.1. V. 71, №3.-P. 393-400.

285. Scheibe R. Quantitation of the groupes involved in the reductive activation of NADP-malate dehydrogenase / R. Scheibe // Biochem. et Biophys.

286. Acta: Protein Struct, and Mol. Enzymol. 1984. - V. 788, № 2.1. P. 241-247.

287. Scheibe R. The dark NADP-dependent malate dehydrogenase frompea chloroplast is catalytically active in the presence of guanidine-HCl / R. Scheibe, K. Fickenscher // FEBS Lett. 1985. - V. 180, № 2. - P. 317-320.

288. Schepens I. Inhibition of the thioredoxin-dependent activation of the NADP-malate dehydrogenase and cofactor specificity / I. Schepens, K. Johansson, P. Decottignies et al. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, № 28. -P. 20996-21001.

289. Schepens I. The dimer contact area of sorghum NADP-malate dehydrogenase: role of aspartate 101 in dimer stability and catalytic activity /1. Schepens, P. Decottignies, E. Ruelland et al. // FEBS Lett. 2000. -V. 471,• № 2-3. P. 240-244.

290. Schepens I. The role of active site arginines of sorghum NADP-malate dehydrogenase in thioredoxin-dependent activation and activity / I. Schepens, E. Ruelland, M. Miginiac-Maslow et al. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, № 46. - P. 35792-35798.

291. Schildkraut J.M. Coronary risk associated with age and sex of parental heart disease in the Framingham study / J.M. Schildkraut, R.H. Myers, L.A. Cupples et al. // Amer. J. Cardiol. 1989. - V. 64, № 10. - P. 555-559.

292. Schurman P. Improvedin vitro light activation and assay systems for two spinach chloroplast enzymes / P. Schurman, J. P. Jacguot // Biochem. et

293. Biophys. Acta. 1979. - V. 569, № 2. - P. 309-312.

294. Shiniy L. Characterization of an essentional histidine residue in thermophilic malate dehydrogenase / L. Shiniy, O. Man-Jin, S. Nakashi et al. // J. Biochem. 1986 - V. 99, № 6. - P. 1669-1672.

295. Shinji I. Reversible denaturation of thermophilic malate dehydrogenase by guanidine hydrochloride and acid / I. Shinji, S. Takashi, B. Teru-hiko // J. Biochem. 1984. - V. 95, № 5. - P. 1273—1281.

296. Skulachev V.P. Role of uncoupled and non-coupled oxidations in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electrone reductants / V.P. Skulachev // Quant. Rev. Biophys. 1996. - V. 29. - P. 169-203.

297. Sloan R. A kinetic assay for the isoenzymes of malate dehydrogenase / R. Sloan, R.J. Elliott //Biochem. Soc. Trans. 1991. - V. 19, № 1. - P. 545.

298. Smith K. A facile method for the isolation of porcine heart mitochon• drial malate dehydrogenase by affinity elution chromatography on Procion Red HE3B / K. Smith, T. K. Sundaram // Biosci. Repts. 1983. - V. 3, № 11.-P. 1035-1043.

299. Smith K. Action of surfactans on porcine heart malate dehydrogenase isoenzymes and a simple method for the differential assay of these isoenzymes / K. Smith, T.K. Sundaram // Biochim. et Biophys. Acta: Gen. Subj. -1986. V. 884, № 1. - P. 109-118.

300. Smith K. Purifiication of bacterial malate dehydrogenases by selective• elution from a Triazinyl dye affinity column / K. Smith, T. K. Sundaram, M.

301. Kernick et al. // Biochem. et Biophys. Acta. 1982. - V. 708, № 1. -P. 17—25.

302. Stadtman E.R. Protein oxidation / E.R. Stadtman, R.L. Levine // Ann.

303. NY Acad. Sci. 2000. - V. 899. - P. 191-208.

304. Steffan J.S. Structural and functional effects of mutations altering the subunit interact of mitochondrial malate dehydrogenase/ J.S. Steffan, L. McAlister-Hann // Arch. Biochem. and Biophys. 1991. - V. 287, № 2. -P. 276-282.

305. Suh J. Anti- and pro-oxidant effects of ascorbate on iron-mediated oxidative damage to bovine serum albumin / J. Suh, B.Z. Zhu, B. Frei // Free• Radie. Biol. Med. 1999. -V. 27. -P. 305-311.

306. Sulc R.M. Leakage of intracellular substances as an indicator of freezing injury in alfalfa / R. M. Sulc, K.A. Albrecht, S.H. Duke // Crop Sci. — 1991. —V. 31, №2. —P. 430—435.

307. Sutharam R.R. Stimulation of oxidanive metabolism by tiroid hormones in a apodan amphibian Gegenophis carnozus (Beddome) / R.R. Sutharam, M.C. Peter, O.V. Subasy // Gen. and Compar. Endocrinol. -1990. V. 79, № 2. - P. 246-252.

