Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Перспективы использования методов биотехнологии в селекции сахарного тростника на устойчивость к гипоксии

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Перспективы использования методов биотехнологии в селекции сахарного тростника на устойчивость к гипоксии"

РГ6 Он

1 3 ШН 1985

На правах рукописи

РАМЖГ ПЕРСОД ХАРИНАРШ

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИЙ. В СЕЛЕКЦИИ САХАРНОГО ТРОСТНИКА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГИПОКСИИ

(06.01.05 - селекция и семеноводство)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 1995

Работа выполнена в 1992-1995 гг. на кафедре генетики и селекции Российского университета дружбы народов и в лаборатории генетики культивируемых клеток Института физиологии растений им. К А. Тимирязева Российской Академии наук.

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, академик МАНВШ доктор биологических наук, профессор Л Л. Гулов кандидат биологических наук, старший научный сотрудник № И. Долгих

Официальные оппоненты: академик Международной академии информатизации (МАИ) доктор сельскохозяйственных наук, профессор П. Ф. Колонков кандидат сельскохозяйственных наук, доцент А. В. Калинин

Ведущая организация: Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева

Защита диссертации состоится "_20_ " июня 1995 г. в 11.^ ч заседании диссертационного совета К 053.22. 22 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8, корп. 2, лекционный зал N 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая,6.

Автореферат разослан "2_!!икжя 1995 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат сельскохозяйственных наук

доцент

М. П. Харламов

Актуальность проблемы

Переувлажнение почвы приводит к значительным потерям урожая ;ахарного тростника Активные агротехнические меры не всегда ком-[енсируют отрицательное влияние неблагоприятных погодных условий, [озтому исключительно важным является создание сортов, способных гри гипоксии, вызываемой затоплением, формировать высокие уро-¡аи [ Шевелуха, 1992].

В последние годы большое значение приобретают новые биотех-юлогические подходы, которые облегчают и ускоряют селекционный [роцесс, в частности, использование сомаклональной изменчивости [ля повышения генетического разнообразия и проведение первичного iT6opa на уровне культивируемых in vitro клеток растений [Бутен-»,1985].

Возможность использования культивируемых клеток сахарного ростника для улучшения коммерческих сортов впервые появилась в :онце 60-х годов, когда было показано, что растения, регенериро-¡анные из клеток, могут отличаться от исходной формы. Среди рас-ений-регенерантов были обнаружены варианты с хозяйственно ценны-и признаками. Благодаря сочетанию сомаклональной изменчивости и неточной селекции удалось получить формы сахарного тростника, ■стойчивые к вирусу Фиджи, пятнистости, ложной мучнистой росе, арианты с повышенной продуктивностью CScowcroft et al. ,1985].

Однако пока не разработаны селективные системы, позволяющие тбирать в условиях in vitro клетки, устойчивые к гипоксии. Зада-:а осложняется тем, что большая часть приспособительных реакций ахарного тростника на затопление проявляется на организменном, а :е на клеточном уровне.

В связи с этим целью исследования было изучение возможности :спользования культуры тканей сахарного тростника для отбора то-:ерантных к гипоксии растений.

При этом были поставлены следующие конкретные задачи:

1) изучить морфофизиологические реакции исходных растений сахарного тростника в условиях затопления;

2) подобрать условия получения каллуса и массовой регенерации растений;

3) разработать селективные системы для отбора клеток, устойчивых к недостатку кислорода;

4) получить растения из устойчивых клеточных линий и оценить их реакцию на условия гипоксии.

Научная новизна работы. Показано, что культура тканей сахарного тростника может быть использована б селекции, направленной на повышение устойчивости к гипоксии. Разработаны две селективные системы in vitro для отбора устойчивых к недостатку кислорода форм. Впервые из каллусных линий, отобранных по резистентности к токсичному аналогу метионина - этионину и к условиям анаэробиоза, получены растения сахарного тростника с повышенной толерантностью к корневому затоплению.

Практическая ценность. Разработан метод клеточной селекции устойчивых к гипоксии форм сахарного тростника. Полученные растения могут быть использованы и в традиционной селекции в качестве доноров этой устойчивости.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на III Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений (Пущино, 1995), на заседании кафедры генетики и селекции РУДН, на расширенном семинаре отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР.

Публикации. По материалам работы опубликованы тезисы и сдана в печать статья.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, результаты и обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, содержат 8 таблиц 5 рисунков и JS фотографий. Библиография содержит 9оо источников из которых то зарубежных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования были использованы три коммерческих сорта сахарного тростника - Со 421, PR 980 и P0J 2878, а также клон Saccharum giganteum, относящийся к виду S. robustum Grassl.

Тестирование растений.

Для изучения реакции на гипоксию растения сахарного тростника различного возраста выращивали в условиях затопления в течение двух месяцев или трех недель при использовании песчаной культуры и оценивали выживаемость, а тага® следующие морфологические приз-

пси: длину корней и стеблей, сухую массу корней и стеблей и чис-

> листьев. Растения в условиях корневого затопления выращивали >д слоем воды толщиной 5 см.

Индукция каллусогенеза, морфогенеза и ризогенеза.

Каллус получали из молодых неразвернувшихся листьев -4-месячных растений. Отрезки листовой трубки длиной 4 см тщз-;льно промывали проточной водопроводной водой и стерилизовали ¡ачала 2-3 минуты 70%-ным этанолом, а затем 20 минут 0,1%-ным ютвором сулемы. После стерилизации листовые трубки промывали 5 © стерильной дистиллированной водой, разрезали на сегменты по 4 I и помещали на агаризованную питательную среду. Для индукции шлусогенеза использовали модифицированную среду Мурасиге-Скуга .962) с 3 мг/л 2,4-Д (МО) и среду Скоукрофта [Ьагкт, 19823 с 3 '/л 2,4-Д и 0,25 мг/л кинетина (С). Чтобы уменьшить окисление ¡нольных соединений, образующихся в эксплантах, к обеим средам )бавляли Ь-цистеин или диэтилдитиокарбамат (ДЭДТК) в концентра-1И 5 мг/л. Каллус инкубировали в чашках Петри при температуре

> С на свету интенсивностью 3000 лк. Длина светового дня составила 16 час.

Для индукции морфогенеза каллус пересаживали на среду Мура-[ге-Скуга с 1 мг/л НУК и 1 мг/л кинетина. Регенерированные побе-[ пересаживали на среду Шенка-Хильдебрандта (1972) (ПЬХ) с раз-ми концентрациями ЛУК и НУК для укоренения. Полностью сформиро-шные растения перед высадкой в почву адаптировали в оранже-е: сначала 2 дня в открытых культуральных сосудах на агаре, а лем 5 дней в воде.

Анализ аминокислот.

Свободные аминокислоты экстрагировали согласно методике Ти-1шенко и др. [1980]. Определение аминокислот в экстрактах провощи на аминокислотном анализаторе ААА-339М фирмы "Коуо" ( Че-

и).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУДДЕНИЕ Реакция исходных растений на гипоксию

Растения в возрасте 1 месяца испытывали в условиях корневого полного затопления. При полном затоплении все растения погибли, рневое затопление сильно угнетало роет корней у всех сортов, а

также рост стеблей у сортов Со 421 и РОЛ 2878. У сорта РЯ 98С контрольные и затопленные растения почти не различались между собой по этим показателям (табл.1). По-видимому, этот сорт боле« толерантен к условиям гипоксии.

Таблица 1. Показатели роста исходных растений сахарного тростникг после двухмесячного корневого затопления

Сорт Вариант опыта Длина, см Сухая масса, мг Число

корня стебля корней стебля листье

Со 421 контр, затопл. 5 затопл. в % к контр. 15,6+1,0 20,5+1,4 121 80,7+3,4 61,0+4,7 76 275,5+37,3 150,9+42,4 54 1437,0+209,1 739,1Ц31,9 51 6,5+0, 5,0+0, 77

РЯ 980 контр, затопл. затопл. в % к контр. 15,4+0,6 13,1±1,3 85 44,7+2,0 34,1+4,1 76 140,3+20,1 69,7£13,1 50 379,7+56,3 356,0±46,5 95 6,4+0, 5,140, 80

РОЛ 2878 контр, затопл. затопл. в % к контр. 19,2+0,8 20,8+1,1 108 61,6+3,2 52,Б±3,0 - 86 290,3+38,7 146,1+22,3 48 914,1+185,1 647,8+81,2 66 6,0+0, 5,2±0, 86

* В этой и других таблицах жирным шрифтом выделены значен® статистически достоверно (р<0,05) отличающиеся от контроля

У растений, подвергнутых корневому затоплению в возрасте месяцев, наблюдали усиленное по сравнению с контрольными растен: ями развитие корневой системы. Затопление не угнетало рост на, земной части растений, у сортов Со 421 и РОЛ 2878 опытные раст ния даже превышали контрольные по сухой массе стебля.

Полученные результаты позволяют заключить, что молодые ра тения более чувствительны к затоплению, чем взрослые. В последу

щих опытах для оценки устойчивости тестировали только одномесячные растения при корневом затоплении.

Получение каллуса и регенерация растений сахарного тростника

Необходимым условием использования культивируемых клеток для улучшения сельскохозяйственных культур является возможность регенерации из них растений. Поэтому важно было разработать систему получения морфзгенного каллуса и массовой регенерации растений. Для каллусогенеза использовали два типа питательной среды. Каллус образовывался на всех вариантах сред, однако для формирования каллуса, способного к регенерации растений, оптимальной была среда ЫС с ДЭДТК. Эта среда оказалась универсальной для всех четырех тестируемых генотипов. Наибольший регенерадионный потенциал как по частоте индукции морфогенного каллуса, так и по среднему числу растений-регенерантов на каллус продемонстрировал сорт PR 980: эмбриогенный каллус образовался на 60% эксплантов, и частота регенерации составила в среднем 3,2 растения на каллус. У сортов Со 421 и POJ 2878, соответственно, 38 и 46% эксплантов сформировали эмбриогенный каллус, и среднее число растений-регенерантов равнялось 2,9 и 2,6 на каллус. Клон S. giganteum показал самый низкий иорфогенетический потенциал (около 10%), поэтому он был исключен из дальнейшей работы.

Эффективность сред для укоренения оценивали по частоте побегов, образовавших корни, и по выживаемости пересаженных в почву растений. Среда Ш-Х с 5 мг/л НУК была оптимальной для укоренения эегенерантов, выживаемость которых достигала 90%. ЛУК и НУК в сонцентрации 10 мг/л ингибировали ризогенез (табл.2).

Таким образом, были определены условия получения каллуса и дегенерации растений сахарного тростника, включающие индукцию и 1ассирование каллуса на среде МС с ДЭДТК, регенерацию растений на греде МО и укоренение их на среде Ш-Х с 5 мг/л НУК

Получение устойчивых к гипоксии растений сахарного тростника

Следующим этапом работы было определение способа отбора в условиях in vitro клеток, способных дать начало растениям с повы-юнной устойчивостью к гипоксии. Были использованы три системы:

1) культивирование каллуса на среде без селективного фактора

с целью получения сомаклонов;

2) выращивание каллуса на среде с селективным фактором -этионином, токсичным аналогом метионина, и отбор устойчивых клеточных линий;

3) инкубация каллуса в условиях анаэробиоза и выделение устойчивых клеточных линий.

Таблица 2. Частота укоренения и выживаемость в почве растений-регенерантов сахарного тростника на среде Ш-Х I зависимости от содержания в среде гормонов, %

Сорт Вариант среды

Без ИУК НУК

гормонов

2 мг/л 10 мг/л 5 мг/л 10 мг/Л

Укоренение

Со 421 64+7 72+6 44+7 94+3 46+7

РИ 980 68+7 70+6 40+7 88+5 48+7

Р01 2878 72¿6 84±5 54+7 98+2 54+7

- Выживаемость

Со 421 59+7 69+6 27+6 94+3 35±7

РИ 980 62+7 74±6 30+6 91+4 38±7

РО] 2878 67+7 79+6 59±7 94+3 67±7

Сомаклоны, полученные в неселективных условиях, а также растения, регенерированные из устойчивых клеточных линий, были оценены на устойчивость к гипоксии. Результаты, приведенные в табл.3, показывают, что для всех сортов выживаемость сомаклонов в условиях затопления была выше, чем у исходных растений. Для сортов Со 421 и РОД 2878 разница достигала двух раз. У сахарного тростника описаны случаи, когда измененный признак проявлялся у

значительной части популяции сомаклонов [Heinz et al., 1977; Lar-kin, Scowcroft, 1981]. Причиной этого может быть более высокая скорость размножения, в условиях in vitro клеток с измененным признаком. За счет более быстрого роста вариантные клетки вытесняют нормальные, и как следствие, вариантный признак проявляется у большей части растений-регенерантов.

Таблица 3. Выживаемость исходных растений и сомаклонов сахарного тростника в условиях корневого затопления

Сорт Вариант опыта Число Выживаемость,

проанализированных %

растений

Исходные

растения 17 35,3+11,6

Со 421

Сомаклоны 16 75,0+10,8

Исходные

растения 36 69,4±7,7

PR 980

Сомаклоны 36 94,0+4,0

Исходные

растения 24 43,8+10,1

P0J 2878

Сомаклоны 29 86,0+6,4

Существует две стратегии адаптации высших растений к анаэробным условиям среды. Первая из них направлена на избегание неблагоприятных условий за счет дальнего транспорта кислорода из надземных незатопленных частей растения. Вторая стратегия связана с метаболическими перестройками, обеспечивающими энергией процессы жизнедеятельности при отсутствии кислорода СВартапетян, 19823.

В первом случае растения выживают за счет образования дополнительных корней, которые развиваются ближе к поверхности воды, а

также благодаря образованию воздухоносных полостей и каналов в корнях - аэренхимы. Стимулятором образования аэренхимы является этилен. Этилен синтезируется через ряд промежуточных продуктов из метионина, причем этот процесс ускоряется в условиях гипоксии. Возможно, при усилении синтеза метионина будет увеличиваться и количество образующегося из него этилена. Можно предположить, что растения, регенерированные из клеток с повышенным синтезом этилена, будут лучше адаптироваться в условиях затопления за счет более быстрого образования аэренхимы. Для получения сверхпродукции аминокислот, чей синтез регулируется по принципу обратной связи, обычно используют селекцию на устойчивость к токсическому аналогу данной аминокислоты [Widholm, 19781. В данном случае была применена селективная система, включающая этионин.

Для отбора устойчивых клеточных линий нужно было определить сублетальную концентрацию этионина. Каллус культивировали на протяжении двух пассажей на средах, содержащих от 0,1 до 0,5 мМ этионина и определяли увеличение его массы. Для всех проверенных сортов сублетальной оказалась концентрация этионина 0,2 мМ, прирост каллуса при этой дозе составлял в зависимости от сорта от 10 до 35% от контрольного уровня.

При отборе этионин-устойчивых клеточных линий каллус пассировали три раза на среде с этионином, затем два раза на среде без селективного фактора и еще один раз на селективной среде. Такая схема селекции обеспечивает наиболее полную элиминацию чувствительных клеток. Учитывая уменьшение способности к морфогенезу по мере культивирования in vitro, растения регенерировали, начиная со второго пассажа в селективных условиях. Однако для тестирования в условиях затопления Орали растения, полученные только из клеточных линий, сохранивших устойчивость к зтионину в течение всего цикла селекции.

Использованная селективная система оказалась достаточно жесткой: после пассирования на среде с этионином только 4% от числа высаженных эксплантов сохранили жизнеспособность у сорта Со 421, 5% - у сорта PR 980 и 1% - у сорта P0J 2878 (табл.4). Из устойчивых линий были регенерированы растения. Всего было получено регенерантов у сортов Со 421, PR 980 и P0J 2878, соответственно, 240, 351 и 101.

Часть растений, регенерированных из этионин-устойчивых клеточных линий, была оценена в условиях гипоксии. В среднем выжива-

емость регенерантов, подвергнутых корневому затоплению, оказалась намного выше, чем у исходных растений. Особенно заметной была разница для более чувствительных к гипоксии сортов Со 421 и РОЛ

Таблица 4. Выживаемость каллусов в процессе селекции на среде с этионином.%

Сорт Число высаженных каллусов Номер пассажа

1 2 3 4 5 6

Со 421 750 52 15 5 5 4 4

Р1? 980 750 57 28 6 6 5 5

РОЛ 2878 1020 80 64 24 1 1 1

1,2,3 и 6 - пассажи на селективной среде

4 и 5 - пассажи на неселективной среде

2878. Толерантность растений, полученных из отдельных клеточных линий, значительно колебалась. Наибольшую устойчивость продемонстрировали линии 271 и 358 у сорта Со 421, 40, 51, 412 и 418 у сорта Р1? 980, 75 и 162 у сорта РОЛ 2878 (табл.5). В среднем доля устойчивых растений была выше у исходно толерантного сорта РИ 980, однако в результате селекции и у чувствительных сортов некоторые линии достигли уровня толерантных.

Исходной гипотезой при выборе селективной системы с этиони-ном была возможная корреляция увеличения концентрации метионина с повышенной устойчивостью к гипоксии на основе усиления синтеза этилена. Количественный анализ аминокислот аспартатного пути синтеза показал, что в регенерантах из различных этионин-устойчивых клонов пул свободных аминокислот в значительной степени варьирует. Однако содержание лизина, треонина и изолейцина во всех устойчивых клонах было значительно выше, чем в исходных растениях у всех сортов. Метионин присутствовал у исходных растений сорта РОЛ 2878 в очень низкой концентрации, а у сортов Со 421 и РИ 980 вообще не был обнаружен. После селекции на среде с этионином метионин появился у растений из части устойчивых клонов. При этом ко-

личество аспартата у этих клонов уменьшалось по сравнению с исходными растениями. По-видимому, в отселектированных растениях активизируется синтез аминокислот аспартатного пути, в том числе и метионина и, возможно, повышается продукция этилена.

Таблица 5. Выживаемость в условиях затопления растений-регенеран-тов, полученных после селекции на среде с этионином

Сорт Вариант Число Выживаемость,

проанализированных %

растений

Исходные

растения 17 35,3+11,6

Регенеранты: N 68 12 33,3±13,6

Со 421 N 100 21 42,9±10,8

N 102 15 73,3+11,4

N 271 11 90,9+8,7

N 358 35 88,6+5,4

Исходные

растения 36 69,4+7,7

Регенеранты: N 40 35 90,0±5Д

РЕ? 980 N 50 10 64,3±15,2

N 51 14 94,4±Б,1

N 148 18 77,8±9,8

N 269 9 75,0£14,4

N 412 12 85,7±10,1

N 418 14 100,0

Исходные

растения 24 45,8+10,1

Регенеранты: N 75 5 100,0

N 162 7 85,7+13,2

РОЛ 2878 N 194 7 71,4+19,8

N 220 14 57,1+13,2

N 307 5 80,0+17,9

N 331 10 70,0£14,5

Вторая селективная система была использована с целью отбора клеток с изменениями метаболизма, позволяющими им выживать при отсутствии кислорода. Каллусные ткани инкубировали под слоем жидкой питательной среды в колбах, где воздух был заменен азотом. Предварительно была установлена продолжительность продувания азотом, которая требовалась для полного вытеснения воздуха из колбы. Чтобы убедиться в отсутствии кислорода в колбах после продувки, использовали биотест - проращивание зерен риса Известно, что в бескислородных условиях из замоченных зерновок риса развиваются колеоптили, но корни не образуются. С помощью биотеста было определено, что для полного вытеснения кислорода достаточно продувать колбы азотом в течение 10 минут.

Для проведения селекции нужно было определить продолжительность инкубации каллуса в бескислородных условиях. Клетки оставляли под слоем питательной среды в герметически закрытых колбах с азотом в течение нескольких суток. Затем их переносили в обычные условия культивирования и через месяц оценивали рост по сравнению с контрольными каллусами, не подвергавшимися воздействию аноксии.

Выяснилось, что инкубация клеток в условиях анаэробиоза не вызывала существенного снижения их жизнеспособности. Рост каллусов, прошедших трехдневную обработку, снизился по сравнению с контролем только на 14-23% в зависимости от сорта сахарного тростника. Возможно, каллус выживал за счет кислорода, оставшегося в межклетниках, или для поддержания жизнедеятельности хватало энергии, выделяемой в процессе гликолиза. Однако инкубация клеток в условиях аноксии привела к значительному снижению способности к морфогенезу. После трех дней пребывания в атмосфере азота только 15% каллусов сохранили регенерационный потенциал у сорта Со 421, 10% - у сорта РЕ 980 и 7% - у сорта ЯЭД 2878. Вероятно, процесс дифференцировки, связанный с активными клеточными делениями, требует больше энергии и поэтому сильнее страдает в условиях недостатка кислорода. Для проведения селекции была выбрана двухдневная инкубация в атмосфере азота, при которой примерно 20% клеток сохраняло способность к регенерации растений.

Растения, регенерированные из каллусов после инкубации в условиях анаэробиоза, были испытаны в условиях затопления. Результаты показывают, что у всех сортов выживаемость регенерангов была выше, чем у исходных форм. Количество проанализированных растений

у сортов Со 421 и РК 980 не позволяет говорить о достоверном повышении толерантности, однако для сорта РОД 2878, где было проверено 36 растений, отселектированные варианты имели явное преимущество по сравнению с контрольными растениями (табл. 6).

Таблица 6. Выживаемость в условиях затопления растений-регенеран-тов, полученных из устойчивых к анаэробиозу каллусов

Сорт Вариант опыта Число проанализированных растений Выживаемость, %

Со 421 Исходные растения Регенеранты 17 5 35,3+11,6 80,0±17,9

PR 980 Исходные растения Регенеранты 36 5 69,4+7,7 100,0

P0J 2878 Исходные растения Регенеранты 24 36 45,8+^.0,1 94,0+4,0

Для того, чтобы рекомендовать наилучшие биотехнологические подходы к селекции сахарного тростника на устойчивость к корневому затоплению, было проведено сравнение эффективности трех проверенных систем отбора in vitro. Как уже отмечалось многими авторами, сомаклональная изменчивость у сахарного тростника позволяет получать формы с агрономически ценными признаками [Heinz, Мзе, 1969; Evans, Sharp, 1986]. И в данной работе растения, полученные без селективного давления, тем не менее обладали повышенной толерантностью к гипоксии. Выживаемость растений, регенерированных из устойчивых к анаэробиозу каллусов, а также из лучших этионин-устойчивых клеточных линий, была еще выше, чем у сомакло-нов (табл. 7).

Таблица 7. Выживаемость в условиях затопления растений-регенерантов, полученных в разных системах отбора

Сорт Система отбора Выживаемость, %

Со 421 Исходные растения Сомаклоны без селекции Этионин Аанаэробиоз 35,3+11,6 75,0+10,8 90,9+8,7 80,0+17,9

РЯ 980 Исходные растения Сомаклоны без селекции Этионин Анаэробиоз 69,4±7,7 94,0+4,0 100,0 100,0

РОЛ 2878 Исходные растения Сомаклоны без селекции Этионин Анаэробиоз 45,8+10,1 86,0+6,4 100,0 94,0+4,0

У сорта Со 421 селекция на среде с этионином позволила получить растения с более развитой корневой системой. Благодаря этому, регенеранты лучше росли в условиях затопления. Об этом свидетельствуют больше длина и масса стебля (табл.8). Для двух других сортов регенерированные из этионин-устойчивых линий растения не превосходили сомаклоны по ростовым параметрам. Малое количество регенерадтсв, полученное в селективной системе с использование анаэробиоза в качестве селективного фактора, не позволяет судить о ростовых характеристиках растений сортов Со 421 и РИ 980. У сорта РОЛ 2878 регенеранты, полученные из устойчивых к аноксии

клеток, примерно в два раза превосходили сомаклоны по массе корней и стебля. Данные результаты свидетельствуют о целесообразности проведения отбора на уровне культивируемых клеток.

Таблица 8. Средние показатели роста в условиях затопления растений- регенерантов, полученных в разных системах отбора

Сорт Система отбора Длина, см Сухая масса, мг Число листьев

корня стебля корней стебля

Зо 421 Сомаклоны без селекции Этионин Анаэробиоз 6,3±0,4 8,0+0,8 17,4±0,6 22,8+1,2 16,3+0,4 18,6±0,3 27,8±3,1 56,8±8,6 5,0±0,3 4,6±0,2

Рй 980 Сомаклоны без селекции Этионин Анаэробиоз 9,3±1,1 4,6+0,8 18,440,9 16,9±1,5 15,2+1,8 5,9*1,8 29,6+2,7 20,9+5,4 4,3±0,2 3,9±0,3

ГСЦ 2878 Сомаклоны без селекции Этионин Анаэробиоз 6,8±0,8 6,3+0,8 8,2±0,4 16,8+1,5 17,3+1,3 18,5±1,0 8,7+0,1 10,6+2,5 21,7+2,6 21,8±3,1 24,6±4,9 43,3+4,1 4,2±0,2 4,310,3 4,5+0,2

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований подобраны оптимальные условия для каллусогенеза и регенерации растений для тре> коммерческих сортов сахарного тростника. Наилучшей средой для индукции морфогенного каллуса является среда Мурасиге-Скуга с <

мг/л 2,4-Д и 5 мг/л диэтилдитиокарбамата. Среда Ш с 1 мг/л НУК и 1 мг/л кинетика была оптимальной для регенерации растений, а среда Шэнка-Хильдебрандта с 5 мг/л НУК - для их укоренения.

2. Полученные растения-регенеранты всех трех сортов продемонстрировали более высокую выживаемость в условиях корневого затопления по сравнению с исходными растениями.

3. Растения, регенерированные из клеточных линий, отобранных in vitro в условиях анаэробиоза или на селективной среде с этио-нином, обладали еще долее высокой толерантностью к гипоксии.

4. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности включения методов культуры тканей в селекцию сахарного тростника на устойчивость к затоплению.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Оптимальными условиями получения морфогенного каллуса и массовой регенерации растений сахарного тростника являются: индукция каллуса на среде Мурасиге-Скуга с 3 мг/л 2,4-Д и 5 мг/л ДЭДТК, регенерация побегов на среде MC с 1 мг/л НУК и 1 мг/л кинетика и укоренение их на среде Шенка-Хильдебрандта с 5 мг/л НУК.

2. При выведении устойчивых к гипоксии сортов сахарного тростника целесообразно использовать культуру тканей для первичного отбора Наилучшие результаты дают такие селективные системы in vitro, как резистентность к этионину и к условиям анаэробиоза.

Список работ по теме диссертации

1. Р. П. Харинарайн, Ю. И. Долгих, 10. JL Гужов. Выбор оптимальных сред для массовой регенерации растений сахарного тростника из каллусной культуры //Физиология растений (в печати).

2. Р. П. Харинарайн, Ю. И. Долгих, Ю. Л. Гужов. Разработка методов клеточной селекции для получения устойчивых к гипоксии форм сахарного тростника // Тезисы III Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1995 (в печати).

3. 3!аринарайн Р. П., Долгих Ю. И., Гужов Ю. JL Применение метод культуры тканей в селекции сахарного тростника на устойчивость к за топлению. - М., 1995. - 2 с. - Депон. в ВИНИТИ.

- 16 -

HARINARAIN RAMJEET PERSAUD (GUYANA)

THE PROSPECTS OF USING BIOTECHNOLOGICAL METHODS IN SUGARCANE SELECTION FOR TOLERANCE TO HYPOXIA The possibility of obtaining somaclonal variants of sugarcane with increased resistance to hypoxia was demonstrated in this study. Regenerants tolerant to oxygen stress induced by flooding were obtained from calli cultured on media; without selective agent; with toxic quantities of the methionine analog -ethionine-, and calli cultured in a nitrogen environment. Regenerants obtained from calli cultured on selective media even demonstrated increased viability under flooding stress as coirpared with those developed in non-selective condition. The most effective system to obtain somaclonal variants with increased resistance to flooding stress was with use of nitrogen. Plants regenerated in this system demonstrated not only a high pecentage of viability but also a more intensive growth of roots and stems.

ХАРИНАРАЙН РАМЖИТ ПЕРСОД (ГАЙЯНА)

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ САХАРНОГО ТРОСТНИКА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГИПОКСИИ В работе продемонстрирована возможность получения сомакло-нальных вариантов с повышенной устойчивостью к гипоксии. Растения- регенеранты, толерантные к недостатку кислорода, вызванному затоплением, были получены из каллусных тканей, выращиваемых на средах: без селективного фактора, с селективным фактором токсичным аналогом метионина этионином, или из каллусов, росших в условиях анаэробиоза По сравнению с сомаклонами, полученными на среде без селективного фактора, растения, регенерированные из этионин-устойчивых каллусов, продемонстрировали более высокую выживаемость в условиях затопления. Инкубация клеток в условиях анаэробиоза оказалась наиболее эффективной селективной системой in vitro: растения-регенеранты обладали не только высокой выживаемостью в условиях затопления, но и хорошей интенсивностью роста корней и стеблей.

Зек.

100