Реакция культивируемых клеток на анаэробный стресс и получение in vitro устойчивых к затоплению растений

Степанова, Анна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реакция культивируемых клеток на анаэробный стресс и получение in vitro устойчивых к затоплению растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Реакция культивируемых клеток на анаэробный стресс и получение in vitro устойчивых к затоплению растений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

Степанова Анна Юрьевна

Реакция культивируемых клеток на анаэробный стресс и получение in vitro устойчивых к затоплению растений (на примере сахарного тростника и пшеницы)

Специальность 03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в лаборатории генетики культивируемых клеток отдела биологии клетки и биотехнологии и в группе анаэробиоза Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Вартапетян Борис Багратович кандидат биологических наук Долгих Юлия Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гринева Галина Михайловна

доктор биологических наук, профессор Мазин Валентин Викторович

Ведущая организация:

Кафедра физиологии растений Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева

Защита состоится «28» октября 2003 г. в 13.00 на заседании Диссертационного совета К 002.210.01 в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276 Москва, ул. Ботаническая, 35, Факс: (095) 977-80-18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «¿6» сентября 2003 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук

2oOj-A

\i4jc>

Актуальность проблемы

Дефицит кислорода в среде обитания (гипоксия и аноксия) существенно влияет на метаболизм высших растений, которые, являясь облигатными аэробами, нуждаются в постоянном притоке молекулярного кислорода извне. Чаще всего дефицит кислорода испытывают растения на переувлажненных и затопленных почвах ввиду низкой растворимости и скорости диффузии кислорода в воде. Тем не менее, многие виды высших растений постоянно обитают на переувлажненных и даже затопленных почвах, что предполагает наличие механизмов адаптации. Существуют, по крайней мере, две главные стратегии адаптации высших растений в условиях анаэробного стресса: адаптация на уровне всего организма, анатомо-морфологические особенности которого облегчают транспорт молекулярного кислорода из аэрируемых частей в органы, локализованные в анаэробной среде (кажущаяся толерантность), и так называемая метаболическая адаптация, реализующаяся на молекулярном уровне в условиях отсутствия кислорода в среде (истинная толерантность). Эта концепция, выдвинутая около 20 лет назад (Vartapetian, 1978), теперь является общепринятой (Blom et ai, 1993; Ricard et a/., 1994; Drew, 1997; Vartapetian, Jackson, 1997; Jackson, Armstrong, 1999). Несмотря на то, что в последние два десятилетия интерес к анаэробиозу растений резко возрос, и проблема активно изучается с различных точек зрения, биотехнологические подходы, использующие культивируемые in vitro клетки, до сих пор сравнительно редко использовались для этих целей. Между тем, культивируемые клетки являются удобной моделью для изучения клеточной устойчивости к анаэробному стрессу и могут быть использованы для получения устойчивых к затоплению форм. Клеточная селекция уже зарекомендовала себя как перспективный способ получения растений, устойчивых к таким стрессовым факторам, как засоление, засуха, тяжелые

металлы, экстремальные температуры

1994;

Narayanan et at., 1989; Freytag et al., 1990; Belowaly, Bouharmont, 1992; Bajji, «¡net, 1995). Всего в одной работе (Харинарайн с соавт., 1996) была показана принципиальная возможность отбора in vitro клеточных линий и растений сахарного тростника, выдерживающих продолжительный дефицит кислорода. Однако при этом почти не была исследована реакция культивируемых клеток на аноксию, а методика отбора устойчивых клеток требовала оптимизации.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы состоит в том, чтобы на основании исследования действия анаэробного стресса на культивируемые клетки усовершенствовать систему селекции и получить растения, стабильно устойчивые к корневому затоплению. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности действия анаэробного стресса на культивируемые клетки сахарного тростника и пшеницы.

2. Усовершенствовать систему отбора in vitro толерантных клеток и получить устойчивые клеточные линии.

3. Исследовать возможные механизмы устойчивости (метаболизм углеводов, динамика этанольного брожения, роль анаэробносинтезируемых белков) толерантных клеток.

4. Получить разработанным методом толерантные растения и проверить наследование устойчивости.

Научная новизна работы

Впервые была исследована реакция культивируемых клеток сахарного тростника и пшеницы на аноксию. Разработана оригинальная схема селекции и получена устойчивая к аноксии клеточная линия сахарного тростника. Показано, что толерантность отобранной линии в

I «*! >?гЛ

условиях аноксии обусловлена продолжительным гликолизом и этанольным брожением, обеспеченными активной утилизацией крахмала и активным синтезом анаэробных белков-ферментов. Из отобранных устойчивых клеток сахарного тростника и пшеницы были получены растения, обладающие повышенной, по сравнению с исходными формами, устойчивостью к затоплению. Для пшеницы показано сохранение устойчивости в первом семенном поколении.

Практическая значимость работы

Полученные резистентные формы пшеницы и сахарного тростника могут служить основой для создания новых форм, обладающих устойчивостью к корневому затоплению. Разработанный метод клеточной селекции может быть применен для отбора других видов сельскохозяйственных растений, толерантных к дефициту кислорода.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на:

1. Международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия». (Москва, 4-9 октября 1999 г.)

2. 7-th Conference of the Intern. Society for Plant Anaerobiosis (Nijmegen, 12-16 june, 2001).

3. Расширенном семинаре отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН им. КАТимирязева (Москва, 2001).

4. Молодежной конференции ИФР РАН (Москва, 4 марта 2003).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на /W страницах машинописного текста,

содержит 6 таблиц, 34" рисунков. Список использованной литературы включает ¿/¿наименований.

Материалы и методы исследований

В качестве объекта исследований использовали коммерческий сорт сахарного тростника (БассЛашт оШстагит 1~) РСМ 2878 и скороспелый сорт яровой мягкой пшеницы (ТпИсит аев^ит 1-.) «Таежная». Каллус пшеницы получали из незрелых зародышей на 14-е сутки после опыления. Для каплусообразования в чашку Петри помещали по 20 зародышей щитком вниз на модифицированную агаризованую среду Мурасиге-Скуга (МС) (МигавЫде, Экоод, 1962) с добавлением 2,5 мг/л 2,4-Д. Для регенерации растений каллус переносили на среду МС без гормонов. Для укоренения использовали среду, содержащую половинную норму солей по МС и 1мг/л НУК. Каллус сахарного тростника получали из молодых неразвернувшихся листьев 3-4-месячных растений. Для индукции и роста каллуса использовали модифицированную (Харинарайн с соавт., 1996) агаризованную среду МС с добавлением 3 мг/л 2,4 - Д. Для регенерации растений каллус пересаживали на среду МС с 1 мг/л НУК и 1 мг/л кинетина. Регенерированные побеги пересаживали на среду Шенка и Хильдебрандта (вИепк, НИс1еЬгапсй, 1972) с 1 мг/л НУК для укоренения. Регенерационную способность сахарного тростника и пшеницы определяли как отношение числа каллусов, образовавших растения - регенераты, к общему числу проанализированных каллусов, выраженное в процентах. Полностью сформированные растения сахарного тростника и пшеницы перед высадкой в почву адаптировали в оранжерее: сначала 2 дня в открытых культуральных сосудах на агаризованной среде, а затем 5 дней в воде с половинным количеством солей по МС.

Анаэробные условия создавали двумя методами. В первом случае каллусную ткань инкубировали под слоем жидкой питательной среды в

колбах в атмосфере азота, которую создавали продуванием азота в течение 20 мин. Во втором случае условия анаэробиоза создавали описанным ранее способом эвакуации атмосферы (Costes, Vartapetian, 1978) в лиофильных приборах объемом 200 мл. После анаэробной инкубации разной продолжительности каллусную ткань сахарного тростника и пшеницы разделяли на инокулюмы массой 40 мг и высаживали на агаризованную питательную среду (МС) в условиях нормальной аэрации. В каждом варианте опыта было по 100 инокулюмов. Через месяц каллусы взвешивали и определяли индекс роста как разницу между конечной массой и начальной, деленную на начальную. Выживаемость каллусных тканей определяли по степени возобновления в условиях нормальной аэрации роста по сравнению с контрольным каллусом, который не испытывал недостатка кислорода. Часть каллусной ткани сахарного тростника фиксировали 2.5%-ым глютаровым альдегидом для электронно-микроскопических исследований. Состояние клеток после аноксии анализировали под электронным микроскопом TEMSCAN 100СХ («JEOL» Япония). Методика определения описана ранее в работе Andreev et al., 1991. (Andreev et al., 1991).

Интенсивность гликолиза и брожения определяли по накоплению этанола по методу, описанному Andreev, Vartapetian (1992). Содержание растворимых углеводов определяли по методу Дюбуа и др., (1956) после экстракции кипящим спиртом и перевода в водный раствор. Крахмал определяли в растительном осадке, образованном после экстракции растворимых углеводов (Туркина, Соколова, 1971).

Для изучения реакции растений - регенерантов сахарного тростника на гипоксию их выращивали в почве в течение 30 дней в условиях корневого затопления. Для исследования реакции растений - регенерантов пшеницы на гипоксию, их выращивали в течение 7-14 дней в условиях корневого

затопления. Уровень воды над поверхностью почвы составлял 5 см.

Результаты и обсуждения

1. Изучение реакции культивируемых клеток сахарного тростника и пшеницы на аноксию

Для разработки условий селекции нужно было предварительно определить реакцию на аноксию каллусных клеток сахарного тростника и пшеницы.

Действие анаэробиоза на кагшусные клетки сахарного тростника изучали, наблюдая за динамикой изменения ультраструктуры клеток, главным образом митохондрий, в процессе анаэробной инкубации разной продолжительности в присутствие экзогенной глюкозы и без нее. В качестве контроля служили клетки каллуса до анаэробного воздействия.

В аэробных условиях каллусные клетки имели нормальную ультраструктуру, характерную для клеток растений. Инкубация каллуса в анаэробных условиях в среде с глюкозой в течение 96 ч не вызвала деструктивных изменений в ультраструктуре митохондрий и других органелл (микрофотографии приведены в диссертации).

Несмотря на отсутствие визуальных повреждений ультраструктуры, через 72 ч анаэробной инкубации в присутствии глюкозы часть клеток утратила способность к возобновлению роста. По мере увеличения продолжительности анаэробной инкубации жизнеспособность клеток постепенно понижалась. Тем не менее, после четырнадцатидневной анаэробной обработки в культуре оставались отдельные живые клетки, благодаря делению которых в условиях нормальной аэрации восстанавливался рост каллуса (табл.1).

Таблица 1. Индекс роста каллуса сахарного тростника, прошедшего анаэробную инкубацию на среде с 3%-ной глюкозой, после месяца культивирования в условиях нормальной аэрации

Время анаэробной инкубации, сут Индекс роста % к контролю

Контроль 5,7 ± 0,51 100

3 3,0 ± 0,29 53,0 ± 5,0

5 2,9 ± 0,31 50,8 ± 5,4

7 2,5 ± 0,27 43,8 ±4,7

9 1,5 ± 0,14 26,3 ± 2,4

14 0,2 ± 0,06 3,3 ±1,1

При инкубации каллуса в условиях аноксии в среде без углеводов деструкцию митохондрий в отдельных клетках отмечали уже после шестичасовой обработки, однако до 70% клеток ещё содержали нормальные митохондрии с правильно организованными кристами. После 24 ч анаэробиоза состояние клеточных органелл также существенно не менялось, но после 48 ч наблюдали заметную деструкцию значительной части митохондрий: появлялись разбухшие митохондрии без крист, с просветленным матриксом. Существенные изменения происходили и в цитоплазме: резко сокращалось количество рибосом, эндоплазматический ретикулум был представлен одиночными цистернами. Интактная ультраструктура митохондрий сохранялась лишь у 7-10% клеток, которые, по-видимому, обладали повышенной устойчивостью. Даже после 72 ч аноксии можно было обнаружить отдельные митохондрии с неповрежденной ультраструктурой, но после 96 ч анаэробиоза почти все митохондрии и другие субклеточные структуры подверглись полной деградации. Такое состояние митохондрий соответствует высокой степени

их повреждения и является необратимым. Несмотря на отсутствие явных деструктивных изменений в ульраструктуре митохондрий, примерно 50% клеток потеряли способность к росту уже после шестичасовой анаэробной инкубации в отсутствие глюкозы. После 48 ч анаэробиоза способность к росту и регенерации сохранялись примерно у 13% клеток. Рост каллуса возобновлялся благодаря делению небольших групп клеток у некоторых калпусных инокулюмов. Эти результаты, как и данные электронной микроскопии, свидетельствуют о гетерогенности клеток каллусов сахарного тростника в отношении устойчивости к недостатку кислорода. Дальнейшее увеличение продолжительности анаэробной инкубации приводило к потере ростового потенциала клеток, после 96 ч анаэробиоза практически не оставалось клеток, способных к росту. Инкубация клеток в условиях аноксии приводила и к значительному снижению способности к морфогенезу. После суток пребывания в анаэробных условиях в среде без глюкозы только 15% каллусов были способны к регенерации растений, после 48 часов - 9%. После 72 и 96 часов каллус полностью терял способность к морфогенезу (табл.2).

Реакцию на аноксию культивируемых клеток пшеницы определяли только на среде без глюкозы. Каллус пшеницы оказался более чувствительным, чем каллус сахарного тростника: инкубация в анаэробных условиях в течение 48 часов вызывала более резкое замедление роста и полную потерю морфогенетического потенциала (рис.1). Более высокая по сравнению с ростом чувствительность процесса морфогенеза к стрессам отмечалась и другими авторами для сахарного тростника (Харинарайн с соавт., 1996), риса (Белянская с соавт., 1994) и ячменя (Россеев, 1995). Вероятно, процесс дифференцировки, связанный с активными клеточными делениями, требует больше энергии и поэтому сильнее страдает в условиях стресса.

Таблица 2. Индекс роста каллуса сахарного тростника и способность к регенерации после анаэробной инкубации в среде без глюкозы

Время анаэробной инкубации, ч Индекс роста % к контролю Регенерировавшие каллусы, %

Контроль 4,63 ± 0,50 100 85 ±3,1

6 2,35 ± 0,25 50,7 ± 5,4

24 1,47 ±0,15 31,7 ±3,2 15 ±2,5

48 0,60 ± 0,09 13,0 ±2,0 9 ±2,1

72 0,55 ±0,10 11,8 ±2,2 0

96 0,16 ±0,01 3,5 ±0,3 0

I 30

24 32 48

Продолжительность аноксии, ч Рис 1. Индекс роста каллуса пшеницы и способность к регенерации после анаэробной инкубации в среде без глюкозы 1 - индекс роста, % к контролю; 2 - регенерировавшие каллусы, %

Существенное повышение жизнеспособности клеток сахарного тростника на среде с глюкозой указывает на ключевую роль энергетического метаболизма в адаптации клеток к условиям кислородной недостаточности. Исходя из этих соображений, а, также принимая во внимание то обстоятельство, что растения в естественных условиях обитания в состояние утилизировать лишь эндогенные резервы углеводов, дальнейшие работы по селекции толерантных клеточных линий и растений было целесообразно проводить с каллусами, которые анаэробно инкубировали в отсутствии экзогенной глюкозы. Использование среды без углеводов должно было способствовать отбору клеток либо с большими запасами эндогенных углеводов, либо с более эффективным их использованием. Кроме того, более жесткие селективные условия в отсутствии экзогенной глюкозы позволяли значительно быстрее элиминировать чувствительные к анаэробиозу клетки. В этом состояло принципиальное отличие нашей схемы от предложенной ранее (Харинарайн с соавт., 1996), в которой авторы для отбора устойчивой клеточной линии использовали среду с 3% сахарозой.

Поскольку основной задачей клеточной селекции являлось получение не только толерантных к аноксии клеточных линий, но и растений -регенерантов, в качестве селективной для сахарного тростника, была выбрана 48-часовая инкубация в анаэробных условиях в среде без глюкозы, то есть экспозиция, после которой некоторые клетки еще сохраняют морфогенетический потенциал, а для культивируемых клеток пшеницы была выбрана 32 -часовая экспозиция.

2. Отбор устойчивых к аноксии клеток и получение толерантных к корневому затоплению растений сахарного тростника и пшеницы

Селекцию резистентных к аноксии клеток сахарного тростника проводили в несколько этапов. На первом этапе каллус сахарного тростника

инкубировали без кислорода в течение 48 ч, а затем культивировали в течение месяца в условиях нормальной аэрации. После месяца культивирования часть клеток была отсажена для получения растений. Остальные каллусы повторно инкубировали в условиях аноксии, увеличив экспозицию до 72 ч. Выжившие после второго этапа селекции клетки, подвергали действию 96-часового анаэробиоза и отбирали растущие клоны. После трех этапов селекции была выделена клеточная линия сахарного тростника, значительно более толерантная к аноксии (табл.3).

Таблица 3. Отбор толерантной клеточной линии и растений-регенерантов сахарного тростника

Этапы селекции Продолжительность аноксии, ч Общее число каллусов Число устойч. клонов Число регенер. т УИго Число регенер. в почве

1 48 800 160 70 36

II 72 90 60 - -

III 96 100 90 - -

IV 96 100 100 - -

Выделенная линия отличалась от исходного каллуса по интенсивности роста и морфологическим особенностям. Индекс роста отселектированной линии после месяца культивирования был равен 13, в то время как у исходной культуры масса клеток увеличивалась за это же время в среднем в 5-6 раз. Устойчивая линия была однородной, водянистой, белого цвета, в отличие от гетерогенной, сухой, желтоватой ткани исходного каллуса. Отселектированная линия была более устойчива к анаэробным условиям: даже после 96 ч аноксии половина клеток сохраняла способность к

делению, тогда как для исходного каллуса такая выживаемость была отмечена только после 6-часового анаэробиоза (рис.2).

120

6 24 48 72 96

Время анаэробной инкубации, ч Рис.2. Индекс роста каллуса, прошедшего анаэробную

инкубацию, после месяца культивирования в нормальных условиях 1- исходный каллус, 2-устойчивая линия

Для выделения устойчивых клонов пшеницы каллусы инкубировали в условиях анаэробиоза в среде без углеводов в течение 32 часов, затем их пересаживали в условия нормальной аэрации. После месяца культивирования в аэробных условиях светлые экспланты, увеличившиеся в размере, пересаживали на среду для регенерации. Из 392 каллусов было получено 40 растений - регенерантов in vitro, в почве укоренилось только 11.

Таким образом, для получения устойчивых к корневому затоплению растений - регенерантов сахарного тростника и пшеницы была выбрано однократное культивирование в анаэробных условиях с последующим переводом на среду для регенерации. Несмотря на достаточно жесткие

условия, при такой схеме селекции не происходит полной элиминации чувствительных генотипов, и окончательный отбор ведется на уровне регенерантов. Зато, благодаря малой продолжительности культивирования клеток in vitro сохраняется регенерационная способность, и не накапливаются нежелательные сомаклональные вариации. Для получения устойчивой клеточной линии сахарного тростника использовали многоступенчатую селекцию. Такая схема селекции обеспечивает наиболее I полную элиминацию чувствительных клеток.

3. Характеристика резистентной к аноксии клеточной линии

Р.

сахарного тростника

Отобранная в результате селекции in vitro устойчивая к аноксии клеточная линия сахарного тростника была использована для изучения механизмов толерантности. По данным многих авторов, гликолиз, переходящий в спиртовое брожение, является основным путем получения энергии в анаэробных условиях (Good, Muench, 1993; Armstrong, Brandie, 1994). Гибель клеток при недостатке кислорода может происходить в случае слишком слабого гликолиза, который не может поддерживать жизнедеятельность клеток в условиях аноксии (Waters et al., 1991; Brandie, » 1991). Наоборот, очень высокая скорость анаэробного гликолиза приводит к

' более раннему исчерпанию эндогенных резервов углеводов и также к

I гибели клеток. Аналогичная ситуация была описана у трансгенных растений

табака, у которых стимуляция гликолиза путем введения гена пируват декарбоксилазы приводила не к повышению, а напротив, к снижению толерантности к аноксии (Tadege, et al., 1998). В обоих случаях дополнительная подкормка углеводами повышает жизнеспособность так же, как и в наших опытах с сахарным тростником.

При одинаковой интенсивности гликолиза именно содержание эндогенных углеводов может быть решающим для выживания клеток в

условиях аноксии. Клетки, обладающие большими резервами углеводов и

способные утилизировать запасные углеводы, должны быть более i

устойчивыми к аноксии, т.к. это позволяет им более длительный срок

поддерживать энергетический метаболизм и тем самым обеспечивать собственную интактность (Hanhijârvi and Fagerstedt, 1995; Perata et ai, 1996).

Имея контрастные по устойчивости к аноксии клеточные линии, можно было, используя эту удобную модельную систему, подойти к выяснению важнейшего теоретического вопроса, касающегося биохимических механизмов, ответственных за толерантность растений к анаэробному стрессу. Особый интерес в этом отношении представлял круг вопросов, J

относящихся к энергетике клеток. С этой целью нами было исследовано влияние аноксии на динамику этанольного брожения, которое является '

главным энергообеспечивающим механизмом в условиях анаэробиоза, а 1

также влияние на метаболизм углеводов, утилизируемых в процессе J

брожения как исходными каллусами, так и полученной от них устойчивой |

линией. |

В течение первых 24 часов аноксии интенсивное накопление этанола отмечено как у исходного каллуса, так и у устойчивой линии (рис.3). На вторые сутки аноксии скорость выделения этанола у чувствительных клеток •

понизилась, в то время как у устойчивого каллуса за вторые сутки образовалось в 2 раза больше этанола по сравнению с исходным щ

(чувствительным) каллусом (рис 4). В клетках неустойчивого каллуса после 48 часов прекращалось накопление этанола, что совпадало с нашими данными по постанаэробному росту. Гликолиз у устойчивого к аноксии каллуса сохранялся в течение, по крайней мере, 96 часов аноксии. Если сравнивать полученные данные по гликолизу с литературными, то можно сказать, что гликолиз у каппусных линий сахарного тростника достаточно интенсивный (Waters et al., 1991; Zhang, Greenway, 1994; Setter, Ella, 1994;

Schlüter, Crawford, 2003). Следовательно, гибель чувствительных клеток не связана с низкой активностью гликолиза и недостатком АТФ.

Так как гликолиз поддерживается за счет углеводов то, возможно, остановка гликолиза после 48 часов у чувствительной линии связана с быстрой утилизацией эндогенных углеводов, которое обусловлено их небольшим начальным количеством. Чтобы проверить это предположение исследовали количество и динамику изменения углеводов в течение анаэробного периода в двух линиях сахарного тростника.

Продолжительность анаэробной инкубации, ч Рис.3. Влияние аноксии на накопление этанола

1-исходный каллус, 2-устойчивая линия

2,5

О 24 48 72 96 Продолжительность анаэробной инкубации, ч

Рис.4. Посуточное накопление этанола

1- исходный каллус, 2-устойчивая линия

Количество растворимых углеводов и крахмала в аэробных условиях на единицу сырого веса было высоким у обеих линий, но выше у устойчивой линии и соответственно составляло 3% и 2,7% относительно сырого веса; у чувствительной линии - 2,7% и 1,9%. По содержанию углеводов культивируемые клетки сахарного тростника сравнимы с такими устойчивыми к аноксии объектами, как корневища гигрофитов, которые могут сохранять жизнеспособность до нескольких месяцев (Crawford, Brandie, 1994; Zhang and Greenway, 1994; Barclay and Crawford, 1983; Hanhijârvi and Fagerstedt, 1995). Следовательно, запас углеводов не являлся лимитирующим фактором.

В условиях аноксии содержание Сахаров, как у устойчивого, так и неустойчивого каллуса заметно снизилось за первые сутки (рис.5.1, 5.3). После 24 часов уровень растворимых углеводов у устойчивой линии в течение двух суток почти не менялся, в то время как у чувствительной продолжалось расходование Сахаров. После 48 часов количество растворимых углеводов в клетках исходного каллуса упало до критического

уровня. Содержание крахмала у устойчивой линии сильно снизилось за 48 часов аноксии, затем падало незначительно (рис.5.2). У неустойчивой линии крахмал расходовался только первые 24 часа, затем его содержание стабилизировалось (рис.5.4). Таким образом, ограничение жизнеспособности исходного каллуса, вероятнее всего, связано с нарушением системы мобилизации крахмала после 24 часов, что

ф ограничивало пополнение пула растворимых углеводов и, вследствие этого,

лишало гликолиз субстрата. В клетках устойчивой линии, напротив, активное расходование крахмала не прекращалось в течение всего периода

анаэробной инкубации (96 ч), что обеспечивало длительный гликолиз.

(О

с; л

X (О

Ш (О

а5

ш'5 х 9 со 0-о 3

Ф о

(О

о. ф

сс о О

35 30 25 20 15 10 5 О

0 24 48 72 96

Продситм/ггегьнэсгь анаэробной шфацял, ч

Рис. 5. Влияние аноксии на содержание растворимых углеводов и крахмала

1- устойчивая линия (сахара); 2 - устойчивая линия (крахмал) 3 - исходный каллус (сахара); 4 - исходный каллус (крахмал)

Для поддержания гликолиза необходимо не только субстратное, но и ферментативное обеспечение этого процесса. Было показано, что условия кислородной недостаточности вызывают существенную перестройку белкового метаболизма (Маслова и др. 1975, Sachs et al. 1980, Sachs et al. 1996), так как блокируют синтез аэробных белков и индуцируют синтез анаэробных белков - ферментов, катализирующих реакции гликолиза и брожения, а также утилизацию углеводов. Гибель клеток в условиях аноксии может быть, в частности, вызвана блокировкой синтеза ферментов, обеспечивающих гидролиз крахмала, как это показано в работах Perata et al. (1992,1996). Для того чтобы выявить роль анаэробно синтезируемых белков в условиях аноксии мы ингибировали их новообразование с помощью циклогексимида (ЦГ) (10^ М), который блокирует белковый синтез на уровне трансляции (Vartapetian and Poljakova, 1994; Ellis et al., 1999).

В контроле у устойчивой линии содержалось 0,3 мг этанола /г сырого веса. Через сутки аноксии в отсутствии ЦГ было зафиксировано 2,88 этанола мг/г сыр. веса. В присутствии ЦГ наблюдалось явное подавление гликолиза и брожения - за 24 часа анаэробной инкубации образовалось только 0,64 мг этанола/г сыр.веса, что составляло лишь 23% от накопленного этанола за сутки аноксии в отсутствии ЦГ. Результаты приведенных опытов свидетельствуют об активном синтезе анаэробных белков-ферментов, обеспечивающих адекватное протекание этанольного брожения, а, следовательно, энергетических потребностей клеток устойчивой линии в процессе всего анаэробиоза.

4. Характеристика растений, регенерированных из устойчивых клеточных линий

Растения, регенерированные из каллуса после инкубации в условиях кислородной недостаточности, были испытаны в условиях затопления почвы. В качестве контроля служили растения, не прошедшие селекцию.

Результаты показали, что выживаемость растений, прошедших селекцию была выше, чем у контрольных растений.

4.1. Выживаемость растений - регенерантов сахарного тростника сорта РОи2878 в условиях почвенного затопления

В условиях затопления испытывали растения в возрасте 1 месяца. Было проанализировано 24 контрольных растения и 36 растений, * прошедших селекцию. Отселектированные растения обнаружили явное

преимущество по толерантности к корневому затоплению по сравнению с ^ исходными формами: после месяца гипоксии, при температуре 20°С, 34

растений сохранили жизнеспособность, в то время как в контрольном варианте -11. Используемый сорт сахарного тростника РСи 2878 является межвидовым гибридом, поэтому семенами он не размножается, что не дает возможности проверить наследование устойчивости. Поэтому анализ потомства проводили только для растений - регенерантов пшеницы.

4.2. Выживаемость растений - регенерантов пшеницы сорта «Таежная» в условиях почвенного затопления

Растения - регенераты пшеницы были испытаны в возрасте двух } недель. После 16 дней затопления при 26°С осталось 73% растений,

полученных из отселектированной линии и, 33% контроля. Семена выживших растений, полученных после селекции, были использованы для получения и анализа потомства. Все растения имели нормальную мррфологию и не отличались от контрольной линии (табл.4). При тестировании потомства регенерантов Ш в почвенном опыте показано сохранение устойчивости.

Таблица 4. Выживаемость потомства растений - регенерантов после 8 дней затопления при температуре 32°С

Растения Количество растений Количество выживших растений Выживаемость, %

Контроль 20 0

Растения, полученные от устойчивых регенерантов 22 7 32

Растения, полученные от регенерантов, не прошедших селекцию 22 1 4,5

Полученные результаты говорят о том, что толерантность выделенных нами растений имеет генетическую природу. Все это указывает на перспективность включения методов культуры тканей в селекцию пшеницы и сахарного тростника на устойчивость к затоплению.

Выводы

1. Электронно-микроскопические исследования состояния ультраструктуры клеток сахарного тростника, культивируемых аэробно in vitro, а затем инкубируемых анаэробно в среде с глюкозой и без глюкозы, выявили резкие различия в тонкой структуре мембран митохондрий: в присутствии экзогенной глюкозы даже после 96 часов анаэробной инкубации клеток не наблюдалось деструкции ультраструктуры митохондрий и других субклеточных структур, тогда как в отсутствии экзогенной глюкозы явная деструкция мембран митохондрий в отдельных клетках имело место уже через 6 часов анаэробиоза.

2. Выживаемость клеток, оцененная по постанаэробному росту, была значительно выше в присутствии экзогенной глюкозы. После 6 часов инкубации в условиях аноксии в среде без углеводов способность к постанаэробному росту оставалось у 50% клеток, что было равносильно пяти-суточной инкубации каллуса в среде с углеводами.

3. Опираясь на результаты как электронно-микроскопических наблюдений, I так и опытов по выявлению способности анаэробно культивируемых клеток

к постанаэробному росту и морфогенезу, была разработана технология многоступенчатой селекции клеточных линий, толерантных к анаэробному

стрессу в отсутствии экзогенного сахара, предусматривающая постепенное увеличение продолжительности аноксии.

4. Клеточная линия сахарного тростника, отобранная после многоступенчатой селекции, выдерживала 96 ч аноксию в отсутствии экзогенного сахара, сохраняя при этом способность к постанаэробному росту. Данная линия была использована в качестве модельной системы для проведения теоретических исследований, в частности, для выяснения биохимических механизмов, обеспечивающих высокую толерантность клеток растений к анаэробному стрессу.

5. В сравнительных исследованиях динамики этанольного брожения, которое является единственным энергообеспечивающим процессом в условиях анаэробиоза, показано, что у клеток толерантной линии этанольное брожение активно протекает, по крайней мере, в течение 96 часов анаэробной инкубации, тогда как у чувствительных клеток после 24 часов наблюдается заметное, а после 48 часов почти полное ингибирование этанольного брожения.

6. Исследование динамики утилизации эндогенных углеводов показало более длительное и активное использование крахмала в процессе анаэробной инкубации у толерантной клеточной линии по сравнению с

! \

контрольными более чувствительными к аноксии клетками.

7. Ингибирование циклогексимедом синтеза анаэробных белков, большинство которых является ферментами гликолиза и брожения, а также утилизации углеводов, приводило к резкому подавлению этанольного брожения у толерантных клеток и к существенной потере толерантности.

8. На основании сравнительного изучения динамики метаболизма углеводов и этанольного брожения, а также реакции клеток на • ингибирование синтеза анаэробных белков у толерантных к аноксии клеточных линий делается заключение о ключевой роли энергетического метаболизма в толерантности культивируемых клеток к аноксии и рекомендуется использовать именно эту особенность при селекции in vitro

других устойчивых к анаэробному стрессу сельскохозяйственных растений.

9. Из клеточных линий сахарного тростника и пшеницы, отобранных после первого этапа селекции и толерантных, соответственно, к 48- и 32-часовой аноксии, регенерированы растения. Клеточные линии, отобранные после многоступенчатой 72 и 96 - часовой анаэробной инкубации, не обладали способностью к морфогенезу.

10. Показано, что растения сахарного тростника и пшеницы,

регенерированные из толерантных клеточных линий, заметно более устойчивы к почвенному анаэробиозу по сравнению с исходными

контрольными растениями, а также с растениями, полученными из клеточных линий, не прошедших предварительной селекции в условиях аноксии.

11. Устойчивость к почвенному анаэробиозу сохранялась в первом семенном поколении растений-регенерантов пшеницы.

Публикации

1. Степанова А.Ю., Долгих Ю.И., Вартапетян Б.Б. Разработка технологии получения растений, устойчивых к затоплению на примере сахарного тростника // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». Брянск, 1-5 ноября 1999 г., с.21.

2. Степанова А.Ю., Полякова Л.И., Долгих Ю.И., Вартапетян Б.Б. Реакция клеток сахарного тростника на аноксию in vivo, in vitro // Тезисы международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия». Москва, 4-9 октября 1999 г., с. 707.

3. Степанова А.Ю., Полякова Л.И., Долгих Ю.И., Вартапетян Б.Б. Способы адаптации растений к кислородному недостатку // Тезисы школы -конференции «Горизонты физико-химической биологии». Пущино, 28 мая-2 июня 2000 г., с. 164-165.

4. Степанова А.Ю., Долгих Ю.И., Вартапетян Б.Б. Получение устойчивых к корневому затоплению растений сахарного тростника и пшеницы II Тезисы II Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, 2000, с.159-160.

5. Vartapetian В.В., Stepanova A.Yu., Dolgikh Yu. I., Polyakova L.I. Selection of cell clones and regenerated plants tolerant to anoxia // Abstr. 7-th Conference of the Intern. Society for Plant Anaerobiosis. Nijmegen, 12-16 june, 2001, p.46.

6. Вартапетян Б.Б., Генерозова И.П., Полякова Л.И., Долгих Ю.И., Степанова А.Ю. Главные стратегии адаптации растений к анаэробному стрессу II Тезисы Международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке». Сыктывкар, Республика Коми, 1-6 октября 2001 г, с.34.

7. Stepanova A.Yu., Generozova I.P., Dolgikh Yu.l., Vartapetian B.B. Comparison of carbohydrate utilization and rate of glycolysis in the anoxia-tolerant and the intolerant cell lines of sugarcane (Saccharum officinarvm L.) under anaerobic incubation // Abstr. Intern. Symp. "Plant under Environmental Stress". Moscow, October 23-28, 2001, p.280.

8. Степанова А.Ю., Полякова Л.И., Долгих Ю.И., Вартапетян Б.Б. Реакция культивируемых клеток сахарного тростника Saccharum officinarum L. на аноксию и отбор устойчивой клеточной линии // Физиология растений, 2002, т.49, №3, с.451-458.

9. Vartapetian В.В., Andreeva I.N., Generozova I.P., Polyakova L.I., Maslova I.P., Dolgikh Yu.l., Stepanova A.Yu. Functional electron microscopy in studies of plant response and adaptation to anaerobic stress // Annals of Botany, 2003, v.91, p. 155-172.

10. Stepanova A.Yu., Novikova E.G., Dolgikh Yu. I., Vartapetian B.B. In vitro selection of hypoxia tolerance in wheat // Abstr. VIII International Conference "The biology of plant cells in vitro and biotechnology". Saratov, Sept.9-13, 2003, p.304 -305.

Гарнитура Times. Формат 60V90/16. Бумага офсетная 80 г. Печать офсетная. Уч .-изд. л 1,0 Усл.печл 1,5. Тираж 100 экз. Отпечатано с готового Оригинал-макета в ООО "Знаменка".

2ooiT-A

P 16470

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степанова, Анна Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Влияние избыточного увлажнения на почву.

2. Влияние избыточного увлажнения на растения.

3. Метаболическая адаптация к условиям кислородной недостаточности

3.1. «Метаболическая теория устойчивости к затоплению».

3.2. Гипотеза Дэвиса- Робертса. Уклонение от цитоплазма-тического закисления.

3.3. Поддержание энергетического метаболизма j в анаэробных условиях.

3.3.1. Подкормка экзогенной глюкозой для стимуляции энергетического обмена.

3.3.2. Роль углеводов в поддержании устойчивости клеток к условиям анаэробиоза.

3.3.3. Синтез белков в анаэробных условиях.

4. Предгипоксическая предобработка.

5. Анатомические приспособления к условиям кислородной недостаточности. j 6. Стратегии адаптации растений к условиям затопления.

7. Клеточная селекция.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Объекты исследования.

2. Получение каллуса и регенерация растений.

3. Создание условий анаэробиоза.

4. Определение интенсивности роста каллуса сахарного тростника и пшеницы.

5. Определение митотического индекса.

6. Электронно-микроскопическое изучение каллуса сахарного тростника.

7. Определение содержания этанола.

8. Количественное определение углеводов в каллусной ткани сахарного тростника.

9. Тестирование проростков сахарного тростника и пшеницы в условиях затопления.

9.1. Проверка в условиях корневого затопления растений — регенерантов пшеницы.

9.2. Проверка в условиях корневого затопления растений — регенерантов сахарного тростника.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Характеристика каллусной ткани сахарного тростника и пшеницы.

Глава 2. Реакция на аноксию культивируемых клеток сахарного тростника и пшеницы

2.1. Исследование действия анаэробного стресса на культивируемые клетки сахарного тростника.

2.2. Исследование действия анаэробного стресса на культивируемые клетки пшеницы.

2.2.1. Сравнение жизнеспособности в условиях аноксии каллуса сахарного тростника и пшеницы.

2.2.2. Сравнение жизнеспособности в условиях. аноксии каллусов сахарного тростника с другими клетками in vitro

2.2.3. Увеличение жизнеспособности каллусов в условиях аноксии в присутствии экзогенной глюкозы.

Глава 3. *

3.1. Отбор устойчивых к аноксии клеток и получение. толерантных к корневому затоплению растений сахарного тростника

3.2. Характеристика резистентной к аноксии клеточной линии сахарного тростника.

3.3. Отбор устойчивых к аноксии клеток и получение толерантных к корневому затоплению растений пшеницы.

Глава 4. Исследование механизмов устойчивости культивиw руемых клеток к условиям кислородной недостаточности.

4.1. Изучение интенсивности гликолиза в анаэробных условиях.

4.2. Содержание углеводов в каллусах сахарного тростника.

4.3. Динамика расходования углеводов в течение анаэробного периода.

4. 4. Определение интенсивности гликолиза в присутствии циклогексимида у устойчивого каллуса.

4.4.1. Биохимические исследования.

4.4.2. Электронно-микроскопические исследования.

Глава 5. Характеристика растений, регенерированных из устойчивых клеточных линий.

5.1. Выживаемость растений - регенерантов сахарного тростника сорта POJ2878 в условиях корневого затопления.

5.2. Выживаемость растений - регенерантов пшеницы сорта «Таежная» в условиях корневого затолпения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реакция культивируемых клеток на анаэробный стресс и получение in vitro устойчивых к затоплению растений"

Дефицит кислорода в среде обитания (гипоксия и аноксия) существенно влияет на метаболизм высших растений, которые, являясь облигатными аэробами, нуждаются в постоянном притоке молекулярного кислорода извне. Чаще всего дефицит кислорода испытывают растения на переувлажненных и затопленных почвах ввиду низкой растворимости и скорости диффузии кислорода в воде. Тем не менее, многие виды высших растений постоянно обитают на переувлажненных и даже затопленных почвах, что предполагает наличие механизмов адаптации. Существуют, по крайней мере, две главные стратегии адаптации высших растений в условиях анаэробного стресса - адаптация на уровне всего организма, анатомо-морфологические особенности которого облегчают транспорт молекулярного кислорода из аэрируемых частей в органы, локализованные в анаэробной среде - кажущаяся толерантность, и так называемая метаболическая адаптация, реализующаяся на молекулярном уровне в условиях отсутствия кислорода в среде - истинная толерантность. Эта концепция, выдвинутая около 20 лет назад (Vartapetian, 1978), теперь является общепринятой (Blom et al., 1993; Ricard et al., 1994; Drew, 1997; Jackson, Armstrong, 1999). Несмотря на то, что в последние два десятилетия интерес к анаэробиозу растений резко возрос и проблема активно изучается с различных точек зрения, биотехнологические подходы, использующие культивируемые in vitro клетки, до сих пор сравнительно редко использовались для этих целей. Между тем, культивируемые клетки являются удобной моделью для изучения клеточной устойчивости к анаэробному стрессу и могут быть использованы для получения устойчивых к затоплению форм. Клеточная селекция уже зарекомендовала себя как перспективный способ получения растений, устойчивых к таким стрессовым факторам как засоление, засуха, тяжелые металлы, экстремальные температуры (Ларина, 1995; Долгих, 1994; Narayanan et al., 1989; Freytag et al., 1990; Belowaly, Bouharmont, 1992; Bajji, Kinet, 1995). Всего в одной работе (Харинарайн с соавт., 19966) была показана принципиальная возможность отбора in vitro клеточных линий и растений сахарного тростника, выдерживающих продолжительный дефицит кислорода. Однако при этом почти не была исследована реакция культивируемых клеток на аноксию, а методика отбора устойчивых клеток требовала оптимизации.

2. Усовершенствовать систему отбора in vitro толерантных клеток и получить устойчивые клеточные линии.

4. Получить разработанным методом толерантные растения и проверить наследование устойчивости.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Степанова, Анна Юрьевна

выводы

3. Опираясь на результаты как электронно-микроскопических наблюдений, так и опытов по выявлению способности анаэробно культивируемых клеток к постанаэробному росту и морфогенезу, была разработана технология многоступенчатой селекции клеточных линий, толерантных к анаэробному стрессу в отсутствии экзогенного сахара, предусматривающая постепенное увеличение продолжительности аноксии.

7. Ингибирование циклогексимидом синтеза анаэробных белков, большинство которых является ферментами гликолиза и брожения, а также утилизации углеводов, приводило к резкому подавлению этанольного брожения у толерантных клеток и к существенной потере толерантности.

8. На основании сравнительного изучения динамики метаболизма углеводов и этанольного брожения, а также реакции клеток на ингибирование синтеза анаэробных белков у толерантных к аноксии клеточных линий делается заключение о ключевой роли энергетического метаболизма в толерантности культивируемых клеток к аноксии и рекомендуется использовать именно эту особенность при селекции in vitro других устойчивых к анаэробному стрессу сельскохозяйственных растений.

10. Показано, что растения сахарного тростника и пшеницы, регенерированные из толерантных клеточных линий, заметно более устойчивы к почвенному анаэробиозу по сравнению с исходными контрольными растениями, а также с растениями, полученными из клеточных линий, не прошедших предварительной селекции в условиях аноксии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Культивируемые in vitro клетки являются удобной моделью для изучения механизмов «истинной устойчивости». Впервые была исследована реакция культивируемых клеток сахарного тростника и пшеницы на аноксию. Было показано, что инкубация в среде с 3% глюкозой увеличивала жизнеспособность каллусных клеток в условиях аноксии по сравнению с инкубацией в среде без углеводов. Повышение жизнеспособности каллусных клеток в условиях аноксии указывает на ключевую роль углеводного метаболизма как основы энергетического обеспечения клеток в условиях аноксии. Данные результаты явились основой для разработки оригинальной схемы селекции, предусматривающей отбор в среде без Сахаров и направленной на выделение клеток с измененным метаболизмом углеводов. По сравнению с ранее предлагаемой схемой отбора, использующей среду с сахарозой, предложенные нами условия не только дают возможность направленно отбирать клетки с изменениями энергетического метаболизма, но и являются более жесткими, что позволяет сократить время селекции, делает ее результаты более надежными,

После инкубации каллуса в анаэробных условиях в среде без углеводов была получена толерантная к аноксии клеточная линия. Сравнительный анализ чувствительной и устойчивой к аноксии линий показал, что одним из факторов адаптации является интенсивный гликолиз, обеспеченный активным гидролизом крахмала. Гибель клеток исходного каллуса связана с быстрой утилизацией Сахаров и прекращением гидролиза крахмала после 24 часов анаэробной инкубации. Полученные результаты, также как и в работах Guglielminetti et al (1995), Perata et al. (1992, 1996, 1997), Loreti et al. (2003) указывают на чувствительность именно процесса мобилизации крахмала к условиям кислородной недостаточности.

Из отобранных в результате селекции устойчивых клонов сахарного тростника и пшеницы были получены растения-регенеранты. Выживаемость этих растений в условиях корневого затопления вдвое превосходила выживаемость исходных растений. Данные результаты показывают, что с помощью селекции in vitro можно получать не только клетки, но и растения, толерантные к дефициту кислорода. У растений-регенерантов пшеницы удалось получить семена, что позволило проверить наследование признака устойчивости. Было показано, что после культивирования в затопленной почве, вызвавшей гибель всех контрольных образцов, выжило более 30% растений, полученных из семян отселектированных регенерантов. Все это указывает на перспективность биотехнологических методов для получения толерантных к дефициту кислорода растений, которые можно использовать как в практической деятельности, так и для изучения механизмов устойчивости к кислородной недостаточности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степанова, Анна Юрьевна, Москва

1. Андреев В.Ю., Генерозова И.П., Вартапетян Б.Б. Интенсивность гликолиза и устойчивость к аноксии // Физиология растений. 1996. Т.43. №2. С.278.

2. Белянская СЛ., Шамина З.Б., Кучеренко JI.A. Морфогенез в клонах риса, резистентных к стрессовым факторам // Физиология растений. 1994. Т.41. №.4. С.573-577.

3. Бутенко Р.Г., Шамина З.Б., Фролова JI.B. Индуцированный органогенез и характеристика растений, полученных в культуре тканей табака // Генетика. 1967. Т.2. №3. С.29-39.

4. Бутенко Р.Г., Холодова В.П., Урманцева В.В. Закономерности роста и некоторые корреляции между ростом и содержанием Сахаров в клетках культуры ткани сахарной свеклы // Физиология растений. 1972. Т.19. № 5. С.926-936.

5. Вартапетян Б.Б., Андреева И.Н., Маслова И.П. Ультраструктура клеток колеоптилей риса в аэробных и анаэробных условиях // Докл. АН СССР. 1971. Т. 196. С. 1231-1233.

6. By Дык Куанг, Шамина З.Б. Цитогенетический анализ клонов, полученных от индивидуальных клеток и протопластов кукурузы // Цитология и генетика. 1985. Т.19. №1. С.85

7. Генерозова И.П., Андреев В.Ю., Вартапетян В.В., Вартапетян Б.Б. Ультраструктура митохондрий и динамика углеводов плодов яблони в условиях строгой аноксии // Физиология растений. 1990. Т. 37. С. 271-278.

8. Гринева Г.М. Регуляция метаболизма у растений при недостатке кислорода. Под ред. Петинова Н.С. М.: Наука. 1975. 279 с.

9. Гринева Г.М., Борисова Т.А., Гарковенкова А.Ф., Ахриф Г.М, Брагина Т.В. Влияние длительного затопления на экссудацию,дыхание и анатомическое строение корней кукурузы // Физиология растений. 1986. Т.ЗЗ. № 5. С. 987-995.

10. Гринева Г.М., Брагина Т.В. Структурные и функциональные параметры формирования адаптаций к затоплению у кукурузы // Физиология растений. 1993. Т.40. №4. С.662-667.

11. Гужов Ю.Л. Селекция сахарного тростника // Вопросы тропического сельского хозяйства. Под ред. Гужова Ю.Л. М.: Изд-во РУДН. 1976. 75 с.

12. Джое Л., Калашникова Е.А. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориазу // Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. академика РАСХН Шевелуха B.C. М.: Евразия, 2000.264 с.

13. Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б. Селекция на осмоустойчивость кукурузы in vitro и характеристика растений-регенерантов // Физиология растений. 1994. Т.41. №1. С.114-117.

14. Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б., Жданова Н.Е., Пустовойтова Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэтиленгликоля клеточных линий // Физиология растений. 1994. Т.41. С. 853-858.

15. Дубинина И. М., Кудрявцева Л.Ф., Бураханова Е.А. Особенности углеводного обмена в культурах изолированных тканей сахарной свеклы. Тез. конф. «Культура клеток растений. Труды II Всесоюзной конференции». Киев: Наукова думка. 1978. С.214-220.

16. Ежова Т.А., Гостимский С.А. Современные методы селекции высших растений на устойчивость к гербицидам // Сельскохозяйственная биология. 1989. № 1. С. 25-34.

17. Ежова Т.А., Тихвинская Н.С., Багрова A.M., Васильев И.Р., Машорин Д.Н., Гостиский С.А. Получение толерантных к гербицидам форм гороха методом селекции in vitro // Докл. АН СССР. 1990. Т.310. № 4. с. 987-990.

18. Крауфорд Р.М.М., Вартапетян Б.Б. Действие этанола и аноксии на ультраструктуру митохондрий растений // Доклады Академии наук СССР. 1984. Т.275. № 5. С. 1279-1280.

19. Ларина С.Н. Клеточные линии и растения-регенеранты как модель для изучения солеустойчивости: Автореф. дис.канд. биол. наук. М: ИФР РАН, 1995. 24 с.

20. Майсурян А.Н., Хадеева Н.В., Дридзе ИМ. Селекция и изучение свойств клеточных линий сои и табака, устойчивых к L-азетидин-2-карбоновой кислоте. Тез. докл. по генетике сомат. клеток в культуре. Звенигород. 1986. 19-22 окт. С. 29-30.

21. Муромцев Г.С., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агропромиздат. 383 С.

22. Никифорова И.Д., Чернов В.А., Бутенко Р.Г. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к засолению. Тез. док. всес. конф. по генетике сом. клеток в культуре. Звенигород. 1989. 12-15 окт. С. 84-85.

23. Пекеньо Х.П. Тропическое земледелие. М.: Изд-во УДН. 345 с.

24. Писаренко Н.Ф. Методы определения крахмала и некоторых полисахаридов клеточных стенок растений // Биохимические методы в физиологии растений / Под ред. Павлиновой О.А. М: Наука. 1971. С.35-47.

25. Россеев В.М. Новый способ оценки растений на устойчивость к неблагоприятным факторам // Селекция и семеноводство. 1995.1. С.31-32.

26. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция / Под ред. Горбань Т.Л. Киев: Наукова думка. 1990. 280 с.

27. Туркина М.В., Соколова С.В. Методы определения моносахаридов и олигосахаридов // Биохимические методы в физиологии растений / Под ред. Павлиновой О.А. М.:Наука. 1971. С.7-34.

28. Харинарайн Р.П., Долгих Ю.И., Гужов Ю.Л. Выбор оптимальных сред для массовой регенерации растений сахарного тростника из каллусной культуры // Физиология растений. 1996а. Т. 43. С. 111115.

29. Харинарайн Р.П., Гужов Ю.Л., Долгих Ю.И. Перспективы использования биотехнологических методов в селекции сахарного тростника Saccharum Ofjicinarum на устойчивость к гипоксии // Известия РАН. Серия биол. 19966. № 4. С. 411-421.

30. Чиркова Т.В., Белоногова В.А. Активность нитратредуктазы зерновых культур в условиях переувлажнения // Агрохимия. 1991. №5. С. 56-65.

31. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. М.: Колос. 1992. 594 с.

32. Adkins S.W., Shiraishi Т., McComb J.A., Ratanopol S., Kupkanchanakul Т., Armstrong L.J., Schultz A.L. Somaclonal variation in rice submergence tolerance and other agronomic characters // Physiologia Plantarum. 1990. V.80. №4. P.647- 654.

33. Albrecht G., Biemelt S. A comparative study on carbohydrate reservesand ethanolic fermentation in the roots of two wetland and non-wetland species after commencement of hypoxia // Physiologia Plantarum. 1998. V.104. №1. P.81-86.

34. Alpi A., Beevers H. Effects of O2 concentration on rice seedlings // Plant Physiology. V.71. P.30-34.

35. Andreev V. Yu., Generozova I.P., Vartapetian B.B. Energy status and mitochondrial ultrastructure of excised pea root at anoxia and postanoxia // Plant Physiol. Biochem. 1991. V. 29. P. 171-176.

36. Andreev V. V., Vartapetian B.B. Induction of alcoholic and lactic fermentation in the early stages of anaerobic incubation of higher plants // Phytochemistry. 1992. V. 31. P. 1859-1861.

37. Andrews C.J., Pomeroy M.K. Toxicity of anaerobic metabolites accumulating in winter wheat seedlings during ice lencasement // Plant Physiology. 1979. V. 64. P. 120-125.

38. Andrews C.J., M.K.Pomeroy. The effect of flooding pretreatment on cold hardiness and survival of winter cereals in ice encasement // Canadian Journal of Plant Science. 1981. V. 61. P. 507-513.

39. Andrews C.J., M.K.Pomeroy. The influence of flooding pretreatment on metabolic changes in winter cereal seedlings during ice encasement // Canadian Journal of Plant Science. 1983. V. 61. P. 142-147.

40. Ap Rees Т., Wilson P. Effect of reduced supply of oxygen on the metabolism of roots Glyceria maxima and Pisum sativum II Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie. 1984. V. 114. P. 493-503.

41. Ap Rees Т., Jenkin L.E.T., Smith A.M., Wilson P.M. The metabolism of flood- tolerant plants // Plant life in aquatic and amphibious habitats / Eds Crawford R.M.M. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1987. P. 227-238.

42. Appleby C.A., Bogusz D., Dennis E.S, Peacock W.J. A rolehaemoglobin in all plant roots? // Plant, Cell and Environment. 1988. V.11.P. 359-367.

43. Armstrong W. Root aeration in the wetland condition // Plant life in anaerobic environments / Eds Hook D.D., Crawford R.M.M. Ann Arbor, Michigan: Ann Arbor Science, 1978. P. 269-297.

44. Armstrong W. Aeration in higher plants // Advances in Botanical Research. 1979. V. 7. P. 225-332.

45. Armstrong W., Beckett P.M. Root aeration in unsaturated soil: a multishelled mathematical model of oxygen diffusion and distribution with and without sectoral wet-soil blocking of the diffusion path // New Phytol. 1985. V.100. P.293-311.

46. Armstrong W., Brandle R., Jackson M.B. Mechanisms of flood tolerance in plants // Acta Bot.Neerl. 1994.V. 43.№ 4.P. 307-358.

47. Arpagaus S., Brandle R. The significance of a- amylase under anoxia in tolerant rhizomes and intolerant tubers // J. Exp. Bot. 2000. V.51. P.1475-1477.

48. Atwell B.J., Thomson C.J., Greenway H., Ward G., Waters I. A study of the impaired growth of roots Zea mays seedlings at low oxygen concentrations // Plant Cell and Environment. 1985. № 8. P. 179-188.

49. Atwell B.J., Greenway H. Carbohydrate metabolism of rice seedlings grown in oxygen deficient solution // J. Exp. Bot. 1987. V.38. №188. P.454-466

50. Bajji M., Kinet J.M., Bouharmont J. Characterization of progenies issued from drought tolerant plants of durum wheat selected in vitro. Proc. Intern. Congr. " Integrated study on drought tolerance of higher plants". Montpellier. France. 1995.VII2.

51. Barclay A.M., Crawford R.M.M. The effect of anaerobiosis on carbohydrate levels in wetland plant storage tissue // Annals of Bot. 1983. V. 51. №2. P. 255-259.

52. Belowaly N., Bouharmont J. NaCl tolerant plants of Poncirus trifoliata regenerated from tolerant cell lines 11 Theor. Appl. Enet. 1992. V. 83. P. 509-514.

53. Bergmeyer H., Bernt E., Schmidt F„ Stork H. D-Glucose // Methoden der Enzimatischen Analyse / H. Bergmeyer. Berlin: Akad-Verlag. В II, 1970. P. 1163-1168.

54. Bertani A., I.Brambilla, F.Menegus. Effect of anaerobiosis on rice seedlings: growth, metabolic rate, and rate of fermentation product // Journal of Experimental Botany. 1980. V.3 1. № 120. P. 325-331.

55. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a Review // Annals of Botany. 2003. V. 90. P. 179-194.

56. Bouny J.M., Saglio P.H. Glycolytic flux and hexokinase activities in anoxic maize root tips acclimated by hypoxic pretreatment //Plant Physiology. 1996. V. 111. № 1. P. 187-194.

57. Brandle R.A. Flooding resistance of rhizomatous amphibious plants // Plant life under oxygen deprivation / Eds Jackson M.B., Davies D.D., Lambers H. Ecology, Physiology, and Biochemistry. The Hague: SBP1. Academic, 1991. P. 35-46.

58. Burrows W.J., Carr D.T. Effects of flooding the root system of sunflower plants on cytokinin in the xylem sap // Physiologia Plantarum. 1969. V. 22. P. 1105-1112.

59. Campbell R., Drew M.C. Electron microscopy of gas space (aerenchyma) formation in adventitious roots of Zea mays L. subjected to oxygen shortage // Planta. 1983. V.157. P.350-357.

60. Cannell R.Q., Calusk, Shaydon R.A., Suhall R.A. Effects of short term waterlogging on the growth and yield of peas (Pisum sativum L.) // Ann.Appl.Biol. 1979. V.93. №3. P. 327-335

61. Colmer T.D., Huang S., Greenway H. Evidence for down-regulation of ethanolic fermentation and K+ effluxes in the coleoptile of rice seedlings during prolonged anoxia // J. Exp. Bot. 2001. V. 52. № 360. P. 1507-1517.

62. Cossins E.A. Ethanol metabolism in plants // Plant Life in Anaerobic Environments / Eds. D.Hook, R.M.M. Crawford. Ann Arbor, Michigan: Ann Arbor Science. 1978. P. 169-202.

63. Costes C., Vartapetian B.B. Plant grown in a vacuum: the ultrastructure and functions of mitochondria // Plant Sci. Lett. 1978. V. 11.P. 115-119.

64. Crawford R.M.M. Tolerance of anoxia and the metabolism of ethanol in tree roots //The New Phytologist. 1977. V. 79. P. 519-526.

65. Crawford R.M.M., McManmon M. A Metabolic theory of flooding tolerance: the significance of enzyme distribution and behavior // New Phytologist. 1971. V. 70. № 2. P. 299-306.

66. Davies D.D. Anaerobic metabolism and the production of organic acids // The biochemistry of plants / Eds Davies D.D. New York, London: Academic Press, 1980. V.2. P.581-611.

67. Davies M.S., Hillman G.C. Effects of soil flooding on growth and grain yield of population of tetraploid and hexaploid species of wheat // Annals of Botany. 1988. V. 62. № 6. Р.5 97-604.

68. Dix P.J., Joo F., Maliga P. A cell line of Nicotiana sylvestris with resistance to kanamicin and streptomycin // Molec. and Gen. Genet. 1977. V. 157. P. 285-290.

69. Drew M.C., Sisworo E.S. The development of waterlogging damage in young barley plants in relation to plant nutrient status and changes in soil properties // New Phytologist. 1979. V. 82. P. 302-314.

70. Drew M.C., Saglio P.H., Pradet A. Larger adenylate energy charge ATP/ADP ratios in aerenchymatous roots of Zea Mays in anaerobic media as a consequence of improved internal oxygen transport // Planta. 1985. V. 165. № . P. 51-58.

71. DrewM.C. Sensing soil oxygen // Plant, Cell and Environment. 1990. V. 13. P. 681-693.

72. Drew M.C. Oxygen deficiency and root metabolism: injury and acclimation under hypoxia and anoxia // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 1997. V.48. P.223-250.

73. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Calorimetric method for determination of sugars and related substances // Analytical Chemistry. 1956. V. 28. № 3. P. 350-356.

74. Ellis M.H., Setter T.L. Hypoxia induces anoxia tolerance in completely submerged rice seedlings // J. Exp. Bot. 1999. V.154.P.219-230.

75. Fan T. W-M., Lane A.N., Higashi R.M. Hypoxia does not affect rate of ATP synthesis and energy metabolism in rice shoot tips as measured31by P NMR in vivo И Archives of Biochemistry and Biophysics. 1992. V. 294. P. 314-318.

76. Fox G. C., McCallan N.R., Ratcliffe R. G. Manipulating cytoplasmic pHunder anoxia: a critical test of the role of pH in the switch from aerobic to anaerobic metabolism // Planta. 1995. V. 195. P. 324-330.

77. Freytag A.H., Wrather J.A., Erichsen A.W. Salt tolerant sugarbeet progeny from tissue cultures challenged with multiple salts // Plant Cell Reports. 1990. V. 8. № 11. P. 647-650

78. Gendenbach B.G., Green C.E., Donovan C.M. Inheritance of selected pathotoxin resistance in maize plants regenerated from cell cultures // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. № 11. P. 5113-5117.

79. Good A.G., Muench D.G. Long term anaerobic metabolism in root tissue. Metabolic products of pyruvate metabolism // Plant Physiology. 1993. V.101.P.1163-1168.

80. Guglielminetti L., Perata P.,Alpi A. Amylolytic activities in cereal seeds under aerobic and anaerobic conditions // Plant Physiology. 1995. V.109. P.1069-1076.

81. Guglielminetti L., Perata P.,Alpi A. Effect of anoxia on carbohydrate metabolism in rice seedlings // Plant Physiology. 1995. V. 108. P. 735741.

82. Hanhijarvi A.M., Fagerstedt K.V. Comparison of carbohydrate utilization and energy charge yellow flag iris (Iris pseudocorus) and garden iris (Iris germanica) under anoxia // Physiologia Plantarum. 1995. V. 93. P. 493-497.

83. Hanson A.D., Jacobsen J. V. Control of lactate dehydrogenase, lactate glycolysis, and a amylase by 02 in barley root tissue // Plant Physiol. 1984. V.75. №3. P.566-572.

84. He C.J., Drew М.С., Morgan P.W. Induction of enzyme associated with lysigenous aerenchyma formation in roots of Zea mays during hypoxia or nitrogen starvation // Plant Physiology. 1994. V.105. P.861-865.

85. Heinz D.J., Mee G. W.P. Differential from callus tissue in Saccharum species // Crop Science. 1969. V. 9. P. 346-348.

86. Heinz D.J., Mee G.W.P. Morphologic cytogenetic and enzymatic variation in Saccharum species hybrid clones derived from callus tissue // Amer. J. Bot. 1971. V. 56. P. 450-456.

87. Hole D.J., Cobb B.G., Hole P., Drew M.C. Enhancement of anaerobic respiration in root tips of Zea Mays following low oxygen (hypoxic) acclimation//Plant Physiol. 1992. V.99. P.213-218.

88. Hook D.D., Scholtens JR. Adaptations and flood tolerance of tree species // Plant life in anaerobic environments / Eds Hook D.D., Crawford R.M.M. Ann. Arbor, Michigan: Ann. Arbor Sci., 1978. P.299-331.

89. Huang В., Johnson J. W., Bridges D.C. Root and shoot growth of wheat genotypes in response to hypoxia and subsequent resumption of aeration // Crop physiology and metabolism. 1994. V. 43. P. 15381544.

90. Huang В., Johnson J. W., Box J.E., NeSmith D. S. Root characteristics and hormone activity of wheat in response to hypoxia and ethylene //Crop Science. 1997. V. 37. P. 812-818.

91. Igaue I., Yagi M. Alcohol dehydrogenase from cultured rice cells // Plant and Cell Physiology. 1982. V. 23. № 2. P. 213-225.

92. Jackson M.B., Herman B. and Goodenough A. An examination of the importance of ethanol in causing injury of flooded plants // Plant Cell and Environment. 1982.V. 5. P. 163-172.

93. Jackson M.B. Plant and crop response to waterlogging of the soil //Aspects of Appl. Biol. 1983 V.4. P.99-116.

94. Jackson M.B., Kowalewska A.K.B. Positive and negative messages from roots induce foliar desiccation and stomatal closure in flooded pea plants // J. Exp. Bot. 1983. V. 34. P. 493-506.

95. Jackson M.B., Drew M.C. Effects of flooding on the growth and metabolism of herbaceous plants // Flooding and Plant Growth / Eds Kozlowski T.T. Academic Press, New York. 1984. P. 47-128.

96. Jackson M.B, Armstrong W. Formation of aerenchyma and the processes of plant ventilation in relation to soil flooding and submergence // Plant Biology. 1999. V. 1. P. 274-287.

97. Jackson M.B., Ram P.C. Physiological and molecular basis of susceptibility and tolerance of rice plants to complete submergence // Annals of Botany. 2003. V. 91. P. 227-241.

98. James E.K., Crawford R.M.M. Effect of oxygen availability on nitrogen fixation by two Lotus species under flooded conditions // J. Exp. Bot. 1998. V.49. №320. P.599-609.

99. Johnson J.R., Cobb B.G., Drew M.C. Hypoxic induction of anoxia tolerance in root tips of Zea mays II Plant Physiology. 1989. V.91. P.837-841.

100. Joly C.A., Brandle R. Fermentation and adenylate metabolism of Hedychium coronarium J.G. Koenig (Zingiberaceae) and Acorus calamus L. (Araceae) under hypoxia and anoxia // Functional Ecology. 1995. V.9.P.505-510.

101. Justin S.H.F.W., Armstrong W. The anatomical characteristics of roots and plant response to soil flooding // The New Phytologist. 1987. V.105. P.465-495.

102. Justin S.H.F.W., Armstrong W. Evidence for the involvement ofethene in aerenchyma formation in adventitious roots of rice (Oryza sativa L.) // The New Phytologist. 1991. V.l 18. P.49-62.

103. Karnovsky MJ. A formaldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy //J. Cell Biol. 1965. V. 27. 137A-138A.

104. Kato-Noguchi H. Abscisic acid and hypoxic induction of anoxia tolerance in roots of lettuce seedlings // J. Exp. Bot. 2000. V.51. №352. P. 1939-1944.

105. Kato-Noguchi H., Kugimiya T. Anoxia tolerance and ethanol sensitivity of rice and oat coleoptiles // Acta Physiologiae Plantarum. 2002. V. 24. P. 73-77.

106. Kawase M. Effect of ethylene on aerenchyma formation // Am. J. Bot. 1981. V.68. P.651-658.

107. Kennedy R.A., Rumpho M.E., Fox T.C. Anaerobic metabolism in plants // Plant Physiology. 1992. V. 100. P. 1-6.

108. Kiyosawa К Studies on the effects of alcohols on membrane water permeability oiNitella II Protoplasma. 1975. V. 86. P. 243-252.

109. Kuehnle A.R., Earle E.D. In vitro selection for methomyl resistance in CMS-T maize // Theor. And Appl. Genet. 1989. V. 78. № 5. P.672-682.

110. Larkin P. J., Scowcroft W.R. Somaclonal variation as a novel source of variability from cell cultures for plant improvement // Theor. Appl. Genet. 1981. V. 60. P. 197-214.

111. Larkin P.J., Ryan S.A., Brettell R.I.S., Scowcroft W.R. Heritable somaclonal variation in wheat // Theor. Appl. Genet. 1984. V.67. №2. P.443-445.

112. Loreti E.,Yamaguchi J., Alpi A., Perata P. Sugar modulation of a-amylase genes under anoxia // Annals of Botany. 2003. V. 91. P. 143-148.

113. Maberly S.C., Spence D.H.N. Photosynthesis and photorespiration in freshwater organisms: amphibious plants // Aquatic Botany. 1989. V. 34. P. 267-286.

114. Mackill D.J., Nguyen H.T., Zhang J.X. Use of molecular markers in plant improvement programs for rainfed lowland rice // Field Crop Research. 1999. V.64. P.177-185.

115. MacDonald R.C., Kimmer T.W. Metabolism of transpired ethanol by eastern cottonwood (Populus deltoides Bartr.) // Plant Physiology. 1993. V. 102. P. 173-179.

116. Maslova I.P., Tchernyadeva I.F., Vartapetian B.B. Soluble proteins and alcochol dehydrogenase of rice seedlings in anoxia. // Twelfth International Botanical Congress / Abstracts. Leningrad: Nauka,1. V. 2, 1975. P. 365.

117. Mastrangelo I.A, Smith H.H. Selection and differentiation of aminopterin resistant cells of Datura innoxia II Plant Sci. Lett. 1977. V. 10. P. 171-79.

118. McCoy T.J. Characterization of alfalfa (Medicago sativa L.) plants regenerated from selected NaCl tolerant ell lines // Plant Cell Reports. 1987. V. 6. P. 417-422.

119. McManmon M., Crawford R.M.M. A metabolic theory of flooding tolerance: the significance of enzyme distribution and behaviour // New Phytologist. 1971. V. 70. № 2. P. 299-306.

120. Menegus F., Cataruzza L., Chersi A., Fronza G. Differences in the changes of cell sap pH for plants with high and low resistance to anoxia // Plant Physiology. 1989. V. 90. № 1. P. 29-32.

121. Menegus F., Cataruzza L., Matana M., Bejfagna N., Ragg E. Responses to anoxia in rice and wheat seedlings. Changes in the pH of intracellular compartments, glucose-6-phosphate level and metabolicrate // Plant Physiology. 1991. V. 95. P. 760-767.

122. Meredith C.P. Selecting better crops from cultured cells // Gene manipulation in plant improvement / New York: Plenium Publ. Co. 1984. P. 503-528.

123. Mocquot В., Prat C., Mouches C., Pradet P. Effect of anoxia on energy charge and protein synthesis in rice embryo // Plant Physiol. 1981. V.68. P.636-640.

124. Mohanty В., Wilson P.M., Ap Rees T. Effects of anoxia on growth and carbohydrate metabolism in suspesion cultures of soybean and rice // Phitochemistry. 1993. V. 34. P. 75-82.

125. Monk L.S., Brandle R., Crawford R.M.M. Catalase activity and post-anoxic injury in monocotyledonous species // Journal of Experimental Botany. 1987. V. 38. № 187. P. 233-246.

126. Monk L.S., Crawford R.M.M., Brandle R. Fermentation rates and ethanol accumulation in relation to flooding tolerance in rhizomes of monocotyledonous species //J. Exp. Bot. 1984. V.35. P.738-745.

127. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiology Plantarum.1962. V. 15. P. 473-497.

128. Nandini-Kishore S.G., Mattox S.M., Martin C.E., Thompson G.A. Membrane changes during growth of Tetrahymena in the presence of ethanol // Biochimica et biophysica acta. 1979. V. 551. P. 315-327.

129. Narayanan K.K., Kangasamy S.R. Inheritance of salt tolerance in progenies of tissue culture selected variants of rice // Curr. Sci. 1989. №21. P. 1204-1205.

130. Nie X.Z., Silva-Gardenas I., Hill R.D. Function and regulation of hemoglobin in barley aleurone tissue and maize roots // Plant Physiol. 1996. V.lll. P.252.

131. Oberson J., Pavelic D., Brandle R., Rawyler A. Nitrate increases membrane stability of potato cells under anoxia // J. Plant Physiol. 1999. V. 155. P. 1-3.

132. Perata P., Alpi A., LoSchiavo F. Influence of ethanol on plant cells and tissues//Plant Physiology. 1986. V. 126. P. 181-188.

133. Perata P., LoSchiavo F., Alpi A. Ethanol production and toxicity in suspension-cultured carrot cells and embryos I I Planta. 1988. V. 173. № 3. P. 322-330.

134. Perata P., Alpi A. Ethanol metabolism in suspension-cultured carrot cells //Physiologia Plantarum. 1991. V. 82. P. 103-108.

135. Perata P., Alpi A. Ethanol-induced injuries to carrot cells. The role acetaldehyde // Plant Physiology. 1991. V. 95. P. 748-752.

136. Perata P. Pozueta-Romero J., Akazawa Т., Yamaguchi J. Effect of anoxia on starch breakdown in rice and wheat seeds // Planta. 1992. V. 188. P. 611-618.

137. Perata P., Alpi A. Plant responses to anaerobiosis // Plant Sci. 1993. V. 93. P.l-17.

138. Perata P., Guglielminetti L., Alpi A. Anaerobic carbohydrate metabolism in wheat and barley, two anoxia-intolerant cereal seeds // Journal of Experimental Botany. 1996. V. 47. № 301. P. 999-1006.

139. Perata P., Guglielminetti L., Alpi A. Mobilization of endosperm reserves in cereal seeds under anoxia // Annals of Botany. 1997. V.79 (Suppl.A). P.49-56.

140. Ratclijfe R.G. pH regulation in plants under anoxia // Regulation of tissue pH in plants and animals: a reappraisal of current techniques / Eds. Egginton S., Taylor E.W., Raven J.A. Cambridge: University Press, 1999. P.193-214.

141. Rawyler A., Pavelic D., Oberson J., Brandle R. Membrane lipidintegrity relies on a threshold of ATP production rate in potato cell cultures submitted to anoxia // Plant Physiol. 1999. V. 120. P. 293300.

142. Raymond P., Al Ani A., Pradet A. ATP production by respiration and fermentation, and energy charge during aerobiosis and anaerobiosis in twelve fatty and starchy germinating seeds // Plant Physiol. 1985. V. 79. P. 879-884.

143. Ricard В., Couee I.,Saglio P.H, Saint-Ges V., Pradet A. Plant metabolism under hypoxia and anoxia // Plant Physiol. Biochem. 1994.V. 32.№ 1. P. 1-10.

144. Rivoal J., Hanson A.D. Evidence for a large and sustained glycolytic flux to lactate in anoxic roots of some members of the halophytic genus Limonium II Plant Physiol. 1993. V.101. P.553-560.

145. Roberts J.KM., Callis J., Wemmer D., Walbot V., Jardetzky O. Mechanism of cytoplasmic pH regulation in hypoxic maize root tips and its role in survival under hypoxia // Proc.Natl. Acad. Sci, USA. 1984a. V. 81. P. 3379-3383.

146. Roberts J.K.M., Callis J., Jardetzky O., Walbot V., Freeling M. Cytoplasmic acidosis as a determinant of flooding intolerance // Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 1984b. V. 81. P. 6029-6033.

147. Roberts J.K.M., Andrade F.H., Anderson I.C. Further evidence that cytoplasmic acidosis is a determinant of flooding intolerance in plants // Plant Physiology. 1985. V. 77. P. 492-494.

148. Rumpho M.E., Kennedy R.A. Activity of the pentose phosphate andglycolytic pathways during anaerobic germination of Echinochloa crus-galli (barnyard grass) seeds // Journal of Experimental Botany. 1983. V. 34. P. 893-902.

149. Sachs M.M., Freeling M., Okimoto R. The anaerobic proteins of maize //Cell. 1980. V. 20. P. 761-767.

150. Sachs M.M., Ho T.H.D. Alteration of gene expression during environment stress in plants // Ann. Rev. Plant Physiol. 1986. V. 37. P. 363-376.

151. Sachs M.M., Subbaiah С. C., Saab I.N. Anaerobic gene expression and flooding tolerance in maize // J. Exp. Bot. 1996. V. 47. P. 1-15.

152. Sacristan D., Melchers G. The caryological analysis of plants regenerated from tumorous and other callus cultures of tobacco // Mol. And Gen. Genet. 1969. V. 05. P.3 17-333.

153. Saglio P.H., Raymond P., Pradet A. Metabolic acclimation to anoxia induced by low (2-4 kPa) partial pressure oxygen pretreatment (hypoxia) in root tips of Zea mays И Plant Physiol. 1988. V.86. P.61-66.

154. Saglio P.H., Raymond P., Pradet A. Metabolic activity and energy charge of excised maize root tips under anoxia // Plant Physiol. 1980. V. 66. P.1053-1057.

155. Saint-Ges V., Roby C., Bligny R., Pradet A., Douce R. Kinetic studies of the variations of cytoplasmic pH, nucleotide triphosphates(P-NMR) and lactate during normoxic and anoxic transitions in maize root tips //

156. Eur.J.Biochem. 1991. V. 200. P. 477-482.

157. Saltveit M.E. Effect of alcohol and their interaction with ethylene on the ripening of epidermal pericarp discs of tomato fruits // Plant Physiology. 1989. V. 90. № 1. P. 167-174.