308. Swierczynski J. Stimulation of citrate oxidation and transport in human placental mitochondria by L-malate / J. Swierczynski, P. Scislowski, Z. Aleksandrowicz et al. // Acta Biochim. (Pol.). 1976. - V. 23. - P. 93-103.

309. Sorribas A. Thermal stability of the molecular forms of guinea-pig skeletal muscle cytoplasmic malate dehydrogenase and kinetic mechanismof the thermostable form / A. Sorribas, J. Puig, A. Cortes / Int. J. Biochem.- 1981. V. 13, №3.-P. 355—364.

310. Scawen M.D. The rapid purification of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase and malate dehydrogenase on triazine dye affinity matrices / M.D. Scawen, J. Darbishire, M.J. Harvey et al. // Biochem. J. 1982. - V. 203, № 3.-P. 699-705.

311. Takahashi K. Selenium-dependent glutathione peroxidase protein and activity: immunological investigations on cellular and plasma enzymes / K. Takahashi, H.J. Cohen // Bllod. 1986. - V. 68. - P. 640-646.

312. Taylor A.O. Plants under climatic stress. VI. Chilling and light effects on photosynthetic enzymes of sorgnum and maize / A.O. Taylor, C.R. Sack, H.G. McPherson et al. // Plant. Physiol. 1974. - V. 54, № 5. - P. 696-701.

313. Teague W. Physical properties and chemical composition of cytoplasmic and mitochondrial malate dehydrogenase from Physarum poly-cephalum / W. Teague, H. Henney // Biochim. et Biophys. acta. 1976. - V. 434, № l.-P. 118-125.

314. Thorniley M. NADP-linked malic enzyme. Purification from maize leaves. Mr and subunit composition. / M. Thorniley, K. Dalzicl // Biochem.- 1988. V. 254, № 1. - P. 229.

315. Tkemaladze G.Sh. Regulatory functions of plant malate and glutamate dehydrogenases / G.Sh. Tkemaladze // Biochem. Soc. Trans. 1981. - V. 9, №2.-P. 221.

316. Tobin A.K. Inhibition of malate dehydrogenase from mung bean hy-pocotyl mitochondria / A.K. Tobin, C.V. Givan // Plant. Sci. Lett. 1984. -V. 34, № 1-2.-P. 51-59.

317. Toshihisa Obshima. Purification and characterization of Malate dehydrogenase from the phototrophic bacterium Rhodopseudomonas capsulata /

318. Obshima Toshihisa, Sacuraba Haruhico // Biochem. et Biophis. Acta. -1986.-V. 869, №2.-P. 171-177.

319. Toyoda Y. Evidence of apoptosis induced by myocardial ischemia: a case of ventricular septal rupture following acute myocardial infarction / Y. Toyoda, T. Shida, N. Wakita et al. // Cardiology. 1998. - V. 90. -P. 149-151.

320. Trejo F. Cloning sequencing and functional expression of a DNA encoding pig cytosolic malate dehydrogenase: purification and characterization of the recombinant enzyme / F. Trejo, M. Costa, L. Gelpij // Gene. 1996. -V. 172.-P. 303-308.

321. Trejo F. Cloning, sequencing and functional expression of a DNA encoding pig cytosolic malate dehydrogenase: purification and characterization of the recombinant enzyme / F. Trejo, M. Costa, J.L. Gelpi et al. // Gene. -1996.-V. 172.-P. 303-308.

322. Trejo F. Contribution of engineered electrostatic interactions to the stability of cytosolic malate dehydrogenase / F. Trejo, J.L. Gelpi, A. Ferrer et al.//Protein Eng.-2001.-V. 14, № 11.-P. 911-917.

323. Trump B.F., Recent studies on the pathophysiology of ischemic cell injury / B.F. Trump, I.K. Berezesky // Beitr.Path. 1976. - V. 158. -P. 363-388.

324. Turanek J. Rapid chromatogragic purification of the mitochondrial isoenzymes of beef heart malate dehydrogenase / J. Turanek, Z. Skabranova, J. Kovar // J. Chromatogr. 1986. - V. 369, № 2. - P. 426-430.

325. Tyagi A.K. Studies on the purification and characterization of malate dehydrogenaze from Mycobacteriumphlei / A.K. Tyagi, F.A. Siddigui, T.A. Yerkitasubramanian // Biochem. and Biophys. acta. 1977. - V. 485, № 2. -P. 255-267.

326. Uttaro A.D. A family of highly conserved glycosomal 2-hydroxyacid dehydrogenases from Phytomonas sp. / A.D. Uttaro, S.G. Altabe, M.H. Rider et al. //J. Biol. Chem. 2000. -V. 275, № 41. - P. 31833-31837.

327. Vidal J. Detection and study of protein factors involved in dithiothrei-tol activation of NADP-malate dehydrogenase from a C4 plant / J. Vidal, J.P. Jacquot, H. Membre et al. // Plant Sci. Lett. 1978. - V. 11, № 3-4. -P. 305-310.

328. Vidal J. Identification of a cDNA clon for sorghum leaf malate dehydrogenase (NADP) light dependent mRNA accumulation / J. Vidal, C. Clareal // Eur. J. Biochem. 1988. - V. 174, № 3. - P. 497-501.

329. Vidal J. Influence of protein factors on the activation of NADP-malate dehydrogenase by dithiothreitol / J. Vidal, J.P. Jacquot, P. Gadal et al. // Physiol. Plant. 1978. - V. 42, № 3. - P. 307-314.

330. Vincent H.K. Mechanism for obesity-induced increase in myocardial lipid peroxidation / H.K. Vincent, S.K. Powers, A.J. Dirks et al. // Int. J. Obesity. 2001. - T.25, № 3. - P. 378-388.

331. Vincenzini M.T. The palmitoleate: a natural selective denaturant of enzymes / M.T. Vincenzini, F. Favilli, C. Treves et al. // Int. J. Biochem. -1953. V. 15, № 10. - P. 1083 - 1086.

332. Waters J.K. Cytoplasmic malate dehydrogenase from Phycomyces blakesleanus: kinetics and mechanism / J.K. Waters, B. Dale // Can. J. Bio-chem. and Cell. Biol. 1985. - V. 63, № 10. - P. 1097-1105.

333. Waters J.K. Malate dehydrogenase from Rhizobium japonicum 311b-143 bacteroides and glycine max root-nodule mitochondria / J.K. Waters, B. Dale, D.W. Emerich / Biochemistry. 1985. - V. 24, № 23. -P. 6479 - 6486.

334. Weiland U. Inhibition of endogenous nitric oxide synthase potentiates ischemia-reperfusion-induced myocardial apoptosis via a caspase-3 dependent pathway / U. Weiland, J. Haendeler, C. Ihling et al. // Cardiovasc. Res. -2000.-V. 45.-P. 671-678.

335. Weisel R.D. Myocardial free-radical injury after cardioplegia / R.D. Weisel, D.A.G. Mickle, C.D. Finkle et al. // Circulation. 1989. - V. 80, №5.-P. 14-18.

336. Weisiger R.A. Mitochondrial superoxide dismutase: site of synthesis and intramitochondrial location / R.A. Weisiger, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - P. 4793-4796.

337. Wise D.J. Purification and kinetic characterization of Haemophilus parasuis malate dehydrogenase / D.J. Wise, C.D. Anderson, B.M. Anderson // Arch. Biochem. and Biophys. 1997. - V. 344, № 1. - P. 176-183.

338. Wood D. The relation of the pH and concentration-dependent dissociation of dehydrogenase / D. Wood, C. Hodges, J. Harrison // Biochem. and Biophys. Res. Commuc. 1978. - V. 82, № 3. - P. 943 - 950.

339. Wood D.C. Subunit interactions in mitochondrial malate dehydrogenase. Kinetics and mechanism of reassociation / D.C. Wood, S.R. Jurgen-sen, J.S. Geesin et al. // J. Biol. Chem. 1981. - V. 256, № 5. -P. 2377—2382.

340. Wright S.K. Alteration of the specificity of malate dehydrogenase by chemical modulation of an active site arginine / S.K. Wright, R.E. Viola // J.

341. Biol. Chem.-2001.-V. 276, № 33. P. 31151-31155.

342. Wright S.K. Mechanistic studies on malate dehydrogenase from Escherichia coli / S.K. Wright, F.J. Zhao, J. Rardin et al. // Arch. Biochem. and Biophys. 1995. - V. 321, № 2. - P. 289-296.

343. Wu G. Convergent evolution of Trichomonas vaginalis lactate dehy-drogenase from malate dehydrogenase // G. Wu, A. Fiser, B. ter Kuile et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96, № 11. - P. 6285-6290.

344. Yoon H. Site-directed inhibinion of Haemophillus influenzae malate dehydrogenase / H. Yoon, B.M. Anderson / J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 135, № 2.-C. 245-250.

345. Young I.S. Antioxidants in health and disease / I.S. Young, J.V. Woodside // J. Clin. Pathol. 2001. - V. 54.- P. 176-186.

346. Zenka J. Studies on the properties of malic enzime and malate dehydrogenase from Taenia crassiceps / J. Zenka, D. Kopacek, N. Vokurkova // Folia parasitol. 1987. - V. 34, № 4. -P. 323-328.

347. Zhao Z.Q. Reperfusion induces myocardial apoptotic cell death / Z.Q. Zhao, M. Nakamura, N.P. Wang et al. // Cardiovasc. Res. 2000. - V. 45. -P. 651-660.

Информация о работе

Сафонова, Ольга Анатольевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Свойства и регуляция активности НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ в условиях оксидативного стресса в миокарде крыс при ишемии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы