Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕАЛИЗАЦИЯ МОРФОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА ГИПОКОТИЛЕЙ ГРЕЧИХИ КУЛЬТУРНОЙ FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ IN VITRO

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "РЕАЛИЗАЦИЯ МОРФОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА ГИПОКОТИЛЕЙ ГРЕЧИХИ КУЛЬТУРНОЙ FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ IN VITRO"



На правах рукописи

ГУМЕРОВА ЕЛЕНА АЗАТОВНА

РЕАЛИЗАЦИЯ МОРФОГЕ ИНОГО ПОТЕНЦИАЛА ГИП ОКОТ ИЛЕЙ ГРЕЧИХИ КУЛЬТУРНОЙ РАСОРтиМ ЕзсиьЕгггиммотсн. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ /Л' УПКО

03,00.12 - физиологи« и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 2004

Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики культивируемых клеток Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель

кандидат биологических наук Н. И. Румянцева

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Н. Н. Круглова

кандидат биологических наук И, А. Ларская

Ведущая организация

Казанский государственный университет им В. И. Ульянова-Ленина

Защита состоится "„Ц." января Г" 4 года в Ц?.00 час,

на заседании диссертационного совета К .,005,01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук t v казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН (420111, г. Казань, а/я ЗС, \ ... оачевского, 2/31)

С диссертацией можно ознакомиться 1 . игральной библиотеке Казанского научного центра РАН

Автореферат разослан" 3

.4

абря 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А. Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Методы культуры клеток и тканей широко используются „как .для, проведения фундаментальных исследований, так и для решения практических задач. Успехи применения большинства методов in vitro связаны, главным образом, с возможностью регенерации растений. Существуют три основных пути регенерации растений in vitro - эмбриокулътура, соматический эмбриогенез и органогенез. Однако способов регенерации растений гораздо больше - в зависимости от выбора экспланта, условий культивирования и подхода к поставленной задаче. Можно проводить регенерацию растений, индуцируя к развитию апикальные, пазушные или адвентивные почки, микроклубнями, используя каллусные и суспензионные культуры, культивируя пыльники и семяпочки, применяя методы выделения и культивирования протопластов.

Культивируемые клетки и ткани растений являются пластичной системой, обладающей способностью изменять скорость пролиферации, интенсивность метаболизма, процессы дифференцировки в результате определенных химических и физических воздействий. Это свойство дает возможность подбора условий для максимальной реализации морфогенного потенциала культивируемого объекта.

Известные для гречихи культурной Fagopyrum escxdentum способы регенерации осуществляются а основном через стадию каллусообразования и зачастую многократного пассирования каллусной культуры (Lachmann, 1991; Нао et al., 1993; Woo et al., 2000). Такой способ регенерации растений занимает много времени и не всегда имеет высокую эффективность в отношении как количественного выхода регенератов, так и их генетическое однородности. Использование же в качестве зксплантов незрелых тканей или частей взрослых растений ставит опыты в зависимость от сезона. Поэтому разработка быстрых и эффективных способов регенерации растений из обладающих высоким морфогенным потенциалом, легкодоступных, асептически выращиваемых тканей является необходимым этапом для развития биотехнологии гречихи.

Цель настоящей работы заключалась в изучении морфогенетической способности тканей гипокотилей проростков гречихи культурной при различных способах регенерации растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способ регенерации растений из протопластов, выделенных из . гнпокотилей проростков гречихи культурной.

2, Провести сравнительную оценку эффективности (выход, жизнеспособность и регенерационная активность протопластов) отечественных ферментных препаратов, разработанных в институте биохимии им, А. Н. Баха, и коммерческих препаратов импортного производства при выделении протопластов из тканей гипокотилей гречихи культурной. |

3. Разработать способ регенерата и растений гречихи культурной из тканей гипокотилей 4-5-дневных проростков,

4. Изучить действие различных факторов на образование проэмбриогенных клеточных комплексов в тканях гипокотилей гречихи и их регенерационный потенциал.

5. Провести гистологическое исследование процесса образование проэмбриогенных клеточных комплексов.

6. Провести цитогепетический анализ растений-регенерантов, полученных путем соматического эмбриогенеза и геммогенеза.

7. Провести сравнительный анализ спектров растворимых белков у линий растений-регенерантов.

Научная новизна работы. Установлена высокая эффективность отечественных ферментных препаратов, предоставленных институтом биохимии им. А. Н. Баха, по сравнению с коммерческими ферментными препаратами импортного производства при выделении и культивировании протопластов из разных тканей гречихи. Впервые получены феногапически нормальные растения при регенерации растений из протопластов гречихи; время, необходимое для их получения, было сокращено в 2 раза по сравнению с результатом Адачи с сотр. (Adaehi et at., 1989). Впервые разработан способ регенерации растений гречихи культурной через соматический эмбриогенез из гипокотилей 4-5-дневных проростков, который позволяет в сжатые сроки (в течение 2 мес.) получить высокий выход генетически однородных растений. Впервые показана возможность регенерации растений у гречихи через стадию формирования ПЭКК (проэмбриогенных клеточных комплексов) из прокамбиальных клеток обкладки сосудистых пучков.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные представляют интерес для специалистов, изучающих процессы деднфференциацин, дифференциации и морфогенеза в растительных клепках и тканях. Разработанные нами методы регенерации могут найти применение в области биотехнологии и генетики для интенсификации процесса селекции гречихи. Экспериментальный материал может быть использован для чтения лекций по курсу "Биотехнология растений".

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Международном симпозиуме "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), IV Международном симпозиуме по гречихе (Орел, 1989), III Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки" (Казань, 1990), II съезде ВОФР (Минск, 1990), VII Международном симпозиуме по протопластам "Progress in Plant Protoplast Research" (Швеция, 1991), итоговой научной конференции Казанского научного центра РАН (1990), II Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1996), X конгрессе FESSP "From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach" (Италия,

1996), VIII Международной конференции эмбриологов растений (Польша, 1997), И (X) съезде Русского ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков" (Санкт-Петербург, 1998), VII Международном симпозиуме по гречихе "Advances in Buckwheat Research" (Канада, 1998), II Международном симпозиуме по биотехнологии (Украина, 1998), Ш Международном симпозиуме "Recent Advances in Plant Biotechnology" (Словакия, 1999), IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), VIII Международном симпозиуме по гречихе "Advances in Buckwheat Research" (Корея, 2001), 17 Международной конференции по регуляторам роста растений (Чехия, 2001), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), Международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), VIII Международной конференции «Биология растительной клетки in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003), V Международном симпозиуме "Recent advances in Plant Biotechnology" (Словакия, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ.

. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, изложения результатов работы к их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 32 рисунка. Список использованной литературы включает 359 источников, в том числе 295 • иностранных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследований была выбрана гречиха культурная, Fagopyrum esculentum Moench., сорта Казанская крупнозерная.

Для получения проростков семена стерилизовали 10 мин в 7% растворе NaOCl, трижды промывали стерильной дистиллированной водой, высаживали в чашки Петри на раствор 1 мМ СаС!у2НгО, дополненный 0,8% агаром, и проращивали в темноте в термостате при 2S-26°C.

Выделение я культивирование протопластов н регенерация m нщ растений. В качестве источника протопластов использовали: гипокотили 6-дневных этиолированных, асептически выращенных растений; рыхлый, пассируемый через 25-30 суток каллус, полученный из незрелых зародышей; первые настоящие листья стерильно выращенных растений (5000 лк) в условиях 16/8 (свет/гемнота) часового фотопериода.

Протопласты выделяли на среде CPW 13М (Power, Chapman, 1985), используя ферментные препараты: коммерческие - Cellulase Onozuka R-10 ("Yacult Pharmaceutical Industry Co.", Япония), Macerozyme R-10 ("Yacult Honsha Co.", Япония), Driselase ("Sigma",

США) - и отечественные - Целлюлазу (продуцент - Trichoderma viride) и Пекгиназу (продуцент - Aspergillus foelidus), предоставленные Институтом биохимии им, А, Н, Баха РАН. Оценку жизнеспособности протопластов проводили с помощью окраски эозином G (0,1%) в среде CPW 14М. Очистку проводили методом флотации в среде CPW 2IS (Power, Chapman, 1985), Протопласты культивировали на среде SVS (Сидоров и др., 1985). Регенерацию растений из протопластов осуществляли на среде Bj (Gamborg, 1968) с 0,175мг/лИУК,2,23 мг/лБАП.

Регенерация растений через соматический эибрчогени и геммргеиед из тканей гноокотнлей

Эксплангами служили разрезанные вдоль пополам отрезки гипокотилей длиной 0,6-0,7 см 4-5-дневных этиолированных проростков.

Эксгстанш инкубировали на питательных средах В5 и а некоторых случаях - MS (Murashige, Skoog, 1962). Твердые среды дополняли 0,8% агаром. При культивировании на твердых средах зкепланга ориентировали срезом вниз. В случае использования жидких сред экепланты (по 20, 40 шт. в колбе в зависимости от условий опыта) культивировали в конических колбах (100 мл) в 20 мл среды на качалке при 130 об/мик в темноте и на свету (5 ООО лк).

Приаципиальная схема экспериментов

Среда I

Среден —Средя -

регенеряанн

Условия культивирования

: Безгормональная ; среда

1

Гормоны 2.4-Д • 4,0-JS,0 мг/л | 2,4-Д 0,0-2,0 мг/л ИУК-0,175 мг/л БАП - 2ДЗ мг/л -

Фшчсское СОСТОЯ ВВС срады жидкая, j Твердя* жидкая, тверда* жидкая, твердая жидкая, твердая

Сия рам 30 или 100 г/л : 30 иди 100 г/л 30 или 100 т/я 30 г/а

Время кудътпвя-ромвня, 1 ыркяят, яи» 40 1 - 30 до появлеки» морфогекетмчссхого отклика

Время культавя-ровяяяя, 2 мряавт, див 7-14 : 30 30 до появления морфогенегического отклика

При проведении экспериментов в среды культивирования добавляли гормоны: Среда I - 2,4-Д (6,0-15,0 мг/л); Среда II - 2,4-Д (0,0-2,0 мг/л);

Среда регенерации - ИУК-0,175 мг/л и БАЛ - 2,23 мг/л.

Во время культивирования эксплантов на среде I или на среде II на эксплантах появлялись проэмбриогенные клеточные комплексы (ПЭКК). После этого их переносили на среду регенерации на срок до 3-х недель, а затем - на без гормональную среду. К концу культивирования на среде регенерации или в начале культивирования на безгормональной среде наблюдали образование соматических зародышей и почек. На безгормональной среде зародыши и почки прорастали, развиваясь в растеиия-регенеранты, которые в дальнейшем размножали микрочеренкованием па безгормональной среде.

Онтогенетический анализ. Для цитогелогического анализа использовали кончики корешков растешш-рсгенерантов. Ко1гтролем служили корешки двухдневных проростков, выращенных in viVo и in vitro. Кончики корешков выдерживали в 0,03% растворе колхицина (2-3 часа) или в насыщенном растворе 8-оксихинолина (3-4 часа). Для фиксации использовали уксусный алкоголь (этиловый спирт:уксусная кислота - 1:3), после чего проводили окраску пропионовым орсеином (36 часов) и готовили давленые препараты (Паушева, 1988), Для получения достоверных данных подсчет числа хромосом проводился не менее чем в 30 мегафазкых пластинках (Стрельчук, 1984), Сравнение выборочных долеИ проводиди при 5% уровне значимости. Посте подсчет хромосом в метафазных пластинках проводили распределение клепж по классам плоидносги.

Препараты, предназначенные для учета аберраций, готовили аналогичным способом, исключая предобработку корешков в колхицине и 8-оксихшюлине. Применяли анафаэно-телофазный метод учета аберраций.

Приготовление гистологических препаратов проводили по стандартной методике (Киясов, 1998). Срезы окрашивали гематоксилин-эозином (Меркулов, 1961). Фотографирование препаратов производилось на микроскопе "Jenamed" (Германия) с помощью фотоприставки "Reichert" (Австрия).

Для биохимического анализа растений-реге нерантов использовали зеленые части регенерантов и контрольных растений, выращенных in vitro. После удаления пигментов водорастворимые белки экстрагировали 0,025 мМ трисглици новым (Tricin) буфером. Содержание белка в экстракте определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976), Полученные белки подвергали осаждению трихлоруксусной кислотой.

Одномерный электрофорез бел коз с ДДС-Na проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1978) в градиентном (6-16%) полиакриламидном геле (ПААГ). Гели окрашивали 0,1% раствором Кумасси G-250. Полученные электрофореграммы белков сканировали и

обрабатывали с помощью статистических программ "Scion Image" и "Mathcad 2000 Professional" (www.srioncorp.com).

В каждом варианте опыта использовали не менее 120 эксплантов. Все опыты проводились не менее чем в трех биологических повторностях. В некоторых таблицах приводятся данные наиболее характерного опыта.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1, Регенерация растений через протопласты

Большое влияние на выход протопластов, их жизнеспособность и ре генерационную активность оказывают выбор ферментных препаратов и их концентрация. Опыты показали, что эффективность выделения протопластов при использовании отечественных ферментных препаратов в концентрациях 0,J6% сопоставима с эффективностью выделения протопластов коммерческими препаратами, применяемыми в значительно более высоких концентрациях (табл. 1; табл. 2, варианты I, II). Следует отметить, однако, что в случае использования коммерческих ферментов при почти одинаковом общем выходе протопластов из тканей гипокотилей количество жизнеспособных протопластов было гораздо выше.

Влияние композиции, составленной из различных ферментных препаратов, на эффективность выделения протопластов хорошо видно по данным, представленным в таблице 2. Так, удаление из раствора ферментов препарата "Drtselase" (композиция II) снижает общий выход протопластов, увеличивая при этом выход жизнеспособных протопластов. В таблице 2 приведены также результаты сравнительного сопоставления действия коммерческого препарата Cellulase Qnozuka R-10 и отечественного препарата Целлюлаза в однотипных ферментных композициях (I и Ш). Из таблицы видно, что замена

Таблица 1. Эффективность выделения протопластов из гипокотилей проростков гречихи при различных концентрациях отечественных препаратов.

Концентрация ферментов в растворе, % Выход протопластов из 1 г ткани * 105 Жизнеспособность, %

Целлюлаза Пектиназа

0,16 0,16 8,0 ±1,27 17,7

0,16 0,8 7,3 ±0,51 15,5

0,8 0,16 6,8 ±0.75 16,8

0,8 0,8 6,0 ±0,58 12,3

Таблица 2. Эффективность выделения протопластов из гипокотилей проростков гречихи при использовании различных ферментных систем.

Состав ферментной композиции Выход

Жизнеспособность,

Наименование ферментных препаратов Концентрация, % протопластов из 1 гткани ■ 101 , ; %

Опогика Я-)0 1,0

1 Масегогуте В,-10 0,6, 7,8 ±1,09 ! 30,5

ОпзеЫе 0,25

и Опогика И-10 1.0 5,6 ±1,32 38,3

Масегогуте И,-10 0,6

Целлюлаза 0,16

Ш Масегогуте Я-10 0,6 12,8 ±1,0 26,6

Оп5е1а$е 0,25

целлюлазного препарата японского производства на отечественный в концентрации в б раз меньшей повышала более чем в полтора раза абсолютный выход протопластов при практически одинаковой жизнеспособности протопластов в обоих опытах.

Нами также было проведено изучение эффективности выделения протопластов из гипокотилей, листьев и каллусных тканей культурной гречихи. Из таблицы 3 видно, что ткани листа оказались самыми устойчивыми к ферментативному лизису отечественными ферментами - для выделения протопластов из листьев требовалась в 2 раза большая их концентрация, чем при выделении протопластов из гипокотилей и каллуса. Следует отметить, что эти данные находятся в противоречии с известным мнением о том, что по сравнению с другими тканями при выделении протопластов из каллуса требуются более концентрированные ферментные растворы (Сидоров и др., 1985), То, что эффективность выделения протопластов из листьев оказалась на два порядка выше выхода протопластов из тканей гипокотилей и каллуса, можно объяснить малыми размерами клеток листьев растений, выращенных в стерильных условиях и, соответственно, ббльшим их количеством на единицу массы ткани.

Другим интересным фактом стал в 3-4 раза больший выход жизнеспособных протоачастов из тканей листьев и каллуса по сравнению с тканями гипокотилей. При этом обращает на себя внимание более высокая жизнеспособность протопластов, полученных с помощью отечественных ферментных препаратов (табл. 3).

С целью определения влияния ферментных растворов на морфогенетическую активность протопластов, последние, после выделения из тканей гнпокотилей и очистки, культивировали на искусственной питательной среде. Протопласты начинали образовывать клеточную стенку на второй день после выделения независимо от использованной ферментной системы. Однако дальнейшее развитие регенерировавших клеточную стенку протопластов наблюдалось только у тех из них, которые были получены из тканей гнпокотилей с использованием отечественных ферментных препаратов. Клетки приступали к делению на 5-й день, а на 17-й в микроколониях насчитывалось в среднем по 8-10 клеток. Регенерация нескольких нормальных по морфологии растений из образовавшихся каллусных колоний наблюдалась через 9 месяцев.

В литературе известен только один случай регенерации растений гречихи из протопластов. Через 1,5 года культивирования (т.е. в 2 раза дольше) группе исследователей (А<1асЫ е1 а1., 1989) удалось получить из пассируемого каллуса несколько

Таблица 3, Эффективность выделения протопластов из различных тканей культурной гречихи.

Вид ткани Состав ферментной композиции Концентрация ферментов, % Выход протопластов из 1 г ткани Жизнеспособность, %

Гипокотиль Целлюлаза Пектиназа 0,16 0,16 8,0 ±1,27 (105) 17,7

Лист Целлюлаза Пектиназа 0,16 0,16 — —

Целлюлаза Пектиназа 0,32 0,32 8,5 ±0,8 (-107) 63,0

Опогика Я-10 Масегогупэе К-10 Г)л$е1а5е 1,0 0,6 0,25 8,5 ±3,0 (-107) 54,0

Каллус Целлншаза Пектиназа 0,16 0,16 6,9 ±0,2 (-Ю5) 70,0

Опогика Я-10 Масегогуше Н.-10 Опзе1а5е 1,0 0,6 0,25 5,8 ±0,13 (-105) 34,0

побегов и эмбриоидов, Все растения имели аномальную морфологию и не цвели.

Несмотря на то, что мы получили регенерацию растений из культивируемых протопластов Г, езси1еп!ит, стоит отметить, что в целом ре генерационная активность полученных из протопластов каллусов была низкой, а период, необходимый для регенерации, - длительным. Исходя из полученных нами результатов, а также литературных данных, можно прийти к следующему заключению: культивирование протопластов у гречихи в настоящее время не является гарантирующнм успех методом.

2.2. Регенерация растений через соматический эмбриогенез и геммогенез из тканей гипокотилей

Альтернативой использования техники культивируемых протопластов может являться постановка методов "быстрой" регенерации растений. Одним из эффективных решений в этом случае может быть разработка приемов индукции органогенеза и соматического эмбриогенеза без стадии образования и пассирования каллусных культур.

2.2.1. Образование прозмбриогенных клеточных комплексов. Факторы, влияющие на их образование

Концентрация и длительность воздействия 2,4-Д на экспланты. В экспериментах мы опробовали различные схемы культивирования эксплантов на жидких средах с варьированием концентрации 2,4-Д: 1) длительное культивирование эксплантов на среде с 2,4-Д - 4,0-6,0. мг/л; 2) прекультивирование эксплантов в течение 4-х или 8 дней на среде I с высокой концентрацией 2,4-Д от 6,0 мг/л до 15,0 мг/л с последующим культивированием их на среде II с концентрацией 2,4-Д от 0,0 до 2,0 мг/л.

В процессе культивирования на эксплантат развивались шарообразные структу ры,

состоящие из мелких, плотно прилегающих друг к другу клеток - проэм-бр йоге иные клеточные комплексы (ПЭКК) (рис. 1). Следует отметить, что при индукции соматического эмбриогенеза у гречихи другие исследователи не отмечали появления подобных глобулярных структур непосредственно в тканяхэксплантов.

Наши исследования показали, что разл1гчные схемы кул ынв про ванн я эксплантов на средах с 2,4-Д заметно влияли на скорость образования ПЭКК на эксилачтач и на

Рис. 1. Эксплант из гипокотнля гречихи в среде П с развившимися на нем проэмбрногенными клеточными комплексами.

Таблица 4. Время появления ПЭКК в среде II в зависимости от длительности культивирования эксплантов из гипокотилей гречихи в среде [ и концентрации 2,4-Д в среде П.

Продолжительность культивирования эксплантов на среде I (2,4-Д- 6 мг/л) Содержание 2,4-Д в среде II, мг/л

0,1 1,0 2,0

4 сут не развивались 31 сут 25 сут

8 сут 37 сут 17 сут 13 сут

количество эксплантов, образующих ПЭКК. В первом случае ПЭКК на эксплантах появлялись через шесть недель культивирования. Во втором случае для образования ПЭКК требовалось времени тем меньше, чем дольше экспланты выдерживали на среде I, и чем выше была концентрация гормона в среде II (табл. 4).

Таким образом, основным условием образования ПЭКК непосредственно в тканях экспланта можно считать прекультивирование эксплантов на среде с повышенным содержанием одного ауксина - 2,4-Д, а фактором, ускоряющим их появление, - снижение концентрации этого гормона при дальнейшем культивировании.

Минеральная основа среды культивирования экснлянтов. Нами установлено, что на процесс образования ПЭКК в культуре гипокотилей гречихи оказывает влияние не только гормональный статус среды. Так, замена в среде культивирования минеральных солей В5 на МЗ вызвала изменение картины морфогеиеткческого отклика у эксплантов. На среде II с солями В3 в отсутствии 2,4-Д на эксплантах развивались корни нормальной морфологии, а на той же среде с концентрацией 2,4-Д от 0,1 до 2,0 мг/я - ПЭКК, На среде П с минеральными солями МБ, в зависимости от содержания 2,4-Д, наблюдали: без 2,4-Д - корни нормальной морфологии; при концентрации 0,1 мг/л - короткие утолщенные корни; яри 0,5 мг/л - структуры, имеющие промежуточную морфологию между корнями и ПЭКК; при 1,0 мг/л - обычные ПЭКК; при 2,0 мг/л - каллусируюшие, разросшиеся ПЭКК. Возможно, такое различие в проявлении мррфогенетического отклика связано с разным соотношением азот/фосфор в составах этих солей или соотношением азот/ауксин в среде.

Конпентрацня сахарозы в среде'1 культивирования. Полученные нами результаты также говорят о сильном влиянии концентрация сахарозы на образование ПЭКК и способность к регенерации у эксплантов гречихи. Из данных, приведенных в таблице 5, видно, что культивирование экенлангов на среде I с содержанием сахарозы 25 г/л способствовало образованию ПЭКК у 80% эксплантов против 5% в контроле (100 г/л сахарозы). Слезет отметить, что при низком содержании сахарозы в среде I практически

Таблица 5, Влияние концентрации сахарозы в средах I и II на процесс образования ПЭКК эксплантами гречихи.

Среда I (2,4-Д - 8,0 мг/л) Среда II (2,4-Д- 2,0 мг/л)

Концентрация сахарозы, г/л Экспланты с ПЭКК, % Концентрация сахарозы, г/л Экспланты с ПЭКК, %

25 80 ±4 25 100 96 ±2 95 ±2

100 5±2 25 100 82 ± 3 80 ±3

все экспланты при переносе в среду II образовывали ПЭКК. Интересно, что концентрация сахарозы в среде II в этот момент уже не имела значения.

На среде I с содержанием сахарозы 100 г/л ПЭКК на эксплантах почти не развивались. Они появлялись только после переноса эксплантов на среду II. Количество эксплантов с ПЭКК в этом случае было на 15-20% меньше, чем в предыдущем варианте и также уже не зависело от содержания сахарозы в среде II.

Несмотря на меньшее число эксплантов, образующих ПЭКК в среде И после культивирования на среде I с высоким уровнем сахарозы, именно эти экспланты к концу культивирования могли образовывать соматические зародыши. Таким образом, низкое содержание сахарозы в среде I препятствовало в дальнейшем образованию соматических зародышей из ПЭКК даже в том случае, если их в дальнейшем культивировали на среде II с концентрацией сахарозы 100 г/л.

Увеличение морфогенной активности эксплантов при высокой концентрации углевода в среде может являться результатом не столько усиления питания, сколько повышения осмотического потенциала среды и проявления регуляторной роли сахарозы (Iraqî, Tremblay, 2001).

Плотность культивирования эксплантов. В ходе изучения условий культивирования эксплантов гречихи нами было показано, что плотность и количество совместно культивируемых эксплантов существенно влияют на эффективность образования ПЭКК. Из таблицы б видно, что при увеличении в два раза плотности и количества совместно культивируемых эксплантов ПЭКК начинали развиваться в обоих случаях практически одновременно, однако скорость образования ПЭКК при меньшей плотности культивирования была в даа раза ниже, чем при высокой, и на 15-Й день

Таблица 6, Влияние количества и плотности совместно культивируемых эксплантов на образование ПЭКК при культивировании на среде Н.

Количество совместно кул ьтивируемых эксплантов Плотность культивирования эксплантов, экеплант/мл среды п | Количество Время начала , „Г.___ ттли- эксплантов, образования ПЭКК, ' , г | образовавших ПЭКК ] на 15 сутки, %

20 1 5-6 10

40 2 5-6 21

4 2 15 1,7

культивирования ПЭКК образовали только 10% эксплантов против 21% соответственно. Уменьшение количества совместно культивируемых эксплантов в 50 раз при одинаковой плотности культивирования приводило к увеличению в три раза времени, необходимого для начала образования ПЭКК, и к резкому сокращению количества эксплантов (до 1,7%), способных к их образованию.

В настоящее время известно, что культивируемые клетки секретируют в питательную среду множество молекул, являющихся в основном компонентами неточной стенки. Часть из них является факторами кондиционирования, влияющими на жизнеспособность, пролиферативную активность и морфогенетичесхие свойства культивируемых клеток. Содержание факторов кондиционирования в клетке является результатом трех процессов - образования, выделения в среду и поглощения из среды (Еннкеев и др., 2000). При большом количестве клеток в единице объема среды содержание факторов кондиционирования в клетке достаточно для их деления. Когда же на каждую клетку приходится большой объем среды, то выделение факторов кондиционирования из меток не компенсируется обратным поглощением, и их содержание в клетках становится недостаточным для деления. Именно этим, скорее всего, объясняется в наших опытах положительное влияние большой плотности и большого количества совместно культивируемых эксплантов на количество и скорость образования ПЭКК.

Положение экспланта по длине гнпокотиля. Морфогенетический градиент может проявляться в зависимости от местонахождения экспланга в растении. Нами было показано также, что эксплакты из разных участков гнпокотиля и проростки гречихи в целом обладали разной способностью к формированию ПЭКК. Экспланты из апикальных и базальных участков гипокотилей опережали экспланты из центральной части по скорости формирования ПЭКК, Кроме того, количество эксплантов, образующих ПЭКК и

¿ г

Об

58

праяоляолгедъмоггъ

культнвиромния, сут

Рис. 2. Способность эксплантов из различных участков гигшкоталей к образованию ПЭККна среде II (а - апикальная часть, б - баэальная часть, ц -центральная часть гипокотиля),

взятых из апикальных и базальных участков гипокотилей, в среднем в 1,5-2 раза превышало количество эксплантов с ПЭКК, взятых из средней части гипокотилей (рис. 2),

Следует отметить также, что только у 80% проростков экспланты были способны к образованию ПЭКК. Из этого количества 3/4 проростков реализовали морфоген етическую программу с высокой частотой (ПЭКК формировали более 50% эксплантов с каждого проростка).

2.2.2. Гистологическое исследование процесса формирования ПЭКК

Гистологические исследования показали, что ПЭКК на эксплантах возникают из прокамбиальных клеток обкладки сосу-

дистых пучков. Уже на 4-е сутки культивирования эксплантов на среде II происходит активация делений в этой области, а на 6-е сутки ясно виден образующийся в тканях ПЭКК, Поверхность ПЭКК состоит из 2-3 рядов рыхло расположенных слущивающихся клеток; глубже находятся тесно прилегающие друг к: другу меристематические клетки с большими ядрами и плотно окрашиваемой цитоплазмой. Середина ПЭКК

\ ЧЛ ^ ¡V. *

1(0 мк.ч

Рис. 3. Поперечный срез экспланта с формирующимся ПЭКК на 6-й день культивирования в среде II.

заполнена сильно вакуолизированными клетками. Такое строение характерно для ПЭКК других растений (Батыгина и др., 1978). По мере разв!£тия ПЭКК происходит выпячивание его на поверхность зкспланта, у его основания формируются ряды крупно вакуолизированных клеток, ПЭКК отделяется от зкспланта и выпадает в среду культивирован ия.

2.2.3. Регенерации растений нз проэмбр но генных клеточных комплексов

В конце культивирования на среде регенерации или в начале культивирования на безгормональной среде на зксплантах появлялись соматические зародыши (рис. 4) и реже -почки. По нашим наблюдениям, регенерация растений из ПЭКК может происходить тремя способами:

1. образование соматических зародышей из клеток ПЭКК;

2. образование почек из клеток ПЭКК;

3. превращение (реорганизация) целого ПЭКК в прорастающий зародыш.

Процесс соматического эмбриогенеза развивался асинхронно, что также отмечалось Нешкович с соавт, (Ые&оугё е! а!., 1987). На одном экспланте можно было наблюдать зародыши на разных стадиях развития. При этом соматические зародыши, как правило, проходили все характерные для них-стадии развития и имели нормальную морфологию. Образовавшиеся соматические зародыши и почки переносили затем на безгормональную среду, где они прорастали (рис, 5) н развивались в растения. Изредка при прорастании зародышей отмечалось недоразвитие семядолей.

Следует отметить, что число эксплаетов, образующих соматические зародыши, составляло 24% от общего количества эксплантов. В то же время количество эксплакгов, способных к образованию почек, составляло только 6-8%, то есть соматический эмбриогенез был доминирующим путем регенерации.

Необходимо отметить, что крайне редко на одном экспланте можно было наблюдать образование и зародышей, и почек одновременно. В отличие от наших результатов, Нешкович с соавт. (ЫеЗко^чЙ е! а1„ 1987) отмечали одновременное развитие соматических зародышей и почек.

Соматический эмбриогенез -сложный процесс, в котором количество конечного продукта, т. е.

Рис. 4. Образование соматических зародышей на эксачантах гречихи при переносе их на безгормональную среду.

Рис, 5. Прорастающий соматический зародыш гречихи.

выживание и рост регенерировавших растений, зависит от условий, имеющихся на ранних стадиях. Проведенные нами эксперименты позволили установить, что для развития соматических зародышей из ПЭКК необходимо выполнение нескольких условий.

Во-первых, на процесс образования зародышей из ПЭКК очень большое влияние оказывает концентрация 2,4-Д в среде I. Чем она выше, тем быстрее появляются зародыши. По-видимому, концентрация 2,4-Д - 6,0 мг/л является пороговой для этого процесса, поскольку при этой концентрации можно добиться образования зародышей, только увеличив в два раза время культивирования эксплантов на среде II.

Во-вторых, обязательным является этап культивирования эксплантов с ПЭКК на среде регенерации, содержащей 6-БАП, а затем - на безгормональной среде.

В-третьих, физическое состояние среды культивирования, а именно замена жидкой среды регенерации на агаризоваиную, также способствует развитию соматических зародышей. Таким образом, оптимизация схемы культивирования позволила нам сократить время, необходимое для получения соматических зародышей, до 63 дней, что значительно меньше срока (4 мес.), о котором сообщи Lachmann (1991).

2.2.4. Анализ растений-perene рантов на сома клона льну ю вариабельность

Известно, что растения, полученные в культуре, подвергаясь воздействию различных факторов (главным образом гормональной природы), могут отличаться от исходных форм. При анализе растений-регенерантов на сомаклональную вариабельность мы оценивали фенотипическую, цнтогенетическую (хромосомные числа, хромосомные аберрации) и биохимическую (спектры растворимых белков) изменчивость.

Фенотипнческнй аиалт регенерянтов. В целом, практически все растения, полученные нами в процессе регенерации, имели нормальный морфотил. Отклонения выражались в меньших размерах листовых пластинок, увеличении количества междоузлий, их утолщении и уменьшении длины междоузлий. Однако постепенно, в процессе микроклонального размножения, растения этих линий приблизились к фенотипу, сходному с фенотипом регенерантов других линий. Видимо, это явление не связано с устойчивыми изменениями генома, а скорее объясняется эпигенетической изменчивостью и размахом варьирования признаков в пределах исходного вида.

Цитогеистическн» анализ пегенерянгов. Проведенный нами ц итоге нети1чески й анализ 30 линий растений-регенсрантов;.- выращенных из соматических зародышей » почек, показал, что подавляющее большинство из них имеют основной модальный класс хромосом 2п=] б (pire, 6), ,.

Все полученные линии регенератов по набору хромосомных чисел можно условно разделить на три группы (рис. 6):

1 ) растения с распределенном хромосомных чисел, близким к контролю. К этой группе можно отнести лннии Э.5. Э.6. Э.12, Э,1б, Э.25, Э.ЗО, Э.36, Э.(2-1), П.7(8), П. 18(2-1);

2) растения с распределением хромосомных чисел, отличающимся от контрольного в сторону преобладания диплондного набора. В эту группу можно поместить растения линий 3.1, 3.24, Э.31. Э.ЗЗ, 3,35. Э.40, 3.43, Э.1(6), ГШ(8), П. 1(2-1), П. 10(2-1), П,13(2-1).П,(5(2-1), П. 17(2-1 >;

3) растения, у которых уровень липло иди их клеток ниже, чем в контроле, а число анеуплоидных н полиплоидных клеток значительно выше - 3.21, Э.23, 3,39, 11.7(2-1), Возможно, зги растения представляют собой химеры, образовавшиеся в результате развития зародышей из нескольких клеток.

Согласно статистической обработке, только одна из всех изучаемых линий - Э.23 -имела долю диплоидных клеток ниже, чем в контроле. Таким образом, однородность среди подученных регенератов составила 96.6%. _

□ аберрации 8 16хромосом ■ < 16хромосом >16хромосом ил.....

Рис. 6. Распределение метафазлы.ч клеток по классам хромосом н доля аберрантных клеток у линий растеннй-регснерантов и в контроле.

Интересно, что количество днллоилных клеток в кончиках корней у растений, полученных через геммогенез, оказалось очень высоким (до 94%) и только у одной линии -ПЛ 8(2-1) - снижалось до 61,17%.

Хромосомные аберрации рассматривают как одно из проявлений сомаклональной изменчивости в культуре клеток и тканей, причинами которой могут быть как особенности исходного материала, так и сам процесс культивирования in vitro (Кунах, 1999). Наши исследования показали, что аберрации в клетках меристемы корней регенератов были представлены мостами и отставаниями. Встречались также клетки, сочетающие в себе и те, к другие аберрации.

При разбросе долей хромосомных аберраций от 3,6% у растений линии Э.24 до 8,7% у растений линии Э.ЗО, в среднем доля аберрантных клеток составляла 5,75%. Отклонение опытных показателей от контрольных находилось в пределах ошибки выборочной доли, что доказывает отсутствие статистически достоверной разницы между исследуемыми вариантами.

Низкая частота хромосомных аберраций как у контрольных, так и у опытных растений может быть обусловлена особенностями происхождения соматических зародышей и проэмбриональных клеточных комплексов. Как показало гистологическое исследование, ПЭКК формировались из прокамбиальныч клеток обкладки сосудистого пучка. Эти клетки относятся к меристематической ткани, которая содержит преимущественно диплоидные клетки.

Биохимический анализ вегенерантов. Элекггрофореэ растворимых белков широко используется как наиболее простой н достаточно эффективный способ биохимического анализа растений-регенерантов. Электрофорез белков позволяет непосредственно увидеть продукт экспрессии гена и на уровне белка оценить генетическую вариабельность.

Мы изучали спектры растворимых белков как у растений, полученных через соматический эмбриогенез, так и растений, полученных через геммогенез. Характеризуя электрофореграммы в целом, можно говорить только о количественных, а не о качественных изменениях, затронувших процесс синтеза белка у регенерированных растений, т. е, только об изменении степени экспрессии отдельных генов. При этом следует отметить два белка: белок с М 16,59 кДа, который практически не прослеживается в контроле и у линий растений, полученных из почек, н белок с М 18,62 кДа, который наоборот, характерен в основном для линий, полученных из почек, но отсутствует в регенератах "эмбриогенного" происхождения.

Вариабельность в экспрессии белков у растений-регенерантов можно объяснить тем, что экешаигами служат растения и проростки, получаемые из разных семян смешанной популяции. Гречиха является перекрестноопыляемым растением, вследствие чего все

растения даже одного сорта можно рассматривать как гибридные, не совсем однородные по морфологическим и биологическим признакам (Кротов, 1975). Такие растения демонстрируют повышенную вариабельность и в культуре in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Морфогенез - сложный интегральный процесс, регуляция которого осуществляется на клеточном, тканевом и организменком уровнях взаимозависимой системой физических и химических факторов, определяющих процессы деления, растяжения, дифференцировки, старения и смерти клеток.

Культура растительных клеток, тканей и органов может быть использована как модель для изучения механизма дифференциации и путей морфогенеза. Применение этого экспериментального подхода открывает новые перспективы для познания и управления процессом онтогенеза, а также для создания новых форм растений.

Проведенные нами исследования позволили выявить ряд факторов, ключевых для развития эмбриогеиной программы в культуре гипокотилей гречихи культурной F. escukntum - объекта, у которого этот процесс изучен крайне недостаточно. Нами установлено, что^ соматический эмбриогенез в гипокотилях гречихи осуществляется через образование ПЭКК, т. е. непрямым путем. Гистологически доказано, что способностью к образованию ПЭКК обладают прокамбиальные клетки сосудистых пучков пшокотилей. Выявлено, что для индукции ПЭКК из этих клеток критичными являются уровень 2,4-Д в среде, содержание осмотика, минеральный состав среды, а также положение экспланта по длине гипокотиля и плотность культивирования эксплангов. Последнее свидетельствует о том, что в регуляции дифференцировки ПЭКК, кроме выявленных нами гормональных и трофических факторов, принимают участие секретируемые молекулы; важным также является эндогенный уровень гормонов в определенной части гипокотиля. Впервые установлено, что ПЭКК при одних и тех же условиях культивирования тканей гречихи могут формировать либо эмбриоиды, либо почки, что свидетельствует о пластичности ПЭКК и различной компетенции их поверхностных клеток, которая, по всей вероятности, определяется эндогенным уровнем гормонов в экспланте.

, Особенно следует отметить, что межклеточные взаимодействия являются одним из ключевых факторов, влияющих на реализацию морфогенного потенциала в тканях пшокотилей. Нарушение таких взаимодействий при выделении протопластов из пшокотилей кардинально меняет их морфогенную компетенцию: мы ни разу не наблюдали при культивировании протопластов неравных делений и развития ПЭКК, регенерация растений из протопластов шла только через геммогенез, Удаление клеточной стенки является жестким воздействием, последствия которого могут сказываться не только

на процессе восстановления клеточной стенки, но и на более отдаленных процессах, таких как пролиферация и морфотеиетическая активность протопластов. Поэтому важен устшоатенный нами факт наличия морфогенной способности у протопластов, полученных с помощью ферментов, прошедших специальную очистку.

Несмотря на двукратное сокращение временного интервала, необходимого для регенерации растений в культуре протопластов по сравнению с описанным ранее способом (с 1,5 лет до 9 месяцев), протопластаая технология для гречихи на современном этапе исследований не может быть признана удачной. К ее основным недостаткам могут быть отнесены следующие: низкая эффективность регенерации, регенерация через геммогенез с возможным получением химер, длительное пребывание в условиях in vitro, стимулирующих сомакяональную изменчивость. Как показали наши исследования, разработанный нами способ регенерации растений из тканей гипокотилей через непрямой соматический эмбриогенез значительно снижает риск появления сомаклональиых вариантов и дает высокий выход генетически однородных растений-регенерангов в сжатые сроки (через 2 месяца культивирования).

ВЫВОДЫ

]. Разработаны методы выделения и культивирования протопластов из тканей гипокотилей гречихи. Установлена высокая эффективность отечественных ферментных препаратов, предоставленных Институтом биохимии им. А. Н. Баха, ло сравнению с коммерческими ферментными препаратами импортного производства.

2. Получена регенерация растений из протопластов гипокотилей гречихи культурной. Показана низкая эффективность регенерации из протопластов гипокотилей гречихи при длительном периоде культивирования in vitro.

3. Впервые разработай способ регенерации растений гречихи культурной через соматический эмбриогенез кз гипокотилей 4-5-дневных проростков, позволяющий в сжатые сроки (в течение 2 мес.) получить высокий выход генетически однородных растений.

4. Установлено, что при осуществлении разработанного способа преимущественное образование соматических зародышей сопровождается одновременным развитием вегетативных почек. При этом каждая морфогенегическая программа реализуется, как правило, у разных экспяантов.

5. Показано, что регенерация растений и при соматическом эмбриогенезе, и при геммогеиеэе осуществляется путем формирования проомбриогенных клеточных комплексов (ПЭКК) из лрокамбиальных клеток обкладки сосудистых пучков.

6. Выявлено, что на процесс развития ПЭКК в тканях гипокотилей гречихи и

регенерацию из них растений оказывают влияние следующие факторы: а) концентрация и длительность воздействия 2,4-Д на экспланты; 6) минеральный состав среды культивирования; в) концентрация сахарозы; г) плотность культивирования эксплантов; д) местонахождение экспланта в гипошгиле; е) наличие этапа культивирования эксплантов на среде регенерации с БАП; ж) физическое состояние среды культивирования.

7. Цкгогенетический и биохимический анализы растений-регенераотов показали, что при осуществлении разработанного метода получения соматических, зародышей и почек в высокой степени сохраняется исходный генотип и однородность регенерированных растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Возможности использования методов культуры клеток и тканей в селекции гречихи: Труды межд. сим п. "Биология культивируемых клеток и биотехнология". Новосибирск, СССР, август 1988 г.- Новосибирск, 1988,-450 с.

2. Румянцева Н. И., Сергеева Н. В., Хакимова Л. Э., Сальников В. В., Гумерова Е. А., Лозовая В. В. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи// Физиология растениЙ.-1989.-Т.Зб, № 1.-С. 187-194.

3. Morphogenesis and plant regeneration in buckwheat tissue culture: Proc, of 4th Intern. Symp. on Buckwheat Orel, USSR, July 1989,-Orel, 1989.-575 p.

4. Перспективность использования новых отечественных ферментных препаратов для получения протопластов высших растений: Тез. докл. III Всесоюзн. конф. "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки". Казань, июнь 1990 г.-Казань, 1990.-150 с.

5. Биотехнология в селекции гречихи: Тез. И съезда ВОФР. Минск, сентябрь 1990 г,. Минск, 1990.-176 с.

6. Gumerova Е. A. Regeneration of plantlets from protoplasts of Fagopyrum esctdentum Moench. // Proceedings of 7th Intern. Protoplast Symposium "Progress in Plant Protoplast Research", Uppsala, Sweden, June 1991.-Physiol. Plant.-199 l.-V. 82, NI-A 19.

7. Factors determined low cellulose content in cell wall regenerated by plant protoplasts: Abstr. 6th Cell Wail Meeting, Nijmegen, the Netherlands, August l992.-the Netherlands, 1992.-308 p.

8. Гумерова E А., Румянцева H. И„ Лозовая В. В., Селиванов М. С., Рабинович М. Л. Новые литические композиции ферментов для получения делящихся протопластов гречихи // Прикладная биохимия и микробиология.-1993.-Т. 29,№4.-С. 591-596,

9. Разработка тест-системы на основе тонкослойных эксплантов гречихи: Тез. докладов II Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов. Казань, июнь-июль 1996 г.-Казань, 1996.-Т, 1.-110с.

10. Gumerova Е., Rumyantseva N.. Gatina Е. Morphogenic capacity of buckwheat small explants cultured in -vitro // Proc. of 10th Federation of European Societies of Plant Physiology (FESPP) Congress "From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach", Florence, Italy, September 1996-PIant Physiol. В iochem.-1996.-Special issire.-P. 25.

11. Somatic embiyogenesis in different explants of two buckwheat species (F. esculentum Moench., F. latarlcum (L.) Gaerm.): Proc. of 8th Coof. of Plant Embryologists from Poland, Bohemia and Slovakia. Gdansk, Poland, September 1997-Poland, 1997.-150 p.

12. Получение эмбриогенной суспензионной культуры из Тонкослойных эксплантов гипокотилей культурной гречихи (Fagopyrum esculentum Moench.): Тезисы докл. HI Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов. Казань, октябрь 1997 г.-Казань, 1997.-128 с.

13. Образование проэмбриогенных структур в тканях гипокотилей гречихи культурной (Fagopyrum esculentum, Polygonaceae); Тезисы докл.'^П (X) съезда Русского ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже' XX-XXI веков". Санкт-Петербург, май 1998 г.-Санкт-Петербург, 1998.-Т, 1,-398 с,

14. Gumerova Е., Rumyantseva N.. Gatina Е. Formation of proembryogenic cell complexes in hypocotyl tissues of common buckwheat Fagopyrum esculentum Moench. U Proc. of 7th Intern. Symposium on Buckwheat "Advances in Buckwheat Research", Manitoba, Canada, August 1998.-P. 53-57.

15. Rapid obtaining of morphogenic culture of buckwheat F. esculentum Moench, through the direct formation of proembiyogenic cell complexes; Proc. of II Intern. Symp. or Biotechnology. Kiev, Ukraine, Octoder 1998.-Ukraine, 1998.-327 p.

16. Peculiarities of proembiyogenic cell complexes formation by the hypocotyl tissues of Fagopyrum esculentum seedlings: Abstr. 3th Symposium in the Series "Recent Advances in Plant Biotechnology" - "From Cells to Crops". Stars Lesra, High Tatras, Slovak Republic, September 1999,-Slovak Republic, 1999.-192 p.

17. Соматический эмбриогенез в тканях гипокотилей Fagopyrum esculentum Moench.: Тез. докл. IV съезда Общества: физиологов растений России. Москва, октябрь 1999 г.Москва, 1999.-836 с.

18. Gumerova Е. A, Gatina ЕЛ., Chuenkova S. A, Rumyantseva N. I. Somatic embryogenesis in common buckwheat Fagopyrum esculentum Moench. It Proc. of VHIth Intern, Symp. on Buckwheat, Chunchon, Korea, August-September 2001.-P. 377-381.

920 95 2

19. Somatic embryogenesis in hypocotyl culture of F. esculentum: Abstracts of 17th Intern. Conf. on Plant Orowtfa Substances. Brno, Czech Republic, September 2001,-Czech Republic, 2001.-208 p.

20. Цитогенеггический анализ растений-регенерангов, полученных в культуре гипокотилей гречихи Fagopyrum esculentum: IV научко-гграктическая конференция молодых ученых и специалистов республики Татарстан. Казань, декабрь 2001 г.Казань, 2001.-186 с.

2!. Изучение вариабельности растений-регенерангов, полученных в культуре гипокотилей гречихи Fagopyrum esculentum; Труды III съезда биохимического общества. Санкт-Петербург, июнь-июль 2002 г.-Санкг-Петербург, 2002.-672 с.

22. Гумерова Е. А., Чуенкова С. А., Гатина Е. А., Румянцева Н. И. Соматический эмбриогенез и геммогенез в кулыуре гипокотилей Fagopyrum esculentum Moench. // Физиология растений,-2003.-Т. 50, № 5.-С. 716-721.

23. Protein polymorphism analysis of buckwheat {Fagopyrum esculentum) regenerants obtained in culture in vitro-. Proc, Joint Intern. Conf. "New Geometry of Nature", Kazan, Russia, August-September 2003,-Kazan, 2003,-V. II.-452 p.

24. Somaclonal variation analysis of in vitro regenerated buckwheat plants Fagopyrum esculentum: Absrtracts of VIII Intern. Conf. "The Biology of Plant Cell» In Vitro and Biotechnology". Saratov, Russia, September 2003.- Saratov, 200Э.-Р. 117-118.

25. Somaclonal variation analysis of somatic embryos of common buckwheat Fagopyrum esculentum: Abstracts of 5th Intern. Symp. in the Series "Recent advances in Plant Biotechnology" - "Plant Biotechnology: Progress and Development". High Tatras, Slovak Republic, September 2003,-Slovak Republic, 2003.-187 p.

Отпечатано в ООО «Печатный двор». Казань, ул. Журналистов, i/!6. ЛицензияПД №7-О215от0ШД! Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТРРФ. Заказ № К-II70. Формат 60x901/16, Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Печать - ризография