Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реализация морфогенного потенциала гипокотилей гречихи культурной Fagopyrum Esculentum Moench. в зависимости от способа регенерации растений IN VITRO
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Реализация морфогенного потенциала гипокотилей гречихи культурной Fagopyrum Esculentum Moench. в зависимости от способа регенерации растений IN VITRO"

На правах рукописи

ГУМЕРОВА ЕЛЕНА АЗАТОВНА

РЕАЛИЗАЦИЯ МОРФОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА ГИПОКОТИЛЕЙ ГРЕЧИХИ КУЛЬТУРНОЙ FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ IN VITRO

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 2004

Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики культивируемых клеток Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель

кандидат биологических наук Н. И. Румянцева

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Н. Н. Круглова

кандидат биологических наук И. А. Ларская

Ведущая организация

Казанский государственный университет им В. И. Ульянова-Ленина

Защита состоится" 15 " января 2004 года в 12.00 час.

на заседании диссертационного совета К 002.005.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН (420111, г. Казань, а/я 30, ул. Лобачевского, 2/31)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН

Автореферат разослан" 8 " декабря 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А. Б. Иванова

ооЗ-ft

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

i

Актуальность проблемы. Методы культуры клеток и тканей широко используются' как для проведения фундаментальных исследований, так и для решения практических задач. Успехи применения большинства методов in vitro связаны, главным

образом, с возможностью регенерации растений. Существуют три основных пути регенерации растений in vitro - эмбриокультура, соматический эмбриогенез и органогенез. Однако способов регенерации растений гораздо больше - в зависимости от выбора экспланта, условий культивирования и подхода к поставленной задаче. Можно проводить регенерацию растений, индуцируя к развитию апикальные, пазушные или адвентивные почки, микроклубнями, используя каллусные и суспензионные культуры, культивируя пыльники и семяпочки, применяя методы выделения и культивирования протопластов.

Культивируемые клетки и ткани растений являются пластичной системой, обладающей способностью изменять скорость пролиферации, интенсивность метаболизма, процессы дифференцировки в результате определенных химических и физических воздействий. Это свойство дает возможность подбора условий для максимальной реализации морфогенного потенциала культивируемого объекта.

Известные для гречихи культурной Fagopyrum esculentum способы регенерации осуществляются в основном через стадию каллусообразования и зачастую многократного пассирования каллусной культуры (Lachraann, 1991; Нао et al., 1998; Woo et al., 2000). Такой способ регенерации растений занимает много времени и не всегда имеет высокую эффективность в отношении как количественного выхода регенерантов, так и их генетической однородности. Использование же в качестве эксплангов незрелых тканей или частей взрослых растений ставит опыты в зависимость от сезона. Поэтому разработка быстрых и эффективных способов регенерации растений из обладающих высоким морфогенным потенциалом, легкодоступных, асептически выращиваемых тканей является необходимым этапом для развития биотехнологии гречихи.

Цель настоящей работы заключалась в изучении морфогенетической способности тканей гипокотилей проростков гречихи культурной при различных способах регенерации растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способ регенерации растений из протопластов, выделенных из гипокотилей проростков гречихи культурной.

2. Провести сравнительную оценку эффективности (выход, жизнеспособность и регенерационная активность протопластов) отечественных ферментных препаратов, разработанных в институте биохимии им. А. Н. Баха, и коммерческих препаратов импортного производства при выделении протопластов из тканей гипокотилей

3. Разработать способ регенерации растений гречихи культурной из тканей гипокотилей 4-5-дневных проростков.

4. Изучить действие различных факторов на образование проэмбриогенных клеточных комплексов в тканях гипокотилей гречихи и их регенерационный потенциал.

5. Провести гистологическое исследование процесса образования проэмбриогенных клеточных комплексов.

6. Провести цитогенетический анализ растений-регенерантов, полученных путем соматического эмбриогенеза и геммогенеза.

7. Провести сравнительный анализ спектров растворимых белков у линий растений-регенерантов.

Научная новизна работы. Установлена высокая эффективность отечественных ферментных препаратов, предоставленных институтом биохимии им. А. Н. Баха, по сравнению с коммерческими ферментными препаратами импортного производства при выделении и культивировании протопластов из разных тканей гречихи. Впервые получены фенотипически нормальные растения при регенерации растений из протопластов гречихи; время, необходимое для их получения, было сокращено в 2 раза по сравнению с результатом Адачи с сотр. (Adachi et al., 1989). Впервые разработан способ регенерации растений гречихи культурной через соматический эмбриогенез из гипокотилей 4-5-дневных проростков, который позволяет в сжатые сроки (в течение 2 мес.) получить высокий выход генетически однородных растений. Впервые показана возможность регенерации растений у гречихи через стадию формирования ПЭКК (проэмбриогенных клеточных комплексов) из прокамбиальных клеток обкладки сосудистых пучков.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные представляют интерес для специалистов, изучающих процессы дедифференциации, дифференциации и морфогенеза в растительных клетках и тканях. Разработанные нами методы регенерации могут найти применение в области биотехнологии и генетики для интенсификации процесса селекции гречихи. Экспериментальный материал может быть использован для чтения лекций по курсу "Биотехнология растений".

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Международном симпозиуме "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), IV Международном симпозиуме по гречихе (Орел, 1989), Ш Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки" (Казань, 1990), II съезде ВОФР (Минск, 1990), VII Международном симпозиуме по протопластам "Progress in Plant Protoplast Research" (Швеция, 1991), итоговой научной конференции Казанского научного центра РАН (1990), II Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1996), X конгрессе FESSP;"From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach" (Италия,

1996), VIII Международной конференции эмбриологов растений (Польша, 1997), II (X) съезде Русского ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков" (Санкт-Петербург, 1998), VII Международном симпозиуме по гречихе "Advances in Buckwheat Research" (Канада, 1998), II Международном симпозиуме по биотехнологии (Украина, 1998), III Международном симпозиуме "Recent Advances in Plant Biotechnology" (Словакия, 1999), IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), VIII Международном симпозиуме по гречихе "Advances in Buckwheat Research" (Корея, 2001), 17 Международной конференции по регуляторам роста растений (Чехия, 2001), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), Международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), VIII Международной конференции «Биология растительной клетки in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003), V Международном симпозиуме "Recent advances in Plant Biotechnology" (Словакия, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 32 рисунка. Список использованной литературы включает 359 источников, в том числе 295 - иностранных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследований была выбрана гречиха культурная, Fagopyrum esculentum Moench., сорта Казанская крупнозерная. _ _

Для получения проростков семена стерилизовали 10 мин в 7% растворе NaOCl, трижды промывали стерильной дистиллированной водой, высаживали в чашки Петри на раствор 1 мМ СаС12-2Н20, дополненный 0,8% агаром, и проращивали в темноте в термостате при 25-26°С.

Выделение и культивирование протопластов и регенерация из них растений. В качестве источника протопластов использовали: гипокотили 6-дневных этиолированных, асептически выращенных растений; рыхлый, пассируемый через 25-30 суток каллус, полученный из незрелых зародышей; первые настоящие листья стерильно выращенных растений (5000 лк) в условиях 16/8 (свет/темнота) часового фотопериода.

Протопласты выделяли на среде CPW 13М (Power, Chapman, 1985), используя ферментные препараты: коммерческие - Cellulase Onozuka R-10 ("Yacult Pharmaceutical Industry Co.", Япония), Macerozyme R-10 ("Yacult Honsha Co.", Япония), Driselase ("Sigma",

США) - и отечественные - Целлюлазу (продуцент - Trichoderma viride) и Пектиназу (продуцент - Aspergillus foetidus), предоставленные Институтом биохимии им. А. Н. Баха РАН. Оценку жизнеспособности протопластов проводили с помощью окраски эозином G (0,1%) в среде CPW 14М. Очистку проводили методом флотации в среде CPW 21S (Power, Chapman, 1985). Протопласты культивировали на среде SVS (Сидоров и др., 1985). Регенерацию растений из протопластов осуществляли на среде В5 (Gamborg, 1968) с 0,175 мг/л ИУК, 2,23 мг/л БАП.

Регенерация растений через соматический эмбриогенез и геммогеиез из тканей гипокотилей

Эксплантами служили разрезанные вдоль пополам отрезки гипокотилей длиной 0,6-0,7 см 4-5-дневных этиолированных проростков.

Экспланты инкубировали на питательных средах В5 и в некоторых случаях - MS (Murashige, Skoog, 1962). Твердые среды дополняли 0,8% агаром. При культивировании на твердых средах экспланты ориентировали срезом вниз. В случае использования жидких сред экспланты (по 20, 40 шт. в колбе в зависимости от условий опыта) культивировали в конических колбах (100 мл) в 20 мл среды на качалке при 130 об/мин в темноте и на свету (5 000 лк).

Принципиальная схема экспериментов

Среда!

Среда И —Среда -регенерации

Условия культивирования

Безгормоиальная среда

1

_ 2,4-Д Гормоны 4,0-15,0 мг/л 2,4-Д 0,0-2,0 мг/л ИУК-0,175 мг/л БАП-2,23 мг/л -

Физическое жидкая, состояние твердая среды жидкая, твердая жидкая, твердая жидкая, твердая

Сахароза 30 или 100 г/л 30 или 100 г/л 30 или 100 г/л 30 г/л

Время культиви- роваиия, 40 1 вариант, дни - 30 до появления морфогенетического отклика

Время культивирования, 7-14 2 вариант, дни 30 30 до появления морфогенетического отклика

При проведении экспериментов в среды культивирования добавляли гормоны: Среда I- 2,4-Д (6,0-15,0 мг/л); Среда II - 2,4-Д (0,0-2,0 мг/л);

Среда регенерации - ИУК - 0,175 мг/л и БАП - 2,23 мг/л.

Во время культивирования эксплантов на среде I или на среде II на эксплантах появлялись проэмбриогенные клеточные комплексы (ПЭКК). После этого их переносили на среду регенерации на срок до 3-х недель, а затем - на безгормональную среду. К концу культивирования на среде регенерации или в начале культивирования на безгормональной среде наблюдали образование соматических зародышей и почек. На безгормональной среде зародыши и почки прорастали, развиваясь в растения-регенеранты, которые в дальнейшем размножали микрочеренкованием на безгормональной среде.

Дитогенетический анализ. Для цитогенетического анализа использовали кончики корешков растений-регенерантов. Контролем служили корешки двухдневных проростков, выращенных in vivo и in vitro. Кончики корешков выдерживали в 0,03% растворе колхицина (2-3 часа) или в насыщенном растворе 8-оксихинолина (3-4 часа). Для фиксации использовали уксусный алкоголь (этиловый спирт: уксусная кислота - 1:3), после чего проводили окраску пропионовым орсеином (36 часов) и готовили давленые препараты (Паушева, 1988). Для получения достоверных данных подсчет числа хромосом проводился не менее чем в 30 метафазных пластинках (Стрельчук, 1984). Сравнение выборочных долей проводили при 5% уровне значимости. После подсчета хромосом в метафазных пластинках проводили распределение клеток по классам плоцдносга.

Препараты, предназначенные для учета аберраций, готовили аналогичным способом, исключая предобработку корешков в колхицине и 8-оксихинолине. Применяли анафазно-телофазный метод учета аберраций.

и Приготовление гистологических препаратов проводили по стандартной методике (Киясов, 1998). Срезы окрашивали гематоксилин-эозином (Меркулов, 1961). Фотографирование препаратов производилось на микроскопе "Jenamed" (Германия) с помощью фотоприставки "Reichert" (Австрия).

: Для биохимического анализа растений-регенерантов использовали зеленые части *

регенерантов и контрольных растений, выращенных in vitro. После удаления пигментов водорастворимые белки экстрагировали 0,025 мМ трисглициновым (Tricin) буфером. Содержание белка в экстракте определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976). ■ Полученные белки подвергали осаждению трихлоруксусной кислотой.

Одномерный электрофорез белков с ДЦС-Na проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1978) в градиентном (6-16%) полиакриламидном геле (ПААГ). Гели окрашивали 0,1% раствором Кумасси G-250. Полученные электрофореграммы белков сканировали и

обрабатывали с помощью статистических программ "Scion Image" и "Mathcad 2000 Professional" (www.scioncorp.com).

В каждом варианте опыта использовали не менее 120 эксплантов. Все опыты проводились не менее чем в трех биологических повторностях. В некоторых таблицах приводятся данные наиболее характерного опыта.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Регенерация растений через протопласты

Большое влияние на выход протопластов, их жизнеспособность и регенерационную активность оказывают выбор ферментных препаратов и их концентрация. Опыты показали, что эффективность выделения протопластов при использовании отечественных ферментных препаратов в концентрациях 0,16% сопоставима с эффективностью выделения протопластов коммерческими препаратами, применяемыми в значительно более высоких концентрациях (табл.1; табл. 2, варианты I, II). Следует отметить, однако, что в случае использования коммерческих ферментов при почти одинаковом общем выходе протопластов из тканей гипокотилей количество жизнеспособных протопластов было гораздо выше.

Влияние композиции, составленной из различных ферментных препаратов, на эффективность выделения протопластов хорошо видно по данным, представленным в таблице 2. Так, удаление из раствора ферментов препарата "Driselase" (композиция II) снижает общий выход протопластов, увеличивая при этом выход жизнеспособных протопластов. В таблице 2 приведены также результаты сравнительного сопоставления действия коммерческого препарата Cellulase Onozuka R-10 и отечественного препарата Целлюлаза в однотипных ферментных композициях (I и III). Из таблицы видно, что замена

Таблица 1. Эффективность выделения протопластов из гипокотилей проростков гречихи при различных концентрациях отечественных препаратов.

Концентрация ферментов в растворе, % Выход протопластов Жизнеспособность, %

Целлюлаза Пекгиназа из 1 г ткани ■ 105

0,16 0,16 8,0 ±1,27 17,7

0,16 0,8 7,3 ±0,51 15,5

0,8 0,16 6,8 ±0,75 16,8

0,8 0,8 6,0 ±0,58 12,3

Таблица 2. Эффективность выделения протопластов из гипокотилей проростков гречихи при использовании различных ферментных систем.

Состав ферментной композиции Выход

Жизнеспособность,

протопластов из 1 г ткани • 105

Наименование ферментных препаратов Концентрация, % %

OnozukaR-lO 1,0

I Macerozyme R-10 0,6 7,8 ±1,09 30,5

Driselase 0,25

jj OnozukaR-lO 1,0 5,6 ±1,32 38,3

Macerozyme R-10 0,6

Целлюлаза 0,16

III Macerozyme R-10 0,6 12,8 ±1,0 26,6

Driselase 0,25

целлюлазного препарата японского производства на отечественный в концентрации в 6 раз меньшей повышала более чем в полтора раза абсолютный выход протопластов при практически одинаковой жизнеспособности протопластов в обоих опытах.

Нами также было проведено изучение эффективности выделения протопластов из гипокотилей, листьев и каллусных тканей культурной гречихи. Из таблицы 3 видно, что ткани листа оказались самыми устойчивыми к ферментативному лизису отечественными ферментами - для выделения протопластов из листьев требовалась в 2 раза бблыная их концентрация, чем при выделении протопластов из гипокотилей и каллуса. Следует отметить, что эти данные находятся впротиворечии с известным мнением о том, что по сравнению с другими тканями при выделении протопластов из каллуса требуются более концентрированные ферментные растворы (Сидоров и др., 1985). То, что эффективность выделения протопластов из листьев оказалась на два порядка выше выхода протопластов из тканей гипокотилей и каллуса, можно объяснить малыми размерами клеток листьев растений, выращенных в стерильных условиях и, соответственно, большим их количеством на единицу массы ткани.

Другим интересным фактом стал в 3-4 раза больший выход жизнеспособных протопластов из тканей листьев и каллуса по сравнению с тканями гипокотилей. При этом обращает на себя внимание более высокая жизнеспособность протопластов, полученных с помощью отечественных ферментных препаратов (табл. 3).

С целью определения влияния ферментных растворов на морфогенетическую активность протопластов, последние, после выделения из тканей гипокотилей и очистки, культивировали на искусственной питательной среде. Протопласты начинали образовывать клеточную стенку на второй день после выделения независимо от использованной ферментной системы. Однако дальнейшее развитие регенерировавших клеточную стенку протопластов наблюдалось только у тех из них, которые были получены из тканей гипокотилей с использованием отечественных ферментных препаратов. Клетки приступали к делению на 5-й день, а на 17-й в микроколониях насчитывалось в среднем по 8-10 клеток. Регенерация нескольких нормальных по морфологии растений из образовавшихся каллусных колоний наблюдалась через 9 месяцев.

В литературе известен только один случай регенерации растений гречихи из протопластов. Через 1,5 года культивирования (т.е. в 2 раза дольше) группе исследователей (АёасЫ е1 а!., 1989) удалось получить из пассируемого каллуса несколько

Таблица 3. Эффективность выделения протопластов из различных тканей культурной гречихи.

Вид ткани Состав ферментной композиции Концентрация ферментов, % Выход протопластов из 1 г ткани Жизнеспособность, %

Гипокотиль Целлюлаза Пектиназа 0,16 0,16 8,0 ±1,27 СЮ5) 17,7

Лист Целлюлаза Пектиназа 0,16 0,16 — —

Целлюлаза Пектиназа 0,32 0,32 8,5 ±0,8 (-107) 63,0

ОпошкаЯ-Ю Масегогуте Я-10 МввЫе 1,0 0,6 0,25 8,5 ±3,0 (-107) 54,0

Каллус Целлюлаза Пектиназа 0,16 0,16 6,9 ±0,2 (-105) 70,0

Опогика 11-10 Масегогуте Я-10 Энве^е 1,0 0,6 0,25 5,8 ±0,13 (-105) 34,0

побегов и эмбриоидов. Все растения имели аномальную морфологию и не цвели.

Несмотря на то, что мы получили регенерацию растений из культивируемых протопластов /\ езсикмит, стоит отметить, что в целом регенерационная активность полученных из протопластов каллусов была низкой, а период, необходимый для регенерации, - длительным. Исходя из полученных нами результатов, а также литературных данных, можно прийти к следующему заключению: культивирование протопластов у гречихи в настоящее время не является гарантирующим успех методом.

2.2. Регенерация растений через соматический эмбриогенез и геммогенез из тканей гипокотилей

Альтернативой использования техники культивируемых протопластов может являться постановка методов "быстрой" регенерации растений. Одним из эффективных решений в этом случае может быть разработка приемов индукции органогенеза и соматического эмбриогенеза без стадии образования и пассирования каллусных культур.

2.2.1. Образование проэмбриогенных клеточных комплексов. Факторы, влияющие на их образование

Концентрация, и длительность воздействия 2,4-Д на экспланты. В экспериментах мы опробовали различные схемы культивирования эксплантов на жидких средах с варьированием концентрации 2,4-Д: 1) длительное культивирование эксплантов на среде с 2,4-Д - 4,0-6,0 мг/л; 2) прекультивирование эксплантов в течение 4-х или 8 дней на среде I с высокой концентрацией 2,4-Д от 6,0 мг/л до 15,0 мг/л с последующим культивированием их на среде II с концентрацией 2,4-Д от 0,0 до 2,0 мг/л.

В процессе культивирования на эксплантах развивались шарообразные структуры,

состоящие из мелких, плотно приле-

-— гающих друг к другу клеток - проэм-

бриогенные клеточные комплексы (ПЭКК) (рис. 1). Следует отметить, что при индукции соматического эмбриогенеза у гречихи другие исследователи не отмечали появления подобных глобулярных структур непосредственно в тканях эксплантов.

Наши исследования показали, что различные схемы культивирования эксплантов на средах с 2,4-Д заметно влияли на скорость образования ПЭКК на эксплантах и на

Рис. 1. Эксплант из гипокотиля гречихи в, среде II с развившимися на нем проэмбриогенными клеточными комплексами.

Таблица 4. Время появления ПЭКК в среде II в зависимости от длительности культивирования эксплантов из гипокотилей гречихи в среде I и концентрации 2,4-Д в среде II.

Продолжительность культивирования эксплантов на среде I (2,4-Д- 6 мг/л) Содержание 2,4-Д в среде И, мг/л

0,1 1,0 2,0

4 сут не развивались 31 сут 25 сут

8 сут 37 сут 17 сут 13 сут

количество эксплантов, образующих ПЭКК. В первом случае ПЭКК на эксплантах появлялись через шесть недель культивирования. Во втором случае для образования ПЭКК требовалось времени тем меньше, чем дольше экспланты выдерживали на среде I, и чем выше была концентрация гормона в среде П (табл. 4).

Таким образом, основным условием образования ПЭКК непосредственно в тканях экспланта можно считать прекультивирование эксплантов на среде с повышенным содержанием одного ауксина - 2,4-Д, а фактором, ускоряющим их появление, - снижение концентрации этого гормона при дальнейшем культивировании.

Минеральная основа среды культивирования эксплантов. Нами установлено, что на процесс образования ПЭКК в культуре гипокотилей гречихи оказывает влияние не только гормональный статус среды. Так, замена в среде культивирования минеральных солей В5 на Мв вызвала изменение картины морфогенетического отклика у эксплантов. На средеП с солями В3 в отсутствии 2,4-Д на эксплантах развивались корни нормальной морфологии, а на той же среде с концентрацией 2,4-Д от 0,1 до 2,0 мг/л - ПЭКК. На среде II с минеральными солями МБ, в зависимости от содержания 2,4-Д, наблюдали: без 2,4-Д - корни нормальной морфологии; при концентрации 0,1 мг/л - короткие утолщенные корни; при 0,5 мг/л - структуры, имеющие промежуточную морфологию между корнями и ПЭКК; при 1,0 мг/л - обычные ПЭКК; при 2,0 «г/л - каллусирующие, разросшиеся ПЭКК. Возможно, такое различие в проявлении морфогенетического отклика связано с разным соотношением азот/фосфор в составах этих солей или соотношением азот/ауксин в среде.

Конпентрапия сахарозы в среде культивирования. Полученные нами результаты также говорят о сильном влиянии концентрации сахарозы на образование ПЭКК и способность к регенерации у эксплантов гречихи. Из данных, приведенных в таблице 5, видно, что культивирование эксплантов на среде I с содержанием сахарозы 25 г/л способствовало образованию ПЭКК у 80% эксплантов против 5% в контроле (100 г/л сахарозы). Следует отметить, что при низком содержании сахарозы в среде I практически

Таблица 5. Влияние концентрации сахарозы в средах I и II на процесс образования ПЭКК эксплантами гречихи.

Среда 1(2,4-Д-8,0 мг/л) Среда II (2,4-Д - 2,0 мг/л)

Концентрация сахарозы, г/л Экспланты с ПЭКК, % Концентрация сахарозы, г/л Экспланты с ПЭКК, %

25 80 ±4 25 100 96 ± 2 95 ±2

100 5 ± 2 25 100 82 ±3 80 ±3

все экспланты при переносе в среду II образовывали ПЭКК. Интересно, что концентрация сахарозы в среде II в этот момент уже не имела значения.

На среде I с содержанием сахарозы 100 г/л ПЭКК на эксплантах почти не развивались. Они появлялись только после переноса эксплантов на среду II. Количество эксплантов с ПЭКК в этом случае было на 15-20% меньше, чем в предыдущем варианте и также уже не зависело от содержания сахарозы в среде И.

Несмотря на меньшее число эксплантов, образующих ПЭКК в среде II после культивирования на среде I с высоким уровнем сахарозы, именно эти экспланты к концу культивирования могли образовывать соматические зародыши. Таким образом, низкое содержание сахарозы в среде I препятствовало в дальнейшем образованию соматических зародышей из ПЭКК даже в том случае, если их в дальнейшем культивировали на среде II с концентрацией сахарозы 100 г/л.

Увеличение морфогенной активности эксплантов при высокой концентрации углевода в среде может являться результатом не столько усиления питания, сколько повышения осмотического потенциала среды и проявления регуляторной роли сахарозы (Iraqi, Tremblay, 2001).

Плотность культивирования эксплантов. В ходе изучения условий культивирования эксплантов гречихи нами было показано, что плотность и количество совместно культивируемых эксплантов существенно влияют на эффективность образования ПЭКК. Из таблицы б видно, что при увеличении в два раза плотности и количества совместно культивируемых эксплантов ПЭКК начинали развиваться в обоих случаях практически одновременно, однако скорость образования ПЭКК при меньшей плотности культивирования была в два раза ниже, чем при высокой, и на 15-й день

Таблица 6. Влияние количества и плотности совместно культивируемых эксплантов на образование ПЭКК при культивировании на среде II.

Количество совместно культивируемых эксплантов Плотность культивирования эксплантов, эксплант/мл среды Время начала образования ПЭКК, сут Количество эксплантов, образовавших ПЭКК на 15 сутки, %

20 1 5-6 10

40 2 5-6 21

4 2 15 1,7

культивирования ПЭКК образовали только 10% эксплантов против 21% соответственно. Уменьшение количества совместно культивируемых эксплантов в 10 раз при одинаковой плотности культивирования приводило к увеличению в три раза времени, необходимого для начала образования ПЭКК, и к резкому сокращению количества эксплантов (до 1,7%), способных к их образованию.

В настоящее время известно, что культивируемые клетки секретируют в питательную среду множество молекул, являющихся в основном компонентами клеточной стенки. Часть из них является факторами кондиционирования, влияющими на жизнеспособность, пролиферативную активность и морфогенетические свойства культивируемых клеток. Содержание факторов кондиционирования в клетке является результатом трех процессов - образования, выделения в среду и поглощения из среды (Еникеев и др., 2000). При большом количестве клеток в единице объема среды содержание факторов кондиционирования в клетке достаточно для их деления. Когда же на каждую клетку приходится большой объем среды, то выделение факторов кондиционирования из клеток не компенсируется обратным поглощением, и их содержание в клетках становится недостаточным для деления. Именно этим, скорее всего, объясняется в наших опытах положительное влияние большой плотности и большого количества совместно культивируемых эксплантов на количество и скорость образования ПЭКК.

Положение экспланта по длине гипокотиля. Морфогенетический градиент может проявляться в зависимости от местонахождения экспланта в растении. Нами было показано также, что экспланты из разных участков гипокотиля и проростки гречихи в целом обладали разной способностью к формированию ПЭКК. Экспланты из апикальных и базальных участков гипокотилей опережали экспланты из центральной части по скорости формирования ПЭКК. Кроме того, количество эксплантов, образующих ПЭКК и

58

продолжительность культивирования, сут

Рис. 2. Способность эксплантов из различных участков гипокотилей к образованию ПЭККна среде П (а - апикальная часть, б - базальная часть, ц -центральная часть гипокотиля).

взятых из апикальных и базальных участков гипокотилей, в среднем в 1,5-2 раза превышало количество эксплантов с ПЭКК, взятых из средней части гипокотилей (рис. 2).

Следует отметить также, что только у 80% проростков экспланты были способны к образованию ПЭКК. Из этого количества 3/4 проростков реализовали морфогенетическую программу с высокой частотой (ПЭКК формировали более 50% эксплантов с каждого проростка).

2.2.2. Гистологическое исследование процесса формирования ПЭКК

Гистологические исследования показали, что ПЭКК на эксплантах возникают из прокамбиальных клеток обкладки сосудистых пучков. Уже на 4-е сутки культивирования эксплантов на среде II происходит активация делений в этой области, а на 6-е сутки ясно виден образующийся в тканях ПЭКК. Поверхность ПЭКК состоит из 2-3 рядов рыхло расположенных слущивающихся клеток; глубже находятся тесно прилегающие друг к другу меристематические клетки

с большими ядрами и* плотно окраши- Рис. 3. Поперечный срез экспланта с

„ ~ „ формирующимся ПЭКК на 6-й день

ваемои цитоплазмой. Середина ПЭКК т г "

культивирования в среде II.

заполнена сильно вакуолизированными клетками. Такое строение характерно для ПЭКК других растений (Батыгина и др., 1978). По мере развития ПЭКК происходит выпячивание его на поверхность экспланта, у его основания формируются ряды крупно вакуолизированных клеток, ПЭКК отделяется от экспланта и выпадает в среду культивирования.

2.2.3. Регенерация растений из проэмбриогенных клеточных комплексов

В конце культивйрования среде регенерации или в начале культивирования на безгормональной среде На эксплаЩ-ах появлялись соматические зародыши (рис. 4) и реже -почки. По нашим наблюдениям, регенерация растений из ПЭКК может происходить тремя способами:

1. образование соматических зародышей из клеток ПЭКК;

2. образование почек из клеток ПЭКК;

3. превращение (реорганизация) целого ПЭКК в прорастающий зародыш.

Процесс соматического эмбриогенеза развивался асинхронно, что также отмечалось Нешкович с соавт. (Ые8коу"1б е( а!., 1987). На одном экспланте можно было наблюдать зародыши на разных стадиях развития. При этом соматические зародыши, как правило, проходили все характерные для них стадии развития и имели нормальную морфологию. Образовавшиеся соматические зародыши и почки переносили затем на безгормональную среду, где они прорастали (рис. 5) и развивались в растения. Изредка при прорастании

? J 'V

зародышей отмечалось недоразвитие семядолей.

Следует отметить, что число эксплантов, образующих соматические зародыши, составляло 24% от общего количества эксплантов. В то же время количество эксплантов, способных к образованию почек, составляло только 6-8%, то есть соматический эмбриогенез был доминирующим путем регенерации.

Необходимо отметить, что крайне редко на одном экспланте можно было наблюдать образование и зародышей, и почек одновременно. В отличие от наших результатов, Нешкович с соавт. (Ые5коу{с е1 а1., 1987) отмечали одновременное развитие соматических зародышей и почек.

Соматический эмбриогенез -сложный процесс, в котором количество конечного продукта, т. е.

Рис. 4. Образование соматических зародышей на эксплантах гречихи при переносе их на безгормональную среду.

Рис. 5. Прорастающий соматический зародыш гречихи.

выживание и рост регенерировавших растений, зависит от условий, имеющихся на ранних стадиях. Проведенные нами эксперименты позволили установить, что для развития соматических зародышей из ПЭКК необходимо выполнение нескольких условий.

Во-первых, па процесс образования зародышей из ПЭКК очень большое влияние оказывает концентрация 2,4-Д в среде I. Чем она выше, тем быстрее появляются зародыши. По-видимому, концентрация 2,4-Д - 6,0 мг/л является пороговой для этого процесса, поскольку при этой концентрации можно добиться образования зародышей, только увеличив в два раза время культивирования эксплантов на среде II.

Во-вторых, обязательным является этап культивирования эксплантов с ПЭКК на среде регенерации, содержащей б-БАП, а затем - на безгормональной среде.

В-третьих, физическое состояние среды культивирования, а именно замена жидкой среды регенерации на агаризованную, также способствует развитию соматических зародышей. Таким образом, оптимизация схемы культивирования позволила нам сократить время, необходимое для получения соматических зародышей,' до 63 дней, что значительно меньше срока (4 мес.), о котором сообщал ЬасЬтапп (1991).

2.2.4. Анализ растений-регенерантов на сомаклональную вариабельность

Известно, что растения, полученные в культуре, подвергаясь воздействию различных факторов (главным образом гормональной природы), могут отличаться от исходных форм. При анализе растений-регенерантов на сомаклональную вариабельность мы оценивали фенотипическую, цитогенетическую (хромосомные числа, хромосомные аберрации) и биохимическую (спектры растворимых белков) изменчивость.

Фенотипический анализ регенерантов. В целом, практически все растения, полученные нами в процессе регенерации, имели нормальный морфотип. Отклонения выражались в меньших размерах листовых пластинок, увеличении количества междоузлий, их утолщении и уменьшении длины междоузлий. Однако постепенно, в процессе микроклонального размножения, растения этих линий приблизились к фенотипу, сходному с фенотипом регенерантов других линий. Видимо, это явление не связано с устойчивыми изменениями генома, а скорее объясняется эпигенетической изменчивостью и размахом варьирования признаков в пределах исходного вида.

Цитогеиетический анализ регенерантов. Проведенный нами цитогенетический анализ 30 линий растений-регенерантов, выращенных из соматических зародышей и почек, показал, что подавляющее большинство из них имеют основной модальный класс хромосом 2п=16 (рис. 6).

Все полученные линии регенеран гов по набору хромосомных чисел можно условно разделить на три группы (рис. 6): - ~

1) растения с распределением хромосомных чисел, близким к контролю. К этой группе можно отнести линии Э.5, Э.6, Э.12, Э.16, Э.25, Э.30, Э.36, Э.(2-1), П.7(8), П.Щ2-1);

2) растения с распределением хромосомных чисел, отличающимся от контрольного в сторону преобладания диплоидного набора. В эту группу можно поместить растения линий Э.1, Э.24, Э.31. Э.ЗЗ, Э.35, Э.40, Э.43, Э.1(6), П. 11(8), П.Ц2-1), П. 10(2-1), П. 13(2-1), П. 15(2-1). П. 17(2-1);

3) растения, у которых уровень диплоидных клеток ниже, чем в контроле, а число анеуплоидных и полиплоидных клеток значительно выше - Э.21, Э.23, Э.39, 11.7(2-1). Возможно, эти растения представляют собой химеры, образовавшиеся в рез\льтате развития зародышей из нескольких клеток.

Согласно статистической обработке, только одна из всех изучаемых линий - Э.23 -имела долю диплоидных клеток ниже, чем в контроле. Таким образом, однородность среди полеченных регенерантов составила 96,6%.

Рис. 6. Распределение метафазных клеток но классам хромосом и доля аберрантных клеток у линий растений-регенерантов и в контроле.

Интересно, что количество диплоидных клеток в кончиках корней у растений, полученных через геммогенез, оказалось очень высоким (до 94%) и только у одной линии -П.18(2-1) - снижалось до 61,17%.

Хромосомные аберрации рассматривают как одно из проявлений сомаклональной изменчивости в культуре клеток и тканей, причинами которой могут быть как особенности исходного материала, так и сам процесс культивирования in vitro (Кунах, 1999). Наши исследования показали, что аберрации в клетках меристемы корней регенерантов были представлены мостами и отставаниями. Встречались также клетки, сочетающие в себе и те, и другие аберрации.

При разбросе долей хромосомных аберраций от 3,6% у растений линии Э.24 до 8,7% у растений линии Э.ЗО, в среднем доля аберрантных клеток составляла 5,75%. Отклонение опытных показателей от контрольных находилось в пределах ошибки выборочной доли, что доказывает отсутствие статистически достоверной разницы между исследуемыми вариантами.

Низкая частота хромосомных аберраций как у контрольных, так и у опытных растений может быть обусловлена особенностями происхождения соматических зародышей и проэмбриональных клеточных комплексов. Как показало гистологическое исследование, ПЭКК формировались из прокамбиапьных клеток обкладки сосудистого пучка. Эти клетки относятся к меристематической ткани, которая содержит преимущественно диплоидные клетки.

Биохимический анализ регенеиантов. Электрофорез растворимых белков широко используется как наиболее простой и достаточно эффективный способ биохимического анализа растений-регенерантов. Электрофорез белков позволяет непосредственно увидеть продукт экспрессии гена и на уровне белка оценить генетическую вариабельность.

Мы изучали спектры растворимых белков как у растений, полученных через соматический эмбриогенез, так и растений, полученных через геммогенез. Характеризуя электрофореграммы в целом, можно говорить только о количественных, а не о качественных изменениях, затронувших процесс синтеза белка у регенерированных растений, т. е. только об изменении степени экспрессии отдельных генов. При этом следует отметить два белка: белок с М 16,59 кДа, который практически не прослеживается в контроле и у линий растений, полученных из почек, и белок с М 18,62 кДа, который наоборот, характерен в основном для линий, полученных из почек, но отсутствует в регенератах "эмбриогенного" происхождения.

Вариабельность в экспрессии белков у растений-регенератов можно объяснить тем, что эксплантами служат растения и проростки, получаемые из разных семян смешанной популяции. Гречиха является перекрестноопыляемым растением, вследствие чего все

растения даже одного сорта можно рассматривать как гибридные, не совсем однородные по морфологическим и биологическим признакам (Кротов, 1975). Такие растения демонстрируют повышенную вариабельность и в культуре in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Морфогенез - сложный интегральный процесс, регуляция которого осуществляется на клеточном, тканевом и организменном уровнях взаимозависимой системой физических и химических факторов, определяющих процессы деления, растяжения, дифференцировки, старения и смерти клеток.

Культура растительных клеток, тканей и органов может быть использована как модель для изучения механизма дифференциации и путей морфогенеза. Применение этого экспериментального подхода открывает новые перспективы для познания и управления процессом онтогенеза, а также для создания новых форм растений.

Проведенные нами исследования позволили выявить ряд факторов, ключевых для развития эмбриогенной программы в культуре гипокотилей гречихи культурной F. esculentum - объекта, у которого этот процесс изучен крайне недостаточно. Нами установлено, что соматический эмбриогенез в гипокотилях гречихи осуществляется через образование ПЭКК, т. е. непрямым путем. Гистологически доказано, что способностью к образованию ПЭКК обладают прокамбиальные клетки сосудистых пучков гипокотилей. Выявлено, что для индукции ПЭКК из этих клеток критичными являются уровень 2,4-Д в среде, содержание осмотика, минеральный состав среды, а также положение экспланта по длине гщюкотиля и плотность культивирования эксплантов. Последнее свидетельствует о том, что в регуляции дифференцировки ПЭКК, кроме выявленных нами гормональных и трофических факторов, принимают участие секретируемые молекулы; важным также — является"эндогенный "уровень^гормонов в определенной "части гипокотиля. Впервые установлено, что ПЭКК при одних и тех же условиях культивирования тканей гречихи могут формировать либо эмбриоиды, либо почки, что свидетельствует о пластичности ПЭКК и различной компетенции их поверхностных клеток, которая, по всей вероятности, определяется эндогенным уровнем гормонов в экспланте. .

Особенно следует отметить, что межклеточные взаимодействия являются одним из ключевых факторов, влияющих на реализацию морфогенного потенциала в тканях гипокотилей. Нарушение таких взаимодействий при выделении протопластов из гипокотилей кардинально меняет их морфогенную компетенцию: ми ни разу не наблюдали при культивировании протопластов неравных делений и развития ПЭКК, регенерация растений из протопластов шла только через геммогенез. Удаление клеточной стенки является жестким воздействием, последствия которого могут сказываться не только

на процессе восстановления клеточной стенки, но и на более отдаленных процессах, таких как пролиферация и морфогенетическая активность протопластов. Поэтому важен установленный нами факт наличия морфогенной способности у протопластов, полученных с помощью ферментов, прошедших специальную очистку.

Несмотря на двукратное сокращение временного интервала, необходимого для регенерации растений в культуре протопластов по сравнению с описанным ранее способом (с 1,5 лет до 9 месяцев), протопластная технология для гречихи на современном этапе исследований не может быть признана удачной. К ее основным недостаткам могут быть отнесены следующие: низкая эффективность регенерации, регенерация через геммогенез с возможным получением химер, длительное пребывание в условиях in vitro, стимулирующих сомаклональную изменчивость. Как показали наши исследования, разработанный нами способ регенерации растений из тканей гипокогилей через непрямой соматический эмбриогенез значительно снижает риск появления сомаклональных вариантов и дает высокий выход генетически однородных растений-регенерантов в сжатые сроки (через 2 месяца культивирования).

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы выделения и культивирования протопластов из тканей гипокотилей гречихи. Установлена высокая эффективность отечественных ферментных препаратов, предоставленных Институтом биохимии им. А. Н. Баха, по сравнению с коммерческими ферментными препаратами импортного производства.

2. Получена регенерация растений из протопластов гипокотилей гречихи культурной. Показана низкая эффективность регенерации из протопластов гипокотилей гречихи при длительном периоде культивирования in vitro.

3. Впервые разработан способ регенерации растений гречихи культурной через соматический эмбриогенез из гипокотилей 4-5-дневных проростков, позволяющий в сжатые сроки (в течение 2 мес.) получить высокий выход генетически однородных растений.

4. Установлено, что при осуществлении разработанного способа преимущественное образование соматических зародышей сопровождается одновременным развитием вегетативных почек. При этом каждая морфогенетическая программа реализуется, как правило, у разных эксплантов.

5. Показано, что регенерация растений и при соматическом эмбриогенезе, и при геммогенезе осуществляется путем формирования проэмбриогенных клеточных комплексов (ПЭКК) из прокамбиальных клеток обкладки сосудистых пучков.

6. Выявлено, что на процесс развития ПЭКК в тканях гипокотилей гречихи и

регенерацию из них растений оказывают влияние следующие факторы: а) концентрация и длительность воздействия 2,4-Д на экспланты; б) минеральный состав среды культивирования; в) концентрация сахарозы; г) плотность культивирования эксплантов; д) местонахождение экспланта в гипокотиле; е) наличие этапа культивирования эксплантов на среде регенерации с БАП; ж) физическое состояние среды культивирования.

7. Цитогенетический и биохимический анализы растений-регенерантов показали, что при осуществлении разработанного метода получения соматических зародышей и почек в высокой степени сохраняется исходный генотип и однородность регенерированных растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Возможности использования методов культуры клеток и тканей в селекции гречихи: Труды межд. симп. "Биология культивируемых клеток и биотехнология". Новосибирск, СССР, август 1988 г.- Новосибирск, 1988.-450 с.

2. Румянцева Н. И., Сергеева Н. В., Хакимова Л. Э., Сальников В. В., ГумероваЕ. А., Лозовая В. В. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи//Физиология растений.-1989.-Т.Зб,№ 1.-С. 187-194.

3. Morphogenesis and plant regeneration in buckwheat tissue culture: Proc. of 4th Intern. Symp. on Buckwheat. Orel, USSR, July 1989.-OreI, 1989.-575 p.

4. Перспективность использования новых отечественных ферментных препаратов для получения протопластов высших растений: Тез. докл. III Всесоюзн. конф. "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки". Казань, июнь 1990 г.-Казань, 1990.-150 с.

5. Биотехнология в селекции гречихи: Тез. II съезда ВОФР. Минск, сентябрь 1990 г.Минск, 1990.-176 с.

6. Gumerova Е. A. Regeneration of plantlets from protoplasts of Fagopyrum esculentum Moench. // Proceedings of 7th Intern. Protoplast Symposium "Progress in Plant Protoplast Research", Uppsala, Sweden, June 1991.-Physiol. Plant.-199l.-V. 82, N 1-A 19.

7. Factors determined low cellulose content in cell wall regenerated by plant protoplasts: Abstr. 6th Cell Wall Meeting, Nijmegen, the Netherlands, August 1992.-the Netherlands, 1992.-308 p.

8. Гумерова E. А., Румянцева H. И., Лозовая В. В., Селиванов М. С., Рабинович М. Л. Новые литические композиции ферментов для получения делящихся протопластов гречихи // Прикладная биохимия и микробиология.-1993.-Т. 29, № 4.-С. 591-596.

9. Разработка тест-системы на основе тонкослойных эксплантов гречихи: Тез. докладов II Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов. Казань, июнь-июль 1996 г.-Казань, 1996.-Т. 1.-110 с.

10. Gumerova Е., Rumyantseva N., Gatina Е. Morphogenic capacity of buckwheat small explants cultured in vitro II Proc. of 10th Federation of European Societies of Plant Physiology (FESPP) Congress "From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach", Florence, Italy, September 1996-Plant Physiol. Biochem.-1996.-Special issue.' P. 25.

11. Somatic embiyogenesis in different explants of two buckwheat species (F. esculentum * Moench., F. tataricum (L.) Gaertn.): Proc. of 8th Conf. of Plant Embiyologists from Poland,

Bohemia and Slovakia. Gdansk, Poland, September 1997-Poland, 1997.-150 p.

12. Получение эмбриогенной суспензионной культуры из тонкослойных эксплантов гипокотилей культурной гречихи (Fagopyrum esculentum Moench.): Тезисы докл. Ш Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов. Казань, октябрь 1997 г.-Казань, 1997.-128 с.

13. Образование проэмбриогенных структур в тканях гипокотилей гречихи культурной (Fagopyrum esculentum, Polygonaceae): Тезисы докл. II (X) съезда Русского ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков". Санкт-Петербург, май 1998 г.-Санкт-Петербург, 1998.-Т. 1.-398 с.

14. Gumerova Е., Rumyantseva N., Gatina Е. Formation of proembryogenic cell complexes in hypocotyl tissues of common buckwheat Fagopyrum esculentum Moench. // Proc. of 7th Intern. Symposium on Buckwheat "Advances in Buckwheat Research", Manitoba, Canada, August 1998.-P. 53-57.

15. Rapid obtaining of morphogenic culture of buckwheat F, esculentum Moench. through the direct formation of proembryogenic cell complexes: Proc. of П Intern. Symp. on Biotechnology. Kiev, Ukraine, Octoder 1998.-Ukraine, 1998.-327 p.

16. Peculiarities of proembryogenic cell complexes formation by the hypocotyl tissues of Fagopyrum esculentum seedlings: Abstr. 3th Symposium in the Series "Recent Advances in Plant Biotechnology" - "From Cells to Crops". Stara Lesna, High Tatras, Slovak Republic, September 1999,-Slovak Republic, 1999.-192 p.

17. Соматический эмбриогенез в тканях гипокотилей Fagopyrum esculentum Moench.: Тез. докл. IV съезда Общества физиологов растений России. Москва, октябрь 1999 г.Москва, 1999.-836 с.

18. Gumerova Е. A, Gatina Е. I., Chuenkova S. A, Rumyantseva N. I. Somatic embiyogenesis in common buckwheat Fagopyrum esculentum Moench. // Proc. of Vlllth Intern. Symp. on Buckwheat, Chunchon, Korea, August-September 2001.-P. 377-381.

19. Somatic embryogenesis in hypocotyl culture of F. esculentum: Abstracts of 17th Intern. Conf. on Plant Growth Substances. Brno, Czech Republic, September 2001.-Czech Republic, 2001.-208 p.

20. Цитогенетический анализ растений-регенерантов, полученных в культуре гипокотилей гречихи Fagopyrum esculentum: IV научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов республики Татарстан. Казань, декабрь 2001 г.Казань, 2001.-186 с.

21. Изучение вариабельности растений-регенерантов, полученных в культуре гипокотилей гречихи Fagopyrum esculentum: Труды Ш съезда биохимического общества. Санкт-Петербург, июнь-июль 2002 г.-Санкт-Петербург, 2002.-672 с.

22. Гумерова Е. А., Чуенкова С. А., Гатина Е. А., Румянцева Н. И. Соматический эмбриогенез и геммогенез в культуре гипокотилей Fagopyrum esculentum Moench. // Физиология растений.-2003.-Т. 50, № 5.-С. 716-721.

23. Protein polymorphism analysis of buckwheat (Fagopyrum esculentum) regenerants obtained in culture in vitro: Proc. Joint Intern. Conf. "New Geometry of Nature". Kazan, Russia, August-September 2003.-Kazan, 2003.-V. II.-452 p.

24. Somaclonal variation analysis of in vitro regenerated buckwheat plants Fagopyrum esculentum: Absrtracts of VIII Intern. Conf. "The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology". Saratov, Russia, September 2003.- Saratov, 2003.-P. 117-118.

25. Somaclonal variation analysis of somatic embiyos of common buckwheat Fagopyrum esculentum: Abstracts of 5th Intern. Symp. in the Series "Recent advances in Plant Biotechnology" - "Plant Biotechnology: Progress and Development". High Tatras, Slovak Republic, September 2003,-Slovak Republic, 2003.-187 p.

Отпечатано в ООО «Печатный двор». Казань, ул. Журналистов, 1/16. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.01 Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Заказ № К-1170. Формат 60x901/16. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Печать - ризография

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гумерова, Елена Азатовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Морфогенез в культуре клеток in vitro.

1.1.1. Типы морфогенеза.

1.1.2. Основные пути регенерации растений in vitro.

1.1.2.1. Гемморизогенез.

1.1.2.2. Соматический эмбриогенез.

1.1.2.3. Особенности регенерации растений из протопластов.

1.2. Сомаклональная вариабельность.

1.2.1. Уровни изменчивости генетического аппарата, наблюдаемые в культуре in vitro.

1.2.2. Факторы, обусловливающие сомаклональную изменчивость.

1.2.3. Предполагаемые механизмы сомаклональной изменчивости.

1.2.4. Подходы и методы выявления сомаклональной изменчивости.

1.3. Гречиха как объект для биотехнологических исследований.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Получение стерильных проростков.

2.2.2. Выделение и культивирование протопластов и регенерация из них растений.

2.2.3. Регенерация растений из тканей гипокотилей гречихи.

2.2.4. Цитогенетический анализ.

2.2.5. Гистологический анализ.

2.2.6. Биохимический анализ растений-регенерантов.

2.2.6.1. Выделение фракции растворимых белков.

2.2.6.2. Электрофорез белков.

2.2.7. Статистическая обработка результатов наблюдений.

2.2.7.1. Подсчет протопластов.

2.2.7.2. Анализ распределения хромосомных чисел у регенерантов.

2.2.7.3. Анализ аберраций у растений-регенерантов.

2.2.7.4. Анализ электрофореграмм белков.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Регенерация в культуре гипокотилей проростков гречихи.

3.1.1. Выбор экспланта.

3.1.2. Регенерация растений через протопласты.

3.1.2.1. Эффективность выделения протопластов при использовании различных ферментных композиций.

3.1.2.2. Культивирование протопластов и регенерация растений культурной гречихи.

3.1.3. Регенерация через соматический эмбриогенез и геммогенез.

3.1.3.1. Образование проэмбриогенных клеточных комплексов. Факторы, влияющие на их образование.

3.1.3.2. Гистологическое исследование процесса формирования ПЭКК.

3.1.3.3. Регенерация растений из проэмбриогенных клеточных комплексов.

3.2. Анализ растений-регенерантов на сомаклональную вариабельность.

3.2.1. Фенотипическая изменчивость.

3.2.2. Генетическая изменчивость.

3.2.2.1. Анализ хромосомных чисел.

3.2.2.2. Анализ хромосомных аберраций.

3.2.3. Биохимическая изменчивость.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реализация морфогенного потенциала гипокотилей гречихи культурной Fagopyrum Esculentum Moench. в зависимости от способа регенерации растений IN VITRO"

Методы культуры клеток и тканей широко используются как для проведения фундаментальных исследований, так и для решения практических задач. Успехи применения большинства методов in vitro связаны, главным образом, с возможностью регенерации растений. Существуют три основных пути регенерации растений in vitro - эмбриокультура, соматический эмбриогенез и органогенез. Однако, способов регенерации растений гораздо больше - в зависимости от выбора экспланта, условий культивирования и подхода к поставленной задаче. Можно проводить регенерацию растений, индуцируя к развитию апикальные, пазушные или адвентивные почки, микроклубнями, используя каллусные и суспензионные культуры, культивируя пыльники и семяпочки, применяя методы выделения и культивирования протопластов.

Культивируемые клетки и ткани растений являются пластичной системой, обладающей способностью изменять скорость пролиферации, интенсивность метаболизма, процессы дифференцировки в результате определенных химических и физических воздействий. Это свойство дает возможность подбора условий для максимальной реализации морфогенного потенциала культивируемого объекта.

Известные для гречихи культурной Fagopyrum esculentum способы регенерации осуществляются в основном через стадию каллусообразования и зачастую многократного пассирования каллусной культуры (Lachmann, 1991; Нао et al., 1998; Woo et al., 2000). Такой способ регенерации растений занимает много времени, и не всегда имеет высокую эффективность как в отношении количественного выхода регенерантов, так и их генетической однородности. Использование же в качестве эксплантов незрелых тканей или частей взрослых растений ставит опыты в зависимость от сезона. Поэтому разработка быстрых и эффективных способов регенерации растений из обладающих высоким морфогенным потенциалом, легкодоступных, асептически выращиваемых тканей является необходимым этапом для развития биотехнологии гречихи.

Цель настоящей работы заключалась в изучении морфогенетической способности тканей гипокотилей проростков гречихи культурной при различных способах регенерации растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способ регенерации растений из протопластов, выделенных из гипокотилей проростков гречихи культурной.

2. Провести сравнительную оценку эффективности (выход, жизнеспособность и регенерационная активность протопластов) отечественных ферментных препаратов, разработанных в Институте биохимии им. А. Н. Баха, и коммерческих препаратов импортного производства при выделении протопластов из тканей гипокотилей гречихи культурной.

3. Разработать способ регенерации растений гречихи культурной из тканей гипокотилей 4-5-дневных проростков.

4. Изучить действие различных факторов на образование проэмбриогенных клеточных комплексов в тканях гипокотилей гречихи и их регенерационный потенциал.

5. Провести гистологическое исследование процесса образования проэмбриогенных клеточных комплексов.

6. Провести цитогенетический анализ растений-регенерантов, полученных путем соматического эмбриогенеза и геммогенеза.

7. Провести сравнительный анализ спектров растворимых белков у линий растений-регенерантов.

Научная новизна работы. Установлена высокая эффективность отечественных ферментных препаратов, предоставленных Институтом биохимии им. А. Н. Баха, по сравнению с коммерческими ферментными препаратами импортного производства при выделении и культивировании протопластов из разных тканей гречихи. Впервые получены фенотипически нормальные растения при регенерации растений из протопластов гречихи; время, необходимое для их получения, было сокращено в 2 раза по сравнению с результатом Адачи с сотр. (Adachi et al., 1989). Впервые разработан способ регенерации растений гречихи культурной через соматический эмбриогенез из гипокотилей 4-5-дневных проростков, который позволяет в сжатые сроки (в течение 2 мес.) получить высокий выход генетически однородных растений. Впервые показана возможность регенерации растений у гречихи через стадию формирования ПЭКК (проэмбриогенных клеточных комплексов) из прокамбиальных клеток обкладки сосудистых пучков.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные представляют интерес для специалистов, изучающих процессы дедифференциации, дифференциации и морфогенеза в растительных клетках и тканях. Разработанные нами методы регенерации могут найти применение в области биотехнологии и генетики для интенсификации процесса селекции гречихи. Экспериментальный материал может быть использован для чтения лекций по курсу "Биотехнология растений".

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), IV Международном симпозиуме по гречихе (Орел, 1989), III Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки" (Казань, 1990), II съезде ВОФР (Минск, 1990), VII Международном симпозиуме по протопластам "Progress in Plant Protoplast Research" (Швеция, 1991), итоговой научной конференции Казанского научного центра РАН (1990), II Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1996), X конгрессе FESSP "From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach" (Италия, 1996), VIII Международной конференции эмбриологов растений (Польша, 1997), II (X) съезде Русского ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков" (Санкт-Петербург, 1998), VII Международном симпозиуме по гречихе "Advances in Buckwheat Research" (Канада, 1998), II Международном симпозиуме по биотехнологии (Украина, 1998), III Международном симпозиуме "Recent Advances in Plant Biotechnology" (Словакия, 1999), IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), VIII Международном симпозиуме по гречихе "Advances in Buckwheat Research" (Корея, 2001), 17 Международной конференции по регуляторам роста растений (Чехия, 2001), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), Международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), VIII Международной конференции «Биология растительной клетки in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003), V Международном симпозиуме "Recent advances in Plant Biotechnology" (Словакия, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 32 рисунка. Список использованной литературы включает 359 источников, в том числе 295 -иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Гумерова, Елена Азатовна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы выделения и культивирования протопластов из тканей гипокотилей гречихи. Установлена высокая эффективность отечественных ферментных препаратов, предоставленных Институтом биохимии им. А. Н. Баха, по сравнению с коммерческими ферментными препаратами импортного производства.

2. Получена регенерация растений из протопластов гипокотилей гречихи культурной. Показана низкая эффективность регенерации из протопластов гипокотилей гречихи при длительном периоде культивирования in vitro.

3. Впервые разработан способ регенерации растений гречихи культурной через соматический эмбриогенез из гипокотилей 4-5-дневных проростков, позволяющий в сжатые сроки (в течение 2 мес.) получить высокий выход генетически однородных растений.

4. Установлено, что при осуществлении разработанного способа преимущественное образование соматических зародышей сопровождается одновременным развитием вегетативных почек. При этом каждая морфогенетическая программа реализуется, как правило, у разных эксплантов.

5. Показано, что регенерация растений и при соматическом эмбриогенезе, и при геммогенезе осуществляется путем формирования проэмбриогенных клеточных комплексов (ПЭКК) из прокамбиальных клеток обкладки сосудистых пучков.

6. Выявлено, что на процесс развития ПЭКК в тканях гипокотилей гречихи и регенерацию из них растений оказывают влияние следующие факторы: а) концентрация и длительность воздействия 2,4-Д на экспланты; б) минеральный состав среды культивирования; в) концентрация сахарозы; г) плотность культивирования эксплантов; д) местонахождение экспланта в гипокотиле; е) наличие этапа культивирования эксплантов на среде регенерации с БАП; ж) физическое состояние среды культивирования.

7. Цитогенетический и биохимический анализы растений-регенерантов показали, что при осуществлении разработанного метода получения соматических зародышей и почек в высокой степени сохраняется исходный генотип и однородность регенерированных растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Морфогенез - сложный интегральный процесс, регуляция которого осуществляется на клеточном, тканевом и организменном уровнях взаимозависимой системой физических и химических факторов, определяющих процессы деления, растяжения, дифференцировки и смерти клеток.

Культура растительных клеток, тканей и органов может быть использована как моделью для изучения механизма дифференциации и путей морфогенеза. Применение этого экспериментального подхода открывает новые перспективы для познания и управления онтогенезом, а также для создания новых форм растений.

Проведенные нами исследования позволили выявить ряд факторов, критичных для развития эмбриогенной программы в культуре гипокотилей гречихи культурной F. esculentum - объекта, у которого этот процесс изучен крайне недостаточно. Нами установлено, что соматический эмбриогенез в гипокотилях гречихи осуществляется через образование ПЭКК, т. е. непрямым путем. Гистологически доказано, что эмбриогенной компетенцией обладают прокамбиальные клетки сосудистых пучков гипокотилей. Выявлено, что для индукции ПЭКК из этих клеток критичными являются уровень 2,4-Д в среде, содержание осмотика, минеральный состав среды, а также положение экспланта по длине гипокотиля и плотность культивирования эксплантов. Последнее свидетельствует о том, в регуляции дифференцировки ПЭКК кроме выявленных нами гормональных и трофических факторов принимают участие секретируемые молекулы, а также важным является эндогенный уровень гормонов в определенной части гипокотиля. Впервые установлено, что ПЭКК при одних и тех же условиях культивирования тканей гречихи могут формировать либо эмбриоиды, либо почки, что свидетельствует о пластичности ПЭКК и различной компетенции их поверхностных клеток, которая, по всей вероятности, определяется эндогенным уровнем гормонов в экспланте.

Особо следует отметить, что межклеточные взаимодействия являются одним из ключевых факторов, регулирующих реализацию морфогенного потенциала в тканях гипокотилей. Нарушение таких взаимодействий при выделении протопластов из гипокотилей кардинально меняет их морфогенную компетенцию: мы ни разу не наблюдали неравных делений в протопластах и развития ПЭКК, регенерация растений из протопластов шла только через геммогенез. Удаление клеточной стенки является жестким воздействием, последствия которого могут сказываться не только на процессе восстановления клеточной стенки, но и на более отдаленных процессах, таких как пролиферация и морфогенетическая активность протопластов. Поэтому важным представляется тот факт, что морфогенной компетенцией обладали только протопласты, полученные с помощью ферментов, прошедших специальную очистку.

Несмотря на то, что нам удалось в 2 раза сократить время, необходимое для регенерации растений в культуре протопластов по сравнению с описанным ранее способом (с 1,5 лет до 9 месяцев), протопластная технология на данный момент не может быть признана удачной. К ее основным недостаткам могут быть отнесены следующие: низкая эффективность регенерации, регенерация через геммогенез с возможным получением химер, длительное пребывание в условиях in vitro, стимулирующих сомаклональную изменчивость. Как показали наши исследования, разработанный нами способ регенерации растений из тканей гипокотилей через непрямой соматический эмбриогенез значительно снижает риск появления сомаклональных вариантов и дает высокий выход генетически однородных растений-регенерантов в сжатые сроки (через 2 месяца культивирования).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гумерова, Елена Азатовна, Казань

1. Бабаева С. А., Петрова Т. Ф., Гапоненко Л. К. Полиплоидия и политения в культивируемых in vitro клетках злаков // Генетика.-1995.-Т. 31.-С. 678-683.

2. Баврина Т. В., Голяновская С. А., Аксенова Н. П., Константинова Т. Н., Миляева Э. Л. Рост, органогенез и белково-нуклеиновый обмен на разных этапах развития каллусов табака Трапезонд // Физиология растений.-1974.-Т. 21, № З.-С. 589-597.

3. Батыгина Т. Б. Хлебное зерно: Атлас.-Ленинград: Наука. 1987.-103 с.

4. Батыгина Т.Б. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей // Физиология растений-1999.-Т. 46, № 6.-С. 884-898.

5. Батыгина Т. Б., Васильева В. Е., Маметьева Т. Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro: эмбриоидогенез у покрытосеменных растений // Ботанический журнал.-1978.-Т. 63, № 1.-С. 87-111.

6. Батыгина Т. Б., Захарова А. А. Параллели в развитии полового и соматического зародышей // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2. / Под ред. Батыгиной Т. Б.-СПб.: Мир и семья-95. 1997.-С. 635-648.

7. Белова Л. П., Ламберова М. Э., Зуева Т. Г. Исследование клонального микроразмножения растений гречихи в культуре in vitro II Деп. в ВИНИТИ,-1985.-№ 8674.-В.-7 с.

8. Бондаренко А. М. Клеточные технологии и сомаклональная изменчивость в селекции пшеницы // Физиол. и биохимия культурных растений.-1996.-Т. 28, № З.-С. 183-195.

9. Бургутин А. Б., Мусин С. М., Бутенко Р. Г. Сегрегация биохимических и генетических детерминант у сомаклональных вариантов межвидового соматического гибрида картофеля // Физиология растений.-1994.-Т. 41, № 6.-С. 843-852.

10. Бутенко Р. Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений // Гормональная регуляция онтогенеза растений.-Москва: Наука. 1984,1. С. 42-54.

11. Бутенко Р. Г. Клеточные и молекулярные аспекты морфогенеза растений in vitro III Чайлахян. чтение, Пущинский НЦ, 1994.-С. 7-26.

12. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: Учебное пособие-Москва: ФБК-ПРЕСС. 1999.-160 с.

13. Витанова 3. И. Сомаклональная изменчивость // Физиол. и биохимия культурных растений.-1990.-Т. 22, № 5.-С. 419-426.

14. Гумерова Е. А., Румянцева Н. И., Лозовая В. В., Селиванов А. С.,

15. Рабинович М. Л. Новые литические композиции ферментов для получения делящихся протопластов гречихи // Прикладная биохимия и микробиология.-1993.-Т. 29, № 4.-С. 591-596.

16. Данилина А. Н., Александрова И. В., Данилов А. В. Цитоморфологическое изучение культуры ткани Panax ginseng. II Культура клеток растений— Киев: Hayкова Думка. 1978.-С. 129-134.

17. Дейнеко Е. В., Цевелева О. Н., Пельтек С. Е., Бабенко В. Н., Сидорчукф Ю. В., Шумный В. К. Сомаклональная изменчивость морфологических ибиохимических признаков у растений-регенерантов люцерны // Физиология растений,-1997.-Т. 44, № 5.-С. 775-781.

18. Джонс О. П. Размножение хозяйственно важных древесных растений in vitro II Биотехнология сельскохозяйственных растений.-Москва: Агропромиздат. 1987.-С. 134-152.

19. Дмитриева Н. Н. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений // Культура клеток растений.-Москва:1. Наука. 1981.-С. 113-123.

20. Долгих Ю. И., Шамина 3. Б. Современные представления о причинах и механизмах сомаклональной изменчивости // Молекулярные механизмы генетических процессов / Под ред. Тарасова В. А.-Москва: Наука. 1991.-С. 123-126.

21. Еникеев А. Г., Гамбург К. 3., Высоцкая Е. Ф. "Фактор кондиционирования" в культурах клеток растений различных таксономических групп //• Известия АН. Серия биологическая.-2000.-№. 2.-С. 186-190.

22. Ермаков И. П., Матвеева Н. П. Регуляция начальных этапов эмбриогенеза у высших растений // Физиология растений.-1994.-Т. 41, № 3.- С. 467-477.

23. Загорска Н. А., Бутенко Р. Г., Шамина 3. Б. Закономерности морфогенеза в культуре тканей диплоидного и полиплоидного табака // ДАН СССР.-1971.-Т. 196, № 5.-С. 219-222.

24. Зориянц С. Э., Смоленская И. Н., Носов А. М., Бадаева Е. Д. Длительно культивируемая суспензия клеток Triticum timopheevii II Физиологият растений,-1998.-Т. 45, № 1.-С. 86-94.

25. Кацы Е. И. Участие ауксинов в регуляции экспрессии генов бактерий и растений // Генетика.-1997.-Т. 33.- С. 565-576.

26. Кефели В. И., Коф Э. М., Власов П. В., Кислин Е. Н. Природный ингибитор роста абсцизовая кислота.-Москва: Наука. 1989.-184 с.

27. Киясов А. П. Методы иммуногистохимии // Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека: Руководство для врачей-морфологов / под ред. Петрова С. В., Киясова А. П.-Казань. 1998.-С. 9-34.

28. Коваленко В. И., Шумный В. К. Эволюция видов и их систем размножения в роде Fagopyrum Mill // Генетика цветка и проблема совместимости у гречихи / под ред. Шумного В. К., Довженко JI. И.-Москва: Наука. 1988.-С.5-20.

29. Константинов Ю. М., Ривкин М. И. Возможный свободнорадикальный механизм возникновения сомаклональной изменчивости у растений // Молекулярные механизмы генетических процессов: Сборник докладов VII Всесоюзного симпозиума.-Москва: Наука. 1991.-С. 127-130.

30. Кротов А. С. Гречиха Fagopyrum Mill. // Культурная флора СССР. III. Крупяные культуры / Под ред. Жуковского П. М.-Ленинград: Колос. 1975.-С. 7-118.

31. Круглова Н. Н., Горбунова В. Ю. // Тез. докл. междунар. симпоз. "Апомиксис у растений: состояние проблемы и перспективы исследований", Саратов.-1994.-С. 86.

32. Круглова Н. Н., Горбунова В. Ю., Батыгина Т. Б. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков // Успехи современной биологии.-1995.-Т. 115, № 6.-С. 692-705.

33. Круглова Н. Н., Горбунова В. Ю., Куксо П. А. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов // Успехи совр. биол.-1999.-Т. 119, № 6.-С. 567-577.

34. Кунах В. А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 1. Изменчивость в онтогенезе // Биополимеры и клетка.-1994.-Т. 10.-С. 5-35.

35. Кунах В. А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 3. Каллусообразование in vitro II Биополимеры и клетка,-1997.-Т. 13.-С. 362-371.

36. Кунах В. А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 4. Изменчивость при дедифференцировке и каллусообразовании in vitro II Биополимеры и клетка.-1998.-Т. 14.-С. 298-319.

37. Кунах В. А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro И Физиология Растений,-1999.-Т. 46, № 6.-С. 919-929.

38. Кунах В. А., Алпатова Л. К. Роль фитогормонов в изменчивости числа хромосом в культуре тканей Haplopappus gracilis II ДАН СССР.-1979.-Т. 245, № 4.-С. 967-970.

39. Лакин Г. Ф. Биометрия.-Москва: Высш. школа. 1990.-352 с.

40. Лукина Ю. А., Румянцева Н. И. Каллусогенез и морфогенез в культуре незрелых зародышей различных видов рода Fagopyrum (Polygonaceae) // Бот. журн.-1999.-Т. 84, № З.-С. 74-80.

41. Медведев С. С. Физиологические основы полярности растений.-СПб.:1. Кольна. 1996.-159 с.

42. Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники.-Ленинград: Медгиз. 1961.-340 с.

43. Мохамед А. А., Дмитриева Н. Н. Некоторые особенности культуры клеток моркови (Daucus carota L.) при индукции соматического эмбриогенеза // Физиология растений.-1977.-Т. 24, № 6.-С. 1289-1294.

44. Носов А. М. Культура клеток растений уникальная система, модель, инструмент // Физиология растений.-1999.-Т. 46, № 6.-С. 837-844.

45. Осипова Е. С., Кокаева 3. Г., Троицкий А. В., Долгих Ю. И., Шамина 3. Б., Гостимский С. А. RAPD-анализ сомаклонов кукурузы // Генетика.-2001 .Т. 37, № 1.-С. 91-96.

46. Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений.-М.-Колос.-1988.-271с.

47. Полевой В. В., Саламатова Т. С. Физиология роста и развития растений.-Ленинград: изд-во ЛГУ. 1991.-239 с.

48. Румянцева Н. И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты: Автореф. .дис. канд. биол. наук-Казань, 1990.-29 с.

49. Румянцева Н. И., Сальников В. В., Федосеева Н. В., Лозовая В. В. Особенности морфогенеза в длительно культивируемых каллусах гречихи //Физиология растений,-1992.-Т. 39, № 1.-С. 143-151.

50. Румянцева Н. И., Сергеева Н. В., Хакимова Л. Э., Сальников В. В., Гумерова Е. А., Лозовая В. В. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи // Физиология растений,-1989.-Т.36, № 1.-С. 187-194.

51. Сиволап Ю. М., Солоденко А. Е., Бурлов В. В. RAPD-анализ молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника {Helianthus annum) II Генетика.-1998.-Т. 34, № 2.-С. 226-271.

52. Сидоров В. А., Пивень Н. М., Глеба Ю. Ю., Сытник К. М. Соматическая гибридизация пасленовых.-Киев: Наукова думка. 1985.-132 с.

53. Стрельчук С. И. Цитогенетика // Общая и молекулярная генетика: Практикум.-Киев: Вищашк. 1984.-С. 94-134.

54. Фоменко Т. И., Кондрацкая И. П., Чумакова И. М., Бердичевец Л. Г.,

55. Володько И. Ф. Характеристика регенерантов и сортов картофеля при длительном культивировании in vitro II Абстр. VIII Межд. конф. "The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology", Саратов, Россия, сентябрь 2003.-P. 103.

56. Фролова JI. В. Цитогенетическая гетерогенность растительных клеток // Культура клеток растений.-Москва: Наука. 1981.-С.9-13.

57. Фролова Л. В., Шамина 3. Б. Кинетика искусственно культивируемой клеточной популяции бобов // Цитология,-1978.-Т. 20, № 5.-С. 551-556.

58. Хавкин Э. X., Забродина М. В. Наследуемые изменения в спектрах пероксидаз и эстераз у сомаклонов кукурузы // Физиология растений,-1994.-Т. 41, № 6.-С. 859-867.

59. Хасанов М. М., Бутенко Р. Г. Культура изолированных протопластов из семядолей хлопчатника Gossypium hirsutum II Физиология растений,-1979.-Т. 26, № 1.-С. 103-108.

60. Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro II Биотехнология сельскохозяйственных растений.-Москва: Агропромиздат. 1987.-С. 105-133.

61. Шамина 3. Б. Генетика и цитология культуры ткани и растений-регенерантов // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений.-Москва: Наука. 1970.-С.129-136.

62. Шамина 3. Б. Генетическая изменчивость растительных клеток in vitro II Культура клеток растений / Под ред. Бутенко Р. Г.-Киев: Наукова Думка. 1978.-С. 80-93.

63. Шаяхметов И. Ф. Соматический эмбриогенез и селекция злаковых культур.-Уфа: Издание Башкирского Университета. 1999.-166 с.

64. Эльконин Л. А., Пахомова Н. В. Влияние источников азота и фосфора на рост и морфотип эмбриогенного каллуса сорго // Биология клеток растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда.-Москва: Россия. 1997.-С. 187.

65. Adachi Т., Suputtitada S., Miike I. Plant regeneration from anther culture in common buckwheat (Fagopyrum esculentum) // Fagopyrum.-1988.-V. 8.-P. 5-9.

66. Adachi Т., Yamaguchi A., Miike Y., Hoffmann F. Plant regeneration from protoplasts of common buckwheat (Fagopyrum esculenlum) II Plant cell Rep.-1989.-V. 8.-P. 247-250.

67. Albertsheim P., Darvill A. G. Oligosaccharins // Scientific American.-1985.-V. 253.-P. 44-50.

68. Altamura M. M., Cersosimo A., Majoli C., Crespan M. Histological study of embryogenesis and organogenesis from anthers of Vitis rupestris du Lot cultured in vitro II Protoplasma.-1992.-V. 171.-P. 134-147.

69. Ammirato P. V. Embryogenesis // Handbook of Plant Cell Culture / Ed. Evans D. A. et al.-New-York, London: Macmillan Publ. 1983.-P. 82-123.

70. Ammirato P. V., Steward F. C. Some effects of the environment on the development of embryos from cultured free cells // Bot. Gaz.-1971.-V. 132,-P. 149-158.

71. Anandarajah K., Mac Kersie B. D. Enhanced vigour of dry somatic embryos of Medicago sativa L. with increased sucrose // Plant Sci.-1990.-V. 71.-P. 261-272.

72. Azmi A., Noin M., Landr P., Prouteau M., Boudet A. M., Chriqui D. High frequency plant regeneration from Eucalyptus globulus Labill. hypocotyls: Ontogenesis and ploidy level of the regenerants // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1997.-V. 51.-P. 9-16.

73. Backs-Hiisemann D., Reinert J. Embryo formation by isolated single cells from tissue cultures of Daucus carota II Protoplasma.-1970.-V. 70.-P. 49-60.

74. Baertlein D. A., McDaniel R. G. Molecular divergence alfalfa somaclones // Theor. Appl. Genet.-1987.-V. 73.-P. 575-580.

75. Bandyopadhyay S., Cane K., Rasmussen G., Hamill J.D. Efficient plant regeneration from seedling explant commercially important temperate eucalypt species Eucalyptus nitens and E. globules II Plant Sci.-1999.-V. 140,-P. 189-198.

76. Banks M. S., Haskett W. P. Differentiation from Hedera helix callus // Plant Physiol.-1979.-V. 61, suppl.-P. 45.

77. Bennici A., Caffaro L. Kariological behavior during the first phases of differentiation and habituation in Nicotiana bigelovii II Protoplasma-1985.1. V. 124.-P. 130-136.

78. Berbec A., Doroszewska T. Effect of thidiazuron on in vitro regeneration in three buckwheat cultivars // Proc. of 7th Int. Symp. on buckwheat, Canada.-1998a.-P. V- 42-47.

79. Berbec A., Doroszewska T. Callus formation and plant regeneration in anther cultures of three buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) cultivars // Proc. of 7th Int. Symp. on buckwheat, Canada.-1998b.-P. V- 48-52.

80. Berbec A., Laskowska D., Doroszewska T. Investigations on in vitro callus formation and plant regeneration potential of three polish buckwheat cultivars // Current Advances in Buckwheat Research.-1995.-P. 197-203.

81. Bertram L., Lercari B. Phytochrome A and phytochrome B1 control the acquisition of competence for shoot regeneration in tomato hypocotyls // Plant Cell Rep.-2000.-V. 19.-P. 604-609.

82. Biahoua A., Bonneau L. Control of in vitro somatic embryogenesis of the spindle tree (Euonymus europaeus L.) by the sugar type and the osmotic potential of the culture medium // Plant Cell Rep.-1999.-V. 19.-P. 185-190.

83. Binding H. Somatic hybridisation experiments in solanaceous species // MMG.-1976.-V. 144.-P. 171-175.

84. Bohanec B. Improvement in buckwheat micropropagation procedures // Fagopyrum.-1987.-V. 7.-P. 13-15.

85. Bohanec В., Neskovic M., Vujicic R. Anther culture and androgenetic plant regeneration in buckwheat {Fagopyrum esculentum Moench.) // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1993.-V. 35.-P. 259-266.

86. Bohanec B. Progress of buckwheat in vitro culture techniques with special aspect on induction of haploid plants // Current Advances in Buckwheat Research.-1995.-P. 205-209.

87. Bradford M. M A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem.-1976.-V. 72.-P. 248-254.

88. Brettell R. I. S., Pallotta M. A., Gustafson J. f., Appels R. Variation at the Nor loci in triticale derived from tissue culture // Ibid.-1986.-V. 71.-P. 637-643.

89. Buchheim J. A., Colburn S. M., Ranch J. P. Maturation of soybean somatic embryos and the transition to plantlet growth // Plant Physiol.-1989.-V. 89, № 3.-P. 768-775.

90. Bui Van Le, Do My Nghieng Thao, Gendy C., Vidal J., Tran Thanh Van K. Somatic embryogenesis on thin cell layers of a C4 species, Digitaria sanguinalis (L.) scop // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1997.-V. 49.-P. 201-208.

91. Burger D. W., Hackett W. P. Gradients of adventitious bud formation on excised epicotyl and root sections of Citrus // Plant Sci.-1986.-V. 43, № 3.-P. 229-232.

92. Caboche M. Nutritional requirements of protoplasts derived, haploid tobacco cells grown at low cells densities in liquid medium // Planta.-1980.-V. 149.-P. 7-18.

93. Campbell C. Inter-specific hybridization in the genus Fagopyrum II Proc. of 6th Int. Symp. on buckwheat, Japan.-1995.-V. l.-P. 255-263.

94. Carlson P. S., Smith H. H., Dearing R. D. Parasexual interspecific plant hybridization // Proc. Nat. Acad. Sci.-1972.-V. 69.-P. 2292-2294.

95. Carman J. G. Embryogenic cells in plant tissue cultures: occurrence and behavior // In Vitro Cell. Dev. Biol.- 1990.-V. 26, № 8.-P. 746-753.

96. Cella R., Galun E. Utilization of irradiated carrot cell suspensions as feeder layer for cultured Nicotiana cells and protoplasts // Plant Sci. Let.-1980.-V. 19.-P. 243-252.

97. Chengalrayan K., Hazra S., Gallo-Meagher M. Histological analysis of somatic embryogenesis and organogenesis induced from mature zygotic embryo-derivedleaflets of peanut (Arachis hypogaea L.) // Plant Science.-2001 .-V. 161.-P. 415-421.

98. Christiansen M. L., Warnick D. A. Phenocritical times in the process of in vitro shoot organogenesis // Dev. Biol.-1984.-V. 101.-P. 382-390.

99. Chu С. C., Wang С. C., Sun C. S., Hsu C., Yin К. C., Chu C. Y., Bi F. Y. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources // Sci. Sin.-1975.-V. 28.1. P. 659-668.

100. Cionini P. G., Bennici A., D'Amato F. Nuclear cytology of callus induction and development in vitro II Protoplasma.-1978.-V. 96.-P. 101-112.

101. Cocking E. C. A method for the isolation of plant protoplasts // Nature.-1960,-V. 187.-P. 962-963.

102. Cocking E. C. Plant cell protoplasts — Isolation and development // Annu. Rev. Plant Physiol.-1972.-V. 23 .-P. 29-50.

103. Compton M. E. Dark pre-treatment improves adventitious shoot organogenesis Ф from cotyledons of diploid watermelon // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1999.1. V. 58.-P. 185-188.

104. Conger В. V., Hanning G. E., Gray D. J., McDaniel J. K. Direct embryogenesis from mesophyll cells of orchardgrass // Science.-1983.-V. 221.-P. 850-851.

105. Cvikrova M., Mala J., Eder J., Hrubcova M., Vagner M. Abscisic acid,polyamines and phenolic acids in sessile oak somatic embryos in relation to their conversion potential // Plant Physiol. Biochem.-1998.-V. 36, № 3.-P. 247-255.

106. Dahmer M. L., Hilderbrand D. F., Collins G. B. Comparative protein accumulation patterns in soybean somatic and zygotic embryos // In Vitro Cell Dev. Biol.-1992.-V. 28P.-P. 106-114.

107. D'Amato F. Nuclear changes in cultured plant cells // Cariologia-1991 .-V. 44,-P. 217-224.Ф

108. Dijak M., Smith D. L., Wilson T. J., Brown D. C. W. Stimulation of directembryogenesis from mesophyll protoplasts of Medicago sativa II Plant Cell Rep.-1986.-V. 5.-P. 468-470.

109. Dodeman V. L., Ducreux G., Kreis M. Zigotic embryogenesis versus somatic embryogenesis // J. Exp. Bot.-1997.-V. 48, № 313.-P. 1493-1509.

110. Dudits D., Gyorgyey J., Bogre L., Bako L. Molecular biology of somatic embryogenesis // In vitro embryogenesis in plants / Ed. by Thorpe T. A.Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers. 1995.-P. 267-308.

111. Eapen S., Abraham V., Gerdemann M., Schieder O. Direct somaticembryogenesis, plant regeneration and evaluation of plants obtained from mesophyll protoplasts of Brassica juncea II Ann. Bot.-1989.-V. 63.-P. 369-372.

112. Eapen S., George L. Somatic embryogenesis in peanut: influence of growth regulators and sugar//Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1993 .-V. 35-P. 151-156.

113. Egertsdotter U., von Arnold S. Importance of arabinogalactan proteins for the development of somatic embryos of Norway spruce (Picea abies) II Physiol. Plant.-1995.-V. 93.-P. 334-345.

114. Elhag H. M., Whipkey A., Janick J. Induction of somatic embryogenesis from callus in Theobroma cacao in response to carbon source and concentration // Rev. Theobroma.-1987.-V. 17.-P. 153-162.

115. Emons A. M. C., Kieft H. Somatic embryogenesis in maize (Zea mays L.) // Biotechnology in Agriculture and Forestry. V. 31. Somatic embryogenesis and synthetic seed II / Ed. by Bajaj Y. P. S.-Berlin, Heidelberg: Springer Verlag. 1995.-P. 24-39.

116. Eriksson T. Technical advances in protoplast isolation and cultivation // Plant Tissue Culture and its Bio-technological Application / Ed. by Barz W., Reinhard E., ZenkM. H.-Berlin, New-York: Springer-Verlag. 1977.-P. 313-322.

117. Evans D. A., Bravo J. E. Protoplast isolation and culture // Handbook of Plant Cell Culture / Ed. Evans D. A. et al.-New-York, London: Macmillan Publ. 1983.-P. 124-176.

118. Evans D. A., Sharp W. R., Flick С. E. Growth and behavior of cell cultures: Embryogenesis and organogenesis // Plant tissue culture: methods and applications in agriculture / Ed. by Thorpe T. A.-New-York: Academic Press. 1981.-P. 45-113.

119. Ezura H., Kikuta I., Oosawa K. Long-term stability of shoot primordium cultures and produced plants of melon // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1997,-V. 48.-P. 31-35.

120. Find J. I, Norgaard J. V., Krogstrup P. Growth parameters, nutrient uptake and maturation capacity of two cell-lines of Norway spruce (Picea abies) in suspension culture // J. Plant Physiol.- 1998.-V. 152.-P. 510-517.

121. Fowler J. E., Quatrano R. S Plant cell morphogenesis: Plasma membrane interactions with the cytoskeleton and cell wall // Annu. Rev. Cell Dev. Biol.-1997.-V. 13.-P. 697-743.

122. Fridborg G., Pedersen M., Landstron L.-E., Eriksson T. The effect of activated charcoal on tissue cultures: Adsorption of metabolites inhibiting morphogenesis //Physiol. Plant.-1978.-V. 43.-P. 104-106.

123. Fry S. C. The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis // New-York.: Longmann scientific and technical. 1988.-333 p.

124. Fujimura Т., Komamine A. Mode of action of 2,4-D and zeatin on somatic embryogenesis in a carrot cell suspension culture // Z. Pflanzenphysiol.-1980.-V. 99.-P. 1-8.

125. Galiba Y., Yamada Y. A novel method for increasing the frequency of somatic embryogenesis in wheat tissue culture by NaCl and KC1 supplementation // Plant Cell Rep.-1988.-V. 7.-P. 55-58.

126. Gamborg O. L., Miller R. A., Ojima K. Plant cell cultures. I. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells // Exp. Cell Res.-1968.-V. 50.-P. 151-158.

127. Gamborg O. L. Plant cell cultures: nutrition and media // Cell culture and somatic cell genetics of plants. V. 1. Laboratory procedures and their applications / Ed. by Vasil I. K.-Orlando, Florida: Academic Press, Inc. 1984.-P. 18-26.

128. Garcia-Luis A., Bordon Y., Moreira-Dias J. M. Molina R. V., Guardiola J. L. Explant orientation and polarity determine the morphogenic response of epicotyl segments of Troyer citrange II Ann. Bot.-1999.-V. 84.-P. 715-723.

129. George E. F. Plant propagation by tissue culture. Part 1. The technology.-UK: Exegetics Ltd.-1993.-P. 273-343.

130. Gleba Y. Y. Microdroplet culture: tobacco plants from single mesophyll protoplasts // Naturwissenschaften.-1978.-V. 65.-P. 158-159.

131. Goldberg R. В., Barker S. S., Perez-Grau L. Regulation of gene expression during plant embryogenesis // Cell.-1989.-V. 56, № 2.-P. 149-160.

132. Green С. E., Phillips R. L. Plant regeneration from tissue cultures of maize // Crop Sci.-1975.-V. 15.-P. 417-421.

133. Grieb В., GroB U., Pleschka E., Arnholdt-Schmitt В., Neumann K.-H. Embryogenesis of photoautotrophic cell cultures of Daucus carota L. H Plant

134. Cell Tiss. Org. Cult.-1994.-V. 38.-P. 115-122.

135. Gumerova E. A. Regeneration of plantlets from protoplasts of Fagopyrum esculentum Moench. // Proceedings of 7th Intern. Protoplast Symposium "Progress in Plant Protoplast Research", Uppsala, Sweden, June 1991.-Physiol. Plant.-199l.-V. 82, N 1-A 19

136. Guzzo F., Baldan В., Levi M., Sparvoli E., Loschiavo F., Terzi M., Mariani P. Early cellular events during induction of carrot explants with 2,4-D // Protoplasma.-1995.-V. 185.-P. 1-2.

137. Haccius B. Question on unicellular origin of non-zygotic embryo in callus cultures // Phytomorphology.-1978.-V. 28.-P. 74-81.

138. Haccius В., Bhandary N. N. Delayed histogen differentiation as a common primitive character in all types of non-zygotic embryos // Phytomorphology.-1975.-V 25, № l.-P. 91-94.

139. Hakman I. Embryology in Norway spruce {Picea abies). An analysis of seed storage proteins and deposition of storage reserves during seed development and somatic embryogenesis // Physiol. Plant.-1993.-V. 87.-P. 148-159.

140. Halford N. G., Purcell P. C., Hardie D. G. Is hexokinase really a sugar sensor in plants? // Tends Plant Sci.-1999.-V. 4.-P. 117-120.

141. Halperin W. Alternative morphogenetic events in cell suspensions // Amer. J. Bot.-1966.-V. 53.-P. 443-453.

142. Halperin W. Population density effects on embryogenesis in carrot cell cultures // Exp. Cell Res.-1967.-V. 48.-P. 170-173.

143. Halperin W. Attainment and retention of morphogenic capacity in vitro 11 Cell culture and somatic cell genetics of plants. Vol. 3. Plant regeneration and genetic variability / Ed. by Vasil I. K.-Orlando: Academic Press. 1986.-P. 3-47.

144. Halperin W., Jensen W. A. Ultrastructural changes during growth and embryogenesis in carrot cell cultures // J. Ultrastruct. Research.-1967.-V. 18.-P. 428-443.

145. Halperin W., Wetherell D. F., Adventive embryony in tissue cultures of the wild carrot Daucus carota II Amer. J. Bot.-1964.-V. 51.-P. 274-283.

146. Havranek P., Vagera J. Regulation of in vitro androgenesis in tobacco through iron-free media//Biol. Plant.-1979.-V. 21.-P. 412-417.

147. He D. G., Yang Y. M. Scott K. J. The effect of macroelements in the induction of embryogenic callus from immature embryos of wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Science.-1989.-V. 64.-P. 251-258.

148. Heberle-Bors E. Interaction of activated charcoal and iron chelates in antherф cultures of Nicotiana and Atropa belladonna II Z. Pflanzenphysiol.-1980.1. V. 99.-P. 339-347.

149. Hirose Т., Lee B. S., Okuno J., Konishi A., Minami M., Ujihara A. Interspecific pollen-pistil interaction and hybridization in genus Fagopyrum И Proc. of 6th Int. Symp. on buckwheat, Japan, 1995.-V. l.-P. 239-245.

150. Hirose Т., Ujihara A., Kitabayashi H., Minami M. Interspecific cross-compatibility in Fagopyrum according to pollen tube growth // Breeding Science.-1994.-V. 44, № 3.-P. 307-314.

151. Ни C. Y., Ochs J. D., Mancini F. M. Further observations on Ilex embryoid production // Z. Pflanzenphysiol.-1978.-V. 89.-P. 41-49.

152. Hush J. M., Overall R. L. Electrical and mechanical fields orient cortical microtubules in higher plant tissues // Cell Biol. Int. Rep.-1991.-V. 15, № 7.1. P. 551-559.

153. Ikeda-Iwai M., Umehara M., Saton S., Kamada H. Stress-induced somatic embryogenesis in vegetative tissues of Arabidopsis thaliana // The Plant J.-2003.-V. 34.-P. 107-114.

154. Iraqi D., Tremblay F. M. The role of sucrose during maturation of black spruce {Picea mariana) and white spruce (Picea glauca) somatic embryos // PhysiologiaPlant.-2001 .-V. 111.-P. 381-388.

155. Jang J.C., Sheen N. Sugar sensing in higher plants // Trends Plant Sci.-1997.1. V. 2.-P. 208-214.

156. Jeannin G., Bronner R., Hahne G. Somatic embryogenesis and organogenesis induced on the immature zygotic embryo of sunflower {Helianthus annuus L.) cultivated in vitro: role of the sugar // Plant Cell Rep.-1995.-V. 15.-P. 200-204.

157. Jin H., Jia J.-f., Hao J.-g. Efficient plant regeneration in vitro in buckwheat // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-2002.-V. 69.-P. 293-295.

158. Jones T. J, Rost T. L. The developmental anatomy and ultrastructure of somatic ф embryos from rice (Oriza sativa L.) scutellum epithelial cells // Bot. Gaz.1989a.-V. 150.-P. 41-53.

159. Jones T. J, Rost T. L. Histochemistry and ultrastructure of rice (Oriza sativa L.) zygotic embryogenesis // Amer. J. Bot.-1989b.-V. 76.-P. 504-513.

160. Joy R. W., Yeung E. C., Kong L., Thorpe T. A. Development of white spruce somatic embryos: I. storage product deposition // In Vitro Cell Dev.-1991.-V. 27P.-P. 32-39.

161. Kachonpadungkitti Y., Romchatngoen S., Hasegawa K., Hisajima S. In vitro ^ cross breeding — in vitro flowering and pollination in buckwheat {Fagopyrumesculentum Moench.) plants // Proc. of 8th Int. Symp. on buckwheat, Korea.-2001.-P. 351-360.

162. Kagemaya C., Komatsuda Т., Nakajima K. Effects of sucrose concentration on morphology of somatic embryos from immature soybean cotyledons // Plant Tiss. Cult. Lett.-1990.-V. 7.-P. 108-110.

163. Kaldenhoff R., Henningsen U., Richter G. Gene activation in the suspension-cultured cells of Arabidopsis thaliana during blue-light-dependent plantletregeneration //Planta.-1994.-V. 195.-P. 182-187.

164. Kao K. N., Michayluk M. R. Nutritional requirements for growth of Vicia hajastana cells and protoplasts at a very low population density in liquid media //Planta.-1975.-V. 126.-P. 105-110.

165. Kao K. N., Michayluk M. R. Plant regeneration from mesophyll protoplasts of alfalfa//Z. Pflanzenphysiol.-1980.-V. 96.-P. 135-141.

166. Kao K. N., Michayluk M. R. Embryoid formation in alfalfa cell suspensions from different plants // In Vitro.-1981 .-V. 17.-P. 645-648.

167. Karp A., Bright S. W. J. On the causes and origins of somaclonal variation // Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol.-1985.-V. 2.-P. 199-234.

168. Kartha К. K., Gamborg O. L., Constabel F., Kao K. N. Fusion of rapeseed and soybean protoplasts and subsequent division of heterokaryocytes // Can. J. Bot.-1974.-V. 52.-P. 2435-2436.

169. Kawahara R., Sunabory S., Fukuda H., Komamine A. A gene expressed in the globular-stage of somatic embryogenesis encodes elongation-factor la in carrot // Eur. J. Biochem.-1992.-V. 209, № l.-P. 157-162.

170. Kermode A. R. Regulatory mechanisms involved in the transition from seed development to germination // Crit. Rev. Plant Sci.-1990.-V. 9.-P. 155-195.

171. Keyes G. J., Collins G. В., Taylor N. L. Genetic variation in tissue cultures of red clover // Theor. Appl. Genet.-1980.-V. 58.-P. 265-271.

172. Klimaszewska K., Smith D. Maturation of somatic embryos of Pinus strobus is promoted by a high concentration of gellan gum // Physiol. Plant.-1997.-V. 100.-P. 949-957.

173. Knox J. P. Cell adhesion, cell separation and plant morphogenesis // Plant J.-1992.-V. 2, № 2.-P. 137-141.

174. Koch К. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.-1996.-V. 47.-P. 509-540.

175. Kochba J., Spiegel-Roy P., Neumann H., Saad S. Stimulation of embryogenesis in Citrus ovular callus by ABA, ethephon, CCC and alar and its suppression by GA // Z. Pflanzenphysiol.-1978.-V. 89.-P. 427-432.

176. Kohlenbach H.W. Comparative Somatic Embryogenesis // Frontiers of Plant Tissue Cultures / Ed. Thorpe T.A.-Calgary: Univ. Calgary Press. 1978.-P. 59-66.

177. Komai F., Okuse I., Harada T. Somatic embryogenesis and plant regeneration in culture of root segments of spinach (Spinacia oleracea L.) // Plant Science.-1996.-V. 113.-P. 203-208.

178. Konar R. N., Nataraja K. Experimental studies in Ranunculus sceleratus L. Development of embryos from the stem epidermis // Phytomorphology.- 1965a.-V. 15.-P. 132-137.

179. Konar R. N., Nataraja K. Experimental studies in Ranunculus sceleratus L. Plantlets from freely suspended cells and cell groups // Phytomorphology.-1965b.-V. 15.-P. 206-211.

180. Konar R. N., Thomas E., Street H. E. Origin and structure of embryoids arising from epidermal cells of the stem of Ranunculus sceleratus L. // J. Cell Sci.-1972.-V. 11.-P. 77-93.

181. Koul A. K., Karihaloo J. L .In vivo embryoids from anthers of Narcissus biflorus Curt. // Euphytica.-1977.-V. 26.-P. 97.102.

182. Kreuger M., Van Hoist G.-J. Arabinogalactan proteins and plant differentiation //PlantMol. Biol.-1996.-V. 30.-P. 1077-1086.

183. Kreuger M., Van Hoist G.-J. Arabinogalactan proteins are essential in somatic embryogenesis ofDaucus carota L. // Planta.-1993.-V. 189.-P. 243-248.

184. Lachmann S. Plant cell and tissue culture in buckwheat: an approach towards genetic improvements by means of unconventional breeding techniques // Proc. oflCOBB inMiyazaki, Japan, 1991.-P. 145-154.

185. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature.-1970.-V. 227, № 5259.-P. 680-685.

186. Lambe P., Mutambel H. S. N., Fouche J-G., Deltour R., Foidart J-M., Gaspar T. DNA methylation as a key in regulation of organogenic totipotency and plantneoplastic progression // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant.-1997.-V. 33.-P.155-162.

187. Lapitan N. L., Sears R. G., Gill B. S. Translocations and other karyotypic structural changes in wheat-rye hybrids regenerated from tissue culture // Theor. Appl. Genet.- 1984.-V. 68.-P. 547-554.

188. Larkin P. G., Scowcroft W. R. Somaclonal variation a novel source of variability from cell cultures for plant improvement // Theor. Appl. Genet.-1981.-V.60.-P. 197-214.

189. Last D. L, Brettel R. I. S. Embryo yield in wheat anther culture is influenced bythe choice of sugar in the culture medium // Plant Cell Rep.-1990.-V. 9.-P. 14-16.

190. Lazzeri P. A., Hildebrand D. F., Sunega J., Williams E. G., Collins G. B. Soybean somatic embryogenesis: interactions between sucrose and auxin // Plant Cell Rep.-1988.-V. 7.-P. 517-520.

191. Lee M., Philips R. L. The chromosomal basis of somaclonal variation // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.-1988.-V. 39.-P. 413-437.

192. Lee K. S., Zapata-Arias F. J., Brunner H., Afza R. Histology of somatic embryoinitiation and organogenesis from rhizome explants of Musa spp. // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1997.-V. 51.-P. 1-8.

193. Lercari В., Moscatelli S., Ghirardi E., Niceforo R., Bertram L. Photomorphogenic control of shoot regeneration from etiolated and light-grown hypocotyls of tomato // Plant Sci.-1999.-V. 140.-P. 53-64.

194. Linsmaier E. M., Skoog F. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures // Physiol. Plant.-1965.-V. 18.-P. 100-127.

195. Litz R. E., Conover R. A. High frequency somatic embryogenesis from Carica suspension cultures // Annals of Botany.-1983.-V. 51.-P. 683-686.

196. Liu Chun-ming, Xu Zhi-hong, Chua Nam-hai. Auxin polar transport is essential for the establishment of bilateral symmetry during early plant embryogenesis // Plant Cell.-1993.-V. 5, № 6.-P. 621-630.

197. Lloyd G., McCown В. H. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel Kalmia latifolia by use of shoot tip culture // Proc. Int. Plant Prop. Soc.-1981.-V. 30.-P. 421-427.

198. Lozovaya V. V., Zabotina O. A., Rumyantseva N. I., Malihov R. G., Zihareva M. V. Stimulation of root development on buckwheat thin cell-layer explants by pectic fragments from pea stem cell walls // Plant Cell Rep.-1993.-V. 12,-P. 530-533.

199. Lu C., Ozias-Akins P. Somatic embryogenesis in Zea mays L. // Theor. Appl. Genet.-1982.-V. 62.-P. 109-112.

200. Maes O., Coutos-Thevenot P., Jouenne Т., Boulay M., Guern J. Influence of extracellular proteins, proteases and protease inhibitors on grapevine somatic embryogenesis //Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1997.-V. 50.-P. 97-105.

201. Maheswaran G., Williams E. G. Origin and development of somatic embryos formed directly on immature embryos of Trifolium repens in vitro II Ann. Bot.-1985.-V. 56.-P. 619-630.

202. Mandal A. K. A., Dutta Gupta S., Chatterji A. K. Factors affecting somatic embryogenesis from cotyledonary explants of safflower // Biologia Plantarum.-2001.-V. 44, № 4.-P. 503-507.

203. Maretzki A., Nickell L. G. Formation of protoplasts from sugarcane cell suspensions and the regeneration of cell cultures from protoplasts // Protoplastes et Fusion de Cellules Somatiques Vegetales // Paris: C. N. R. S. 1973 .-No 212.-P. 51-63.

204. Masuda H., Oohashi S.-I., Tokuji Y., Mizue Y. Direct embryo formation from epidermal cells of carrot hypocotyls // J. Plant Physiol.-1995.-V. 145.-P. 531-534.

205. Matsubayashi Y., Sakagami Y. Phytosulfokine, sulphated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. // Proc. Natl. Acad. USA.-1996.-V. 93.-P. 7623-7627.

206. May R. A., Sink К. C. Genotype and auxin influence direct somatic embryogenesis from protoplasts derived from embryogenic cell suspensions of Asparagus officinalis L. // Plant Science.-1995.-V. 108.-P. 71-84.

207. McCabe P. F., Valentine T. A., Forsberg L. S., Pennel R. I. Soluble signals from cells identified at the cell wall establish a developmental pathway in carrot // The Plant Cell.-1997.-V. 9.-P. 2225-2241.

208. McDaniel R. G., Ramage R. T. Genetics of a primary trisomic series in barley: identification by protein electroforesis // Can. J. Genet. Cytol.-1970.-V. 12,-P. 490-495.

209. McVeigh J. Regeneration in Crassula multicava // Amer. J. Bot.-1938.-V. 25,-P. 7-11.

210. McWilliam A. A., Smith S. M., Street H. E. The origin and development of embryoids in suspension cultures of carrot (Daucus carota) II Ann. Bot.-1974.-V. 38.-P. 243-250.

211. Meinke D. V. Perspectives on genetic analysis of plant embryogenesis // Plant Cell.-1991.-V. 3, № 9.-P. 857-866.

212. Menczel L., Lazar G., Maliga P. Isolation of somatic hybrids by cloning Nicotiana heterokaryons in nurse cultures // Planta.-1978.-V. 143.-P. 29-32.

213. Merkle S. A., Parrott W. A., Williams E. G. Applications of somatic embryogenesis and embryo cloning // Plant Tissue Culture: Applications and Limitations / Ed. by Bhojwani S. S.-Amsterdam: Elsevier. 1990.-P. 67-101.

214. Meyer Y., Herth W. Chemical inhibition of cell wall formation and cytokinesis, but not of nuclear division, in protoplasts of Nicotiana tabaccum L. cultivated in vitro II Planta.-1978.-V. 142.-P. 253-262.

215. Michalczuk L., Ribnicky D. M., Cooke T. J., Cohen J. D. Regulation of indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in carrot cell cultures // Plant Physiol.-1992.-V. 100.-P. 1346-1353.

216. Michler С. H., Bauer E. O. High frequency somatic embryogenesis from leaf tissue of Populus spp//Plant Sci.-1991.-V. 77.-P. 111-118.

217. Michler С. H., Lineberger R. D. Effects of light on somatic embryo development and abscisic acid levels in carrot suspension cultures // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1987.-V. 11.-P. 189-207.

218. Milju-Djukic J., Neskovic M., Ninkovic S., Crvenjakov R. Agrobacterium-mediated transformation and plant regeneration of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1992.-V. 29.-P. 101-108.

219. Mordhorst A. P., Toonen M. A. J., de Vries S. C. Plant embryogenesis // Crit. Rev. Plant Sci.-1997.-V. 16.-P. 535-576.

220. Mouras A., Lutz A. Induction, repression et conservation des ргорпё1ёз embryogenetiques des cultures de tissues de Carotte sauvage // Bull. Soc. Bot. Fr.-1980.-V. 127.-P. 93-98.

221. Mulin M., Bellio-Spataru A. Organogenesis from hypocotyl thin cell layers of Lupinus mutabilis and Lupinus albus II Plant Growth Regulation.-2000.-V. 30,-P. 177-183.

222. Muniyamma A. Triploid embryos from endosperm in vivo (Short comm.) 11 Ann. Bot.-1977.-V. 41.-P. 1077-1079.

223. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant.-1962.-V. 15.-P. 473-497.

224. Nagata Т., Takebe I. Plating of isolated tobacco mesophyll protoplasts on agar medium//Planta.-l97l.-V. 99.-P. 12-20.

225. Neskovic M., Vinterhalter В., Milju-Djukic J., Ninkovic S., M., Vinterhalter D., Jovanovic V., Knezevic J. Susceptibility of buckwheat {Fagopyrum esculentum Moench.) to Agrobacterium tumefaciens and A.rhizogenes II Fagopyrum.-1990b.-V. 10.-P. 57-61.

226. Neskovic M., Vujicic R., Budimir S. Somatic embryogenesis and bud formation from immature embryos of buckwheat {Fagopyrum esculentum Moench.) // Plant Cell Rep.-1987.-V. 6.-P. 423-426.

227. Nickle Т. C., Yeung E. C. Failure to establish a functional shoot apical meristem may be a cause of conversion failure in somatic embryo of Daucus carota II Amer. J. Bot.-1993.-V. 80.-P. 1284-1291.

228. Nishiwaki M., Fujino K., Koda Y., Masuda K., Kikuta Y. Somatic embryogenesis induced by the simple application of abscisic acid to carrot {Daucus carota L.) seedlings in culture // Panta.-2000.-V. 211.-P. 756-759.

229. Nitsch J. P., Nitsch C. Haploid plants from pollen grains // Science.-1969.-V. 163.-P. 85-87.

230. Nomura K., Komamine A. Polarized DNA synthesis and cell division in cell clusters during somatic embryogenesis from single carrot cells // New Phytol.-1986.-V. 104.-P. 25-32.

231. Osuga K., Komamine A. Synchronization of somatic embryogenesis from carrot cells at high frequency as a basis for the mass production of embryos // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1994.-V. 39.-P. 125-135.

232. Overvoorde P. J., Grimes H. D. The role of calcium and calmodulin in carrot somatic embryogenesis // Plant Cell Physiol.- 1994.-V. 35.-P. 135-144.

233. Ozias-Akins P., Anderson W. F., Holbrook С. C. Somatic embryogenesis in Arachis hypogaea L.: genotype comparison // Plant Sci.-1992.-V. 83.-P. 103-111.

234. Park Sang-Un, Park Cheol-Ho Multiple shoot organogenesis and plant regeneration from cotyledons of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) // Proc. of 8th Int. Symp. on buckwheat, Korea.-2001a.-P. 427-430.

235. Park Sang-Un, Park Cheol-Ho The establishment of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) transgenic root cultures stably transformed with Agrobacterium rhizogenes II Proc. of 8th Int. Symp. on buckwheat, Korea.-2001b.-P. 422-426.

236. Patnaik G., Wilson D., Cocking E. C. Importance of enzyme purification for increased plating efficiency and plant regeneration from single protoplasts of Petuniaparodii IIZ. Pflanzenphysiol.-1981.-V. 102.-P. 199-205.

237. Pennel R. I., Janniche L., Scofield G. N., Booij H., de Vries S. C., Roberts K. Identification of a transitional cell state in the developmental pathway to carrot somatic embryogenesis // J. Cell Biol.-1992.-V. 119, № 5.-P. 1371-1380.

238. Peschke V. M., Phillips R. L. Activation of the maize transposable element• 147suppressor-mutator (Spm) in tissue culture // Theor. Appl. Genet.-199 l.-V. 81.-P. 90-97.

239. Petru E. Development of embryoids in carrot root callus culture (Daucus carota L.) // Biol. Plant.-1970.-V. 12.-P. 1-5.

240. Pliego-Alfaro F., Murashige T. Somatic embryogenesis in avocado (Persea Americana Mill.) in vitro II Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1988.-V. 12.-P. 61-66.

241. Pitto L., Giorgetti L., Turrini A., Evangelista M., Luccarini G., Colella C.,

242. Collina F., Caltavuturo L., Nuti Ronchi V. Floral genes expressed in tomato hypocotyls explants in liquid culture // Protoplasma.-2001.-V. 218.-P. 3-4.

243. Polanco M. C., Ruiz M.L. Factors that affect plant regeneration from in vitro culture of immature seeds in four lentil cultivars // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-2001.-V. 66.-P. 133-139.

244. Potrycus I., Harms С. Т., Lorz H. Problems in culturing cereal protoplasts // Cell genetics in higher plants / Ed. by Dudits D., Farakus G. L., Maliga P.Budapest: Akademiai Kiado. 1976.-P. 129-140.

245. Ф 267. Power J. В., Chapman J. V. Isolation, Culture and Genetic Manipulation of Plant

246. Protoplasts // Plant Cell Culture: a practical approach / Ed. by Dixon R. A.Oxford: IRL Press. 1985.-P. 37-66.

247. Pua E.-C. Somatic embryogenesis and plant regeneration from hypocotyls protoplasts of Brassica juncea (L.) Czern & Coss // Plant Science.-1990.-V. 68.-P. 231-238.

248. Quiroz-Figueroa F. R., Fuentes-Cerda C. F. J., Rojas-Herrera R., Loyola-Vargas V. M. Histological studies on the developmental stages and differentiation of0 two different somatic embryogenesis systems of Coffea arabica // Plant Cell

249. Rep.-2002.-V. 20.-P. 1141-1149.

250. Rajbhandari B. P., Dhaubhadel S., Gautam D. M., Gautam B. R. Plant regeneration via calli of leaf and stem explants in common buckwheat ecotypes // Proc. of 6th Int. Symp. on buckwheat, Japan.-1995.-P. 191-196.

251. Rangan T. S. Ovary, ovule and nucellus culture // Experimental embryology of vascular plants / Ed. by Johri B. M.-Berlin, New-York: Springer-Verlag. 1982.-P. 105-129.

252. Raveh D., Galun E. Rapid regeneration of plants from tobacco protoplasts plated at low densities // Z. Pflanzenphysiol.-1975.-V. 76.-P. 76-79.

253. Reinert J. Morphogenese und ihre Kontrolle an Gewebekulturen aus Carotten // Naturwissenschaften.-1958.-Bd. 45, № 14.-P. 344-345.

254. Reinert J. Uber die Kontrolle der Morphogenese und die Induktion von Adventureembryonen an Gewebakulturen aus Carotten // Planta.-1959.-V. 53.-P. 318-333.

255. Reinert J., Tazawa M., Semenoff S. Nitrogen compounds as factors of embryogenesis in vitro II Nature.-1967.-V. 216.-P. 1215-1216.

256. Reynolds J. F., Murashige T. Asexual embryogenesis in callus cultures of palms //In Vitro.-1979.-V. 15.-P. 383-387.

257. Roberts D. R. Abscisic acid and mannitol promote early development, maturation and storage protein accumulation in somatic embryos of interior spruce // Physiol. Plant.-199l.-V. 83.-P. 247-251.

258. Rumyantseva N. I. Protoplasts from different buckwheat species: isolation and culture // Proceedings of 7th Intern. Protoplast Symposium "Progress in Plant Protoplast Research", Uppsala, Sweden, 1991.-Physiol. Plantarum.-199l.-V. 82, N1.-A19.

259. Rumyantseva N., Fedoseeva N., Abdrakhmanova G., Nikolskaya V., Lopato S. Interspecific hybridisation in the genus Fagopyrum using in vitro embryo culture // Proc. of 6th Int. Symp. on Buckwheat, Japan.-1995.-V. l.-P. 211-220.т

260. Rumyantseva N.I., Strashko О. V., Fedoseeva N. V., Nikolskaya V. G., Lozovaya V. V. Biotechnology of buckwheat // Proc. of Intern. Conf. "Biology of cell cultures and biotechnology", Alma-Ata, Kazakhstan, 1993.-P. 156.

261. Sahoo Y., Pattnaik S. K., Chand P. K. Plant regeneration from callus cultures of Morus indica L. derived from seedlings and mature plants // Scientia Hort.-1997.-V. 69.-P. 85-98.

262. Saini R., Jaiwal P. K. Age, position in mother seedling, orientation, and polarity • of the epicotyl segments of blackgram (Vigna mungo L. Hepper) determines itsmorphogenic response // Plant Sci.-2002.-V. 163.-P. 101-109.

263. Samaj J., Baluska F., Bobak M., Volkmann D. Extracellular matrix surface network of embryogenic units of friable maize callus contains arabinogalactan-proteins recognized by monoclonal antibody JIM4 // Plant Cell Rep.-1999,-V. 18.-P. 369-374.

264. Samimy C., Bjorkman Т., Siritunga D., Blanchard L. Overcoming the barrier to interspecific hybridisation of Fagopyrum esculentum with wild Fagopyrum tataricum II Euphytica.-1996.-V. 91.-P. 323-330.

265. Schenk R. U., Hildebrandt A. C. Production of protoplasts from plant cells in liquid culture using purified commercial cellulases // Crop Sci.-1969.-V. 9.-P. 629-631.

266. Schenk R. U., Hildebrandt A. C. Medium and techniques for induction of growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Can. J. Bot.-1972.-V. 50.-P. 166-204.

267. Schiavone F. M., Cooke T. J. A geometric analysis of somatic embryo formation in carrot cell culture // Can. J. Bot.-1985.-V. 63.-P. 1573-1578.

268. Schiavone F. M., Racusen R. H. Microsurgery reveals regional capabilities for pattern reestablishment in somatic carrot embryos // Develop. Biol.-1990.-V. 14l.-P. 211-219.

269. Schieder O. Hybridization experiments with protoplasts from chlorophyll-deficient mutants of some Solanaceous species // Planta.-1977.-V. 137.-P. 253-257.т

270. Sharma P., Rajam M. V. Spatial and temporal changes in endogenous polyamine levels associated with somatic embryogenesis from different hypocotyl segments of eggplant (Solarium melongena L.) // J. Plant Physiol.-1995.-V. 146, № 5-6.-P. 658-664.

271. Sharp W. R., Sondahl M. R., Caldas L.S., Maraffa S. B. The physiology of in vitro asexual embryogenesis // Hortic. Rev.-1980.-V. 2.-P. 2658-310.

272. Shepard J. F., Bidney D., Shanin E. Potato protoplasts in crop improvement // * Science.-1980.-V. 20-8.-P. 17-24.

273. Sim G.-E., Loh C.-S., Goh C.-J. Direct somatic embryogenesis from protoplasts of Citrus mitis Blanco // Plant Cell Rep.-1988.-V. 7.-P. 418-420.

274. Skoog F., Miller С. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro II Symp. Soc. Exp. Biol. "The biological action of growth substances" No. 11 / Ed. Porter H. K.-Cambridge: Univ. Press. 1957.-P. 118-131.

275. Smith D. L., Krikorian A. D. Somatic proembryo production from excised, ф wounded zygotic carrot embryos on hormone-free medium: evaluation of theeffects of pH, ethylene and activated charcoal // Plant Cell Rep.-1990.-V. 9.-P. 468-470.

276. Smith J. A., Sung Z. R. Increase in regeneration of plant cells by cross feeding with regenerating Daucus carota cells // Somatic Embryogenesis / Ed. by Terzi M., Pitto L., Sung Z. R.-Rome: Incremento Produttivita Risorse Agricole. 1985.-P. 133-136.

277. Smith S. M., Street H. E. The decline of embryogenic potential as callus and suspension cultures of carrot {Daucus carota) are serially subcultured // Ann. Bot.-1974.-V. 38.-P. 223-241.

278. Souter M., Lindsey K. Polarity and signalling in plant embryogenesis // J. Exp. Bot.-2000.-V. 51, № 347.-P. 971-983.

279. Srejovic V., Neskovic M. Regeneration of plants from cotyledon fragments of buckwheat {Fagopyrum esculentum Moench.) // Z. Pflanzenphysiol.-1981.-V. 104.-P. 37-42.

280. Srejovic V., Neskovic M. Formation and anatomy of buckwheat organogenic callus tissue in vitro // Bulletin de l'Universite de Beograd.-1983.-V. XVII,-P. 45-50.

281. Sterk P., Booij H., Schellekens G. A., van Kammen A., de Vries S. C. Cell-specific expression of the carrot EP2 lipid transfer protein gene // Plant Cell.-1991.-V. 3,№9.-P. 907-921.

282. Steward F. C. Growth and organized development of cultured cells. III.• Interpretations of the growth from free cells to carrot plants // Amer. J. Bot.1958.-V. 45, № 10.-P. 709-713.

283. Steward F. C., Ammirarato P. V., Mapes M. O. Growth and Development of Totipotent Cells: Some Problems, Procedures, and Perspectives // Ann. Bot.-1970.-V. 34.-P. 761-787.

284. Steward F. C., Mapes M. O., Hears K. Growth and organized development of cultured cells. II. Organization in cultures grown from freely suspended cells // Am. J. Bot.-1958.-V. 45.-P. 705-708.

285. Steward F. C., Mapes M. O., Kent A.E., Holsten R. D. Growth and developmentof cultured plant cells // Science.-1964.-V. 143, № 2.-P. 20-27.

286. Street H. E. Single-cell clones derivation and selection // Plant tissue cell culture / Ed. by Street H. E.-Oxford: Blackwell. 1977.-P. 207-222.

287. Street H. E., Withers L. A. The anatomy of embryogenesis in culture // Proc. Ill Intern. Congress Plant Tissue and Cell Culture, Leicester.-1974.-P. 71-100.

288. Strickland S. G., Nichol J. W., Mc Call С. M., Stuart D. A. Effects of carbohydrate source on alfalfa somatic embryogenesis // Plant Sci.-1987.-V. 48.-P. 113-121.

289. Suh H. W., Goforth D. R., Cunningham B. A., Liang G. H. Biochemical characterization of six trisomies of grain sorghum, Sorghum bicolor (L.) Monench. //Biochem. Genet.-1977.-V. 15.-P. 611-620.

290. Suvorova G. N., Fesenko N. N., Kostrubin M. M. Obtaining of interspecific buckwheat hybrid (Fagopyrum esculentum Moench. x F. cymosum Meissn.) // Fagopyrum.-1994.-№. 14.-P. 13-16.

291. Suvorova G., Fesenko N. V., Fesenko M. Buckwheat micropropagation by means of meristem culture // Proc. of 7th Int. Symp. on buckwheat, Canada.-1998.-P. V-25-31.

292. Swamy B. G. L., Krishnamurthy К. V. On embryos and embryoids // Proc. Indian Acad. Sci.-1981.-V. 96.-P. 401-414.

293. Takahata Y., Jumonji E. Plant regeneration from hypocotyl sections and callus in buckwheat // Ann. Rep. Fac. Educ., Iwate Univ.-1985.-V. 45, № 1.1. P. 137-142.

294. Takebe I., Labib G., Melchers G. Regeneration of whole plants from isolated mesophyll prtotoplasts of tobacco // Naturwissenschaften.-1971.-V. 58.-P. 318-320.

295. Tang W., Guo Z. In vitro propagation of loblolly pine via direct somatic organogenesis from mature cotyledons and hypocotyls // Plant Growth Reg.-2001.-V. 33.-P. 25-31.

296. Thorpe T. A. In vitro organogenesis and somatic embryogenesis: physiological ^ and biochemical aspects // Morphogenesis in Plants / Eds. Roubelakis-Angelakis

297. K.A., Tran Thanh Van K.M.-New York: Plenum Press. 1993.-P. 19-38.

298. Thorpe T. A., Meier D. D. Starch metabolism respiration and shoot formation in tobacco callus cultures // Physiol. Plantarum.-1972.-V. 27, № l.-P. 365-369.

299. Thorpe T. A., Patel K. R. Clonal propagation: adventitious buds // Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, V. 1 / Ed. by Vasil I. K.-Orlando, Florida: Academic Press, Inc. 1984.-P. 49-60. ,

300. Tisserat В., Esan В. В., Murashige T. Somatic embryogenesis in angiosperm // Hortic. Rev.-1979.-V. l.-P. 1-78.

301. Toonen M. A. J., Hendriks Т., Schmidt E. D. L., Verhoeven H. A., van Kammen A., de Vries S. C. Description of somatic embryo forming single cells in carrot suspension cultures employing video cell tracking // Planta.-1994.-V. 194.-P. 565-572.

302. Tran Thanh Van K. Control of morphogenesis in in vitro cultures // Ann. Rev. Plant Physiol.-198l.-V. 32.-P.291-311.

303. Tremblay L., Tremblay F. M. Carbohydrate requirements for the development of black spruce (Picea mariana (Mill) B. S. P.) and red spruce (P.rubens Sarg.) somatic embryos // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1991.-V. 27.-P. 95-103.

304. Tremblay L., Tremblay F. M. Maturation of black spruce somatic embryos: Sucrose hydrolysis and resulting osmotic pressure of the medium // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1995.-V. 42.-P. 39-46.

305. Ujihara A., Nakamura Y., Minami M. Interspecific hybridisation in genus ♦ Fagopyrum Propeties of hybrids (F. esculentum Moench. x F. cymosum

306. Meissner) through ovule culture // Gamma Field Symposia, Japan.-1990.-№ 29.-P. 45-53.

307. Van Engelen F. A., de Vries S. C. Extracellular proteins in plant embryogenesis // TIG.-1992.-V. 8, № 2.-P. 66-70.

308. Vardi A., Spiegel-Roy P., Galun E. Citrus cell culture: Isolation of protoplasts, plating densities, effect of mutagens and generation of embryos // Plant. Sci. Lett.-1975.-V. 4.-P. 231-236.

309. Vasil I., Vasil V., Sutton W. D., Giles K. L. Protoplasts as tools from the geneticmodification of plants // Proc. Int. Symp. Yearst and Other Protoplasts, University of Nottingham.-1975.-P. 82.

310. Vasil V., Vasil I. K. Somatic embryogenesis and plant regeneration from suspension cultures of pearl millet {Pennisetum americanum) II Ann. Bot.-1981.-V. 47.-P. 669-678.

311. Verhagen S. A., Wann S. R. Norway spruce somatic embryogenesis: high-frequency initiation from light-cultured mature embryos // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1989.-V. 16.-P. 103-111.

312. Verma D. C., Dougall D. K. Influence of carbohydrates on quantitative aspects of growth and embryo formation in wild carrot suspension cultures // Plant Physiol.-1977.-V. 59.-P. 81-85.

313. Vyskot В., Gazdova В., Siroky J. Methylation patterns of two repetitive DNA sequences in tobacco tissue cultures and their regenerants // Biol. Plant.-1993,-V. 35.-P. 321-327.

314. Wang Y. J., Campbell C. Interspecific hybridisation among Fagopyrum esculentum, F. homotropicum and F. tataricum // Proc. of 7th Int. Symp. on buckwheat, Canada.-1998.-P. 1-1-12.

315. Warren G. S., Fowler M. W. Physiological interactions during the initial stages of embryogenesis in cultures of Daucus carota L. // New Phytol.-198l.-V. 87.-P. 481-486.

316. Warren Wilson J., Warren Wilson P. M. Mechanisms of auxin regulation of structural and physiological polarity in plants, tissues cells and embryos // Austral. J. Plant Physiol.-1993.-V. 20.-P. 555-571.

317. Weatherhead M. A., Burdon J., Henshaw G. G. Some effects of activated charcoal as an additive to plant tissue culture media // Z. Pflanzenphysiol.-1978.-V. 89.-P. 141-147.

318. Weber H., Borisjuk L., Wobus U. Sugar import and metabolism during seed development // Trends Plant Sci.-1997.-V. 2.-P. 169-174.

319. Wernicke W., Potrykus I., Thomas E. Morphogenesis from cultured leaf tissue of Sorghum bicolour the morphogenetic pathways // Protoplasma.-1982.-V. 111.-P. 53-62.

320. Wetherell D. F. Enhanced adventive embryogenesis resulting from plasmolysis of cultured wild carrot cells // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1984.-V. 3.-P. 221-227.

321. White P. R. The Cultivation of Animal and Plant Cells // 2nd ed. New York: Roland Press. 1963.-239 p.

322. Williams E. G., Maheswaran G. Somatic Embryogenesis: Factors Influencing Coordinated Behaviour of Cells as an Embryogenic Group // Annals of Botany.-1986.-V. 57.-P. 443-462.

323. Williams M. E., Hepburn A. G., Widholm J. M. Somaclonal variation in a maize inbred line is not associated with change of a number or location of Ac-homologous sequences // Theor. Appl. Genet.-199l.-V. 8l.-P. 272-276.

324. Wilms F. H. A., Sassen M. M. A., Origin and development of floral buds in tobacco explants // New Phytol.-1987.-V. 105.-P. 57-65.

325. Witjaksono, Litz R. E. Maturation of avocado somatic embryos and plant recovery//Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1999.-V. 58.-P. 141-148.

326. Woo S. H., Adachi T. Production of interspecific hybrids between Fagopyrum esculentum and F. homotropicum through embryo rescue // SABRAO J.-1997.-V. 29.-P 89-95.

327. Woo S. H., Jong S. K., Adachi T. Plant regeneration from hypocotyl of common buckwheat (Fagopyrum esculentum) and wild buckwheat (F. homotropicum) II Proc. of 7th Intern. Symp. on buckwheat, Canada, 1998-P. I- 326-333.

328. Woo S. H., Nair A., Adachi Т., Campbell C. G. Plant regeneration from cotyledon tissues of common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) // In Vitro Cell Dev. Biol.- Plant.-2000.-V. 36.-P. 358-361.

329. Woo S. H., Wang Y. J., Campbell C. G. Interspecific hybrids with Fagopyrum cymosum in the genus Fagopyrum // Fagopyrum.-1999.-№ 16.-P. 13-18.

330. Xu N., Coulter К. M., Bewley J. L. Abscisic acid and osmoticum prevent germination of developing alfalfa embryos but only osmoticum maintains the synthesis of developmental proteins // Planta.-1990.-V. 182.-P. 382-390.

331. Xu Z. H., Huang В., Sunderland N. Culture of barley anthers in conditioned media // J. Exp. Bot.-1981.-V. 32.-P. 767-778.

332. Yamane Y. Induced differentiation of buckwheat plants from subcultured calluses in vitro I/ Japan J. Genetics.-1974.-V. 49.-P. 139-146.

333. Yeung E. C. Structural and developmental patterns in somatic embryogenesis // In vitro Embryogenesis in Plants / Ed. by Thorpe T. A.-Dordrecht: Kluwer Acad. Pub.-1995.-V. 20.-P. 205-247.

334. Yoshihiko Т., Hiroshi M. Duration of treatment of carrot hypocotyl explants with 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid for direct somatic embryogenesis // Biosci. Biotechnol. Biochem.-1996.-V. 60, № 5.-P. 891-892.

335. Yu W. C., Joyce P. J., Cameron D. C., McCown В. H. Sucrose utilization during potato microtuber growth in bioreactors // Plant Cell Rep.-2000.-V. 19.-P. 407-413.

336. Zimmerman J. L. Somatic embryogenesis: a model for early development in higher plants//Plant Cell.-1993 .-V. 5.-P. 1411-1423.