158. Schenk R.U., Hildebrandt A.C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Canad. J. Bot. 1972. V.50. №1. P. 1999

159. Scliiter U., Crawford R.M.M. Metabolic adaptation to prolonged anoxia in leaves of American cranberry (Vaccinium macrocarpon) // Physiol. Plantarum. 2003. V.l 17. P.492-499.

160. Schussler E.E., Longstreth D.J. Aerenchyma develops by cell-lysis in roots and cell-separation in leaf petioles in Sagitaria lancifolia (Alismataceae) // American J. Bot. 1996. V.83. P. 1266-1273.

161. Scott H.D., DeAngulo J., Daniels M.B., Wood L.S. Flood duration effects on soybean growth and yield // Agron.J. 1989.V. 81. P. 631636.

162. Setter T.L., Ella E.S. Relationship between coleoptile elongation and alcoholic fermentation in rice exposed to anoxia. I. Importance of treatment conditions and different tissues // Annals of Botany. 1994. V. 74. P. 265-271.

163. Setter T.L., Ella E.S., Valdez A.P. Relationship between coleoptile elongation and alcoholic fermentation in rice exposed to anoxia. II. Cultivar differences // Annals of Botany. 1994b. V. 74. P. 273-279.

164. Siangliw M., Toojinda Т., Tragoonrung S., Vanavichit A. Molecular genetics of submergence tolerance in rice: QTL analysis of key traits // Annals of Botany. 2003. V.91. P.243-253.

165. Sieber M., Brandle R.A. Energy metabolism in rhizomes of Acorus calamus (L.) and in tuber of Solanum tuberosum (L.) with regard totheir anoxia tolerance // Bot. Acta. 1991. V. 104. P. 279-282.

166. Smirnoff N., Crawford R.M.M. Variation in the structure and response to flooding of root aerenchyma in some wetland plants // Annals of Botany. 1983. V. 51. P.237-249.

167. Smith A.M, Ap Rees T. Pathways of carbohydrate fermentation in the roots of marsh plants // Planta. 1979. V. 146. P. 327-334.

168. Smith K.A., Restall S.W.F. The occurrence of ethylene in anaerobic soil I I Journal of Soil Science. 1971. V. 22. P. 430-443.

169. Subbaiah C.C., Bush D.S., Sachs M.M. Elevation of cytosolic calcium precedes anoxic gene expression in maize suspension-cultured cells // The Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1747-1762.

170. Subbaiah C.C., Sachs M.M. Moleculer and cellular adaptations of maize to flooding stress // Annals of Botany. 2003. V. 91. P. 119-127.

171. Summers J.E., Jackson M.B. Anaerobic promotion of stem extension in Potomogen pectinatus: roles for carbon dioxide, acidification and hormones //Physiol. Plantarum. 1996. V.96. P.615-622.

172. Sun Z., Henson C.A. A quantative assessment of the importance of barley seed a-amylase, debranching enzyme, and a-glucosidase in starch degradation // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1991. V.284. P.298-305.

173. Swaaij A.C., Jacobsen E. Frost tolerant plants obtained from proline accumulation cell lines // Genetic Manipulation in Plant Breeding. Berlin, New York: Walter de Gruyter. 1986. P. 355-357.

174. Tadege M., Brandle R., Kuhlemeier C. Anoxia tolerance in tobacco roots: effect of overexpression of pyruvate decarboxylase // The Plant Journal. 1998. V. 14. № 3. P. 327-335.

175. Tantau H., Dorffling K. In-vitro selection of proline overproducing cell lines of winter wheat with increased frost tolerance // Physiol.

176. Plant. 1990. V. 79. № 2. P. 104.

177. Thomson C.J., Colmer T.D., Watkin E.L.J., Greenway H. Tolerance of wheat (Triticum aestivum с vs. Gamenya and Kite) and triticale (Triticosecale cv. Muir) to waterlogging // New Phytologist. 1992.V.120. P.335-344.

178. Thorpe T.A., Meier D.D. Starch metabolism, respiration, and shoot formation in tobacco callus cultures // Physiologia Plantarum. 1972. V. 27. № 3. P. 365-369.

179. Tripepi R.R., Mitchell C.A. Metabolic response of river birch and european birch roots to hypoxia // Plant Physiology. 1984. V. 76. P. 31-35.

180. Trought M.C.T., Drew M.C. Effects of waterlogging on young wheat plants (Triticum aestivum L.) and on soil solutes at different soil temperatures // Plant and Soil. 1982. V. 69. P. 311-326.

181. Trought M. С. Т., Drew M. C. The development of waterlogging damage in young wheat plants in anaerobic solution culture // Journal of Experimental Botany. 1980c. V. 31. P. 1573-1585.

182. Umemura Т., Perata P., Futsuhara Y., Yamaguchi J. Sugar sensing and a-amylase gene repression in rice embryos // Planta. 1988. V.204. P.420-428.

183. Umiel N. Goldner R. Effects of streptomycin on diploid tobacco callus cultures and the isolation of resistant mutants // Protoplasma. 1976. V. 89. P. 83-89.

184. Van Toai T.T., Martin S.K.S., Chase K., Boru G., Schnipke V.,

185. Schmitthenner A.F., Lark G.L. Identification of QTL associated with tolerance of soybean to soil waterlogging // Crop Science. 2001. V.41. P.1247-1252.

186. Van Toai T.T., Boru G., Zhang J. Flooding tolerance of crops // Encyclopedia of Soil Science. 2002. P. 1-3.

187. Vartapetian B.B., Andreeva I.N., Maslova I.P., Davtian N.G. The oxygen and ultrastructure of root cells // Agrochimica. 1970. V. 15. P. 1-19.

188. Vartapetian B.B. Aeration of roots in relation to molecular oxygen transport in plants // Plant response to climatic factors. Proceedings of Uppsala Symposium / Slater RO.Paris: UNESCO, 1973. P. 259-265.

189. Vartapetian B.B., Agapova L.P., Averianov A.A., Veselovsky V.A. New approach to study of oxygen transport in plants using chemiluminiscent method // Nature. 1974b. V. 249. P. 269.

190. Vartapetian B.B., Andreeva I.N., Kozlova G.L The resistance to anoxia and the mitochondrial fine structure of rice seedlings // Protoplasma. 1976. V. 88. P. 215-224.

191. Vartapetian B.B, Andreeva L.N., Kozlova G.I., Agapova L.P. Mitochondrial ultra- structure in roots of mesophyte and hydrophyte at anoxia and after glucose feeding // Protoplasma. 1977. V. 93. P. 243-256

192. Vartapetian B.B., Andreeva I.N., Kozlova G.I., Agapova L.P. Mitochondrial ultrastructure in roots of mesophytes and hydrophytes at anoxia and after glucose feeding // Protoplasma. 1977. V. 91. P. 243-256.

193. Vartapetian B.B. Introduction: Life without Oxygen // Plant Life in Anaerobic Environments / Eds Hook D.D., Crawford R.M.M. Ann. Arbor, Michigan: Ann. Arbor Sci., 1978. P. 1-12.

194. Vartapetian B.B.,Mazliak P., Lance C. Lipid biosynthesis in rice coleoptilies grown in the presence or in the absence of oxygen // Plant Sciences Letters. 1978b. V. 13. P. 321-328.

195. Vartapetian B.B., Andreeva I.N. Mitochondrial ultrastructure of three hydrophyte species at anoxia and in anoxic glucose-supplemented medium // J. Exp. Bot. 1986. V.37. №178. P.685-692.

196. Vartapetian B.B., Polyakova L.I. Blocking of anaerobic protein synthesis destabilizes dramatically plant mitochondrial membrane ultrastructrure // Bichem. and Molec. Biol. Internat. 1994. V. 33. № 2. P. 405

197. Voesenek L.A., Van Oorschot F.J.M.M., Smits A.J.M., Blom C. W.P.M. The role of flooding resistance in the establishment of Rumex seedlings in river flood plains // Functional Ecology. 1993. V.7. P.105-114.

198. Wadman-van-Schravendijk H., Van Andel O.M. Interdependence of growth, water relations and abscisic acid level in Phaseolus vulgaris during waterlogging // Physiologia plantarum. 1985. V.63. P.215-220.

199. Waters I., Armstrong W., Thompson C.J, Setter T.L., Adkins S. Diurnal changes in radial oxygen loss and ethanol metabolism in roots of submerged and non-submerged rice seedlings // New Phytologist. 1989. V. 113. P. 439-451.

200. Waters I., Morrell S., Greenway H., Colmer T.D. Effects of anoxia on wheat seedlings.2.Influence of 02 supply prior to anoxia on tolerance to anoxia, alcoholic fermentation, and sugar levels // J. Exp. Bot. 1991. V. 42. № 244. P. 1437-1447.

201. Webb Т., Armstrong W. The Effects of anoxia and carbohydrates on the growth and viability of rice, pea and pumpkin roots // J. Exp. Bot. 1983. V. 34. P. 579-603.

202. Wink M. Composition of the spent cell culture medium. 1. Time course of ethanol formation and the excretion of hydrolytic enzymes into the medium of suspension-cultured cells of Lupinus polyphyllus // J. Plant Physiol. 1985. V. 121. P. 287-293.

203. Xia J.H., Saglio P.H. Lactic acid efflux as a mechanism of hypoxic acclimation of maize root tips to anoxia // Plant Physiology. 1992. V. 100. P. 40-46.

204. Xia J.H., Saglio P.H., Roberts J.K.M. Nucleotide levels do not critically determine survival of maize root tips acclimated to low oxygen environment // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 589-595.

205. Xia J.H., Roberts J.K.M. Regulation of H+ extrusion and cytoplasmic pH in maize root tips acclimated to a low oxygen environment // Plant Physiol. 1996. V.l 11. P.227-233.

206. Xu K., Mackill D.J. A major locus for submergence tolerance mapped on rice chromosome 9 // Mol. Breed. 1996. V.2. P.219-224.

207. Yang Y, Chu D., Aizawa M., Kim M., Yamomoto T. Ethanol metabolism by tobacco callus in vitro // Plant Science. 1995. V. 104. P. 147-151.

208. Zenk M.H. Haploids in physiological and biochemical research // Haploids in Higher Plants. Guelf: Univ. Press. 1974. P. 339-353.

209. Zhang J., Van Toai Т., Huynh L., Preiszner J. Development of flooding-tolerant Arabidopsis thaliana by autoregulated cytokinin production // Moleculer Breeding. 2000. V.6. P. 135-144.

210. Zhang Q., Greenway H. Anoxia tolerance and anaerobic catabolism of aged beetroot storage tissues // J. Exp. Bot. 1994. V. 45. № 274. P. 67575.

Информация о работе

Степанова, Анна Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.12

Диссертация

Реакция культивируемых клеток на анаэробный стресс и получение in vitro устойчивых к затоплению растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы