Регуляторные Т-клетки и трансформирующий фактор роста-β при опухолевом росте

Чуров, Алексей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляторные Т-клетки и трансформирующий фактор роста-β при опухолевом росте
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные Т-клетки и трансформирующий фактор роста-β при опухолевом росте"

На правах рукописи

ЧУРОВ Алексей Викторович

РЕГУЛЯТОРНЫЕ Т-КЛЕТКИ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЙ ФАКТОР РОСТА-Р ПРИ ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ

03.03.01 - физиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

~ 2 ЛЕН 2010

Петрозаводск 2010

004615720

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук «Институт биологии Карельского научного центра РАН»

доктор биологических наук, Евгения Константиновна Олейник

доктор медицинских наук, Екатерина Прохоровна Киселёва

доктор биологических наук, Вадим Александрович Иванов

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Петрозаводский государственный университет

Защита диссертации состоится «¿1 » декабря 2010 года в часов на заседании объединенного диссертационного совета (ДМ 212.087.02) при ГОУВПО Карельской государственной педагогической академии по адресу: 185680, Республика Карелия, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, д. 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельской государственной педагогической академии.

Автореферат разослан: « » ноября 2010 г.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

А.И. Малкиель

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Несмотря на интенсивное изучение состояния иммунитета при опухолевом росте, основные закономерности формирования иммунных нарушений в онкогенезе по-прежнему не определены. В настоящее время не сформированы четкие представления о значении иммунной системы в процессе возникновения и развития опухолей.

В современных исследованиях, посвященных нарушениям иммунофизиологических функций при опухолевом росте, большое внимание уделяется изучению механизмов регуляции иммунного ответа и сохранения постоянства внутренней среды организма. Важную роль в поддержании гомеостаза в иммунной системе играют регуляторные Т-клетки (Treg), основными маркерами которых являются мембранные антигены CD4, CD25 и внутриклеточный транскрипционный фактор FOXP3 (forkhead box РЗ). В последние годы были получены данные, свидетельствующие об увеличении численности Treg-клвток у больных с опухолями (Hueman et al., 2006; Leong et al., 2006; Miller et al., 2006; Ling et al., 2007). Оказалось, что повышенное содержание Treg-лимфоцитов ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при опухолевом росте (Curiel et al., 2004; Petersen et al., 2006; Yakirevich, Resnick, 2007). Эти данные позволяют предполагать, что Treg-клетки имеют решающее значение в патогенезе онкологических заболеваний.

По мнению ряда авторов (Nomura, Sakaguchi, 2005; Beyer, Schultze, 2006; Knutson et al., 2007) в ходе онкогенеза Treg-лимфоциты обеспечивают формирование иммунологической толерантности к антигенам опухоли благодаря супрессии функциональной активности эффекторов противоопухолевого иммунного ответа: натуральных киллеров, цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), Т-хелперов и антигенпрезентирующих клеток. Однако механизмы, индуцирующие дифференцировку и активацию Treg-клеток, а также обеспечивающие их функционирование, не изучены.

Предполагается, что одним из медиаторов функциональной активности Treg-клеток является трансформирующий фактор роста-р (TGF-P) (Zhang et al., 2006; Wan, Flavell, 2007). Важным свойством TGF-{3 является плейотропность, что в значительной степени обуславливает широкий спектр его биологического действия и иммунорегуляторную активность. Известно, что TGF-(3 регулирует функции всех видов иммунокомпетентных клеток. Наиболее сильное действие и, главным образом, иммуносупрессорное, TGF-(3 оказывает на Т-клетки: подавляет пролиферацию, блокирует секрецию IL-2, ингибирует дифференцировку

Т-хелперов первого и второго типа (Li, 2006; Zhang et al., 2006) и может стимулировать образование Treg-клеток (Rao et al., 2005; Liu et al., 2007).

Особенности функционирования TGF-P и Treg-клеток представляют большой интерес при изучении состояния иммунитета в условиях опухолевого роста. Активация, увеличение численности Treg-лимфоцитов и ингибирующее действие TGF-p могут быть ключевыми механизмами возникновения иммунных нарушений в онкогенезе, которые приводят к супрессии противоопухолевого иммунного ответа и формированию толерантности к опухолевым антигенам. Изучение функциональной взаимосвязи Treg-клеток и TGF-p открывает перспективы для разработки новых методов оценки степени иммунной супрессии и эффективной иммунотерапии у больных с опухолями.

Цель исследования состояла в изучении роли Treg-клеток и TGF-P в формировании иммунной супрессии при опухолевом росте.

Задачи исследования:

1. Изучить численность различных популяций лимфоцитов периферической крови (Т-клеток, Т-хелперов, ЦТЛ, наивных CD4+ Т-лимфоцитов, CD4+ Т-клеток памяти, В-лимфоцитов) при опухолевом росте.

2. Определить содержание Treg-клеток периферической крови в норме и при опухолевом росте.

3. Изучить уровень экспрессии генов цитокина TGF-P (TGF-pi) и транскрипционного фактора FOXP3 в лимфоцитах периферической крови в процессе онкогенеза.

4. Исследовать особенности экспрессии основных компонентов сигнального пути TGF-p (TGF-pi, TGF-PRII, FOXP3, Smad3 и Smad7) в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте.

5. Провести сравнительное изучение функционального состояния популяции Treg-клеток по уровню экспрессии TGF-P (TGF-pi) и транскрипционного фактора FOXP3 в лимфоцитах периферической крови у лиц с опухолями, аутоиммунной патологией и хронической вирусной инфекцией.

Научная новизна работы. Работа содержит новые данные о роли TGF-p и Treg-клеток в развитии иммунной супрессии при опухолевом росте. Впервые на клеточном и молекулярном уровне дана комплексная оценка степени иммунной супрессии у онкологических больных. Впервые в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте изучен уровень экспрессии генов, ассоциированных с активностью Treg-клеток и их основного цитокина - TGF-p (TGF-p 1, TGF-PRII, FOXP3,

БтаёЗ и 8тас17). Установлено, что в ходе онкогенеза происходит увеличение экспрессии генов ТСР-Р 1 и РОХРЗ и снижается уровень экспрессии основного ингибитора сигнального пути ТСР-р - 8тас17, что может рассматриваться как один из механизмов активации супрессорной активности. Впервые дана сравнительная оценка уровня экспрессии генов ТСР-Р1 и РОХРЗ при различных иммунных патологиях.

Теоретическое и практическое значение работы. На основании результатов проведенного исследования можно предполагать, что в ходе онкогенеза происходит гиперактивация механизмов, вызывающих снижение эффективности противоопухолевого иммунитета. По всей видимости, при опухолевом росте изменяется функционирование эффекторов иммунного ответа в результате снижения их активации, ингибирования пролиферации и развития анергии. В дальнейшем развивается толерантность к антигенам опухоли. Одним из механизмов, обуславливающих эти процессы, является усиление активности Тге§-клеток и изменение секреции их функционального медиатора — ТвР-р1.

Полученные результаты дополняют и уточняют имеющиеся в литературе данные о роли Тге§-клеток и ТСР-Р в развитии иммунной супрессии в ходе онкогенеза. Результаты работы целесообразно использовать при разработке методов оценки степени иммунной супрессии у онкологических больных. Материалы диссертации могут применяться при чтении курсов лекций по общей, молекулярной и клинической иммунологии для студентов ВУЗов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. При опухолевом росте в периферической крови увеличивается численность Treg-клeтoк с фенотипом СВ4+СО25Ы8ЬСБ45К0+.

2. В ходе онкогенеза происходит усиление экспрессии генов ТСР-Р1 и РОХРЗ, ассоциированных с активностью Treg-клeтoк. При этом их экспрессия увеличивается по мере развития опухолевого процесса.

3. Одним из механизмов активации сигнального пути ТСР-р в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте является увеличение экспрессии изоформы ТСР-р 1 и снижение экспрессии медиатора 8тас17.

Конкурсная поддержка работы. Работа выполнена в рамках Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (2008 г.) и при финансовой поддержке РФФИ (грант № 08-04-98838).

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на XI, XII и XIII Всероссийских научных форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2007, 2008, 2009), IV съезде иммунологов России (Санкт-Петербург, 2008), VI

Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2007) и XVI Международной научной конференции «Ломоносов» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них 8 статей, в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, а также списка литературы, включающего 211 источников, из них 207 иностранных.

Благодарности. Выражаю глубокую признательность моему научному руководителю д.б.н. Е.К. Олейник и д.б.н. В.М. Олейник за ценные советы и рекомендации при подготовке диссертации, а также д.м.н. И.Е. Бахлаеву, к.м.н. М.И. Шибаеву, к.м.н. П.И. Ковчуру и к.м.н. A.A. Мясникову за помощь в организации взятия биологического материала.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал исследования

Всего в ходе работы исследовано 160 образцов периферической крови больных (п=121) и здоровых лиц (п=39) из различных районов Республики Карелия. Проведен анализ образцов периферической крови больных колоректальным раком (КРР), раком лёгкого (PJI), желудка (РЖ), молочной железы (РМЖ) в возрасте от 29 до 74 лет. Также были обследованы пробы крови пациентов - носителей хронической папилломавирусной инфекции в возрасте от 19 до 45 лет и больных ревматоидным артритом в возрасте от 21 года до 56 лет. Возраст здоровых лиц варьировал в пределах от 31 года до 68 лет.

Методы исследования

Для иммунофенотипирования лимфоцитов цельной крови методом проточной цитометрии использовали моноклональные антитела CD4-FITC, CD3-ECD, CD8-PC5, CD19-PE, CD45RO-FITC, CD45RA-ECD, CD25-PC5, CD4-PC7 («Beckman Coulter», США) и соответствующие изотопические контроли. Лизис эритроцитов и фиксацию лимфоцитов в пробе проводили на автоматической станции пробоподготовки TQ-Prep с использованием системы реагентов Immunoprep. Сбор данных производили на проточном цитометре FC500 с применением программного обеспечения СХР 2.0 («Beckman Coulter», США).

Рис. 1. Распределение субпопуляций лейкоцитов периферической крови по каналам прямого (FS Lin) и бокового (SS Lin) светорассеяния. Примечание: для удаления из зоны анализа частиц, не соответствующих клеткам по параметрам прямого светорассеяния (дебрис) был использован дискриминатор.

При анализе данных проводили построение гейта лимфоцитов на основании характеристик прямого (FS) и бокового (SS) светорассеяния, исключая моноциты, гранулоциты и дебрис (Рис.1). Подсчет клеток осуществляли до накопления 3x104 событий внутри лимфоцитарного гейта.

Выделение тотальной РНК лимфоцитов проводили из 100 мкл цельной крови с использованием набора реагентов «YellowSolve» (АОЗТ «Клоноген», Санкт-Петербург) в соответствии с протоколом предприятия-изготовителя. Очистку тотальной РНК от примесей геномной ДНК осуществляли с помощью ДНазы (ООО «Силекс», Москва). Чистоту препарата РНК оценивали на спектрофотометре «SmartSpec Plus» («Bio-Rad», США). Нативность РНК определяли методом электрофореза в агарозном геле.

Синтез комплементарной ДНК проводили из 1 мкг тотальной РНК с использованием случайных гексапраймеров и MMLV-обратной транскриптазы (ООО «Силекс», Москва) в амплификаторе «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», Москва). Синтезированную комплементарную ДНК хранили при температуре - 20 °С.

Праймеры к нуклеотидным последовательностям исследуемых генов (TGF-ßl, TGF-ßRII, FOXP3, Smad3, Smad7) и референсного гена GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени подбирали с использованием программы Beacon Designer 5.01 («Premier Biosoft», США). Амплификацию кДНК, а также анализ продуктов амплификации в режиме реального времени проводили с использованием реакционной смеси с интеркалирующим красителем SYBR Green I (НПК «Синтол», Москва) на приборе «iCycler Thermal Cycler» («Bio-Rad», США) с программным обеспечением «iQ5 Optical System Software» версия 2.0 («Bio-Rad», США). Все реакции проводили в триплетах. Уровень

экспрессии исследуемых генов определяли относительно количества мРНК гена GAPDH методом 2~MCt (Livak, Schmittgen, 2001).

Культивирование лимфоцитов периферической крови в присутствии рекомбинантного TGF-fJl. Для культивирования лимфоциты периферической крови выделяли на градиенте фиколла плотностью 1,077 г/см3 (ООО НПП «Панэко», Москва). После выделения лимфоцитов концентрацию клеток рассчитывали в камере Горяева. Количество живых клеток, определенное по окрашиванию трипановым синим («Sigma», США) составляло от 97 до 99%. Для стимуляции лимфоцитов использовали анти-СБЗ-антитела («Медбиоспектр», Москва) в конечной концентрации 2 мкг/мл. Лимфоциты культивировали в 96-луночных планшетах («Corning-Costar», США), в питательной среде RPMI-1640 (ООО НПП «Панэко», Москва), содержащей 25 мМ HEPES, 25 мМ бикарбоната натрия, с добавлением 2мМ/мл L-глутамина («Sigma», США), 100 мкг/мл гентамицина («Gibco», США) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки («РАА Laboratories», Австрия). После добавления питательной среды, в каждую лунку вносили суспензию, содержащую 105 клеток и IL-2 («ProSpec», США) в конечной концентрации 10 нг/мл. После всех процедур в лунки вносили рекомбинантный TGF-pi («ProSpec», США) в конечных концентрациях 1, 2, 5, 10 и 20 нг/мл. Общий объем культивируемой смеси составлял 200 мкл. Культивирование проводили в С02-инкубаторе («ShelLab», США) при температуре 37°С, влажности 95% и 5% содержании С02 в течение 24 часов. По окончании культивирования клетки отмывали, определяли их концентрацию в камере Горяева и проводили анализ на цитометре.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Biostat 2007. Достоверность различий между группами оценивали по критерию Манна-Уитни при уровне значимости р<0,05. В таблицах и на графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки среднего (М±т).

Основные результаты исследования и их обсуждение

1. Содержание основных популяций лимфоцитов в периферической крови при опухолевом росте.

При оценке состояния иммунной системы важными показателями являются содержание Т-клеток, Т-хелперов, ЦТЛ, В-клеток в периферической крови. Результаты работы свидетельствуют о том, что у онкологических больных (п=14) численность основных популяций лимфоцитов была на уровне контроля. Другой важный показатель состояния иммунитета - иммунорегуляторный индекс (ИРИ),

отражающий соотношение Т-хелперов и ЦТЛ, также не отличался от контроля. В то же время можно отметить, что при опухолевом росте количество Т-хелперов и В-клеток было почти на 20% ниже, чем у здоровых лиц, хотя эти различия и не были статистически достоверными (табл. 1).

Таблица 1

Содержание основных популяций лимфоцитов в периферической крови при опухолевом росте (%).

Показатель Контроль (п=13) Онкобольные (п=14) КРР (п=5) РЛ (п=3) РМЖ (п=3) РЖ (п=3)

Т-клетки 69,7±2,2 64,4±3,4 64,0±7,5 68,6±2,2 68,9+2,9 56,4±10,1

Т-хелперы 40,6±2,4 33,6±3,6 26,7±5,7 36,7±9,3 37,9±6,2 37,7±10,2

ЦТЛ 26,8±2,4 28,8±3,6 32,2±6,7 30,7±11,2 31,0±7,4 19,1±1,8

В-клетки 12,8±1,2 10,1 ±0,9 8,3±1,1* 12,0±2,9 10,9±0,6 10,5±2,8

ИРИ 1,8+0,3 1,6±0,4 1,0±0,3 2,4±1,7 1,4±0,5 2,0±0,6

Исследование численности популяций в зависимости от локализации опухоли выявило пониженное содержание В-клеток при КРР. При других локализациях изученные показатели оказались в пределах нормы (табл.1). Однако при опухолевом росте наблюдались значительные индивидуальные колебания численности некоторых видов лимфоцитов. Так, например, при КРР, РЛ и РЖ в ряде случаев было отмечено низкое количество Т-хелперов, а при РМЖ, РЛ и КРР у некоторых лиц выявлено повышенное содержание ЦТЛ (Рис. 2).

60 50 40 30 20 10 0

Т-хелперы

♦

♦ ♦

К КРР РЛ РМЖ РЖ

60 50 40 30 20 10

♦ * ♦ * ♦

ЦТЛ

♦ ♦

♦

К КРР РЛ РМЖ РЖ

Рис.2. Индивидуальные показатели содержания Т-хелперов и ЦТЛ при опухолевом росте (%), К - контроль. Примечание: горизонтальными линиями показаны средние значения.

2. Содержание наивных клеток, активированных лимфоцитов и клеток памяти внутри популяции С04-клеток при опухолевом росте.

Соотношение наивных Т-клеток, активированных лимфоцитов и Т-клеток памяти является одним из главных показателей нормального функционирования иммунной системы. СБ4+ Т-лимфоциты человека можно разделить на наивные клетки, клетки памяти и активированные лимфоциты в зависимости от экспрессии двух изоформ молекулы СБ45: С045ЯА и С045Я0 (Хайдуков, Зурочка, 2008). Пример такого распределения показан на рисунке 3.

А Б

С045-1ЧО-Р1ТС СММЮ-ПТС

Рис. 3. Пример анализа лимфоцитов периферической крови здорового донора (А) и больного колоректальным раком (Б) методом проточной цитометрии в зависимости от экспрессии маркеров СБ4511А и С045Я0. Квадранты А1 и Б1 -наивные Т-клетки, квадранты А2 и Б2 - активированные клетки, квадранты А4 и Б4 - Т-клетки памяти. Примечание: анализ лимфоцитов проводился при помощи гейтирования по СВ4-клеткам.

По нашим данным, количество наивных лимфоцитов у онкологических больных (п=14) не отличалось от контроля (31,7±2,7% и 30,5±1,0% соответственно). В то же время, число активированных клеток при опухолевом росте было почти вдвое выше, чем в контроле (15,8±1,7% против 8,1±0,5%; р<0,05). В норме активированные клетки составляют менее 10% от общего числа С04+ лимфоцитов (Хайдуков, Зурочка, 2008).

Содержание клеток памяти у больных с опухолями (52,5±2,6%) оказалось ниже (р<0,05), чем в контроле (61,3+0,9%), что может быть связано с нарушением процессов формирования иммунологической памяти при опухолевом росте.

При исследовании содержания наивных Т-лимфоцитов, Т-клеток памяти и активированных Т-клеток у лиц с различной локализацией опухоли был выявлен ряд различий по сравнению со здоровыми лицами (табл. 2). Количество наивных СБ4+ Т-клеток было выше при РЛ и РМЖ (р<0,05). Низкое содержание Т-лимфоцитов памяти отмечено при КРР, РЛ и РМЖ. У больных КРР и РМЖ также отмечено более высокое содержание активированных клеток. Таким образом, наиболее значительные изменения в содержании наивных СВ4+ Т-лимфоцитов и СБ4+ Т-клеток памяти были выявлены у больных РЛ (табл.2).

Таблица 2

Содержание наивных клеток, клеток памяти и активированных лимфоцитов в периферической крови больных с различной локализацией опухоли (% от числа С04+-клеток).

Показатель Контроль (п=10) КРР (п=5) РЛ (п=3) РМЖ (п=3) РЖ (п=3)

Наивные Т-клетки 30,5+1,0 29,1±6,1 39,3+1,2* 35,2±0,7* 25,1+5,4

Т-клетки памяти 61,3±0,9 54,0+3,6* 45,9±4,6* 50,0±2,1* 59,2+9,1

Активированные клетки 8,1±0,5 16,9±3,2* 14,7±5,8 14,7±2,1* 15,8+3,8

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

3. CD4+CD25+ клетки периферической крови при опухолевом росте.

Treg-клетки относятся к популяции CD4+CD25+ лимфоцитов. Однако популяция CD4+CD25+ клеток является гетерогенной по уровню экспрессии мембранной молекулы CD25 и состоит из клеток с низкой (CD4+CD25dim) и высокой (CD4+CD25high) экспрессией этого антигена. Лимфоциты с фенотипом CD4+CD25hlEh принято относить к Treg-клеткам, так как они проявляют супрессорную активность. В периферической крови CD4+CD25hl8h клетки составляют по разным данным 1-3% от общего числа лимфоцитов или около 5% среди СБ4-клеток (Sasaki et al., 2004; Knutson et al., 2007). Пример анализа популяции CD4+CD25high лимфоцитов показан на рисунке 4.

Содержание Treg-клеток с фенотипом CD4+ CD25hlgh в контроле составило 2,4±0,1% от общего числа лимфоцитов, что с учётом среднего возраста обследованных нами лиц (52,1±2,2 года) согласуется с литературными данными (Gregg et al., 2005). У онкологических больных количество CD4+CD25hlg клеток было выше, чем в контроле (табл. 3).

10 10" ССМ-РС7

С04+С025И'оЬ

С04+С025й|т

Пример анализа С04+СВ25Ы811 проточной

Рис.4. популяции клеток методом цитометрии.

Примечание: анализ клеток проводился при помощи гейтирования по лимфоци-

При исследовании содержания Тге§-клеток в зависимости от локализации опухоли были выявлены некоторые особенности. Так, при РЛ и РМЖ содержание С04+С025Ь1ёЬ клеток заметно отличалось от контроля, тогда как при КРР и РЖ различий выявлено не было.

Более значительные изменения отмечены при исследовании содержания СБ4+С025'118Ь клеток внутри популяции С04-лимфоцитов (табл. 3). Содержание Т^ в контроле составило 5,0±0,3%, тогда как при опухолевом росте - 7,2±0,5% (р<0,05). Было отмечено увеличение количества Treg внутри популяции СБ4+ клеток при РЛ, РМЖ, КРР. В то же время при раке желудка число С04+С025Ь'ЕЬ клеток не отличалось от контроля.

Особый интерес представляло исследование содержания СВ4+С025Ы8Ь клеток внутри популяции СЭ4+ лимфоцитов имеющих маркер С045Я0, поскольку в литературе имеются данные о том, что Treg-клeтки отличаются высокой экспрессией этого антигена й а1., 2006).

Таблица 3

Содержание Т^-клеток с фенотипом С04+СВ25Ы811 в периферической крови больных с опухолями (%).

Группы С04+С025Ы8Ь/ Лимфоциты С04+С025ы^/ С04>-клетки С04+С025Ы8"/ С04+СШ5Я0+

Контроль (п=10) 2,4 ±0,1 5,0 ±0,3 6,4 ±0,3

Онкологические больные (п=14) 3,2 ±0,3* 7,2 ± 0,5* 10,2 ± 1,0*

РЛ (п=3) 3,6 ± 0,2* 7,6 ±0,7* 12,9 ±2,8*

РМЖ (п=3) 3,2 ±0,1* 6,7 ±0,8* 9,0 ±1,5

КРР (п=5) 3,3 ± 0,9 7,6 ±1,1* 10,4 ±1,8*

РЖ (п=3) 2,8 ± 0,4 6,5 ±1,4 8,2 ± 1,9

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

При изучении содержания С04+С025ЫеЬ клеток с учетом экспрессии маркеров СО4+ и С045Я0+ был выявлен ряд существенных различий относительно контроля. Так, количество СБ45ЯО+ Treg-клeтoк у онкологических больных было выше, чем в контрольной группе (р<0,05). Значительное изменение численности Treg-клeтoк было отмечено при РЛ и КРР, тогда как при РМЖ и РЖ различий выявлено не было.

Таким образом, установлено, что количество Treg-клeтoк увеличивается при опухолевом росте. Наиболее значительные изменения численности Т^-клеток выявлены при КРР и РЛ. По всей видимости, Т^-лимфоциты могут служить удобным индикатором степени иммунной супрессии у больных с опухолями. При этом для определения клеток-супрессоров большое значение имеет набор используемых маркеров. По всей видимости, применение маркера клеток памяти -СБ45110+ может успешно применяться при идентификации Treg-лимфоцитов.

4. Исследование экспрессии маркеров Treg-клеток (TGF-ßl и FOXP3) в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте.

Для оценки состояния популяции Treg-клеток у онкологических больных было проведено исследование экспрессии генов TGF-ßl и FOXP3, ассоциированных с активностью клеток-супрессоров (Ярилин, Донецкова, 2006; Chen, Wahl, 2003; Yagi et al., 2004).

Проведенное исследование показало, что уровень относительной экспрессии TGF-ßl при опухолевом росте оказался значительно выше по сравнению с контролем (р<0,05) (Рис. 5).

Рис.5. Экспрессия генов ТОИ-р 1 и БОХРЗ в лимфоцитах периферической крови больных с опухолями (п=33) и здоровых доноров (п=15).

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

TGF-ß1

FOXP3

□ Контроль Ш Онкологические больные

При изучении содержания мРНК транскрипционного фактора РОХРЗ в лимфоцитах периферической крови онкологических больных установлено, что уровень экспрессии гена РОХРЗ у больных с опухолями оказался заметно выше, чем в контрольной группе (Рис. 5).

Уровень экспрессии генов ТСР-р1 и РОХРЗ определяли также на разных стадиях опухолевого процесса (Рис. 6).

й 1'8 S.S 1.6

1 I w

й 8 о.» I S 0,8

§ 0,4

I °'2 б 0,0

TGF-ß1 □ Контроль Ш-ll стадии I

т 1

¡яр

¡¡ЯР

FOXP3 I стадия ■ IV стадия

Рис.6. Экспрессия генов ТСР-Р1 и БОХРЗ в лимфоцитах периферической крови на разных стадиях опухолевого роста.

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

Самые незначительные изменения экспрессии генов TGF-ßl и FOXP3 отмечены на I и II стадиях заболевания. Уровень экспрессии цитокина TGF-ßl в группе больных с I-II стадиями не отличался от контроля. Величина экспрессии другого маркера Treg-клеток - FOXP3, также была самой низкой у лиц с опухолями на I-II стадиях, но при этом оказалась выше, чем в контроле (р<0,05). На поздних стадиях выявлены более существенные различия. Содержание мРНК TGF-ßl на III и IV стадиях онкогенеза было в полтора раза выше по сравнению с контролем (р<0,05). Уровень экспрессии FOXP3 на поздних стадиях опухолевого роста также оказался более высоким. В группе больных с опухолями на

III стадии уровень экспрессии FOXP3 составил 1,56±0,09, а у больных с

IV стадией - 1,76±0,12, что значительно выше, чем в контроле (р<0,05). Для изучения содержания мРНК генов TGF-pi и FOXP3 в

зависимости от локализации опухоли были исследованы пробы крови больных КРР и PJI (Рис. 7). Оказалось, что количество мРНК TGF-pi в лимфоцитах периферической крови больных КРР и РЛ значительно выше, по сравнению с контролем (р<0,05). При PJI отмечен более высокий уровень экспрессии TGF-ß 1, в отличие от больных КРР.

TGF-ßl FOXP3

□ Контроль ЩКРР ШРЛ

Рис.7. Экспрессия генов ТСР-Р1 и РОХРЗ в лимфоцитах периферической крови. КРР - колоректальный рак (п=22), РЛ - рак лёгкого (п=11).

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

Величина экспрессии транскрипционного фактора БОХРЗ в лимфоцитах периферической крови больных КРР и РЛ также была выше, чем в контроле (р<0,05). Следует отметить, что уровень экспрессии РОХРЗ в лимфоцитах крови у больных РЛ оказался значительно выше, чем при КРР (р<0,05).

Таким образом, исследование показало, что при опухолевом росте происходит увеличение экспрессии ингибирующего цитокина - ТСР-р1, а также внутриклеточного маркера РОХРЗ. Отмечается тенденция к увеличению экспрессии этих генов по мере развития опухолевого процесса, что указывает на усиление активации Тге£-клеток. При КРР изменения экспрессии генов ТОР-Р1 и РОХРЗ были менее значительными, тогда как при РЛ содержание мРНК ТОР-Р1 и РОХРЗ было выше. Результаты настоящего исследования позволяют предполагать, что в процессе формирования иммунной супрессии при опухолевом росте происходит изменение функциональной активности Treg-клeтoк, что сопровождается усилением экспрессии генов РОХРЗ и ТвР-Р!.

5. Изучение экспрессии основных компонентов сигнального пути TGF-J5 в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте.

По некоторым данным, TGF-Р может стимулировать дифференцировку Treg-лимфоцитов (Perrot et al., 2007), а также ингибировать функции эффекторов противоопухолевого иммунного ответа: Т-хелперов, ЦТЛ, дендритных клеток (Chen et al., 2005; Larmonier et al., 2007). В связи с этим, значительный интерес представляет изучение роли TGF-Р в механизмах супрессии с участием Treg-клеток и в процессе их дифференцировки на периферии. Однако молекулярные механизмы этих воздействий требуют дальнейшего, всестороннего изучения. Поэтому было проведено исследование экспрессии основных компонентов сигнального пути TGF-Р: TGF-pi, TGF-PRII, FOXP3, Smad3 и Smad7.

i 1*

S 1,6

i* M

«I u

£ = M Co

<0 2 0.6

t <0 •

§ OA

g 0,2

5 °.o

TOF-fS1 TQF-pRl FOXPJ SmadS Srrad7

□ Контроль ■Онкологические больные

Рис. 8. Экспрессия генов сигнального пути ТвР-р в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте.

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

Уровень экспрессии генов TGF-pi и FOXP3 в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте был выше, чем в контроле, тогда как уровень экспрессии TGF-PRII значительно не изменялся (Рис.8). Особый интерес представляло исследование изменения экспрессии молекул семейства Smad, которые выполняют ключевую роль в активации (Smad3) и подавлении (Smad7) передачи сигнала при связывании TGF-pi с рецептором. Проведенное исследование показало, что в лимфоцитах периферической крови не изменяется экспрессия активатора сигнального пути TGF-pi - Smad3. Согласно данным литературы, транскрипционный фактор Smad3 необходим при передаче сигнала и подавлении функций CD4+ и CD8+ Т-клеток под действием TGF-pi (McKams, Schwartz, 2005). Таким образом, можно предположить, что при опухолевом росте механизм активации сигнального пути TGF-pi на уровне Smad3 функционирует без изменений. В то же время, уровень экспрессии ингибирующего медиатора Smad7 в лимфоцитах периферической крови оказался значительно ниже, чем в контроле (р<0,05). Аналогичные данные были получены и другими исследователями. Например, в работе Fantini и соавт. (Fantini et al., 2004) было показано, что TGF-pi может стимулировать развитие регуляторного фенотипа у CD4+CD25~ клеток в результате индукции мРНК FOXP3 и подавления экспрессии Smad7.

Таким образом, усиление супрессорной активности при опухолевом росте, вероятно, происходит в результате увеличения экспрессии TGF-pi и снижения экспрессии медиатора Smad7.

6. Сравнительная характеристика экспрессии молекулярных маркеров Treg (FOXP3 и TGF-pl) при вирусных инфекциях, аутоиммунных и онкологических заболеваниях.

В последнее время большое внимание уделяется изучению механизмов регуляции иммунного ответа при различных заболеваниях. По современным представлениям основными эффекторами иммунитета, обеспечивающими выполнение регулхторных функций, являются Treg-лимфоциты. Treg-клетки обеспечивают не только нормальное протекание физиологических процессов, но в тоже время контролируют развитие патологий (Chatila, 2005; Belkaid et al., 2006; Strauss et al., 2007a). В частности, при различных аутоиммунных заболеваниях наблюдается уменьшение численности Treg-клеток (Crispin et al., 2003; Longhi et al., 2004) и снижение их супрессорной активности (Viglietta et al., 2004; Longhi et al., 2005; Kekâlainen et al., 2007). Было показано, что Treg-лимфоциты участвуют в регуляции вирусспецифического иммунитета (Воробьев и др., 2006; Ярилин, Донецкова, 2006). В последнее время

изменение функциональной активности Тгец-клеток рассматривается в качестве одного из основных механизмов иммунной супрессии при опухолевом росте (Ктйвоп, 2007; УакисукИ, Левшск, 2007).

Целью данного исследования было сравнительное изучение состояния иммунной супрессии при онкологических, аутоиммунных заболеваниях, а также у больных с хронической вирусной инфекцией (вирус папилломы человека). Оценка степени иммунной супрессии проводилась по уровню экспрессии ТСР-Р1 и РОХРЗ.

У лиц с аутоиммунной патологией не выявлено изменений в экспрессии мРНК ТОР-[31 относительно контроля. В то же время, уровень относительной экспрессии ТОР-Р1 при опухолевом росте, а также у лиц с вирусной инфекцией оказался значительно выше по сравнению с контролем (р<0,05) (Рис. 9).

При опухолевом росте уровень экспрессии гена РОХРЗ оказался заметно выше, чем в контрольной группе (р<0,05) (Рис. 9).

У лиц с хронической

о ф

о.

с. о

о л

ш ш

о а

>5 л

л с; ф н

1,6 1.4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

TGF.pi

контроль АИЗ

ви

РОХРЗ

онко

ви

онко

контроль АИЗ

Рис. 9. Уровень экспрессии ТСР-Р1 и РОХРЗ в лимфоцитах периферической крови. Условные обозначения: АИЗ -аутоиммунные заболевания; ВИ -хроническая вирусная инфекция; ОНКО -опухоли различной локализации. Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

вирусной инфекцией относительное количество мРНК гена РОХРЗ было несколько ниже, чем у больных с опухолями, но отличалось от контроля (р<0,05). В случае с аутоиммунной патологией различий в уровне экспрессии гена РОХРЗ выявлено не было.

Изучение экспресссии генов, ассоциированных с активностью Treg-клeтoк в лимфоцитах периферической крови больных при различных патологиях показало, что наиболее высокое содержание мРНК ТСР-Р1 и РОХРЗ отмечается в лимфоцитах периферической крови онкологических больных и у лиц с хронической вирусной инфекцией. Результаты исследования согласуются с данными литературы

(Воробьёв и др., 2006; Насонов, Быковская, 2006; Chatila, 2005; Franzke et al., 2006) о роли Trcg-клеток при опухолевом росте, аутоиммунных процессах, хронических вирусных инфекциях и свидетельствуют о возможности применения маркеров TGF-pi и FOXP3 для оценки состояния популяции Treg-клеток.

7. Изучение влияния рекомбинантного TGF-pl на CD4+CD25+ клетки в культуре лимфоцитов периферической крови.

Многочисленные исследования свидетельствуют о значительной роли TGF-P в регуляции иммунных реакций организма при опухолевом росте. Однако, изучение функций TGF-P осложняется тем, что его активность может изменяться под действием факторов микросреды и, главным образом, это происходит при участии различных про- и противовоспалительных цитокинов. Поэтому, для изучения свойств цитокина было проведено исследование его воздействия на клетки-мишени в условиях in vitro.

Целью эксперимента было изучение воздействия рекомбинантного человеческого TGF-pi на CD4+CD25+ клетки при культивировании лимфоцитов периферической крови в зависимости от его концентрации, а также наличия экзогенного IL-2.

Результаты эксперимента представлены на рисунке 11. Оказалось, что с увеличением концентрации рекомбинантный TGF-pi оказывает ингибирующее действие на CD4+CD25+ клетки при культивировании, что отражается в изменении относительного содержания CD4+CD25+ лимфоцитов, а также снижении интенсивности флюоресценции по CD25.

-ф-TOF-pi ♦ Й--2 -a-TGF.pl

1 2 5 10 TGF-pi, нг/мл

-♦-TGF-pi + IL-2 -*-TGF-p1

1 2 5 10 TGF-p 1, нг/мл

Рис.11. Изменение содержания С04^С025+ лимфоцитов (% от числа С04+-клеток) в зависимости от концентрации рекомбинантного ТОР-р1. А - контроль (п=6), Б - онкологические больные (п=10). Примечание: * - различия достоверны между группами («ТСР-Р1» и «ТОР-Р1+1Ь-2») (р<0,05).

Характер воздействия TGF-pi на клетки изменялся при добавлении в культуру экзогенного IL-2. При этом исходный уровень содержания CD4+CD25+ лимфоцитов, соответствующий концентрации TGF-pi равной О нг/мл, был несколько выше (Рис. 11). С увеличением концентрации TGF-pi от 0 нг/мл до 2 нг/мл при культивировании лимфоцитов в присутствии равных доз IL-2, относительное количество CD4+CD25+ клеток возрастало, что можно объяснить кооперативным действием цитокинов по усилению экспрессии молекул CD25. Таким образом, наиболее высокое содержание CD4+CD25+ лимфоцитов, как в опытных образцах, так и в контроле достигалось при концентрации TGF-pl равной 2 нг/мл (Рис. 11). В дальнейшем, с увеличением концентрации TGF-pl до 5 нг/мл, наблюдалось незначительное снижение количества лимфоцитов, несущих маркер CD25. Однако численность CD4+CD25+ клеток при этом оставалась на высоком уровне. Начиная с концентрации 10 нг/мл, отмечалось ингибирующее действие TGF-pi на клетки, а воздействие цитокина в концентрации 20 нг/мл почти полностью нивелировало эффект от присутствия IL-2.

Таким образом, исходя из результатов эксперимента, можно заключить, что TGF-pi оказывает ингибирующее действие на лимфоциты при культивировании, в результате чего с ростом концентрации супрессорного цитокина происходит снижение экспрессии молекул CD25. Однако, наличие в культуре лимфоцитов дополнительно экзогенного IL-2 оказывает положительный кооперативный эффект на CD4+CD25+ лимфоциты, что способствует возрастанию их количества при низких концентрациях TGF-pi (1-5 нг/мл). Важно отметить, что увеличение численности СВ25+-клеток, может быть связано как с изменениями фенотипа клеток при их активации, так и в результате роста числа регуляторных лимфоцитов в процессе культивирования. По некоторым данным, IL-2 и TGF-P при совместном воздействии могут способствовать индукции фенотипа Treg-клеток, усиливать экспрессию Foxp3, а также мембранного маркера CD25 (Davidson et al., 2007; Zheng et al., 2007).

ВЫВОДЫ

1. При опухолевом росте наблюдается повышение количества Treg-клеток с фенотипом CD4+CD25highCD45RO+ в периферической крови, что указывает на активацию механизмов иммунной супрессии у онкологических больных.

2. Установлено, что в онкогенезе происходит усиление экспрессии генов TGF-pi и FOXP3, которые ассоциированы с супрессорной

активностью Treg-клеток. Уровень экпрессии этих генов возрастает по мере прогрессирования опухолевого процесса.

3. Одним из механизмов активации сигнального пути TGF-P при опухолевом росте может быть увеличение секреции TGF-pi и снижение экспрессии ингибирующего медиатора Smad7.

4. Применение рекомбинантного IL-2 снижает супрессорное влияние TGF-pi и способствует индукции клеток с фенотипом CD4+CD25+. Таким образом, показана возможность использования экзогенных факторов для модуляции активности TGF-pi.

5. Полученные данные о функциональном состоянии популяции Treg-клеток в онкогенезе могут быть использованы в комплексной оценке степени иммунной супрессии у онкологических больных.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КРР - колоректальный рак

РЖ - рак желудка

PJI - рак лёгкого

РМЖ - рак молочной железы

ЦТЛ - цитотоксический Т-лимфоцит

CD - cell differentiation antigene- антиген кластеров

дифференцировки клеток FOXP3 - транскрипционный фактор forkhead box РЗ IL - interleukin - интерлейкин Smad - семейство транскрипционных факторов TGF-p - transforming growth factor-p - трансформирующий фактор роста- Р

TGF- PRII - рецептор к TGF- р II типа. Treg — регуляторный Т-лимфоцит

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чуров А.В., Олейник Е.К., Олейник В.М. TGF-p, регуляторные Т-клетки (Treg) и перспективы терапии онкопатологий // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10. - №1. - С. 113.

2. Чуров А.В., Олейник Е.К., Олейник В.М. Анализ экспрессии трансформирующего фактора роста (3 лимфоцитами периферической крови в онкогенезе // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10. - №2. -С. 254.

3. Олейник В.М., Олейник Е.К., Чуров A.B. Изучение экспрессии молекулярных маркеров иммунной супрессии FOXP3, TGF-ß, TßRII в лимфоцитах периферической крови онкологических больных // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2. - №2-3. - С. 123.

4. Ковчур П.И., Олейник Е.К., Бахлаев И.Е, Чуров A.B., Олейник В.М. Влияние «Аллокина-альфа» на экспрессию маркеров регуляторных лимфоцитов Treg у больных с хронической папилломавирусной инфекцией // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2009. - Т. 11. - №1. - С. 958 - 961.

5. Ковчур П.И., Олейник Е.К., Бахлаев И.Е, Чуров A.B., Олейник В.М. Клиническая эффективность «Аллокина-альфа» и его влияние на экспрессию маркеров регуляторных лимфоцитов Treg при лечении больных с хронической ВПЧ-инфекцией // Материалы III регионального научного форума «Мать и дитя». - Саратов, 2009. - С. 127 - 128.

6. Олейник Е.К., Бахлаев И.Е., Игнатьев К.С., Олейник В.М., Чуров A.B. Особенности фенотипа лимфоцитов периферической крови при раке молочной железы // Материалы XXVI научно-практической конференции хирургов Республики Карелия, посвященной 45-летию хирургического отделения ГУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова» и 45-летию кафедры госпитальной хирургии ГОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет». - Петрозаводск, 2009. -С. 176- 178.

7. Олейник Е.К., Бахлаев И.Е., Ястребова A.B., Олейник В.М., Чуров A.B. Изучение иммунного статуса у больных колоректальным раком // Материалы XXVI научно-практической конференции хирургов Республики Карелия, посвященной 45-летию хирургического отделения ГУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова» и 45-летию кафедры госпитальной хирургии ГОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет». - Петрозаводск, 2009. - С. 172 - 175.

8. Олейник Е.К., Олейник В.М., Донников М.Ю., Чуров A.B., Чурова М.В., Герасимова JI.A. Изучение экспрессии IL-4, IL-10, TGF-ß лимфоцитами периферической крови онкологических больных // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9. - №2-3. - С. 282.

9. Олейник Е.К., Олейник В.М., Чуров A.B. Экспрессия молекулярных маркеров иммунной супрессии FOXP3, TGF-ß, TGF-ß-RII в лимфоцитах периферической крови у больных с различными иммунными патологиями // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11. - №4-5. -С. 430.

10. Олейник Е.К., Олейник В.М., Чуров A.B., Бахлаев И.Е., Ковчур П.И., Мясников A.A., Балашов А.Т. Экспрессия молекулярных маркеров регуляторных лимфоцитов FOXP3 и TGF-ß 1 при вирусных инфекциях, аутоиммунных и онкологических заболеваниях // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2009. - Т. 11.— №1. — С. 1006- 1009.

11. Олейник Е.К., Олейник В.М., Чуров A.B., Бахлаев И.Е., Мясников A.A., Топчиева JI.B. Регуляторные клетки Treg и иммунотерапия в онкологии // Аллергология и иммунология. - 2008. - №3. - С. 323.

12. Чуров A.B. Изучение экспрессии маркеров иммунной супрессии TGF-ßl, CD25 и FOXP3 в лимфоцитах крови онкологических больных // Материалы международной молодежной научной конференции «Ломоносов-2009». - Москва. - 2009. - С. 51 - 52.

13. Чуров A.B., Олейник Е.К., Олейник В.М. TGF-ßl и регулятрные Т-клетки в формировании иммунной супрессии у онкологических больных // Цитокины и воспаление. - 2009. - Т. 8. - №2. - С. 27 - 30.

14. Чуров A.B., Олейник Е.К., Олейник В.М. Оценка функциональной активности регуляторных Т-лимфоцитов у онкологических больных по уровню экспрессии CD25, TGF-ßl и FOXP3 в лимфоцитах периферической крови у больных с различными иммунными патологиями // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11. - №4-5. -С. 441.

15. Чуров A.B., Олейник Е.К., Олейник В.М. Роль трансформирующего фактора роста ß в формировании иммуносупрессии в онкогенезе // Цитокины и воспаление. - 2009. - Т. 8. - №3. - С. 11 - 15.

16. Чуров A.B., Чурова М.В., Олейник Е.К. Модуляция экспрессии TGF-ß у лимфоцитов периферической крови человека при опухолевом росте // Тезисы докладов VI Мол. науч. конф. «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике». - Сыктывкар: УроРАН, 2007.

17. Чурова М.В., Чуров A.B., Олейник Е.К. Влияние ронколейкина на экспрессию интерлейкина-10 при опухолевом росте // Тезисы докладов VI Мол. науч. конф. «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике». - Сыктывкар: УроРАН, 2007.

18. Чуров A.B., Олейник Е.К., Олейник В.М., Шибаев М.И. Содержание CD4+CD25high лимфоцитов-супрессоров в периферической крови больных колоректальным раком // Цитокины и воспаление. - 2010. -Т. 9,-№4.-С. 133- 134.

19. Олейник Е.К., Чуров A.B., Олейник В.М. Регуляторные лимфоциты и субпопуляции клеток памяти CD4+CD45RO+ у онкологических больных // Цитокины и воспаление. - 2010. - Т. 9. - №4. - С. 105 - 106.

Формат 60x84 V16. Бумага офсетная. Гарнитура «Times». Уч.-изд. л. 1,0. Усл. печ. л. 1,2. Подписано в печать 11.11.10. Тираж 100 экз. Изд. № 156. Заказ № 909.

Карельский научный центр РАН Редакционно-издательский отдел 185003, Петрозаводск, пр. А. Невского, 50

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чуров, Алексей Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Иммунитет и опухоли.

1.2. Регуляция иммунного ответа: роль СБ4+СБ25+ клеток-супрессоров.

1.2.1 Общая характеристика СБ4+С025+ регуляторных клеток.

1.2.2. Фенотип регуляторных лимфоцитов.

1.2.3. Динамика численности регуляторных клеток в онкогенезе.

1.2.4. Механизмы функционирования регуляторных клеток.

1.3. Трансформирующий фактор роста-р - индуктор иммунной супрессии при опухолевом росте.

1.3.1. Общая характеристика ТСР-(3 и его функций.

1.3.2 Значение ТвБ-р, как стимулятора дифференцировки регуляторных клеток в онкогенезе.

1.3.3. Роль ТвБ-Р в осуществлении супрессорной активности регуляторных лимфоцитов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материал исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Получение периферической крови.

2.2.2. Проточная цитофлюориметрия.

2.2.3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени, совмещенная с обратной транкрипцией.

2.2.4. Культивирование лимфоцитов периферической крови в присутствии рекомбинантного ТОР-131.

2.2.5. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Содержание основных популяций лимфоцитов в периферической крови при опухолевом росте.

3.2 Содержание наивных клеток, активированных лимфоцитов и клеток памяти внутри популяции С04-клеток при опухолевом росте.

3.3 CD4+CD25+ клетки периферической крови при опухолевом росте.

3.4 Исследование экспрессии маркеров Treg-клеток (TGF-ßl и FOXP3) в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте.

3.5 Изучение экспрессии основных компонентов сигнального пути TGF-ß в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте.

3.6 Сравнительная характеристика экспрессии молекулярных маркеров Treg (FOXP3 и TGF-ßl) при вирусных инфекциях, аутоиммунных и онкологических заболеваниях.

3.7 Изучение влияния рекомбинантного TGF-ßl на CD4+CD25+ клетки в культуре лимфоцитов периферической крови.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляторные Т-клетки и трансформирующий фактор роста-β при опухолевом росте"

Актуальность работы. Несмотря на интенсивное изучение состояния иммунитета при опухолевом росте, основные закономерности формирования иммунных нарушений в онкогенезе по-прежнему не определены. В настоящее время не сформированы четкие представления о значении иммунной системы в процессе возникновения и развития опухолей.

В современных исследованиях, посвященных нарушениям иммунофизиологических функций при опухолевом росте, большое внимание уделяется изучению механизмов регуляции иммунного ответа и сохранения постоянства внутренней среды организма. Важную роль в поддержании гомеостаза в иммунной системе играют регуляторные Т-клетки (Treg), основными маркерами которых являются мембранные антигены CD4, CD25 и внутриклеточный транскрипционный фактор FOXP3 (forkhead box РЗ). В последние годы были получены данные, свидетельствующие об увеличении численности Treg-клеток у больных с опухолями (Hobeika et al., 2004; Kawaida et al., 2005; Okita et al., 2005; Ormandy et al., 2005; Clarke et al., 2006; Hueman et al., 2006; Leong et al., 2006; Liu et al., 2006a; Miller et al., 2006; Knutson et al., 2007; Ling et al., 2007). Оказалось, что повышенное содержание Treg-лимфоцитов ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при опухолевом росте (Curiel et al., 2004; Petersen et al., 2006; Schreiber, 2007; Yakirevich, Resnick, 2007). Эти данные позволяют предполагать, что Treg-клетки имеют решающее значение в патогенезе онкологических заболеваний.

Предполагается, что одним из медиаторов функциональной активности Treg-клеток является трансформирующий фактор роста-p (TGF-P) (Zhang et al., 2006; Wan, Flavell, 2007). Важным свойством TGF-(3 является плейотропность, обуславливающая широкий спектр его биологического действия и иммунорегуляторную активность. Известно, что TGF-(3 регулирует функции всех видов иммунокомпетентных клеток. Наиболее сильное действие и, главным образом, иммуносупрессорное, TGF-P оказывает на Т-клетки: подавляет пролиферацию, блокирует секрецию IL-2, ингибирует дифференцировку Т-хелперов первого и второго типа (Li, 2006; Zhang et al., 2006) и может стимулировать образование Treg-клеток (Rao et al., 2005; Liu et al., 2007).

Особенности функционирования TGF-P и Treg-клеток вызывают большой интерес в исследовании состояния иммунитета при опухолевом росте. Активация, увеличение численности Treg-лимфоцитов и иммуносупрессорное действие TGF-P могут быть ключевыми механизмами возникновения иммунных нарушений в онкогенезе, которые приводят к снижению эффективности противоопухолевого иммунного ответа и формированию толерантности к опухолевым антигенам. Изучение функциональной взаимосвязи Treg-клеток и TGF-P открывает перспективы для разработки новых методов оценки степени иммунной супрессии и эффективной иммунотерапии у больных с опухолями.

Цель исследования состояла в изучении роли Treg-клеток и TGF-p в формировании иммунной супрессии при опухолевом росте.

Задачи исследования: 1. Изучить численность различных популяций лимфоцитов периферической крови (Т-клеток, Т-хелперов, ЦТЛ, наивных CD4+ Т-лимфоцитов, CD4+ Т-клеток памяти, В-лимфоцитов) при опухолевом росте.

2. Определить содержание Treg-клeтoк периферической крови в норме и при опухолевом росте.

3. Изучить уровень экспрессии генов цитокина ТОР-р (ТОР~Р 1) и транскрипционного фактора РОХРЗ в лимфоцитах периферической крови в процессе онкогенеза.

4. Исследовать особенности экспрессии основных компонентов сигнального пути ТСБ-Р (ТОР-[И, ТОБ-РЯН, РОХРЗ, SmadЗ и 8тасГ7) в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте.

5. Провести сравнительное изучение функционального состояния популяции Т^-клеток по уровню экспрессии ТОР-р (ТОР-(И) и транскрипционного фактора РОХРЗ в лимфоцитах периферической крови у лиц с опухолями, аутоиммунной патологией и хронической вирусной инфекцией.

Научная новизна работы. Работа содержит новые данные о роли ТОР-р и Тге§-клеток в развитии иммунной супрессии при опухолевом росте.

Впервые на клеточном и молекулярном уровне дана комплексная оценка степени иммунной супрессии у онкологических больных. Впервые в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте изучен уровень экспрессии генов, ассоциированных с активностью Тге§-клеток и их основного цитокина - ТОР-р (ТОР-Р1, ТОР-рШ1, РОХРЗ, БтасВ и БтасП).

Установлено, что в ходе онкогенеза происходит увеличение экспрессии генов ТОР-р 1 и РОХРЗ и снижается уровень экспрессии основного ингибитора сигнального пути ТОР-Р - 8тасГ7, что может рассматривться как один из механизмов активации супрессорной активности. Впервые дана сравнительная оценка уровня экспрессии генов ТОР-р 1 и РОХРЗ при различных иммунных патологиях.

Теоретическое и практическое значение работы. На основании результатов проведенного исследования можно предполагать, что в ходе онкогенеза происходит гиперактивация механизмов, вызывающих снижение эффективности противоопухолевого иммунитета. По всей видимости, при опухолевом росте изменяется функционирование эффекторов иммунного ответа в результате снижения их активации, ингибирования пролиферации и развития анергии. В дальнейшем развивается толерантность к антигенам опухоли. Одним из механизмов, обуславливающих эти процессы, является усиление активности Т^-клеток и изменение секреции их функционального медиатора - ТОР-|31.

Полученные результаты дополняют и уточняют имеющиеся в литературе данные о роли Т^-клеток и ТСР-(3 в развитии иммунной супрессии в ходе онкогенеза. Результаты работы целесообразно использовать при разработке методов оценки степени иммунной супрессии у онкологических больных. Материалы диссертации могут применяться при чтении курсов лекций по общей, молекулярной и клинической иммунологии для студентов ВУЗов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. При опухолевом росте в периферической крови увеличивается численность Т^-клеток с фенотипом С04+С025Ь18ЬС045БЮ+.

2. В ходе онкогенеза происходит усиление экспрессии генов ТСР-|31 и БОХРЗ, ассоциированных с активностью Тге§-клеток. При этом их экспрессия увеличивается по мере развития опухолевого процесса.

3. Одним из механизмов активации сигнального пути ТвБ-Р в лимфоцитах периферической крови при опухолевом росте является увеличение экспрессии изоформы ТСР-Р1 и снижение экспрессии медиатора 8тас17.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XI, XII и XIII Всероссийских научных форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2007, 2008, 2009),

IV съезде иммунологов России (Санкт-Петербург, 2008), VI Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2007) и XVI Международной научной конференции «Ломоносов» (Москва, 2009).

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, а также списка литературы, включающего 211 источников, из них 207 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Чуров, Алексей Викторович

выводы

1. При опухолевом росте наблюдается повышение количества Тл^-клеток с фенотипом СВ4+СБ25Ы^С0451Ю+ в периферической крови, что указывает на активацию механизмов иммунной супрессии у онкологических больных.

2. Установлено, что в онкогенезе происходит усиление экспрессии генов ТОБ-(31 и РОХРЗ, которые ассоциированы с супрессорной активностью Т^-клеток. Уровень экпрессии этих генов возрастает по мере прогрессирования опухолевого процесса.

3. Одним из механизмов активации сигнального пути ТвР-Р при опухолевом росте может быть увеличение секреции ТОР-р1 и снижение экспрессии ингибирующего медиатора 8тасГ7.

4. Применение рекомбинантного 1Ь-2 снижает супрессорное влияние ТвР-Р1 и способствует индукции клеток с фенотипом С04+С025+. Таким образом, показана возможность использования экзогенных факторов для модуляции активности ТОБ-РЬ

5. Полученные данные о состоянии популяции Treg-клeтoк в онкогенезе могут быть использованы в комплексной оценке степени иммунной супрессии у онкологических больных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что при опухолевом росте содержание основных популяций лимфоцитов значительно не изменяется. Однако наблюдаются значительные индивидуальные колебания численности Т-клеток, ЦТЛ и Т-хелперов. В целом, результаты работы свидетельствуют об отсутствии выраженного иммунного дефицита у больных с опухолями.

Более детальное изучение популяции С04+-клеток, а именно, определение содержания наивных лимфоцитов, активированных клеток и клеток памяти позволило выявить ряд существенных изменений. По нашим данным, количество наивных клеток у больных с опухолями не отличалось от контроля. Однако при изучении этого показателя у лиц с различной локализацией опухоли было установлено, что при раке легкого и молочной железы содержание наивных лимфоцитов было выше, чем в контроле. В то же время, у больных с опухолями было отмечено снижение численности клеток памяти и почти двукратное увеличение активированных клеток по сравнению с контролем. Это может быть связано с нарушением процессов формирования иммунологической памяти у онкологических больных.

При исследовании содержания Тл^-клеток с фенотипом СЭ4+С025ь'ёЬ было выявлено значительное увеличение их численности у больных с опухолями. Оказалось, что для идентификации Тл^-клеток может быть полезным применение маркера клеток памяти — С045Я0, который позволяет определить существенные различия, не заметные при оценке содержания Тл^-клеток внутри общей популяции лимфоцитов. Другими словами, для детекции клеток-супрессоров предпочтительнее использовать фенотип С04+С025Ы8ЬС045БЮ+, вместо СБ4+СВ25Ы8Ь. Так, например, учитывая маркер СБ45КО, нами было отмечено, что самые значительные изменения в содержании Treg-клeтoк происходят при колоректальном раке и раке легкого.

У больных колоректальным раком и раком легкого проводилась оценка функциональной активности Т^-клеток по уровню экспрессии генов ТвР-[31 и БОХРЗ, которые, по данным литературы, играют важную роль в процессе дифференцировки и функционирования Treg-лимфoцитoв. Показано, что экспрессия вышеуказанных генов значительно увеличивается при опухолевом росте. Наиболее высокий уровень экспрессии генов ТвР-р1 и РОХРЗ был отмечен на поздних (П1-1У) стадиях онкогенеза, при этом величина экспрессии РОХРЗ изменялась более значительно. При раке легкого функциональная активность Т^ была выше, чем при колоректальном раке.

Для исследования механизмов активации супрессорной активности в онкогенезе был изучен уровень экспрессии компонентов сигнального пути ТОБ-Р: ТОР-(31, ТСР-РШ, РОХРЗ, БтаёЗ и 5тас17. В результате проведенного исследования нами было установлено, что уровень экспрессии ТОР-[31 в лимфоцитах больных с опухолями увеличивался. В то же время, экспрессия гена рецептора ТОР-|31Ш не изменялась, по сравнению с контролем. Исследование экспрессии медиаторов семейства Бтас! показало, что уровень экспрессии 5тас13 не изменялся, однако экспрессия БтасП, напротив, была значительно ниже, чем в контроле. При исследовании экспрессии компонентов сигнального пути ТОР-(31 также была выявлена повышенная экспрессия РОХРЗ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чуров, Алексей Викторович, Петрозаводск

1. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение / Под ред. С.В. Хайдукова, А.В. Зурочки. Челябинск. -2008. - 195 с.

2. Воробьев А.А., Быковская С.Н., Пашков Е.П., Быков А.С. Роль клеток-регуляторов CD4+CD25+ в развитии хронических инфекционных заболеваний // Вестник Российской АМН. 2006. - № 9- 10.-С. 24-29.

3. Насонов Е.Л., Быковская С.Н. Т-регуляторные клетки при аутоиммунных ревматических заболеваниях // Вестник Российской АМН. 2006. - № 9 - 10. - С. 74 - 82.

4. Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Естественные регуляторные Т-клетки и фактор FOXP3 // Иммунология. 2006. - №3 - С. 176. - 188.

5. Ahmadzadeh М., Rosenberg S.A. TGF-(31 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD 8 T cells //J. Immunol. 2005. - Vol. 174. - P. 5215 - 5223.

6. Asensio C., Zapata A., Garcia-Ahijado J., Gil В., Salvadores P., Schneider J. Fas expression is associated with a better prognosis in laryngeal squamos cell carcinoma // Anticancer Res. 2007. - Vol. 27. - P. 4083 - 4086.

7. Askenasy N., Kaminitz A., Yarkoni S. Mechanisms of T regulatory cell function // Autoimmunity Reviews. 2008. - Vol. 7. - P. 370 - 375.97

8. Baecher-Allan C., Wolf E., Hafler D.A. Functional analysis of highly defined, FACS-isolated populations of human regulatory CD4+CD25+ T cells // Clin. Immunol. 2005. - Vol. 115. - P. 10 - 18.

9. Baecher-Allan C., Wolf E., Hafler D.A. MHC class II expression identifies functionally distinct human regulatory T cells // J. Immunol. 2006. - Vol. 176.-P. 4622-4631.

10. Banchereau J., Palucka A.K. Dendritic cells as therapeutic vaccine against cancer // Nat. Rev. Immunol. 2005. - Vol. 5. - P. 296 - 306.

11. Becker C., Fantini M.C., Neurath M.F. TGF-beta as a T cell regulator in colitis and colon cancer // Cytokine & Growth Factor Reviews. 2006a. -Vol. 17.-P. 97- 106.

12. Becker C., Stoll S., Bopp T., Schmitt E., Jonuleit H. Regulatory T cells: present facts and future hopes // Med Microbiol Immunol. 2006b. - Vol. 195.-P. 113-124.

13. Belkaid Y., Blank R.B., Suffia I. Natural regulatory T cells and parasites: a common quest for host homeostasis // Immunol. Rev. 2006. - Vol. 212. -P. 287-300.

14. Ben-Barach A. The multifaceted roles of chemokines in malignancy // Cancer Metast. Rev. 2006. - Vol. 25. - P. 357 - 371.

15. Berndt U., Philipsen L., Bartsch S., Wiedenmann B., Baumgart D.C., Hammerle M., Sturm A. Systematic high-content proteomic analysis reveals substantial immunologic changes in colorectal cancer // Cancer. Res. 2008. - Vol. 68. - P. 880 - 888.

16. Beyer M., Schultze J.L. Regulatory T cells in cancer // Am. Soc. Hematol. -2006.-Vol. 108.-P. 804-811.

17. Block M.S., Markovic S.N. The tumor/immune interface: clinical evidence of cancer immunosurveillance, immunoediting and immunosubversion // Am. J. Immunol. 2009. - Vol. 5. - P. 29 - 49.

18. Bui J., Schreiber R.D. Cancer immunosurveillance, immunoediting and inflammation: independent or interdependent processes? // Curr. Opin. Immunol. 2007. - Vol. 19. - P. 203 - 208.

19. Bui J.D., Uppaluri R., Hsieh C.S., Schreiber R.D. Comparative analysis of regulatory and effector T cells in progressively growing versus rejecting tumors of similar origins // Cancer Res. 2006. - Vol. 66. - P. 7301 -7309.

20. Burnet M. Cancer: a biological approach. I. The process of control // Br. Med. J. 1957. - Vol. 1. - P. 779 - 786.

21. Cederbom L., Hall H., Ivars F. CD4+CD25+ regulatory T cells down-regulate co-stimulatory molecules on antigen-presenting cells // Eur. J. Immunol. 2000. - Vol. 30. - P. 1538 - 1543.

22. Chatila T.A. Role of regulatory T cells in human diseases // J. Allergy. Clin. Immunol. 2005. - Vol. 116. - P. 949 - 959.

23. Chen M.-L., Pittet M.J., Gorelik L., Flavell R.A., Weissleder R., Von Boehmer H., Khazaie K. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-p signals in vivo // PNAS. 2005. - Vol. 102.-P. 419-424.

24. Chen W., Jin W., Tian H., Sicurello P., Frank M., Orenstein J.M., Wahl S.M. Requirement for transforming growth factor pi in controlling T cell apoptosis // J. Exp. Med. 2001. - Vol. 194. - P. 439 - 453.

25. Chen W., Wahl S.M. TGF-P: the missing link in CD4+CD25+ regulatory T cell-mediated immunosuppression // Cytokine Growth Factor Rev. 2003. -Vol. 14.-P. 85-89.

26. Chen W.-J. Dendritic cells and CD4+CD25+ T regulatory cells: crosstalk between two professionals in immunity versus tolerance // Front. Biosc. -2006.-Vol. 11.-P. 1360-1370.

27. Chiao E.Y., Krown S.E. Update on non-aquired immunodeficiency syndrome-defining malignancies // Curr. Opin. Oncol. 2003. - Vol. 15. -P. 389-397.

28. Cho Y., Miyamoto M., Kato K., Fukunaga A., Shichinohe T., Kawarada Y., Hida Y., Oshikiri T., Kurokawa T., Suzuoki M., Nakakubo Y., Hiraoka K., Murakami S., Shinohara T., Itoh T., Okushiba S., Kondo S., Katoh H.

29. CD4+ and CD8+ T cells cooperate to improve prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma // Cancer Res. 2003. - Vol. 63. - P. 1555- 1559.

30. Crispin J. C., Martinez A., Alcocer-Varela J. Quantification of regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus // J. Autoimmun. -2003. Vol. 21. - P. 273 - 276.

31. Cua D.J., Kastelein R.A. TGF-|3, a "double agent" in the immune pathology war // Nat. Immunol. 2006. - Vol. 7. - P. 557 - 559.

32. Das S., Karim S., Datta Ray C., Maiti A.K., Ghosh S.K., Chaudhury K. Peripheral blood lymphocyte subpopulations in patients with cervical cancer // International Journal of Gynecology Obstetrics. 2007. - Vol. 98. -P. 143-146.

33. Davidson T.S., DiPaolo R.J., Andersson J., Shevach E.M. Cutting edge: IL-2 is essential for TGF-p-mediated induction of FOXP3+ T regulatory cells // J. Immunol. 2007. - Vol. 178. - P. 4022 - 4026.

34. De la Rosa M., Rutz S., Dorninger H., and Scheffold A. Interleukin 2 is essential for CD4+CD25+ regulatory T cell function // Eur. J. Immunol.2004. Vol. 34. - P.2480 - 2488.

35. Dieckmann D., Bruett C. H., Ploettner H., Lutz M. B., Schuler G. Human CD4+ CD25+regulatory interleukin 10-producing, contact-independent type 1-like regulatory T cells // J. Exp. Med. 2002. - Vol. 196. - P. 247 - 253.

36. Dunn G.P., Ikeda H., Bruce A.T., Koebel C., Uppaluri R., Bui J., Chan R., Diamond M., White J.M., Sheehan K., Schreiber R.D. Interferon-y and cancer immunoediting // Immunol. Res. 2005. - Vol. 32. - P. 231-245.

37. Dunn G.P., Old L.J., Schreiber R.D. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting // Immunity. 2004a. - Vol. 21. -P. 137-148.

38. Dunn G.P., Old L.J., Schreiber R.D. The three Es of cancer immunoediting // Ann. Rev. Immunol. 2004b. - Vol. 22. - P. 321 - 360.

39. Ehrenstein M.R., Evans J.G., Singh A., Moore S., Warnes G., Isenberg D.A., Mauri C. Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by anti-TNF-a therapy // J. Exp. Med. 2004. - Vol. 200. - P. 277 - 285.

40. Elliott R.L., Blobe G.C. Role of transforming growth factor beta in human cancer // J. Clin. Oncol. 2005. - Vol. 23. - P. 2078 - 2093.

41. Fahlen L., Read S., Gorelik L. et al. T cells that cannot respond to TGF-beta escape control by CD4+CD25+ regulatory T cells // J. Exp. Med.2005. Vol. 201. - P. 737 - 746.

42. Fallarino F., Grohmann U., Hwang K.W., Orabona C., Vacca C., Bianchi R., Belladonna M.L., Fioretti M.C., Alegre M.-L., Puccetti P. Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells // Nat. Immunol. 2003. -Vol. 4.-P. 1206-1212.

43. Fantini M.C., Becker C., Monteleone G., Pallone F., Galle P.R., Neurath M.F. Cutting edge: TGF-P induces a regulatory phenotype in CD4+CD25~ T cells through FOXP3 induction and down-regulation of Smad7 // J. Immunol. 2004. - Vol.172. - P. 5149 - 5153.

44. Fehervari Z., Sakaguchi S. A paragon of self-tolerance: CD25+CD4+ regulatory T cells and the control of immune responses // Arth. Res. Ther. — 2004.-Vol. 6. P. 19 - 25.

45. Fehervari Z., Sakaguchi S. CD4+ regulatory cells as a potential immunotherapy // Phil. Trans. R. Soc. B. 2005. - Vol. 360. - P. 1647 -1661.

46. Fontenot J.D., Rasmussen J.P., Williams L.M., Dooley J.L., Farr A.G., Rudensky A.Y. Regulatory T cells lineage specification by the forkhead transcription factor FOXP3 // Immunity. 2005. - Vol. 22. - P. 329 - 341.

47. Fox J.G., Wang T.C. Inflammation, atrophy, and gastric cancer // J. Clin. Invest. 2007. - Vol. 117. - P. 60 - 69.

48. Franzke A., Hunger J.K., Dittmar K.E.J., Ganser A., Buer J. Regulatory T-cells in the control of immunological diseases // Ann. Hematol. 2006. -Vol. 85.-P. 747-758.

49. Funada Y., Noguchi T., Kikuchi R., Takeno S., Uchida Y., Gabbert H E. Prognostic significance of CD8+ T cell and macrophage peritumoral infiltration in colorectal cancer // Oncol. Rep. 2003. - Vol. 10. - P. 309313.

50. Garcia-Lora A., Algarra I., Garrido F. MHC class I antigens, immune surveillance and tumor immune escape // J. Cell. Physiol. 2003. - Vol. 195.-P. 346-355.

51. Genestier L., Kasibhatla S., Brunner T., Green D.R. Transforming growth factor (31 inhibits Fas ligand expression and subsequent activation-inducedcell death in T cells via down regulation of c-Myc // J. Exp. Med. 1999. -Vol. 189.-P. 231-239.

52. Gondek D.C., Lu L.F., Quezada S.A., Sakaguchi S., Noelle R.J. Cutting edge: contact-mediated .suppression by CD4+CD25+ regulatory cells involves granzyme B-dependent, perforin-independent mechanism // J. Immunol. 2005. - Vol. 174. - P. 1783 - 1786.

53. Gorelik L., Flavell R.A. Transforming growth factor-(3 in T-cell biology // Nat. Rev. Immunol. 2002. - Vol. 2. - P. 46 - 53.

54. Grabenbauer G.G., Lahmer G., Distel L., Niedobitek G. Tumor-infiltrating cytotoxic T cells but not regulatory T cells predict outcome in anal squamous cell carcinoma // Clin. Cancer Res. 2006. - Vol. 12. - P. 3355- 3360.

55. Gregg R., Smith C.M., Clark F.J., Dunnion D., Khan N., Chakraverty R., Nayak L., Moss P.A. The number of human peripheral blood CD4+CD25hlgh regulatory T cells increases with age // Clin. Exp. Immunol.- 2005. Vol. 140. - P. 540 - 546.

56. Gri G., Piconese S., Frossi B., Manfroi V., Merluzzi S., Tripodo C., Viola A., Odom S., Rivera J., Colombo M.P., Pucillo C. CD4+CD25+ regulatory

57. T cells suppress mast cell degranulation and allergic responses through OX40-C)X40L interaction // Immunity. 2008. - Vol. 29. - P. 771 - 781.

58. Grossman W.J., Verbsky J.W., Barchet W., Colonna M., Atkinson J.P., Ley TJ. Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous target cell death // Immunity. 2004. - Vol. 21. - P. 589 - 601.

59. Hirahara K., Liu L., Clark R.A., Yamanaka K.-I., Fuhlbrigge R.C., Kupper T.S. The majority of human peripheral blood CD4+CD25highFOXP3+ regulatory T cells bear functional skin-homing receptors // J. Immunol. — 2006. Vol. 177. - P. 4488 - 4494.

60. Hiraoka N., Onozato K., Kosuge T., Hirohashi S. Prevalence of FOXP3+ regulatory T cells increases during the progression of pancreatic ductal adenocarcinoma and it's premalignant lesions // Clin. Cancer Res. 2006. -Vol. 12.-P. 5423-5434.

61. Hobeika A.C., Doldo T., Clay T.M., Lyerly H. K., Morse M.A. Regulatory and effector T cell subsets in colon cancer // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 2004. - Vol.45. - P. 532 - 541.

62. Holm L.T., Nielsen J., Claesson H.M. CD4+CD25+ regulatory T cells: phenotype and physiology // APMIS. 2004. - Vol. 112. - P. 629 - 641.

63. Hori S., Nomura T., Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor FOXP3 // Science. 2003. - Vol. 299. - P. 1057 -1061.

64. Ishida T., Ishii T., Inagaki A., Yano H., Komatsu H., Iida S., InagakiH., Ueda R. Specific recruitment of CC chemokine receptor 4-positive regulatory T cells in Hodgkin lymphoma fosters immune privilege // Cancer Res. 2006. - Vol. 66. - P.5716 - 5722.

65. Ito M., Minamiya Y., Kawai H., Saito S., Saito H., Nakagawa T., Imai K., Hirokawa M., Ogawa J. Tumor-derived TGFp-1 induces dendritic cell apoptosis in the sentinel lymph node // J. Immunol. 2006. - Vol. 176. - P. 5637 - 5643.

66. Jonuleit H., Schmitt E., Kakirman H., Stassen M., Knop J., Enk A. H. Infectious tolerance: human CD25+ regulatory T cells convey suppressor activity to conventional CD4+ T helper cells // J. Exp. Med. 2002. -Vol.196. -P. 255-260.

67. Jonuleit H., Schmitt E., Stassen M., Tuettenberg A., Knop J., Enk A.H. Identification and functional characterization of human CD4+CD25+ T-cells with regulatory properties isolated from peripheral blood // J. Exp. Med. -2001. Vol. 193.-P.1285- 1294.

68. Kaminska B., Wesolowska A., Danilkiewcz M. TGF beta signaling and its role in tumour pathogenesis // Acta Biochimica Polonica. 2005. - Vol. 52.-P. 329-337.

69. Kearley J., Barker J.E., Robinson D.S., Lloyd C.M. Resolution of airway inflammation and hyperreactivity after in vivo transfer of CD4+CD25+ regulatory T cells is interleukin 10 dependent // J. Exp. Med. 2005. - Vol. 202.-P. 1539-1547.

70. Kim R., Emi M., Tanabe K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape // Immunology. 2007. — Vol. 121. - P. 1 — 14.

71. Knutson K.L., Disis M.L., Salazar L.G. CD4 regulatory T cells in human cancer pathogenesis // Cancer Immunol. Immunother. 2007. - Vol. 56. -P. 271 -285.

72. Kobayashi N., Hiraoka N., Yamagami W. Ojima H., Kanai Y., Kosuge T., Nakajima A., Hirohashi S. FOXP3+ regulatory T cells affect the development and progression of hepatocarcinogenesis // Clin. Cancer Res. -2007.-Vol. 13.-P. 902-911.

73. Koizumi K., Hojo S., Akashi T., Yasumoto K., Saiki I. Chemokine receptors in cancer metastases and cancer cell-derived chemokines in host immune response // Cancer Sci. 2007. - Vol. 98. - P. 1652 - 1658.

74. Kriegel M.A., Lohmann T., Cristoph G., Blank N., Kalden J., Lorenz H.-M. Defective suppressor function of human CD4+CD25+ regulatory T cells in autoimmune polyglandular syndrome type II // J. Exp. Med. 2004. -Vol. 199.-P. 1285-1291.

75. Kusmartsev S., Gabrilovich D. Role of immature myeloid cells in mechanisms of immune evasion in cancer // Cancer Immunol. Immunother. 2006. - Vol. 55. - P. 237 - 245.

76. Kuss I., Hattaway B., Ferris R.L., Gooding W., Whiteside T.L. Decreased absolute counts of T lymphocyte subsets and their relation to disease in squamous cell carcinoma of the head and neck // Clin. Cancer Res. — 2004. -Vol. 10.-P. 3755-3762.

77. Le N.T., Chao N. Regulating regulatory T cells // Bone Marrow Transplantation. 2007. - Vol. 39. - P. 1 - 9.

78. Lee J.-C., Lee K.-M., Kim D.-W., Heo D.S. Elevated TGF-pl secretion and down-modulation of NKG2D underlies impaired NK cytotoxicity in cancer patients // J. Immunol. 2004. - Vol. 172. - P. 7335 - 7340.

79. Lee W.-J., Chang K.-J., Lee C.-S., Chen K.-M. Selective depression of T-lymphocyte subsets in gastric cancer patients: an implication of immunotherapy // J. Surg. Oncol. 2006. - Vol. 55. - P. 165 - 169.

80. Lerma E., Romero M., Gallardo A., Pons C., Munoz J., Fuentes J., Lloveras B., Catasus L., Prat J. Prognostic significance of the Fasreceptor/Fas-ligand system in cervical squamous cell carcinoma // Virchows Arch. -2008. Vol. 452. - P. 65 - 74.

81. Levings M.K., Roncarolo M.G. Phenotypic and functional differences between human CD4+CD25+ and type 1 regulatory T cells // CTMI. 2005. -Vol. 293.-P. 303-326.

82. Levy L., Hill C.S. Alterations in components of the TGF-(3 superfamily signaling pathways in human cancer // Cytokine Growth Factor Rev.2006.-Vol. 17.-P. 41-58.

83. Li M.O., Wan Y.Y., Sanjabi S., Robertson A.-K. L., Flavell R.A. Transforming growth factor-3 regulation of immune responses // Annu. Rev. Immunol. 2006. - Vol. 24. - P. 99-146.

84. Lim H.W., Hillsamer P., Banham A.H., Kim C.H. Cutting edge: direct suppression of B cells by CD4+CD25+ regulatory T cells // J. Immunol. -2005.-Vol. 175.-P. 4180-4183.

85. I.Lin W.-W., Karin M. A cytokine-mediated link between innate immunity, inflammation and cancer // J. Clin. Invest. 2007. - Vol. 117. - P. 1175 -1183.

86. Liu L., Yao J., Ding Q., Huang S. CD4+CD25high regulatory cells in peripheral blood of NSCLC patients // Journal of Huazhong University of Science and Technology. 2006a. - Vol. 26. - P. 548 - 551.

87. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2"AACt method // Methods. 2001. - Vol. 25. - P. 402 - 408.

88. Longhi M.S., Ma Y., Bogdanos D.P., Cheeseman P., Mieli-Vergani G., Vergani D. Impairment of CD4+CD25+ regulatory T-cells in autoimmune liver disease // J. Hepatol. 2004. - Vol. 41. - P. 31 - 37.

89. Longhi M.S., Ma Y., Mitry R.R., Bogdanos D.P., Heneghan M., Cheeseman P., Mieli-Vergani G., Vergani D. Effect of CD4+CD25+ regulatory T-cells on CD8 T-cell function in patients with autoimmune hepatitis // J. Autoimmun. 2005. - Vol. 25. - P. 63 - 71.

90. Loskog A., Ninalga C., Paul-Wetterberg G., de la Torre M., Malmstrom P.-U., Totterman T. Human bladder carcinoma is dominated by T-regulatory cells and Thl inhibitory cytokines // 2007. Vol. 177. - P. 353 - 358.

91. Lu H., Ouyang W., Huang C. Inflammation, a key event in cancer development // Mol. Cancer Res. 2006. - Vol. 4. - P. 221 - 233.

92. Marshall N. A., Christie L. E., Munro L. R., Culligan D. J., Johnston P. W., Barker R. N., Vickers M. A. Immunosuppressive regulatory T cells are abundant in the reactive lymphocytes of Hodgkin lymphoma // Blood. -2004. Vol. 103. - P. 1755 - 1762.

93. McKarns S.C., Schwartz R.H. Distinct effects of TGF-pl on CD4+ and CD8+ T cell survival, division, and IL-2 production: a role for T cell intrinsic Smad3 // J. Immunol. 2005. - Vol. 174. - P. 2071 - 2083.

94. Mellor A. L., Munn D. H. IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism // Nat. Rev. Immunol. 2004. - Vol.4. - P.762 -774.

95. Miller A.M., Lundberg K., Ozenci V., Banham A.H., Hellstrom M., Egevad L, Pisa P. CD4+CD25high T cells are enriched in the tumor and peripheral blood of prostate cancer patients // J. Immunol. 2006. - Vol. 177.-P. 7398-7405.

96. Miyara M., Sakaguchi S. Natural regulatory T cells: mechanisms of suppression // Trends Mol. Med. 2007. - Vol. 13. - P. 108 - 116.

97. Munn D. H., Sharma M. D., Mellor A. L. Ligation of B7-1/B7-2 by human CD4(+) T cells triggers indolamine 2,3-dioxygenase activity in dendritic cells // J. Immunol. 2004. - Vol. 172. - P. 4100 - 4110.

98. Nakamura K., Kitani A., Fuss I., Pedersen A., Harada N., Nawata H., Strober W. TGF-pl plays an important role in the mechanism of CD4+CD25+ regulatory T cell activity in both humans and mice // J. Immunol. 2004. - Vol. 172. - P. 834 - 842.

99. Nakamura K., Kitani A., Strober W. Cell contact-dependent immunosuppression by CD4+CD25+ regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor-p // J. Exp. Med. 2001. Vol. 194.-P. 629-644.

100. Nixon D.F., Aandahl E.M., Michaelsson J. CD4+CD25+ regulatory T cells in HIV infection // Microbes. Infect. 2005. - Vol. 7. - P. 4272 - 4276.

101. Parmiani G., Filippo A., Novellino L., Castelli C. Unique human tumor antigens: immunobiology and use in clinical trials // J. Immunol. 2007. -Vol. 178.-P. 1975-1979.

102. Paust S., Lu L., McCarty N., Cantor H. Engagement of B7 on effector T cells by regulatory T cells prevent autoimmune disease // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-2004.-Vol. 101.-P. 10398- 10403.

103. MO.Perrot I., Blanchard D., Freymond N., Isaak S., Guibert B., Pacheco Y., Lebecque S. Dendritic cells infiltrating human non-small cell lung cancer are blocked at immature stage // J. Immunol. 2007. - Vol. 178. - P. 2763- 2769.

104. Petersen R.P., Campa M.J., Sperlazza J., Conlon D., Joshi M.-B., Harpole D.H., Patz E.F. Tumor infiltrating FOXP34" regulatory T-cells are associated with recurrence in pathologic stage I NSCLC patients // Cancer.- 2006. Vol. 107. - P. 2866 - 2872.

105. Picirillo C.A., Shevach E.M. Cutting edge: control of CD8+ T cell activation by CD4+CD25+ immunoregulatory cells // J. Immunol. 2001. -Vol. 167.-P. 1137-1140.

106. Qin H.Y., Mukherjee R., Lee-Chan E., Ewen C., Bleackley R.C., Singh B. A novel mechanism of regulatory T cell-mediated down-regulation of autoimmunity // Int. Immunol. 2006. - Vol. 18. - P. 1001 - 1015.

107. Rabinovich G.A., Gabrilovich D., Sotomayor E.M. Immunosuppressive strategies that are mediated by tumor cells // Annu. Rev. Immunol. 2007. -Vol. 25.-P. 267-296.

108. Rao P.E., Petrone A.L., Ponath P.D. Differentiation and expansion of T cells with regulatory function from human peripheral lymphocytes by stimulation in the presence of TGF-P // J. Immunol. 2005. - Vol. 174. -P. 1446-1455.

109. Ruffini E., Asioli S., Filosso P.L., Lyberis P., Bruna M.C., Macri L., Daniele L., Oliaro A. Clinical significance of tumor-infiltrating lymphocytes in lung neoplasms // Ann. Thorac. Surg. 2009. - Vol. 87. -P. 365-372.

110. Salavoura K., Kolialexi A., Tsangaris G., Mavrou A. Development of cancer in patients with primary immunodeficiencies // Anticancer Res. -2008. Vol. 28. - P. 1263 - 1269.

111. Salazar-Onfray F., Lopez M., Mendoza-Naranjo A. Paradoxical effects of cytokines in tumor immune surveillance and tumor immune escape // Cytokine Growth Factor Rev. 2007. - Vol. 18. - P. 171 - 182.

112. Sasaki Y., Sakai M., Miyazaki S., Higuma S., Shiozaki A., Saito S. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases // Mol. Hum. Reprod. -2004. Vol. 10. - P. 347 - 353.

113. Schreiber T.H. The use of FOXP3 as a biomarker and prognostic factor for malignant human tumors // Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 2007. -Vol. 16.-P. 1931 -1934.

114. Schuster N., Krieglstein K. Mechanisms of TGF- (3-mediated apoptosis // Cell Tissue Res. 2002. - Vol. 307. - P. 1 - 14.

115. Sengupta N. MacFie T., MacDonald T.T., Pennington D., Silver A.R. Cancer immunoediting and "spontaneous" tumor regression // Pathol. Res. Pract. 2010. - Vol. 206. - P. 1 - 8.

116. Smyth M.J., Dunn G.P., Schreiber R.D. Cancer immunosurveillance and immunoediting: the roles of immunity in suppressing tumor development and shaping tumor immunogenicity // Adv. Immunol. 2006a. - Vol. 90. -P. 1 - 50.

117. Smyth M.J., Teng M.W.L., Swann J., Kyparissoudis K., Godfrey D.I., Hayakawa Y. CD4+CD25+ T regulatory cells suppress NK cell-mediated immunotherapy of cancer // J. Immunol. 2006b. - Vol. 176. - P. 1582 -1587.

118. Spano J.P., Costagliola D., Katlama C., Mounier N., Oksenhendler E., Khayat D. AIDS-related malignancies: state of the art and therapeutic challenges / J. Clin. Oncol. 2008. - Vol. 26. - P. 4834 - 4842.

119. Strauss L., Bergmann C., Whiteside T.L. Functional and phenotypical characteristics of CD4+CD25highFOXP3+ Treg clones obtained from peripheral blood of patients with cancer // Int. J. Cancer. — 2007b. Vol. 121.-P. 2473 - 2483.

120. Suri-Payer E., Cantor H. Differential cytokine requirements for regulation of autoimmune gastritis and colitis by CD4+CD25+ T cells // J. Autoimmun. 2001. - Vol. 16. - P. 115 - 123.

121. Swann J.B., Smyth M.J. Immune surveillance of tumors // J. Clin. Invest. -2007. Vol. 117. - P. 1137 - 1146.

122. Tachibana T., Onodera H., Tsuruyama T., Mori A., Nagayama S., Hiai H., Imamura M. Increased intratumor Va24-positive natural killer T cells: a prognostic factor for primary colorectal carcinomas // Clin. Cancer Res. -2005. Vol. 11. - P. 7322 - 7327.

123. Takahashi T., Tagami T., Yamazaki S., Uede T., Shimizu J., Sakaguchi N., Mak T. W., Sakaguchi S. Immunologic self-tolerance maintained by CD4+CD25+ regulatory T-cells constitutively expressing CTLA-4 // J. Exp. Med.-2000.-Vol.192.-P. 303-310.

124. Tang Q., Bluestone J. A. The FOXP3+regulatory T cell: a jack of all trades, master of regulation // Nat. Immunol. 2008. - Vol. 9. - P. 239 - 244.

125. Teicher B.A. Transforming growth factor-(3 and the immune response to malignant disease // Clin. Cancer Res. 2007. - Vol. 13. - P. 6247 - 6251.

126. Thomas D.A., Massague J. TGF-J3 directly targets cytotoxic T cell functions during tumor evasion of immune surveillance // Cancer Cell. -2005.-Vol. 8.-P. 369-380.

127. Thomas L. Reactions of homologous tissue antigens in relation to hypersensitivity // Cellular and Humoral aspects of the hypersensitive states. H.S. Lawrence, editor. Hoeber-Harper. 1959. - New York, USA. P. 529-532.

128. Tomsova M., Melichar B., Sedlakova I., Steiner I. Prognostic significance of CD3+ tumor-infiltrating lymphocytes in ovarian carcinoma //Gynecologic Oncology. 2008. - Vol. 108. - P. 415 - 420.

129. Viglietta V., Baecher-Allan C., Weiner H.L., Hafler D.A. Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis // J. Exp. Med. 2004. - Vol. 199. - P. 971 - 979.

130. Visser K.E., Eichten A, Coussens L.M. Paradoxical roles of the immune system during cancer development // Nat. Rev. Cancer. 2006. - Vol. 6. -P. 24- 40.

131. Von Boehmer H. Mechanisms of suppression by suppressor T cells // Nat. Immunol. 2005. - Vol. 6. - P. 338 - 344.

132. Wan Y.Y., Flavell R.A. Regulatory T cells, transforming growth factor-|3, and immune suppression // Proc. Am. Thorac. Soc. 2007. - Vol. 4. - P. 271 -276.

133. Wang J., Ioan-Facsinay A., van der Voort E.I., Huizinga T.W., Toes R.E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells // Eur. J. Immunol. 2007. - Vol. 37. - P. 129 - 138.

134. Wang R.-F. Regulatory T cells and innate immune regulation in tumor immunity // Springer Semin. Immun. 2006. - Vol. 28. - P. 17 - 23.

135. Weaver C.T., Harrington L.E., Mangan P.R., Gavrieli M., Murphy K.M. Thl7: an effector CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties // Immunity. 2006. - Vol. 24. - P. 677-688.

136. Wei S., Kryczek I., Zou W. Regulatory T-cell compartmentalization and trafficking // Blood. 2006. - Vol. 108. - P. 426 - 431.

137. Whiteside T.L. Immune suppression in cancer: effects on immune cells, mechanisms and future therapeutic intervention // Seminars in Cancer Biology. 2006. - Vol. 16. - P. 3 - 15.

138. Wilson M.S., Taylor M.D., Balic A., Finney C.A.M., Lamb J.R., Maizels R.M. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells // J. Exp. Med. 2005. - Vol. 202. - P. 1199 - 1212.

139. Woo E.Y. Yeh H., Chu C.S., Schlienger K., Caroll R.G., Riley J.L., Kaiser L.R., June C.H. Regulatory T cells from lung cancer patients directly inhibit autologous T cell proliferation // J. Immunol. 2002. - Vol. 168. -P. 4272-4276.

140. Wylie F. Immunoediting: elimination, equilibrium and escape // Australian Life Scientist. 2008. - Vol. 5. - P. 26 - 28.

141. Yakirevich E., Resnick M.B. Regulatory T Lymphocytes: pivotal components of the host antitumor response // J. Clin. Oncol. 2007. - Vol. 25.-P. 2506-2508.

142. Yamagiwa S., Gray J.D., Hashimoto S., Horwitz D.A. A role for TGF-(3 in the generation and expansion of CD4+CD25+ regulatory T cells from human peripheral blood // J. Immunol. 2001. - Vol. 166. - P. 7282 -7289.

143. Yang W.F., Yu J.M., Zou W.S., Wang S.Z. Expression of CD80, CD86, TGF-betal and IL-10 mRNA in the esophageal carcinoma // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2006a. - Vol. 28. - P. 762 - 765.

144. Yang X., Lu P., Fujii C., Nakamoto Y., Gao J.L., Kaneko S., Murphy P.M., Mukaida N. Essential contribution of a chemokine, CCL3 and its receptor, CCR1, to hepatocellular carcinoma progression // Int. J. Cancer. 2006b. -Vol. 118.-P. 1869-1876.

145. Yang Z. Z., Novak A. J., Stenson M. J., Witzig T. E., Ansell S. M. Intratumoral CD4+CD25+ regulatory T-cell-mediated suppression of infiltrating CD4+ T-cells in B-cell non-Hodgkin lymphoma // Blood. -2006c. Vol. 107. - P. 3639 - 3646.

146. Yi H., Zhen Y., Jiang L., Zheng J., Zhao Y. The Phenotypic characterization of naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells // Cell. Mol. Immunol. 2006. - Vol. 3. - P. 189 - 195.

147. Yu J., Zhang L. Apoptosis in human cancer cells // Curr. Opin. Oncol. -2004.-Vol. 16.-P. 19-24.

148. Yu P., Fu Y.-X. Tumor-infiltrating T lymphocytes: friends or foes? // Lab. Invest. 2006. - Vol. 86. - P. 231 - 245.

149. Zhang L., Yi H., Xia X-P., Zhao Y. Transforming growth factor-beta: an important role in CD4+CD25+ regulatory T cells and immune tolerance // Autoimmunity. 2006. - Vol. 39. - P. 269 - 276.

150. Zhao D.M., Thornton A.M., Dipaolo R.J., Shevach E.M. Activated CD4+CD25+ T cells selectively kill B-lymphocytes // Blood. 2006. Vol. 107.-P. 3925-3932.

151. Zheng S. G., Gray J. D„ Ohtsuka K., Yamagiwa S., Horwitz D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from

152. CD4+CD25~ precursors // J. Immunol. 2002. - Vol. 169. - P. 4183 -4189.

153. Zheng S.G., Wang J., Wang P., Gray D.J., Horwitz D.A. IL-2 is essential for TGF-beta to convert naive CD4+CD25 cells to CD25+FOXP3+ regulatory T cells and for expansion of these cells // J. Immunol. 2007. -Vol. 178.-P. 2018-2027.

154. Zheng S.G., Wang J.H., Stohl W„ Kim K.S., Gray J.D., Horwitz D.A. TGF-p requires CTLA-4 early after T cell activation to induce FOXP3 and generate adaptive CD4+CD25+ regulatory cells // J. Immunol. 2006. -Vol. 176.-P. 3321-3329.

155. Zitvogel L., Tesniere A., Kroemer G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion // Nat. Rev. Immunol. 2006. -Vol. 6.-P. 715-727.

156. Zou W. Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance // Cancer. 2005. - Vol. 5. - P. 263 - 274.

157. Zou W. Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy // Nat. Rev. Immunol. 2006. - Vol. 6. - P. 295 - 307.

Информация о работе

Чуров, Алексей Викторович
кандидата биологических наук
Петрозаводск, 2010
ВАК 03.03.01

Диссертация

Регуляторные Т-клетки и трансформирующий фактор роста-β при опухолевом росте - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Регуляторные Т-клетки и трансформирующий фактор роста-β при опухолевом росте ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные Т-клетки и трансформирующий фактор роста-β при опухолевом росте"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чуров, Алексей Викторович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляторные Т-клетки и трансформирующий фактор роста-β при опухолевом росте"

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Чуров, Алексей Викторович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чуров, Алексей Викторович, Петрозаводск

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляторные Т-клетки и трансформирующий фактор роста-β при опухолевом росте
ВАК РФ 03.03.01, Физиология